JP2547317B2 - リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａとハイブリダイズしうるクロ−ン化ｄｎａ配列 - Google Patents
リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａとハイブリダイズしうるクロ−ン化ｄｎａ配列Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はリンパ節障害関連ウイルス（LAV）のゲノムR
NAおよびDNAとハイブリダイズしうるクローン化DNA配
列、その製造方法ならびにその用途に係る。さらに特定
的には、LAVウイルスまたは関連ウイルスまたはDNAプロ
ウイルスのいずれかを含有しているあらゆる媒質サンプ
ル、特に生物学的飼料中のこれらウイルスの検出に用い
ることができるDNA配列を含む安定なプローブに係る。
NAおよびDNAとハイブリダイズしうるクローン化DNA配
列、その製造方法ならびにその用途に係る。さらに特定
的には、LAVウイルスまたは関連ウイルスまたはDNAプロ
ウイルスのいずれかを含有しているあらゆる媒質サンプ
ル、特に生物学的飼料中のこれらウイルスの検出に用い
ることができるDNA配列を含む安定なプローブに係る。
リンパ節障害関連ウイルス（LAV）は、後天性免疫不
全症候群（AIDS）の前徴または良性形態であることが多
いリンパ節障害症候群に患つた同性愛の患者のリンパ節
から初めて単離されたヒトレトロウイルスである（１参
照）。その後別のLAVがAIDS患者やプレーAIDS患者から
単離されている（２〜５参照）。入手できるデータは全
て、このウイルスがAIDSの病因であることと一致してい
る（11参照）。
全症候群（AIDS）の前徴または良性形態であることが多
いリンパ節障害症候群に患つた同性愛の患者のリンパ節
から初めて単離されたヒトレトロウイルスである（１参
照）。その後別のLAVがAIDS患者やプレーAIDS患者から
単離されている（２〜５参照）。入手できるデータは全
て、このウイルスがAIDSの病因であることと一致してい
る（11参照）。
このウイルスは活性化Ｔリンパ球で増殖し、Ｔ細胞サ
ブセツトOKT4に対して向性をもつており（２〜６参
照）、このサブセツト中で細胞変性効果を誘発する。し
かしこのウイルスは、ある種のエプスタイン−バール
（Epstein−Barr）ウイルスでトランスフオームしたＢ
細胞株（cell line）（７参照）中や樹立したＴリンパ
芽球細胞株、CEM中で増殖できるように順応させられて
いる。
ブセツトOKT4に対して向性をもつており（２〜６参
照）、このサブセツト中で細胞変性効果を誘発する。し
かしこのウイルスは、ある種のエプスタイン−バール
（Epstein−Barr）ウイルスでトランスフオームしたＢ
細胞株（cell line）（７参照）中や樹立したＴリンパ
芽球細胞株、CEM中で増殖できるように順応させられて
いる。
さらに最近になつて、LAV様ウイルスがAIDS患者とプ
レーAIDS患者から別個に単離された。HTLV−III（ヒト
Ｔ細胞白血病／リンパ腫ウイルスIII型。12〜15参照）
およびARV（AIDS関連レトロウイルス）とよばれるこれ
らのウイルスはLAVに類似した特性を多く有しており、L
AV原型（prototype）の別々の単離体である。言葉の便
宜上以後これらを全部「LAV」と指称する。
レーAIDS患者から別個に単離された。HTLV−III（ヒト
Ｔ細胞白血病／リンパ腫ウイルスIII型。12〜15参照）
およびARV（AIDS関連レトロウイルス）とよばれるこれ
らのウイルスはLAVに類似した特性を多く有しており、L
AV原型（prototype）の別々の単離体である。言葉の便
宜上以後これらを全部「LAV」と指称する。
現在のところ利用できる検出法はウイルスタンパク質
の識別を基にしている。このような方法は、1983年９月
15日付の英国出願第83 24800号の優先権を主張して198
4年９月14日に出願された名称を「リンパ節障害と後天
性免疫不全症候群を診断するための抗原、手段および方
法」とする欧州出願に開示されている。実際抗−p25抗
体がAIDS患者とプレーAIDS患者の血清中に高率で発見さ
れ、これよりは低いがかなりの程度でAIDSの罹患の危険
度が高い群でも見つかつている（８〜10参照）。
の識別を基にしている。このような方法は、1983年９月
15日付の英国出願第83 24800号の優先権を主張して198
4年９月14日に出願された名称を「リンパ節障害と後天
性免疫不全症候群を診断するための抗原、手段および方
法」とする欧州出願に開示されている。実際抗−p25抗
体がAIDS患者とプレーAIDS患者の血清中に高率で発見さ
れ、これよりは低いがかなりの程度でAIDSの罹患の危険
度が高い群でも見つかつている（８〜10参照）。
本発明は、LAVやその関連ウイルス（以後さらに概括
的に「LAVウイルス（群）」と指称する）の検出に同様
に有用であるばかりでなく、特にこれらのウイルスのゲ
ノムDNAの特定の一部であつてその発現産物が免疫的手
法では必ずしも検出できないようなDNA検出する際にさ
らに多くの有用性を発揮する新規な手段を提供すること
を目的としている。
的に「LAVウイルス（群）」と指称する）の検出に同様
に有用であるばかりでなく、特にこれらのウイルスのゲ
ノムDNAの特定の一部であつてその発現産物が免疫的手
法では必ずしも検出できないようなDNA検出する際にさ
らに多くの有用性を発揮する新規な手段を提供すること
を目的としている。
以下図面を参照するが、図面中で、 −第１図はプラスミド組換え体に含有される好ましいLA
Vインサート（挿入物）の制限地図を示し、 −第２図は完全なLAV断片の制限地図を示し、 −第３図は完全なLAVゲノム（クローンλJ19）の制限地
図であり、 −第４〜11図は、第４図に制限地図を示したLAVゲノム
の全配列を示す。
Vインサート（挿入物）の制限地図を示し、 −第２図は完全なLAV断片の制限地図を示し、 −第３図は完全なLAVゲノム（クローンλJ19）の制限地
図であり、 −第４〜11図は、第４図に制限地図を示したLAVゲノム
の全配列を示す。
本発明のDNAはLAVのゲノムRNAとハイブリダイズしう
るDNA断片を含有するDNAから成つている。特定的には、
このDNAは前記cDNAまたはcDNA断片またはこのcDNAもし
くはcDNA断片を含有する組換えDNAから成る。
るDNA断片を含有するDNAから成つている。特定的には、
このDNAは前記cDNAまたはcDNA断片またはこのcDNAもし
くはcDNA断片を含有する組換えDNAから成る。
好ましいクローン化cDNA断片は各々次の制限部位をそ
れぞれ（３′末端から５′末端へ）次の順序で含有す
る。
れぞれ（３′末端から５′末端へ）次の順序で含有す
る。
１） Hind III,Sac I,Bgl II（LAV75） ２） Hind III,Sac I,Bgl II,Bgl II,Kpn I（LAV82） ３） Hind III,Sac I,Bgl II,Bgl II,Kpn I,Xho I,Bam
H I,Hind III,Bgl II（LAV13）． ここで、LAV75,LAV82およびLAV13という表示はそれぞ
れを最初にクローン化した組換えプラスミド（それぞれ
pLAV75,pLAV82およびpLAV13と表示）の名称に対応して
いる。言い換えると、LAV75,LAV82およびLAV13はそれぞ
れ上記の組換えプラスミド中にインサートとして存在す
るということである。便宜上、cDNA断片が単離形態にあ
つてもプラスミド形態にあつても、本明細書を通じてこ
の断片を表示するのにこのLAV75,LAV82およびLAV13とい
う表示を使用する。したがつて、上で最後に述べた組換
え体の他のDNA部分はそれぞれpLAV75,pLAV82およびpLAV
13の対応する部分と同一かまたは異なる。
H I,Hind III,Bgl II（LAV13）． ここで、LAV75,LAV82およびLAV13という表示はそれぞ
れを最初にクローン化した組換えプラスミド（それぞれ
pLAV75,pLAV82およびpLAV13と表示）の名称に対応して
いる。言い換えると、LAV75,LAV82およびLAV13はそれぞ
れ上記の組換えプラスミド中にインサートとして存在す
るということである。便宜上、cDNA断片が単離形態にあ
つてもプラスミド形態にあつても、本明細書を通じてこ
の断片を表示するのにこのLAV75,LAV82およびLAV13とい
う表示を使用する。したがつて、上で最後に述べた組換
え体の他のDNA部分はそれぞれpLAV75,pLAV82およびpLAV
13の対応する部分と同一かまたは異なる。
好ましいcDNAも（LAV75,LAV82およびLAV13と同様
に）、特にLAVのレトロウイルス構造が今日までに知ら
れたレトロウイルスのゲノム構造と概ね一致するものと
仮定すれば、レトロウイルスのDNAのコード領域の３′
末端はもちろんLTR（長い末端反復配列、Long Terminal
Repeat）のＲ領域とU3領域に対応する領域を含有して
いる。
に）、特にLAVのレトロウイルス構造が今日までに知ら
れたレトロウイルスのゲノム構造と概ね一致するものと
仮定すれば、レトロウイルスのDNAのコード領域の３′
末端はもちろんLTR（長い末端反復配列、Long Terminal
Repeat）のＲ領域とU3領域に対応する領域を含有して
いる。
大きさが約2.5KbpのLAV13は特に有利であることが判
明した。このものはLAVやLAV関連ウイルスに対して特異
性が高く、またLAV75やLAV82よりも多くのLAVレトロウ
イルスゲノムを認識する。特に、LAV13によつてLTR内部
のレトロウイルスゲノムのRU5接合部の同定が可能とな
り、その後LAVゲノムのサイズの決定が可能になつた。L
AVゲノムサイズは平均すると約9.1〜約9.2kbである。
明した。このものはLAVやLAV関連ウイルスに対して特異
性が高く、またLAV75やLAV82よりも多くのLAVレトロウ
イルスゲノムを認識する。特に、LAV13によつてLTR内部
のレトロウイルスゲノムのRU5接合部の同定が可能とな
り、その後LAVゲノムのサイズの決定が可能になつた。L
AVゲノムサイズは平均すると約9.1〜約9.2kbである。
LAV13は酵素Eco R I,Nru I,Pvu I,Sal I,Sma I,Sph
I,Stu IおよびXba Iに対する制限部位をもたない。
I,Stu IおよびXba Iに対する制限部位をもたない。
さらにLAV13は、レトロウイルスゲノム内でエンベロ
ープタンパク質をコードしている配列に相当するDNA配
列部分だけは少なくとも含有しているようである。
ープタンパク質をコードしている配列に相当するDNA配
列部分だけは少なくとも含有しているようである。
また本発明はLAVレトロウイルスゲノム全体の一部分
に相当すると思われるcDNA中に含有される任意の断片に
も係る。このLAVレトロウイルスゲノム全体はその特長
として（５′末端から３′末端に向かつて）後述の順序
で一連の制限部位を含有している。
に相当すると思われるcDNA中に含有される任意の断片に
も係る。このLAVレトロウイルスゲノム全体はその特長
として（５′末端から３′末端に向かつて）後述の順序
で一連の制限部位を含有している。
好ましい全LAVゲノムの連続する部位の座標（制限地
図）も後に、Ｒ領域に位置するHind III部位（これを座
標１に選択した）に対する座標として示す。この座標は
+200bp以内で評価されている。あるものは他のものより
も充分に確立されている。
図）も後に、Ｒ領域に位置するHind III部位（これを座
標１に選択した）に対する座標として示す。この座標は
+200bp以内で評価されている。あるものは他のものより
も充分に確立されている。
Hind III ０ sac I 50 Bam H I 460 Hind III 520 Bam H I 600 Pst I 800 Hind III 1100 Bgl II 1500 Kpn I 3500 Kpn I 3900 Eco R I 4100 Eco R I 5300 Sal I 5500 Kpn I 6100 Bgl II 6500 Bgl II 7600 Hind III 7850 Bam H I 8150 Xho I 8600 Kpn I 8700 Bgl II 8750 Bgl II 9150 Sac I 9200 Hind III 9250 上記した本発明のDNAはほぼ5550の座標の所にHind II
Iを余分に含んでいることもある。
Iを余分に含んでいることもある。
さらに詳しくいうと本発明は概略の大きさが0.1kb（1
0kb）で第３図に示した一連の制限部位を含むDNAに係
る。
0kb）で第３図に示した一連の制限部位を含むDNAに係
る。
より一般的にいつて本発明は、さらに詳細にいつた場
合後者（上記のDNA）のcDNA変異体（variants）に係
り、これら変異体は同じ一連の制限部位を後記の（５′
末端から３′末端へ向かう）順序で有していてもよい
が、制限部位のあるものが意図（自発）的かまたは意図
的なく誘発された突然変異に起因して欠失していてもま
たは付加されていてもよい。
合後者（上記のDNA）のcDNA変異体（variants）に係
り、これら変異体は同じ一連の制限部位を後記の（５′
末端から３′末端へ向かう）順序で有していてもよい
が、制限部位のあるものが意図（自発）的かまたは意図
的なく誘発された突然変異に起因して欠失していてもま
たは付加されていてもよい。
さらに本発明は上述の制限地図でそれぞれ以下のよう
に延びるDNA断片にほぼ対応する別の好ましいDNA断片に
も係る。
に延びるDNA断片にほぼ対応する別の好ましいDNA断片に
も係る。
−Kpn I（6100）あたりからBgl II（9150）あたりま
で。この断片は少なくとも１部がエンベロープのタンパ
ク質をコードしている遺伝子に対応していると考えられ
る。特に約110000ダルトン（Daltons）のタンパク質p11
0はこの領域にコードされている。
で。この断片は少なくとも１部がエンベロープのタンパ
ク質をコードしている遺伝子に対応していると考えられ
る。特に約110000ダルトン（Daltons）のタンパク質p11
0はこの領域にコードされている。
−Kpn I（3500）あたりからBgl II（6500）あたりま
で。この断片は少なくとも１部がpol遺伝子（ウイルス
ポリメラーゼをコードしている。）に対応していると考
えられる。
で。この断片は少なくとも１部がpol遺伝子（ウイルス
ポリメラーゼをコードしている。）に対応していると考
えられる。
−Pst（800）あたりからKpn I（3500）あたりまで。こ
の断片は少なくとも１部がgag遺伝子（タンパク質p25,p
18およびp13を含めたコア抗原をコードしている）に対
応していると考えられる。
の断片は少なくとも１部がgag遺伝子（タンパク質p25,p
18およびp13を含めたコア抗原をコードしている）に対
応していると考えられる。
また本発明は、後に示されるようにLAVのゲノムRNAと
ハイブリダイズしうる他のDNA断片ならびにLAVウイルス
群の全ゲノムに相当する別のcDNA変異体とハイブリダイ
ズしうる他のDNA断片にも係り、さらにこれらDNAやcDNA
断片を含有するDAN組換え体にも係る。
ハイブリダイズしうる他のDNA断片ならびにLAVウイルス
群の全ゲノムに相当する別のcDNA変異体とハイブリダイ
ズしうる他のDNA断片にも係り、さらにこれらDNAやcDNA
断片を含有するDAN組換え体にも係る。
さらに特定的には本発明は、上記の断片に対応してお
り、ほぼ同じ部位を互いにほとんど同じ距離だけ離して
有するあらゆる断片に係り、これら断片は全て共通して
LAVレトロウイルスゲノムとハイブリダイズしうるとい
う能力をもつている。もちろん、同様にLAVレトロウイ
ルスゲノムとハイブリダイズするという能力を実質的に
変えない欠失や突然変異を有する断片は上でより特定的
に述べたDNA断片の自明な均等物を形成するものと理解
されたい。
り、ほぼ同じ部位を互いにほとんど同じ距離だけ離して
有するあらゆる断片に係り、これら断片は全て共通して
LAVレトロウイルスゲノムとハイブリダイズしうるとい
う能力をもつている。もちろん、同様にLAVレトロウイ
ルスゲノムとハイブリダイズするという能力を実質的に
変えない欠失や突然変異を有する断片は上でより特定的
に述べたDNA断片の自明な均等物を形成するものと理解
されたい。
本発明の別の付加的な特徴は制限地図とヌクレオチド
配列を含めて本発明の好ましいDNAの付加的な特徴に関
する開示を通して明らかとなろう。以下本発明の好まし
いDNAの製造条件とその特性を非限定的に例証する。
配列を含めて本発明の好ましいDNAの付加的な特徴に関
する開示を通して明らかとなろう。以下本発明の好まし
いDNAの製造条件とその特性を非限定的に例証する。
1. cDNAライブラリーの構築 1.1 ウイルス精製 不死化した永久系LAV産生Ｂ−リンパ球株（line）FR8
（1984年５月９日付でパリ・パスツール研究所（INSTIT
UTPASTEUR）の“Collection Nationale de Cultures de
Micro−organismes"に番号Ｉ−303で寄託。７参照）か
らビリオンを精製した。精製手順（プロトコル）は既報
の通り（１参照）。主要なステツプは、培養上清のポリ
エチレン−グリコール処理と、20％シユクロース層（cu
shion）を通すペレツト化と、20〜60％シユクロース勾
配によるバンド分け（banding）と、ウイルス含有画分
のペレツト化であつた。
（1984年５月９日付でパリ・パスツール研究所（INSTIT
UTPASTEUR）の“Collection Nationale de Cultures de
Micro−organismes"に番号Ｉ−303で寄託。７参照）か
らビリオンを精製した。精製手順（プロトコル）は既報
の通り（１参照）。主要なステツプは、培養上清のポリ
エチレン−グリコール処理と、20％シユクロース層（cu
shion）を通すペレツト化と、20〜60％シユクロース勾
配によるバンド分け（banding）と、ウイルス含有画分
のペレツト化であつた。
1.2 第１ストランドcDNA合成 ウイルスに関連する洗浄で活性化された内因性反応
は、ウイルスを精製しそのエンベロープを溶解した後こ
のウイルスのリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵
素）を作用せしめる技術である。
は、ウイルスを精製しそのエンベロープを溶解した後こ
のウイルスのリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵
素）を作用せしめる技術である。
各反応毎にFR8上清250〜300mlに相当する精製ウイル
スを用いた。最終反応（液）量は1mlであり、インキユ
ベーシヨンは37℃で45分間、タンパク質濃度は約250μg
/mlであつた。バツフアーはNaCl25mM,Tris HCl（pH 7.
8）50mM、ジチオスレイトール10mM,MgCl2 6mM、dATP,dG
TP,dTTP各0.1mM、Triton X−100 0.02％、オリゴdTプラ
イマー50μg/mlであつた。α−32P−dCTP 400 Ci/mmol
eを0.6μＭまでかつコールド（放射化していない、col
d）dCTPを４μＭまで用いて15分間cDNAを標識した。そ
の後、コールドdCTPを25μＭまで加えて第１ストランド
の最適な伸長を確実にした。
スを用いた。最終反応（液）量は1mlであり、インキユ
ベーシヨンは37℃で45分間、タンパク質濃度は約250μg
/mlであつた。バツフアーはNaCl25mM,Tris HCl（pH 7.
8）50mM、ジチオスレイトール10mM,MgCl2 6mM、dATP,dG
TP,dTTP各0.1mM、Triton X−100 0.02％、オリゴdTプラ
イマー50μg/mlであつた。α−32P−dCTP 400 Ci/mmol
eを0.6μＭまでかつコールド（放射化していない、col
d）dCTPを４μＭまで用いて15分間cDNAを標識した。そ
の後、コールドdCTPを25μＭまで加えて第１ストランド
の最適な伸長を確実にした。
dCTP追跡（付加、chase）の30分後EDTAを20mMまで、S
DSを0.5％まで加えて反応を停止させ、プロテイナーゼ
Ｋ 100μg/mlで１時間消化し、フエノール−クロロホ
ルム抽出した。
DSを0.5％まで加えて反応を停止させ、プロテイナーゼ
Ｋ 100μg/mlで１時間消化し、フエノール−クロロホ
ルム抽出した。
次にＧ−50 Sephadex（Pharmacia）上でcDNAを精製
し、エタノール沈殿した。
し、エタノール沈殿した。
1.3 第２ストランド合成とクローニング 精製したcDNA−RNAハイブリツドをGUBLERとHOFFMAN
（17参照）に従つてDNAポリメラーゼＩとRNase Hで処理
した。ターミナルトランスフエラーゼを用いて２本鎖cD
NAを末端にdcを付加（dc−tail）し、pBR322の誘導体で
あるpBR327（34参照）をPst消化し末端にdGを付加した
ものとアニールした。
（17参照）に従つてDNAポリメラーゼＩとRNase Hで処理
した。ターミナルトランスフエラーゼを用いて２本鎖cD
NAを末端にdcを付加（dc−tail）し、pBR322の誘導体で
あるpBR327（34参照）をPst消化し末端にdGを付加した
ものとアニールした。
大腸菌（Ｅ.coli）C600 recbBC株をトランスフエクシ
ヨンしてcDNAライブラリーを得た。
ヨンしてcDNAライブラリーを得た。
2. LAV−特異的クローンの検出 2.1 ライブラリーのスクリーニング 500個の組変えクローンをニトロセルロースフイルタ
ー上で増殖させ、既報（1,2参照）のように内因性ウイ
ルス関連反応で作成し、32Pで標識したcDNAのもう１つ
のバツチを用いてその場（in situ）でコロニーハイブ
リダイゼーシヨン（35参照）を実施した。クローンの約
10％が検出できた。
ー上で増殖させ、既報（1,2参照）のように内因性ウイ
ルス関連反応で作成し、32Pで標識したcDNAのもう１つ
のバツチを用いてその場（in situ）でコロニーハイブ
リダイゼーシヨン（35参照）を実施した。クローンの約
10％が検出できた。
これらのクローンを小規模に増殖しそれらのインサー
トのクロスハイブリダイゼーシヨンを行なつて主要な１
群を得た。これらのクローンのうち組変え体とハイブリ
ダイズする主要な１群を固定した。これらのcDNAクロー
ンのうち３個、すなわち2.5kb,0.6kbおよび0.8kbのイン
サートをもつものをそれぞれpLAV 13,75および82と命名
して更に特性決定した（第１図）。
トのクロスハイブリダイゼーシヨンを行なつて主要な１
群を得た。これらのクローンのうち組変え体とハイブリ
ダイズする主要な１群を固定した。これらのcDNAクロー
ンのうち３個、すなわち2.5kb,0.6kbおよび0.8kbのイン
サートをもつものをそれぞれpLAV 13,75および82と命名
して更に特性決定した（第１図）。
３種のインサートは全て一端に共通の制限パターンを
もつており、プライミング部位が共通であることを示唆
している。長さ50bpで共通のHind III−Pst I断片の配
列を決定した（第１図）。これら共通断片はクローニン
グdCテイル部の前にポリＡ鎖を含有することが示され
た。すなわちこれらのクローンはポリＡ−RNAの３′末
端のコピーである。
もつており、プライミング部位が共通であることを示唆
している。長さ50bpで共通のHind III−Pst I断片の配
列を決定した（第１図）。これら共通断片はクローニン
グdCテイル部の前にポリＡ鎖を含有することが示され
た。すなわちこれらのクローンはポリＡ−RNAの３′末
端のコピーである。
LAV13の特異性をいろいろなアツセイで示した。
pLAV13の特異性を、ニツク翻訳したpLAV13をプローブ
として用いた一連のフイルターハイブリダイゼーシヨン
実験で決定した。先ずこのプローブはドツト（dot）お
よびノーザン（Northern）ブロツテイングによつて精製
したLAVゲノムRNAにハイブリダイズした（データは示さ
ず）。またpLAV13は培養上清から濃縮されフイルターに
直接固定されたウイルスのゲノムRNAにもハイブリダイ
ズする（ドツトブロツト法）。同様な方法でいろいろな
起源、すなわち正常Ｔ細胞、FR8その他のＢ細胞のLAV産
生株、CEM細胞、および、（これら程強くはないが）AID
Sに罹つた血友病患者から得た骨髄培養物由来のLAV（３
参照）から得たLAV RNAが検出された。非感染培養物は
負であることが立証された。この迅速なドツトブロツト
法は多少修正すれば血清その他の体液中のLAVの検出に
適用することができる。
として用いた一連のフイルターハイブリダイゼーシヨン
実験で決定した。先ずこのプローブはドツト（dot）お
よびノーザン（Northern）ブロツテイングによつて精製
したLAVゲノムRNAにハイブリダイズした（データは示さ
ず）。またpLAV13は培養上清から濃縮されフイルターに
直接固定されたウイルスのゲノムRNAにもハイブリダイ
ズする（ドツトブロツト法）。同様な方法でいろいろな
起源、すなわち正常Ｔ細胞、FR8その他のＢ細胞のLAV産
生株、CEM細胞、および、（これら程強くはないが）AID
Sに罹つた血友病患者から得た骨髄培養物由来のLAV（３
参照）から得たLAV RNAが検出された。非感染培養物は
負であることが立証された。この迅速なドツトブロツト
法は多少修正すれば血清その他の体液中のLAVの検出に
適用することができる。
第二にこのプローブはLAVに感染したＴリンパ球のサ
ザン（Southern）ブロツトとLAVを産生するCEM細胞株
（cell line）とにおいてDNAを検出した。同じハイブリ
ダイゼーシヨン条件下では、非感染リンパ球のDNAでも
正常肝から得たDNAでもハイブリダイゼーシヨンは検出
されなかつた（データは示さず）。
ザン（Southern）ブロツトとLAVを産生するCEM細胞株
（cell line）とにおいてDNAを検出した。同じハイブリ
ダイゼーシヨン条件下では、非感染リンパ球のDNAでも
正常肝から得たDNAでもハイブリダイゼーシヨンは検出
されなかつた（データは示さず）。
後述するようにLAVウイルス群の全レトロウイルスゲ
ノムを同定するのにLAV13を用いることができるという
可能性から第３の特徴が導かれた。Hind IIIで開裂した
pLAV 13中の内部ウイルス断片と共に移動する特に特徴
的な1.45kb Hind III断片が検出された。2.3kbと6.7kb
にもバンドが検出された。このプローブの長さは2.5kb
しかなく、しかも接合断片は全く検出できなかつたの
で、これら大き過ぎるバンドは、LAVゲノムのHind III
多型性から生じた内部断片に当たるのであろう。
ノムを同定するのにLAV13を用いることができるという
可能性から第３の特徴が導かれた。Hind IIIで開裂した
pLAV 13中の内部ウイルス断片と共に移動する特に特徴
的な1.45kb Hind III断片が検出された。2.3kbと6.7kb
にもバンドが検出された。このプローブの長さは2.5kb
しかなく、しかも接合断片は全く検出できなかつたの
で、これら大き過ぎるバンドは、LAVゲノムのHind III
多型性から生じた内部断片に当たるのであろう。
これらのデータを合わせると、pLAV13DNAはヒトゲノ
ムに対して外因性であり、LAVに感染した細胞から得たR
NA形も組み込まれたDNA形も双方とも検出することが示
される。すなわちpLAV13はLAVに特異的である。従来知
られているレトロウイルスのゲノム構造を考えれば、PL
AV13はオリゴーdTでプライムしたのでコード領域の３′
末端と共にLTRのＲ領域とU3領域も含有するはずであ
る。
ムに対して外因性であり、LAVに感染した細胞から得たR
NA形も組み込まれたDNA形も双方とも検出することが示
される。すなわちpLAV13はLAVに特異的である。従来知
られているレトロウイルスのゲノム構造を考えれば、PL
AV13はオリゴーdTでプライムしたのでコード領域の３′
末端と共にLTRのＲ領域とU3領域も含有するはずであ
る。
LAVゲノムDNAのクローニング LTRのＲ領域内にHind III部位があることが判別した
ので、LAVに感染した細胞から得たプロウイルスDNAをHi
nd IIIで部分消化することによりLAVゲノムをクローン
化することにした。（ａ）部分消化すると完全なクロー
ンを単離する機会が増大すること、および（ｂ）Hind I
II断片はラムダ置換ベクター（lambda replacement vec
tors）中で容易にクローン化されることが判明した。健
常ドナーから得インビトロで（in vitro）LAVに感染さ
せた後のＴ細胞から単離したDNAをHind IIIで部分消化
して分画した。９±1.5kbDNAを含有する画分を沈殿さ
せ、ラムダ−L47.1のHind III腕（arms）内へ連結した
（18参照）。
ので、LAVに感染した細胞から得たプロウイルスDNAをHi
nd IIIで部分消化することによりLAVゲノムをクローン
化することにした。（ａ）部分消化すると完全なクロー
ンを単離する機会が増大すること、および（ｂ）Hind I
II断片はラムダ置換ベクター（lambda replacement vec
tors）中で容易にクローン化されることが判明した。健
常ドナーから得インビトロで（in vitro）LAVに感染さ
せた後のＴ細胞から単離したDNAをHind IIIで部分消化
して分画した。９±1.5kbDNAを含有する画分を沈殿さ
せ、ラムダ−L47.1のHind III腕（arms）内へ連結した
（18参照）。
LAVゲノムDNAのクローニングはさらに詳細には次のよ
うにして行なつた。
うにして行なつた。
cDNAを上述のようにLAVに感染したＴ細胞から調製し
た後、Hind IIIで部分的に消化し、10mM Tris Cl（pH
8）,10mM EDTA,1M NaCl中５〜40％のシユクロース勾配
上で分画した（SW41ローター,40,000rpmで16時間）。単
一画分（９±0.5kb）をキヤリヤーとしてのDextran T40
20μg/mlで沈殿させ、TEバツフアー（10mM Tris.Cl,pH
8,1mM EDTM）中に取つた。λ−L47.1 Hind III腕は、
先ずcos部位を連結した後Hind IIIで消化し５〜40％の
シユクロース勾配を通して分画して調製した。λ−Hind
III腕のみを含有する画分をプールし、沈殿させ、TE−
バツフアーに取つた。この腕とDNAの連結は、3:1過剰モ
ル濃度の腕と300単位のT4DNAリガーゼ（Biolabs）とを
用いてDANほぼ200μg/mlで行なつた。溶解物（lysate
s）のin vitroパツク組立（packaging）は（38）に従つ
て行なつた。in vitroパツク組立後このフアージの溶菌
物（lysate）をC600recBC株上のNM538の上にプレートア
ウトした。ニトロセルロースフイルターを用いたin sit
uハイブリダイゼーシヨン（39参照）によつて約２百万
のプラークをスクリーニングした。ハイブリダイゼーシ
ヨンは１×Denhardt溶液、0.5％SDS,2×SSC,2mM EDTAの
中68℃で行なつた。プローブはpLAV13の32Pでニツク翻
訳したLAVインサーとであつた（＞108cpm/μｇ）。フイ
ルターを68℃の０−1SSC,0.1％SDS中30分間で２回洗浄
し、Kodak XAR−５フイルムに29〜40時間露出した。陽
性のクローンを７個同定し、C600rec BC株上でプラーク
を精製した。液体培養し、組換えフアージをCsCl中にバ
ンド分けした。フアージDNAを抽出し、適当な条件下で
消化した。
た後、Hind IIIで部分的に消化し、10mM Tris Cl（pH
8）,10mM EDTA,1M NaCl中５〜40％のシユクロース勾配
上で分画した（SW41ローター,40,000rpmで16時間）。単
一画分（９±0.5kb）をキヤリヤーとしてのDextran T40
20μg/mlで沈殿させ、TEバツフアー（10mM Tris.Cl,pH
8,1mM EDTM）中に取つた。λ−L47.1 Hind III腕は、
先ずcos部位を連結した後Hind IIIで消化し５〜40％の
シユクロース勾配を通して分画して調製した。λ−Hind
III腕のみを含有する画分をプールし、沈殿させ、TE−
バツフアーに取つた。この腕とDNAの連結は、3:1過剰モ
ル濃度の腕と300単位のT4DNAリガーゼ（Biolabs）とを
用いてDANほぼ200μg/mlで行なつた。溶解物（lysate
s）のin vitroパツク組立（packaging）は（38）に従つ
て行なつた。in vitroパツク組立後このフアージの溶菌
物（lysate）をC600recBC株上のNM538の上にプレートア
ウトした。ニトロセルロースフイルターを用いたin sit
uハイブリダイゼーシヨン（39参照）によつて約２百万
のプラークをスクリーニングした。ハイブリダイゼーシ
ヨンは１×Denhardt溶液、0.5％SDS,2×SSC,2mM EDTAの
中68℃で行なつた。プローブはpLAV13の32Pでニツク翻
訳したLAVインサーとであつた（＞108cpm/μｇ）。フイ
ルターを68℃の０−1SSC,0.1％SDS中30分間で２回洗浄
し、Kodak XAR−５フイルムに29〜40時間露出した。陽
性のクローンを７個同定し、C600rec BC株上でプラーク
を精製した。液体培養し、組換えフアージをCsCl中にバ
ンド分けした。フアージDNAを抽出し、適当な条件下で
消化した。
このように、ニツク翻訳したpLAV 13インサートをプ
ローブとして用いたin situスクリーニングによつて約
２百万のフアージプラークから７個の別々のクローンが
得られた。λ−J19の制限地図をHind III多型性のλ−J
81の制限地図と共に第２図に示す。他の組換えλ−J2
7、λ−J31およびλ−J57はλ−J19と同じHind III地図
を示した。λ−J81の地図は同様であるが約5550の座標
の所に余分なHind III部位がある。
ローブとして用いたin situスクリーニングによつて約
２百万のフアージプラークから７個の別々のクローンが
得られた。λ−J19の制限地図をHind III多型性のλ−J
81の制限地図と共に第２図に示す。他の組換えλ−J2
7、λ−J31およびλ−J57はλ−J19と同じHind III地図
を示した。λ−J81の地図は同様であるが約5550の座標
の所に余分なHind III部位がある。
第２図の制限地図はブロツトをpLAV13DNAに対してハ
イブリダイスすることで方向を決定した。
イブリダイスすることで方向を決定した。
LAV13cDNAクローンの制限地図も第２図に示してあ
る。λ−J19の制限部位はＢがBam H I,BgがBgl II、Ｈ
がHind III,KがKpn I.PがPst I,RがEco R I,SがSac I,S
aがSal I,XがXho Iである。目盛り（スケール）の下に
はレトロウイルスの一般的な構造の概略図があり、これ
にはLTRの要素U3,RおよびU5が示されている。R/US境界
のみがはつきり決められており、他の境界は単に比ゆ的
に図示しただけである。
る。λ−J19の制限部位はＢがBam H I,BgがBgl II、Ｈ
がHind III,KがKpn I.PがPst I,RがEco R I,SがSac I,S
aがSal I,XがXho Iである。目盛り（スケール）の下に
はレトロウイルスの一般的な構造の概略図があり、これ
にはLTRの要素U3,RおよびU5が示されている。R/US境界
のみがはつきり決められており、他の境界は単に比ゆ的
に図示しただけである。
λ−J19の５′の0.52kbHind III断片中には他のBam H
I部位があるかもしれない。これらの部位は小さ過ぎて
検出できない断片を生ずる。
I部位があるかもしれない。これらの部位は小さ過ぎて
検出できない断片を生ずる。
第２図はまた、λ−J19とλ−J81のHind III断片のう
ちpLAV13で検出されるものを（＋）として検出されない
ものを（−）として示している。
ちpLAV13で検出されるものを（＋）として検出されない
ものを（−）として示している。
さらに詳細にみると、λ−J19には４つのHind IIIバ
ンド、すなわち6.7kb、1.45kb、0.6kbおよび0.52kbのバ
ンドがあり、これらの最初の２つがHind IIIで制限した
DANのゲノムブロツト中にあるバンドに対応する。最小
の0.6kbと0.52kbのバンドはゲノムブロツト内にはみら
れなかつたが、これらが独立に得られた分析クローンの
全てに現われるという事実は、LAVのプロウイルスDNAの
ランダムな組み込みを仮定すると、これらのバンドが内
部断片に相当するもので接合断片（junction fragment
s）ではないということを示唆している。実際、0.5kbバ
ンドはpLAV13の小さいHind III−Pst I断片を介してpLA
V13DNAとハイブリダイズする（第２図）。すなわちλ−
J19の0.5kb Hind III断片はLTR内部のＲ−U5接合部（ju
nction）を含有している。
ンド、すなわち6.7kb、1.45kb、0.6kbおよび0.52kbのバ
ンドがあり、これらの最初の２つがHind IIIで制限した
DANのゲノムブロツト中にあるバンドに対応する。最小
の0.6kbと0.52kbのバンドはゲノムブロツト内にはみら
れなかつたが、これらが独立に得られた分析クローンの
全てに現われるという事実は、LAVのプロウイルスDNAの
ランダムな組み込みを仮定すると、これらのバンドが内
部断片に相当するもので接合断片（junction fragment
s）ではないということを示唆している。実際、0.5kbバ
ンドはpLAV13の小さいHind III−Pst I断片を介してpLA
V13DNAとハイブリダイズする（第２図）。すなわちλ−
J19の0.5kb Hind III断片はLTR内部のＲ−U5接合部（ju
nction）を含有している。
λ−J81はλ−J19の制限部位多型現象であると思われ
る。λ−J81には4.3kb、2.3kb、1.45kb、0.6kbおよび0.
52kbの５種のHind IIIバンドがある。この2.3kbバンド
はpLAV13プローブによるゲノムブロツトで容易に検出さ
れるが、4.3kb断片は検出されない。λ−J81がHind III
多型現象の１つであり組換えウイルスではないというこ
とは、ニツク翻訳したλ−J19DNAが緊縮ハイブリダイゼ
ーシヨンおよび洗浄条件下でλ−J81の５つのHind III
バンド全てとハイブリダイズするという事実によつて示
される。また、λ−J81内のその他の制限部位はλ−J19
と同一である。
る。λ−J81には4.3kb、2.3kb、1.45kb、0.6kbおよび0.
52kbの５種のHind IIIバンドがある。この2.3kbバンド
はpLAV13プローブによるゲノムブロツトで容易に検出さ
れるが、4.3kb断片は検出されない。λ−J81がHind III
多型現象の１つであり組換えウイルスではないというこ
とは、ニツク翻訳したλ−J19DNAが緊縮ハイブリダイゼ
ーシヨンおよび洗浄条件下でλ−J81の５つのHind III
バンド全てとハイブリダイズするという事実によつて示
される。また、λ−J81内のその他の制限部位はλ−J19
と同一である。
LAV由来cDNAの配列決定 フアージ組換え体に対し特に重要な部位の配列決定を
行なつた。
行なつた。
クローンλJ19の組換えフアージDNA全体をDEININGER
（1983）,Analytical Biochem.,129,216のプロトコル
（手順）に従つて超音波処理した。このDNAをクレノウ
（Klenow）反応によつて16℃で12時間修復した。DNAを
0.8％アガロースゲル中に電気泳動させ、300〜600bpの
サイズ範囲のDNAを切出し、電気溶出し、沈殿させた。D
NAを（10mM Tris,pH8,0.1mM EDTA中に）再懸濁し、T4DN
AおよびRNA−リガーゼ（ManiatisTら（1982）,Molecula
r cloning,Cold Spring Harbor Laboratory）を用い
て、（制限酵素Sma Iで切断した後アルカリ性ホスフア
ターゼ処理をした）M13mp8RF DNA中に連結した。TG1と
名付けたＥ.coli株を用いて以下の研究を行なつた。こ
の株の遺伝子型はΔlac pro,supE,thi.F′traD36,proA
B,lac Iq,ZΔM15,r-である。
（1983）,Analytical Biochem.,129,216のプロトコル
（手順）に従つて超音波処理した。このDNAをクレノウ
（Klenow）反応によつて16℃で12時間修復した。DNAを
0.8％アガロースゲル中に電気泳動させ、300〜600bpの
サイズ範囲のDNAを切出し、電気溶出し、沈殿させた。D
NAを（10mM Tris,pH8,0.1mM EDTA中に）再懸濁し、T4DN
AおよびRNA−リガーゼ（ManiatisTら（1982）,Molecula
r cloning,Cold Spring Harbor Laboratory）を用い
て、（制限酵素Sma Iで切断した後アルカリ性ホスフア
ターゼ処理をした）M13mp8RF DNA中に連結した。TG1と
名付けたＥ.coli株を用いて以下の研究を行なつた。こ
の株の遺伝子型はΔlac pro,supE,thi.F′traD36,proA
B,lac Iq,ZΔM15,r-である。
このＥ.coli TGI株の特有の性質によつて組換え体を
容易に識別できる。LAV DNAの断片で組み換えなかつた
プラスミドによつてトランスフエクトされた細胞の青色
は変化しない。逆に、LAV DNA断片を含有する組換えプ
ラスミドでトランスフエクトした細胞は白色のコロニー
となる。用いた方法はGene（1983），26,101に開示され
ている。
容易に識別できる。LAV DNAの断片で組み換えなかつた
プラスミドによつてトランスフエクトされた細胞の青色
は変化しない。逆に、LAV DNA断片を含有する組換えプ
ラスミドでトランスフエクトした細胞は白色のコロニー
となる。用いた方法はGene（1983），26,101に開示され
ている。
Hanahan法（Hanahan D（1983）,J.Mol.Biol.,166,55
7）を用い、この菌株を連結混合物で形質転換した。軟
アガロース中にIPTGとＸ−galを有するトリプトン−ア
ガロースプレート上にプレートアウトした。白色のプラ
ークを摘出した後かまたは直接in situでニトロセルロ
ースフイルターを用いてスクリーニングした。これらプ
ラークのDNAはλJ19のpUC18Hind IIIサブクローンのDAN
インサートをニツク翻訳したものとハイブリダイズし
た。これによつて後記表に示すλのプラスミドまたはサ
ブクローンの単離が可能になつた。この表に関して、各
プラスミドの表示の後ろに各各のプラスミドを含有する
Ｅ.coil TGIの培養細胞をフランス、パリのPasteur Ins
tituteの“Collection Nationale des Cultures de Mic
ro−organismes"（C.N.C.M）に寄託した番号も示されて
いることに注意されたい。形質転換してないTGI細胞株
も番号Ｉ−364でC.N.C.M.に寄託した。これらの寄託は
全て1984年11月15日付で行なつた。LAVゲノムから得ら
れた対応するインサートのサイズも一緒に示す。
7）を用い、この菌株を連結混合物で形質転換した。軟
アガロース中にIPTGとＸ−galを有するトリプトン−ア
ガロースプレート上にプレートアウトした。白色のプラ
ークを摘出した後かまたは直接in situでニトロセルロ
ースフイルターを用いてスクリーニングした。これらプ
ラークのDNAはλJ19のpUC18Hind IIIサブクローンのDAN
インサートをニツク翻訳したものとハイブリダイズし
た。これによつて後記表に示すλのプラスミドまたはサ
ブクローンの単離が可能になつた。この表に関して、各
プラスミドの表示の後ろに各各のプラスミドを含有する
Ｅ.coil TGIの培養細胞をフランス、パリのPasteur Ins
tituteの“Collection Nationale des Cultures de Mic
ro−organismes"（C.N.C.M）に寄託した番号も示されて
いることに注意されたい。形質転換してないTGI細胞株
も番号Ｉ−364でC.N.C.M.に寄託した。これらの寄託は
全て1984年11月15日付で行なつた。LAVゲノムから得ら
れた対応するインサートのサイズも一緒に示す。
表 組換えプラスミドの基本的特徴 −pJ19−１プラスミド （Ｉ−365）Hind III−Sac I−
Hind III 0.5kb −pJ19−17プラスミド （Ｉ−367）Hind III−Pst 1−
Hind III 0.6kb −pJ19−６プラスミド （Ｉ−366） 1.5kb Hind III（５′） Bam H I Xho I Kpn I Bgl II Sac I（３′） Hind III −pJ19−13プラスミド （Ｉ−368） 6.7kb Hind III（５′） Bgl II Kpn I Kpn I Eco R I Eco R I Sal I Kpn I Bgl II Bgl II Hind III（３′） 正にハイブリダイズするM13フアージプレートを５時
間増殖させ、一本鎖DNAを抽出した。
Hind III 0.5kb −pJ19−17プラスミド （Ｉ−367）Hind III−Pst 1−
Hind III 0.6kb −pJ19−６プラスミド （Ｉ−366） 1.5kb Hind III（５′） Bam H I Xho I Kpn I Bgl II Sac I（３′） Hind III −pJ19−13プラスミド （Ｉ−368） 6.7kb Hind III（５′） Bgl II Kpn I Kpn I Eco R I Eco R I Sal I Kpn I Bgl II Bgl II Hind III（３′） 正にハイブリダイズするM13フアージプレートを５時
間増殖させ、一本鎖DNAを抽出した。
Sangerらによつて改良されたジデオキシ法および技法
（Sangerら（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463
およびM13 Cloning and sequencing handbook,AMERSHAM
（1983））に従つてλJ19DNAのM13mp8サブクローンの配
列決定をした。17量体のオリゴヌクレオチドプライマー
α−35SdATP（400Ci/mmol,AMERSHAM），および0.5X−5X
バツフアー勾配ゲル（Biggen M.D.ら（1983）,Pro.Nat
l.Acad.Sci.USA,50,3963）を用いた。ゲルを読み取り、
Stadenのプログラム（Staden R.（1982）,Nucl.Acids R
es.,10,4731）を組み込んだコンピユーターに入力し
た。適当な参考文献と方法は全てAMERSHAM M13 Cloning
and sequencing handbook中に書いてある。
（Sangerら（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463
およびM13 Cloning and sequencing handbook,AMERSHAM
（1983））に従つてλJ19DNAのM13mp8サブクローンの配
列決定をした。17量体のオリゴヌクレオチドプライマー
α−35SdATP（400Ci/mmol,AMERSHAM），および0.5X−5X
バツフアー勾配ゲル（Biggen M.D.ら（1983）,Pro.Nat
l.Acad.Sci.USA,50,3963）を用いた。ゲルを読み取り、
Stadenのプログラム（Staden R.（1982）,Nucl.Acids R
es.,10,4731）を組み込んだコンピユーターに入力し
た。適当な参考文献と方法は全てAMERSHAM M13 Cloning
and sequencing handbook中に書いてある。
λJ19の完全な配列を第５〜12図に示す。
他のヒトレトロウイルスとの関係 HTLV−ＩとHTLV−IIはＴ細胞サブセツトであるOKT4に
対する指向性をもつた１対のＣ−タイプ形質転換型レト
ロウイルスを構成している（20参照）。単離したHTLV−
Ｉは全配列が決定されており（21参照）、HTLV−IIの部
分配列も決定・報告されている（22〜24参照）。どちら
のゲノム（LTR1個）も長さが約8.3kbであり、pX領域を
有しており、広い範囲で配列に相同性がある。これらの
ゲノムはかなり緊縮な条件（40％ホルムアミド,5XSSC）
下でお互いにハイブリダイズし、しかもpX領域は60％ホ
ルムアミドでさえハイブリダイズする。（26参照）。し
たがつて、保存されたpX領域はこの類のウイルスの極立
つた特徴である。
対する指向性をもつた１対のＣ−タイプ形質転換型レト
ロウイルスを構成している（20参照）。単離したHTLV−
Ｉは全配列が決定されており（21参照）、HTLV−IIの部
分配列も決定・報告されている（22〜24参照）。どちら
のゲノム（LTR1個）も長さが約8.3kbであり、pX領域を
有しており、広い範囲で配列に相同性がある。これらの
ゲノムはかなり緊縮な条件（40％ホルムアミド,5XSSC）
下でお互いにハイブリダイズし、しかもpX領域は60％ホ
ルムアミドでさえハイブリダイズする。（26参照）。し
たがつて、保存されたpX領域はこの類のウイルスの極立
つた特徴である。
我々はクローン化したLAV DNAとクローン化したHTLV
−II DNA（pMO、27参照）とをブロツト−ハイブリダイ
ゼーシヨンで比較し、ハイブリダイゼーシヨンおよび洗
浄の低緊縮条件下ではクロス−ハイブリダイゼーシヨン
が全く起こらないことを見出した。たとえば、Hind III
で消化したλ−J19、λ−J27およびλ−J81を電気泳動
させ、ブロツトし、32P−ニツク翻訳したpMO（HTLV−I
I）DNA（比活性は0.5×108cpm/μｇより大）と、20％ホ
ルムアミド、５×SSC、１×Denhardts溶液、10％Dextra
nsulphate（硫酸デキストラン）中37℃で一晩ハイブリ
ダイズさせた。HLTV−Ｉ配列（21）から得た5.31％GC含
量を用いて37℃（tm.50）tm.50でフイルターを洗浄し
た。洗浄を50℃と65℃、１×SSK、0.1％SDS中で繰り返
した。20％ホルムアミド、８×SSC（tm.50）中でハイブ
リダイズさせ、２×SSC（tm.50）中37℃で洗浄した場合
でさえ、増感スクリーンを用いて−70℃で２日露光した
後でもハイブリダイゼーシヨンは全く検出されなかつ
た。
−II DNA（pMO、27参照）とをブロツト−ハイブリダイ
ゼーシヨンで比較し、ハイブリダイゼーシヨンおよび洗
浄の低緊縮条件下ではクロス−ハイブリダイゼーシヨン
が全く起こらないことを見出した。たとえば、Hind III
で消化したλ−J19、λ−J27およびλ−J81を電気泳動
させ、ブロツトし、32P−ニツク翻訳したpMO（HTLV−I
I）DNA（比活性は0.5×108cpm/μｇより大）と、20％ホ
ルムアミド、５×SSC、１×Denhardts溶液、10％Dextra
nsulphate（硫酸デキストラン）中37℃で一晩ハイブリ
ダイズさせた。HLTV−Ｉ配列（21）から得た5.31％GC含
量を用いて37℃（tm.50）tm.50でフイルターを洗浄し
た。洗浄を50℃と65℃、１×SSK、0.1％SDS中で繰り返
した。20％ホルムアミド、８×SSC（tm.50）中でハイブ
リダイズさせ、２×SSC（tm.50）中37℃で洗浄した場合
でさえ、増感スクリーンを用いて−70℃で２日露光した
後でもハイブリダイゼーシヨンは全く検出されなかつ
た。
このように、LAVとHTLVウイルスの間の関係を示す分
子的な証拠はない。また、HTLVウイルスが8.3kbである
のに対しLAVゲノムはほぼ9kbの長さである。ゲノムサイ
ズが近いにもかかわらず、LAVとビスナ（Visna.29参
照）のクローン化したウイルスゲノムはクロスハイブリ
ダイズすることはなく、非緊縮条件（ハイブリダイゼー
シヨン 20％ホルムアミド、8SSC、37℃；洗浄 2SSC、0.
1％SDS、37℃）でLAVと多くのヒト内因性ウイルスゲノ
ム（30参照）とのハイブリダイゼーシヨンが起こること
もない。
子的な証拠はない。また、HTLVウイルスが8.3kbである
のに対しLAVゲノムはほぼ9kbの長さである。ゲノムサイ
ズが近いにもかかわらず、LAVとビスナ（Visna.29参
照）のクローン化したウイルスゲノムはクロスハイブリ
ダイズすることはなく、非緊縮条件（ハイブリダイゼー
シヨン 20％ホルムアミド、8SSC、37℃；洗浄 2SSC、0.
1％SDS、37℃）でLAVと多くのヒト内因性ウイルスゲノ
ム（30参照）とのハイブリダイゼーシヨンが起こること
もない。
本発明はまた、さらに特定的には本発明によるDNA断
片のいずれかから出発して作製することができるクロー
ン化プローブにも係り、したがつてこのような断片を含
有する組換えDNA特に原核または真核細胞中で増幅でき
前記の断片を担持しているあらゆるプラスミドにも係
る。既に述べたように好ましいDNA断片はLAV13である。
片のいずれかから出発して作製することができるクロー
ン化プローブにも係り、したがつてこのような断片を含
有する組換えDNA特に原核または真核細胞中で増幅でき
前記の断片を担持しているあらゆるプラスミドにも係
る。既に述べたように好ましいDNA断片はLAV13である。
クローン化したプロウイルスDNAを放射性核種か蛍光
試薬のいずれかで標識することにより分子ハイブリダイ
ゼーシヨンプローブとして用いるとLAVビニオンRNAを、
血液、体液および（たとえば第VIII因子濃縮物のような
抗血友病因子の）血液製剤ならびにワクチンすなわちＢ
型肝炎ワクチン中で直接検出しうる。LAV産生細胞の培
養上清中でウイルス全体が検出できることは既に示され
ている。その検出を達成する適切な方法は、前記の如き
担体たとえばニトロセルロースフイルター等にウイルス
を固定し、ビリオンを破砕し、標識（放射標識または
「冷い（cold）」蛍光もしくは酵素標識）したプローブ
とハイブリダイズすることである。このような方法は既
に、末梢血中のＢ型肝炎ウイルスの場合について（SCOT
TO,J.ら,Hepatology（1983），３,379−384に従つて）
開発されている。
試薬のいずれかで標識することにより分子ハイブリダイ
ゼーシヨンプローブとして用いるとLAVビニオンRNAを、
血液、体液および（たとえば第VIII因子濃縮物のような
抗血友病因子の）血液製剤ならびにワクチンすなわちＢ
型肝炎ワクチン中で直接検出しうる。LAV産生細胞の培
養上清中でウイルス全体が検出できることは既に示され
ている。その検出を達成する適切な方法は、前記の如き
担体たとえばニトロセルロースフイルター等にウイルス
を固定し、ビリオンを破砕し、標識（放射標識または
「冷い（cold）」蛍光もしくは酵素標識）したプローブ
とハイブリダイズすることである。このような方法は既
に、末梢血中のＢ型肝炎ウイルスの場合について（SCOT
TO,J.ら,Hepatology（1983），３,379−384に従つて）
開発されている。
本発明のプローブはまた、LAV関連症状を示している
患者の組織から得たゲノムDNAの迅速なスクリーニング
に使用してプロウイルスDNAまたはRNAが宿主組織および
その他の組織中に存在するかどうかを検べることもでき
る。
患者の組織から得たゲノムDNAの迅速なスクリーニング
に使用してプロウイルスDNAまたはRNAが宿主組織および
その他の組織中に存在するかどうかを検べることもでき
る。
このようなスクリーニングに使用できる方法は次のス
テツプからなる。すなわち、組織からのDNAの抽出、こ
のDNAの制限酵素開裂、断片の電気泳動および組織から
のゲノムDNAのサザンブロツテイング、その後の標識ク
ローン化LAVプロウイルスDNAとのハイブリダイゼーシヨ
ンである。in situハイブリダイゼーシヨンも使用でき
る。
テツプからなる。すなわち、組織からのDNAの抽出、こ
のDNAの制限酵素開裂、断片の電気泳動および組織から
のゲノムDNAのサザンブロツテイング、その後の標識ク
ローン化LAVプロウイルスDNAとのハイブリダイゼーシヨ
ンである。in situハイブリダイゼーシヨンも使用でき
る。
また、ヒト、霊長目その他の哺乳類の種のリンパ液や
リンパ組織およびその他の非リンパ組織を別の進化上関
連したレトロウイルスが存在するかどうか検討するため
にスクリーニングすることもできる。上述の方法が使用
できるがハイブリタイゼーシヨンと洗浄は非緊縮条件下
で行なわれるであろう。
リンパ組織およびその他の非リンパ組織を別の進化上関
連したレトロウイルスが存在するかどうか検討するため
にスクリーニングすることもできる。上述の方法が使用
できるがハイブリタイゼーシヨンと洗浄は非緊縮条件下
で行なわれるであろう。
本発明のDNAは診断目的用のLAVウイルス抗原の発現を
達成するためにと、もちろんLAVに対するワクチンの製
造にも使用できる。この点特に有利なのはコア（gag領
域）およびエンベロープタンパク質をコードしているDN
A断片、特にKpn I（6100）からBgl II（9150）まで延び
るDNA断片である。
達成するためにと、もちろんLAVに対するワクチンの製
造にも使用できる。この点特に有利なのはコア（gag領
域）およびエンベロープタンパク質をコードしているDN
A断片、特にKpn I（6100）からBgl II（9150）まで延び
るDNA断片である。
このために使用できる方法は多様である。
ａ） DNAは様々な技法、たとえばリン酸カルシウム沈
殿、ポリエチレングリコール，プロトプラスト−融合、
等によつて適当な選択マーカーをもつた哺乳動物細胞中
にトランスフエクトすることができる。
殿、ポリエチレングリコール，プロトプラスト−融合、
等によつて適当な選択マーカーをもつた哺乳動物細胞中
にトランスフエクトすることができる。
ｂ） 遺伝子に対応するDAN断片をＥ.coli、酵母または
哺乳類の細胞用の発現ベクター中でクローン化し、得ら
れたタンパク質を精製することができる。
哺乳類の細胞用の発現ベクター中でクローン化し、得ら
れたタンパク質を精製することができる。
ｃ） プロウイルスDNAを「シヨツトガンによつて（断
片化して）」原核生物発現ベクター中に導入して融合ポ
リペプチドを生成させることができる。抗原性のある融
合タンパク質を産生する組換え体はこの組換え体をLAV
抗原に対する抗体で単にスクリーニングするだけで同定
できる。
片化して）」原核生物発現ベクター中に導入して融合ポ
リペプチドを生成させることができる。抗原性のある融
合タンパク質を産生する組換え体はこの組換え体をLAV
抗原に対する抗体で単にスクリーニングするだけで同定
できる。
ｄ） 本発明はまた、免疫原と抗原を産生すべくLAV抗
原−遺伝子のDNA配列から推定され、化学的に合成でき
るオリゴペプチドにも係る。
原−遺伝子のDNA配列から推定され、化学的に合成でき
るオリゴペプチドにも係る。
上記（ａ〜ｄ）は全て診断において許容されない系を
用いて産生されるウイルス粒子をもたない、したがつて
生物学的危険がほとんどまたは全くない免疫原または抗
原の入手源として使用できる。
用いて産生されるウイルス粒子をもたない、したがつて
生物学的危険がほとんどまたは全くない免疫原または抗
原の入手源として使用できる。
さらに本発明は上述の組換え体で形質転換され、前記
DNA断片を発現することができる宿主（原核または真核
細胞）に係る。
DNA断片を発現することができる宿主（原核または真核
細胞）に係る。
最後に本発明は、活性成分を発現された抗原、すなわ
ち抗原全体、融合ポリペプチドまたはオリゴペプチドか
ら成るようなワクチン組成物にも係る。
ち抗原全体、融合ポリペプチドまたはオリゴペプチドか
ら成るようなワクチン組成物にも係る。
本発明は最後に、LAVウイルス群から抽出するかまた
はcDNAか再度合成することができる精製ゲノムmRNA、特
に大きさがほぼ9.1〜9.2kbで上記に定義したDNA断片の
いずれかにハイブリダイズできる精製mRNA、あるいは前
記精製mRNAの一部に関する。また本発明は前記RNAの一
部分にも係る。この精製RNAまたはその一部分のヌクレ
オチド構造は実際関連cDNAのヌクレオチド配列から推定
することができる。
はcDNAか再度合成することができる精製ゲノムmRNA、特
に大きさがほぼ9.1〜9.2kbで上記に定義したDNA断片の
いずれかにハイブリダイズできる精製mRNA、あるいは前
記精製mRNAの一部に関する。また本発明は前記RNAの一
部分にも係る。この精製RNAまたはその一部分のヌクレ
オチド構造は実際関連cDNAのヌクレオチド配列から推定
することができる。
最後に、ラムダ−J19とラムダ−J81は1984年９月11日
付でそれぞれ番号Ｉ−338とＩ−339をもつてPasteur
（フランス）のINSTITUT PASTEURのCollection Nationa
le des Cultures de Micro−organismes（C.N.C.M）に
寄託されていることに言及しておく。
付でそれぞれ番号Ｉ−338とＩ−339をもつてPasteur
（フランス）のINSTITUT PASTEURのCollection Nationa
le des Cultures de Micro−organismes（C.N.C.M）に
寄託されていることに言及しておく。
終りに本発明は、そのDNA配列を決定してウイルスタ
ンパク質（抗原）のアミノ酸配列の予知に使用すること
ができるようなゲノムDNA、およびcDNAから誘導するこ
とができるRNAプローブに関する。
ンパク質（抗原）のアミノ酸配列の予知に使用すること
ができるようなゲノムDNA、およびcDNAから誘導するこ
とができるRNAプローブに関する。
本明細書を通じてかつこで括つた数で参照して来た参
考文献の目録を次に挙げる。
考文献の目録を次に挙げる。
次の目録で参照されている刊行物は全て引用によつて
ここに含まれるものとする。
ここに含まれるものとする。
参考文献 1.Barr−Sinoussi,F.et al.Science 220,868−871（1
983）． 2.Montagnier,L.et al.in Human T−cell LeuKemia Vir
uses（eds.R.C.Gallo,M.Essex and L.Gross）p.363−37
9（Cold Spring Harbor,New−York,1984）． ３ Vilmer,E.et al.Lancet,ii,753−757（1984）． ４ Ellrodt,A.et al.Lancet,i,1383−1385（1984）． ５ Feorino,M.P.et al.Science,225,69−72（1984）． ６ Klatzmann.D.et al.Science,225,59−63（1984）． ７ Montagnier,L.et.al.Science,885,63−66（198
4）． ８ Brun−Ｖzinet,F.et al.Lancet,i,1253−1256（1
984）． ９ Kalyanaraman,V.S.et al.Science,225,321−323（1
984）． 10 Brun−Ｖzinet,F.et al.Science in Press. 11 Montagnier,L.,Barr−Sinoussi,F.and Chermann,
J.C.in Prog.Immunodef.Res.Therapy,I,（eds,C.Grisce
lli and J.Vossen）p.367−372（Excerpta Medica,Amst
erdam,1984）． 12 Popovic,M.,Sarngadharan,M.G.,Read,E.and Gall
o,R.C.Science,224,497−500（1984）． 13 Gallo,et al.Science,224,500−503（1984）． 14 Schpbach,J.et al.Science,224,503−505（198
4）． 15 Sarngadharan,M.G.,Popovic,M.,Bruch,L.,Schpba
ch,J.and Gallo,R.C.Science,224,506−508（1984）． 16 Levy,J.A.et al.Science,225,840−842（1984）． 17 Gubler,U.,and Hoffman,B.J.Gene,25,263−269（19
83）． 18 Loenen,W.A.M.and Brammar,W.J.Gene,10,249−259
（1980）． 19 Fujiyama,A.et al.Nuc.Acids.Res.,11,4601−4610
（1983）． 20 Gallo,R.C.et al.Proc Natl.Acad.Sci.USA,79,5680
−5683（1982）． 21 Seiki,M.,Hattori,S.,Hirayama,Y.and Yoshida,M.P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,80,3618−3622（1983）． 22 Haseltine,W.A.et al.Science,225,419−421（198
4）． 23 Sodroski,J.et al.Science,225,421−424（198
4）． 24 Shimotohno,K.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,in p
ress. 25 Chen,I.S.Y,Mc Laughlin,J.,Gasson,J.C.,Clark,S.
C.and Golde,D.W.Nature,305,502−505（1983）． 26 Shaw,G.M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4544
−4548（1984）． 27 Gelmann,E.P.,Franchini,G.,Manzari,V.,Wong−Sta
al,F.and Gallo,R.C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,993−
997（1984）． 28 Arya,S.K.et al.Science,225,927−930（1984）． 29 Harri,J.D.et al.Virology,113,573−583（198
1）． 30 Steele,P.E.,Rabson,A.B.,Bryan,T.and Martin,M.
A.Science,225,943−947（1984）． 31 Montagnier,L.et al.Ann.Virol.（Institut Pasteu
r）,135 E,119−134（1984）． 32 Lenz,J.et al.Nature,308,467−470（1984）． 33 Chen,I.S.Y.,Mc Laughlin,J.and Golde,D.W.Natur
e,309,276−279（1984）． 34 Soberon,X.,Covarrubias,L.and Bolivar,F.Gene,9,
287−305（1980）． 35 Grunstein,M.and Hognhess,D.Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,72,3961−3965（1975）． 36 Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulsen,A.R.Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,79,5463−5476（1977）． 37 Southern,E.M.J.Mol.Biol.,98,503−517（1975）． 38 Ish−Horowicz,D.and Burke,J.F.Nucl.Acids Res.,
9,2989−2998（1981）． 39 Benton,W.D.and Davis,R.W.Science,196,180−182
（1977）．
983）． 2.Montagnier,L.et al.in Human T−cell LeuKemia Vir
uses（eds.R.C.Gallo,M.Essex and L.Gross）p.363−37
9（Cold Spring Harbor,New−York,1984）． ３ Vilmer,E.et al.Lancet,ii,753−757（1984）． ４ Ellrodt,A.et al.Lancet,i,1383−1385（1984）． ５ Feorino,M.P.et al.Science,225,69−72（1984）． ６ Klatzmann.D.et al.Science,225,59−63（1984）． ７ Montagnier,L.et.al.Science,885,63−66（198
4）． ８ Brun−Ｖzinet,F.et al.Lancet,i,1253−1256（1
984）． ９ Kalyanaraman,V.S.et al.Science,225,321−323（1
984）． 10 Brun−Ｖzinet,F.et al.Science in Press. 11 Montagnier,L.,Barr−Sinoussi,F.and Chermann,
J.C.in Prog.Immunodef.Res.Therapy,I,（eds,C.Grisce
lli and J.Vossen）p.367−372（Excerpta Medica,Amst
erdam,1984）． 12 Popovic,M.,Sarngadharan,M.G.,Read,E.and Gall
o,R.C.Science,224,497−500（1984）． 13 Gallo,et al.Science,224,500−503（1984）． 14 Schpbach,J.et al.Science,224,503−505（198
4）． 15 Sarngadharan,M.G.,Popovic,M.,Bruch,L.,Schpba
ch,J.and Gallo,R.C.Science,224,506−508（1984）． 16 Levy,J.A.et al.Science,225,840−842（1984）． 17 Gubler,U.,and Hoffman,B.J.Gene,25,263−269（19
83）． 18 Loenen,W.A.M.and Brammar,W.J.Gene,10,249−259
（1980）． 19 Fujiyama,A.et al.Nuc.Acids.Res.,11,4601−4610
（1983）． 20 Gallo,R.C.et al.Proc Natl.Acad.Sci.USA,79,5680
−5683（1982）． 21 Seiki,M.,Hattori,S.,Hirayama,Y.and Yoshida,M.P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,80,3618−3622（1983）． 22 Haseltine,W.A.et al.Science,225,419−421（198
4）． 23 Sodroski,J.et al.Science,225,421−424（198
4）． 24 Shimotohno,K.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,in p
ress. 25 Chen,I.S.Y,Mc Laughlin,J.,Gasson,J.C.,Clark,S.
C.and Golde,D.W.Nature,305,502−505（1983）． 26 Shaw,G.M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4544
−4548（1984）． 27 Gelmann,E.P.,Franchini,G.,Manzari,V.,Wong−Sta
al,F.and Gallo,R.C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,993−
997（1984）． 28 Arya,S.K.et al.Science,225,927−930（1984）． 29 Harri,J.D.et al.Virology,113,573−583（198
1）． 30 Steele,P.E.,Rabson,A.B.,Bryan,T.and Martin,M.
A.Science,225,943−947（1984）． 31 Montagnier,L.et al.Ann.Virol.（Institut Pasteu
r）,135 E,119−134（1984）． 32 Lenz,J.et al.Nature,308,467−470（1984）． 33 Chen,I.S.Y.,Mc Laughlin,J.and Golde,D.W.Natur
e,309,276−279（1984）． 34 Soberon,X.,Covarrubias,L.and Bolivar,F.Gene,9,
287−305（1980）． 35 Grunstein,M.and Hognhess,D.Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,72,3961−3965（1975）． 36 Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulsen,A.R.Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,79,5463−5476（1977）． 37 Southern,E.M.J.Mol.Biol.,98,503−517（1975）． 38 Ish−Horowicz,D.and Burke,J.F.Nucl.Acids Res.,
9,2989−2998（1981）． 39 Benton,W.D.and Davis,R.W.Science,196,180−182
（1977）．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アリゾン，マルク フランス国、75005・パリ、リユ・ド ユ・カルデイナル・ルモワンヌ、71 (72)発明者 バール・シヌーシ，フランソワーズ フランス国、92130・イツシー・レ・ム リノー、リユ・デヴラン、50、ル・カプ リコルヌ・104 (72)発明者 ソニゴ，ピエール フランス国、75015・パリ、リユ・ド ウ・サツクス、64 (72)発明者 チオレ，ピエール フランス国、75015・パリ、リユ・ド ウ・ラ・グラシエール、16 (72)発明者 シエルマン，ジヤン‐クロード フランス国、78310・エランクール、ク ロ・ドルガル、２ (72)発明者 モンテニエ，リユツク フランス国、92350・ル・プレシ・ロバ ンソン、リユ・ドウ・マラブリ、21 (72)発明者 ヴアン‐オブソン，シモン フラス国、78180・モンテイニ・ル・ブ ルトヌー、リユ・ジヤン・ドウ・ラ・フ オンテーヌ、32
Claims (16)
- 【請求項１】ラムダJ19（CNCM Ｉ−338）に含まれるLA
Vレトロウイルスゲノムの全部又はその一部に対応するD
NAインサートを含有するクローン化DNAであって、該DNA
インサートが、LAVウイルスのゲノムRNAと非緊縮条件下
でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及び
洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーショ
ンの低緊縮条件が20％ホルムアミド、５×SSC、１×デ
ンハート溶液、10％硫酸デキストラン中37℃であるドッ
ト−ハイブリダイゼーションアッセイにおいてはHTLV−
Ｉ及びHTLV−IIレトロウイルスのRNAとクロス−ハイブ
リダイズしないことを特徴とするDNA。 - 【請求項２】LAVウイルスのゲノムRNAとハイブリダイズ
する前記DNAインサートの組換え体である請求の範囲１
に記載のDNA。 - 【請求項３】前記DNAインサートがcDNAである請求の範
囲１または２に記載のDNA。 - 【請求項４】次の制限部位を次の順序で（３′末端から
５′末端に向かって）含有する請求の範囲１−３のいず
れかに記載のDNA: Hind III,Sac I,Bgl II（LAV 75）。 - 【請求項５】次の制限部位を次の順序で（３′末端から
５′末端に向かって）含有する請求の範囲４に記載のDN
A: Hind III,Sac I,Bgl II,Bg II,Kpn I（LAV 82）。 - 【請求項６】次の制限部位を次の順序で（３′末端から
５′末端に向かって）含有する請求の範囲４に記載のDN
A:Hind III,Sac I,Bgl II,Bgl II,Kpn I,Xho I,Bam H
I,Hind III,Bgl II（LAV 13）。 - 【請求項７】大きさが約2.5kbである請求の範囲６に記
載のDNA。 - 【請求項８】LTRのＲ領域およびU3領域とLAVレトロウイ
ルスDNAのコード領域の３′末端とに対応する領域を含
有する請求の範囲１−７のいずれかに記載のDNA。 - 【請求項９】大きさが約9.1−9.2kbである請求の範囲１
に記載のDNA。 - 【請求項１０】次の一連の制限部位を含有する請求の範
囲９に記載のDNA: Hind III ０ Sac I 50 Bam H I 460 Hind III 520 Bam H I 600 Pst I 800 Hind III 1100 Bgl II 1500 Kpn I 3500 Kpn I 3900 Eco R I 4100 Eco R I 5300 Sal I 5500 Kpn I 6100 Bgl II 6500 Bgl II 7600 Hind III 7850 Bam H I 8150 Xho I 8600 Kpn I 8700 Bgl II 8750 Bgl II 9150 Sac I 9200 Hind III 9250。 - 【請求項１１】さらにほぼ5550の座標付近にHind IIIを
一個含有する請求の範囲10に記載のDNA。 - 【請求項１２】請求の範囲11に記載の配列のKpn I（610
0）辺りからBam H I（8150）辺りまで延びる配列からな
るDNAインサートを含有する請求の範囲１に記載のDNA。 - 【請求項１３】請求の範囲11に記載の配列のKpn I（350
0）辺りからBgl II（6500）辺りまて延びる配列からな
るDNAインサートを含有する請求の範囲１に記載のDNA。 - 【請求項１４】請求の範囲11に記載の配列のPst（800）
辺りからKpn I（3500）辺りまで延びる配列からなるDNA
インサートを含有する請求の範囲１に記載のDNA。 - 【請求項１５】ラムダ19（CNCM Ｉ−338）に含まれるL
AVレトロウイルスゲノムの全部又はその一部に対応する
DNAインサートを含有するクローン化DNAであって、該DN
Aインサートが、LAVウイルスのゲノムRNAと非緊縮条件
下でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及
び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーシ
ョンの低緊縮条件が20％ホルムアミド、５×SSC、１×
デンハート溶液、10％硫酸デキストラン中37℃であるド
ット−ハイブリダイゼーションアッセイにおいてはHTLV
−Ｉ及びHTLV−IIレトロウイルスのRNAとクロス−ハイ
ブリダイズしないDNAからなるLAVのインビトロ検出用プ
ローブ。 - 【請求項１６】LAVウイルス感染のインビトロ検出方法
であって、LAV感染の診断をすべき人から得、ハイブリ
ダイゼーションに適した形態のDNAを含有する生物学的
サンプルを、ハイブリダイズ条件下で、ラムダJ19（CNC
M Ｉ−338）に含まれるLAVレトロウイルスゲノムの全
部又はその一部に対応するDNAインサートを含有するク
ローン化DNAであって、該DNAインサートが、LAVウイル
スのゲノムRNAと非緊縮条件下でハイブリダイズする
が、ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で
行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が20％
ホルムアミド、５×SSC、１×デンハート溶液、10％硫
酸デキストラン中37℃であるドット−ハイブリダイゼー
ションアッセイにおいてはHTLV−Ｉ及びHTLV−IIレトロ
ウイルスのRNAとクロス−ハイブリダイズしないDNAから
なるLAVのインビトロ検出用プローブと接触せしめ、ハ
イブリダイズしたプローブを検出することを特徴とする
方法。
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