JPH06500230A - レトロウイルスSIVcpz―ant及びその用途 - Google Patents
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- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
レトロウィルスS I VC,!−,,,及びその用途後天性免疫不全症候群ま
たはAIDSに対する理解は実質的に進歩してきた。
主要な原因物質は、T4ヘルパー/インデューサーリンパ球に対する親和性を有
する非形質転換レトロウィルスであることが証明されており(1,2)、全世界
で数百万人が既に感染していると予想されている。このウィルスによる感染は、
少なくとも症例のかなりの割合は、この疾患の特徴である日和見感染の罹病性の
増大を伴うT4リンパ球数の進行性欠乏につながる。
疫学的研究は、AIDS症例の大多数に対する病因物質であるヒト免疫不全ウィ
ルス1型(HIV−1)が、現在量も広範に広まっているHIVであり、中央ア
フリカ、ヨーロッパ及び米国において優勢であることを指摘している。
ヒト免疫不全関連レトロウィルスの第二の群であるヒト免疫不全ウィルス2型(
HIV−2)は西アフリカで同定された(3.4)。HIV−2ウイルスはEP
○−0239425号に開示されている。HIV−1ウイルスはWO36102
383号に開示されている。
ヒト免疫不全ウィルスの比較を複雑にしている一つの特徴はその遺伝的変化性で
ある。遺伝的変異体が自然に且つ高頻度で出現するのである。種々のHIV−1
分離物の比較により、ゲノムの成る領域は極めて可変性があり、−万能の領域は
適度に良く保存されることが明らかとなった(5−10)。類似の多形性はHI
V−2についても観察された(11)。最大の遺伝的安定性を有する領域は、お
そらく構造的にまたは酵素的に必須のウィルス蛋白領域をコードしている領域で
あろう。最大の総合的遺伝的安定性を有するウィルス遺伝子はgag及びp。
l遺伝子である。一方env遺伝子の幾らかの領域、並びにrev、tat、s
or及びnefのような調節蛋白をコードしている遺伝子は、高度の変化性を示
す。gag及びpol遺伝子産物の主要な構造上の特徴の幾つかは、特定のHI
V型の全変異体に共通するだけでな(、少な(とも成る程度まではウィルス型間
で保存されているようである。
HrV−1に対して産生された抗血清は、対応するHIV−1遺伝子産物に対す
る親和性より低い親和性ながら、HIV−2のgag及びpoi遺伝子産物と交
叉反応するが、エンベロープ蛋白に対する血清学的交叉反応性は観察されない。
しかしながら、免疫学的交叉反応性が立証できるにも拘らず、核酸レベルの配列
相同性は僅かであり、これはHIV−1及びHIV−2が遺伝学的に別個である
ことを示すものである。そして非常に緊縮性の低い条件における場合を除き、こ
れら二つのウィルス間の有意なハイブリダイゼーションを検出することはできな
い(11)。
サルの免疫不全ウィルス、またはSIVは、HIVの最も近い既知の類縁体であ
る非ヒト霊長顕しンティウイルスである。SIVはかつてマカーク(SIV、。
、)(12,13)、スーティ・マンガベイ(SIV、、)(14,15)、ア
フリカミドリザル(SIVA、11)(16)及びマンドリル(SIVMNo)
(17)から分離されている。
マンガベイ、ミドリザル及びマンドリルはアフリカの旧世界の霊長類であり、こ
れに対してマカークはアジアの旧世界の霊長類である。これら四つのSIVは、
遺伝子配列分析に基づき、SIV、、、c及びSIV、、を一つの遺伝学的群と
する三つの別個の群に分類される(18)。マカークはその自生生息地ではSI
Vに感染しないように見受けられる(19)。故に幾らかのマカーク個体が米国
の地域霊長類センター(リージョナル・ブライメイト・センターズ)でスーテイ
ー・マンガベイからSIV、ゆに感染したと考えられる(20)。
HIV−2はその配列レベルにおいて、個々のSIV、、単離物が互いに異なっ
ているのと同程度にSIV、。と異なっているに過ぎない(18,21)。
SIVAoM及びS I V、、DはHIV−1及びHIV−2とは別個のもの
であり、S I VM、DはHIV−1及びHIV−2とほぼ等距離にあるよう
に思われ(22)、一方SIVAGMはHIV−1よりHIV−2により近い(
23)。血清学的交叉反応性が、異なったH I V/S I Vの構造蛋白間
に観察された。エンベロープ蛋白のレベルにおいては、交叉反応性がS I V
、、c、 S I V、、、、5IvAG11及びHIV−2のエンベロープ蛋
白間に存在するが、これらのウィルスに感染した非ヒト霊長類由来の血清は、H
IV−1エンベロープ蛋白と反応しない。5IV−0陽性マンドリル由来の血清
はHIV−1またはHIV−2エンベロープ蛋白と反応しない。
1988年にHIV−1抗体陽性の野生チンパンジー2例がガボン国の熱帯雨林
で観察された。これらのチンパンジーの1頭からレトロウィルスが分離され、S
IV、、、−6,、−1と命名された。このウィルスはフランス国特許出願第8
9−02964号(1989年3月7日)に開示された。このウィルスは、その
増殖特性、異なる蛋白の分子量を決定するための放射免疫沈降法及びウェスタン
プロット並びに血清学的交叉反応性によって特性決定された(24)。このウィ
ルスの配列決定を行なったところ、HIV−1と84%の相同性があった(25
)。これが、HIV−1群のレトロウィルスに属する非ヒト霊長類由来の最初の
レトロウィルスである。
この感染の蔓延及び重要性を決定するために、より多くのチンパンジーをHIV
/SIV抗体について試験した。HIV−1抗体陽性の野生チンパンジーの新た
な症例が観察された。ザイール国起源のチンパンジー由来の新規な免疫不全ウィ
ルスの分離及び特性決定を記載する。
地理的にはこのウィルスは、HIVが風土病的であるアフリカの一地域に由来し
ている。この単離物は、免疫学的に、HIV−2よりHIV−1に対して抗原性
の上でより密接に関連していることが示されている。
したがって本発明は、チンパンジーから分離されS I V、、、、、、と命名
されたレトロウィルス、並びにヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・
セル・カルチャーズ(ECACC)に受理番号V900 61 322の下で寄
託された該レトロウィルスの本質的な形態学的及び免疫学的性質を有するこのウ
ィルスの変異体に関するものである。
ウィルスの分離は、感染物質の注射を受けたことのない4歳の若い無症候性の雄
のチンパンジー由来の血液から行なった。
このチンパンジーからの血清は、酵素結合免疫吸着検定(HIV1+2ELIS
A、ベージング)において陽性(0,D、 /カットオフの比が6)であった。
市販のHIV−1ウエスタンプロツト(デュポン・ドウ・ネムーア)において、
明瞭なバンドがp24、p34、gp41、gp120及びgp160に、そし
て弱いバンドがp55及びp68に観察された。市販のウェスタンプロット(デ
ュポン・ドウ・ネムーア)における異なったHIV−1抗原に対するこのチンバ
ンノーの血清の力価は以下の通りである
p24 : 1/1.000
p34 : 1/1000
100O・1150.000
gp120:1/10.000
gp160:1/100.000
このウィルスを、10%牛脂児血清、2μg/mlポリブレン、抗生物質(10
0μg/mlゲンタマイシン)及び150U/mlインターロイキンー2を添加
した、2QmM Hepesを含有する1640RPMIからなる培地中で、チ
ンパンジーのリンパ球と健康なHIV陰性ヒトドナーからのPHA刺激リンパ球
との同時培養によって分離した。13日間培養した後、陽性HIV−1抗原捕捉
試験(インノジェネティクス)に基づいて該ウィルスを培養中に検出した。逆転
写酵素(RT)の存在もまた培養上清中に検出された(50.OOOcpm)。
細胞不含RT上清及び抗原陽性上清を用いて新たなリンパ球上でこのウィルスを
継代し、再度陽性抗原捕捉試験を実施し、上清中に逆転写酵素活性を検出した。
巨細胞の形成に伴う細胞傷害効果はリンパ球において観察されなかった。このウ
ィルスを、健康なヒト血液ドナー由来のPHA刺激刺激9璋8次いで白血病起源
の連続的セルラインに移した。ウィルス含有上清を、HIV−1の含有がわかっ
ている培養上清と平行して、下記に詳説する分化抗原捕捉試験で試験した。この
比較結果は、新しい分離物はHIV−1と同一ではないが近似していることを示
した。次いでこの新しいウィルスを、その蛋白抗原について特性決定した。ウィ
ルスの増殖に使用されるセルラインはCEMまたはMOLT−4型、または細胞
表面にT4レセプターを有する他の不死化セルラインとすることができる。S
I Ve.、、n.の連続的増殖に好ましいセルラインはMOLT−4及びCE
M−8S細胞である。S I V.、、、、、に感染させたMOLT−4細胞は
、1990年6月13日に受理番号V900 61 322の下でECACCに
寄託された。
慢性感染させたセルラインの確立は、例えば以下のように実施した。MOLT=
4細胞(106細胞/ml)、好ましくはMOLT−4クローン8細胞(Nヤマ
モト、イエマグチ、日本、から取得)またはCEM−8S細胞(ビータ−・ナラ
、フレデリクスバーグ、メリーランド、米国、から取得)を、20mM Hep
esで緩衝化し10%牛脂児血清を含有するRPM11640培養基中で、S
I V.、、、、、感染ヒトリンパ球(106細胞/mりと同時培養する。ウィ
ルスの産生を抗原捕捉試験(インノンエネティクス、オーガノン)を用いて追跡
した。
CEM−8Sセルラインについては抗原捕捉試験は直ちに陽性となり、これが持
続した。MOLT−4クローン8細胞については、抗原捕捉試験は同時培養後5
0日日月陽性となった。細胞傷害効果はどちらのセルラインにも観察されなかっ
た。これらの細胞からの上清はウィルスの供給源として使用することができる。
さらに本発明は、下に述べる本質的な形態学的及び免疫学的特性を有する精製さ
れたレトロウィルスに関するものである。多くの場合、S IVc.、、、、の
特異な性質は、他のヒト免疫不全ウィルスHIV−1及びHIV−2、並びに他
のサル免疫不全ウィルス、特にガボン由来のS I Vc.、G.、分離物につ
いての同じ型の性質と比較することによって最も良く理解できる。
図面の簡単な説明
1、市販のHIV−1ウ工スタンプロツト片における抗5IVc,.血清の反応
性を示す。HIV−1ウ工スタンプロツト片における三つの異なるS I Vc
,、陽性血清の反応性及び力価を示す・
血清I 5IVc,、、、、が分離された動物からの血清。
血清2 SIV.、、、、、が分離された動物からの血清。
血清3 ウィルスが分離できなかったガボン由来の第二のチンパンジーからの血
清。
2、ウェスタンプロットにおけるHIv−1(HTLv−IIIB)、SIvc
gr−Gab及びS I V.、、−、、、のgag,pol及びenv蛋白の
比較に関する。
3、放射免疫沈降法ニ.J. ル、HIV−1 (HTLV−1 1 IB)
、5IVe,、−Cab及びS I Ve.、−、、、の蛋白の比較に関する。
4、HIV−1 (HTLV−I I IB) 、5IVe.、、、、、S I
Ve,、−、、、、 HIV−2、5IvA61.11S■■工0、及びS
I VyAcf)蛋白の比較に関スル。
5 ヒトポリクローナル及びマウス抗HIV−1モノクローナル抗体を用いたウ
ィルス分離物の抗原捕捉を示す。
6 異なったHIV/SIV型に対するS I V,p,抗血清の反応性の比較
。
7、電子顕微鏡写真。
形態学
S I V.、、、、、感染CEM−5S及びMOLT−4細胞の電子顕微鏡写
真は、発芽及びおよそ130nmの直径を有する細胞外ウィルス粒子の存在を示
した。
S I V.、、、、、は形態学的に池の既知のH I V及びSIVと非常に
似かよっていルカ、HTLV−1、HTLV−1 1及USTLV−10)よう
す他(1)Iニド及ヒサルのレトロウィルスとは容易に識別される。
蛋白及び糖蛋白抗原
S I V.、、、。、感染MOLT−4細胞の培養上清中に存在するウィルス
を、ベックマン19Ti型ローター中19.000rpmで一夜遠心することに
より濃縮した。得られたベレットを電気泳動試料緩衝液(62.5mMトリス、
pH67、2%2−メルカプトエタノール、1%ドデシル硫酸ナトリウム及び1
0%グリセロールを含有)中に再懸濁し、王たるウィルス抗原を、変性条件の下
でポリアクリルアミドゲル(12.5%または10%)上の電気泳動によって分
離した。
分子量を評価する基準を提供するため同ゲルには分子量マーカーを含ませた。分
離後、この蛋白を電気泳動的にニトロセルロース紙に移しくウェスタンプロット
)、次いでこれをホモローガスな抗血清と共にインキュベートした。この手法に
おいてS I V.o.−m g a g及びpol及びenv遺伝子産物の分
子量が、HIV−1及びS I V.、、、、、についてのそれと比較できる。
SIV.、□−hnl蛋白について観察された見かけの分子量はHIV−1及び
s r ve,、−6.bの両者について観察されたものに近い。にも拘らず、
小さいが再現性のある分子量の差異もまた5IVr.r−1ml並びにHIV−
1及びs i ve,、−c.、蛋白間に認められる。蛋白のプロットは、主要
コア蛋白S I V.、、、、、が分子量27.000を有することを示した。
慣例により、蛋白類はしばしば蛋白に対しては「p」、または糖蛋白に対しては
rgpJで表わし、この後に、1.000倍するとそのポリペプチドのおよその
分子量を与える数を続ける。SIV.。、−、。1の主要コア蛋白は以後p27
と呼称する。
測定された分子量の値は真の値の10%以内で正しいものと予想される。にも拘
らず、使用される電気泳動装置及び緩衝液構成成分の供給源が研究所毎に異なっ
ているため、蛋白の分子量値に関して多くの混乱が存在する。故に、SIV.い
、−17,の蛋白抗原の見かけの分子量をHIV−1またはS I V.p,−
、、、のそれについて比較する場合は、全ての試料を同一のゲル上で電気泳動に
付す必要がある。このようなゲルは、例えば図2に見ることができる。特に、主
要コア蛋白の場合、三つのウィルスのホモローガスな蛋白の分子量値は非常に近
接しているが、HIV−1から誘導された蛋白が最も小さいことが明らかである
。s r v.、、−c.l,の主要コア蛋白は、かつて報告されているように
(24)HIV−1のそれより幾分大きい。S I V.、、、□からのホモロ
ーガスな蛋白は、S I V.、、−c−bの主要コア蛋白より大きい。これら
の蛋白の算出された分子量を第1表に示す。
第1表
gag及びpol遺伝子産物の分子量の比較gag エンドヌクレアーゼ゛ 膜
透過蛋白 外層膜HIV−1 25 34 41−45 120stvc,、−
G,、 25.5 32 42−46 130SIV.、、、、、 27 34
44−50 140SIV。3.−、イ,は、見かけの分子量が34.000
のエンドヌクレアーゼであってHIV−1からのホモローガスな蛋白と分子量に
おいて有意に異なっていないpol遺伝子由来ポリペプチドを有する。
異なったウィルスの蛋白プロットを、このウィルスに感染した個体から得られた
ホモローガスな血清と共にそれぞれインキュベートすると、エンベロープ蛋白が
見られる。これらの蛋白はenv遺伝子から誘導されるものであって、ウィルス
のエンベロープ糖蛋白である。膜透過蛋白である最小の糖蛋白は広幅のバンドト
シテ移動シ、H I V−1 及U S I V − p8−c− l:ライ’
Cは40.000及び45。
000の間の見かけ土間−の分子量、そしてs r v.、、、。1については
44,000及び50.000の間の見かけ上より高い分子量を有する。
外層膜蛋白である、より大きな蛋白は、HIV−1については120.000の
分子量を有し、S I Vc,、−6.ゎ分離物については幾分高い分子量を、
そして新規な分離物5IVc、□1.1については最も高い分子量を有する。
糖蛋白は高度に解糖され、観察される見かけの分子量はこのウィルスの産生に使
用されるセルラインにより同程度まで影響を受ける。エンベロープ蛋白のレベル
において異なったウィルス間の相違を決定するためには、ウィルスは同じセルラ
インで増殖されねばならない。
ウェスタンプロットに加えてウィルス蛋白抗原は放射免疫沈降検定(RIPA)
によって視覚化することもできる。この目的のために、ウィルス蛋白を、ウィル
ス感染細胞のインビボで、メチオニンを除去し10%牛脂児血清を添加したRP
Ml 1640中US−メチオニン(200μCi/mlまたは4.10’細胞
/m+)の存在下で代謝的に標識する。16時間後、標識したウィルスを上清か
ら収穫し、細胞を溶菌緩衝液(0,02M1−リスpH7,6+0.15M N
aC1;0.05M KCI :0.001mM EDTA+0.2mM PM
SF;005%アプロチニン:1%β−メルカプトエタノール及び2%トリトン
X−100)中に収穫する。
免疫沈降のために、2.10’細胞中で収穫したウィルスの当量を、緩衝液中で
10μmの試験血清と4℃で1時間反応させる。次いで得られた免疫複合体を4
℃で一夜蛋白A−セファロースに結合させ、よく洗浄し、結合した蛋白を1%S
DSを含有する電気泳動試料緩衝液で溶出する。続いてこの抗原を電気泳動、引
続き蛍光写真法及びオートラジオグラフィーにより分析する。図3においてHI
V−1、S I V、、、−G、、及びS I Ve、、−、、、のRIPAを
示すが、ここでは各ウィルスをホモローガスな血清を用いて沈澱させ、12.5
%ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ウェスタンプロットの場合と同様、三
つのウィルスについての主要コア蛋白の分子量の相違、即ちS I V、、、、
、、が最大の分子量を有するということ、並びに外部糖蛋白の相違を直ちに認め
ることができる。S I V、、、、。
、の外部糖蛋白の分子量はS I Ve、、、、、またはHIV−1のそれより
高い。分子量の相違がセルラインに関係する因子に起因しないよう、三つのウィ
ルスはMOLT−4セルライン上で増殖させた。
図4において、各々ホモローガスな血清により沈澱させた異なるHIV及びSI
Vの10%ゲル上のRIPAを示す。S I V、、、−、n、分離物は、示さ
れた他のHIV及びSIVより高い分子量の主要コア蛋白を有する。
SIV、い8−1、の蛋白抗原は、二つの異なってはいるが関連する試みによっ
てS I Vc、、、、、、 HI V−1及び他のHIV/SIVの蛋白抗原
を参考に性質決定することができる。一方では、抗原はHIV/SIVに感染し
た個体由来の抗血清と交叉反応する能力を基準に特性決定することができる。他
方では、5IVepr−a□に感染したチンパンジー由来であってSIV、、□
11抗原に応答して産生された抗体を含む抗血清を使用して、他のHIV及びS
IV蛋白に対する交叉反応性を試験することができる。S I V、、、、、、
及び他のHIV/SIVの間の抗原の関係は、下記の実施例において実質的に説
明する。S IV、、、、、、抗血清はHIV−1及びS I Vep、−、、
、ウィルスのgag、pol及びenv産物と交叉反応することから、S I
Vc、、、、、はHIV−1及びs I Vc、、−0,、とより密接に関連し
ている。S I V、、、、、、抗血清はHIV−2、S I VL、c、 S
I VA、、、及び5IV11Noのコア蛋白とのみ交叉反応し、エンベロー
プ蛋白とは交叉反応しない。HIV−2、S I V、、、、、、S I VA
、、、及びS I VMIIDI:対する抗体を有する血清はS I V、、、
、、、のコア蛋白とのみ交叉反応する。抗S I Ve、、血清(SIVgel
−4ml及びS I Ve、、−、、、)のみがS I Vc、、−、、、のg
agSpol及びenv産物と反応する。
試験された25のHIV−1陽性血清のうち、全ての血清がs r vc、、−
、、、のgag及びpol抗原と交叉反応し、5/25がgp41と弱い反応を
し、モして25のうちただ一つの血清がS I V、、、、、、のgp140と
反応する。この血清はカメルーンの女性からのものであって、ここから異型HI
V−1ウィルスが分離された。
下記の実施例において、S I V、、、、、、は、1 供給源の蛋白の分子量
の違い、
2、モノクローナル抗体との反応、
3、ウェスタンプロット上での異なったHIV−1蛋白に対するS I V、、
、−、。
、抗血清の反応、
と言う基準において、HIV−1及び別のチンパンノー分離物S I vep+
−cabとは実質的に異なっていることが証明される。
さらに本発明は、少なくとも一つの抗原、特にS I V、、、、□ルートロウ
ィルスの蛋白または糖蛋白を含む組成物に関するものである。このような組成物
は、抗体を検出するための方法及び係る方法を実施するためのキットに使用する
ことができる。
S I V、、、、□ウィルスは、SIV、いI−IR+または異型HIV−1
と接触するに至った霊長類において抗体を検出するための抗原の供給源として使
用できることが判明した。したがって、本ウィルスは既に述べた方法により増殖
させ濃縮することができ、適当な洗浄剤で本ウィルスを処理することにより溶l
!i液が調製できる。総ウィルス溶菌液の調製にとって好ましい洗浄剤は、0.
5%濃度で使用されるトリトンX−100である。別の好ましい洗浄剤は、やは
り0. 5%濃度で使用されるノニデノトP−40(NP−40)である。
別法として、ウィルス蛋白はそのウィルスの溶菌液から精製することができる。
これらの蛋白を精製する好ましい方法は親和クロマトグラフィーである。例えば
ウィルス抗原を調製用ポリアクリルアミドゲル上で分離し、個々の抗原を精製さ
れた形で溶出することができる。これらはさらに、個々のウィルス蛋白に特異的
な、例えばウサギにおいて抗血清を作製するために使用することができる。
免疫ウサギ血清から誘導したIgG分画をCNBr−活性化セファロース4B(
ファルマンア)のような固相と結合させ、ウィルス溶菌液から個々のウィルス抗
原を選択的に除去するのに使用することができる。次いでこれらの蛋白を低pH
緩衝液を用いて親和支持体から溶離し、標準的クロマトグラフィー技術を用いて
さらに精製することができるが、その例がモンテラーロ等、ジャーナル・オブ・
バイooジー(J、of Virology)(1982)第42巻1029−
1030頁に掲げられている。
本発明は一般に、S I Vc、、、、、感染の診断または予知的価値を有する
試験のために使用できる任意の組成物に関するものである。これらの診断方法は
、SIV’ll+−18+の抗原の少なくとも一つを目的とする、血清または他
の体液中の抗体の検出を含むものである。
好ましい組成物は、ウィルスのコア蛋白またはエンベロープ蛋白またはpol遺
伝子から誘導される蛋白のうち少なくとも一つを含む、ウィルス溶菌液または精
製された抗原である。特に好ましいのは、例として以下の蛋白を同時に含む組成
物である・p27及びgl)140;p27及びgp44−50 : p27、
gp44−50及びgp140;及びp27;p27、p34及びgp140゜
しかしながら、上記組成物は例としての役割を意味するに過ぎず、本発明は上記
の蛋白または糖蛋白の1またはそれ以上を含む全ての溶菌液または蛋白調製物に
関するということが理解されねばならない。
さらに本発明は、検出されるウィルスの絶対的同定に顧慮することな(、免疫不
全ウィルスによる感染または接触を一般的に診断するために、いずれかのSrV
xDI−awlウィルス溶菌液を、HIV−1及び/またはHIV−2、及び/
またはS I Vc、、、、、から誘導され同様に調製された蛋白と組み合わせ
て使用する、任意の組成物に関するものである。例えばこのような組成物はHI
V−1、HIV−2、S I Ve−−−c−1及びs r v、、、−、、、
の溶菌液の混合物からなることができ、または以下の物からなることができるニ
ー HIV−1、HIV−2、S I V−1−c−及びS I V、、、−、
、、のコア蛋白、特にS I Ve、、、、、 p27蛋白に対しホモローガス
な、各ウィルス型の主要コア蛋白、
−HIV−1、HIV−2、S I Vc−−−c−及びS I V+a+−a
at)工/ヘロープ糖蛋白、特に5IVe、□−,,,gp140に対しホモロ
ーガスな、各ウィルス型の外部エンベロープ糖蛋白、
−HIV−1、HIV−2、S I Vm−aab及ヒS I V++ei−a
atノ:’7ffl白並びl:HIV−1、HIV−2、及ヒS I V、、−
sagノエンベローブ糖蛋白、特に、5IVc、、、、、p27蛋白に対しホモ
ローガスな、各ウィルス型の主要コア蛋白並びにS I V、、、、。、gp1
40に対しホモローガスな、各ウィルス型の主要外部エンベロープ蛋白、
−HIV−1、HIV−2、S I Vm−caJcFs I Vc、、−、a
+ノコ7蛋白及びエンベロープ蛋白、特にS I Vc、、、、、の蛋白p27
及びgp140に対しそれぞれホモローガスであるもの、並びにHIV−1、H
IV−2、S I Ve、、−、。
b及びS I V、、、、、、のpol遺伝子から誘導される蛋白、特にS I
V、、、−、、、のp34エンドヌクレアーゼ蛋白に対しホモローガスな各ウ
ィルス型の蛋白、の組合せ。
さらに本発明は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のハンドを提供
する抗原であって、一般にSIV、、、〜1..レトロウィルスの精製された抗
原の一つ、抗S I V、、、、、、抗体を有する個体の血清により認識される
エピトープを含む抗原に関するものである。
これらのエピトープに対応するアミノ酸配列は、個々の蛋白を調製用電気泳動ま
たは親和クロマトグラフィーのいずれかにより単離し、蛋白全体、またはトリプ
シンもしくはキモトリプシン消化により酵素的にもしくは化学的手段により生成
させたフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を決定することによって、容易に
決定することができる。得られたペプチドまたはポリペプチドは引続きエドマン
減成によって配列決定できる。故に本発明は、ウィルスから直接誘導された、ま
たは、細菌性発現ベクターにおいて、もしくは挿入されたDNAを哺乳動物もし
くは昆虫の細胞中で発現させるためのウィルス性発現ベクターにおいて、ウィル
スの任意のcDNAフラグメントをクローニングし、発現された蛋白を上記の方
法によって精製することにより産生された、任意の蛋白、糖蛋白もしくはペプチ
ドに関するものである。さらに本発明は、メリフィールド合成またはFmo c
化学のいずれかにより産生される合成ペプチドに関するものでもあり、このペプ
チドは引続きウェスタンブロッティングまたは放射免疫沈降のいずれかによって
等質的状態まで精製することができ、その配列中には天然s r vc、、、、
、に共有されるエピトープが含まれている。ニトロセルロースに結合することの
できない小さなペプチドの場合は、これらのペプチドをナイロン膜(ポール・バ
イオダインまたはアマ−ジャム)に結合させ、この膜を抗S I V、、、、、
、抗血清と反応させることにより検出することができる。特に本発明は、任意の
S I Vc、、、、、コア蛋白に含まれる、またはそのポリペプチド鎖の一部
としてコア蛋白の組合せから誘導されるエピトープを含み得る蛋白に含まれる、
エピトープに関するものである。さらに本発明は、二つのS I V、、、、、
、エンベロープ糖蛋白のいずれかに含まれるエピトープ、並びに、S I Vc
、、、、、エンベロープ糖蛋白の組合せまたはs i v、、、、、、、、コア
蛋白の組合せから誘導されるエピトープを、そのポリペプチド鎖の一部として含
む任意の蛋白、に関するものである。
さらに本発明は、その合成が、S I V、、、、、、蛋白または糖蛋白由来の
エピトープをHIV−1及び/またはHIV−2の蛋白または糖蛋白由来のエピ
トープと共に一つのポリペプチド鎖に組み込む組み替えDNA法によって組み立
てられる発現ベクターにより支配されるポリペプチドに関するものである。係る
組み立rの調aは、S I V、、、−、、、並ヒl:HI V−1及びHIV
−2のcDNAから適切なコード化領域を切り取り、同じ位相のDNAを結合さ
せて、必要な信号配列を有する発現ベクター中に挿入された時に、HIV−1、
HIV−2、SIV、。
r−Gab及び5IVe、ヮー1□のエピトープが含まれるハイブリッド蛋白の
合成を支配するコード化配列を形成させることを含む。
さらに本発明は、特にS I V、、、、、ルトロウイルスにより引き起こされ
る潜在的または存在するARCまたはAIDSの診断のための、生物学的流体中
の5IVe、、−ヮ、に対する抗体の検出方法であって、診断される人の体液を
1またはそれ以上のS I Vc、、、、、の蛋白または糖蛋白を含有する組成
物と、または該ウィルスの溶菌液と、またはS I Vcpm−satに共通す
るエピトープを有する抗原と接触させ、S I Vc、、、、、抗体と使用され
た抗原との間に形成された免疫学的複合体を検出することを特徴とする方法に関
するものである。
好ましい方法は例えば免疫蛍光検定または免疫酵素検定を包含する。免疫蛍光検
定は、典型的には例えば試験される人の血清をS I Vcp、、、、に感染し
た細胞と共にインキュベートし、これを固定し冷アセトンにより透過性を増すこ
とを含む。形成された免疫複合体は直接的または間接的方法のいずれかを用いて
検出し、ヒト免疫グロブリンと特異的に反応する抗体の使用を含む。検出は、フ
ルオレセインまたはローダミンのような蛍光標識と結合させた抗体を使用するこ
とにより達成する。
免疫酵素検定は例えば以下のように実施するニー SIV、、、、、、ウィルス
抽出物または本発明に係る組成物の特異的量を微量定量プレートのウェルに入れ
る。
−適当なインキュベーンタン時間の後、過剰の非結合物質を洗浄によって除去す
る。
−1またはそれ以上のS IV、、、、、、の蛋白または糖蛋白抗原に対する抗
体の存在を試験すべき他の体液の血清の適当な希釈物を、ウェルに導入する。
−二の微量定量プレートを、結合反応が起こるのに必要な時間インキュベートす
る。
−プレートを完全に洗浄する。
−免疫複合体の存在を、ヒト免疫グロブリンと特異的に結合し、無色または殆ど
無色の物質を高度に着色した生成物に変換することのできる酵素(好ましくは西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトノダ
ーセのいずれかであるがこれらに限定される訳ではない)で標識した抗体を用い
て検出する。別法として、検出系は、適当な基質の存在下で光を放射する酵素を
使用することもできる。
−形成された生成物の量を視覚的、分光光度的、または発光光度的のいずれかに
より検出し、同様に処理された対照と比較する。
やはり使用できる他の検出系は、スタフィロコッカス・アウレウス・コラアン菌
株Iから誘導される蛋白A、C群ストレプトコンカス種(26RP66菌株)か
らの蛋白Gの使用に基づ(系、またはビオチン−アビジン結合反応の使用を利用
する系を包含する。
1またはそれ以上のs r ve、、、、、抗原に対する抗体の存在を免疫酵素
的に検出するもう一つの方法は、ウェスタンプロットである。ウィルス抗原を電
気泳動により分離し、ニトロセルロース膜または他の適当な支持体に移す。次に
、試験されるべき体液をこの膜に接触させ、形成された免疫複合体の存在を既に
述べた方法により検出する。この方法の変法においては、精製されたウィルス抗
原を線または点として適用し、次いで、試験されるべき体液と接触させ、形成さ
れた免疫複合体を前記の技術を用いて検出する。
体液中の抗体の存在は凝集によって検出することもできる。S I Vc、、、
、、溶菌液群またはS I V、、、、、、溶菌液、抗原または本発明により言
及される抗原組成物を、例えば均一な懸濁液を形成するラテックス粒子の被覆に
使用する。存在する抗原に対する抗体を含む血清と混合すると、このラテックス
粒子は凝集を起こし、大きな凝集体の存在が視覚的に検出できる。
本発明はさらに、SIV、。1−Al11または前記組成物の標識された抽出物
に関するものである。標識は、例えば酵素的、化学的、蛍光または放射活性のよ
うな任意の型とすることができる。
さらに本発明は、体液中のS IV、、、、、、抗原の存在を検出する方法に関
するものである。これは例えば以下の手法で達成することができる・−SIV、
、、−1Mこ感染した個体、またはS I V、、、−、、、溶菌液もしくは既
に述べた組成物を注射した動物のいずれかから誘導される抗血清のIgG画分を
、微量定量プレートのウェルに入れる。
−吸着させるための適当な時間の後、過剰の非結合物質を洗い流す。
−検出すべき抗原を含む体液をこのウェルに入れる。
−微量定量プレートを、結合を起こすのに適当な時間インキュベートさせる。
−次いでプレートを適当な緩衝液で完全に洗浄する。
−結合した抗原の存在を、例えば検出すべき抗原に対して同じく特異的であり、
且つ、標識された(好ましくは前述の酵素のうちの一つによって標識された)、
免疫グロブリンを使用することにより、直接または間接的に検出する。
−次いで適当な基質を加え、存在する抗原の量を測定するために、反応の程度を
対照と比較する。
さらに本発明は、5IvcD□−16,溶菌液または上記組成物、及び形成され
た免疫複合体を検出するための手段からなる、生物学的流体中の抗SIV、、□
−awl抗体を検出するためのキットに関するものである。
免疫酵素法により特異的抗体を検出するよう設計されたキットの場合、このよう
なキットは以下のものを含むであろうニー 好ましくは精製された形の、そして
好ましくは微量定量プレートのような固体支持体に結合させた、S I V、、
、、、、溶菌液または既に述べた型のうち一つの組成物。
−検出すべき抗体と結合することのできる免疫グロブリン分画及び酵素の複合体
、または酵素と細菌性蛋白Aもしくは蛋白Gとの間の複合体。
− ヒト免疫不全ウィルスによって共有されるエピトープを持たない対照抗原。
−検定の実施にとって適当な緩衝液。
−酵素にとって適当な基質。
S識さtl、f−:妨4原を利用す−る特異的抗体の検出のだYlのナツトは以
下のものを含むであろう。
−既に述べた型の過当(:?1識された抗原または抗原の組合せ。
−好ましくは蛋白A、 −・汁ファロース4B(フフルマンア)のような不溶性
支持体または同等の支持体と結合させた、蛋白Aもしくは抗ヒト免疫グロブリン
。
−抗s i v、、、、、、抗血清により認識されない対照抗原。
−検定の実施にとって適当な緩衝液。
−適当ならば、酵素的に標識された抗原の検出のための基質。
さらに本発明は、生物学的流体中のs r v、、、、、、抗原の検出のために
開発されたキットであって、
−好ましくは微量定量プレートのような固体支持体に結合させた抗S I Vc
。
+−ms+免疫グロブリン、
−酵素と結合させた抗s r v、、、、、、免疫グロブリン、−抗S I V
、、、、、、免疫グロブリンにより認識されない負の対照抗原、−SIV、、、
、、、抗原または既に述べた組成物のうちの一つからなる、正の対照抗原、
−試験の実施にとって適当な緩衝液、
−結合した酵素の検出にとって適当な基質、からなるキットに関するものである
。
さらに本発明は、S I Vep、、、、レトロウィルスのエンベロープ糖蛋白
または該糖蛋白の一部を、S I Vc、、−〇□に対して有効なワクチンの構
成にとって適当な薬学上許容し得る媒質と組み合わせて含有する、免疫原性組成
物に関するものである。さらに本発明は、その配列内にS I Vc、、−。レ
トロウィルスの蛋白バックボーンの全てもしくは一部を含む任意のペプチドもし
くはポリペプチド、並びに該ペプチドの一般的免疫特性に影響を及ぼさないアミ
ノ酸の付加、置換もしくは除去によって得られるペプチドに関するものである。
さらに本発明は、S I V、、、、、、抗原または前記に定義される組成物に
含まれるエピトープを特異的に認識する能力により特徴付けられるモノクローナ
ル抗体、特に、該抗原に対して特異的に作製され常套的技術により産生されるモ
ノクローナル抗体に溪うするものである。本発明は、s i v、p、、、、に
感染した霊長類から誘みされるB細胞を不死化することにより産生されるモノク
ローナル抗体、例えばBm胞ベア、プスタイン〜バーウィルスにより形質転換し
、その形質転換体をサブクローニングすることにより産生されるモノクローナル
抗体にも関するものである。
本発明はまた、1またはそれ以上のS I V、、、、□抗原を認識し、動物を
精製S I Vc、、−、、、またはS I Vcp+−am+抗原もしくは抗
原の組合せ、特にS I Vep、−11,の蛋白もしくは糖蛋白に感染させる
ことにより産生される、動物におけるポリクローナル抗血清の産生に関するもの
である。
ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体は、5IVc、□−□、の感染性の
中和、生物学的流体または感染した細胞中での5IVc、、−□、抗原の検出、
並びに5Ivc、、−□蛋白及び糖蛋白抗原の精製を包含する極めて様々な目的
に使用することができる。
さらに本発明は、一部は少なくともs r v、、、−□、レトロウィルスまた
はこのウィルスの変異体のRNAから誘導される、所望により標識された核酸に
関するものである。
本発明はまた、s r v、、、、、レトロウィルスの全ゲノムRNAに対応す
るCDNAの少なくとも一部を含むことを特徴とする、cDNAもしくはcDN
Aの一部またはそれらを含む組み替え体の使用に関するものである。このような
cDNAは、生物学的流体、組織及び細胞におけるsrv、、、−□、配列の特
異的検出のためのプローブとして使用することができる。好ましくはこのプロー
ブもまた、放射活性的にまたは化学的に、または別法としてプローブの検出を可
能にする酵素的、蛍光的もしくは化学ルミネセントの標識を用いて標識されてい
る。5IVcp+−a*+の特異的検出及びS I V、、、−、、、感染の診
断のための好ましいプローブは、s r v、、、、、、ゲノムに対し相補的な
cDNAの全部または一部を含むプローブである。
にもかかわらず、S I Vc、、、、、感染の診断に使用できるプローブは、
srv。
。l−111ゲノムを起源とする全配列またはその天然に存在する変異体を組み
込んでおり、ウィルスコア蛋白(gag遺伝子)、二つの型の逆転写酵素、及び
エンドヌクレアーゼ(pol遺伝子)、並びに二つのウィルスエンベロープ糖蛋
白(e0v遺伝子)をコードしている配列を含む事が理解される。
さらに本発明は、ベクターからの核酸を含み、該cDNAまたは該cDNAの一
部をそれに挿入させている、組み替え核酸中に組み込まれた、S I V、、、
、、、核酸配列に関するものである。このような組み立て物は、ウィルスcDN
Aまたはそのフラグメントを天然の宿主以外の生物または細胞中で複製するため
に使用することができ、その結果、診断目的に使用される充分量のプローブを提
供することができる。
このような手法により生成されるプローブは、以下の本質的工程を組み入れてい
るs r v、、、、、、の特異的検出のための診断試験に使用することができ
るニー 上記のようにして生成したプローブを、前記の方法によって標識する。
−該プローブを、緊縮ハイブリダイゼーション条件の下で、感染した細胞からの
DNAまたは感染した細胞もしくは生物学的流体からのウィルスRNAと接触さ
せる。但しそれ以前に該DNAまたはRNAは好ましくは膜に適用しプローブに
接近し易くしである。
−緊縮条件が維持される状況の下でこの膜を緩衝液により洗浄する。
−好ましくは、プローブが放射活性標識されている場合はオートラジオグラフィ
ーによって、またはプローブが化学的に標識されている場合は適当な免疫検出技
術によって、標識されたプローブを検出する。
さらに本発明は、ヒトT4リンパ球またはT4+表現型を有する白血病起源のヒ
トリンパ球セルラインを、前もってS I V、、3IIIレトロウイルスの分
離物に感染させたリンパ球またはセルラインと共に培養し、その培養基から該レ
トロウィルスを回収し精製することを特徴とする、S I V、、、、、、レト
ロウィルスの産生方法に関するものである。本発明はまた、該レトロウィルスを
、好ましくは洗浄剤で溶菌し、SIVレトロウィルスの抗原を含む溶菌液を回収
することを特徴とする、該抗原の産生方法に関するものである。
さらに本発明は、蛋白または糖蛋白をコードしている核酸を発現ベクターに挿入
し、該ベクターによって宿主を形質転換し、形質転換された宿主を培養し、そし
て発現された蛋白を回収及び精製することを特徴とする、任意のS I Vep
、−、。
1蛋白もしくは糖蛋白または前記定義による逆転写酵素の産生方法に関するもの
である。
この方法は、融合蛋白の合成を目的とするまたはしないベクターを含み、また、
細菌性発現ベクター、ワクシニアウィルスのような哺乳動物の発現ベクター、及
び昆虫細胞におけるクローニングされた遺伝子の発現のためのバキュロウィルス
に基づくベクターを含むがこれらに限定される訳ではない。
さらに本発明は、非ヒト霊長類モデルの開発のためのS I Vc、、、、、の
使用に関するものである。
このようなモデルの開発は、例えば以下の手法によって達成することができるー
異なった非ヒト霊長類種を該ウィルスに感染させる。
−二の動物に、S I Ve、、、。、感染チンパンジーからのリンパ球を静脈
内注射する、またはS I Vc、、、、、ウィルスの高力価を示す感染したヒ
トの細胞を静脈内注射する。
−持続性の感染及びその結果を、異なった時間間隔における感染動物の臨床的お
よび生物学的追跡によって調べる。評価すべき種々のパラメータは以下のものを
含むニ
ー 臨床的調査ニ
ー −膜状態
−リンパ腺症
−CD4”リンパ球数の減少
−肝臓または膵臓のメパシー
一 発熱、体重減少
−AIDSまたはAIDS様疾患の症状の発現−特異的S I V、、、、、、
試験を用いるウェスタンプロット及びRIPAによるS I Ve、、−、、、
に特異的な抗体の検出。
−リンパ球または血漿からのウィルスの分離及び特異的S I V、、、、、、
試験による抗原血症の測定。
−中和抗体の存在の決定。
AIDSの発症を伴うまたは伴わない持続的な感染が起こると、感染した霊長類
はHIV−1のための可能性ある動物モデルとして使用することができ、これは
ワクチン及び抗ウイルス化学療法物質の試験に利用することができる。
ワクチンの評価は数多くの良く知られた技術により達成することができ、その全
ては、引き続いて行なう感染性ウィルスのチャレンジに対する防御を付与するこ
とのできる細胞毒性リンパ球または抗体の産生を誘導するための1またはそれ以
上のウィルス蛋白を含有する免疫原性調製物の投与に依存している。ワクチン接
種の好ましい方法は、経口または注射による免疫原性組成物の投与、殺したまた
は弱毒化したウィルスの投与、S I V、、、、、、蛋白を発現するワクンニ
アのようなウィルス発現ベクターの使用、及びS I V、、、、、、蛋白を発
現または分泌する弱毒化した細菌菌株の経口投与を含む。
抗ウイルス化学療法物質は、S I V、o、、、、に霊長類を感染させる前ま
たは後にこの物質を実験プロトコルに従って投与することによって評価できる。
感染の予防またはウィルスの複製の阻害という点における該物質の有効性は、上
に概説したように評価することができる。
さらに本発明は、HIVに対する新規なワクチン及び抗ウイルス産物を評価する
ための、SIV、、、−7,に持続的に感染した非ヒト霊長類の使用に関するも
のである。特に、抗ウイルス化学療法物質を、この系において該物質の投与前及
び後の臨床症状を比較することによって評価することができる。臨床症状に加え
て、循環しているウィルス抗原のレベルの測定、ウィルスの分離の容易さ、免疫
機能の測定、並びに適当なプライマー及びプローブをポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)に使用することによるウィルス荷重の定量的見積り、ちまた、この評価に
包含される。
実施例
材料及び方法
ウィルス及び細胞培養
A、ウィルス株及びセルライン
−HIV−1(HTLV−1[IB) 、HIV−2−rod (3) 、SI
V、、l−6−−−+ (24) 、S I V−D−611−+ (17)
、S I VAc−−−v。−、(16)、S IV、AC(12)を比較の
目的に使用した。
− セルラインMOLT−4クローン8(N ヤマモト、ヤマグチ、日本、によ
り提供された)及びCEM−8S (P、ナラ、フレデリクスバーグ、メリーラ
ンド、米国、により提供された)を連続的ウィルス産生に使用した。
B、ウィルス分離
チノパンツー及び健康なドナーからのリンパ球を、リンホプレプにが一ド・アン
ド・COl、オス口、ノルウェー)により、ヘパリン処理した全血から分離した
。健康なドナーからのリンパ球を、20mM Hepesを含みL−グルタミニ
/(0,03%/ml)、10%牛脂児血清、ゲンタマイシン(100μg/m
l)を添加した]、640RPMI培地(GIBCO)中で0..5μg/ml
のフィトヘマグルチニン(PHA、ウェルカム)により刺激した。5 10’(
7)fンパンジー由来リンパ球を、20mM Hepesを含みL−グルタミン
(0゜03%/m1L10%牛脂児血清(GIBCO)、ゲンタマイシン(1(
H’lμg/ml) 、2μg/mlポリブレン(アルドリソヒ)及び150
U / m !インターロイキンー2を添加した1640RPMI培地(GIB
CO)中で、5.106のPMA刺激されt:ドナーのリンパ球と、最終濃度1
.10’細胞/mlで同時培養した。
培地は3ないし4日毎に新鮮な培地と交換し、その際細胞を計数し、細胞濃度を
1.10’細胞/m l l::g節した。細胞濃度が低下した場合には新たな
PHA刺激リンパ球を分離物の培養に加えた。さらに培養は、3ないし4日毎に
細胞傷害効果、並びに培養上清中の抗原の存在を、抗原捕捉試験(インノジエネ
テイクス、またはオーガノン)によって、及び逆転写酵素活性によって監視した
。
慢性的に感染した永久セルラインを確立するために、ウィルスに感染したリンパ
球の一次培養を、MOLT−4クローン8及びCEM−5S細胞と同時培養した
。逆転写酵素活性及び抗原捕捉によってウィルスの産生を監視した。
分化抗原の捕捉
HiV−1及び他の関連するヒト免疫不全ウィルスの間の識別を行ない得る試験
系を開発した。二の系は二つの異なったポリクローナルIgGJ製物の能力の比
較に基づいており、一つは、特に主要コア蛋白に対する非常に高い力価に起因す
る広範な抗HIV特異性を有し、一つは培養上溝中で洗浄剤処理したウィルスを
捕捉する、専らHIV−1と反応する低い力価を有する。捕捉された抗原の検出
は、広特異性のIgG/西洋ワザビベルオキシダーゼ複合体を用いて達成する。
この試験は王としてp24コア蛋白を検出するが、これのみを検出する訳ではな
い。
HIV−1に対するモノクローナル抗体使用された15のうち8つのモノクロー
ナル抗体は記載されており(26)、残りのモノクローナル抗体はインノノエネ
ティクスにより製造されている。この抗体は、トリトンX−100で破断したH
IV−1調製物中で、天然のウィルス蛋白に対して調製した。
蛋白の分析
A、電気泳動
本質的にはマイセルによる記載(27)に従って、ウィルス蛋白のポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なった。
B、蛋白のプロッティング
プロッティングは、ダンにより記載された(28)バイオラドのトランスプロッ
トセル中で400mAで4時間、炭酸塩緩衝液を用いて実施した。
電子顕微鏡写真
S I Vc、、、、、に感染したMOLT−4及びCEM−8S細胞をカコジ
ル酸塩緩衝液中のグルタルアルデヒドで固定し、四酸化オスミウムで染色し、エ
ポンに包埋した。薄い切片をアナンシルアセタート及びクエン酸鉛で染色し、透
過型電子顕微鏡で調べた。
放射免疫沈降検定
感染細胞を5sS−メチオニンにより37℃で一夜代謝的に標識した(4.)、
06細胞/mlにおいて200μCi/ml)。上清および細胞を集めた後、ウ
ィルスをペレット化し、次いで溶菌緩衝i!(0,02MトリスpH7,6:0
15MNaC1,0,05M KCI :O,001mM EDTA、Q 2m
MPMSF、0.05%アプロチニン:1%β−メルカプトエタノール及び2%
トリトンX−100)中で溶菌した。次いで希釈し、たウィルス(2,106細
胞から収穫したウィルスに相当)を血清10μmと共に4℃で1時間インキュベ
ートした。免疫複合体を蛋白Aセファロースに4℃で一夜吸着させた。洗浄後、
免疫複合体を1%SDS (ドデンル硫酸ナトリウム)及びβ−メルカプトエタ
ノールを含有する試料緩衝液で溶出し、100℃で3分間加熱した。次にこれを
12゜5%または10%SDSポリアクリルアミドスラブゲル(SDS−PAG
E)上で電気泳動に付した。3sS−メチオニン標識した蛋白を蛍光光度法及び
オートラジオグラフィーにより検出した。
血清学
HIV−1及びHIV−2に対する抗体を市販の酵素結合免疫吸着検定(HIV
−1+2 ELISA、ベージング)によって検定した。使用した確認試験は市
販のHIV−1(デュポン・ドウ・ネムーア)及びHIV−2(ダイアグノステ
ィクス・バストゥア)ウェスタンプロットであった。
結果
血清学
チンパンジーからの血清は酵素結合免疫吸着検定において陽性(光学密度/カッ
トオフの比=6)であった。市販のHIV−1ウエスタンプロツト(デュポン・
ドウ・ネムーア)においては、明瞭なバンドがp24、p34、gp41、gp
120及びgp160に観察され、p55及びp68には弱いバンドが観察され
るのみであった。市販のウェスタンプロット(デュポン・ドウ・ネムーア)にお
ける異なったHIV−1抗原に対するチンパンジー血清の力価を図1に示す。
p24:1/1000;p34:1/1000;gl)41:1150.000
;gp120 : 1/10.000 :gp160 : 1/100.000
゜ウィルスの分離
チンパンジーのリンパ球を健康な非感染ヒトドナーからのPHA−刺激リンパ球
と同時培養することにより、ウィルスを分離した。13日間培養した後に、陽性
抗原捕捉試験(インノジェネティクス、オーガノン)により判定してウィルスを
培養中に検出した。逆転写酵素の存在もまた培養上清中に検出された。巨細胞の
形成に伴う細胞傷害効果はリンパ球に観察されなかった。細胞を含まない培養上
清を使用して新たなリンパ球におけるウィルスの継代を行なった。7日後、陽性
抗原捕捉試験が観察され、逆転写酵素活性が上清中に検出された。S I V、
、。
、□感染−次リンパ球をMOLT−4クローン8及びCEM−3S細胞と同時培
養することにより、このウィルスを永久セルラインに移す試みがなされた。
CEM−5Sセルラインを用いた場合、逆転写酵素活性は7日後に検出され、培
養上清は抗原捕捉試験で陽性であった。MOLT−4クローン8細胞の場合、抗
原捕捉試験は同時培養の50日後でやっと陽性となった。巨細胞の形成に伴う典
型的な細胞傷害効果はこれらのセルラインでは観察されなかった。
ウィルス蛋白の特性決定
19Tiベツクマンロ一ター中4℃、19.000t/分で一夜遠心することに
より、培養上清中のウィルスをペレット化した。ペレット化したウィルスを5D
S−試料緩衝液中で分離して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて蛋白プ
ロッティングにより分析した。図2にHI V−I S I V、、、G、、及
びS I Vc、。
−1□のウェスタンプロット片を示す。
各ウィルスの溶菌液をホモローガスな血清と反応させた。即ち、HIV−1をH
rV−1抗体陽性血清と、S I Vc、、−、、、ウィルスをこのウィルスが
分離された動物の血清と、モしてS I Vc、、、、、ウィルスをこのウィル
スが分離されたチンパンジーの血清と反応させた。
図カラ、S I V、、、−、、、遺伝子産物の分子量はHIV−1及びS I
Vclll−Gabのそれとは異なることが明らかである。蛋白の分子サイズ
の比較を第1表に示す。
最も重要な相違は主要コア蛋白の分子量(p27に対して、HIV−1について
はp25、そしてS I Vc、、−C,、についてはp25.5)、及び外部
糖蛋白の分子量である。ウィルス(HIV−1、S I V−−−−a−及びS
IVc、、−、、、)の増殖に使用されるセルラインはMOLT−4クローン
8セルラインであり、これは三つのウィルス間に観察される相違が異なるセルラ
インの影響を受けないようにするものである。
ウェスタンプロットに加えて、ウィルス蛋白抗原は放射免疫沈降(RI PA)
によって視覚化することもできる。この目的のためには、MOLT−4クローン
8細胞をウィルスに感染させ、ウィルス蛋白を3sS−メチオニンで代謝的に標
識した。標識されたウィルスを上清および細胞から収穫した。図3にHIV−1
、S I Vc、、G、、及びS I Ve、、−、、、のRIPAを示す。標
識されたウィルスを培養上清から収穫し、各ウィルスをホモローガスな血清によ
って沈澱させた。ウェスタンプロット上で観察されるように、s r v、、、
、、、遺伝子産物の分子量はHIV−1及びS I Vc、、−c、、のそれと
異なることがわかる。S I V、、、−、、、の主要コア蛋白及び外部糖蛋白
はHIV−1及びS I V、、、−6,5の対応蛋白より高い分子量を有する
。
図4において、ウィルス間の相違をより良好に決定するために各々ホモローガス
な血清で沈澱させた異なるHIV及びSIvのRIPAを示す。即ち、)IIV
−1ウィルス+HIV−1抗体陽性血清、S I V−−−−a−を該ウィルス
の分離された動物の血清で、S I vcB−ms+ウィルスを該ウィルスの分
離された動物の血清で、HIV−2をHIV−2に体陽性血清テ、S I VA
、、i−、、、ヲS I V、、−抗体陽性血清で、S I VMNDを5Iv
IINO抗体陽性血清で、ソI、テs I V、、、ヲs I V。
、6抗体陽性血清で沈澱させた。この図はさらに分子量の相違をも示す。
HIV−1p24コア蛋白に対するマウスモノクローナル抗体の交叉反応性HI
V−1p24コア蛋白に対して調製されたマウスモノクローナル抗体(MAb)
のパネルを、HIV−1、HIV−2、S I V、、4.5IvAGIl及び
SIvcpt−maIの分離物と交叉反応する能力について試験した。原則とし
て、その群がHIV−1p24分子上の異なるエピトープと反応するモノクロー
ナル抗体を含む限り、いかなる抗HIV−1p24モノクローナル抗体のパネル
も使用できる。抗体を含む腹水を希釈してマイクロウェルプレートの被覆に使用
した。次に、洗浄剤処理したウィルス含宵上清を、被覆したプレートに加えた。
結合した抗原を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた広特異性の抗HIV
IgGを用いて検出した。得られた結果を図5に示す。
ポリクローナル広スペクトルIgGで被覆した対照ウェルにおいては、全ての密
度を示した。しかしながら、種々のモノクローナル抗体で被覆したウェルにおい
て試験した場合はかなり異なったパターンが出現した。前の研究は、試験された
MAbはp2・4分子上の少なくとも7つのエピトープに対して反応することを
示した。
S I V、、、、□分離物は、同じように試験された異なるモノクローナル抗
体と最も弱い反応をする。この結果は、S I V、、、、、、は他の試験され
たH I V/SIvとはp24抗原のレベルで異なることを示している。
血清学的交叉反応
SIV、、、−ヮ、と他のHIV/SIVとの間の抗原の関係は、実質的には下
記の実施例で説明する。S I VCDI−1111は、より緊密にHIV−1
及びS I Vc9.−。
、bと関連する。何故ならSIV、□−,□抗血清はこれらのウィルスのgag
Spol及びenv産物と交叉反応し、他のウィルス(HIV−2、S I V
、、、、、SI VA、11.及びS I V、、、d)とはコア蛋白としか交
叉反応しないからである。Hlv−2、S I V、−1S I VAOM、
及ヒS I V、、、、ニ対スル抗体を含ム血fil;!、Sr v、、、、。
、のコア蛋白と交叉反応するのみである。
抗srv、、、血清(S I Ve、、、、、及びS I V、−8−a、−)
のみがS I V、、、−,1のgagSpol及びenv産物と反応する。2
5のHIV−1陽性血清のうち、全ての血清がS I Vc、、〜、。1のga
g及びpol抗原と交叉反応し、5つがgp41と弱く反応し、そしてただ一つ
の血清がgp120バンドと反応する。gp120バンドと反応する血清は、異
型HIV−1ウィルスが分離されたカメルーンの女性からのものである。
論考
新規な免疫不全ウィルスが野生チンパンジーから分離された。この動物は実験的
に感染させられたことが無く、またヒトの血液産物を受け入れたことが無い。
この動物は健康であり、実際AIDSまたはAIDS様疾患の症候を示していな
い。
このウィルスは、ウェスタンプロットにおけるs rv、、、、、、陽性血清の
Hlv−1抗原との血清学的交叉反応を基礎とするとHIV−1に近いように思
われる。
しかしながら、該ウィルスがHIV−1とは異なることを示す幾つかの論拠があ
る。
−ウィルス蛋白の分子量の相違。
−HIV−1とは異なった抗HIV−1抗血清との交叉反応性の1<ターン。
−p24コア蛋白に対して作製されたマウスモノクローナル抗体によって認識さ
れるきわめて低下した能力。
S I Vc、、−□ウィルスはさらに、ウィルス蛋白の分子量の相違を基礎と
すると、他のガボンからのチンパンジー分離物(S I Vc、、−6ab)と
も異なっている。
図1
市販のウェスタンプロット(デュポン・ドウ・ネムーア)上での異なるHIV−
1抗原に対する3つの陽性チンパンジー血清の反応性。
血清1 : S I V、、、、、、、、が分離された動物からの血清。
血清2 : S I V、、、、−が分離された動物からの血清。
血清3:ウィルスが分離できなかったガボンの第二のチンノくンジーからの血清
。
図2
ウェスタンプロットによる、HIV−1(HTLV−I I IB) 、SIV
、、、−Cab及びS I V、、、−、、、のgag、pol及びenv蛋白
の比較。
ウィルス溶菌液は同じポリアクリルアミドゲル(10%)上で分離した。各々の
ウィルスをホモローガスな血清と反応させた。
第1列:HIV−1(HTLV−I I IB)とHIV−111性血清。
箪2列: S I V、、、、、、と該ウィルスが分離された動物の血清。
第3列: S I Vc、、、、、と該ウィルスが分離された動物の血清。
図3
放射免疫沈降(RI PA) 1mヨるHIV−1(HTLV−11IB) 、
SIvcpt−Gab及びS I Ve、−、、のgag、pol及びenv蛋
白の比較。
ウィルス蛋白は12.5%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。各々のウィル
スをホモローガスな血清で沈澱させた。
第1列:HIV−1(HTLV−I I IB)とHIV−1抗体陽性血清。
第2列:SIV、。+−+slと該ウィルスが分離された動物の血清。
第3列:SIV、、、−6゜と該ウィルスが分離された動物の血清。
図4
RIPAによる異なるHIV及びSIVの蛋白の比較。
ウィルス蛋白は10%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。各々のウィルスを
ホモローガスな血清と反応させた。
第1列・HTV−1(HTLV−111B)とHIV−1抗体陽性血清。
第2列・S I V、、、、□と該ウィルスが分離された動物の血清。
第3列 S I V、、、G、bと該ウィルスが分離された動物の血清。
第4列 HIV−2−rodとHIV−2抗体陽性血清。
第5列: S I VAcb+−tvoとSIVAoM抗体陽性血清。
第6列: SIV、N、、、、とS I Vll、n抗体陽性血清。
第7列: S I V、A、、と5IVIIAC抗体陽性血清。
図5
ヒトポリクローナル及びマウス抗HIV−1p24モノクローナル抗体を用いた
異なるウィルス分離物の抗原捕捉。
HIV−1(HTLV−I I IB)HIV−2rod
図6a
358−メチオニンで標識されたHIV−2RODを異なる血清で沈澱させた。
第1列:SIV、、、〜1、抗体陽性血清。
第2列: S I V、、、G、、抗体陽性血清。
第3列・ウィルス分離物が得られなかったガボンからの第二の陽性チンパンジー
の血清。
第4列・HIV−1抗体陽性血清。
第5列:HIV−2抗体陽性血清。
図6b
3AS−メチオニンで標識されたS I V、、、−G、、−、を異なる血清で
沈澱させた。
第1列・S I V、、、、、、抗体陽性血清。
第2列 S I V−、、−、c、n抗体陽性血清。
第3列:ウィルス分離物が得られなかったガボンからの第二の陽性チンパンジー
の血清。
第4列・HIV−1抗体陽性血清。
箪5列:HIV−2抗体陽性血清。
第6列: S I VAct+抗体陽性血清。
第7列:SIV、。抗体陽性血清。
図60
srv、、□−11、抗原を有するウェスタンプロット片を異なる血清と共にイ
ンキュベートした。
第1列+ S I V、、、、、、抗体陽性血清。
第2列: S I Veal−scab抗体陽性血清。
第3列・ウィルス分離物が得られなかったガボンからの第二の陽性チンパンジー
の血清。
箪4列 異型HIV−1(HTV−1,、、?。)が分離されたカメルーンの女
性の血清。
東5列ないし第14列:HIV−1抗体陽性血清。
図7
S I Vc、、、、、ピリオンの存在の電子顕微鏡写真による証明(x27.
000)。
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A B C
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FIGURE 4
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国際調査報告
m #1cTmommq−陣蛇謹c+w国際調査報告
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号C12N 5/20
C12P 21100 C8214−4B21108 8214−4B
C12Q 1/68 Z 7823−48GOIN 33153 V 8310
−2J331569 H9015−2J
//(C12P 21100
C12R1:92)
8931−4B
(72)発明者 デラポルラー、エリックベルギー国べ一−2018アントベル
ペン、フレトリストラード22番
I
C12N 15100 A
(72)発明者 ペーテルス、マルティーネベルギー国ベー−2018アントベ
ルペン、フレトリストラード22番
Claims (34)
- 1.ヨーロピアン・コレクション・オブ・アエマル・セル・カルチャーズ(EC ACC)にV 900 61 322号の下で寄託されている任意のレトロウイ ルスの本質的な形態学的性質を有する、SIVcpz−antレトロウイルスま たはこのウイルスの変異体。
- 2.本質的な形態学的及び免疫学的性質が、−該ウイルスはT4リンパ球への親 和性を表わす。 −該ウイルスは、これが感染するリンパ球における巨細胞の形成に伴う典型的な 細胞傷害効果を表わさない。 −該ウイルスはおよそ130nmの直径を有する。 −該ウイルスはマグネシウムに依存する逆転写酵素活性を有する。 これはT4レセプターを有する不死化セルラインで培養することができる。 該ウイルスの溶菌液は、ウェスタンブロット上でHIV−1のp25及びHTL V−1のp19蛋白と免疫学的に識別されるp27蛋白を含む。 −該ウイルスの溶菌液は、ウェスタンブロット分析によりHIV−1のgp12 0及びHTLV−1のgp110と免疫学的に識別されるgp140蛋白を含む 。 −該ウイルスの溶菌液はさらに分子量44,000ないし50,000KDの膜 透過糖蛋白を含む。 のように特徴付けられる、請求項1の精製されたレトロウイルス。
- 3.少なくとも一つの抗原、特に請求項1ないし2のいずれかに記載のSIVc pz−antレトロウイルスの蛋白または糖蛋白を含む組成物。
- 4.該レトロウイルスの総抽出物または溶菌液を含有することを特徴とする、請 求項3の組成物。
- 5.該レトロウイルスの少なくとも一つの内部コア蛋白を含有することを特徴と する、請求項3の組成物。
- 6.該レトロウイルスの少なくとも一つのエンベロープ蛋白を含有することを特 徴とする、請求項3の組成物。
- 7.ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを提供する抗原であ って、SIVcpz−antレトロウイルスの精製された抗原の一つに共通する 、抗SIVcpz−ant抗体を有する霊長類の血清によって認識されるエピト ープを含む抗原。
- 8.SIVcpz−antの蛋白または糖蛋白の一つの免疫学的特性を有する精 製された抗原。
- 9.SIVcpz−antにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法により ゲル電気泳動に付しp16蛋白を単離することによって得られるp16蛋白のア ミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項8の抗原。
- 10.SIVcpz−antにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しp27蛋白を単離することによって得られるp27蛋白の アミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項8の抗原。
- 11.SIVcpz−antにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しp34蛋白を単離することによって得られるp34蛋白の アミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項8の抗原。
- 12.SIVcpz−antにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しgp44−50蛋白を単離することによって得られるgp 44−50蛋白のアミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項8の抗原。
- 13.SIVcpz−antにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しgp140蛋白を単離することによって得られるgp14 0蛋白のアミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項8の抗原。
- 14.特にSIVcpz−ant、HIV−1またはHIV−2レトロウイルス に起因する潜在的または存在するARCまたはAIDSの診断のための、血清ま たは髓液のような生物学的流体中のSIVcpz−ant、HIV−1またはH IV−2レトロウイルスに対する抗体の検出方法であって、診断されるべき霊長 類の体液を請求項3ないし6のいずれかに記載の組成物または請求項7ないし1 3のいずれかに記載の抗原と接触させ、この抗SIVcpz−ant、HIV− 1またはHIV−2抗体および使用された抗原の間に形成された免疫複合体を検 出することを特徴とする方法。
- 15.該免疫複合体の該検出が、該免疫複合体を抗ヒト免疫グロブリン抗体また は細菌性A蛋白もしくはG蛋白から選択される標識された試薬と反応させ、該複 合体と該試薬との間に形成された複合体を検出することを特徴とする、請求項1 4の方法。
- 16.生物学的流体中の抗一SIVcpz−ant、HIV−1またはHIV− 2抗体の検出のためのキットであって、 −請求項3ないし6のいずれかに定義される組成物、または請求項7ないし13 のいずれかに定義される抗原、及び、 −形成された免疫複合体を検出する手段 、からなるキット。
- 17.該免疫複合体を検出する該手段が、抗−ヒト免疫グロブリンまたは蛋白A 並びに検出される免疫複合体中に含まれる抗SIVcpz−ant、抗HIV− 1、または抗HIV−2抗体間に形成される複合体を検出する手段からなること を特徴とする、請求項16に記載のキット。
- 18.SIVcpz−antレトロウイルスのエンベローブ糖蛋白、または糖蛋 白の一部を、SIVcpz−ant、HIV−1またはHIV−2に対して有効 なワクチンの構成のために好適な薬学上許容し得る媒質と組み合わせて含有する 、免疫原性組成物。
- 19.請求項12ないし13のいずれかに定義されるエンベローブ蛋白またはそ の一部の蛋白バックボーンを含む糖蛋白の少なくとも一部を含有することを特徴 とする、請求項18に記載の組成物。
- 20.請求項10ないし13のいずれかに定義される抗原の一つを特異的に認識 する能力を特徴とするモノクローナル抗体、特に、該抗原に対して特異的に作製 されたモノクローナル抗体。
- 21.請求項20のモノクローナル抗体の分泌ハイブリドーマ。
- 22.所望により標識された、一部は少なくともSIVcpz−antレトロウ イルスまたはその変異体のRNAから誘導される、核酸。
- 23.SIVcpz−antレトロウイルスの総ゲノムRNAに対応するcDN Aの一部を少なくとも含むことを特徴とする、請求項22に記載の核酸。
- 24.該cDNA、または該cDNAの一部をその中に挿入させたベクター由来 の核酸を含む組み替え核酸が形成されることを特徴とする、請求項22ないし2 3のいずれかに記載の核酸。
- 25.標識されていることを特徴とする、請求項24に記載の組み替え核酸。
- 26.緊縮ハイブリダイゼーション条件下において、生物学的液体または組織に 含まれる核酸を請求項22ないし25に記載の核酸を含有するプローブと接触さ せ、形成されたハイブリッドを該緊縮条件を保持する溶液で洗浄し、そして形成 されたハイブリッドを検出することを特徴とする、生物学的液体または組織中の SIVcpz−antレトロウイルスまたはそのRNAを検出する方法。
- 27.ヒトT4リンパ球、またはここから誘導されるT4表現型を有する永久セ ルラインを、前もってSIVcpz−antレトロウイルスの分離物に感染させ てあるリンパ球またはセルラインと共に培養し、培養基から該レトロウイルスを 回収し精製することを特徴とする、SIVcpz−antレトロウイルスの産生 方法。
- 28.該レトロウイルスを溶菌し該抗原を含む溶菌液を回収することを特徴とす る、SIVcpz−antレトロウイルスの抗原の産生方法。
- 29.対応する核酸配列を発現ベクターに挿入し、該ベクターによって宿主を形 質転換し、形質転換した宿主を培養し、そして発現された蛋白を回収及び精製す ることを特徴とする、前記に定義される蛋白または糖蛋白p16、p27、gp 44−50及びgp140のいずれかを産生する方法。
- 30.DNA配列、特に請求項22ないし25のいずれかに記載のDNA配列を インビボの組み替えによってクローニングベクターに挿入し、適当な細胞宿主中 で得られた修飾ベクターをクローニングし、そしてハイブリダイゼーションプロ ーブを回収することを特徴とする、SIVcpz−antレトロウイルスのRN Aの検出のためのハイブリダイゼーションプローブの産生方法。
- 31.SIVcpz−antに対して作製された免疫グロブリン分画で表面を被 覆し、分析されるべき体液または培養液を該免疫グロブリンと接触させ、そして 該免疫グロブリン及び抗原間に形成される複合体を検出することを特徴とする、 SIVcpzの抗原を検出する方法。
- 32.SIVcpz−antに持続的に感染した非ヒト霊長類を、人におけるH IV感染をシミュレートするためのモデルとして使用する試験系。
- 33.請求項32の試験系を、可能性あるHIVワクチンの評価に使用する方法 。
- 34.請求項32の試験系を、抗ウイルス化学療法薬の有効性の評価に使用する 方法。
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