JPH08511954A - Ｈｔｌｖ−▲ｉｉ▼▲下ｎｒａ▼構成物およびｈｔｌｖ感染検出用アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＴＬＶ−IIＮＲＡに由来するライゼート、ＤＮＡおよびアミノ酸配列を含む構成物を提供する。開示するＨＴＬＶ−IIＮＲＡ構成物を使用するＨＴＬＶ感染検出用アッセイも提供する。さらに、ＨＴＬＶアッセイ実施用キットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＴＬＶ−II_NRA構成物およびＨＴＬＶ感染検出用アッセイ 利用分野 本発明は、「ＮＲＡ」と呼ばれるヒトＴ細胞リンパ球性ウイルスII型（ＨＴＬ Ｖ−II）の単離株に関するものである。より詳細には、ＮＲＡプロウイルスに由 来する構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、およびＨＴＬＶ感染検出のためのア ッセイおよびキットにおけるこのような構成物の利用に関するものである。関連する特許出願 本出願は、引用により本明細書に含まれるものとする米国特許出願第０８／０ ８６，４１５号（１９９３年７月１日出願）の一部継続出願である。発明の背景 ヒトＴ細胞リンパ球性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）は、２種類の疾患の病因 ウイルスであることが確認されている。すなわち、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ） ［ポイエツらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７巻７４ １５〜７４１９頁（１９８０年）；内山らによるＢｌｏｏｄ５ ０巻 ４８１〜４９２頁（１９７７年）］およびＨＴＬＶ関連ミエロパシー（ＨＡ Ｍ）［辻本らによるＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５巻２９〜４２頁（１９８８年 ）］または熱帯性痙性麻痺（ＴＳＰ）［ゲサインらによるＬａｎｃｅII巻４０７ 〜４０９頁（１９８５年）］のいずれかとして知られる神経疾患である。 ＨＴＬＶ−Ｉゲノムの遺伝分析はすでに行われている。［ラトナーらによるＡ ＩＤＳ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ７巻 ９２３〜 ９４１頁（１９９１年）グッデノーらによるＪ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎ ｅ Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．２巻 ３４４〜３５２頁（１９８８年）；グレイら によるＶｉｒｏｌｏｇｙ１７７巻３９１〜３９５頁（１９９０年）］。ＨＴＬＶ −Ｉゲノム内での遺伝的多様性が、単離株の起源地と関連していることが報告さ れている［ゲサインらによるＪ．Ｖｉｒｏｌ．６６巻２２８８〜２２９５頁（１ ９９２年）；シェルマンらによるＪ．Ｖｉｒｏｌ ６６巻２５５６〜２５６３頁 （１９９２年）］。 もう１種類のヒトリンパ球性ウイルスであるＨＴＬＶ−IIは、抗ＨＴＬＶ反応 性を有する米国の献血者の約半数で確認されて おり［ヒエルらによるＢｌｏｏｄ ７６巻４５０〜４５４頁（１９９０年）；リ ーらによるＬａｎｃｅｔ３３７巻１４３５〜１４３９頁（１９９１年）］、また 静注薬使用者（ＩＶＤＵ）ではハイリスクであることがニューオリンズ［リーら によるＳｃｉｅｎｃｅ２４４巻４７１〜４７５頁（１９８９年）］、ニューヨー ク市［ロバート−グロフらによるＪＡＭＡ２５５巻３１３３〜３１３７頁（１９ ８６年）；エールリッヒらによるＢｌｏｏｄ７４巻１６５８〜１６６４頁（１９ ８９年）］、英国［テッダーらによるＬａｎｃｅｔ１１巻１２５〜１２８頁（１ ９８４年）］、およびイタリア［ゼッラらによるＬａｎｃｅｔ３３６巻５７５〜 ５７６頁（１９９０年）］から報告されている。ＨＡＭ／ＴＳＰ様ミエロパシー も、ＨＩＶ−１およびＨＴＬＶ−IIに同時感染した患者１名で［バーガーらによ るＮｅｕｒｏｌｏｇｙ４１巻８５〜８７頁（１９９１年）］、また別のＨＴＬＶ −II感染者複数で認められ記述されている［ヒエルらによるＬａｎｃｅｔ３３９ 巻 ６４５〜６４６頁（１９９２年）；ローゼンブラットらによるＡＩＤＳ６巻１ １５１〜１１５８頁（１９９２年）］。 ＨＴＬＶ−IIは、あるＴ細胞変異体毛様細胞白血病患者 （“Ｍｏ”）で初めて確認された［サクソンらによるＡｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍ ｅｄ．８８巻 ３２３〜３２６頁（１９７８年）；カルヤナラマンらによるＳｃｉ ｅｎｃｅ２１８巻 ５７１〜５７３頁（１９８２年）］。“Ｍｏ”細胞系は当該患 者の脾臓細胞から樹立され、Ｍｏプロウイルスの特徴が明らかにされた［チェン らによるＮａｔｕｒｅ３０５巻５０２〜５０５頁（１９８３年）］。ゴルデらの 米国特許第４，４３８，０３２号では、ＭｏＴリンパ芽球細胞系、および同細胞 系が産生する蛋白様産物についてさらに詳しく記述している。Ｍｏプロウイルス のヌクレオチド配列も明らかにされている［シモトノらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２巻 ３１０１〜３１０５頁（１９８５年）］。 １９８６年には、ローゼンブラットらがある非定型毛様細胞白血病患者で第２ のＨＴＬＶ−II（“ＮＲＡ”）を単離したと報告した［ローゼンブラットらによ るＮｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５巻３７２〜３７７頁（１９８６年）］ 。細胞系のＮＲＡ、ＮＲＡ−Ｐ、ＮＲＡ−ＷＭ２、ＮＲＡ−ＳＨが樹立され、新 しいＨＴＬＶ−II単離株の制限酵素解析が行われた。ＮＲＡ単離株の遺伝分析デ ータから、ＨＴＬＶ−II_MoとＨＴＬ Ｖ−II_NRAのゲノムは同一ではないことがわかった［前掲文献］。その後ローゼ ンブラットらはＢｌｏｏｄ７１巻３６３〜３６９頁（１９８８年）で、ＮＲＡ患 者のＨＴＬＶ感染についてフォローアップ分析した結果として、同患者には明ら かにＴ細胞由来とＢ細胞由来の２種類のリンパ球増殖性疾患が同時に存在してい たことを報告した。 最近ではハルらおよびドゥーベらが、様々なＨＴＬＶ−II単離株について記述 し、比較している。ハルらは、静注薬使用者から得た複数のＨＴＬＶ−II単離株 のｇｐ２１ｅエンベロープ領域の部分的配列決定および制限地図作成に基づいて 、ＨＴＬＶ−IIの２種類のサブタイプとしてＨＴＬＶ−II_MoおよびＨＴＬＶ−II_NRA があると提唱している［ハルらによるＪ．Ｖｉｒｏｌ．６６巻２４５６〜２ ４６３頁（１９９２年）］。より詳細には、ハルらはＨＴＬＶ−II_Moをサブタイ プＡ、ＨＴＬＶ−II_NRAをサブタイプＢと呼んでいる。 ドゥーベらはＪ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻１１７５〜１１８４頁（１９９３年）に 示すように、西側圏に居住する様々な患者におけるＨＴＬＶ−IIの不均質性につ いて調べている。ドゥーベらは、西側圏に少なくとも２種類の遺伝的に異なるＨ ＴＬＶ −IIが存在すると報告している。ドゥーベらは研究で得られたデータに基づいて 、新しい世界に導入されたＨＴＬＶ−II単離株は、ＨＴＬＶ−Ｉ株よりもずっと 不均質であったと示唆する。 ＨＴＬＶ−Ｉ感染検出のための様々な構成物およびアッセイについてこれまで 記述されてきている［たとえば、スラモンの国際公開第８５／０１８０３号（１ ９８６年３月２７日公開）を参照］。アボット研究所のＨＴＬＶ−ＩＥＩＡは、 ＨＴＬＶ−Ｉ抗体アッセイ用の市販キットである。このキットではＨＴＬＶ−Ｉ ウイルスライゼート被覆ビードを使用している。ケンブリッジテクノロジーから もＨＴＬＶ−Ｉ抗体アッセイ用のキットが市販されている。こちらのキットは、 ＨＬＴＶ−Ｉウイルスライゼートおよび組換えｇｐ２１Ｅ蛋白を微量定量プレー トに付着させたものを使用している。 ＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染を検出または判別、あるいはその両方を 行うための構成物およびアッセイについてもすでに記述されている［たとえば、 共同所有で共同出願中の米国特許出願第０８／１７０，０６３号（１９９３年１ ２月２０日出願）；ブロンベルグの国際公開第９０／１０２３１号（１９９０年 ３月５日公開）；ヴァルネの国際公開第９０／１５８２ ０号（１９９０年１２月２７日公開）；ラルらによるＪ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ１６３巻 ４１〜４６頁（１９９１年１月）を参照］。 出願人の知る限りにおいては、本出願の申請前にはＮＲＡプロウイルスおよび ＮＲＡ感染細胞系は公的には入手できなかった。さらに本出願人は、ここに開示 するＨＴＬＶ感染検出のためのアッセイまたはキットにおけるＮＲＡ構成物の利 用について報告した文献を知らない。発明の要約 本発明の１実施態様は、ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルスに由来する様々なＤＮ Ａ配列に関する。より詳細には、次のものが提供される。 −ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルスのゲノムをコードするＤＮＡ配列 −ＨＴＬＶ−II _NRA ｇａｇ領域およびｇａｇｐ１９、ｐ２４、ｐ１５をコード するＤＮＡ配列 −ＨＴＬＶ−II _NRA Ｐｏｌ領域をコードするＤＮＡ配列 −ＨＴＬＶ−II _NRA ｅｎｖ領域およびｅｎｖｐ２１ｅをコードするＤＮＡ配列 −ＨＴＬＶ−II _NRA ｔａｘ領域をコードするＤＮＡ配列 −ＨＴＬＶ−II _NRA ｒｅｘ領域をコードするＤＮＡ配列。それぞれのＤＮＡ配 列に対応するアミノ酸配列も提供される。 本発明の別の実施態様は、ＨＴＬＶ−II_NRA構成物に関し、本出願で開示され る配列によってコードされたポリペプチドおよび蛋白質、精製ＨＴＬＶ−II_NRA ウイルスライゼート、精製ＨＴＬＶ−II_NRA、ならびにＨＴＬＶ−II_NRAに感染し た組織培養増殖細胞を含む。 本発明のもう１つの実施態様は、検体中の抗ＨＴＬＶ抗体を検出する方法およ びアッセイに関する。 本発明のさらに別の実施態様は、検体中の抗ＨＴＬＶ抗体を検出するためのキ ットに関する。図面の簡単な説明 図１は、ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルスのゲノム配列図および制限地図である 。 図２は、ＨＴＬＶ−II_NRAゲノムの全ヌクレオチド配列を示す。 図３は、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性試料の希釈パネルについてのＨＴＬＶ−Ｉ ＥＩＡ およびＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II_NRAライ ゼートビーズアッセイの結果を比較したグラフである。 図４は、ＨＴＬＶ−II陽性試料の希釈パネルについてＨＴＬＶ−ＩＥＩＡおよ びＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II_NRAライゼートビーズアッセイの結果を比較した グラフである。現時点で好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルスおよびＨＴＬＶ−II_NRA感染細胞系に 由来する様々な構成物を提供する。本発明の構成物には、ＨＴＬＶ−II_NRAプロ ウイルスライゼート、ならびにＮＲＡプロウイルスの全ゲノムおよびその一部を コードするＤＮＡ配列が包含される。これらをはじめとする構成物について以下 に詳しく説明する。ＨＴＬＶ−IIのＮＲＡ単離株は、非定型毛様細胞白血病と診 断された患者で最初に同定された［ローゼンブラットらによるＮｅｗ Ｅｎｇｌ ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５巻 ３７２〜３７７頁（１９８６年）］。ＮＲＡ単離株、Ｎ ＲＡ、ＮＲＡ−Ｐ、ＮＲＡ−ＷＭ２、ＮＲＡ−ＳＨに感染した細胞系がその後樹 立された。ＮＲＡ−Ｐ細胞系は、フィトヘマグルチニン存在下で患者のＮＲＡの 末梢血リンパ球培養質から樹立されたＬｅｕ４＋Ｔ細胞系である［ローゼンブラ ットらによるＮｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５巻３７ ２〜３７７頁（１９８６年）］。ＷＩＬ−ＮＲＡ細胞系は、患者のＮＲＡの末梢 血リンパ球をＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系であるＷＩＬ−２と同時培養して得られ るもので、サイトカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、または成長因 子などの因子は産生しないＢ細胞系である。本出願前には、ＮＲＡプロウイルス またはＮＲＡ感染細胞系は公的に入手できなかった。 ＷＩＬ−ＮＲＡ細胞系は、ブダペスト条約に基づいて１９９４年３月１５日に ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒ ｙｌａｎｄ ２０８５２）に寄託されており、寄託日から３０年間、もしくは該 寄託に対する最後の要求があってから５年間、もしくは米国特許の有効期間のう ちいずれか長い期間にわたり継続される。ここに述べる寄託は便宜の目的で供さ れるにすぎず、ここに挙げる指示に従って本発明を実践するために要求されるも のではない。ＷＩＬ−ＮＲＡ細胞系は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１５８０で寄 託された。 本発明の１実施態様はＮＲＡライゼートに関するものである。本発明の実践に 役立つＮＲＡライゼートとしては、ＮＲＡ感染 細胞系およびＮＲＡプロウイルスのライゼートがあり、これらは様々な方法で作 製できる。たとえば、当業界公知の標準的な手順でライゼートを作製することが できる。ＮＲＡライゼート作製のために、標準的手順を修正した方法を用いるこ ともできる。たとえば、後出の実施例１で述べるプロセスに従って精製ＮＲＡラ イゼートを作製することができる。その他の適切かつ同等な修正およびＮＲＡラ イゼートの作製も本発明で考えられ、当業者であればよくわかることである。 ＮＲＡプロウイルスに由来するヌクレオチドおよびアミノ酸配列も本発明で提 供される。ＮＲＡプロウイルスは、後出の実施例２で述べるようにクローンされ 配列決定された。ＮＲＡプロウイルスの全ゲノム配列を図２に示す。ＮＲＡプロ ウイルスのゲノム配列も、後出の配列表の配列番号１に記載されている。 ＮＲＡプロウイルスのｇａｇ領域をコードするヌクレオチド配列も提供する。ｇａｇ 領域は、図２および配列番号２に示すゲノム配列のヌクレオチド８１０〜 ２１１１から成る。対応するアミノ酸配列を配列番号３に示す。図１に示すよう に、ｇａｇ領域はｐ１９、ｐ２４、ｐ１５をコードする。ｇａｇｐ１９はヌクレ オチド８１０〜１２１７から成る。ｇａｇｐ２ ４はヌクレオチド１２１８〜１８５９から成り、ｇａｇｐ１５はヌクレオチド１ ８６０〜２１１１から成る。これらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列表の配 列番号４、６、８に示す。ｐ１９、ｐ２４、ｐ１５のヌクレオチド配列に対応す るアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、７、９に示す。 ＮＲＡのｐｏｌ領域をコードするヌクレオチド配列も提供する。ｐｏｌ領域は 、ｐｏｌ前駆体を含み、図２および配列番号１０に示す配列のヌクレオチド２２ ４２〜５１９０から成る。ｐｏｌ領域をコードするヌクレオチド配列に対応する アミノ酸配列は、配列表の配列番号１１に示す。 本発明はさらに、ＮＲＡのｅｎｖ領域をコードするヌクレオチド配列を提供す る。ｅｎｖ領域は、図２および配列番号１２に示す配列のヌクレオチド５１８３ 〜６６４３から成る。対応するアミノ酸配列は配列番号１３に示す。図１に示す ように、ｅｎｖ領域はｇｐ４６およびｐ２１ｅをコードする。ｅｎｖｐ２１ｅは 、ヌクレオチド６１０７〜６６４３から成る（配列番号１４参照）。ｐ２１ｅの ヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を配列番号１５に示す。 ＮＲＡのｔａｘ／ｒｅｘ領域をコードするヌクレオチド 配列も提供する。ＮＲＡのｔａｘ領域は、図２および配列番号１６の配列のヌク レオチド５１８３〜５１８６および７２１６〜８２８２から成る。図１に示すよ うに、ｔａｘ領域はｐ４０ｘをコードする。ｒｅｘ領域は図２および配列番号１ ８に示す配列のヌクレオチド５１２４〜５１８６および７２１６〜７６６５から 成る。ｒｅｘ領域はｐ２６をコードする（図１）。ｔａｘ領域およびｒｅｘ領域 のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および１９ に示す。後出の実施例３で述べるように、ＮＲＡのｔａｘ／ｒｅｘ領域をコード する配列は、ＨＴＬＶ−II_Moプロウイルスのｔａｘ／ｒｅｘ領域に比較すると、 ２５のアミノ酸が追加されて構成されている。さらに詳しい比較を、後出の表４ ｄに示す。一般的には、ｔａｘ／ｒｅｘ領域は遺伝子発現の調節または制御に関 与する。完全にはわかっていないが、この追加されたアミノ酸がｔａｘ遺伝子の 機能を変化させているとも考えらえる。というのも、ＨＴＬＶ−Ｉｔａｘのカル ボキシ末端突然変異体が、ＮＦｋＢ経路などの特異的経路を通じてトランス活性 化を変更することで細胞標的の特異性に影響を及ぼしうることが報告されている からである［ルーベンらによるＮｅｕ．Ｂｉｏ １．１巻 ２７５頁（１９８９年）］。 前述の配列は、当業界公知の技術で作製することができる。たとえば、プロウ イルスＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出による精製またはＰＣＲで配列を 得ることもできれば、組換えクローニング技術または化学的合成によって配列を 生成することもできる。ヌクレオチド配列は１本鎖でも２本鎖でもよい。ＮＲＡ ペプチド、ポリペプチド、および開示された配列またはそのフラグメントに対応 する蛋白質も、当業界公知の技術で作製できると考えられる。 開示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列のフラグメントは、ここで示すＮ ＲＡ配列の機能または能力を有することがある。特定の欠失、挿入または置換が あるヌクレオチドおよびアミノ酸配列も、ここで示すＮＲＡの配列の機能または 能力を有することがある。このような配列すべて、またこのような配列の利用は 、本発明の範囲内に入ると考えられる。 本発明で開示するＮＲＡ構成物は、様々な方法で活用できる。たとえば、ヌク レオチド配列を使って、ＨＴＬＶに関連する相補的配列を検出することができる 。配列は、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）技術またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） 技術でプ ライマーまたはプローブとして利用することもできる。ＰＣＲ増幅は当業界公知 であり、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号にさら に詳しく述べられている。ＬＣＲ技術も当業界公知であり、欧州特許公開第３２ ０，３０８号、欧州特許公開第３３６，７３１号、国際公開第８９／０９８３５ 号、国際公開第８９／１２６９６号にさらに詳しく述べられている。ＮＲＡ構成 物も、当業界公知のサザンブロットまたはウエスタンブロット法でプローブまた は抗原として使用することができる［タウビンらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．７６巻 ４３５０〜４３５４頁（１９７９年）；サザンによるＪ ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８巻 ５０３〜５１７頁（１９７５年）］。ＮＲＡ構成物 を利用して抗体およびワクチンを作成することも考えられる。さらに、ＮＲＡ構 成物は以下に記す方法およびキットで使用することもできる。 本発明の方法は、検体中のＨＴＬＶに関連する抗体を検出するためのアッセイ に関する。このアッセイとしては、凝集など従来のイムノアッセイ、ラジオイム ノアッセイ、酵素イムノアッセイ、ルミネセンスアッセイ、蛍光アッセイがある が、これ らに限定はされない。直接および間接サンドイッチアッセイおよびドットブロッ トアッセイなど、当業界公知の様々なアッセイ法を利用することができる。１つ の実施態様では、ＨＴＬＶ−II抗体を検出する。別の実施態様では、ＨＴＬＶ− ＩまたはＨＴＬＶ−IIあるいはその両者の抗体を検出する。本発明の方法では、 少なくとも１つのＮＲＡ構成物を使用する。ＮＲＡ構成物としては、ウイルスラ イゼート、精製、合成または組換えによって作成した蛋白質、ポリペプチドまた はペプチド、核酸配列、あるいはその組み合わせがある。ＮＲＡ構成物は単独で 使用することも考えられれば、他の診断用試薬と組み合わせて使用することも考 えられる。たとえば、後出の実施例１で述べるように、ＮＲＡライゼートおよび ＨＴＬＶ−Ｉウイルスライゼートを使ってＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIある いはその両者の抗体を検出することができる。ＮＲＡライゼートは、スパイク抗 原または組換え蛋白質あるいは合成蛋白質と組み合わせて使用できるとも考えら れる。さらに、ＮＲＡ構成物は、他の既知の試薬と組み合わせて使用して抗体ま たは抗原あるいはその両者を検出することができると考えられ、その抗体または 抗原としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウ イルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に伴う抗体または抗原あるいは その両者があるが、これらに限定はされない。 この方法の好ましい実施態様では、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIあるいは その両者に対する抗体を検出する。この方法では、検体をＮＲＡライゼートおよ びＨＴＬＶ−Ｉウイルスライゼートと接触させて反応混合物をつくる。アッセイ では１ないし複数の固相を使用することができる。本出願でいう「検体」とは、 ヒトまたは動物の体液の試料のことで、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、その 他の体成分または組織培養上清があるが、これらに限定されない。「固相」とは 広義で使用しており、不溶性の物質またはその後の反応で不溶性にすることがで きる物質のことをいう。固相としては様々な物質が考えられ、当業者であれば過 度の実験をしなくても選択することができる。本発明で使用する固相の例として は、有孔性または無孔性物質、ラテックス粒子、微粒子、ビーズ、膜、プラスチ ックチューブ、マイクロタイターウェルが挙げられるが、これらに限定はされな い。固相のサイズ、寸法、形状は、当業者であれば選択できる。当業者は、アッ セイに適した固相を経験的に決定でき、ま た固相の選択が様々な要因、たとえば検体の量、アッセイで行う作業ステップ、 標識を検出して測定するのに利用する手段などに左右されることを容易に理解す るだろう。 固相にライゼートを付着させる適当な方法としては、イオン結合、疎水性結合 、共有結合がある。ライゼートを付着させるこうした技術は、当業界の技術の範 囲内にある。当業界公知の結合剤を利用して固相にライゼートを確実に付着させ ることもできる。結合剤は、ライゼートを加える前に固相の一部として組み込む か、固相に誘導してもよい。 反応混合物は、ＨＴＬＶ抗原／抗体複合体が十分形成されるるような条件下で 十分な時間だけインキュベートする。インキュベーションの適切な時間、温度、 その他の条件の選択は、当業者に自明である。反応混合物は、信号生成化合物に 付着した結合メンバーを含んで成る指示試薬と同時に接触させるか、あるいは後 で接触させて、第２の反応混合物をつくる。結合メンバーはＨＴＬＶ抗原または 抗体と特異的に結合できる分子であれば何でもよく、ビオチンまたは抗ビオチン のようなハプテンまたは抗ハプテン、アビジンまたはビオチン、炭水化物、レク チン、相補的ヌクレオチド配列、酵素などがある。このよう な結合メンバーは当業界公知であり、市販されている。本発明で考えられている 信号生成化合物すなわち「標識」としては、色素原、酵素などの触媒、フルオレ セインやローダミンなどの発光化合物、化学発光化合物、放射標識および直接的 な可視標識が挙げられる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワ サビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼがある。適当な標識の選択は、当 業者に自明である。標識は、それ自体で信号を発するか、もしくは１ないし複数 の追加物質と結びついて信号を発することができるのが望ましい。当業界公知の 様々な技術を利用して結合メンバーに標識を付着または「結合」させ得ることは 、当業者であれば容易にわかるだろう。第２の反応混合物は、ＨＴＬＶ抗原／抗 体／指示試薬複合体を形成するのに十分な時間と条件でインキュベートする。Ｈ ＴＬＶが存在するかどうかは、固相に関連したまたは結合した標識を検出して、 あるいは未反応の指示試薬に関連する結合する標識を検出して調べる。ここに開 示する方法のいずれか、あるいはすべてでも自動化することもできれば手動で行 うこともできる。 前述の方法ではＮＲＡライゼートの使用について述べている が、精製、合成または組換えによって作成したＮＲＡペプチド、ポリペプチドお よび蛋白質をこうした方法で使用してＨＴＬＶに対する抗体を検出することもで きる。さらに、本発明は１ないし複数の固相を使用することが好ましいとしてい るが、非固相もしくはホモジーニアスなアッセイでＮＲＡ構成物を利用すること も考えられる。これらのアッセイは当業者に公知であり、本発明の範囲に入ると 考えられる。 本発明では、ＨＴＬＶ抗体を検出するためのキットも提供する。一般に、キッ トはＮＲＡライゼートが入った１ないし複数の容器を含む。あるいは、１ないし 複数の容器の中に、精製、合成または組換えＮＲＡ蛋白質、ポリペプチドまたは ペプチドが入っていてもよい。適当な容器としては、瓶、バイアル、トレイ、試 験管およびマイクロタイタープレートがある。キットに、キット内のＮＲＡ構成 物がＨＴＬＶ抗体を検出するのに使用されることを指示したラベルまたは添付文 書が入っていることが好ましい。ラベルまたは添付文書では、本出願で開示する ようなＨＴＬＶアッセイの行い方に関する指示も含めることができる。キットに は、緩衝液、希釈剤、酵素およびそれに類似したものなど適当な試薬を含むこと もできる。 好ましい実施態様では、キットはＮＲＡライゼートが付着した複数のビーズま たは微粒子を含むトレイ、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、抗 体希釈剤、検体希釈剤、ＯＰＤ錠剤、色検出希釈剤を含む。より好ましい実施態 様では、キットはさらにＨＴＬＶ−Ｉライゼートも含んでいる。 以下の実施例では、本発明の新しい構成物を作成し、その構成物を使ってアッ セイを行う方法について説明する。ただし、実施例はあくまでも例証として挙げ たものであり、本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 下記の実施例で採用した方法は、特記のない限り、当業界公知の標準的な組織 培養および分子遺伝学の技術に従って、またマニアチスらが「分子クローニング −実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８ ２年）に述べている方法に従って実行したものである。下記の実施例で使用した 制限酵素は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（メリーランド州ガイザースバーグ）およびＮ ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ベバリー）から入 手 した。制限酵素は、特記のない限り製造業者の指示に従って使用した。 実施例１ ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIウイルスライゼートを使用してＨＴＬＶ−Ｉま たはＨＴＬＶ−IIあるいはその両者の抗体を検出するアッセイ Ａ．ウイルスライゼートの作製 ウイルスライゼートは次のようにして作製した。ＨＴＬＶ−Ｉを細胞系ＨＵＴ −１０２：Ｂ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ ．、メリーランド州ベテスダ）から単離した。ＨＵＴ−１０２：Ｂ２は、ＨＵＴ −１０２（ＡＴＣＣ（メリーランド州ロックビル）から入手可能）のクローンで あり、ＨＵＴ−１０２と同じウイルスを生み出す。ＨＴＬＶ−IIは、前述のＮＲ Ａ感染細胞系ＷＩＬ−ＮＲＡから単離した。まず、ウイルスを組織培養で増殖さ せた。ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、メリーランド州ガイザースバ ーグ）などの血清含有培地を使用し、１０％ウシ胎仔血清を補足した。その後培 養基に排出されたウイルスを収集してライゼート作製に使用した。ウイルスが増 殖した細胞は溶解しなか った。 収集したウイルスを連続フロー超遠心分離で精製し、ＣＦ３２ローターを使っ て２０〜４５％ショ糖密度勾配を通過させた。浮遊密度をＨＴＬＶ−Ｉについて は１．１５、ＨＴＬＶ−IIについては１．１４を基準として無傷のウイルスを選 択した。２８．５〜３８．７％のショ糖濃度をプールした。次いで、プールした ウイルスをトリス生理食塩水緩衝液（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ） に溶解した０．２５％ＴＲＩＴＯＮＸ１００および音波処理を使って溶解させて から遠心分離した。遠心分離後に得られた上清には、ウイルスライゼートが含ま れていた。 Ｂ．ＨＴＬＶ−Ｉ陽性試料およびＨＴＬＶ−II陽性試料を検査するＨＴＬＶ−Ｉ ／ＨＴＬＶ−II_NRAライゼートビーズアッセイ ＨＴＬＶ−ＩウイルスライゼートおよびＨＴＬＶ−IIウイルスライゼート（前 記のＡ項に記したようにして作製）をほぼ５０：５０の比率で合わせてから、以 下に詳しく述べるように疎水性吸着により直径約０．２５インチのポリスチレン ビーズ（Ｕｎｉｔｙ、イリノイ州デスプレインズ）を被覆した。 洗浄および再循環のステップはすべてビーズ被覆カラムで実施した。ライゼー トおよびＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に加えて混和し、被 覆溶液を作製した。ビーズをカラムに充填し、１５％プロパノールで２５〜３５ 分間洗浄した。被覆溶液を加え、約４０℃で２時間±５分再循環させた。ビーズ をＰＢＳですすぎ、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００含有ＰＢＳを使って約４０℃で３０ ±２分間洗浄し、それから再びＰＢＳですすいだ。ブロッキング溶液（ウシ血清 アルブミン含有ＰＢＳ）を加え、約４０℃で３０±２分間再循環させてから、Ｐ ＢＳですすいだ。次に、オーバーコート溶液（２％ショ糖含有ＰＢＳ）を加え、 １０〜２０分間再循環させた。その後、窒素を使って６０−９０分間、最初は４ ０℃、次いで２５℃でビーズを乾燥させ、カラムからとり出し、容器に入れて２ 〜８℃で乾燥保存した。 ３３件の試料を使ってアッセイを実施した（確認済みＨＴＬＶ−Ｉ陽性試料８ 件、確認済みＨＴＬＶ−II陽性試料２０件、および判別できなかった試料５件） 。試料（１０μｌ）を、非特異的結合をブロックする希釈剤（４００μｌ）で希 釈した（１：４１）。希釈剤は滅菌濾過し、それは０．１５Ｍ Ｎａ Ｃｌ含有標準トリス−ＰＢＳ緩衝液中に１０％仔ウシ血清、２０％ヤギ血清、２ ％脱脂粉乳、０．１５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００、アジ化ナトリウム、ＥＤＴＡ 、ＥＧＴＡを、含むものであった。脱脂粉乳は変性も加熱もされなかった。ＨＴ ＬＶ−Ｉ抗体またはＨＴＬＶ−II抗体のいずれも含有しない正常なヒト血清（陰 性対照）およびＨＴＬＶ−Ｉ抗体またはＨＴＬＶ−II抗体の存在が確認済のヒト 血清（陽性対照）についても試験した。 希釈した試料および対照（２００μｌ）を、１プレートあたり６０ウェルがあ る５”×１１”プレート（Ｃｏｕｒｔｅｓｙ、イリノイ州ウィーリング）のウェ ルに入れた。ライゼート被覆したビーズを、１ウェルあたり１ビードずつプレー トに入れて ｎａｍｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 イリノイ州アボットパーク）で回転モードを使って、約４０±２℃で６０±５分 間プレートをインキュベートした。 プレートを覆っているシールを取り外し、ビーズを蒸留水で洗浄した。西洋ワ サビペルオキシダーゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ ｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州ガイザースバーグ）で標識したヤギ抗ヒト ＩｇＧ抗体（γ特異的）を、各ウェルに加えた。標識したヤギ抗体を、１０％ウ シ胎仔血清および０．２５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００を含有するトリス−生理食 塩水緩衝液に入れた。標識したヤギ抗体は、１５％ウシ胎仔血清、５％ヤギ血清 、０．２５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００をトリス緩衝液に入れたものを含む希釈剤 を使って希釈してから使用した。それから各プレートを新しいシールで覆った。 ａｍｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒで）３０±５分間さらにインキュベートしてから ビーズを蒸留水で洗浄した後、新たに作製した３００μｌの基質溶液（過酸化水 素およびオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｊ．Ｐ．Ｂａｋｅｒ、ニュージ ャージー州フィリップスバーグ））を各ウェルに加えた。プレートにカバーをし て光をさえぎった。それからプレートを室温で３０±２分間インキュベートした 。各ウェルに３００μｌから１ｍｌの１Ｎ硫酸を加えて発色を止めた。液相の吸 光度をÅ ４９２ｎｍで測定した。 比較のために、上記の試料についてＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔ ｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＴＬＶ−Ｉキットを使い、製造業者の指示に従っ たやり方でアッセイした。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＴＬＶ−Ｉアッセイでは、ＨＴＬＶ−II陽性試料数件が検出できず（これらは ＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイでは検出された）、またＨＴＬ Ｖ−II試料を１：１２５から１：２０００に希釈したときには同一希釈度でのＨ ＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイ（陽性試料５件を検出）に比べて 特に悪かった（検出は０件）。ＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイ の結果から、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIのＮＲＡライゼートを使用すると 、ＨＴＬＶ−II陽性試料の検出可能性が増大し、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性試料について の感度が増大することがわかった。ＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッ セイでは、特異度も増大した（９９．９３％の割合）。 Ｃ．無作為血漿試料を検査するＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II_NRAライゼートビー ズアッセイ 多数のドナーから血漿試料を入手し、ＡＬＴ、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ抗体、ＨＩ Ｖ−１、ＨＩＶ−２、ＨＢｃＡｇ、梅毒、ＨＴＬＶ−Ｉについてスクリーニング を行った。合計１０５７件 の血漿試料をＡｂｂｏｔｔのＨＴＬＶ−ＩＥＩＡ（製造業者の指示に従う）およ びＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイにより前記Ｂ項に述べられて いるようにして検査した。Ｓ／ＣＯ≧１．０００であれば試料は反応したとみな した。結果は表１のとおりである。 データから、ここで調べた血漿試料群ではＨＴＬＶ−Ｉ／ II_NRAライゼートビーズアッセイのほうが性能がよかったことがわかる。ＨＴＬ Ｖ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイでは、試料母集団平均はアッセイカッ トオッフから１４．４４の母集団標準偏差だけ離れていたが、ＨＴＬＶ−ＩＥＩ Ａアッセイでは７．８２の母集団標準偏差しか離れていなかった。母集団平均か らアッセイ標準カットオフまでの標準偏差の数値が大きくなっているということ は、偽反応および偽陽性の可能性が少なくなることなので有利な点である。 Ｄ．妨害しうる物質がＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II_NRAライゼートビーズアッセ イの特異性に及ぼす影響 妨害物質となりうる１群の試料について、ＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビ ーズアッセイ（上記Ｂ項に記すとおりに実施）およびＡｂｂｏｔｔのＨＴＬＶ− Ｉ ＥＩＡ（製造業者の指示に従う）を実施して、特異性を調べた。１８の試料 分類（表２に示す）から得た合計１６７名の標本について検査した。アッセイの 結果は表２に示すとおりである。 ＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイでは偽反応は見られなかった 。対象者群中、ＨＣＶ（＃８）および骨髄腫（＃１０）の者はＨＴＬＶ−Ｉ Ｅ ＩＡアッセイで反応した。ＨＶＣ（＃８）および骨髄腫（＃１０）の試料につい てＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ ＨＴＬＶ−Ｉ／IIウエスタンブロット（バージョン２．３）キットで 補足検査を行ったところ、ＨＣＶ（＃８）については確認できず、骨髄腫（＃１ ０）の試料は陰性であった。 Ｅ．連続希釈したＨＴＬＶ−Ｉ陽性試料およびＨＴＬＶ−II陽性試料を検査する ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II_NRAライゼートビーズアツセイ ＰＣＲで確認したＨＴＬＶ−Ｉ陽性試料およびＨＴＬＶ−II陽性試料を連続希 釈し、ＨＴＬＶ−Ｉ ＥＩＡ（製造業者の指示に従う）およびＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRA ライゼートビードアッセイ（Ｂ項に述べたとおり）で定量分析し、アッセイ に対する相対的感度を調べた。それぞれＨＴＬＶ−Ｉ試料よびＨＴＬＶ−II試料 の２被験群を、それぞれ対応する陽性血漿を希釈して再石灰化陰性血漿にした。 アッセイの結果を図３および４に示す。データは下の表３にまとめて示す。 希釈全体のＨＴＬＶ−Ｉ／II_NRAライゼートビーズアッセイに対する反応率（ ロットＡについては４６／６１、ロットＢについては４５／６１）は、ＨＴＬＶ −Ｉ ＥＩＡの反応率（３４／６１）を超えていた。データから、ＨＴＬＶ−Ｉ ／II_NRAライゼートビーズアッセイでは、ＨＴＬＶ−Ｉ ＥＩＡに比べてＨＴＬ Ｖ−Ｉ抗体およびＨＴＬＶ−II抗体に対する感度が増すことが、全希釈試料につ いての試料カットオフ値が高くなっていることで立証されている。 Ｆ．ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II_NRAライゼート微粒子アッセイ 約０．２〜０．３ミクロンの微粒子（Ｓｅｒｏｄｙｎｅ（インディアナ州イン ディアナポリス）から購入）をＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIのＮＲＡライゼ ート（前記Ａ項で述べたようにして作製）のいずれかで被覆して、２種類の微粒 子、すなわちＨＴＬＶ−Ｉウイルスライゼートのみで被覆した微粒子およびＨＴ ＬＶ−II_NRAウイルスライゼートのみで被覆した微粒子を作製した。ＨＴＬＶ− Ｉライゼート被覆微粒子は、作業濃度（０．６％固体で６０μｇ／ｍｌ）の約５ 倍で約３５℃で１６〜２４時間被覆した。ＨＴＬＶ−IIライゼート被覆微粒子は 、 作業濃度（０．６％固体で６０μｇ／ｍｌ）の約１０倍で室温で１６〜２４時間 被覆した。それから微粒子の種類を組み合わせて、１２μｇ／ｍｌのＨＴＬＶ− Ｉ、６μｇ／ｍｌのＨＴＬＶ−II、９％ショ糖、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ リン酸、０．１％ＢＳＡ、０．１％トゥイーン、０．１％アジドを含有するｐＨ ７．５の混合液をつくった。 アッセイでは、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性確認済み試料、ＨＴＬＶ−II陽性確認済み試 料、および判別できていない試料を検査した。検体血漿または血清約１００μｌ を反応トレイのウェルに入れた。次いで、微粒子混合液５０μｌをウェルに加え 、試料／微粒子混合液を３５℃で約１８分間インキュベートした。インキュベー ションは、反応トレイの反応ウェル部分で行った。 インキュベーションの後で、反応混合液を反応トレイに置いた捕獲膜に移し、 ３００μｌの移動緩衝液（０．０１Ｍリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ポリエチレングリコール、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２）で２回洗浄 した。約１０分間そのままにして、反応ウェルから液体が完全に排出されるよう にした。 それからプローブ混合液５０μｌを捕獲膜上の微粒子に加え た。プローブ混合液には、ビオチニル化したＨＴＬＶ−Ｉ（約１０ｎｇ／ｍｌ） 、ＨＴＬＶ−II（約２０ｎｇ／ｍｌ）、糖蛋白質（４０ｎｇ／ｍｌ）、０．１Ｍ トリス、２％ウシ血清、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％アジドを混ぜたものが入 っていてｐＨ８．０であった。その後、混合液を３５℃で約２０分間インキュベ ートした。ＨＴＬＶ−Ｉプローブを、５００ｐｇ／ｍｌ（ビオチン／抗原の比が ０．４：１ ｗｔ：ｗｔ）で２〜８℃で約１６〜２４時間かけてビオチニル化し た。ＨＴＬＶ−IIプローブを、２００μｇ／ｍｌ（ビオチン／抗原の比が０．８ ：１ ｗｔ：ｗｔ）で２〜８℃で約１６〜２４時間かけてビオチニル化した。糖 蛋白質は２００μｇ／ｍｌ（ビオチン／抗原の比が０．５：１ ｗｔ：ｗｔ）で ２〜８℃で約１６〜２４時間かけてビオチニル化した。ビオチニル化した調製物 はすべて透析してから使用した。糖蛋白質も硫酸アンモニウムを使って沈澱させ てから使用した。 結合しなかったプローブは０．１Ｍトリス、０．１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ 、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ８．５の洗 浄溶液３００μｌを使って反応トレイ中の吸取紙に洗い流し入れた。次いで、５ ０μｌの アクリジニウム標識した抗ビオチンマウスモノクロナール抗体（０．０１Ｍリン 酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、４％ＢＳＡ、１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００、０．１ ％アジド、ｐＨ６．３で１６０ｎｇ／ｍｌに希釈；アクリジニウム／抗体のモル 比を約５：１から１．８：１になるまで約１０分間反応させて標識し、それから ＨＰＬＣサイズ分画カラム上で分画）を加え、３５℃でさらに１０分間インキュ ベートした。未結合結合体を３００μｌの洗浄溶液（０．０２５Ｍ ＭＥＳ、０ ．９％ＮａＣｌ、０．１％プロクリン、ｐＨ５．７）で吸取紙に洗い流し入れた 。１０分後、５０μｌのアルカリ性ペルオキシド活性剤溶液（０．２Ｎ ＮａＯ Ｈ、０．２％過酸化水素、０．０３％ＤＴＰＡ）を注入してアクリジニウム標識 をトリガーし、光子を採集して計数した。 比較のために、検体についてＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅ ｓ ＨＴＬＶ−ＩキットおよびＡＢＢＯＴＴ ＨＴＬＶ−ＩＥＩＡを使ったアッ セイも行い、いずれも製造業者の指示に従って実施した。試料値とカットオフ値 の比（Ｓ／ＣＯ）が≧１．００の場合に反応したとみなした。結果を表３ａ、３ ｂ、３ｃに示す。 実施例２ ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルスのゲノムのクローニングおよび配列決定 Ａ．ＨＴＬＶ−II_NRAクローンの生成 ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルスの完全な分子クローン（ ＮＲＡ１９ａ）を、 ＨＴＬＶ−II_NRA感染細胞系ＮＲＡ−Ｐからの部分的に消化されたゲノムＤＮＡ である、制限酵素Ｓａｕ３Ａから作成したゲノムライブラリーからクローンした ［ローゼンブラットらによるＮｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５巻３７２〜 ３７７頁（１９８６年）］。Ｓａｕ３Ａ消化ゲノムＤＮＡは、塩化ナトリウム勾 配上でサイズ分画し、８〜２３ｋｂの挿入断片を ＥＭＢＬ３（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）カリフォルニア州ラヨラ）のＳａｕ３Ａ部位にサブクローンした。 ｅｎｅ、カリフォルニア州ラヨラ）を使ってパッケージングし、ＬＥ３９２（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラヨラ）に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ の制限細菌宿主株（株ＬＥ３９２、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ ヨラ）中の約１０⁶のファージプラークを、ＨＴＬＶ−II_MoクローンｐＨ６ ｎｅｏ（ｐＨ６ Ｂ５．０）の４．７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを使ってス クリーンし、またｐＨ６ｎｅｏ（ｐＨ６ Ｂ３．５）からの３．５ｋｂのＢａｍ ＨＩ ３’フラグメントを使って再スクリーンした［チェンらによるＮａｔｕｒ ｅ３０５巻 ５０２〜５０５頁］。双方のプローブにハイブリダイズしたクローン を単離した。クローンのうち最も大きいものを ＮＲＡ１９ａとしたが、これは 完全なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｒｅｘのコーディング配列を含んでい ることがわかった。このクローンをＢａｍＨＩによって消化し、結果として生じ たフラグメントをＰＭ１３ＳＫ＋Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラヨラ）にサブクローンし、３つのクローン、すな わちＰＭ１３．ＮＲＡ１．５（部分的５’ＬＴＲおよびｇａｇを含む１．５ｋｂ ）、ＰＭ１３．ＮＲＡ３．３（３’ｇａｇおよびｐｏｌを含む３．３ｋｂ）、Ｐ Ｍ１３．ＮＲＡ３．５（部分的３’ｐｏｌおよびｔａｘ／ｒｅｘを含む３．５ｋ ｂ）を得た。 Ｂ．サブクローニング ＨＬＶ−IIクローンＰＭ１３．ＮＲＡ３．３をＸｂａｌによって消化し、クロ ーンＰＭ１３．ＮＲＡ３．５をＣｌａｌによ って消化し、図１に示す制限フラグメントを生成した。フラグメントをＭ１３、 ｍｐ１８、ｍｐ１９（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ． （ニュージャージー州ピスキャットアウェイ）から入手）にサブクローンした。 相補的配向を、直接ゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色ゲル上での相補性 試験によりスクリーンした［サムブルックらによる「分子クローニング−実験室 マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）」第２版、４．３９〜４．４３（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）。 Ｃ．ヌクレオチド配列決定 Ｍ１３前進プライマー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌ Ｃｏｒｐ．、オハイオ州クリーブランド）を使って、サンガージデオキシ配 列歩行法［サンガーらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７ ４巻 ５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］を実行した。配列決 で、［ ³²Ｐ］ＡＴＰをシグナル組込み（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリ ントンハイツ）を使って行った。配列は１メ ートルの６％および４％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分析し［バーカ ーらによるＰｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２巻３３５〜３５０頁（１９８３年） ］、データはオートラジオグラムからＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉ ｔｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州マウン テンビュー）に移し、アセンブリして分析した。ＨＴＬＶ−II_NRAプロウイルス の全ヌクレオチド配列は８９５７の塩基から成り、図２および後出の配列表の配 列番号１に示す。 実施例３ ＨＴＬＶ−II_NRAゲノムおよびＨＴＬＶ−II_Moゲノムの比較 ＨＴＬＶ−II単離株Ｍｏ（８９５２ヌクレオチド）と単離株ＮＲＡのプロウイ ルスゲノムの配列アラインメントを行った。ＨＴＬＶ−II_NRAの全ゲノムを、Ｇ ＣＧソフトウェアパッケージ［ドゥブリューらによるＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ．Ｒｅｓ．１２巻 ３８７頁（１９８４年）］およびＧＡＰ位置合わせプログラ ム［ニードルマンらによるＪ．ＭＯｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻４４３〜４５３頁（１ ９７０年）］を使って、ＨＴＬＶ−II_Mo配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１００ ６０）とアライ ンメントした。２種の単離株の全体的相同率は９５．２％で、ＨＴＬＶ−II_Moに 比べてＨＴＬＶ−II_NRAでは４３０のヌクレオチド変化、８ヌクレオチドの欠失 、１０ヌクレオチドの挿入があった。下の表４ａに、５’ＬＴＲ領域におけるヌ クレオチド相同性を示す。 表４ａに示すように、ＨＴＬＶ−II_MoのＬＴＲ領域（７６３塩基）とＨＴＬＶ −II_NRAのＬＴＲ領域（７６６塩基）をアラインメントしたところ、全体でヌク レオチド相同率は９３．７％となり、４７の塩基の変化と１５のギャプがあった （６塩基はＨＴＬＶ−II_Moでのみ見られ、９塩基はＨＴＬＶ−II_NRAでのみ見ら れた）。ｒｅｘ反応要素についての相同率は９４．８％、シス作用抑制要素（Ｃ ＲＳ）についての相同率は９３．４％であり、第２シス作用抑制配列については 相同率は８９．６％でしかなかった。 下記の表４ｂに、主要オープンリーディングフレームのｇａｇ、プロテアーゼ 、ｐｏｌに関するヌクレオチドおよびアミノ酸の相同率を示す。 表４ｂから、ｇａｇ前駆体は１３０２のヌクレオチドから成り、全体的相同率 はｐ１９遺伝子産物については９５．３％、ｐ２４遺伝子産物については９６． １％、ｐ１５遺伝子産物については９６．０％であったことがわかる。遺伝子は ４３４のアミノ酸についてコードしており、アミノ酸の相同率はｐ１９について は９９．３％、ｐ２４については９８．６％、ｐ１５については９６．４％であ った。プロテアーゼ遺伝子は５３６の塩基を含んでいた。ＨＴＬＶ−II_Moとの相 同率は、ヌクレオチドレベルでは９５．５％、１７８のアミノ酸については９６ ．６％であった。ｐｏｌ前駆体は９８３のアミノ酸をコードする２９４９のヌク レオチドから成っていた。ＨＴＬＶ−II_Moに対する相同率は、ヌクレオチド配列 では９５．１％、９８３のアミノ酸については９６．２％であった。 表４ｃにはｅｎｖに関するヌクレオチドおよびアミノ酸の相同率を示す。ｅｎ ｖ遺伝子はｇｐ４６およびｐ２１ｅを含む４８７のアミノ酸をコードした。ＨＴ ＬＶ−II_NRAとＨＴＬＶ−II_Moの相同率は、５１８３〜６６４３のヌクレオチド については９５．５％、アミノ酸レベルでは９６．９％であった。 ｔａｘ／ｒｅｘをコードする配列は一部重なっており、ウイルス転写およびｍ ＲＮＡプロセッシングに必要な蛋白をコードする。表４ｄにｅｎｖに関するヌク レオチドおよびアミノ酸の相同率を示す。ＨＴＬＶ−II_NRAのｔａｘ遺伝子は塩 基７２１６〜８２８２の１０７１のヌクレオチドから成り、塩基５１８３〜５１ ８６に開始コドンを含んでいた。ＨＴＬＶ−II_Moとの相同率は、ヌクレオチドレ ベルでは９６．２％、アミノ酸レベルでは９７．９％であった。ＨＴＬＶ−II_{NR A} では、ｔａｘ／ｒｅｘオープンリーディングフレームの３’末端に２５の追加 のアミノ酸があり、３’ＬＴＲまで延びていた（ヌクレオチド位置８２０８〜８ ２８２）。この領域については、２つの塩基の変化と１つのアミノ酸置換が見ら れた。ｒｅｘはヌクレオチド５１２４〜５１８６および７２１６〜７６６５によ ってコードされた。ｒｅｘの５１３の塩基配列に関する相同率は、ヌクレオチド については９７．８％、アミノ酸については９４．７％であった。 翻訳されないｅｎｖからｔａｘ／ｒｅｘ領域（表４ｄ）では、ｅｎｖ末端から ｔａｘ／ｒｅｘ開始位置まで（塩基６６４４〜７２１５）の５７２のヌクレオチ ドについての相同率は９４． ８％で、欠失が２、挿入が１あった。 実施例４ ＨＴＬＶ−II単離株のエンベロープ遺伝子内の遺伝的多様性 Ａ．方法および材料 １．米国ドナー試料 米国の多地区でのＨＴＬＶ感染罹患試験［リーらによるＬａｎｃｅｔ３３７巻 １４３５〜１４３９頁（１９９１年）］の一部として、抗ＨＴＬＶ−Ｉ／II血清 陽性であることがわかりかつ確認されている定期的献血者に連絡して試験への参 加を依頼し、インフォームドコンセントを行なった。新たに採取しヘパリン化し た血液５０ｍｌから、フィコール−ハイパック密度勾配法により血漿および末梢 血リンパ球（ＰＢＬ）を採集した。リンパ球は凍結保存し、後でＰＣＲのために ＤＮＡを抽出した。ＰＣＲによって分別した後、リンパ球を得たＨＴＬＶ−II感 染者をその後の試験の対象として選んだ。 ２．米国ＩＶＤＵ 同意が得られた抗ＨＴＬＶ−血清陽性静注薬使用者（ＩＶＤＵ）である対象者 から、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（フロリダ州ペンサコラ）において 血漿瀉血分離交換法により 血漿および濃縮赤血球を得た。フィコール−ハイパック密度勾配法によりリンパ 球を回収し、ＤＮＡ抽出用に凍結保存した。ＨＴＬＶ−II感染患者はＰＣＲによ って選択した。 ３．イタリアＩＶＤＵ イタリアのミラノの様々な血清陽性ＩＶＤＵ集団から、またローマの州刑務所 の男性白人ＩＶＤＵ収容者から、全血または血漿と凍結保存リンパ球とを受け取 った。全血から先に述べた方法でリンパ球を収集し、凍結乾燥するか、もしくは 連続細胞培養した。 ４．ＰＢＬの連続培養 米国のドナー８例、米国のＩＶＤＵ１０例、イタリアのＩＶＤＵ１６例から得 た新鮮なＰＢＬまたは凍結保存したＰＢＬを、連続培養した。１００万細胞／ｍ ｌの濃度の２０００万のドナーのＰＢＬ、および５００万のＰＨＡ刺激臍帯血リ ンパ球（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリ ーランド州コロンビア）を、２０％加熱不活化ウシ胎仔血清および１０％インタ ーロイキン２（ＩＬ−２）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ s，Ｉｎｃ．、メリーランド州コロンビア）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地 （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、メリーランド州ガイザースバーグ）に再懸濁した。細胞 を６％ＣＯ₂存在下で３７℃でインキュベートし、１０％ＩＬ−２含有ＲＰＭＩ １６４０培養基を定期的に補充した。５００万の新鮮なＰＨＡ刺激臍帯血リンパ 球を７、１４および２１日目に培養物に加えた。培養４０日目に、細胞がＩＬ− ２非依存になるまでＩＬ−２の濃度をしだいに薄くしていった。培養は８〜１２ 週間維持し、増殖中の様々な時点で凍結乾燥した。 ５．細胞系対照 クローンしたＨＴＬＶ−II_Mo対照ＤＮＡを、プラスミドｐＨ６ｎｅｏ含有細胞 系７２９から得た［ローゼンブラットらによるＮ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１ ３巻 ３７２〜３７７頁（１９８６年）］。ＨＴＬＶ−II_NRA対照プロウイルスＤ ＮＡを、患者ＮＲＡの培養したＰＢＬから得た［ローゼンブラットらによるＮ． Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３巻 ３７２〜３７７頁（１９８６年）］。 ６．ＨＴＬＶの血清学 当初は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、イリノイ州シカゴ）によってＨＴＬ Ｖ−Ｉ／IIに対する抗体について血清のスクリーニングを行った。ＥＩＡでは抗 原入手源としてＨＵＴ１０２−Ｂ２細胞系（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ベゼスダ）から精製し、音波処理 して界面活性剤で分裂させたＨＴＬＶ−Ｉビリオンを使用した。ＥＩＡに反応す る試料を、ウエスタンブロット法でさらに評価した。ウエスタンブロットストリ ップは、先に述べたＨＴＬＶ−Ｉ抗原を使って作製した。ウイルス蛋白を１２％ ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離してから、ニトロセルロースに 移した。検体血清をこのストリップに１晩曝露してから、ストリップをビオチン 標識したヤギ抗ヒトＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州ガイザースバーグ） とインキュベートした。ストリップを４−クロロ−１−ナフトールおよび過酸化 水素の基質溶液とインキュベートして発色を視覚化した。ＨＴＬＶ遺伝子産物コ アｐ２４およびエンベロープｇｐ４６に対して抗体が存在すれば、試料は確認さ れたとみなした。 ウイルス特異なバンドに対して反応性を示さない試料は確認 されないとみなされ、それ以上検査をする必要はなかった。１バンドのみに対し て反応性を示した試料は未決定と分類され、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ） によってさらに検査した。 ³⁵Ｓ−メチオニンおよび³⁵Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓ ｃｉｅｎｃｅｓ、イリノイ州アーリントンハイツ）を使って、ＨＴＬＶ−Ｉ感染 ＨＵＴ１０２−Ｂ２細胞を代謝的に標識し、細胞をさらに界面活性剤で分裂させ 、遠心分離で清澄化した。血清試料を細胞ライゼートおよびプロテインＡセファ ロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）と４℃で １晩インキュベートした。プロテインＡセファロース、抗原および抗体の複合体 を、連続的な高塩緩衝液および低塩緩衝液で洗浄し、煮沸して分裂させ、１２％ ポリアクリルアミドゲルに載せた。電気泳動した後、ゲルを固定させ、蛍光体と インキュベートし、乾燥させてオートラジオグラフィーを行った。ＲＩＰＡ単独 で、あるいはウエスタンブロット法とＲＩＰＡを組み合わせた場合のいずれかで ＨＴＬＶコアｐ２４およびエンベロープｇｐ６１に対する抗体が認められたなら ば、試料は確認されたとみなした。 試験対象者から得た血清試料についても、固相ＥＩＡで一連 の合成ペプチド被覆ポリスチレンビーズを使ってＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ− IIに対する抗体を検査した。各ペプチドは、それぞれＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬ Ｖ−IIのエンベロープ領域からの２０〜３０のアミノ酸を表した。アッセイの条 件はＨＴＬＶスクリーニングＥＩＡの場合と同じであった。 確認のために半自動ドットブロット確認イムノアッセイ（Ｍａｔｒｉｘ）も使 用した。試験配列の抗原は、小型カセット中のニトロセルロースに結合した高度 に精製されたＨＴＬＶ−Ｉウイルスｐ１９、組換えｐ２４、組換えｐ２１ｅ、な らびにＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIに特異な合成ペプチドが入っていた。１ ００倍希釈した血清または血漿をカセット中で３０分間インキュベートしてから 、ビオチン標識した抗ヒトＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ、メ リーランド州ガイザースバーグ）、アルカリホスファターゼ標識した抗ビオチン （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州ガイザースバーグ） 、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）と３０分間イ ンキュベートした。各ステップ終了後に、２０分間の自動化洗浄ステップにより 未結合の試薬を取り除いた。最終ステップが終わったならば、反射率 および反応強度を光学読取装置で調べた。ｇａｇ ｐ２４およびｅｎｖ ｐ２１ ｅの双方に陽性の信号が出れば試料は確認されたとみなした。 ７．スクリーニングＰＣＲ ＨＴＬＶ−ＩおよびIIを判別するために、利用可能なＰＢＬから得たＤＮＡを 、フェノール／クロロホルム抽出により調製し、ＰＣＲで調べてウイルス特異な ＨＴＬＶｔａｘ／ｒｅｘ、ｇａｇ ｐ１９、またはｅｎｖ ｐ２１ｅの配列を検 出した。³⁵Ｐで標識したＰＣＲ増幅産物を制限酵素で分解し、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で分離し、先に述べたようにオートラジオグラフィーで可視化し た［リーらによるＳｃｉｅｎｃｅ２４４巻４７１〜４７５頁（１９８９年）；リ ーらによるＬａｎｃｅｔ３３７巻１４３５〜１４３９頁（１９９１年）］。 ８．米国およびイタリアでの単離株におけるＨＴＬＶ−IIの特徴検査 米国のドナー８例、米国のＩＶＤＵ１０例、イタリアのＩＶＤＵ１６例からの 血漿を対象に、ウエスタンブロット、ＲＩＰＡ、マトリックスおよび合成ペプチ ドにより、ＨＴＬＶ−Ｉ／IIに対する抗体の有無を調べた。米国の被験者は全員 ＨＴＬＶ血清 陽性であり、ウエスタンブロット／ＲＩＰＡおよびマトリックスにより確認され た。イタリアの１６例のＩＶＤＵのうち、１４例（８７．５％）は血清陽性で確 認されたが、２例（１２．５％）はｅｎｖ ｇｐ６１抗体がなかったので判定で きなかった。ただし、イタリアのＩＶＤＵ１６例全員がマトリックスによりｇａ ｇ ｐ２４およびｅｎｖ ｐ２１ｅに対する抗体により確認された。米国ドナー 全員、米国のＩＶＤＵ１０例中９例（９０％）、イタリアのＩＶＤＵ１６例中１ ２例（７５％）が、ＨＴＬＶ−IIｇｐ４６合成ペプチドに対する抗体を有してい た。 培養リンパ球から抽出したＤＮＡのＰＣＲ評価により、本試験で使用した米国 ドナーおよび米国ＩＶＤＵの標本すべてがＨＴＬＶ−IIに感染していることが確 認された。イタリアの血清陽性ＩＶＤＵでは、１６のリンパ球培養物中８でＰＣ ＲによりＨＴＬＶ−IIプロウイルスが検出された。 ９．ＰＣＲ増幅産物の酵素制限マッピング 培養ＰＢＬまたは細胞系ＭｏおよびＮＲＡからのＤＮＡを、フェノール／クロ ロホルム抽出により調製した。ＨＴＬＶ−IIエンベロープ領域における配列の変 動を、ＨＴＬＶ−IIｇｐ４ ６に特異な２対のオリゴヌクレオチドプライマーを使って評価した。プライマー の位置は、ＨＴＬＶ−II_Moのプロウイルスゲノム全体におけるヌクレオチドナン バーに対応している。第１対は、８２／８８であると確認されたが、ヌクレオチ ド５３２３から５８６１までの５３９塩基配列を定めた。第２対の８５／８６は 、ヌクレオチド５６１８から６０５１までの４３４塩基配列を定めた。プライマ ーのヌクレオチド位置は次のとおりである。＃８２（５３２３〜５３４２）、＃ ８８（５８４２〜５８６１に相補的）、＃８５（５６８１〜５６３７）、＃８６ （６０３２〜６０５１に相補的）。合計すると、ｇｐ４６遺伝子の９２４ヌクレ オチド中７２９ヌクレオチド（７８．９％）が増幅された。どの実験でも上流オ リゴヌクレオチドプライマーの５’末端を［ ³²Ｐ］ＡＴＰで標識した。増幅の 条件は先に報告したとおりであった［リーらによるＳｃｉｅｎｃｅ２４４巻４７ １〜４７５頁（１９８９年）］。 ＨＴＬＶ−II単離株間の配列の変動を評価するために、ＰＣＲ増幅産物のアリ コートを制限酵素で消化してから、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動および オートラジオグラフィーを行った。 １０．米国およびイタリアの単離株のＤＮＡ配列決定 ＨＴＬＶ−IIｇｐ４６増幅配列のＤＮＡ配列決定を、サンガージデオキシ媒介 鎖終了法［サンガーらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７ ４巻 ５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］により、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅバージ ョン２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、オハイオ 州クリーブランド）をやや修正使用して実施した。関連制限部位の領域の配列決 定には、第３対のプライマーを使用した。８１／８５Ａという対は、ヌクレオチ ド５２９１〜５６１０の領域を定めた。プライマー＃８１の位置は５２７９〜５ ２９８で、＃８５Ａはヌクレオチド５６１８〜５６３７に対して相補的であった 。ＨＴＬＶ−II単離株からのＤＮＡを、５’末端を［ ³²Ｐ］−ＡＴＰで標識し た（先に述べた）対の１つのプライマーを使って、４０サイクルにわたりＰＣＲ 増幅した。ＰＣＲ産物を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オート ラジオグラフィーをとって関連増幅産物の位置を確認した。放射標識したＤＮＡ を、ロッキングプラットフォーム上で３７℃で１晩インキュベートし、０．５Ｍ 酢酸アンモニウム、１ｍｍＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）でゲルから溶出させ た。０．３Ｍ酢酸ナトリウム存在下でＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、真空条 件で１晩乾燥させた。試料を蒸留水で再構成し、０．４Ｍ ＮａＯＨ、０．４ｍ ｍＥＤＴＡで３７℃で３０分間処理して１本鎖ＤＮＡに変性させた。再びエタノ ール沈殿でＤＮＡを採集し、真空乾燥させた。試料を再構成した後、最初の増幅 段階では標識していなかったプライマーの５’末端に［ ³²Ｐ］−ＡＴＰで標識 したものを使ってジデオキシ配列決定を行った。標識プライマーを変更すること で、ＤＮＡを両方の鎖から配列決定してオーバーラップ読み取りできた。試料を 長さ４０ｃｍの６％アクリルアミド／尿素配列決定ゲルで１５００ボルトで１． ５時間かけて分離した。 Ｂ．遺伝的変動の比較 ２種のプロトタイプの間の配列相同領域についてＰＣＲプライマーを選択した 。ＨＴＬＶ−II単離株間で起こりうる変動のマップを作成するために、ＨＴＬＶ −II_MoおよびＨＴＬＶ−II_NRA対照細胞系から抽出したプロウイルスＤＮＡ、ま た米国ドナー８例、米国ＩＶＤＵ１０例およびイタリアＩＶＤＵ７例の培養細胞 から抽出したプロウイルスＤＮＡを２つのオーバーラップｇｐ４６領域について ＰＣＲによって増幅させてから、増 幅した配列を制限酵素で分解した。プライマー対８２／８８を使用したところ、 ＨＴＬＶ−II_Moプロトタイプの５３９ｎｔＰＣＲ増幅産物では、次のサイズの酵 素分解産物が示された。ＴａｑＩ（２９５ｎｔ）、ＨｐｈＩ（２５９ｎｔ）、Ａ ｐａＩ（２２４ｎｔ）、Ｆｎｕ４ＨＩ（１９３ｎｔ）、ＢｂｖＩ（１７９ｎｔ） 、ＲｓａＩ（１４０ｎｔ）、ＨａｅIII（１３２ｎｔ）。ＨＴＬＶ−II_NRAプロト タイプでは別のパターンが見られた。５３９ｎｔのＰＣＲ増幅産物は、全ＨＴＬ Ｖ−II_Moプロウイルスゲノムにおける番号の付いた位置で決まる塩基５４６２に おける５’−ＧＴＡＣ−３’配列を開裂する酵素のＲｓａＩの影響を受けなかっ た。イタリアのＩＶＤＵのプロウイルスＤＮＡについては、さらに別の３番目の 消化パターンが見られた。５３９ｎｔのＰＣＲ増幅産物をＲｓａＩで開裂したと ころ、９１ｎｔまたは予想された配列より約５０ｎｔ小さい分解産物ができた。 ２番目のＨＴＬＶ−IIｇｐ４６のプライマー８５／８６により定められた４３ ４ｎｔのＰＣＲ増幅領域について酵素制限マッピングを行なったところ、異なる パターンが見られた。ＨＴＬＶ−II_Mo単離株については、消化産物のサイズは次 のとおり であった。ＲｓａＩ（２６６ｎｔ）、ＡｌｕＩ（１９５ｎｔ）、ＨｉｎｆＩ（１ ２７ｎｔ）およびＭｂｏＩ（６０ｎｔ）。ＨＴＬＶ−II_NRAおよびイタリアのＩ ＶＤＵのプロウイルスＤＮＡは、塩基位置５８８３でＲｓａＩにより開裂できな かった。 米国のドナーおよびＩＶＤＵでは、Ｍｏ様単離株およびＮＲＡ様単離株の双方 が認められた。米国ドナー８例中５例、米国ＩＶＤＵ１０例中６例は、ＨＴＬＶ −II_Moプロトタイプに似ていた。米国ドナー８例中３例および米国ＩＶＤＵ １ ０例中２例は、ＨＴＬＶ−II_NRAプロトタイプに似ていた。米国ＩＶＤＵ２例で はｇｐ４６の増幅が見られなかった。調べた７例のイタリアＩＶＤＵでは、全員 がプライマー８５／８６により生成した４３４ｎｔの産物の酵素マッピングによ るＮＲＡタイプの単離株に似ていた。イタリアの７例のＩＶＤＵ全員が、Ｍｏお よびＮＲＡのどちらのプロトタイプとも異なり、プライマー８２／８８からの５ ３９ｎｔの増幅産物を酵素消化したときに第３の異なった消化パターンを示した 。ＲｓａＩ消化すると、全例で９１ヌクレオチドの産物が得られた。 それからＰＣＲで生成したＤＮＡフラグメントの配列決定を行って、単離株間 でのヌクレオチドおよびアミノ酸の相違につ いて調べた。５４６２位におけるＲｓａＩ制限部位を含む領域である位置５２９ １から５６１０までの３２０塩基に関する配列データを、米国ドナー２例、米国 ＩＶＤＵ３例およびイタリアＩＶＤＵ４例について決定した。ゲノムのこの領域 では、配列決定された２つの対照細胞系、ＨＴＬＶ−II_NRAおよびＨＴＬＶ−II_{M o} （７２９ｐＨ６ｎｅｏ）は、３２０塩基中１３塩基（４．１％）が異なってい た。 米国ＩＶＤＵ２例および米国ドナー１例からのＨＴＶＬ−II単離株は、ＨＴＬ Ｖ−II_NRAと比較した場合に１３の変異位置で同一性を示さなかった。これら３ つの単離株は、配列決定したＭｏ対照細胞系７２９ｐＨ６ｎｅｏプロウイルスＤ ＮＡと比較した場合に塩基置換が認められなかった。他の６つのＨＴＬＶ−II単 離株（米国ドナー１例、米国ＩＶＤＵ１例およびイタリアＩＶＤＵ４例）は、Ｎ ＲＡ細胞系対照からの配列決定したプロウイルスＤＮＡに比べて３２０塩基中２ 塩基（０．６％）が異なっていた。変異型ヌクレオチド位置におけるＨＴＶＬ− II_NRAと一致したのは１２／１３または１１／１３であった。塩基置換は、米国 ドナー１例についてヌクレオチド位置５３７１および５４４６で、米国ＩＶＤＵ １例について５４４６およ び５５７５で、イタリアＩＶＤＵ単離株４例については５４１３および５４４６ で生じた。変異位置５４４６で塩基の変化があったのは、ＨＴＬＶ−II_NRA単離 株のみであった。イタリアのＩＶＤＵについては、５４１３位においてＧが置換 されたことで新しいＲｓａＩ酵素消化部位がもたらされたが、これは制限マッピ ングによって見られた消化パターンに一致した。それに対して、イタリアのＩＶ ＤＵは３２０ヌクレオチド中１３ヌクレオチド（４．１％）がＨＴＶＬ−II_Moと 異なっていた。したがって、イタリアのＩＶＤＵ単離株は、ＨＴＬＶ−II_Moより もプロトタイプのＨＴＬＶ−II_NRA単離株のほうに配列がより近かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/70 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ Ｇ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ 33/543 ５０１Ｄ 33/543 ５０１ 8310−2Ｊ 33/569 Ｌ 33/569 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 イドラー，ケネス・ビー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53179、 トレバー、トウーハンドレツド・シツクス テイース・アベニユー・11332 (72)発明者 ローゼンブラツト，ジヨセフ・デイー アメリカ合衆国、カリフオルニア・90036、 ロス・アンジエルス、ノース・ビスタ・ 421 (72)発明者 チエン，アービン・エス・ワイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91367、 ウツドランド・ヒルズ、エル・キヤノン・ 5533 (72)発明者 ゴルデ，デビツド・ダブリユ アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10021、 ニユー・ヨーク、イースト・シツクステ イ・フオース・ストリート・402、アパー トメント・10―エー・エイチ (72)発明者 ロバートソン，ユージエン アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、タルボツト・レーン・1068 (72)発明者 ステイーブンス，ジヨン・イー アメリカ合衆国、イリノイ・60031、グー ニー、プレーリー・オーク・ロード・5048 (72)発明者 チヤン，エマーソン・ダブリユ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、フエアローン・アベニユー・ 933 (72)発明者 バイテンドープ，マーク・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60013、カリ ー、ノース・ウツドランド・24488 (72)発明者 ジヨンソン，ジヨアン・イー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、ウエスト・オーステイン・ア ベニユー・118Ａ (72)発明者 モツトレイ，チエリル・テイー アメリカ合衆国、イリノイ・60087、ウオ ーケガン、ブランチヤード・12611 (72)発明者 エドワーズ，ミツシエル アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノシヤ、フオーテイ・ナインス・アベニ ユー・6401 (72)発明者 タテ，シンシア アメリカ合衆国、イリノイ・60614、シカ ゴ、ノース・ハンプデン・コート・2629、 ナンバー・303 (72)発明者 ピーターソン，ブライアン アメリカ合衆国、イリノイ・60060、モン デレイン、カステイリアン・ウエイ・1641 (72)発明者 グイデインガー，ペギー アメリカ合衆国、イリノイ・60630、シカ ゴ、ウエスト・グニンソン・アベニユー・ 4811

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 単離されたＨＴＬＶ−IIウイルスであって、当該ウイルスのゲノムが配列 番号１に示す配列を含んで成るウイルス。 ２． 精製されたＨＴＬＶ−IIＮＲＡウイルスライゼート。 ３． ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１１５８０として寄託されている細胞由来のウイ ルスを含んで成る請求項２に記載のライゼート。 ４． ＨＴＬＶ−IIＮＲＡに感染した組織培養増殖細胞。 ５． ＨＴＬＶ−IIウイルスｇａｇ遺伝子発現産物。 ６． ｇａｇ蛋白質ｐ１９を含んで成る請求項５に記載の発現産物。 ７． ｇａｇ蛋白質ｐ２４を含んで成る請求項５に記載の発現産物。 ８． ｇａｇ蛋白質ｐ１５を含んで成る請求項５に記載の発現産物。 ９． ＨＴＬＶ−IIウイルスｐｏｌ遺伝子発現産物。 １０． ＨＴＬＶ−IIウイルスｅｎｖ遺伝子発現産物。 １１． ｅｎｖ蛋白質ｐ２１ｅを含んで成る請求項１０に記載 の発現産物。 １２． ＨＴＬＶ−IIウイルスｔａｘ遺伝子発現産物。 １３． ＨＴＬＶ−IIウイルスｒｅｘ遺伝子発現産物。 １４． ＨＴＬＶ−IIウイルス遺伝子発現産物を含んで成る融合蛋白質であって 、当該発現産物がｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｘまたはｒｅｘのいずれか１つ の遺伝子によりコードされている融合蛋白質。 １５． 検体中の抗ＨＴＬＶ−II抗体を検出する方法であって、 ａ）（ｉ）抗ＨＴＬＶ−II抗体を含有する疑いのある検体、 （ｉｉ）ＨＴＬＶ−IIＮＲＡウイルスライゼート、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡペプチ ド、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡ蛋白質、およびその組み合わせから成る群から選択され る構成物を含んで成るＨＴＬＶ−II抗原、および （ｉｉｉ）当該抗原または抗体に特異的な検出可能な標識および結合メンバー を含んで成る指示試薬を用意し、 ｂ）検体を当該抗原および指示試薬に接触させて反応混合物を形成し、 ｃ）抗原／抗体／指示試薬複合体を形成するに十分な条件下で反応混合物をイ ンキュベートし、 ｄ）当該検体中に抗ＨＴＬＶ−II抗体が存在することの指標として標識された 複合体を検出するステップを含んで成る方法。 １６． 当該ＨＴＬＶ−II抗原が固相に付着している請求項１５に記載の方法。 １７． 当該固相をビーズ、微粒子およびマイクロタイタープレートウェルから 成る群から選択する請求項１６に記載の方法。 １８． 当該検出可能な標識を酵素、放射性同位元素、化学発光標識および蛍光 標識から成る群から選択する請求項１５に記載の方法。 １９． 当該指示試薬の結合メンバーが抗ヒトＩｇＧ抗体を含んで成る請求項１ ５に記載の方法。 ２０． 検体中の抗ＨＴＬＶ−II抗体を検出する方法であって、 ａ）（ｉ）抗ＨＴＬＶ−II抗体を含有する疑いのある検体、 （ｉｉ）ＨＴＬＶ−IIＮＲＡウイルスライゼート、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡペプチ ド、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡ蛋白質、およびその組み合わせから成る群から選択され る構成物を含んで成るＨＴＬＶ−II抗原、および （ｉｉｉ）当該抗原または抗体に特異的な検出可能な標識および結合メンバー を含んで成る指示試薬を用意し、 ｂ）検体を当該抗原に接触させて反応混合物を形成し、 ｃ）抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件下で反応混合物をインキュベー トし、 ｄ）インキュベートした後で、 （ｉ）反応混合物を指示試薬に接触させ、 （ｉｉ）抗原／抗体／指示試薬複合体を形成するに十分な条件下で反応混合物 と指示試薬をインキュベートし、 （ｉｉｉ）当該検体中に抗ＨＴＬＶ−II抗体が存在することの指標として標識 された複合体または未反応指示試薬を検出するステップを含んで成る方法。 ２１． 当該ＨＴＬＶ−II抗原が固相に付着している請求項２０に記載の方法。 ２２． 当該固相をビーズ、微粒子およびマイクロタイターウェルから成る群か ら選択する請求項２０に記載の方法。 ２３． 当該検出可能な標識を酵素、放射性同位元素、化学発光標識および蛍光 標識から成る群から選択する請求項２０に記載に方法。 ２４． 検体中のＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIあるいはその両者に対する抗 体を検出する方法であって、 （ａ）ＨＴＬＶ−Ｉ抗体またはＨＴＬＶ−II抗体あるいはその両者を含有する 疑いのある検体を提供し、 （ｂ）当該検体をＨＴＬＶ−Ｉ抗原およびＨＴＬＶ−II抗原と、抗原／抗体複 合体を形成するに十分な条件下で十分な時間接触させ、当該ＨＴＬＶ−Ｉ抗原は ＨＴＬＶ−Ｉウイルスライゼート、ＨＴＬＶ−Ｉペプチド、ＨＴＬＶ−Ｉ蛋白質 、およびその組み合わせから成る群から選択される構成物を含んで成り、また当 該ＨＴＬＶ−II抗原はＨＴＬＶ−IIＮＲＡウイルスライゼート、ＨＴＬＶ−IIＮ ＲＡペプチド、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡ蛋白質、およびその組み合わせから成る群か ら選択される構成物を含んで成り、 （ｃ）当該複合体を、当該抗原または当該抗体に特異的な検出可能な標識およ び結合メンバーを含んで成る指示試薬と、抗原／抗体／指示試薬複合体を形成す るに十分な条件下で接触させ、 （ｄ）当該検体中に抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、抗ＨＴＬＶ−II抗体、あるいはその 両者が存在することの指標として標識複合体を検出するステップを含んで成る方 法。 ２５． 当該ＨＴＬＶ−Ｉ抗原およびＨＴＬＶ−II抗原が固相 に付着している請求項２４に記載の方法。 ２６． 当該ＨＴＬＶ−Ｉ抗原およびＨＴＬＶ−II抗原が単一の固相に付着して いる請求項２５に記載の方法。 ２７． 当該検出可能な標識を酵素、放射性同位元素、化学発光標識および蛍光 標識から成る群から選択する請求項２４に記載の方法。 ２８． 当該指示試薬の結合メンバーが抗ヒトＩｇＧ抗体を含んで成る請求項２ ４に記載の方法。 ２９． ステップ（ｂ）および（ｃ）を同時に実行する請求項２４に記載の方法 。 ３０． 当該ＨＴＬＶ−Ｉ抗原およびＨＴＬＶ−II抗原が別々の固相に付着して いる請求項２５に記載の方法。 ３１． 当該指示試薬の結合メンバーがＨＴＬＶ−Ｉ抗原およびＨＴＬＶ−II抗 原を含んで成る請求項３０に記載の方法。 ３２． 当該指示試薬の検出可能な標識がビオチンを含んで成る請求項３１に記 載の方法。 ３３． 容器、 当該容器上のラベル、および 当該収納容器に入っている構成物 を含んで成る製品であって、 その構成物は抗ＨＴＬＶ−II抗体を検出するのに有効であり、当該容器上のラ ベルはその構成物を抗ＨＴＬＶ−II抗体の検出に使用できることを示しており、 また当該構成物中の有効物質はＨＴＬＶ−IIＮＲＡウイルスライゼート、ＨＴＬ Ｖ−IIＮＲＡペプチド、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡ蛋白質、およびその組み合わせから 成る群から選択されるＨＴＬＶ−II抗原を含んで成る製品。 ３４． 当該容器上のラベルに、さらに当該構成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用 に関する指示が示されている請求項３３に記載の製品。 ３５． 第１の容器、当該容器上のラベル、および当該容器に入っている構成物 を含んで成るキットであって、 その構成物は抗ＨＴＬＶ−II抗体を検出するのに有効であり、当該容器上のラ ベルはその構成物を抗ＨＴＬＶ−II抗体の検出に使用できることを示しており、 また当該構成物中の有効物質はＨＴＬＶ−IIＮＲＡウイルスライゼート、ＨＴＬ Ｖ−IIＮＲＡペプチド、ＨＴＬＶ−IIＮＲＡ蛋白質、およびその組み合わせから 成る群から選択されるＨＴＬＶ−II抗原を含んで成り、 さらに等張性希釈剤を含んで成る第２の容器を含んで成るキット。 ３６． 当該ＨＴＬＶ−II抗原が固相に付着している請求項３５に記載のキット 。 ３７． さらにＨＴＬＶ−Ｉ抗原を含んで成る請求項３５に記載のキット。 ３８． 脱脂粉乳、血清および緩衝液を含んで成る、非特異的結合を減少させる ために有効な試薬。