JP2752327B2 - リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａとハイブリダイズしうるクローン化ｄｎａの逆転写により得られ、ｌａｖゲノムに対応するｒｎａ - Google Patents
リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａとハイブリダイズしうるクローン化ｄｎａの逆転写により得られ、ｌａｖゲノムに対応するｒｎａInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリンパ節障害関連ウイル
ス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡおよびＤＮＡとハイブリダ
イズしうるクローン化ＤＮＡ配列の逆転写（又は該ＤＮ
Ａから再合成）により得られ、ＬＡＶゲノムに対応する
ＲＮＡに係る。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】リンパ
節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）は、後天性免疫不全症候
群（ＡＩＤＳ）の前徴または良性形態であることが多い
リンパ節障害症候群に患った同性愛の患者のリンパ節か
ら初めて単離されたヒトレトロウイルスである（１参
照）。その後別のＬＡＶがＡＩＤＳ患者やプレーＡＩＤ
Ｓ患者から単離されている（２〜５参照）。入手できる
データは全て、このウイルスがＡＩＤＳの病因であるこ
とと一致している（１１参照）。 【０００３】このウイルスは活性化Ｔリンパ球で増殖
し、Ｔ細胞サブセットＯＫＴ４に対して向性をもってお
り（２〜６参照）、このサブセット中で細胞変性効果を
誘発する。しかしこのウイルスは、ある種のエプスタイ
ン−バール(Epstein-Barr)ウイルスでトランスフォーム
したＢ細胞株(cell line) （７参照）中や樹立したＴリ
ンパ芽球細胞株、ＣＥＭ中で増殖できるように順応させ
られている。 【０００４】さらに最近になって、ＬＡＶ様ウイルスが
ＡＩＤＳ患者とプレーＡＩＤＳ患者から別個に単離され
た。ＨＴＬＶ−III （ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイ
ルスIII 型。１２〜１５参照）およびＡＲＶ（ＡＩＤＳ
関連レトロウイルス）とよばれるこれらのウイルスはＬ
ＡＶに類似した特性を多く有しており、ＬＡＶ原型(pro
totype) の別々の単離体である。言葉の便宜上以後これ
らを全部「ＬＡＶ」と指称する。 【０００５】現在のところ利用できる検出法はウイルス
タンパク質の識別を基にしている。このような方法は、
１９８３年９月１５日付けの英国出願第８３ ２４８０
０号の優先権を主張して１９８４年９月１４日に出願さ
れた名称を「リンパ節障害と後天性免疫不全症候群を診
断するための抗原、手段および方法」とする欧州出願に
開示されている。実際抗−ｐ２５抗体がＡＩＤＳ患者と
プレーＡＩＤＳ患者の血清中に高率で発見され、これよ
りは低いがかなりの程度でＡＩＤＳの罹患の危険度が高
い群でも見つかっている（８〜１０参照）。 【０００６】 【課題を解決するたの手段】本発明は、ＬＡＶやその関
連ウイルス（以後さらに概括的に「ＬＡＶウイルス
（群）」と指称する）の検出に同様に有用であるばかり
でなく、特にこれらウイルスのゲノムＤＮＡの特定の一
部であってその発現産物が免疫的手法では必ずしも検出
できないようなＤＮＡを検出する際にさらに多くの有用
性を発揮する新規な手段を提供することを目的としてい
る。 【０００７】以下図面を参照するが、図面中で、 −第１図はプラスミド組換え体に含有される好ましいＬ
ＡＶインサート（挿入物）の制限地図を示し、 −第２図は完全なＬＡＶ断片の制限地図を示し、 −第３図は完全なＬＡＶゲノム（クローンλＪ１９）の
制限地図であり、 −第４〜１１図は、第３図に制限地図を示したＬＡＶゲ
ノムの全配列を示す。 【０００８】本発明のＤＮＡはＬＡＶのゲノムＲＮＡと
ハイブリダイズしうるＤＮＡ断片を含有するＤＮＡから
成っている。特定的には、このＤＮＡは前記ｃＤＮＡま
たはｃＤＮＡ断片またはこのｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡ
断片を含有する組換えＤＮＡから成る。 【０００９】好ましいクローン化ｃＤＮＡ断片は各々次
の制限部位をそれぞれ（３′末端から５′末端へ）次の
順序で含有する。 【００１０】１） HindIII, SacI, BglII(LAV75) ２） HindIII, SacI, BglII, BalII, KpnI(LAV82) ３） HindIII, SacI, BglII, BglII, KpnI, XhoI, Bam
HI, HindIII,BglII(LAV13)。 【００１１】ここで、ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬ
ＡＶ１３という表示はそれぞれを最初にクローン化した
組換えプラスミド（それぞれｐＬＡＶ７５，ｐＬＡＶ８
２およびｐＬＡＶ１３と表示）の名称に対応している。
言い換えると、ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１
３はそれぞれ上記の組換えプラスミド中にインサートと
して存在するということである。適宜上、ｃＤＮＡ断片
が単離形態にあってもプラスミド形態にあっても、本明
細書を通じてこの断片を表示するのにこのＬＡＶ７５，
ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３という表示を使用する。し
たがって、上で最後に述べた組換え体の他のＤＮＡ部分
はそれぞれｐＬＡＶ７５，ｐＬＡＶ８２およびｐＬＡＶ
１３の対応する部分と同一かまたは異なる。 【００１２】好ましいｃＤＮＡも（ＬＡＶ７５，ＬＡＶ
８２およびＬＡＶ１３と同様に）、特にＬＡＶのレトロ
ウイルス構造が今日までに知られたレトロウイルスのゲ
ノム構造と概ね一致するものと仮定すれば、レトロウイ
ルスのＤＮＡのコード領域の３′末端はもちろんＬＴＲ
（長い末端反復配列、Long Terminal Repeat）のＲ領域
とＵ３領域に対応する領域を含有している。 【００１３】大きさが約２．５ｋｂｐのＬＡＶ１３は特
に有利であることが判明した。このものはＬＡＶやＬＡ
Ｖ関連ウイルスに対して特異性が高く、またＬＡＶ７５
やＬＡＶ８２よりも多くのＬＡＶレトロウイルスゲノム
を認識する。特に、ＬＡＶ１３によってＬＴＲ内部のレ
トロウイルスゲノムのＲＵ５接合部の同定が可能とな
り、その後ＬＡＶゲノムのサイズの決定が可能になっ
た。ＬＡＶゲノムサイズは平均すると約９．１〜９．２
ｋｂである。 【００１４】ＬＡＶ１３は酵素EcoRI, NruI, PvuI, Sal
I, SmaI, SphI, StuI およびXbaIに対する制限部位をも
たない。 【００１５】さらにＬＡＶ１３は、レトロウイルスゲノ
ム内でエンベロープタンパク質をコードしている配列に
相当するＤＮＡ配列部分だけは少なくとも含有している
ようである。 【００１６】また本発明はＬＡＶレトロウイルスゲノム
全体の一部分に相当すると思われるｃＤＮＡ中に含有さ
れる任意の断片にも係る。このＬＡＶレトロウイルスゲ
ノム全体はその特徴として（５′末端から３′末端に向
かって）後述の順序で一連の制限部位を含有している。 【００１７】好ましい全ＬＡＶゲノムの連続する部位の
座標（制限地図）も後に、Ｒ領域に位置するHind III部
位（これを座標１に選択した）に対する座標として示
す。この座標は +２００ｂｐ以内で評価されている。あ
るものは他のものよりも十分に確立されている。 【００１８】 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０ Ｓａｃ Ｉ ５０ Ｂａｍ ＨＩ ４６０ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ５２０ Ｂａｍ ＨＩ ６００ Ｐｓｔ Ｉ ８００ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ １ １００ Ｂｇｌ ＩＩ １ ５００ Ｋｐｎ Ｉ ３ ５００ Ｋｐｎ Ｉ ３ ９００ Ｅｃｏ ＲＩ ４ １００ Ｅｃｏ ＲＩ ５ ３００ Ｓａｌ Ｉ ５ ５００ Ｋｐｎ Ｉ ６ １００ Ｂｇｌ ＩＩ ６ ５００ Ｂｇｌ ＩＩ ７ ６００ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ ８５０ Ｂａｍ ＨＩ ８ １５０ Ｘｈｏ Ｉ ８ ６００ Ｋｐｎ Ｉ ８ ７００ Ｂｇｌ ＩＩ ８ ７５０ Ｂｇｌ ＩＩ ９ １５０ Ｓａｃ Ｉ ９ ２００ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ９ ２５０ 上記した本発明のＤＮＡはほぼ５５５０の座標の所にHi
nd IIIを余分に含んでいることもある。 【００１９】さらに詳しくいうと本発明は概略の大きさ
が０．１ｋｂ（１０ｋｂ）で第３図に示した一連の制限
部位を含むＤＮＡに係る。 【００２０】より一般的にいって本発明は、さらに詳細
にいった場合後者（上記のＤＮＡ）のｃＤＮＡ変異体(v
ariants)に係り、これら変異体は同じ一連の制限部位を
後記の（５′末端から３′末端へ向かう）順序で有して
いてもよいが、制限部位のあるものが意図（自発）的か
または意図的でなく誘発された突然変異に起因して欠失
していてもまたは付加されていてもよい。 【００２１】さらに本発明は上述の制限地図でそれぞれ
以下のように延びるＤＮＡ断片にほぼ対応する別の好ま
しいＤＮＡ断片にも係る。 【００２２】−Kpn I （６１００）あたりからBgl II
（９１５０）あたりまで。この断片は少なくとも１部が
エンベロープのタンパク質をコードしている遺伝子に対
応していると考えられる。特に約１１００００ダルトン
(Daltons) のタンパク質ｐ１１０はこの領域にコードさ
れている。 【００２３】−Kpn I （３５００）あたりからBgl II
（６５００）あたりまで。この断片は少なくとも１部が
ｐｏｌ遺伝子（ウイルスポリメラーゼをコードしてい
る。）に対応していると考えられる。 【００２４】−Pst （８００）あたりからKpn I （３５
００）あたりまで。 【００２５】この断片は少なくとも１部がｇａｇ遺伝子
（タンパク質ｐ２５，ｐ１８およびｐ１３を含めたコア
抗原をコードしている）に対応していると考えられる。 【００２６】また本発明は、後に示されるようにＬＡＶ
のゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうる他のＤＮＡ断片
ならびにＬＡＶウイルス群の全ゲノムに相当する別のｃ
ＤＮＡ変異体とハイブリダイズしうる他のＤＮＡ断片に
も係り、さらにこれらＤＮＡやｃＤＮＡ断片を含有する
ＤＮＡ組換え体にも係る。 【００２７】さらに特定的には本発明は、上記の断片に
対応しており、ほぼ同じ部位を互いにほとんど同じ距離
だけ離して有するあらゆる断片に係り、これら断片は全
て共通してＬＡＶレトロウイルスゲノムとハイブリダイ
ズしうるという能力をもっている。もちろん、同様にＬ
ＡＶレトロウイルスゲノムとハイブリダイズするという
能力を実質的に変えない欠失や突然変異を有する断片は
上でより特定的に述べたＤＮＡ断片の自明な均等物を形
成するものと理解されたい。 【００２８】本発明の別の付加的な特徴は制限地図とヌ
クレオチド配列を含めて本発明の好ましいＤＮＡの付加
的な特徴に関する開示を通して明らかとなろう。 【００２９】 【実施例】以下本発明の好ましいＤＮＡの製造条件とそ
の特性を非限定的に例証する。 【００３０】１．ｃＤＮＡライブラリーの構築 １．１ ウイルス精製 不死化した永久系ＬＡＶ産生Ｂ−リンパ球株(Line)ＦＲ
８（１９８４年５月９日付でパリ・パスツール研究所(I
NSTITUT PASTEUR)の“Collection Nationale de Cultur
es de Micro-organismes”に番号Ｉ−３０３で寄託。７
参照）からビリオンを精製した。精製手順（プロトコ
ル）は既報の通り（１参照）。主要なステップは、培養
上清のポリエチレン−グリコール処理と、２０％シュク
ロース層(cushion) を通すペレット化と、２０〜６０％
シュクロース勾配によるバンド分け(banding) と、ウイ
ルス含有画分のペレット化であった。 【００３１】１．２ 第１ストランドｃＤＮＡ合成 ウイルスに関連する洗滌で活性化された内因性反応は、
ウイルスを精製しそのエンベロープを溶解した後このウ
イルスのリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）
を作用せしめる技術である。 【００３２】各反応毎にＦＲ８上清２５０〜３００ｍｌ
に相当する精製ウイルスを用いた。最終反応（液）量は
１ｍｌであり、インキュベーションは３７℃で４５分
間、タンパク質濃度は約２５０μｇ／ｍｌであった。バ
ッファーはＮａＣｌ ２５ｍＭ， Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ジチオスレイトール１０ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ2 ６ｍＭ、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ 各０．１ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０
２％、オリゴｄＴプライマー５０μｇ／ｍｌであった。
α−32Ｐ−ｄＣＴＰ ４００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅを０．
６μＭまでかつコールド（放射化していない、ｃｏｌ
ｄ）ｄＣＴＰを４μＭまで用いて１５分間ｃＤＮＡを標
識した。その後、コールドｄＣＴＰを２５μＭまで加え
て第１ストランドの最適な伸長を確実にした。 【００３３】ｄＣＴＰ追跡（付加、chase ）の３０分後
ＥＤＴＡを２０ｍＭまで、ＳＤＳを０．５％まで加えて
反応を停止させ、プロテイナーゼＫ １００μｇ／ｍｌ
で１時間消化し、フェノール−クロロホルム抽出した。 【００３４】次にＧ−５０ Sephadex (Pharmacia)上で
ｃＤＮＡを精製し、エタノール沈殿した。 【００３５】１．３ 第２ストランド合成とクローニン
グ 精製しｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをGUBLERとHOFFMA
N （１７参照）に従ってＤＮＡポリメラーゼＩとRNase
H で処理した。ターミナルトランスフェラーゼを用いて
２本鎖ｃＤＮＡの末端にｄＣを付加（ｄＣ−ｔａｉｌ）
し、ｐＢＲ３２２の誘導体であるｐＢＲ３２７（３４参
照）をｐｓｔ消化し、末端にｄＧを付加したものとアニ
ールした。 【００３６】大腸菌(E.coli)Ｃ６００ ｒｅｃＢＣ株を
トランスフェクションしてｃＤＮＡライブラリーを得
た。 【００３７】２． ＬＡＶ−特異的クローンの検出 ２．１ ライブラリーのスクリーニング ５００個の組換えクローンをニトロセルロースフィルタ
ー上で増殖させ、既報（１，２参照）のように内因性ウ
イルス関連反応で作成し、32Ｐで標識したｃＤＮＡのも
う１つのバッチを用いてその場（in situ)でコロニーハ
イブリダイゼーション（３５参照）を実施した。クロー
ンの約１０％が検出できた。 【００３８】これらのクローンを小規模に増幅しそれら
のインサートのクロスハイブリダイゼーションを行なっ
て主要な１群を得た。これらのクローンのうち組換え体
とハイブリダイズする主要な１群を同定した。これらの
ｃＤＮＡクローンのうち３個、すなわち２．５ｋｂ、
０．６ｋｂおよび０．８ｋｂのインサートをもつものを
それぞれｐＬＡＶ１３、７５および８２と命名して更に
特性決定した（第１図）。 【００３９】３種のインサートは全て一端に共通の制限
パターンをもっており、プライミング部位が共通である
ことを示唆している。長さ５０ｂｐで共通のHind III−
Ｐｓｔ Ｉ断片の配列を決定した（第１図）。これら共
通断片はクローニングｄＣテイル部の前にポリＡ鎖を含
有することが示された。すなわちこれらのクローンはポ
リＡ−ＲＮＡの３′末端のコピーである。 【００４０】ＬＡＶ１３の特異性をいろいろなアッセイ
で示した。 【００４１】ｐＬＡＶ１３の特異性を、ニック翻訳した
ｐＬＡＶ１３をプローブとして用いた一連のフィルター
ハイブリゼーション実験で決定した。先ずこのプローブ
はドット(dot) およびノーザン(Northern)ブロッティン
グによって精製したＬＡＶゲノムＲＮＡにハイブリダイ
ズした（データは示さず）。またｐＬＡＶ１３は培養上
清から濃縮されフィルターに直接固定されたウイルスの
ゲノムＲＮＡにもハイプリダイズする（ドットブロット
法）。同様な方法でいろいろな起源、すなわち正常Ｔ細
胞、ＦＲ８その他のＢ細胞のＬＡＶ産生株、ＣＥＭ細
胞、および、（これら程強くはないが）ＡＩＤＳに罹っ
た血友病患者から得た骨髄培養物由来のＬＡＶ（３参
照）から得たＬＡＶ ＲＮＡが検出された。非感染培養
物は負であることが立証された。この迅速なドットブロ
ット法は多少修正すれば血清その他の体液中のＬＡＶの
検出に適用することができる。 【００４２】第二にこのプローブはＬＡＶに感染したＴ
リンパ球のサザン(Southern)ブロットとＬＡＶを産生す
るＣＥＭ細胞株(cell line) とにおいてＤＮＡを検出し
た。同じハイブリダイゼーション条件下では、非感染リ
ンパ球のＤＮＡでも正常肝から得たＤＮＡでもハイブリ
ダイゼーションは検出されなかった（データは示さ
ず）。 【００４３】後述するようにＬＡＶウイルス群の全レト
ロウイルスゲノムを同定するのにＬＡＶ１３を用いるこ
とができるという可能性から第３の特徴が導かれた。Hi
nd IIIで開裂したｐＬＡＶ１３中の内部ウイルス断片と
共に移動する特に特徴的な１．４５ｋｂ Hind III 断片
が検出された。２．３ｋｂと６．７ ｋｂにもバンドが
検出された。このプロープの長さは２．５ｋｂしかな
く、しかも接合断片は全く検出できなかったので、これ
ら大き過ぎるバンドは、ＬＡＶゲノムのHind III多型性
から生じた内部断片に当たるのであろう。 【００４４】これらのデータを合わせると、ｐＬＡＶ１
３ＤＮＡはヒトゲノムに対して外因性であり、ＬＡＶに
感染した細胞から得たＲＮＡ形も組み込まれたＤＮＡ形
も双方とも検出することが示される。すなわちｐＬＡＶ
１３はＬＡＶに特異的である。従来知られているレトロ
ウイルスのゲノム構造を考えれば、ｐＬＡＶ１３はオリ
ゴ−ｄＴでプライムしたのでコード領域の３′末端と共
にＬＴＲのＲ領域とＵ３領域も含有するはずである。 【００４５】ＬＡＶゲノムＤＮＡのクローニング ＬＴＲのＲ領域内にHind III部位があることが判明した
ので、ＬＡＶに感染した細胞から得たプロウイルスＤＮ
ＡをHind IIIで部分消化することによりＬＡＶゲノムを
クローン化することにした。(a) 部分消化すると完全な
クローンを単離する機会が増大すること、および(b)Hin
d III 断片はラムダ置換ベクター(lambda replacement
vectors)中で容易にクローン化されることが判明した。
健常ドナーから得インビトロで(in vitro)ＬＡＶに感染
させた後のＴ細胞から単離したＤＮＡをHind IIIで部分
消化して分画した。９±１．５ｋｂＤＮＡを含有する画
分を沈殿させ、ラムダ−Ｌ４７．１のHind III腕(arms)
内へ連結した（１８参照）。 【００４６】ＬＡＶゲノムＤＮＡのクローニングはさら
に詳細には次のようにして行なった。 【００４７】ｃＤＮＡを上述のようにＬＡＶに感染した
Ｔ細胞から調製した後、Hind IIIで部分的に消化し、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ（ｐＨ８）。１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１Ｍ ＮａＣｌ中５〜４０％のシュクロース勾配上
で分画した（ＳＷ４１ローター、４０，０００ｒｐｍで
１６時間）。単一画分（９±０．５ｋｂ）をキャリヤー
としてのDextran Ｔ４０ ２０μｇ／ｍｌで沈殿させ、
ＴＥバッファー（１０ｍＭ Tris.Cl,pH8,1mM EDTA) 中
に取った。λ−Ｌ４７．１Hind III腕は、先ずｃｏｓ部
位を連結した後Hind IIIで消化し５〜４０％のシュクロ
ース勾配を通して分画して調製した。λ−Hind III腕の
みを含有する画分をプールし、沈殿させ、ＴＥ−バッフ
ァーに取った。この腕とＤＮＡの連結は、３：１過剰モ
ル濃度の腕と３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolab
s) とを用いてＤＮＡほぼ２００μｇ／ｍｌで行なっ
た。溶解物(lysates) のin vitroパック組立(packagin
g) は（３８）に従って行なった。in vitroパック組立
後このファージの溶菌物(lysate)をＣ６００ｒｅｃＢＣ
株上のＮＭ５３８の上にプレートアウトした。ニトロセ
ルロースフィルターを用いたin situ ハイブリダイゼー
ション（３９参照）によって約２百万のプラークをスク
リーニングした。ハイブリダイゼーションは１×Denhar
dt溶液、０．５％ＳＤＳ，２×ＳＳＣ，２ｍＭ ＥＤＴ
Ａの中６８℃で行なった。プローブはｐＬＡＶ１３の32
Ｐでニック翻訳したＬＡＶインサートであった（＞１０
8 ｃｐｍ／μｇ）。フィルターを６８℃の０−１ＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳ中３０分間で２回洗浄し、Kodak XA
R −５フィルムに２９〜４０時間露出した。陽性のクロ
ーンを７個同定し、Ｃ６００ｒｅｃ ＢＣ株上でプラー
クを精製した。液体培養し、組換えファージをＣｓＣｌ
中にバンド分けした。ファージＤＮＡを抽出し、適当な
条件下で消化した。 【００４８】このように、ニック翻訳したｐＬＡＶ １
３インサートをプローブとして用いたin situ スクリー
ニングによって約２百万のファージプラークから７個の
別々のクローンが得られた。λ−Ｊ１９の制限地図をHi
nd III多型性のλ−Ｊ８１の制限地図と共に第２図に示
す。他の組換えλ−Ｊ２７、λ−Ｊ３１およびλ−Ｊ５
７はλ−Ｊ１９と同じHind III地図を示した。λ−Ｊ８
１の地図は同様であるが約５５５０の座標の所に余分な
Hind III部位がある。 【００４９】第２図の制限地図はブロットをｐＬＡＶ１
３ＤＮＡに対してハイブリダイスすることで方向を決定
した。 【００５０】ＬＡＶ１３ｃＤＮＡクローンの制限地図も
第２図に示してある。λ−Ｊ１９の制限部位はＢがBamH
Ｉ、ＢｇがBg１ II 、ＨがHind III、ＫがKpn I 、Ｐが
PstI 、ＲがEco RI、ＳがSac I 、ＳａがSal I 、ＸがX
ho I である。目盛り（スケール）の下にはレトロウイ
ルスの一般的な構造の概略図があり、これにはＬＴＲの
要素の要素Ｕ３，ＲおよびＵ５が示されている。Ｒ／Ｕ
Ｓ境界のみがはっきり決められており、他の境界は単に
比ゆ的に図示しただけである。 【００５１】λ−Ｊ１９の５′の０．５２ｋｂ HindIII
断片中には他のBamH I部位があるかもしれない。これら
の部位は小さ過ぎて検出できない断片を生じる。 【００５２】第２図はまた、λ−Ｊ１９とλ−Ｊ８１の
Hind III断片のうちｐＬＡＶ１３で検出されるものを
(＋) として検出されないものを (-)として示してい
る。 【００５３】さらに詳細にみると、λ−Ｊ１９には４つ
のHind IIIバンド、すなわち６．７ｋｂ、１．４５ｋ
ｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂのバンドがあり、こ
れらの最初の２つがHind IIIで制限したＤＮＡのゲノム
ブロット中にあるバンドに対応する。最小の０．６ｋｂ
と０．５２ｋｂのバンドはゲノムブロット内にはみられ
なかったが、これらが独立に得られた分析クローンの全
てに現われるという事実は、ＬＡＶのプロウイルスＤＮ
Ａのランダムな組み込みを仮定すると、これらのバンド
が内部断片に相当するもので接合断片(junction fragme
nts)ではないということを示唆している。実際、０．５
ｋｂバンドはｐＬＡＶ１３の小さいHindIII −Ｐｓｔ
Ｉ断片を介してｐＬＡＶ１３ＤＮＡとハイブリダイズす
る（第２図）。すなわちλ−Ｊ１９の０．５ｋｂ Hind
III断片はＬＴＲ内部のＲ−Ｕ５接合部(junction)を含
有している。 【００５４】λ−Ｊ８１はλ−Ｊ１９の制限部位多型現
象であると思われる。λ−Ｊ８１には４．３ｋｂ、２．
３ｋｂ、１．４５ｋｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂ
の５種のHind IIIバンドがある。この２．３ｋｂバンド
はｐＬＡＶ１３プローブによるゲノムブロットで容易に
検出されるが、４．３ｋｂ断片は検出されない。λ−Ｊ
８１がHind III多型現象の１つであり組換えウイルスで
はないということは、ニック翻訳したλ−Ｊ１９ＤＮＡ
が緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下でλ−
Ｊ８１の５つのHind IIIバンド全てとハイブリダイズす
るという事実によって示される。また、λ−Ｊ８１内の
その他の制限部位はλ−Ｊ１９と同一である。 【００５５】ＬＡＶ由来ｃＤＮＡの配列決定 ファージ組換え体に対し特に重要な部位の配列決定を行
なった。 【００５６】クローンλ−Ｊ１９の組換えファージＤＮ
Ａ全体をＤＥＩＮＩＮＧＥＲ（１９８３）、Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２９，２１６のプロ
トコル（手順）に従って超音波処理した。このＤＮＡを
クレノウ(Klenow)反応によって１６℃で１２時間修復し
た。ＤＮＡを０．８％アガロースゲル中に電気泳動さ
せ、３００〜６００ｂｐのサイズ範囲のＤＮＡを切出
し、電気溶出し、沈殿させた。ＤＮＡを（１０ｍＭ Tr
is,pH8,0.1mM EDTA 中に）再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡ−およ
びＲＮＡ−リガーゼ(Maniatis Ｔら(1982)、Molecular
cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) を用いて、
（制限酵素ＳｍａＩで切断した後アルカリ性ホスファタ
ーゼ処理をした）Ｍ１３ｍｐ８ＲＦ ＤＮＡ中に連結し
た。ＴＧ１と名付けたＥ．ｃｏｌｉ株を用いて以下の研
究を行なった。この株の遺伝子型はΔｌａｃ ｐｒｏ，
ｓｕｐＥ、ｔｈｉ．Ｆ′ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌ
ａｃＩq ，ＺΔＭ１５，ｒ- である。 【００５７】このＥ．ｃｏｌｉ ＴＧＩ株の特有の性質
によって組換え体を容易に識別できる。ＬＡＶ ＤＮＡ
の断片で組換えなかったプラスミドによってトランスフ
ェクトされた細胞の青色は変化しない。逆に、ＬＡＶ
ＤＮＡ断片を含有する組換えプラスミドでトランスフェ
クトした細胞は白色のコロニーとなる。用いた方法はＧ
ｅｎｅ（１９８３）、２６，１０１に開示されている。 【００５８】Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ
（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．，１６６，５５
７）を用い、この菌株を連結混合物で形質転換した。軟
アガロース中にＩＰＴＧとＸ−ｇａｌを有するトリプト
ン−アガロースプレート上にプレートアウトした。白色
のプラークを摘出した後かまたは直接in situ でニトロ
セルロースフィルターを用いてスクリーニングした。こ
れらプラークのＤＮＡはλ−Ｊ１９のｐＵＣ１８Hind I
IIサブクローンのＤＮＡインサートをニック翻訳したも
のとハイブリダイズした。これによって後記表に示すλ
のプラスミドまたはサブクローンの単離が可能になっ
た。この表に関して、各プラスミドの表示の後ろに各各
のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＧＩの培養細
胞をフランス、パリのPasteur Institute の“Collecti
on Nationale des Cultures de Micro-organismes ”
（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）に寄託した番号も示されているこ
とに注意されたい。形質転換してないＴＧＩ細胞株も番
号Ｉ−３６４でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託した。これらの
寄託は全て１９８４年１１月１５日付で行なった。ＬＡ
Ｖゲノムから得られた対応するインサートのサイズも一
緒に示す。 【００５９】 表 組換えプラスミドの基本的特徴 −ｐＪ１９−１プラスミド （Ｉ−３６５） ０．５ｋｂ Ｈｉｎｄ III−Ｓａｃ Ｉ−Ｈｉｎｄ III −ｐＪ１９−１７プラスミド（Ｉ−３６７） ０．６ｋｂ Ｈｉｎｄ III−Ｐｓｔ Ｉ−Ｈｉｎｄ III −ｐＪ１９−６プラスミド （Ｉ−３６６） １．５ｋｂ Ｈｉｎｄ III（５′） Ｂａｍ ＨＩ Ｘｈｏ Ｉ Ｋｐｎ Ｉ Ｂｇｌ II Ｓａｃ Ｉ（３′） Ｈｉｎｄ III −ｐＪ１９−１３プラスミド（Ｉ−３６８） ６．７ｋｂ Ｈｉｎｄ III（５′） Ｂｇｌ II Ｋｐｎ Ｉ Ｋｐｎ Ｉ Ｅｃｏ ＲＩ Ｅｃｏ ＲＩ Ｓａｌ Ｉ Ｋｐｎ Ｉ Ｂｇｌ II Ｂｇｌ II Ｈｉｎｄ III（３′） 正にハイブリダイズするＭ１３ファージプレートを５時
間増殖させ、一本鎖ＤＮＡを抽出した。 【００６０】Ｓａｎｇｅｒらによって改良されたジデオ
キシ法および技法（Sangerら(1977)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463およびＭ１３ Cloning and sequen
cinghandbook, AMERSHAM (1983)）に従って、λＪ１９
ＤＮＡのＭ１３ｍｐ８サブクローンの配列決定をした。
１７量体のオリゴヌクレオチドプライマーα−35ＳｄＡ
ＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＡＭＥＲＳＨＡＭ）、お
よび０．５Ｘ−５Ｘバッファー勾配ゲル（Ｂｉｇｇｅｎ
Ｍ．Ｄ．ら（1983），Pro. Natl, Acad. Sci. USA, 5
0, 3963 ）を用いた。ゲルを読み取り、Ｓｔａｄｅｎの
プログラム（Ｓｔａｄｅｎ Ｒ．(1982) Nucl. Acids R
es., 10, 4731 ）を組み込んだコンピューターに入力し
た。適当な参考文献と方法は全てAMERSHAM M13 Cloning
and sequencing handbook中に書いてある。 【００６１】λＪ１９の完全な配列を第４〜１１図に示
す。 【００６２】他のヒトレトロウイルスとの関係 ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIはＴ細胞サブセットである
ＯＫＴ４に対する指向性をもった１対のＣ−タイプ形質
転換型レトロウイルスを構成している（２０参照）。単
離したＨＴＬＶ−Ｉは全配列が決定されており（２１参
照）、ＨＴＬＶ−IIの部分配列も決定・報告されている
（２２〜２４参照）。どちらのゲノム（ＬＴＲ１個）も
長さが約８．３ｋｂであり、ｐＸ領域を有しており、広
い範囲で配列に相同性がある。これらのゲノムはかなり
緊縮な条件（４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ）下でお
互いにハイブリダイズし、しかもｐＸ領域は６０％ホル
ムアミドでさえハイブリダイズする（２６参照）。した
がって、保存されたｐＸ領域はこの類のウイルスの際立
った特徴である。 【００６３】我々はクローン化したＬＡＶ ＤＮＡとク
ローン化したＨＴＬＶ−ＩＩ ＤＮＡ（ｐＭＯ、２７参
照）とをブロット−ハイブリダイゼーションで比較し、
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の低緊縮条件下では
クロス−ハイブリダイゼーションが全く起こらないこと
を見出した。たとえば、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化したλ
−Ｊ１９、λ−Ｊ２７およびλ−Ｊ８１を電気泳動さ
せ、ブロットし、32Ｐ−ニック翻訳したｐＭＯ（ＨＴＬ
Ｖ−ＩＩ）ＤＮＡ（比活性は０．５×１０8ｃｐｍ／μ
ｇより大）と、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×
Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕ
ｌｐｈａｔｅ（硫酸デキストラン）中３７℃で一晩ハイ
ブリダイズさせた。ＨＴＬＶ−Ｉ配列（２１）から得た
５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ．５０）ｔ
ｍ．５０でフイルターを洗浄した。洗浄を５０℃と６５
℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で繰り返した。２０
％ホルムアミド、８×ＳＳＣ（ｔｍ．５０）中でハイブ
リダイズさせ、２×ＳＳＣ（ｔｍ．５０）中３７℃で洗
浄した場合でさえ、増感スクリーンを用いて−７０℃で
２日露光した後でもハイブリダイゼーションは全く検出
されなかった。 【００６４】このように、ＬＡＶとＨＴＬＶウイルスの
間の関係を示す分子的な証拠はない。また、ＨＴＬＶウ
イルスが８．３ｋｂであるのに対しＬＡＶゲノムはほぼ
９ｋｂの長さである。ゲノムサイズが近いにもかかわら
ず、ＬＡＶとビスナ（Ｖｉｓｎａ．２９参照）のクロー
ン化したウイルスゲノムはクロスハイブリダイズするこ
とはなく、非緊縮条件（ハイブリダイゼーション２０％
ホルムアミド、８ＳＳＣ、３７℃；洗浄２ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ、３７℃）でＬＡＶと多くのヒト内因性ウイ
ルスゲノム（３０参照）とのハイブリダイゼーションが
起こることもない。 【００６５】本発明はまた、さらに特定的には本発明に
よるＤＮＡ断片のいずれかから出発して作製することが
できるクローン化プローブにも係り、したがってこのよ
うな断片を含有する組換えＤＮＡ特に原核または真核細
胞中で増幅でき前記の断片を担持しているあらゆるプラ
スミドにも係る。既に述べたように好ましいＤＮＡ断片
はＬＡＶ１３である。 【００６６】クローン化したプロウイルスＤＮＡを放射
性核種か蛍光試薬のいずれかで標識することにより分子
ハイブリダイゼーションプローブとして用いるとＬＡＶ
ビリオンＲＮＡを、血液、体液および（たとえば第VIII
因子濃縮物のような抗血友病因子の）血液製剤ならびに
ワクチンすなわちＢ型肝炎ワクチン中で直接検出しう
る。ＬＡＶ産生細胞の培養上清中でウイルス全体が検出
できることは既に示されている。その検出を達成する適
切な方法は、前記の如き担体たとえばニトロセルロース
フィルター等にウイルスを固定し、ビリオンを破砕し、
標識（放射標識または「冷い（ｃｏｌｄ）」蛍光もしく
は酵素標識）したプローブとハイブリダイズすることで
ある。このような方法は既に、末梢血中のＢ型肝炎ウイ
ルスの場合について（ＳＣＯＴＴＯ，Ｊ．ら、Hepatolo
gy(1983), 3, 379-384 に従って）開発されている。 【００６７】本発明のプローブはまた、ＬＡＶ関連症状
を示している患者の組織から得たゲノムＤＮＡの迅速な
スクリーニングに使用してプロウイルスＤＮＡまたはＲ
ＮＡが宿主組織およびその他の組織中に存在するかどう
かを検べることもできる。 【００６８】このようなスクリーニングに使用できる方
法は次のステップからなる。すなわち、組織からのＤＮ
Ａの抽出、このＤＮＡの制限酵素開裂、断片の電気泳動
および組織からのゲノムＤＮＡのサザンブロッティン
グ、その後の標識クローン化ＬＡＶプロウイルスＤＮＡ
とのハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションも使用できる。 【００６９】また、ヒト、霊長目その他の哺乳類の種の
リンパ液やリンパ組織およびその他の非リンパ組織を別
の進化上関連したレトロウイルスが存在するかどうかを
検討するためにスクーニングすることもできる。上述の
方法が使用できるがハイブリダイゼーションと洗浄は非
緊縮条件下で行なわれるであろう。 【００７０】本発明のＤＮＡは診断目的用のＬＡＶウイ
ルス抗原の発現を達成するためにと、もちろんＬＡＶに
対するワクチンの製造にも使用できる。この点特に有利
なのはコア（ｇａｇ領域）およびエンベロープタンパク
質をコードしているＤＮＡ断片、特にＫｐｎ Ｉ（６１
００）からＢｇｌII（９１５０）まで延びるＤＮＡ断片
である。 【００７１】このために使用できる方法は多様である。 【００７２】ａ）ＤＮＡは様々な技法、たとえばリン酸
カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール、プロトプラ
スト−融合、等によって適当な選択マーカーをもった哺
乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる。 【００７３】ｂ）遺伝子に対応するＤＮＡ断片をＥ．ｃ
ｏｌｉ、酵母または哺乳類の細胞用の発現ベクター中で
クローン化し、得られたタンパク質を精製することがで
きる。 【００７４】ｃ）プロウイルスＤＮＡを「ショットガン
によって（断片化して）」原核生物発現ベクター中に導
入して融合ポリペプチドを生成させることができる。抗
原性のある融合タンパク質を産生する組換え体はこの組
換え体ＬＡＶ抗原に対する抗体で単にスクリーニングす
るだけで同定できる。 【００７５】ｄ）本発明はまた、免疫原と抗原を産生す
べくＬＡＶ抗原−遺伝子のＤＮＡ配列から推定され、化
学的に合成できるオリゴペプチドにも係る。 【００７６】上記（ａ〜ｄ）は全て診断において許容さ
れない系を用いて産生されるウイルス粒子をもたない、
したがって生物学的危険がほとんどまたは全くない免疫
原または抗原の入手源として使用できる。 【００７７】さらに本発明は上述の組換え体で形質転換
され、前記ＤＮＡ断片を発現することができる宿主（原
核または真核細胞）に係る。 【００７８】最後に本発明は、活性成分が発現された抗
原、すなわち抗原全体、融合ポリペプチドまたはオリゴ
ペプチドから成るようなワクチン組成物にも係る。 【００７９】本発明は最後に、ＬＡＶウイルス群から抽
出するかまたはｃＤＮＡから再度合成（転写）すること
ができる精製ゲノムｍＲＮＡ、特に大きさがほぼ９．１
〜９．２ｋｂで上記に定義したＤＮＡ断片のいずれかに
ハイブリダイズできる精製ｍＲＮＡ、あるいは前記精製
ｍＲＮＡの一部に関する。また本発明は前記ＲＮＡの一
部分にも係る。この精製ＲＮＡまたはその一部分のヌク
レオチド構造は実際関連ｃＤＮＡのヌクレオチド配列か
ら推定することができる。 【００８０】最後に、ラムダ−Ｊ１９とラムダ−Ｊ８１
は１９８４年９月１１日付でそれぞれ番号Ｉ−３３８と
Ｉ−３３９をもってＰａｓｔｅｕｒ（フランス）のＩＮ
ＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄ
ｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．
Ｍ）に寄託されていることに言及しておく。 【００８１】終りに本発明は、そのＤＮＡ配列を決定し
てウイルスタンパク質（抗原）のアミノ酸配列の予知に
使用することができるようなゲノムＤＮＡ、およびｃＤ
ＮＡから誘導することができるＲＮＡプローブに関す
る。 【００８２】本明細書を通じてかっこで括った数で参照
して来た参考文献の目録を次に挙げる。 【００８３】次の目録で参照されている刊行物は全て引
用によってここに含まれるものとする。 【００８４】参照文献 １．Barre-Sinoussi, F. et al. Science 220, 868-871
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ス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡおよびＤＮＡとハイブリダ
イズしうるクローン化ＤＮＡ配列の逆転写（又は該ＤＮ
Ａから再合成）により得られ、ＬＡＶゲノムに対応する
ＲＮＡに係る。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】リンパ
節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）は、後天性免疫不全症候
群（ＡＩＤＳ）の前徴または良性形態であることが多い
リンパ節障害症候群に患った同性愛の患者のリンパ節か
ら初めて単離されたヒトレトロウイルスである（１参
照）。その後別のＬＡＶがＡＩＤＳ患者やプレーＡＩＤ
Ｓ患者から単離されている（２〜５参照）。入手できる
データは全て、このウイルスがＡＩＤＳの病因であるこ
とと一致している（１１参照）。 【０００３】このウイルスは活性化Ｔリンパ球で増殖
し、Ｔ細胞サブセットＯＫＴ４に対して向性をもってお
り（２〜６参照）、このサブセット中で細胞変性効果を
誘発する。しかしこのウイルスは、ある種のエプスタイ
ン−バール(Epstein-Barr)ウイルスでトランスフォーム
したＢ細胞株(cell line) （７参照）中や樹立したＴリ
ンパ芽球細胞株、ＣＥＭ中で増殖できるように順応させ
られている。 【０００４】さらに最近になって、ＬＡＶ様ウイルスが
ＡＩＤＳ患者とプレーＡＩＤＳ患者から別個に単離され
た。ＨＴＬＶ−III （ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイ
ルスIII 型。１２〜１５参照）およびＡＲＶ（ＡＩＤＳ
関連レトロウイルス）とよばれるこれらのウイルスはＬ
ＡＶに類似した特性を多く有しており、ＬＡＶ原型(pro
totype) の別々の単離体である。言葉の便宜上以後これ
らを全部「ＬＡＶ」と指称する。 【０００５】現在のところ利用できる検出法はウイルス
タンパク質の識別を基にしている。このような方法は、
１９８３年９月１５日付けの英国出願第８３ ２４８０
０号の優先権を主張して１９８４年９月１４日に出願さ
れた名称を「リンパ節障害と後天性免疫不全症候群を診
断するための抗原、手段および方法」とする欧州出願に
開示されている。実際抗−ｐ２５抗体がＡＩＤＳ患者と
プレーＡＩＤＳ患者の血清中に高率で発見され、これよ
りは低いがかなりの程度でＡＩＤＳの罹患の危険度が高
い群でも見つかっている（８〜１０参照）。 【０００６】 【課題を解決するたの手段】本発明は、ＬＡＶやその関
連ウイルス（以後さらに概括的に「ＬＡＶウイルス
（群）」と指称する）の検出に同様に有用であるばかり
でなく、特にこれらウイルスのゲノムＤＮＡの特定の一
部であってその発現産物が免疫的手法では必ずしも検出
できないようなＤＮＡを検出する際にさらに多くの有用
性を発揮する新規な手段を提供することを目的としてい
る。 【０００７】以下図面を参照するが、図面中で、 −第１図はプラスミド組換え体に含有される好ましいＬ
ＡＶインサート（挿入物）の制限地図を示し、 −第２図は完全なＬＡＶ断片の制限地図を示し、 −第３図は完全なＬＡＶゲノム（クローンλＪ１９）の
制限地図であり、 −第４〜１１図は、第３図に制限地図を示したＬＡＶゲ
ノムの全配列を示す。 【０００８】本発明のＤＮＡはＬＡＶのゲノムＲＮＡと
ハイブリダイズしうるＤＮＡ断片を含有するＤＮＡから
成っている。特定的には、このＤＮＡは前記ｃＤＮＡま
たはｃＤＮＡ断片またはこのｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡ
断片を含有する組換えＤＮＡから成る。 【０００９】好ましいクローン化ｃＤＮＡ断片は各々次
の制限部位をそれぞれ（３′末端から５′末端へ）次の
順序で含有する。 【００１０】１） HindIII, SacI, BglII(LAV75) ２） HindIII, SacI, BglII, BalII, KpnI(LAV82) ３） HindIII, SacI, BglII, BglII, KpnI, XhoI, Bam
HI, HindIII,BglII(LAV13)。 【００１１】ここで、ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬ
ＡＶ１３という表示はそれぞれを最初にクローン化した
組換えプラスミド（それぞれｐＬＡＶ７５，ｐＬＡＶ８
２およびｐＬＡＶ１３と表示）の名称に対応している。
言い換えると、ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１
３はそれぞれ上記の組換えプラスミド中にインサートと
して存在するということである。適宜上、ｃＤＮＡ断片
が単離形態にあってもプラスミド形態にあっても、本明
細書を通じてこの断片を表示するのにこのＬＡＶ７５，
ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３という表示を使用する。し
たがって、上で最後に述べた組換え体の他のＤＮＡ部分
はそれぞれｐＬＡＶ７５，ｐＬＡＶ８２およびｐＬＡＶ
１３の対応する部分と同一かまたは異なる。 【００１２】好ましいｃＤＮＡも（ＬＡＶ７５，ＬＡＶ
８２およびＬＡＶ１３と同様に）、特にＬＡＶのレトロ
ウイルス構造が今日までに知られたレトロウイルスのゲ
ノム構造と概ね一致するものと仮定すれば、レトロウイ
ルスのＤＮＡのコード領域の３′末端はもちろんＬＴＲ
（長い末端反復配列、Long Terminal Repeat）のＲ領域
とＵ３領域に対応する領域を含有している。 【００１３】大きさが約２．５ｋｂｐのＬＡＶ１３は特
に有利であることが判明した。このものはＬＡＶやＬＡ
Ｖ関連ウイルスに対して特異性が高く、またＬＡＶ７５
やＬＡＶ８２よりも多くのＬＡＶレトロウイルスゲノム
を認識する。特に、ＬＡＶ１３によってＬＴＲ内部のレ
トロウイルスゲノムのＲＵ５接合部の同定が可能とな
り、その後ＬＡＶゲノムのサイズの決定が可能になっ
た。ＬＡＶゲノムサイズは平均すると約９．１〜９．２
ｋｂである。 【００１４】ＬＡＶ１３は酵素EcoRI, NruI, PvuI, Sal
I, SmaI, SphI, StuI およびXbaIに対する制限部位をも
たない。 【００１５】さらにＬＡＶ１３は、レトロウイルスゲノ
ム内でエンベロープタンパク質をコードしている配列に
相当するＤＮＡ配列部分だけは少なくとも含有している
ようである。 【００１６】また本発明はＬＡＶレトロウイルスゲノム
全体の一部分に相当すると思われるｃＤＮＡ中に含有さ
れる任意の断片にも係る。このＬＡＶレトロウイルスゲ
ノム全体はその特徴として（５′末端から３′末端に向
かって）後述の順序で一連の制限部位を含有している。 【００１７】好ましい全ＬＡＶゲノムの連続する部位の
座標（制限地図）も後に、Ｒ領域に位置するHind III部
位（これを座標１に選択した）に対する座標として示
す。この座標は +２００ｂｐ以内で評価されている。あ
るものは他のものよりも十分に確立されている。 【００１８】 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０ Ｓａｃ Ｉ ５０ Ｂａｍ ＨＩ ４６０ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ５２０ Ｂａｍ ＨＩ ６００ Ｐｓｔ Ｉ ８００ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ １ １００ Ｂｇｌ ＩＩ １ ５００ Ｋｐｎ Ｉ ３ ５００ Ｋｐｎ Ｉ ３ ９００ Ｅｃｏ ＲＩ ４ １００ Ｅｃｏ ＲＩ ５ ３００ Ｓａｌ Ｉ ５ ５００ Ｋｐｎ Ｉ ６ １００ Ｂｇｌ ＩＩ ６ ５００ Ｂｇｌ ＩＩ ７ ６００ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ ８５０ Ｂａｍ ＨＩ ８ １５０ Ｘｈｏ Ｉ ８ ６００ Ｋｐｎ Ｉ ８ ７００ Ｂｇｌ ＩＩ ８ ７５０ Ｂｇｌ ＩＩ ９ １５０ Ｓａｃ Ｉ ９ ２００ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ９ ２５０ 上記した本発明のＤＮＡはほぼ５５５０の座標の所にHi
nd IIIを余分に含んでいることもある。 【００１９】さらに詳しくいうと本発明は概略の大きさ
が０．１ｋｂ（１０ｋｂ）で第３図に示した一連の制限
部位を含むＤＮＡに係る。 【００２０】より一般的にいって本発明は、さらに詳細
にいった場合後者（上記のＤＮＡ）のｃＤＮＡ変異体(v
ariants)に係り、これら変異体は同じ一連の制限部位を
後記の（５′末端から３′末端へ向かう）順序で有して
いてもよいが、制限部位のあるものが意図（自発）的か
または意図的でなく誘発された突然変異に起因して欠失
していてもまたは付加されていてもよい。 【００２１】さらに本発明は上述の制限地図でそれぞれ
以下のように延びるＤＮＡ断片にほぼ対応する別の好ま
しいＤＮＡ断片にも係る。 【００２２】−Kpn I （６１００）あたりからBgl II
（９１５０）あたりまで。この断片は少なくとも１部が
エンベロープのタンパク質をコードしている遺伝子に対
応していると考えられる。特に約１１００００ダルトン
(Daltons) のタンパク質ｐ１１０はこの領域にコードさ
れている。 【００２３】−Kpn I （３５００）あたりからBgl II
（６５００）あたりまで。この断片は少なくとも１部が
ｐｏｌ遺伝子（ウイルスポリメラーゼをコードしてい
る。）に対応していると考えられる。 【００２４】−Pst （８００）あたりからKpn I （３５
００）あたりまで。 【００２５】この断片は少なくとも１部がｇａｇ遺伝子
（タンパク質ｐ２５，ｐ１８およびｐ１３を含めたコア
抗原をコードしている）に対応していると考えられる。 【００２６】また本発明は、後に示されるようにＬＡＶ
のゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうる他のＤＮＡ断片
ならびにＬＡＶウイルス群の全ゲノムに相当する別のｃ
ＤＮＡ変異体とハイブリダイズしうる他のＤＮＡ断片に
も係り、さらにこれらＤＮＡやｃＤＮＡ断片を含有する
ＤＮＡ組換え体にも係る。 【００２７】さらに特定的には本発明は、上記の断片に
対応しており、ほぼ同じ部位を互いにほとんど同じ距離
だけ離して有するあらゆる断片に係り、これら断片は全
て共通してＬＡＶレトロウイルスゲノムとハイブリダイ
ズしうるという能力をもっている。もちろん、同様にＬ
ＡＶレトロウイルスゲノムとハイブリダイズするという
能力を実質的に変えない欠失や突然変異を有する断片は
上でより特定的に述べたＤＮＡ断片の自明な均等物を形
成するものと理解されたい。 【００２８】本発明の別の付加的な特徴は制限地図とヌ
クレオチド配列を含めて本発明の好ましいＤＮＡの付加
的な特徴に関する開示を通して明らかとなろう。 【００２９】 【実施例】以下本発明の好ましいＤＮＡの製造条件とそ
の特性を非限定的に例証する。 【００３０】１．ｃＤＮＡライブラリーの構築 １．１ ウイルス精製 不死化した永久系ＬＡＶ産生Ｂ−リンパ球株(Line)ＦＲ
８（１９８４年５月９日付でパリ・パスツール研究所(I
NSTITUT PASTEUR)の“Collection Nationale de Cultur
es de Micro-organismes”に番号Ｉ−３０３で寄託。７
参照）からビリオンを精製した。精製手順（プロトコ
ル）は既報の通り（１参照）。主要なステップは、培養
上清のポリエチレン−グリコール処理と、２０％シュク
ロース層(cushion) を通すペレット化と、２０〜６０％
シュクロース勾配によるバンド分け(banding) と、ウイ
ルス含有画分のペレット化であった。 【００３１】１．２ 第１ストランドｃＤＮＡ合成 ウイルスに関連する洗滌で活性化された内因性反応は、
ウイルスを精製しそのエンベロープを溶解した後このウ
イルスのリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）
を作用せしめる技術である。 【００３２】各反応毎にＦＲ８上清２５０〜３００ｍｌ
に相当する精製ウイルスを用いた。最終反応（液）量は
１ｍｌであり、インキュベーションは３７℃で４５分
間、タンパク質濃度は約２５０μｇ／ｍｌであった。バ
ッファーはＮａＣｌ ２５ｍＭ， Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ジチオスレイトール１０ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ2 ６ｍＭ、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ 各０．１ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０
２％、オリゴｄＴプライマー５０μｇ／ｍｌであった。
α−32Ｐ−ｄＣＴＰ ４００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅを０．
６μＭまでかつコールド（放射化していない、ｃｏｌ
ｄ）ｄＣＴＰを４μＭまで用いて１５分間ｃＤＮＡを標
識した。その後、コールドｄＣＴＰを２５μＭまで加え
て第１ストランドの最適な伸長を確実にした。 【００３３】ｄＣＴＰ追跡（付加、chase ）の３０分後
ＥＤＴＡを２０ｍＭまで、ＳＤＳを０．５％まで加えて
反応を停止させ、プロテイナーゼＫ １００μｇ／ｍｌ
で１時間消化し、フェノール−クロロホルム抽出した。 【００３４】次にＧ−５０ Sephadex (Pharmacia)上で
ｃＤＮＡを精製し、エタノール沈殿した。 【００３５】１．３ 第２ストランド合成とクローニン
グ 精製しｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをGUBLERとHOFFMA
N （１７参照）に従ってＤＮＡポリメラーゼＩとRNase
H で処理した。ターミナルトランスフェラーゼを用いて
２本鎖ｃＤＮＡの末端にｄＣを付加（ｄＣ−ｔａｉｌ）
し、ｐＢＲ３２２の誘導体であるｐＢＲ３２７（３４参
照）をｐｓｔ消化し、末端にｄＧを付加したものとアニ
ールした。 【００３６】大腸菌(E.coli)Ｃ６００ ｒｅｃＢＣ株を
トランスフェクションしてｃＤＮＡライブラリーを得
た。 【００３７】２． ＬＡＶ−特異的クローンの検出 ２．１ ライブラリーのスクリーニング ５００個の組換えクローンをニトロセルロースフィルタ
ー上で増殖させ、既報（１，２参照）のように内因性ウ
イルス関連反応で作成し、32Ｐで標識したｃＤＮＡのも
う１つのバッチを用いてその場（in situ)でコロニーハ
イブリダイゼーション（３５参照）を実施した。クロー
ンの約１０％が検出できた。 【００３８】これらのクローンを小規模に増幅しそれら
のインサートのクロスハイブリダイゼーションを行なっ
て主要な１群を得た。これらのクローンのうち組換え体
とハイブリダイズする主要な１群を同定した。これらの
ｃＤＮＡクローンのうち３個、すなわち２．５ｋｂ、
０．６ｋｂおよび０．８ｋｂのインサートをもつものを
それぞれｐＬＡＶ１３、７５および８２と命名して更に
特性決定した（第１図）。 【００３９】３種のインサートは全て一端に共通の制限
パターンをもっており、プライミング部位が共通である
ことを示唆している。長さ５０ｂｐで共通のHind III−
Ｐｓｔ Ｉ断片の配列を決定した（第１図）。これら共
通断片はクローニングｄＣテイル部の前にポリＡ鎖を含
有することが示された。すなわちこれらのクローンはポ
リＡ−ＲＮＡの３′末端のコピーである。 【００４０】ＬＡＶ１３の特異性をいろいろなアッセイ
で示した。 【００４１】ｐＬＡＶ１３の特異性を、ニック翻訳した
ｐＬＡＶ１３をプローブとして用いた一連のフィルター
ハイブリゼーション実験で決定した。先ずこのプローブ
はドット(dot) およびノーザン(Northern)ブロッティン
グによって精製したＬＡＶゲノムＲＮＡにハイブリダイ
ズした（データは示さず）。またｐＬＡＶ１３は培養上
清から濃縮されフィルターに直接固定されたウイルスの
ゲノムＲＮＡにもハイプリダイズする（ドットブロット
法）。同様な方法でいろいろな起源、すなわち正常Ｔ細
胞、ＦＲ８その他のＢ細胞のＬＡＶ産生株、ＣＥＭ細
胞、および、（これら程強くはないが）ＡＩＤＳに罹っ
た血友病患者から得た骨髄培養物由来のＬＡＶ（３参
照）から得たＬＡＶ ＲＮＡが検出された。非感染培養
物は負であることが立証された。この迅速なドットブロ
ット法は多少修正すれば血清その他の体液中のＬＡＶの
検出に適用することができる。 【００４２】第二にこのプローブはＬＡＶに感染したＴ
リンパ球のサザン(Southern)ブロットとＬＡＶを産生す
るＣＥＭ細胞株(cell line) とにおいてＤＮＡを検出し
た。同じハイブリダイゼーション条件下では、非感染リ
ンパ球のＤＮＡでも正常肝から得たＤＮＡでもハイブリ
ダイゼーションは検出されなかった（データは示さ
ず）。 【００４３】後述するようにＬＡＶウイルス群の全レト
ロウイルスゲノムを同定するのにＬＡＶ１３を用いるこ
とができるという可能性から第３の特徴が導かれた。Hi
nd IIIで開裂したｐＬＡＶ１３中の内部ウイルス断片と
共に移動する特に特徴的な１．４５ｋｂ Hind III 断片
が検出された。２．３ｋｂと６．７ ｋｂにもバンドが
検出された。このプロープの長さは２．５ｋｂしかな
く、しかも接合断片は全く検出できなかったので、これ
ら大き過ぎるバンドは、ＬＡＶゲノムのHind III多型性
から生じた内部断片に当たるのであろう。 【００４４】これらのデータを合わせると、ｐＬＡＶ１
３ＤＮＡはヒトゲノムに対して外因性であり、ＬＡＶに
感染した細胞から得たＲＮＡ形も組み込まれたＤＮＡ形
も双方とも検出することが示される。すなわちｐＬＡＶ
１３はＬＡＶに特異的である。従来知られているレトロ
ウイルスのゲノム構造を考えれば、ｐＬＡＶ１３はオリ
ゴ−ｄＴでプライムしたのでコード領域の３′末端と共
にＬＴＲのＲ領域とＵ３領域も含有するはずである。 【００４５】ＬＡＶゲノムＤＮＡのクローニング ＬＴＲのＲ領域内にHind III部位があることが判明した
ので、ＬＡＶに感染した細胞から得たプロウイルスＤＮ
ＡをHind IIIで部分消化することによりＬＡＶゲノムを
クローン化することにした。(a) 部分消化すると完全な
クローンを単離する機会が増大すること、および(b)Hin
d III 断片はラムダ置換ベクター(lambda replacement
vectors)中で容易にクローン化されることが判明した。
健常ドナーから得インビトロで(in vitro)ＬＡＶに感染
させた後のＴ細胞から単離したＤＮＡをHind IIIで部分
消化して分画した。９±１．５ｋｂＤＮＡを含有する画
分を沈殿させ、ラムダ−Ｌ４７．１のHind III腕(arms)
内へ連結した（１８参照）。 【００４６】ＬＡＶゲノムＤＮＡのクローニングはさら
に詳細には次のようにして行なった。 【００４７】ｃＤＮＡを上述のようにＬＡＶに感染した
Ｔ細胞から調製した後、Hind IIIで部分的に消化し、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ（ｐＨ８）。１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１Ｍ ＮａＣｌ中５〜４０％のシュクロース勾配上
で分画した（ＳＷ４１ローター、４０，０００ｒｐｍで
１６時間）。単一画分（９±０．５ｋｂ）をキャリヤー
としてのDextran Ｔ４０ ２０μｇ／ｍｌで沈殿させ、
ＴＥバッファー（１０ｍＭ Tris.Cl,pH8,1mM EDTA) 中
に取った。λ−Ｌ４７．１Hind III腕は、先ずｃｏｓ部
位を連結した後Hind IIIで消化し５〜４０％のシュクロ
ース勾配を通して分画して調製した。λ−Hind III腕の
みを含有する画分をプールし、沈殿させ、ＴＥ−バッフ
ァーに取った。この腕とＤＮＡの連結は、３：１過剰モ
ル濃度の腕と３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolab
s) とを用いてＤＮＡほぼ２００μｇ／ｍｌで行なっ
た。溶解物(lysates) のin vitroパック組立(packagin
g) は（３８）に従って行なった。in vitroパック組立
後このファージの溶菌物(lysate)をＣ６００ｒｅｃＢＣ
株上のＮＭ５３８の上にプレートアウトした。ニトロセ
ルロースフィルターを用いたin situ ハイブリダイゼー
ション（３９参照）によって約２百万のプラークをスク
リーニングした。ハイブリダイゼーションは１×Denhar
dt溶液、０．５％ＳＤＳ，２×ＳＳＣ，２ｍＭ ＥＤＴ
Ａの中６８℃で行なった。プローブはｐＬＡＶ１３の32
Ｐでニック翻訳したＬＡＶインサートであった（＞１０
8 ｃｐｍ／μｇ）。フィルターを６８℃の０−１ＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳ中３０分間で２回洗浄し、Kodak XA
R −５フィルムに２９〜４０時間露出した。陽性のクロ
ーンを７個同定し、Ｃ６００ｒｅｃ ＢＣ株上でプラー
クを精製した。液体培養し、組換えファージをＣｓＣｌ
中にバンド分けした。ファージＤＮＡを抽出し、適当な
条件下で消化した。 【００４８】このように、ニック翻訳したｐＬＡＶ １
３インサートをプローブとして用いたin situ スクリー
ニングによって約２百万のファージプラークから７個の
別々のクローンが得られた。λ−Ｊ１９の制限地図をHi
nd III多型性のλ−Ｊ８１の制限地図と共に第２図に示
す。他の組換えλ−Ｊ２７、λ−Ｊ３１およびλ−Ｊ５
７はλ−Ｊ１９と同じHind III地図を示した。λ−Ｊ８
１の地図は同様であるが約５５５０の座標の所に余分な
Hind III部位がある。 【００４９】第２図の制限地図はブロットをｐＬＡＶ１
３ＤＮＡに対してハイブリダイスすることで方向を決定
した。 【００５０】ＬＡＶ１３ｃＤＮＡクローンの制限地図も
第２図に示してある。λ−Ｊ１９の制限部位はＢがBamH
Ｉ、ＢｇがBg１ II 、ＨがHind III、ＫがKpn I 、Ｐが
PstI 、ＲがEco RI、ＳがSac I 、ＳａがSal I 、ＸがX
ho I である。目盛り（スケール）の下にはレトロウイ
ルスの一般的な構造の概略図があり、これにはＬＴＲの
要素の要素Ｕ３，ＲおよびＵ５が示されている。Ｒ／Ｕ
Ｓ境界のみがはっきり決められており、他の境界は単に
比ゆ的に図示しただけである。 【００５１】λ−Ｊ１９の５′の０．５２ｋｂ HindIII
断片中には他のBamH I部位があるかもしれない。これら
の部位は小さ過ぎて検出できない断片を生じる。 【００５２】第２図はまた、λ−Ｊ１９とλ−Ｊ８１の
Hind III断片のうちｐＬＡＶ１３で検出されるものを
(＋) として検出されないものを (-)として示してい
る。 【００５３】さらに詳細にみると、λ−Ｊ１９には４つ
のHind IIIバンド、すなわち６．７ｋｂ、１．４５ｋ
ｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂのバンドがあり、こ
れらの最初の２つがHind IIIで制限したＤＮＡのゲノム
ブロット中にあるバンドに対応する。最小の０．６ｋｂ
と０．５２ｋｂのバンドはゲノムブロット内にはみられ
なかったが、これらが独立に得られた分析クローンの全
てに現われるという事実は、ＬＡＶのプロウイルスＤＮ
Ａのランダムな組み込みを仮定すると、これらのバンド
が内部断片に相当するもので接合断片(junction fragme
nts)ではないということを示唆している。実際、０．５
ｋｂバンドはｐＬＡＶ１３の小さいHindIII −Ｐｓｔ
Ｉ断片を介してｐＬＡＶ１３ＤＮＡとハイブリダイズす
る（第２図）。すなわちλ−Ｊ１９の０．５ｋｂ Hind
III断片はＬＴＲ内部のＲ−Ｕ５接合部(junction)を含
有している。 【００５４】λ−Ｊ８１はλ−Ｊ１９の制限部位多型現
象であると思われる。λ−Ｊ８１には４．３ｋｂ、２．
３ｋｂ、１．４５ｋｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂ
の５種のHind IIIバンドがある。この２．３ｋｂバンド
はｐＬＡＶ１３プローブによるゲノムブロットで容易に
検出されるが、４．３ｋｂ断片は検出されない。λ−Ｊ
８１がHind III多型現象の１つであり組換えウイルスで
はないということは、ニック翻訳したλ−Ｊ１９ＤＮＡ
が緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下でλ−
Ｊ８１の５つのHind IIIバンド全てとハイブリダイズす
るという事実によって示される。また、λ−Ｊ８１内の
その他の制限部位はλ−Ｊ１９と同一である。 【００５５】ＬＡＶ由来ｃＤＮＡの配列決定 ファージ組換え体に対し特に重要な部位の配列決定を行
なった。 【００５６】クローンλ−Ｊ１９の組換えファージＤＮ
Ａ全体をＤＥＩＮＩＮＧＥＲ（１９８３）、Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２９，２１６のプロ
トコル（手順）に従って超音波処理した。このＤＮＡを
クレノウ(Klenow)反応によって１６℃で１２時間修復し
た。ＤＮＡを０．８％アガロースゲル中に電気泳動さ
せ、３００〜６００ｂｐのサイズ範囲のＤＮＡを切出
し、電気溶出し、沈殿させた。ＤＮＡを（１０ｍＭ Tr
is,pH8,0.1mM EDTA 中に）再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡ−およ
びＲＮＡ−リガーゼ(Maniatis Ｔら(1982)、Molecular
cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) を用いて、
（制限酵素ＳｍａＩで切断した後アルカリ性ホスファタ
ーゼ処理をした）Ｍ１３ｍｐ８ＲＦ ＤＮＡ中に連結し
た。ＴＧ１と名付けたＥ．ｃｏｌｉ株を用いて以下の研
究を行なった。この株の遺伝子型はΔｌａｃ ｐｒｏ，
ｓｕｐＥ、ｔｈｉ．Ｆ′ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌ
ａｃＩq ，ＺΔＭ１５，ｒ- である。 【００５７】このＥ．ｃｏｌｉ ＴＧＩ株の特有の性質
によって組換え体を容易に識別できる。ＬＡＶ ＤＮＡ
の断片で組換えなかったプラスミドによってトランスフ
ェクトされた細胞の青色は変化しない。逆に、ＬＡＶ
ＤＮＡ断片を含有する組換えプラスミドでトランスフェ
クトした細胞は白色のコロニーとなる。用いた方法はＧ
ｅｎｅ（１９８３）、２６，１０１に開示されている。 【００５８】Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ
（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．，１６６，５５
７）を用い、この菌株を連結混合物で形質転換した。軟
アガロース中にＩＰＴＧとＸ−ｇａｌを有するトリプト
ン−アガロースプレート上にプレートアウトした。白色
のプラークを摘出した後かまたは直接in situ でニトロ
セルロースフィルターを用いてスクリーニングした。こ
れらプラークのＤＮＡはλ−Ｊ１９のｐＵＣ１８Hind I
IIサブクローンのＤＮＡインサートをニック翻訳したも
のとハイブリダイズした。これによって後記表に示すλ
のプラスミドまたはサブクローンの単離が可能になっ
た。この表に関して、各プラスミドの表示の後ろに各各
のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＧＩの培養細
胞をフランス、パリのPasteur Institute の“Collecti
on Nationale des Cultures de Micro-organismes ”
（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）に寄託した番号も示されているこ
とに注意されたい。形質転換してないＴＧＩ細胞株も番
号Ｉ−３６４でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託した。これらの
寄託は全て１９８４年１１月１５日付で行なった。ＬＡ
Ｖゲノムから得られた対応するインサートのサイズも一
緒に示す。 【００５９】 表 組換えプラスミドの基本的特徴 −ｐＪ１９−１プラスミド （Ｉ−３６５） ０．５ｋｂ Ｈｉｎｄ III−Ｓａｃ Ｉ−Ｈｉｎｄ III −ｐＪ１９−１７プラスミド（Ｉ−３６７） ０．６ｋｂ Ｈｉｎｄ III−Ｐｓｔ Ｉ−Ｈｉｎｄ III −ｐＪ１９−６プラスミド （Ｉ−３６６） １．５ｋｂ Ｈｉｎｄ III（５′） Ｂａｍ ＨＩ Ｘｈｏ Ｉ Ｋｐｎ Ｉ Ｂｇｌ II Ｓａｃ Ｉ（３′） Ｈｉｎｄ III −ｐＪ１９−１３プラスミド（Ｉ−３６８） ６．７ｋｂ Ｈｉｎｄ III（５′） Ｂｇｌ II Ｋｐｎ Ｉ Ｋｐｎ Ｉ Ｅｃｏ ＲＩ Ｅｃｏ ＲＩ Ｓａｌ Ｉ Ｋｐｎ Ｉ Ｂｇｌ II Ｂｇｌ II Ｈｉｎｄ III（３′） 正にハイブリダイズするＭ１３ファージプレートを５時
間増殖させ、一本鎖ＤＮＡを抽出した。 【００６０】Ｓａｎｇｅｒらによって改良されたジデオ
キシ法および技法（Sangerら(1977)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463およびＭ１３ Cloning and sequen
cinghandbook, AMERSHAM (1983)）に従って、λＪ１９
ＤＮＡのＭ１３ｍｐ８サブクローンの配列決定をした。
１７量体のオリゴヌクレオチドプライマーα−35ＳｄＡ
ＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＡＭＥＲＳＨＡＭ）、お
よび０．５Ｘ−５Ｘバッファー勾配ゲル（Ｂｉｇｇｅｎ
Ｍ．Ｄ．ら（1983），Pro. Natl, Acad. Sci. USA, 5
0, 3963 ）を用いた。ゲルを読み取り、Ｓｔａｄｅｎの
プログラム（Ｓｔａｄｅｎ Ｒ．(1982) Nucl. Acids R
es., 10, 4731 ）を組み込んだコンピューターに入力し
た。適当な参考文献と方法は全てAMERSHAM M13 Cloning
and sequencing handbook中に書いてある。 【００６１】λＪ１９の完全な配列を第４〜１１図に示
す。 【００６２】他のヒトレトロウイルスとの関係 ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIはＴ細胞サブセットである
ＯＫＴ４に対する指向性をもった１対のＣ−タイプ形質
転換型レトロウイルスを構成している（２０参照）。単
離したＨＴＬＶ−Ｉは全配列が決定されており（２１参
照）、ＨＴＬＶ−IIの部分配列も決定・報告されている
（２２〜２４参照）。どちらのゲノム（ＬＴＲ１個）も
長さが約８．３ｋｂであり、ｐＸ領域を有しており、広
い範囲で配列に相同性がある。これらのゲノムはかなり
緊縮な条件（４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ）下でお
互いにハイブリダイズし、しかもｐＸ領域は６０％ホル
ムアミドでさえハイブリダイズする（２６参照）。した
がって、保存されたｐＸ領域はこの類のウイルスの際立
った特徴である。 【００６３】我々はクローン化したＬＡＶ ＤＮＡとク
ローン化したＨＴＬＶ−ＩＩ ＤＮＡ（ｐＭＯ、２７参
照）とをブロット−ハイブリダイゼーションで比較し、
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の低緊縮条件下では
クロス−ハイブリダイゼーションが全く起こらないこと
を見出した。たとえば、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化したλ
−Ｊ１９、λ−Ｊ２７およびλ−Ｊ８１を電気泳動さ
せ、ブロットし、32Ｐ−ニック翻訳したｐＭＯ（ＨＴＬ
Ｖ−ＩＩ）ＤＮＡ（比活性は０．５×１０8ｃｐｍ／μ
ｇより大）と、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×
Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕ
ｌｐｈａｔｅ（硫酸デキストラン）中３７℃で一晩ハイ
ブリダイズさせた。ＨＴＬＶ−Ｉ配列（２１）から得た
５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ．５０）ｔ
ｍ．５０でフイルターを洗浄した。洗浄を５０℃と６５
℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で繰り返した。２０
％ホルムアミド、８×ＳＳＣ（ｔｍ．５０）中でハイブ
リダイズさせ、２×ＳＳＣ（ｔｍ．５０）中３７℃で洗
浄した場合でさえ、増感スクリーンを用いて−７０℃で
２日露光した後でもハイブリダイゼーションは全く検出
されなかった。 【００６４】このように、ＬＡＶとＨＴＬＶウイルスの
間の関係を示す分子的な証拠はない。また、ＨＴＬＶウ
イルスが８．３ｋｂであるのに対しＬＡＶゲノムはほぼ
９ｋｂの長さである。ゲノムサイズが近いにもかかわら
ず、ＬＡＶとビスナ（Ｖｉｓｎａ．２９参照）のクロー
ン化したウイルスゲノムはクロスハイブリダイズするこ
とはなく、非緊縮条件（ハイブリダイゼーション２０％
ホルムアミド、８ＳＳＣ、３７℃；洗浄２ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ、３７℃）でＬＡＶと多くのヒト内因性ウイ
ルスゲノム（３０参照）とのハイブリダイゼーションが
起こることもない。 【００６５】本発明はまた、さらに特定的には本発明に
よるＤＮＡ断片のいずれかから出発して作製することが
できるクローン化プローブにも係り、したがってこのよ
うな断片を含有する組換えＤＮＡ特に原核または真核細
胞中で増幅でき前記の断片を担持しているあらゆるプラ
スミドにも係る。既に述べたように好ましいＤＮＡ断片
はＬＡＶ１３である。 【００６６】クローン化したプロウイルスＤＮＡを放射
性核種か蛍光試薬のいずれかで標識することにより分子
ハイブリダイゼーションプローブとして用いるとＬＡＶ
ビリオンＲＮＡを、血液、体液および（たとえば第VIII
因子濃縮物のような抗血友病因子の）血液製剤ならびに
ワクチンすなわちＢ型肝炎ワクチン中で直接検出しう
る。ＬＡＶ産生細胞の培養上清中でウイルス全体が検出
できることは既に示されている。その検出を達成する適
切な方法は、前記の如き担体たとえばニトロセルロース
フィルター等にウイルスを固定し、ビリオンを破砕し、
標識（放射標識または「冷い（ｃｏｌｄ）」蛍光もしく
は酵素標識）したプローブとハイブリダイズすることで
ある。このような方法は既に、末梢血中のＢ型肝炎ウイ
ルスの場合について（ＳＣＯＴＴＯ，Ｊ．ら、Hepatolo
gy(1983), 3, 379-384 に従って）開発されている。 【００６７】本発明のプローブはまた、ＬＡＶ関連症状
を示している患者の組織から得たゲノムＤＮＡの迅速な
スクリーニングに使用してプロウイルスＤＮＡまたはＲ
ＮＡが宿主組織およびその他の組織中に存在するかどう
かを検べることもできる。 【００６８】このようなスクリーニングに使用できる方
法は次のステップからなる。すなわち、組織からのＤＮ
Ａの抽出、このＤＮＡの制限酵素開裂、断片の電気泳動
および組織からのゲノムＤＮＡのサザンブロッティン
グ、その後の標識クローン化ＬＡＶプロウイルスＤＮＡ
とのハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションも使用できる。 【００６９】また、ヒト、霊長目その他の哺乳類の種の
リンパ液やリンパ組織およびその他の非リンパ組織を別
の進化上関連したレトロウイルスが存在するかどうかを
検討するためにスクーニングすることもできる。上述の
方法が使用できるがハイブリダイゼーションと洗浄は非
緊縮条件下で行なわれるであろう。 【００７０】本発明のＤＮＡは診断目的用のＬＡＶウイ
ルス抗原の発現を達成するためにと、もちろんＬＡＶに
対するワクチンの製造にも使用できる。この点特に有利
なのはコア（ｇａｇ領域）およびエンベロープタンパク
質をコードしているＤＮＡ断片、特にＫｐｎ Ｉ（６１
００）からＢｇｌII（９１５０）まで延びるＤＮＡ断片
である。 【００７１】このために使用できる方法は多様である。 【００７２】ａ）ＤＮＡは様々な技法、たとえばリン酸
カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール、プロトプラ
スト−融合、等によって適当な選択マーカーをもった哺
乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる。 【００７３】ｂ）遺伝子に対応するＤＮＡ断片をＥ．ｃ
ｏｌｉ、酵母または哺乳類の細胞用の発現ベクター中で
クローン化し、得られたタンパク質を精製することがで
きる。 【００７４】ｃ）プロウイルスＤＮＡを「ショットガン
によって（断片化して）」原核生物発現ベクター中に導
入して融合ポリペプチドを生成させることができる。抗
原性のある融合タンパク質を産生する組換え体はこの組
換え体ＬＡＶ抗原に対する抗体で単にスクリーニングす
るだけで同定できる。 【００７５】ｄ）本発明はまた、免疫原と抗原を産生す
べくＬＡＶ抗原−遺伝子のＤＮＡ配列から推定され、化
学的に合成できるオリゴペプチドにも係る。 【００７６】上記（ａ〜ｄ）は全て診断において許容さ
れない系を用いて産生されるウイルス粒子をもたない、
したがって生物学的危険がほとんどまたは全くない免疫
原または抗原の入手源として使用できる。 【００７７】さらに本発明は上述の組換え体で形質転換
され、前記ＤＮＡ断片を発現することができる宿主（原
核または真核細胞）に係る。 【００７８】最後に本発明は、活性成分が発現された抗
原、すなわち抗原全体、融合ポリペプチドまたはオリゴ
ペプチドから成るようなワクチン組成物にも係る。 【００７９】本発明は最後に、ＬＡＶウイルス群から抽
出するかまたはｃＤＮＡから再度合成（転写）すること
ができる精製ゲノムｍＲＮＡ、特に大きさがほぼ９．１
〜９．２ｋｂで上記に定義したＤＮＡ断片のいずれかに
ハイブリダイズできる精製ｍＲＮＡ、あるいは前記精製
ｍＲＮＡの一部に関する。また本発明は前記ＲＮＡの一
部分にも係る。この精製ＲＮＡまたはその一部分のヌク
レオチド構造は実際関連ｃＤＮＡのヌクレオチド配列か
ら推定することができる。 【００８０】最後に、ラムダ−Ｊ１９とラムダ−Ｊ８１
は１９８４年９月１１日付でそれぞれ番号Ｉ−３３８と
Ｉ−３３９をもってＰａｓｔｅｕｒ（フランス）のＩＮ
ＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄ
ｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．
Ｍ）に寄託されていることに言及しておく。 【００８１】終りに本発明は、そのＤＮＡ配列を決定し
てウイルスタンパク質（抗原）のアミノ酸配列の予知に
使用することができるようなゲノムＤＮＡ、およびｃＤ
ＮＡから誘導することができるＲＮＡプローブに関す
る。 【００８２】本明細書を通じてかっこで括った数で参照
して来た参考文献の目録を次に挙げる。 【００８３】次の目録で参照されている刊行物は全て引
用によってここに含まれるものとする。 【００８４】参照文献 １．Barre-Sinoussi, F. et al. Science 220, 868-871
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180-192(1977).
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド組換え体に含有される好ましいＬＡ
Ｖインサートの制限地図を示す。 【図２】完全なＬＡＶ断片の制限地図を示す。 【図３】完全なＬＡＶゲノム（クローンλＪ１９）の制
限地図を示す。 【図４】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図５】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図６】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図７】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図８】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図９】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図１０】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全
配列を示す。 【図１１】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全
配列を示す。
Ｖインサートの制限地図を示す。 【図２】完全なＬＡＶ断片の制限地図を示す。 【図３】完全なＬＡＶゲノム（クローンλＪ１９）の制
限地図を示す。 【図４】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図５】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図６】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図７】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図８】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図９】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配
列を示す。 【図１０】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全
配列を示す。 【図１１】第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全
配列を示す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｑ 1/68
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 マルク・アリゾン
フランス国、75005・パリ、リユ・ド
ユ・カルデイナル・ルモワンヌ、71
(72)発明者 フランソワーズ・バール・シヌーシ
フランス国、92130・イツシー・レ・ム
リノー、リユ・デヴラン、50、ル・カプ
リコルヌ・104
(72)発明者 ピエール・ソニゴ
フランス国、75015・パリ、リユ・ド
ウ・サツクス、64
(72)発明者 ピエール・チオレ
フランス国、75013・パリ、リユ・ド
ウ・ラ・グラシエール、16
(72)発明者 ジヤン−クロード・シエルマン
フランス国、78310・エランクール、ク
ロ・ドルガル、２
(72)発明者 リユツク・モンテニエ
フランス国、92350・ル・プレシ・ロバ
ンソン、リウ・ドウ・マラブリ、21
(72)発明者 シモン・ヴアンーオブソン
フランス国、78180・モンテイニ・ル・
ブルトヌー、リユ・ジヤン・ドウ・ラ・
フオンテーヌ、32
(56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＶＯＬ．225，（31.
Ａｕｇ．1984），Ｐ927〜930
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ＬＡＶのラムダＪ１９（ＣＮＣＭ Ｉ−３３８）中
に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムのｃＤＮＡの全
部又はその一部であるＤＮＡインサート断片を含有する
クローン化ＤＮＡを転写（又は該クローン化ＤＮＡから
再合成）することにより得られ且つＬＡＶヌクレオチド
配列よりなるＲＮＡであって、該ＤＮＡインサート断片
が２０％ホルムアミド、８×ＳＳＣ、３７℃でのハイブ
リダイゼーション及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３
７℃での洗浄からなる非緊縮条件下でＬＡＶウイルスの
ゲノムＲＮＡとハイブリダイズするが、２０％ホルムア
ミド、５×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、１０％硫酸デ
キストラン中３７℃での低緊縮条件ハイブリダイゼーシ
ョン及び洗浄下のドット−ハイブリダイゼーションアッ
セイにおいてはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩレトロ
ウイルスのＲＮＡとクロス−ハイブリダイズしないこと
を特徴とするＲＮＡ。
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