JPS62502868A - ヒトｔリンパ球指向性ウイルスタイプ３のプラスミド及びファ−ジクロ−ン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＴリンパ球指向性ウィルスタイプ■のプラスミド及びファージクローン ＨＴＬＹ−１［／ＬＡＶの分子クローンが開示されている。

クローンλＨＸＢ−２，λＨＸＢ　−３、ｐＨＸＢ　−２Ｄ及びｐＨＸＢ−５Ｄ は１組込まれたＨＴＬＶ−１１／ＬＡＶのプロウィルスのヌクレオチド配列全長 を含む。前者の２種はλフアージ内に挿入てれており；後者の２種はプラスミド ベクター内にウィルスの配列を含み、そしてＴ細胞培養液に対して細胞変性性で らり、試験管内で感染性である。

さらに、プラスミドクローンｐＨＸＢ−２Ｄ及びｐＨＸＢ−３Ｄｕ、単一の遺伝 子型のウィルスを産生ずるために使用し得、それ故に該プラスミドクローンＦｉ 、後天性免疫不全症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ））の新規な薬剤またはワクチンの 効果を試験するために使用し得る。

背景 後天性免疫不全症候群（エイズ）は、Ｔ−４（ヘルパー）リンパ球の減少と特徴 的に結びついた流行性の免疫抑制疾患である。レトロウィルスの一部は、ヒトＴ リンパ球指向性ウィルスタイプｍ　（ＨＴＬＶ−１［）、＋７　ｙパ腺症関連ウ ィルス（ＬＡＶ）及びエイズ関連ウィルス（ＡＲＶ）として表わされ、エイズの 発病に関連した同種のウィルスの変種である。

本発明の分子クローンは、ＨＴＬＶ−３１の組込まれたプロウィルスＤＮＡ　？ 含む。レトロウィルスの生活環において、宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みの 前に、−重鎖ＲＮＡゲノムは、組込まれかい線状ＤＮ人体に逆転写酵素によシ複 製されなければならない。線状の組込まれないＤＮＡ二重鎖は、変わらない順序 でウィルスのゲノムのコピーを含み、そしてウィルス感染直後の感染細胞の細胞 質中に短寿命の複製中間体としてのみ一般的に検出され得る。組込みの間Ｋ、ウ ィルスの遺伝子要素と細胞の遺伝子要素との組換えが起こる：即ち、細胞は形質 転換され、そしてウィルスの遺伝情報は細胞と共に再生産される。

上記のＨ９／ＨＴＬＶ−１［の組込まれない線状ＤＮＡ体はクローン化でれてい る。これらのフェーズクローン（ｐｈａｓｅ　ｅｌｏｎｅ　）　＃−１、λＢＨ −１ｏ、λＢＨ−８及びλＢＨ−５として表わされ、ウオングースタール等（Ｗ ｏｎｇ　−５ｔａａＣｅｔ　ｈｌ　）の米国特許出ＨＫ６４１３０６号、１９８ ４年８月２２日出願中に記載てれている。組込まれたプロウィルスＤＮＡと組込 まれない線状ＤＮＡのクローンはお互いに類似しているが、しかし種々の切断部 位の相違によフ区別することができる。λＢＨ−１０．λＢＨ−８及びλＢＨ− ５は、５　ＬＴＲ先導配列領域内のおよそ１９０塩基対から々る短いＳａｔ　ｌ −８ｓｔ　１部位を欠いている不完全なウィルスクローンである。これらの配列 は、純粋なウィルス個体群を産生ずる能力を与える。さらに、本発明のファージ クローン、λＨＸＢ−２及びλＨＸＢ−！Ｓは、グラスミク、ウィルスの抗原を 発現し、成熟ウィルス粒子を産生じ、そして試験管内で顕著な細抱変性効果を示 す。

ウィルスのゲノムが長さおよそ１０Ｋｌ）であり、各°端部に非コード要素、Ｌ ＴＲ要素を有することを１本発明のＨＴＬＶ−１１プロウイルスクローンの分析 は示す。ＨＴＬＶ−■のこれらの全長プロウィルスクローンと、同じＨＴＬＶ− １！［ｇ染Ｈ９ＭＩＩｉＭ（りａ−ｙλＢＨ−ｔｏ、２ＢＨ−ｓ及びλＢＨ−５ ）から誘導された線状の組込まれないウィルスＤＮＡとの比較は、それらが類似 しているが、しかし制限パターンが同一ではないということを示す。

ンの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す、λＨＸＢ−２及ヒλＨＸＢ−３Ｂ、　 Ｈ９／ＨＴＬＶ−１１１ＤＮＡ　Ｏ２７７−シｙイプラリイ（実施例１）から得 られるＨＴＬＶ　−１１［の全長の組込まれたプロウィルス体を表わす。これら のクローンは、両端側の細胞性配列（太い線）Ｋ加えて２ケ所のＬＴＲ領域を含 む完全なプロウィルス（細い線）を含む。

該ＬＴＲ領域が、示したように５ケ所の制限酵素部位ＢｇｌＴｉ、５ｓｔｌ及び ＨｉｎｄＩＩＩ　ｔ”含むことは公知であるが。

しかしそれらの全体の長さは見積もられている。クローンλＢＨ−１０及びλＢ Ｈ−５／λＢｌ（−８は、急性感染したＨ９細胞中のＨＴＬＶ−Ｉｎの線状の組 込まれない複製性中（１９８４年）罠記ｆａ、てれた。これらの制限地図は。

λＨＸＢ−２とλＨＸＢ−３との比較及びｉ胞を含有するその他のＨＴＬＶ−［ １からのゲノムＤＮＡのサザンプロットとの比較のため罠、ここに示しである。

共［１つのＨＴＬＮｒ−ｍゲノムの等価物を構成するが、しかし必ずしも同一の ウィルス分子から誘導でれる必要はない２種類の別々にクローン化されたＳｓｔ 　ＩＭ片（λＢＨ−５及びλＢＨ−８）からλＢＨ−５／λＢＨ−８　がなると いうことは注目すべきである。また５　λＢＨ−１ｏ及びλＢＨ−５は、制限酵 素５ａｔｌでクローン化されたから、これらは示されるように５′ＬＴＲ配列を 欠いている。参照として利用したλＢＨ−１゜と、これらのＨＴＬＶ−］１クロ ーンの間の制限地図内のその他の違いＦｉ、太字及び星印により示す。

第２図は、ＨＴＬＶ−ｌ＝ｉ含むグラスミドの構造を示す。

λＨＸＢ−２から誘導され７；１２．７ｋｌ）のＸｂａｌ断片、約１０ｋｂのＨ ＴＬＶ−［プロウィルス配列を含む分子クローン＃ｉ、プラスミドｐ８Ｐ　６２ のポリリンカー内のＸｂａｌ　部位内に挿入嘔れ、プラスミドクローンｐＨＸＢ 　−２Ｄ　ｆ　ｇ造した。このプラスミド構造物は次にＤ）１−１細菌内にトラ ンス７エクシツンさせ、そしてプロトプラスト融合実験に使用した。細い横線は Ｈ’ｌ”ＬＶ−ＩＩＩを表し、そして黒ぬ夕の箱は両端にある細胞性配列を表わ す。

寄託の声明 分子クローンλＨＸＢ　−２、λＨＸＢ−３．ｐＨＸＢ−２Ｄ及びｐ　ＨＸＢ　 −５ｆ　、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクシ璽ン〔人ｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ１２０８５２ １７７６アメリ力合衆国、マリ−ランド、ロックう°′イ１し、パーク日ラン　 ドライブ１２３０１　）ＫＡＴＣＣ第４０２３１．４０２３２．６７０８２およ び６７０８１号の下に１９８６年５月２日寄託した。

詳細な開示 本発明は、下記の流れ図により一般的な表現で表わし得る： プロウイルスＨＴＬＶ−１ｉＤＮＡ配列る不死化細胞 ヒトＴリンパ球指向性ウィルスタイプ■（ＨＴＬＶ−［１）（Ｄ配列１−２．　 感染ＬｔＨ９ｍ胞（Ｈ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）ＯＤＮＡにおいて、ＨＴＬＶ−１ １１ピリオンから調製した　ｐ標識相補性ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）グローブを使用 したサザンプロット分析により最初に検出された。感染していないＨ９細胞にこ のよう表記列の存在する証拠は無かった。Ｈ９／ＨＴＬＶ−■ＤＮＡのサザン消 化の予備分析は、ウィルスがこの細胞系において１組込まれていないＤＮＡとし て、及び多くの異なる部位で細胞性ゲノム内に組込まれたプロウィルスＤＮＡと して両方で存在することを明らかＫした。ＨＴＬＶ−［１プロウイルスは、Ｘｂ ａｌ制限部位を欠くことがわかったので、ゲノムのライブラリィはＸｂａｌ−消 化Ｈ９／ＨＴＬＶ−ｐｉ　ＤＮＡ　（ｍＦｆ＆’６ＤＮＡ　）’ｊｃ使用−ｒる ことにエフ製造し、そしてこれ′ｋＨＴＬＶ−１１ｃＤＮＡプローブでスクリー ニングして両端に細胞性配列を有する組込まれたプロウィルス全長の分子クロー ンｔ−得た。

そのようなりローンは、１０６個の組換えファージの製経ライブライから１４′ Ｍ得られ、そしてこれらのうちの２種にプラークｎ製および特徴づけをした。こ れらのうち。

細胞性の両端にある配列を有し組込まれたプロウィルス全−ｊＥ（約１０キロベ ース）を含有するファージクローンλＨＸＢ−２及びλＨＸＢ−ｓ（全体の長て １２−７キｐベース）を、各々プラスミドクローンｐＨＸＢ−２Ｄおよびｐ　Ｈ ＸＢ−３Ｄを製造するためＫ、プラスミドｐ８Ｐ６２　のポリリンカーのＸｂａ １部位内に挿入した。このプラスミド構造物は１次にプロトプラスト融合実験に 使用するためＫＤＨ−１細菌内にトランス７エクシツンさせた。

好ましいプロトゲラスト融合グロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）において、２− ４）ｌＯＩＬｔ−の濃度までアンピシリンｔ−含むＬ−グロス内で、グラスミド を産生ずる細菌の単一コロニーを増殖でせ、そしてクロラムフェニコールをプラ スミド増殖のためのブ日ス１ｄ当シ２５０μｙの最終濃度になるように添加する 。３７℃で２時間培養後、ゲンタマイシンを１０μｇａｔ−に添加し、そして培 養液′ｆｔ再び１４−１８時間培養し、プラスミドを増や丁。細菌を集め。

そして２０チシヨ″ａを含有するＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水（ＨＢ　８　） 　ｐ　Ｈａ　Ｏ１５ｗＪ　中Ｋ　再５　ｍ　ｆ　ル、　？ニー　Ｏ懸？３ｆ５　 液’を氷上に置き、そシテリゾチーム溶液（α２５Ｍ　Ｔｒｉ８−ＨＣＩ中１０ 　＠ｇ　ｄ−’、　ｐＨ７，０）　（１８ｒＪ、　ＣＬ２５ＭＥＤＴＡ　ｐＨ［ Ｏｔロゴ、およびＨＢＳｔＯ！７Ｑ５分間隔で順次添加する。

細菌の９０チがプロトプラス）Ｋ々るまで懸澗液を５７℃でｔｏ−ｓｏ分間培養 し１次い七氷上に保持し、そしてＲＰＭＩ−１４４０培地で５０ｊ！７？に徐々 に希釈する。おのおのの融合のために、１０　個紀菌プロトグラス）Ｔｈ％ｚ５ ×１０６個ＰＨ人−刺激核血液細胞（ｃｏｒｅ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　）　と 結合重せ、洗浄しそしてベレン）”ｔＲＰＭＩ−１６４０培地α１ｄに再懸濁す る。これらの細胞に対して、ポリエチレングリコール融合試薬（ＰＥＧ−ＰＲ） α８ｄｔ−１分間かけて滴下して添加し、細胞をさらに１分間放置し、そして次 いでＲＰＭＩ−１６４ｎで徐々に希釈する。Ｐ　ＥＧ　−ＰＲをＲＰＭＩ−１６ ４０培地中の４８チ溶液として調製し、そしてヨーカム等（Ｙｏａｋｕｍ、　ｅ ｔｉｌｌ、　）、サイエンス、第２２巻、＠３８５−５８９頁（ｊ９８３年）に 記載されているように樹脂ベッド上を該溶液を通過させることにより予備処理す る。融合後、細胞を洗浄し、そして培養液に戻す。

さらに本発明の範囲内で、エイズに対して潜在的に有効な薬剤またはワクチンの 効果を試駆するための試駆管内でのモデル系が確立された。本発明のクローンは 。

ＨＴＬＶ−１［ゲノムだけが細胞変性性であるＣ補助因子よりもむしろ）とい５ ！初の証拠を表わす。これらのクローンは、それ故に、訳註プロトコールおよび 試験キットに好ましい。ある１種のこのようなプロトコールにおいて、一実施例 としてｐＨＸＢ−２Ｄ　ｆ用いて、コード血液細胞（ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃ ｅｌｌ）　ｔ”試験薬剤またはワクチンと共に処理し、そして次Ｋ　ｐＨＸＢ　 −２Ｄ　またはＨ９／ｐＨＸＢ−２Ｄに暴露する。もう１つ別のプロトコールに おいて。

コード血液細胞を最初にｐＨＸＢ−２ＤまたけＨ９／　ｐ　ＨＸ　Ｂ−２Ｄに暴 露し、そして次に試験薬剤またはワクチンを含有する培養管に懸濁する。次に、 エイズの処理のための薬剤またはワクチンの効能は、感染性の阻止またはウィル スの細胞変性効果の阻止を計測することＫより決定することができる。

本発明のクローンは、適当な細胞系内にトランス７エクシ曹ンさせても良く、そ して前記クローンを慣用の免疫原性担体材料に結合することによりエイズウィル スに特異的に結合する抗体の産生のための免疫原として、これらの細胞またはと 九らの細胞から産生された抗原を使用しても良い。このように産生さ九た免疫ｇ 、＃′ｉ、アジ−パント例えば完全または不完全７０インドのアジュバントを使 用して宿主内に注入される。その結果製造される抗血清（宿主の血液または膵臓 から得た）は、エイズウィルスに特異的に結合する抗体を含有するであろう。

慣用の免疫原性の担体材料は、タンパク質及びポリペプチドを含むものと定義式 れる。しかしながら、適当な慣用のタンパク質は、ヒトもしくはウシのγ−グロ ブリン、またはヒトもしくはウシの血清アルブミンに限定さ几ない。

試験キット クローンｐＨＸＢ−２Ｄまたはｐ　ＨＸＢ　−３Ｄば、Ｈ９のよう力不死化した 細胞系くトランス７エクシ曹ンしてもよく、そして、これらの細胞、抗原または これらの細胞から生産きれるタンパク質は、ヒトの血液中のエイズの診断のため の試験キット中に、抗原として導入しうる。上記の試験キット及び診断方法は、 クローンｐＨＸＢ−２ＤまたはｐＨＸＢ−５Ｄ　（固体の支持体に結合させたも の）をヒトの血液の試験試料と接触させることを含む。試料中に存在する。いず れの抗体も該クローンに結合しうる。

試験試料を除去し、固体の支持体を洗浄（結合していない抗体を除去するためＫ ）Ｌ、た後、エイズウィルスに対するヒト抗体の存在を、エイズウィルス抗体を 選択的に検出しうる試薬で固体支持体を試験すること）（ｘ　４ｇ　、検出し得 る。

ｐＨＸＢ−２Ｄ　（またＦｉｐ）ｉＸＢ　−３Ｄ　）　または該クローンから得 られる断片を含有する不死化細胞系Ｆｉ＃素結合イムノソルベントアッセイ（ｅ ｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏ−ｒｂｅｎｔ　ａｓ＋ａａ）’　 ）　（エリザ、（ＥＬＩ８Ａ））において使用しつる。エイズ−特異性抗体の検 出のための診断試験キット＃′ｉ、使用前に、プラスミドクローンまたはプラス ミドクローンから得られたＤＮＡ配列でトランスフェクシ１７された細胞から誘 導された抗原またはタンパク質で被覆した。複数のウェル（ｗｅｌｌ　）　また はプレート（ンルペン）−またけ多孔性の表面を使用する）ｔ−含む区画に分け られた囲いからなる。そして、多孔性表面に結合したクローンはヒトの血液の試 験材料と共に培養される。

試料を除去した後、エリザアッセイを行なう公知方法を行なう。即ち、正常のヤ ギ血清及びペルオキシダーゼで標識したヤギー抗ヒト免疫グロブリン及び変色指 示薬（例えばリン散塩クエン酸塩緩衝液中のオルトフェニレンジアミン及び過酸 化水素）でウェル被覆する。

他の型の試験キットも考えられる０例えば、競合的ラジオイムノアッセイまたは ドツトプロット（Ｄｏｔ　Ｂｒｏｔ　）アッセイは、カバー、ソルベントもしく はニトロセルロースシートのよう表多孔性表面、界面活性剤、ｐＨ調節剤（ｒｎ ｏｄｉｆｌｅｒ　）　＊　ウシ血清アルブミン、ヒトＦａｂ、希釈した正常のヤ ギ血清、及び３工で標識した動物の抗ヒト−免疫グロブリンを伴なった区画され た容器を含む。

クローンｐＨＸＢ−２Ｄ　（またＦｉｐＨＸＢ−３Ｄ）は、エイズに対して有効 でろりうる新規な薬剤またはワクチンのスクリーニングのための試験管内試験キ ットに導入しテ４　ｊイ、この試験キットは、ウィルス源（ｐＨＸＢ−２Ｄまた はＨ９／ｐＨＸＢ−２Ｄ）、コード血液細胞、及びポリブレンを含む、コード血 液日胞は１種々の濃度の試験薬品に暴露さｎ、ポリプレン及び細胞はベレット化 され、その後ｐＨＸＢ−２ＤまたＦｉＨ９／ｐＨＸＢ−２Ｄに暴露される。

その後、細胞を、新しく製造した完全培地に葱濁し、数日間培養する。その後、 感染度または細胞変性効果を調べるいくつかの方法のうちの−り全周いて、エイ ズに対する試験薬品の有効性を調べる。

上記のように、エイズを引起こすウィルスは様々な形態、　即ちＨＴＬＶ−［［ 、ＬＡＹ、　及びＡＲＣ等として存在ｕ。

僅かしか名付けられていない。

これらの菌各々の制限パターン並びに各菌内の分離物は、わずかに異なるが、実 質的には同じウィルスである。

本発明の範囲が、これらのわずかな相異により制限されることはない。

実施例１ λフアージライブラリーは、標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　等＊Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、　１９ ８２　）に従って、シ１糖密度勾配遠心法によシ、１０−ないし１５−１（１） の断片に富んだクローニング　ベクター　Ｊ１λ及びＸｂａ　１で消化されたＨ ９／ＨＴＬＶ−［Ｉ　ＤＮＡ　’ｅ用いて形成された。ファージ　プラーク（１ ０’　）は、二重に結合したＨＴＬＶ−［１ピリオンから製造さ九るｃＤＮＡ　 でスクリーニングされ、１４種の陽性のシグナルが得られた。これらのうちの二 つ＃′ｉ精製されたプラークであり、これらの制限地図はＭ１図（λＨＸＢ−２ 及びλＨＸＢ　−Ｓ　）Ｋ示したように決定された。

実施例２ ＨＴＬＶ−１１ゲノムが、正常なヒ）ＤＮＡと同様の配列を含むかどうか調べる ために、λＨＸＢ−２のウィルス挿入断片（５，５ｋｂ及びｙ−５ｋｂ　Ｓｓｔ 　Ｉ−Ｂａｔｌ断片）を単離し、ニックトランスレージ１ンを行なって、ＨＴＬ Ｖ−■−感染及び不感染の細胞性ＤＮＡを試験するために使用した。ハイブリッ ド形成の標準的条件（洗浄条件＝１×５ＳＣ（標準的クエン酸塩）、６５℃；ア ニーリング塩ｉ（Ｔｍ）、−２７℃〕下で、このグローブは、未感染のＨ９細胞 、未感染のＨＴ杷胞（そ几からＨ９がクローン化嘔ｎる親細胞系）または正常な ヒトのｍ織由来のＤＮＡＫＴＨなく　、Ｈ９／ＨＴＬＶ−■細胞並びに他０ＨＴ ＬＶ−１１感染細胞由来のＤＮＡＫ、ハイブリッド化した。この発見＃′ｉ、プ ローブとしてＨＴＬｖ−１［の組み込まれない型（複製可能の中間体）が使用さ れた他の実験と一致し。

ＨＴＬＶ−１１ｉ　２＞Ｅ、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−［の！　うに、　ヒ） ＤＮＡ由来の核酸配列を欠いた外因性のレトロウィルスであることを示唆してい る。

実施９’ＩＩ３ コード血液単核細胞培養液中でのプロトプラスト融合に続く細胞成長の動力学及 び逆転写酵素活性全しらべた。

単核細胞全、７４　：Ｉ−７ｔ、トリオシｋ　（Ｆｔｃｏｌｌ　Ｔｒｉｏｓｔｌ 　）を用いて、コードのＪｆＩｌ液試料から製造し、ＰＨＡｉ含む媒地中で５日 間培養した。その後、これらの細胞を、プラスミドｐＨＸＢ　−２Ｄ、　ｐ　Ｓ 　Ｖ　２　ｎｅｏまたはｐＣＨ−１ｇｐ’ｔｆｆｉ供与するバクテリアのプロト プラストと融合し、これに２０チのウシ胎児血清、１０％のＴ−細胞成長因子（ インターロイキン−２）及び抗生物質全含有するＲＰＭＩ−１６４０媒地全添加 することにより、５Ｘ１０’細胞ＩＩＩＪ′−’の密度で培地中に保持する。各 プラスミドについて、異なる個体からの細胞を用いて三つのバ２レル　フユージ 。

ン（ｐａｒａｌｌｅｌ　ｆｕｓｉｏｎ　）　”を完成した。融合後、５，１１゜ １４及び１８日目に、二つの培養物から除去した消費された培地−（５ｐｅｎｔ 　ｍｅｄｉｕｍ　）　ｆ　１０倍に濃縮し、標準的な技術を用いて、逆転写酵素 の存在について分析した。

全周いて導入（試料ＩＩＬ３ｗｉあたりｐｍｏｌで）された　Ｈ−標識化デオキ シ　リボヌクレオシド　モノホスフェート（”Ｈ−ｄＴＭＰ　）　の量として表 わ芒ｎる。

全ての培養液の成長は、プロトプラスト融合後、最初の１４日間、比較される。

しかしながら、１８日目までにｐ　ＨＸＢ　−２Ｄ　でトランスフェクションて れた培養液中の生存細胞の数は劇的に減少する。１８日目と２１日目の間、及び １８日目と３２日目との間で、それぞれ１０倍及び１００倍の減少率である。

ｐｓＶ２ｎｅｏでトランスンエクシ１７を受けた培養液も。

ｐＣＨ−１ｇｐｔでトランスフェクションを受けた培養液も。

同じ期間で４〜５倍の減少率しか示さない。培養液からの上清を、逆転写酵素の 存在について分析する場合、活性は、ｐＨＸＢ−２Ｄでトランス７エクシジンて れた培養液においてのみ、検出さＩＬる。こノＬらのデータは、複製ウィルスが ｐＨＸＢ−２Ｄ　プロトプラストと融合した後１ｊ１８日間焙養液内に存在する ことを、示している。

実施例４ トランスフェクションさｎ　ｆｃ細胞によるＨＴＬＶ−ＩＩＩｇａｇ−関連のタ ンパクＱｐｔ５及びｐ２４の発現を、特定のモノクローナル抗体音用いて示した 。即ち、最大の発現はＪ細胞のトランスフェクシ１ンから１ε日目、細胞の４− １１チ及び５−９ｆ）がｐ１５及びｐ２４に対する抗体とそれぞれ反応性である ときに、観察でれた。ウィルス粒子は、全ての培養液において、ｐＨＸＢ−２Ｄ 　でトランス７エクシジンした後、１４−１８日目に、電子顕微鏡により検出さ れた。粒子Ｆｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ粒子に特徴的な。

圧縮された、先端が切られた形のコアを含んでいた。

実施ｆｙｒＪ５ 時間経過実験において、単一の培養液からｐＨＸＢ−２Ｄによるトラ、ス、エク ションの後、６，１１，１４．１８及び３１日目に単離されたＤＮＡは、Ｂａｍ Ｈｌで消化きれ、ＨＴＬＶ−ｌ配列について分析テした。トランスフェクション 後６臼目に、ａ６−１（１）のＤＮＡ断片？、ρ・すがなバンドとして検出した 。トランスフェクション後１８日目に＃′１ａ６−ｋｂ（７）断片に加、ｔてｔ ５ｋｂ　のＤＮＡ　’ｌｔ出Ｌ５るようＫなりた。培養液内の組み込まれていな いウィルスの総ｔは１時間の経過に伴なうこれらのバンドの強度の増加により示 でれるように、増加するようである。こｎ　ｎ　、　ｐＨＸＢ　−２Ｄ　でもと もとトランスフェクシ１ンを受けている細胞が、培養液内で伝達はする完全な感 染能を有するウィルスを産生しうることの証拠である。

トランスフェクシ１ン後、３１日目に［ＨＴＬＶ−［１配列は検出されなかった 。この点において、培養液はＨＴＬＶ−１［により感染され得なかった細胞のみ を含んでいたと思われる。さらに、この結果は、Ｔ細胞に細胞変性効果を及ぼす トランスフェクションされたＤＮＡについても一致する。どの段階においても、 ウィルスにより感染された細胞が、トランスフェクシ１ンを受けた細胞の少数に 過ぎない（ウィルスのタンパク質の発現１５チ未満）という発見は、細胞変性効 果が、直接的なウィルス感染にのみ起因するものでは々いこと、及び隠された要 因及び／または他の細胞−細胞間の相互作用が細胞変性現象において一役金担っ ていることを示唆している。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．組込まれたヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩのプロウイルスＤＮ Ａ配列を含み、そして試験管内で感染性であり、そしてＴ細胞培養液に紀胞変性 性であるＨＴＬＶ−ＩＩＩの生物学的に受容能力のある組換え体クローン。‘
2. ２．１０キロベースの全長が組込まれたプロウイルス及び２７キロベースの細胞 性の両端部配列からなる１２７キロベースのＸｂａ１断片を含むλＨＸＢ−２で 表わされるファージクローンからなるヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩ Ｉ／リンパ腺症関連ウイルスの分子クローン。
3. ３．ウイルス抗原を発現し、そして成熟ウイルス粒子を産生する、組込まれたヒ トＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩのプロウイルスＤＮＡ配列を含むクロ ーンからなるλＨＸＢ−２で表わされるヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩ ＩＩの分子クローン。
4. ４．第１図の最初の列に描かれた制限エンドヌクレアーゼ地図を実質的に特徴と する分子クローンλＨＸＢ−２。
5. ５．ゲノムライブラリィが細胞性ＤＮＡを使用して製造され、そしてクローンが ウイルスｃＤＮＡプローブを使用してライブラリィから分離されるウイルスの分 子クローンの製造方法において、全長が組込まれたプロウイルスヌクレオチド配 列を含むヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩの分子クローンを製造する ことを特徴とするウイルスの分子クローンの製造方法。
6. ６．適当なクローニングベクター及びエンドヌクレアーゼ消化ヒトＴリンパ球指 向性ウイルスタイプＩＩＩ／リンパ腺症関連ウイルスを使用してファージライブ ラリィを製造し、該ライブラリィをショ糖密度勾配遠心分離により１０−１５キ ロベースＤＮＡ断片に富ませ、そして二重に結合したヒトＴリンパ球指向性ウイ ルスタイプＩＩＩビリオンから調製したｃＤＮＡプローブを使用して該ライブラ リィをスクリーニングし、そしてヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩの 全長が組込まれたプロウイルスヌクレオチド配列を含むファージクローンを得る ことを特徴とするヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩ／リンパ腺症関連 ウイルスの分子クローンの製造方法。
7. ７．プロウイルス配列が、ヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩの×ｂａ Ｉ断片であることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．プロウイルス配列が、ヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩの×ｂａ Ｉ断片であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．ヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩ分子クローンｐＨＸＢ−２Ｄで トランスフェクションされた細胞から誘導された抗原またにタンパク質をその上 に含むことを特徴とブるイムノアッセイに使用するための試験プレートまたはシ ート。
10. １０．ヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩ分子クローンｐＨＸＢ−２Ｄ でトランスフェクションされた細胞から誘導された抗原またはタンパク質をその 上に含むソルベントまたは多孔性表面からなることを特徴とする後天性免疫不全 症候群の診断に使用するための試験キット。
11. １１．分子クローンｐＨＸＢ−２ＤまたはＨ９／ｐＨＸＢ−２Ｄを免疫原性担体 に結合させ、免疫源を形成し、該免疫原を適当な宿主に注入し、そして該宿主の 血液または脾臓から、後天性免疫不全症候群を起こすウイルスに特異的に結合す る抗体を得ることを特徴とする後天性免疫不全症候群を起こすヒトレトロウイル スに特異的に結合する抗体の製造方法。
12. １２．抗原がソルベントまたは多孔性基材に結合し、該抗原がクローンｐＨＸＢ −２ＤのＤＮＡ配列の一部または全部を含むことを特徴とする後天性免疫不全症 候群の診断のために使用される試験キット。
13. １３．後天性免疫不全症候群に対する薬剤またはワクチンの効果を分析するため に有用であり、そしてコード血液細胞、ｐＨＸＢ−２Ｄ源、培養培地及びポリプ レンからなることを特徴とする試験キット。
14. １４．第１図の第２列に描かれた制限エンドヌクレアーゼ地図を実質的に特徴と する分子クローンλＨＸＢ−３。