DE69009066T2

DE69009066T2 - SIV cpz-ant Retrovirus und seine Anwendungen.

Info

Publication number: DE69009066T2
Application number: DE69009066T
Authority: DE
Inventors: Eric Dr Delaporte; Martine Dr Peeters; Peter Prof Dr Piot; Der Groen Guido Dr Sc Van
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2010-06-16
Also published as: EP0494317B2; JPH06500230A; AU7967091A; WO1991019785A1; US5624795A; CA2085370A1; ATE105857T1; EP0494317B1; ES2053014T5; ES2053014T3; AU657479B2; EP0494317A1; DE69009066D1; DK0494317T3; DE69009066T3; DK0494317T4

Description

Wesentliche Fortschritte sind hinsichtlich unseres Verständnisses des erworbenen Immunschwächesyndroms (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) gemacht worden. Es ist gezeigt worden, daß es sich bei dem hauptsächlichen verursachenden Agens um ein nicht-transformierendes Retrovirus mit einem Tropismus für T4-Helfer/Induktor-Lymphozyten (1,2) handelt, und man schätzt, daß weltweit bereits Millionen Menschen infiziert sind. Die Infektion mit dem Virus führt zumindest in einem wesentlichen Prozentsatz der Fälle zu einer fortschreitenden Abnahme der T4-Lymphozytenpopulation und einer damit verbundenen steigenden Anfälligkeit gegenüber opportunistischen Infektionen, die für die Erkrankung charakteristisch sind.
Epidemiologische Studien zeigen, daß menschliches Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), das ätiologische Agens, das für die Mehrzahl der AIDS- Fälle verantwortlich ist, das gegenwärtig am weitesten verbreitete HIV ist und in Zentralafrika, Europa und den USA vorherrscht.
Eine zweite Gruppe von mit menschlicher Immunschwäche assoziierten Retroviren, nämlich menschliches Immunschwächevirus Typ 2 (HIV-2), wurde in Westafrika (3,4) identifiziert. Ein HIV-2-Virus wird in EP-0 239 425 beschrieben. Ein HIV-1-Virus wird in WO 86/02383 beschrieben.
Ein Merkmal menschlicher Immunschwächeviren, das ihren Vergleich erschwert, ist ihre genetische Variabilität; genetische Varianten treten spontan und mit großer Häufigkeit auf. Ein Vergleich verschiedener HIV-1- Isolierungen zeigte, daß einige Regionen des Genoms hochgradig variabel sind, während andere recht gut konserviert sind (5-10). Ähnliche Polymorphismen sind für HIV-2 beobachtet worden (11). Bei den Regionen mit der größten genetischen Stabilität handelt es sich wahrscheinlich um diejenigen Regionen, die für Regionen der viralen Proteine kodieren, die strukturell oder enzymatisch essentiell sind. Die viralen Gene mit der größten gesamten genetischen Stabilität sind die gag- und pol-Gene, während einige Regionen des env-Gens und die Gene, die für regulatorische Proteine, wie rev, tat, sor und nef kodieren, einen hohen Grad an Variabilität zeigen. Einige strukturelle Hauptmerkmale der gag- und pol-Genprodukte werden offensichtlich nicht nur von allen Varianten eines bestimmten HIV- Typs geteilt, sondern sind zumindest in einem gewissen Maß zwischen den Virustypen konserviert.
Gegen HIV-1 hergestelltes Antiserum zeigt eine Kreuzreaktion mit den gag- und pol-Genprodukten von HIV-2, allerdings mit einer geringeren Affinität als für die entsprechenden HIV-1-Genprodukte. Für die Hüllproteine wird jedoch keine serologische Kreuzreaktivität beobachtet. Ungeachtet der nachweisbaren immunologischen Kreuzreaktivität besteht nur eine mäßige Sequenzhomologie auf der Nucleinsäureebene, was anzeigt, daß sich HIV-1 und HIV-2 genetisch unterscheiden, und es kann keine signifikante Hybridisierung zwischen den beiden Viren nachgewiesen werden, außer unter Bedingungen mit sehr geringer Stringenz (11).
Die Affenimmunschwächeviren (SIVs) sind nicht-menschliche Primaten- Lentiviren, die die nächsten Verwandten der HIVs sind. SIVs sind bereits aus Makaken (SIVmac) (12, 13), schwarzen Mangaben ("Sooty Mangabeys") (SIVsmm) (14, 15), afrikanischen grünen Meerkatzen (SIVAGM) (16) und Mandrillen (SIVMND) (17) isoliert worden.
Mangaben, grüne Meerkatzen und Mandrille sind afrikanische Altwelt- Primaten, während Makaken asiatische Altwelt-Primaten sind. Diese vier SIVs gehören auf der Basis der genetischen Sequenzanalyse zu drei diskreten Gruppen, wobei SIVmac und SIVsmm eine einzelne genetische Gruppe bilden (18). Makaken werden offensichtlich in ihrem nativen Habitat nicht mit SIV infiziert (19). Es erscheint daher wahrscheinlich, daß einige einzelne Makaken im US Regional Primate Center mit SIVsmm aus schwarzen Mangaben infiziert wurden (20).
HIV-2 unterscheidet sich von SIVsmm auf der Sequenzebene nicht stärker als einzelne SIVsmm-Isolierungen sich voneinander unterscheiden (18, 21).
SIVAGM und SIVMND unterscheiden sich von HIV-1 und HIV-2, wobei SIVMND von HIV-1 und HIV-2 etwa gleich weit entfernt zu sein scheint (22), während SIVAGM näher zu HIV-2 als zu HIV-1 ist (23). Eine serologische Kreuzreaktivität wurde zwischen Strukturproteinen verschiedener HIV/SIVs beobachtet. Auf der Ebene der Hüllproteine besteht eine Kreuzreaktivität zwischen Hüllproteinen von SIVmac, SIVsmm, SIVAGM und HIV-2, Seren von nicht-menschlichen Primaten, die mit diesen Viren infiziert sind, reagieren jedoch nicht mit HIV-1-Hüllproteinen. Seren von SIVMND- positiven Mandrillen reagieren nicht mit HIV-1- oder HIV-2-Hüllproteinen.
1988 wurden zwei Fälle von in der Wildbahn geborenen Schimpansen, die positiv im Hinblick auf HIV-1-Antikörper waren, im tropischen Regenwald von Gabun beobachtet. Ein Retrovirus wurde aus einem dieser Schimpansen isoliert und als SIVcpz-Gab-1 bezeichnet. Das Virus ist in der französischen Patentanmeldung 89-02964 vom 7. März 1989 beschrieben. Das Virus wurde durch seine Wachstumsmerkmale, Radioimmunpräzipitation und Western- Blot zur Bestimmung des Molekulargewichts der verschiedenen Proteine und serologische Kreuzreaktivitäten charakterisiert (24). Das Virus wurde sequenziert, und es besteht eine 84 %-ige Homologie mit HIV-1 (25). Dies ist das erste Retrovirus aus einem nicht-menschlichen Primaten, das zur HIV-1-Gruppe der Retroviren gehört.
Um die Verbreitung und die Bedeutung dieser Infektion zu bestimmen, wurden weitere Schimpansen auf HIV/SIV-Antikörper untersucht. Ein neuer Fall eines in der Wildbahn geborenen Schimpansen, der positiv im Hinblick auf HIV-1-Antikörper war, wurde beobachtet. Die Isolierung und Charakterisierung eines neuen Immunschwächevirus aus einem Schimpansen mit Ursprung Zaire wird beschrieben.
Geographisch kommt dieses Virus aus einer Region in Afrika, wo HIV-1 endemisch ist. Es wird immunologisch gezeigt, daß diese Isolierung hinsichtlich der antigenen Beschaffenheit näher verwandt mit HIV-1 als mit HIV-2 ist.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Retrovirus, das aus einem Schimpansen isoliert und als SIVcpz-ant bezeichnet wurde, und Varianten dieses Virus mit im wesentlichen den morphologischen und immunologischen Eigenschaften des Retrovirus, der bei der European Collection of Animal Gell Cultures (EGACC) unter der Hinterlegungsnummer V 900 61 322 hinterlegt wurde.
Eine Virusisolierung wurde aus dem Blut eines jungen, symptomfreien, 4 Jahre alten, männlichen Schimpansen durchgeführt, der nie Injektionen mit infiziertem Material erhalten hatte.
Serum aus dem Schimpansen war positiv (Verhältnis OD/Grenzwert von 6) in einem Festphasen-Enzymimmunoassay (HIV 1 + 2 ELISA, Behring). Auf einem handelsüblichen HIV-1-Western-Blot (DuPont de Nemours) wurden klare Banden bei p24, p34, gp41, gp120 und gp160 und nur schwache Banden bei p55 und p68 beobachtet. Die Titer des Schimpansenserums im Hinblick auf die verschiedenen HIV-1-Antigene auf einem handelsüblichen Western-Blot (DuPont de Nemours) sind nachstehend angegeben:
p24 : 1/1000
p34 : 1/1000
gp41 : 1/50 000
gp120 : 1/10 000
gp160 : 1/100 000
Das Virus wurde durch Cokultivierung von Lymphozyten des Schimpansen mit PHA-stimulierten Lymphozyten aus einem gesunden, HIV-negativen menschlichen Spender in einem Medium, das aus RPMI 1640 mit 20 millimolar Hepes, angereichert mit 10 % fötalem Kälberserum, 2 ug/ml Polybrene, Antibiotika (100 ug/ml Gentamicin) und 150 U/ml Interleukin-2, bestand, isoliert. Nach 13-tägiger Kultur wurde das Virus in der Kultur auf der Grundlage eines positiven HIV-1-Antigen-Einfangtests (Innogenetics) nachgewiesen. Das Vorhandensein von reverser Transkriptase (RT) im Kulturüberstand wurde ebenfalls nachgewiesen (50 000 cpm). Zellfreie RT- und Antigen-positive Überstände wurden zum Übertragen des Virus auf frische Lymphozyten verwendet, und erneut wurde ein positives Ergebnis eines Antigen-Einfangtests festgestellt und reverse Transkriptase-Aktivität im Überstand nachgewiesen. Bei den Lymphozyten wurden keine zytopathischen Effekte unter Bildung von Riesenzellen beobachtet. Das Virus wurde weiter in PHA-stimulierten Lymphozyten von gesunden menschlichen Blutspendern vermehrt und dann auf kontinuierliche Zellinien mit Leukämie-Ursprung übertragen. Das Virus enthaltende Überstände wurden parallel zu Kulturüberständen, von denen bekannt war, daß sie HIV-1 enthielten, in einem differentiellen Antigen-Einfangtest untersucht, der nachstehend ausführlich beschrieben wird. Die Ergebnisse dieses Vergleichs zeigten, daß die neue Isolierung nahe verwandt zu HIV-1, jedoch nicht damit identisch war. Das neue Virus wurde dann im Hinblick auf seine Proteinantigene charakterisiert. Die Zellinien für die Vermehrung des Virus können Linien vom Typ CEM oder MOLT-4 oder andere unsterbliche Zellinien, die T4-Rezeptoren auf ihren Zelloberflächen tragen, sein. Bevorzugte Zellinien für die kontinuierliche Vermehrung von SIVcpz-ant sind MOLT-4- und CEM-CEM-SS-Zellen. MOLT-4-Zellen, die mit SIVcpz-ant infiziert sind, wurden bei ECACC am 13. Juni 1990 unter der Hinterlegungsnummer V 900 61 322 hinterlegt.
Das Etablieren einer chronisch infizierten Zellinie kann z. B. wie folgt durchgeführt werden: MOLT-4-Zellen (10&sup6; Zellen/ml), vorzugsweise MOLT-4-Klon-8-Zellen (erhalten von N.Yamamoto, Yemaguchi, Japan) oder CEM-SS-Zellen (erhalten von Peter Nara, Fredericksburg, Maryland, USA), werden mit SIVcpz-ant-infizierten menschlichen Lymphozyten (10&sup6; Zellen/ml) in einem Kulturmedium RPMI 1640, das mit 20 millimolar Hepes gepuffert ist und 10 % fötales Kälberserum enthält, cokultiviert. Die Virusbildung wurde unter Verwendung eines Antigen-Einfangtests (Innogenetics, Organon) verfolgt. Bei der CEM-SS-Zellinie war der Antigen-Einfangtest sofort positiv und blieb positiv. Bei den MOLT-4-Klon-8- Zellen war der Antigen-Einfangtest nach 50-tägiger Cokultivierung positiv. Bei keiner der Zellinien wurde ein zytopathischer Effekt beobachtet. Die Überstände von diesen Zellen können als Quelle für das Virus verwendet werden.
Ferner betrifft die Erfindung ein gereinigtes Retrovirus mit im wesentlichen den nachstehend beschriebenen morphologischen und immunologischen Eigenschaften. In vielen Fällen können die einzigartigen Merkmale von SIVcpz-ant am besten durch Vergleich mit der gleichen Art von charakteristischen Merkmalen, die die anderen menschlichen Immunschwächeviren HIV-1 und HIV-2 sowie die anderen Affenimmunschwächeviren, insbesondere die SIVcpz-Gab-1-Isolierung aus Gabun, betreffen, erkannt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

1. Die Figur zeigt die Reaktivität von anti-SIVcpz-Seren auf handelsüblichen HIV-1-Western-Blot-Streifen. Die Reaktivitäten und Titer von drei verschiedenen SIVcpz-positiven Seren auf HIV-1-Western-Blot-Streifen sind gezeigt:
Serum 1: Serum des Tieres, aus dem SIVcpz-Gab isoliert wurde.
Serum 2: Serum des Tieres, aus dem SIVcpz-ant isoliert wurde.
Serum 3: Serum des zweiten Schimpansen aus Gabun, aus dem kein Virus isoliert werden konnte.
2. Die Figur betrifft den Vergleich der gag-, pol- und env-Proteine von HIV-1 (HTLV-IIIB), SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant auf Western-Blots.
3. Die Figur betrifft den Vergleich der Proteine von HIV-1 (HTLV- IIIB), SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant durch Radioimmunpräzipitation.
4. Die Figur betrifft den Vergleich der Proteine von HIV-1 (HTLV- IIIB), SIVcpz-Gab, SIVcpz-ant, HIV-2, SIVAGM, SIVMND und SIVMAC.
5. Die Figur zeigt das Antigen-Einfangen von Virus-Isolierungen unter Verwendung menschlicher polyklonaler Antikörper und monoklonaler anti- HIV-1-Antikörper aus Maus.
6. Vergleich der Reaktivität von SIVcpz-Antiseren mit verschiedenen HIV/SIV-Typen.
7. Elektronenmikroskopische Aufnahme.

Morphologie

Die elektronenmikroskopische Aufnahme von SIVcpz-ant-infizierten CEM- SS und MOLT-4-Zellen zeigte das Vorhandensein von Knospung und extrazellulären Viruspartikeln mit einem Durchmesser von ungefähr 130 nm. SIVcpz-ant ist morphologisch den anderen HIVs und SIVs sehr ähnlich, es läßt sich jedoch leicht von anderen menschlichen Retroviren und Affenretroviren, wie HTLV-I, HTLV-II und STLV-I unterscheiden.

Protein- und Glykoprotein-Antigene

Das im Kulturüberstand der SIVcpz-ant-infizierten MOLT-4-Zellen vorhandene Virus wurde über Nacht durch Zentrifugation bei 19 000 U/min in einem Beckmann-Rotor vom Typ 19Ti eingeengt. Das erhaltene Pellet wurde in einem Elektrophorese-Sammelpuffer (62,5 millimolar Tris, pH-Wert: 6,7, mit einem Gehalt an 2 % 2-Mercaptoethanol, 1 % Natriumdodecylsulfat und 10 % Glycerin) resuspendiert, und die hauptsächlichen viralen Antigene wurden durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel (12,5 % oder 10 %) unter denaturierenden Bedingungen getrennt. Molekulargewichtsmarker wurden auf das gleiche Gel aufgetragen, um eine Grundlage für die Bestimmung der Molekulargewichte bereitzustellen. Die getrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulose-Papier (Western-Blot) übertragen, das dann mit einem homologen Antiserum inkubiert wurde. Auf diese Weise konnten die Molekulargewichte der gag-, pol- und env-Genprodukte von SIVcpz-ant mit denen von HIV-1 und SIVcpz-Gab verglichen werden. Die scheinbaren Molekulargewichte, die für die SIVcpz-ant-Proteine beobachtet wurden, liegen nahe bei denen, die sowohl für HIV-1 als auch für SIVcpz- Gab beobachtet werden. Es sind jedoch auch geringfügige, aber reproduzierbare Molekulargewichtsunterschiede zwischen den Proteinen von SIVcpz-ant, HIV-1 und SIVcpz-Gab sichtbar. Die Proteinblots zeigten, daß das hauptsächliche Kernprotein SIVcpz-ant ein Molekulargewicht von 27 000 aufweist.
Gemäß einer Konvention werden Proteine häufig mit "p" für Protein oder "gp" für Glykoprotein und einer Zahl, die bei Multiplikation mit 1000 das ungefähre Molekulargewicht des Polypeptids ergibt, bezeichnet. Das hauptsächliche Kernprotein von SIVcpz-ant wird nachstehend als p27 bezeichnet.
Man nimmt am, daß die bestimmten Molekulargewichte bis auf etwa 10 % mit den wahren Werten übereinstimmen. Dennoch besteht eine große Verwirrung hinsichtlich der Molekulargewichtswerte von Proteinen, da der Aufbau der verwendeten Elektrophoresevorrichtung und die Quelle der Pufferbestandteile von Labor zu Labor variieren. Bei einem Vergleich der scheinbaren Molekulargewichte von Proteinantigenen von SIVcpz-ant mit denen von HIV-1 oder SIVcpz-Gab ist es daher erforderlich, alle Proben einer Elektrophorese auf dem gleichen Gel zu unterwerfen. Ein derartiges Gel ist z. B. in Fig. 2 gezeigt. Insbesondere ist ersichtlich, daß zwar im Fall der hauptsächlichen Kernproteine die Molekulargewichtswerte der homologen Proteine der drei Viren sehr nahe benachbart sind, daß jedoch das aus HIV-1 stammende Protein das kleinste ist. Das hauptsächliche Kernprotein von SIVcpz-Gab ist etwas größer als das von HIV-1, wie zuvor berichtet worden ist (24). Das homologe Protein aus SIVcpz-ant ist größer als das hauptsächliche Kernprotein von SIVcpz-Gab. Die berechneten Molekulargewichte dieser Proteine sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Vergleich der Nolekulargewichte der gag- und pol-Genprodukte gag Endonuclease Transmembranprotein Außenmembranprotein
SIVcpz-ant besitzt ein aus dem pol-Gen abgeleitetes Polypeptid, bei dem es sich um eine Endonuclease mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 34 000 handelt und das sich nicht wesentlich hinsichtlich des Molekulargewichts vom homologen Protein aus HIV-1 unterscheidet.
Wenn Protein-Blots der verschiedenen Viren jeweils mit einem homologen Serum inkubiert werden, das von einem Individuum erhalten wird, das mit diesem Virus infiziert ist, dann sind die Hüllproteine sichtbar. Diese Proteine sind aus dem env-Gen abgeleitet, und es handelt sich um virale Hüllglykoproteine. Das kleinste Glykoprotein, bei dem es sich um ein Transmembranprotein handelt, wandert als eine breite Bande mit einem scheinbar identischen Molekulargewicht für HIV-1 und SIVcpz-Gab von zwischen 40 000 bis 45 000 und mit einem offensichtlich höheren Molekulargewicht für SIVcpz-ant zwischen 44 000 und 50 000.
Das größere Protein, bei dem es sich um ein Außenmembranprotein handelt, weist ein Molekulargewicht von 120 000 für HIV-1, ein etwas höheres Molekulargewicht für die Isolierung SIVcpz-Gab und das höchste Molekulargewicht für die neue Isolierung SIVcpz-ant auf.
Die Glykoproteine sind hochgradig glykosyliert, und das scheinbare Molekulargewicht, das man beobachtet, wird bis zu einem gewissen Grad von der Zellinie, die zur Bildung des Virus verwendet wird, beeinflußt. Um Unterschiede zwischen verschiedenen Viren auf der Ebene der Hüllproteine zu bestimmen, müssen die Viren in der gleichen Zellinie gezüchtet werden.
Außer durch Western-Blot können die viralen Proteinantigene auch durch einen Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) sichtbar gemacht werden. Zu diesem Zweck werden die viralen Proteine metabolisch in vivo durch Züchten der mit dem Virus infizierten Zellen in Gegenwart von ³&sup5;S-Methionin (200 uCi pro ml oder 4,10&sup6; Zellen pro ml) in RPMI 1640 ohne Methionin und angereichert mit 10 % fötalem Kälberserum gezüchtet. Nach 16 Stunden wird das markierte Virus aus dem Überstand und den Zellen in einem Lysepuffer (0,02 m Tris, pH-Wert: 7,6; 0,15 m NaCl; 0,05 m KCl; 0,001 millimolar EDTA; 0,2 millimolar PMSF; 0,05 % Aprotinin; 1 % β-Mercaptoethanol und 2 % Triton X-100) gewonnen.
Zur Immunpräzipitation wird die äquivalente Menge an Virus, die aus 2 x 10&sup6; Zellen gewonnen wurde, mit 10 ul eines Testserums in einem Puffer 1 Stunde bei 4ºC umgesetzt. Die erhaltenen Immunkomplexe werden anschließend an Protein-A-Sepharose über Nacht bei 4ºC gebunden und gründlich gewaschen. Die gebundenen Proteine werden mit Elektrophoresesammelpuffer mit einem Gehalt an 1 % SDS eluiert. Die Antigene werden anschließend durch Elektrophorese analysiert, gefolgt von Fluorographie und Autoradiographie. In Fig. 3 ist ein RIPA für HIV-1, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant gezeigt, wobei jedes Virus mit einem homologen Serum gefällt und auf einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel analysiert wurde. Wie beim Western- Blot sind unmittelbar die Unterschiede im Molekulargewicht der hauptsächlichen Kernproteine der drei Viren, wobei SIVcpz-ant das höchste Molekulargewicht aufweist, sowie die Unterschiede in den externen Glykoproteinen sichtbar. Das Molekulargewicht des externen Glykoproteins von SIVcpz-ant ist höher als das von SIVcpz-Gab oder HIV-1. Die drei Viren wurden in der Zellinie MOLT-4 gezüchtet, so daß die Differenzen im Molekulargewicht nicht auf die die Zellinie betreffende Faktoren zurückzuführen sind.
In Fig.4 ist ein RIPA auf einem 10 %-igen Gel für die verschiedenen HIVs und SIVs gezeigt, die jeweils mit einem homologen Serum gefällt wurden. Die SIVcpz-ant-Isolierung weist ein hauptsächliches Kernprotein mit einem Molekulargewicht auf, das höher ist als das der anderen gezeigten HIVs und SIVs.
Die Proteinantigene von SIVcpz-ant können im Hinblick auf diejenigen von SIVcpz-Gab, HIV-1 und andere HIV/SIVs unter Verwendung verschiedener, jedoch im Zusammenhang miteinander stehender Ansätze charakterisiert werden. Einerseits können die Antigene auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Kreuzreaktion mit Antiseren von Individuen, die mit HIV/SIV infiziert sind, charakterisiert werden. Andererseits können Antiseren aus Schimpansen, die mit SIVcpz-ant infiziert sind und die Antikörper enthalten, die als Antwort auf SIVcpz-ant-Antigene gebildet wurden, zur Untersuchung der Kreuzreaktivität mit anderen HIV- und SIV-Proteinen herangezogen werden. Die antigenen Beziehungen zwischen SIVcpz-ant und anderen HIV/SIVs werden im wesentlichen in den nachstehenden Beispielen erläutert. SIVcpz-ant ist enger verwandt zu HIV-1 und SIVcpz-Gab, da ein SIVcpz-ant-Serum eine Kreuzreaktion mit den gag-, pol- und env-Produkten dieser Viren zeigt. SIVcpz-ant-Antiserum zeigt nur mit den Kernproteinen von HIV-2, SIVmac, SIVAGM und SIVMND eine Kreuzreaktion, niemals jedoch mit den Hüllproteinen. Seren mit Antikörpern gegen HIV-2, SIVmac, SIVAGM und SIVMND zeigen nur eine Kreuzreaktion mit den Kernproteinen von SIVcpz-ant. Nur anti- SIVcpz-Seren (SIVcpz-ant und SIVcpz-Gab) reagieren mit den gag-, pol- und env-Proteinen von SIVcpz-ant.
Von 25 HIV-1-positiven Seren zeigten alle Seren eine Kreuzreaktion mit gag- und pol-Antigenen, 5/25 reagierten schwach mit gp41, und nur eines der 25 Seren reagierte mit gp140 von SIVcpz-ant. Dieses Serum stammt von einer Frau aus Kamerun, aus der ein atypisches HIV-1-Virus isoliert wurde.
In den nachstehenden Beispielen wird gezeigt, daß SIVcpz-ant von HIV- 1 und der anderen Isolierung SIVcpz-Gab aus einem Schimpansen auf folgender Basis wesentlich unterscheidet:
1. Unterschiede in den Molekulargewichten der Proteine;
2. Reaktion mit monoklonalen Antikörpern;
3. Reaktion von SIVcpz-ant-Antiserum mit verschiedenen HIV-1-Proteinen bei Western-Blots.
Außerdem betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die mindestens ein Antigen, insbesondere ein Protein oder Glykoprotein, des SIVcpz-ant- Retrovirus umfaßt. Eine derartige Zusammensetzung kann bei Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und in Reagenssätzen zur Durchführung derartiger Verfahren verwendet werden.
Es hat sich gezeigt, daß das SIVcpz-ant-Virus sich als Quelle für Antigene zum Nachweis von Antikörpern in Primaten eignet, die in Kontakt mit SIVcpz-ant oder einem atypischen HIV-1 gekommen sind. Als solches kann das Virus gemäß Verfahren, die bereits beschrieben wurden, gezüchtet und angereichert werden, und ein Lysat kann durch Behandlung des Virus mit einem geeigneten Detergens hergestellt werden. Ein bevorzugtes Detergens zur Herstellung eines Gesamtviruslysats ist Triton X-100, das in einer Konzentration von 0,5 % verwendet wird. Ein weiteres bevorzugtes Detergens ist Nonidet P-40 (NP-40), das ebenfalls in einer Konzentration von 0,5 % verwendet wird.
Alternativ dazu können virale Proteine aus Lysaten des Virus gereinigt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung dieser Proteine ist die Affinitätschromatographie. Zum Beispiel können die viralen Antigene auf einem präparativen Polyacrylamidgel getrennt und die einzelnen Antigene in gereinigter Form eluiert werden. Diese können ferner dazu herangezogen werden, Antiseren, z. B. in Kaninchen, zu erzeugen, die spezifisch für einzelne virale Proteine sind.
Die aus dem Serum immunisierter Kaninchen abgeleitete IgG-Fraktion kann an eine feste Phase, wie CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia), gekoppelt und zur selektiven Entfernung einzelner viraler Antigene aus viralen Lysaten verwendet werden. Diese Proteine können dann vom Affinitätsträger unter Verwendung eines Puffers mit einem niedrigen pH-Wert eluiert und weiter unter Verwendung von chromatographischen Standardtechniken, für die ein Beispiel von Montelaro et al., J. of Virology, Bd. 42 (1982), S. 1029-1030, angegeben ist, gereinigt werden.
Die Erfindung betrifft allgemein beliebige Zusammensetzungen, die zur Diagnose von SIVcpz-ant-Infektionen oder für Tests, die einen prognostischen Wert haben, verwendet werden können. Diese diagnostischen Verfahren umfassen den Nachweis von Antikörpern im Serum oder anderen Körperflüssigkeiten, die sich gegen mindestens eines der Antigene von SIVcpz-ant richten.
Bevorzugte Zusammensetzungen sind virale Lysate oder gereinigte Antigene, die mindestens eines der viralen Kernproteine oder Hüllproteine oder vom pol-Gen abgeleiteten Proteine enthalten. Besonders bevorzugte Zusammensetzungen sind Zusammensetzungen, die z. B. gleichzeitig die folgenden Proteine enthalten: p27 und gp140; p27 und gp44-50; p27, gp44-50 und gp140; und p27; p27, p34 und gp140. Es ist darauf hinzuweisen, daß die vorstehend genannten Zusammensetzungen nur als Beispiele dienen sollen, und daß die Erfindung alle Lysate oder Proteinzubereitungen betrifft, die eines oder mehrere der vorstehend genannten Proteine oder Glykoproteine enthalten.
Die Erfindung betrifft auch beliebige Zusammensetzungen, bei denen ein virales SIVcpz-ant-Lysat in Kombination mit entsprechend hergestellten Proteinen, die aus HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIVcpz-Gab stammen, zur allgemeinen Diagnose einer Infektion oder eines Kontakts mit einem Immunschwächevirus verwendet wird, wobei es nicht um den Nachweis der absoluten Identität des Virus geht. Derartige Zusammensetzungen können z. B. aus einem Gemisch von Lysaten von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant bestehen oder folgende Bestandteile aufweisen:
- Kernproteine von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant, und insbesondere die hauptsächlichen Kernproteine jedes Virustyps, die homolog zu SIVcpz-ant-p27 sind;
- Hüllglykoproteine von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant, und insbesondere die äußeren Hüllglykoproteine jedes Virustyps, die homolog zu SIVcpz-ant-gp140 sind;
- Kernproteine von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant zusammen mit den Hüllglykoproteinen von HIV-1, HIV-2 und SIVcpz-ant, insbesondere die hauptsächlichen Kernproteine jedes Virustyps, die homolog zu SIVcpz-ant-p27 sind, zusammen mit den hauptsächlichen äußeren Hüllproteinen jedes Virustyps, die homolog zu SIVcpz-ant-gp140 sind;
- eine Kombination der Kernproteine und der Hüllproteine von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant, und insbesondere die Proteine, die homolog zu den SIVcpz-ant-Proteinen p27 bzw. gp140 sind, und ein Protein, das vom pol-Gen von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant abgeleitet ist, und insbesondere die Proteine jedes Virustyps, die homolog zu dem Endonucleaseprotein p34 von SIVcpz-ant sind.
Ferner betrifft die Erfindung ein Antigen, das für eine einzelne Bande bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese sorgt, wobei das Antigen, in Übereinstimmung mit einem der gereinigten Antigene des SIVcpz-ant- Retrovirus, ein Epitop umfaßt, das vom Serum von Individuen, die anti- SIVcpz-ant-Antikörper tragen, erkannt wird.
Die Aminosäuresequenzen, die diesen Epitopen entsprechen, können ohne weiteres bestimmt werden, indem die einzelnen Proteine durch präparative Elektrophorese oder durch Affinitätschromatographie isoliert und die Aminosäuresequenz des gesamten Proteins oder der Fragmente davon, die enzymatisch durch Trypsin- oder Chymotrypsinverdau oder durch chemische Maßnahmen erzeugt wurden, bestimmt wird. Die erhaltenen Peptide oder Polypeptide können sodann durch Edman-Abbau sequenziert werden. Die Erfindung betrifft daher beliebige Proteine, Glykoproteine oder Peptide, die direkt aus dem Virus abgeleitet sind oder durch Klonierung beliebiger cDNA-Fragmente des Virus in bakteriellen Expressionsvektoren oder viralen Expressionsvektoren zur Expression der inserierten DNA in Säuger- oder Insektenzellen und Reinigen des exprimierten Proteins nach den vorstehend beschriebenen Methoden hergestellt werden. Ferner betrifft die Erfindung auch synthetische Peptide, die durch Merrifield-Synthese oder Fmoc-Chemie hergestellt werden, die anschließend bis zur homogenen Beschaffenheit gereinigt werden können und die in ihren Sequenzen Epitope enthalten, die sie mit natürlichem SIVcpz-ant entweder gemäß Western-Blot oder gemäß Radioimmunpräzipitation teilen. Im Fall von kleinen Peptiden, die nicht an Nitrocellulose binden können, können diese Peptide durch Binden an Nylonmembranen (Pall Biodyne oder Amersham) und Umsetzen der Membranen mit anti-SIVcpz-ant-Antiserum nachgewiesen werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Epitope, die in beliebigen SIVcpz-ant-Kernproteinen oder in einem Protein, das als Teil seiner Polypeptidkette Epitope enthält, die aus einer Kombination von Kernproteinen abgeleitet sind, enthalten sind. Ferner betrifft die Erfindung Epitope, die in einem der beiden SIVcpz-ant-Glykoproteine enthalten sind, sowie beliebige Proteine, die als Teil ihrer Polypeptidkette Epitope enthalten, die aus einer Kombination des SIVcpz-ant-Hüllglykoproteins oder einer Kombination des SIVcpz-ant-Kernproteins abgeleitet sind.
Die Erfindung betrifft darüberhinaus Polypeptide, deren Synthese durch Expressionsvektoren gesteuert wird, die nach rekombinanten DNA-Methoden konstruiert wurden und Epitope, die aus SIVcpz-ant-Proteinen oder -Glykoproteinen abgeleitet wurden, zusammen mit Epitopen, die aus Proteinen oder Glykoproteinen von HIV-1 und/oder HIV-2 abgeleitet wurden, in einer einzelnen Polypeptidkette umfassen. Die Herstellung eines derartigen Konstrukts beinhaltet das Ausschneiden der relevanten kodierenden Regionen aus der cDNA von SIVcpz-ant sowie von HIV-1 und HIV-2, das Kuppeln der DNA in Phase, so daß eine kodierende Sequenz gebildet wird, die bei Insertion in einen Expressionsvektor, der die erforderlichen Signalsequenzen besitzt, die Synthese eines Hybridproteins steuert, in dem die Epitope von HIV-1, HIV-2, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant enthalten sind.
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen SIVcpz-ant in einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere zur Diagnose eines möglichen oder bestehenden ARC oder AIDS, verursacht durch das SIVcpz-ant-Retrovirus, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß Körperflüssigkeit einer Person, für die eine Diagnose erstellt werden soll, mit einer Zusammensetzung, die eines oder mehrere der Proteine oder Glykoproteine von SIVcpz-ant enthält, oder mit einem Lysat des Virus oder mit einem Antigen, das gemeinsame Epitope mit SIVcpz-ant besitzt, in Kontakt gebracht wird und daß das immunologische Konjugat, das zwischen den SIVcpz-ant-Antikörpern und dem verwendeten Antigen/den verwendeten Antigenen gebildet wird, nachgewiesen wird.
Bevorzugte Verfahren umfassen z. B. Immunofluoreszenzassays und Immunoenzymassays. Immunofluoreszenzassays beinhalten typischerweise das Inkubieren z. B. von Serum der Person, die untersucht werden soll, mit Zellen, die mit SIVcpz-ant infiziert sowie fixiert und mit kaltem Aceton permeabel gemacht worden sind. Gebildete Immunkomplexe werden durch direkte oder indirekte Methoden nachgewiesen. Sie beinhalten die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch mit menschlichen Immunglobulinen reagieren. Der Nachweis wird durch Verwendung von Antikörpern, die mit einer fluoreszierenden Markierung, wie Fluoreszein oder Rhodamin, gekoppelt worden sind, erzielt.
Immunoenzymassays können z. B. wie folgt durchgeführt werden:
- eine bestimmte Menge an SIVcpz-ant-Virusextrakt oder einer Zusammensetzung, auf die erfindungsgemäß Bezug genommen wird, wird in die Vertiefungen einer Mikrotitrationsplatte gegeben;
- das überschüssige, ungebundene Material wird nach einer geeignet gewählten Inkubationszeit durch Waschen entfernt;
- eine geeignete Verdünnung oder geeignete Verdünnungen des Serums oder der anderen Körperflüssigkeit, die auf das Vorhandensein von Antikörpern, die gegen ein oder mehrere der Protein- oder Glykoproteinantigene von SIVcpz-ant gerichtet sind, untersucht werden sollen, werden in die Vertiefungen eingeführt;
- die Mikrotitrationsplatte wird für die zum Auftreten der Bindungsreaktion erforderliche Zeitspanne inkubiert:
- die Platte wird gründlich gewaschen;
- das Vorhandensein von Immunkomplexen wird unter Verwendung von Antikörpern nachgewiesen, die spezifisch an menschliche Immunglobuline binden und die mit einem Enzym, vorzugsweise, jedoch ohne Beschränkung hierauf, mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder β-Galactosidase, markiert sind, wobei das Enzym fähig ist, ein farbloses oder nahezu farbloses Substrat in ein hochgradig gefärbtes Produkt umzuwandeln; alternativ dazu kann für das Nachweissystem ein Enzym eingesetzt werden, das in Gegenwart des geeigneten Substrats/der geeigneten Substrate Licht ausstrahlt;
- die Menge des gebildeten Produkts wird optisch, spektrophotometrisch oder luminometrisch nachgewiesen und mit einer ähnlich behandelten Kontrolle verglichen.
Weitere Nachweissysteme, die ebenfalls verwendet werden können, umfassen Nachweissysteme, die auf der Verwendung von Protein A aus Staphylococcus aureus Cowan-Stamm I oder Protein G aus der Gruppe C Streptococcus sp. (Stamm 26RP66) basieren, und Systeme, bei denen die Biotin-Avidin-Bindungsreaktion ausgenutzt wird.
Ein weiteres Verfahren zum immunoenzymatischen Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern, die gegen ein oder mehrere der SIVcpz-ant-Antigene gerichtet sind, ist der Western-Blot. Die viralen Antigene werden elektrophoretisch getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran oder einen geeigneten Träger übertragen. Die zu untersuchende Körperflüssigkeit wird dann in Kontakt mit der Membran gebracht, und das Vorhandensein der gebildeten Immunkomplexe wird durch ein Verfahren, wie es bereits beschrieben wurde, nachgewiesen. In einer Abwandlung dieser Methode wird gereinigtes virales Antigen in Linien oder Punkten aufgetragen und sodann in Kontakt mit der Körperflüssigkeit, die untersucht werden soll, gebracht, und die gebildeten Immunkomplexe werden unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Techniken nachgewiesen.
Das Vorhandensein von Antikörpern in Körperflüssigkeiten kann auch durch Agglutination nachgewiesen werden. SIVcpz-ant-Lysate, Antigen oder eine gereinigte Antigenzusammensetzung, auf die erfindungsgemäß Bezug genommen wird, werden zum Beschichten z. B. von Latexteilchen verwendet, die eine gleichförmige Suspension bilden. Wenn sie mit Serum gemischt werden, das Antikörper gegen das vorhandene Antigen enthält, dann wird eine Agglutination der Latexteilchen bewirkt, und das Vorhandensein großer Aggregate kann optisch festgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch markierte Extrakte von SIVcpz-ant oder Zusammensetzungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden. Die Markierung kann von einem beliebigen Typ sein, z. B. enzymatisch, chemisch, fluoreszierend oder radioaktiv.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von SIVcpz-ant-Antigenen in Körperflüssigkeiten. Dieses Verfahren kann z. B. auf nachstehende Weise durchgeführt werden:
- die IgG-Fraktion des Antiserums, die entweder von mit SIVcpz-ant infizierten Menschen oder von Tieren, die mit einem SIVcpz-ant-Lysat oder einer vorstehend beschriebenen Zusammensetzung infiziert wurden, stammt, wird in die Vertiefungen einer Mikrotitrationsplatte gegeben;
- nach einer geeigneten Zeitspanne für die Adsorption wird überschüssiges ungebundenes Material weggewaschen;
- eine Körperflüssigkeit, die das nachzuweisende Antigen enthält, wird in die Vertiefung gegeben;
- die Mikrotitrationsplatte wird für eine geeignete Zeitspanne, um das Auftreten der Bindung zu ermöglichen, inkubiert;
- die Platte wird anschließend gründlich mit einem geeigneten Puffer gewaschen;
- das Vorhandensein von gebundenem Antigen wird entweder direkt oder indirekt, z. B. unter Verwendung von Immunglobulinen, die entsprechend spezifisch für das nachzuweisende Antigen/für die nachzuweisenden Antigene sind und die, vorzugsweise mit einem der vorstehend genannten Enzyme, markiert worden sind, nachgewiesen;
- ein geeignetes Substrat wird anschließend zugegeben, und das Ausmaß der Reaktion wird mit einer Kontrolle verglichen, um die Menge an vorhandenem Antigen zu messen.
Ferner betrifft die Erfindung einen Reagenssatz zum Nachweis von anti-SIVcpz-ant-Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, der ein SIVcpz-ant-Lysat oder eine Zusammensetzung, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, und ein Mittel zum Nachweis der gebildeten immunologischen Komplexe umfaßt.
Im Fall von Reagenssätzen, die zum Nachweis spezifischer Antikörper durch immunoenzymatische Methoden entworfen worden sind, umfaßt ein derartiger Reagenssatz:
- ein SIVcpz-ant-Lysat oder eine Zusammensetzung einer der vorstehend bereits genannten Typen, vorzugsweise in einer gereinigten Form und vorzugsweise verknüpft mit einem festen Träger, wie einer Mikrotitrationsplatte;
- ein Konjugat zwischen einem Enzym und einer Immunglobulinfraktion, die zum Binden der nachzuweisenden Antikörper imstande ist, oder ein Konjugat zwischen einem Enzym und dem bakteriellen Protein A oder Protein G;
- ein Kontrollantigen, das keine Epitope besitzt, die beliebige menschliche Immunschwächeviren aufweisen;
- geeignete Puffer zur Durchführung des Assays;
- ein geeignetes Substrat für das Enzym.
Reagenssätze zum Nachweis spezifischer Antikörper, bei denen ein markiertes Antigen verwendet wird, umfassen:
- ein geeignet markiertes Antigen oder eine Kombination von Antigenen der bereits beschriebenen Typen;
- Protein A oder anti-Mensch-Immunglobuline, vorzugsweise gekoppelt an einen unlöslichen Träger, wie Protein A-Sepharose 4B (Pharmacia) oder einen äquivalenten Träger;
- Kontrollantigen, das durch anti-SIVcpz-ant-Antiseren nicht erkannt wird;
- geeignete Puffer zur Durchführung des Assays;
- gegebenenfalls. Substrate zum Nachweis des enzymatisch markierten Antigens.
Die Erfindung betrifft ferner Reagenssätze, die zum Nachweis von SIVcpz-ant-Antigenen in biologischen Flüssigkeiten entwickelt wurden und folgende Bestandteile umfassen:
- anti-SIVcpz-ant-Immunglobuline, vorzugsweise gekoppelt an einen festen Träger, wie eine Mikrotitrationsplatte;
- anti-SIVcpz-ant-Immunglobuline, konjugiert an ein Enzym;
- negatives Kontrollantigen, das durch die anti-SIVcpz-ant-Immunglobuline nicht erkannt wird;
- positives Kontrollantigen, das aus einem der SIVcpz-ant-Antigene oder den bereits beschriebenen Zusammensetzungen besteht;
- geeignete Puffer zur Durchführung des Tests;
- ein geeignetes Substrat zum Nachweis des gebundenen Enzyms.
Ferner betrifft die Erfindung eine immunogene Zusammensetzung, die Hüllglykoproteine des SIVcpz-ant-Retrovirus oder einen Teil dieser Glykoproteine in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, der sich zur Konstitution von gegen SIVcpz-ant wirksamen Vaccinen eignet, enthält. Die Erfindung betrifft außerdem beliebige Peptide oder Polypeptide, die in ihrer Sequenz das gesamte oder einen Teil des Proteingrundgerüsts des SIVcpz-ant-Retrovirus enthalten, sowie Peptide, die aus der Addition, Substitution oder Deletion von Aminosäuren resultieren, die die allgemeinen immunologischen Eigenschaften der Peptide nicht beeinträchtigen.
Die Erfindung betrifft ferner monoklonale Antikörper, die durch ihre Fähigkeit charakterisiert sind, spezifisch Epitope zu erkennen, die in SIVcpz-ant-Antigenen oder Zusammensetzungen, wie sie vorstehend definiert wurden, enthalten sind, und insbesondere monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen die Antigene erzeugt und nach herkömmlichen Techniken hergestellt wurden. Die Erfindung betrifft auch monoklonale Antikörper, die hergestellt werden, indem B-Zellen, die aus mit SIVcpz-ant infizierten Primaten stammen, unsterblich gemacht werden, z. B. durch Transformation der B-Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus und Subklonieren der Transformanten.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Herstellung von polyklonalen Antiseren in Tieren, die eines oder mehrere SIVcpz-ant-Antigene erkennen, wobei die Antiseren durch Infizieren von Tieren mit gereinigtem SIVcpz- ant oder einem SIVcpz-ant-Antigen oder einer Kombination von Antigenen hergestellt werden, wobei es sich bei den Antigenen insbesondere um Proteine oder Glykoproteine von SIVcpz-ant handelt.
Die polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können für eine Reihe von Zwecken verwendet werden, unter Einschluß der Neutralisation der infektiösen Beschaffenheit von SIVcpz-ant, des Nachweises von SIVcpz-ant- Antigenen in biologischen Flüssigkeiten oder in infizierten Zellen und der Reinigung von SIVcpz-ant-Protein- oder -Glykoprotein-Antigenen.
Die Erfindung betrifft ferner wahlweise markierte Nucleinsäuren, die mindestens zum Teil aus RNA des SIVcpz-ant-Retrovirus oder von Varianten dieses Virus abgeleitet ist.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung von cDNA oder Teilen von cDNA oder von Rekombinanten, die diese enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens einen Anteil der cDNA enthalten, die der gesamten genomischen RNA des SIVcpz-ant-Retrovirus entspricht. Derartige cDNAs können als Sonden zum spezifischen Nachweis von SIVcpz-ant-Sequenzen in biologischen Flüssigkeiten, Geweben und Zellen verwendet werden. Die Sonden sind vorzugsweise ebenfalls markiert, und zwar radioaktiv oder chemisch oder alternativ unter Verwendung einer enzymatischen, fluoreszierenden oder chemolumineszierenden Markierung, die einen Nachweis der Sonde ermöglichen. Bevorzugte Sonden zum spezifischen Nachweis von SIVcpz-ant und zur Diagnose einer SIVcpz-ant- Infektion sind Sonden, die die gesamte oder einen Anteil der cDNA, die komplementär zum SIVcpz-ant-Genom ist, enthalten.
Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Sonden, die zur Diagnose einer SIVcpz-ant-Infektion verwendet werden können, alle Sequenzen umfassen, die aus dem SIVcpz-ant-Genom oder seinen natürlich auftretenden Varianten stammen und Sequenzen umfassen, die für die viralen Kernproteine (gag-Gen), zwei Formen der reversen Transkriptase und die Endonuclease (pol-Gen) sowie zwei virale Hüllglykoproteine (env-Gen) kodieren.
Die Erfindung betrifft auch SIVcpz-ant-Nucleinsäuresequenzen, die einer rekombinaten Nucleinsäure einverleibt worden sind, die eine Nucleinsäure aus einem Vektor umfaßt und die cDNA oder einen Teil der cDNA darin inseriert enthält. Ein derartiges Konstrukt wird zum Replizieren der viralen cDNA oder ihrer Fragmente in einem Organismus oder einer Zelle, die vom natürlichen Wirt verschieden ist, verwendet, um ausreichende Mengen der Sonde, die für diagnostische Zwecke verwendet werden soll, bereitzustellen.
Eine auf derartige Weise erzeugte Sonde kann bei einem diagnostischen Test zum spezifischen Nachweis von SIVcpz-ant eingesetzt werden, wobei der Test folgende essentielle Stufen umfaßt:
- Markieren der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen Sonde gemäß den vorstehend beschriebenen Methoden;
- Kontaktieren der Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit DNA aus infizierten Zellen oder viraler RNA aus infizierten Zellen oder biologischen Flüssigkeiten, sobald die DNA oder RNA vorzugsweise auf eine Membran aufgetragen worden ist und vorzugsweise für die Sonde zugänglich gemacht worden ist;
- Waschen der Membran mit einem Puffer auf solche Weise, daß die stringenten Bedingungen aufrechterhalten werden;
- Nachweis der markierten Sonde, vorzugsweise durch Autoradiographie in den Fällen, in denen die Sonde radioaktiv markiert worden ist, oder durch geeignete Immunnachweistechniken in den Fällen, in denen die Sonde chemisch markiert worden ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des SIVcpz-ant-Retrovirus, das durch Züchten menschlicher T4-Lymphozyten oder menschlicher lymphozytischer Zellinien mit Leukämie-Ursprung, die den T4&spplus;-Phänotyp tragen, mit Lymphozyten oder Zellinien, die zuvor mit einer Isolierung des SIVcpz-ant-Retrovirus infiziert worden sind, sowie durch die Gewinnung und Reinigung des Retrovirus aus dem Kulturmedium charakterisiert ist. Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen des SIVcpz-ant-Retrovirus, das durch Lysieren des Retrovirus, vorzugsweise mit einem Detergens, und Gewinnung des Lysats, das die Antigene enthält, charakterisiert ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung beliebiger SIVcpz-ant-Proteine oder -Glykoproteine oder der reversen Transkriptase, wie sie vorstehend definiert sind, oder eines Teils davon, wobei das Verfahren durch Inserieren der Nucleinsäure, die für die Proteine oder Glykoproteine kodiert, in einen Expressionsvektor, Transformieren eines Wirts mit dem Vektor, Züchten des transformierten Wirts sowie Gewinnung und Reinigung des exprimierten Proteins charakterisiert ist.
Das Verfahren umfaßt Vektoren, die die Synthese von Fusionsproteinen steuern oder nicht steuern können und umfaßt, ohne Beschränkung darauf, bakterielle Expressionsvektoren, Säugerexpressionsvektoren, wie Kuhpockenvirus. und Vektoren zur Expression der klonierten Gene in Insektenzellen, die auf dem Baculovirus basieren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SIVcpz-ant zur Entwicklung eines nicht-menschlichen Primatenmodells.
Die Entwicklung eines derartigen Modells kann z. B. auf folgende Weise erfolgen:
- verschiedene nicht-menschliche Primatenspezies werden mit dem Virus infiziert;
- den Tieren werden intravenös die Lymphozyten aus einem mit SIVcpz-ant infizierten Schimpansen injiziert, oder ihnen werden intravenös infizierte menschliche Zellen injiziert, die einen hohen Titer des SIVcpz-ant-Virus zeigen;
- eine persistente Infektion und ihre Konsequenzen werden durch klinische und biologische Nachuntersuchungen der infizierten Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht; verschiedene Parameter, die bewertet werden sollten, umfassen:
- Klinische Untersuchung:
- allgemeiner Zustand
- Lymphadenopathie
- verringerte Anzahl an CD4&spplus;-Lymphozyten
- Hepato- oder Splenomegalie
- Fieber, Gewichtsverlust
- Entwicklung von Symptomen von AIDS oder AIDS-ähnlichen Erkrankungen;
- Nachweis von Antikörpern, die spezifisch für SIVcpz-ant sind, durch Western-Blot oder RIPA unter Verwendung eines spezifischen SIVcpz-ant- Tests;
- Virusisolierung aus Lymphozyten oder Plasma und Messung der antigenen Beschaffenheit durch einen spezifischen SIVcpz-ant-Test;
- Bestimmung des Vorhandenseins neutralisierender Antikörper.
Wenn eine persistente Infektion mit oder ohne Entwicklung von AIDS auftritt, dann kann der infizierte Primat als potentielles Tiermodell für HIV-1 verwendet werden, das zum Testen von Vaccinen und antiviralen chemotherapeutischen Mitteln benutzt werden kann.
Die Bewertung von Vaccinen kann nach einer Anzahl beliebiger bekannter Techniken erfolgen, die alle von der Verabreichung einer immunogenen Zubereitung abhängen, die eines oder mehrere virale Proteine enthält, um die Bildung von Antikörpern oder cytotoxischen Lymphozyten zu induzieren, die imstande sind, einen Schutz gegen eine anschließende Belastung mit dem infektiösen Virus zu verleihen. Bevorzugte Verfahren zum Impfen umfassen die Verabreichung immunogener Zusammensetzungen oral oder durch Injektion, die Verabreichung abgetöteter oder abgeschwächter Viren, die Verwendung viraler Expressionsvektoren, wie Kuhpockenvirus, die SIVcpz-ant-Proteine exprimieren, und die orale Verabreichung abgeschwächter Bakterienstämme, die SIVcpz-ant-Proteine exprimieren oder absondern.
Antivirale chemotherapeutische Mittel können durch Verabreichung des Mittels gemäß einer Versuchsanleitung vor oder nach der Infektion des Primaten mit SIVcpz-ant bewertet werden. Die Wirksamkeit des Mittels bei der Verhinderung der Infektion oder der Hemmung der viralen Replikation kann bewertet werden, wie es vorstehend skizziert wurde.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung nicht-menschlicher Primaten, die persistent mit SIVcpz-ant infiziert sind, um neue Vaccine und antivirale Produkte gegen HIV zu bewerten. Insbesondere können antivirale chemotherapeutische Mittel in diesem System bewertet werden, indem die klinischen Symptome vor und nach der Verabreichung des Mittels verglichen werden. Die Bewertung umfaßt außer den klinischen Symptomen auch die Bestimmung der Spiegel an zirkulierendem viralen Antigen, die Einfachheit der Virusisolierung, die Bestimmung der Immunfunktion und die quantitative Bestimmung der Virusbelastung durch Einsatz geeigneter Primer und Sonden bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Beispiele

Materialien und Methoden

Virus und Zellkultur

A. Virusstämme und Zellinien

- HIV-1 (HTLV-IIIB), HIV-2-rod (3), SIVcpz-Gab&supmin;¹ (24), SIVMND-GB-1 (17), SIVAGM-TYO-1 (16) und SIVMAC (12) wurden zu Vergleichszwecken verwendet.
- Die Zellinien MOLT-4-Klon-8 (zur Verfügung gestellt von N. Yamamoto, Yamaguchi, Japan) und CEM-SS (zur Verfügung gestellt von P. Nara, Fredericksburg, Maryland, USA) wurden zur kontinuierlichen Virusherstellung verwendet.

B. Virusisolierungen

Lymphozyten aus den Schimpansen sowie aus gesunden Spendern wurden aus mit Heparin behandeltem Vollblut auf "Lymphoprep" (Nygaard und Co., Oslo, Norwegen) isoliert. Lymphozyten von gesunden Spendern wurden mit 0,5 ug/ml Phytohämagglutinin (PHA, Wellcome) in RPMI 1640-Medium (GIBCO) mit einem Gehalt an 20 millimolar Hepes, angereichert mit L-Glutamin (0,03 %/ml), 10 % fötalem Kälberserum und Gentamycin (100 ug/ml), stimuliert. 5 x 10&sup6; Lymphozyten aus dem Schimpansen wurden mit 5 x 10&sup6; PHA- stimulierten Spenderlymphozyten bei einer Endkonzentration von 1 x 10&sup6; Zellen pro ml in RPM 1640-Medium (GIBCO) mit einem Gehalt an 20 millimolar Hepes, angereichert mit L-Glutamin (0,03 %/ml), 10 % fötalem Kälberserum (GIBCO) Gentamycin (100 ug/ml), 2 ug/ml Polybrene (Aldrich) und 150 U/ml Interleukin-2, cokultiviert.
Das Medium wurden jeden dritten bis vierten Tag durch frisches Medium ersetzt, wobei zu diesem Zeitpunkt die Zellen gezählt und die Zellkonzentration auf 1 x 10&sup6; Zellen pro ml eingestellt wurde. Frische PHA-stimulierte Lymphozyten wurden den Isolierungskulturen zugegeben, wenn die Zellkonzentration abnahm. Jeden dritten bis vierten Tag wurden die Kulturen auch auf cytopathische Effekte und das Vorhandensein von Antigen im Kulturüberstand durch einen Antigeneinfangtest (Innogenetics oder Organon) und durch reverse Transkriptase-Aktivität untersucht.
Um chronisch infizierte, permanente Zellinien zu etablieren, wurden virusinfizierte primäre Lymphozytenkulturen mit MOLT-4-Klon-8- oder CEM- SS-Zellen cokultiviert. Die Virusbildung wurde durch die reverse Transkriptase-Aktivität sowie durch Antigeneinfangen verfolgt.

Differentielles Antigeneinfangen

Ein Testsystem wurde entwickelt, durch das zwischen HIV-1 und anderen verwandten menschlichen Immunschwächeviren unterschieden werden kann. Das System basiert auf einem Vergleich der Fähigkeit von zwei verschiedenen polyklonalen IgG-Zubereitungen, einer mit einer breiten anti-HIV-Spezifität, die ihre Ursache in einem außergewöhnlich hohen Titer, insbesondere gegen das hauptsächliche Kernprotein, hat, und einer mit einem geringeren Titer, die vorzugsweise mit HIV-1 reagiert, mit Detergens behandelte Viren in Kulturüberständen einzufangen. Der Nachweis des eingefangenen Antigens wird unter Verwendung eines IgG-Meerrettichperoxidase-Konjugats mit einer breiten Spezifität durchgeführt. Der Test weist hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, das p24-Kernprotein nach.

Monoklonale Antikörper gegen HIV-1

8 von 15 verwendeten monoklonalen Antikörpern sind beschrieben worden (26), und die restlichen monoklonalen Antikörper wurden von Innogenetics hergestellt. Die Antikörper wurden gegen native virale Proteine in mit Triton X-100 aufgebrochenen HIV-1-Zubereitungen hergestellt.

Proteinanalyse

A. Elektrophorese

Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese der viralen Proteine wurde, im wesentlichen wie von Maizel (27) beschrieben, durchgeführt.

B. Protein-Blot

Blots wurden in einer Bio-Rad-Transblot-Zelle bei 400 mA für 4 Stunden unter Verwendung von Carbonatpuffer durchgeführt, wie von Dunn (28) beschrieben. Elektronenmikroskopie Mit SIVcpz-ant infizierte MOLT-4- und CEM-SS-Zellen wurden mit Glutaraldehyd in Kakodylatpuffer fixiert, mit Osmiumtetroxid kontrastiert und in Epon eingebettet. Dünne Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert und mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop untersucht.

Radioimmunpräzipitationsassay

Infizierte Zellen wurden metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin über Nacht bei 37ºC (200 uCi/ml bei 4 x 10&sup6; Zellen/ml) markiert. Nach dem Sammeln der Überstände und der Zellen wurden die Viren pelletiert und anschließend in einem Lysepuffer (0,02 m Tris, pH-Wert 7,6; 0,15 m NaCl, 0,05 m KCl; 0,001 millimolar EDTA; 0,2 millimolar PMSF; 0,05 % Aprotinin; 1 % β-Mercaptoethanol und 2 % Triton X-100) lysiert. Die verdünnten Viren (das Virusäquivalent von 2 x 10&sup6; gewonnenen Zellen) wurden anschließend mit 10 ul Serum für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert. Immunkomplexe wurden an Protein A-Sepharose bei 4ºC über Nacht adsorbiert. Nach Waschen wurden die Immunkomplexe mit einem Sammelpuffer mit einem Gehalt an 1 % SDS (Natriumdodecylsulfat) und β-Mercaptoethanol eluiert und 3 Minuten auf 100ºC erwärmt. Sie wurden dann einer Elektrophorese auf einem 12,5 %-igen oder 10 %-igen SDS-Polyacrylamidgel unterworfen (SDS-PAGE). Mit ³&sup5;S-Methionin markierte Proteine wurden durch Fluorographie und Autoradiographie nachgewiesen.

Serologie

Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2 wurden durch einen handelsüblichen Festphasen-Enzymimmunoassay (HIV-1 + 2 ELISA, Behring) untersucht. Zur Bestätigung wurden handelsübliche HIV-1-Western-Blots (DuPont de Nemours) und HIV-2-Western-Blots (Diagnostics Pasteur) durchgeführt.

Ergebnisse

Serologie

Serum von dem Schimpansen war positiv (Verhältnis OD/Grenzwert = 6) im Festphasen-Enzymimmunoassay. Auf einem handelsüblichen HIV-1-Western- Blot (DuPont de Nemours) waren klare Banden bei p24, p34, gp41, gp120 und gp160 und nur schwache Banden bei p55 und p68 sichtbar. Titer des Schimpansenserums im Hinblick auf verschiedene HIV-1-Antigene bei einem handelsüblichen Western-Blot (DuPont de Nemours) sind in Fig. 1 gezeigt.
p24 : 1/1000; p34 : 1/1000; gp41 : 1/50 000; gp120 : 1/10 000; gp160 : 1/100 000.

Virusisolierung

Das Virus wurde durch Cokultivieren von Schimpansenlymphozyten mit PHA-stimulierten Lymphozyten aus gesunden, nicht-infizierten menschlichen Spendern isoliert. Nach 13-tägiger Kultur wurde das Virus in der Kultur nachgewiesen, und zwar aufgrund eines positiven Antigeneinfangtests (Innogenetics, Organon). Das Vorhandensein von reverser Transkriptase im Kulturüberstand wurde ebenfalls nachgewiesen. Bei den Lymphozyten wurden keine cytopathischen Effekte unter Bildung von Riesenzellen beobachtet. Zellfreie Kulturüberstände wurden zur Übertragung des Virus auf frische Lymphozyten verwendet. Nach 7 Tagen wurde ein positiver Antigeneinfangtest beobachtet, und reverse Transkriptase-Aktivität wurde im Überstand nachgewiesen. Es wurde ein Versuch unternommen, das Virus auf eine permanente Zellinie durch Cokultivieren von SIVcpz-ant-infizierten primären Lymphozyten mit MOLT-4-Klon-8- und CEM-SS-Zellen zu übertragen.
Bei Verwendung der CEM-SS-Zellinie wurde reverse Transkriptase-Aktivität nach 7 Tagen nachgewiesen, und er Kulturüberstand war positiv beim Antigeneinfangtest. Bei den MOLT-4-Klon-8-Zellen war der Antigeneinfangtest nach nur 5 Tagen des Cokultivierens positiv. Bei diesen Zellinien wurden keine typischen cytopathischen Effekte unter Bildung von Riesenzellen beobachtet.

Charakterisierung viraler Proteine

Viren im Kulturüberstand wurden über Nacht durch Zentrifugation bei 19 000 U/min bei 4ºC in einem Beckman-Rotor 19Ti pelletiert. Die pelletierten Viren wurden in SDS-Sammelpuffer dissoziiert und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließenden Protein-Blot analysiert. In Fig. 2 sind Western-Blot-Streifen von HIV-1, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant gezeigt.
Jedes Viruslysat wurde mit einem homologen Serum, d. h. HIV-1 mit einem HIV-1-Antikörper-positiven Serum, SIVcpz-Gab mit einem Serum des gleichen Tiers, aus dem das Virus isoliert wurde, und SIVcpz-ant mit Serum von dem Schimpansen, aus dem das Virus isoliert wurde, umgesetzt.
Aus der Figur ist ersichtlich, daß die Molekulargewichte der SIVcpz-ant-Genprodukte sich von denen von HIV-1 und SIVcpz-Gab unterscheiden. Ein Vergleich der Molekülgrößen der Proteine ist in Tabelle 1 gezeigt.
Die wichtigsten Unterschiede sind die Molekulargewichte des hauptsächlichen Kernproteins (p27 gegenüber p25 für HIV-1 und p25,5 für SIVcpz-Gab) und das Molekulargewicht der externen Glykoproteine. Bei der für die Vermehrung der Viren (HIV-1, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant) verwendeten Zellinie handelte es sich um die MOLT-4-Klon-8-Zellinie; dies bedeutet, daß die Unterschiede, die zwischen den drei Viren beobachtet wurden, nicht durch unterschiedliche Zellinien beeinflußt sind.
Außer durch Western-Blot können virale Proteinantigene auch durch Radioimmunpräzipitation (RIPA) sichtbar gemacht werden. Zu diesem Zweck wurden MOLT-4-Klon-8-Zellen mit den Viren infiziert, und die viralen Proteine wurden metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin markiert. Markierte Viren wurde aus den Überständen und den Zellen gewonnen. In Fig. 3 ist ein RIPA von HIV-1, SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant gezeigt. Die markierten Viren wurden aus den Zellüberständen gewonnen, und jedes Virus wurde mit einem homologen Serum gefällt. Wie bei den Western-Blots beobachtet wurde, ist ersichtlich, daß sich die Molekulargewichte der SIVcpz-ant-Genprodukte von denen der HIV-1- und SIVcpz-Gab-Genprodukte unterscheiden. Das hauptsächliche Kernprotein und die externen Glykoproteine von SIVcpz-ant weisen höhere Molekulargewichte als die entsprechenden Proteine von HIV-1 und SIVcpz-Gab auf.
In Fig. 4 ist ein RIPA von verschiedenen HIVs und SIVs gezeigt, die jeweils mit einem homologen Serum gefällt wurden, um die Unterschieden zwischen den Viren besser zu bestimmen, d. h. HIV-1-Virus + HIV-1-Antikörper-positives Serum, SIVcpz-Gab mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde, SIVcpz-ant mit Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde, HIV-2 mit einem HIV-2-Antikörper-positiven Serum, SIVAGM-TYO mit einem SIVagm-Antikörper-positiven Serum, SIVMND mit einem SIVMND-Antikörper-positiven Serum und SIVmac mit einem SIVmac-Antikörper- positiven Serum. Die Figur zeigt wiederum die Unterschiede hinsichtlich der Molekulargewichte.

Kreuzreaktivität von monoklonalen Antikörpern aus Maus gegen HIV-1- p24-Kernprotein

Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern aus Mäusen (MAbs), die gegen das HIV-1-p24-Kernprotein hergestellt worden waren, wurde auf ihre Fähigkeit zur Kreuzreaktion mit HIV-1-, HIV-2-, SIVmnd-, SIVAGM- und SIVcpz-ant-Isolierungen untersucht. Im Prinzip kann eine beliebige Reihe von monoklonalen anti-HIV-1-p24-Antikörpern verwendet werden, so lange die Reihe monoklonale Antikörper umfaßt, die mit verschiedenen Epitopen auf dem HIV-1-p24-Molekül reagieren. Die Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit wurde verdünnt und zum Beschichten von Mikrotitrationsplatten verwendet. Mit Detergens behandelte, Viren enthaltende Überstände wurden dann auf die beschichteten Platten gegeben. Gebundenes Antigen wurde unter Verwendung von anti-HIV-IgGs mit breiter Spezifität, die an Meerrettichperoxidase konjugiert waren, nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
In Kontrollvertiefungen, die mit polyklonalen IgGs mit einem breiten Spektrum beschichtet worden waren, ergaben alle Viren enthaltenden Überstände optische Dichten, die die Grenzen des Mikrotitrationsplatten-Lesegeräts überschritten. Beim Test in Vertiefungen, die mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern beschichtet worden waren, ergab sich jedoch ein recht verschiedenes Muster. Vorherige Untersuchungen zeigten, daß die getesteten MAbs mit wenigstens 7 Epitopen auf dem p24-Molekül reagierten.
Die SIVcpz-ant-Isolierung zeigt die schwächste Reaktion mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern, die untersucht wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß sich SIVcpz-ant von anderen untersuchten HIV/SIVs hinsichtlich des p24-Antigens unterscheidet.

Serologische Kreuzreaktionen

Die antigene Beziehung zwischen SIVcpz-ant und den anderen HIV/SIVs ist im wesentlichen in den nachstehenden Beispielen erläutert. SIVcpz-ant ist näher verwandt zu HIV-1 und SIVcpz-Gab, da ein SIVcpz-ant-Antiserum eine Kreuzreaktion mit den gag-, pol- und env-Produkten dieser Viren und nur mit den Kernproteinen der anderen Viren (HIV-2, SIVmac SIVAGM und SIVmnd) zeigt. Seren mit Antikörpern gegen HIV-2, SIVmac, SIVAGM und SIVmnd zeigen nur eine Kreuzreaktion mit Kernproteinen von SIVcpz-ant.
Nur anti-SIVcpz-Seren (SIVcpz-ant und SIVcpz-Gab) reagieren mit den gag-, pol- und env-Produkten von SIVcpz-ant. Unter den 25 HIV-1-positiven Seren zeigen alle Seren eine Kreuzreaktion mit gag- und pol-Antigenen, 5 reagieren schwach mit gp41 und nur ein Serum reagiert mit der gp120-Bande von SIVcpz-ant. Das Serum, das mit der gp120-Bande reagiert, stammt aus einer Frau aus Kamerun, aus der ein atypisches HIV-1-Virus isoliert wurde.

Diskussion

Ein neues Immunschwächevirus ist aus einem in der Wildbahn geborenen Schimpansen isoliert worden. Das Tier wurde nie experimentell infiziert und erhielt nie menschliche Blutprodukte. Das Tier ist bei guter Gesundheit und zeigt tatsächlich keine Anzeichen von AIDS oder einer AIDS-ähnlichen Erkrankung.
Das Virus scheint nahe verwandt zu HIV-1 auf der Grundlage der serologischen Kreuzreaktion von SIVcpz-ant-positivem Serum mit HIV-1-Antigenen bei Western-Blots zu sein.
Es gibt jedoch mehrere Argumente, die darauf hinweisen, daß das Virus sich von HIV-1 unterscheidet.
- die unterschiedlichen Molekulargewichte der viralen Proteine;
- ein unterschiedliches Muster der Kreuzreaktivität mit anti-HIV-1- Antiserum als bei HIV-1;
- eine drastisch verringerte Fähigkeit, durch monoklonale Antikörper aus Mäusen erkannt zu werden, die gegen p24-Kernproteine erzeugt wurden.
SIVcpz-ant unterscheidet sich auch von der anderen Schimpansenisolierung aus Gabun (SIVcpz-Gab) auf der Grundlage der unterschiedlichen Molekulargewichte der viralen Proteine.

Fig. 1

Reaktivität von 3 positiven Schimpansenseren mit verschiedenen HIV-1- Antigenen bei einem handelsüblichen Western-Blot (DuPont de Nemours).

Serum 1: Serum aus dem Tier, aus dem SIVcpz-Gab isoliert wurde.
Serum 2: Serum aus dem Tier, aus dem SIVcpz-ant isoliert wurde.
Serum 3: Serum aus einem zweiten Schimpansen aus Gabun, aus dem kein Virus isoliert werden konnte.

Fig. 2

Vergleich der gag-, pol- und env-Proteine von HIV-1 (HTLV-IIIB), SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant durch Western-Blot.

Die viralen Lysate wurden auf dem gleichen Polyacrylamidgel (10 %) getrennt. Jedes Virus wurde mit einem homologen Serum umgesetzt.
Spur 1: HIV-1 (HTLV-IIIB) mit einem HIV-1-positiven Serum.
Spur 2: SIVcpz-Gab mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde.
Spur 3: SIVcpz-ant mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde.

Fig. 3

Vergleich der gag-, pol- und env-Proteine von HIV-1 (HTLV-IIIB), SIVcpz-Gab und SIVcpz-ant durch Radioimmunpräzipitation (RIPA).

Die viralen Proteine wurden auf einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel getrennt. Jedes Virus wurde mit einem homologen Serum gefällt.
Spur 1: HIV-1 (HTLV-IIIB) mit einem HIV-1-Antikörper-positiven Serum.
Spur 2: SIVcpz-ant mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde.
Spur 3: SIVcpz-Gab mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde.

Fig. 4

Vergleich von Proteinen aus verschiedenen HIVs und SIVs durch RIPA.

Die viralen Proteine wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel getrennt. Jedes Virus wurde mit einem homologen Serum umgesetzt.
Spur 1: HIV-1 (HTLV-IIIB) mit einem HIV-1-Antikörper-positiven Serum.
Spur 2: SIVcpz-ant mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde.
Spur 3: SIVcpz-Gab mit dem Serum aus dem Tier, aus dem das Virus isoliert wurde.
Spur 4: HIV-2-rod mit einem HIV-2-Antikörper-positiven Serum.
Spur 5: SIVAGM-TYO mit einem SIVAGM-Antikörper-positiven Serum.
Spur 6: SIVMND-GB-1 mit einem SIVMND-Antikörper-positiven Serum.
Spur 7: SIVMAC' mit einem SIVMAC'-Antikörper-positiven Serum.

Fig. 5

Antigeneinfangen bei verschiedenen Virusisolierungen unter Verwendung menschlicher polyklonaler Antikörper und monoklonaler anti-HIV-1-p24-Antikörper aus Maus.

HIV-1 (HTLV-IIIB)
HIV-2-rod
SIVMND-GB-1
SIVAGM-TYO
SIVcpz-ant

Fig. 6a

Mit ³&sup5;S-Methionin markiertes HIV-2-rod wurde mit verschiedenen Seren gefällt.
Spur 1: SIVcpz-ant-Antikörper-positives Serum.
Spur 2: SIVcpz-Gab-Antikörper-positives Serum.
Spur 3: Serum aus dem zweiten positiven Schimpansen aus Gabun, aus dem kein Virus isoliert werden konnte.
Spur 4: HIV-1-Antikörper-positives Serum.
Spur 5: HIV-2-Antikörper-positives Serum.

Fig. 6b

Mit ³&sup5;S-Methionin markiertes SIVMND-Gab-1 wurde mit verschiedenen Seren gefällt.
Spur 1: SIVcpz-ant-Antikörper-positives Serum.
Spur 2: SIVcpz-Gab-Antikörper-positives Serum.
Spur 3: Serum aus dem zweiten Schimpansen aus Gabun, aus dem kein Virus isoliert werden konnte.
Spur 4: HIV-1-Antikörper-positives Serum.
Spur 5: HIV-2-Antikörper-positives Serum.
Spur 6: SIVAGM-Antikörper-positives Serum.
Spur 7: SIVMND -Antikörper-positives Serum.

Fig. 6c

Western-Blot-Streifen mit SIVcpz-ant-Antigen wurden mit verschiedenen Seren inkubiert.
Spur 1: SIVcpz-ant-Antikörper-positives Serum.
Spur 2: SIVcpz-Gab-Antikörper-positives Serum.
Spur 3: Serum aus dem zweiten positiven Schimpansen aus Gabun, aus dem kein Virus isoliert werden konnte.
Spur 4: Serum von einer Frau aus Kamerun, aus der ein atypisches HIV- 1 (HIV-1ant70) isoliert wurde.
Spur 5 bis Spur 14: HIV-1-Antikörper-positive Seren.

Fig. 7

Elektronenmikroskopischer Nachweis (x 27 000) des Vorhandenseins des SIVcpz-ant-Virions.

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Claims

1. SIVcpz-ant-Retrovirus oder Varianten dieses Virus mit den essentiellen morphologischen Eigenschaften des Retrovirus, der bei der European Collection of Animal Cell Gultures (EGACC) unter der Nr. V 900 61 322 hinterlegt ist, wobei die essentiellen morphologischen und immunologischen Eigenschaften nachstehend angegeben sind:

- das Virus zeigt einen Tropismus für T4-Lymphozyten;

- das Virus zeigt keine typischen cytopathischen Wirkungen unter Bildung von Riesenzellen bei Lymphozyten, die es infiziert;

- das Virus weist einen Durchmesser von ungefähr 130 nm auf;

- das Virus besitzt eine von Magnesium abhängige reverse Transkriptase-Aktivität;

- es kann in T4-Rezeptoren tragenden unsterblichen Zellinien kultiviert werden,

- Lysate des Virus enthalten ein p27-Protein, das sich immunologisch vom p25-Protein von HIV-1, vom p25,5-Protein von SIVcpz-Gab und vom p19- Protein von HTLV-1 unterscheidet, was durch Western-Blot und Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) festgestellt wird;

- Lysate des Virus enthalten ein gp140-Protein, das sich immunologisch von gp120 von HIV-I, von gp130 von SIVcpz-Gab und von gp110 von HTLV-1 unterscheidet, was durch Western-Blot-Analyse festgestellt wird;

- das Lysat des Virus enthält außerdem ein Transmembranglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 44 bis 50 kDa, das sich immunologisch von dem Protein mit 41-45 kDa von HIV-1 und von dem Protein mit 42-46 kDa von SIVcpz-Gab unterscheidet, was durch Western-Blot festgestellt wird; und

- das Lysat des Virus enthält ein p34-Protein, das sich immunologisch von p32 von SIVcpz-Gab unterscheidet, was durch Western-Blot festgestellt wird.

2. Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Antigen, insbesondere ein Protein oder Glykoprotein, des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Gesamtextrakt oder ein Gesamtlysat des Retrovirus enthält.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eines der inneren Kernproteine des Retrovirus enthält.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eines der Hüllproteine des Retrovirus enthält.

6. Antigen, das für eine einzelne Bande bei der Polyacrylamidgel- Elektrophorese sorgt, wobei das Antigen, in Übereinstimmung mit einem der gereinigten Antigene des SIVcpz-ant-Retrovirus von Anspruch 1, ein Epitop umfaßt, das durch Serum eines Primaten erkannt wird, der anti-SIVcpz-ant- Antikörper trägt.

7. Gereinigtes Antigen des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1.

8. Antigen nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Antigen um das p27-Protein (das gag-Protein) handelt, wobei das Antigen erhalten wurde, indem das durch SIVcpz-ant gebildete Proteingemisch einer Gelelektrophorese unterworfen und das p27-Protein in einer als solchen bekannten Weise isoliert wurde.

9. Antigen nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Antigen um das p34-Protein (die Endonuclease) handelt, wobei das Antigen erhalten wurde, indem das durch SIVcpz-ant gebildete Proteingemisch einer Gelelektrophorese unterworfen und das p34-Protein in einer als solchen bekannten Weise gewonnen wurde.

10. Antigen nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Antigen um das gp44-50-Protein (das Transmembranprotein) handelt, wobei das Antigen erhalten wurde, indem das durch SIVcpz-ant gebildete Proteingemisch einer Gelelektrophorese unterworfen und das gp44-50-Protein in einer als solchen bekannten Weise isoliert wurde.

11. Antigen nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Antigen um das gp140-Protein (das Außenmembranprotein) handelt, wobei das Antigen erhalten wurde, indem das von SIVcpz-ant erhaltene Proteingemisch einer Gelelektrophorese unterworfen und das gp140-Protein in einer als solchen bekannten Weise isoliert wurde.

12. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen SIVcpz-ant-, HIV-1- oder HIV-2-Retroviren in einer biologischen Flüssigkeit, wie einem Serum oder einer Spinalflüssigkeit, insbesondere zur Diagnose eines möglichen oder bestehenden ARC oder AIDS, verursacht durch das SIVcpz-ant-, HIV-1- oder HIV-2-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit des Primaten, für den eine Diagnose erstellt werden soll, mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 6 bis 11 in Kontakt gebracht wird, und daß das gebildete immunologische Konjugat zwischen den anti-SIVcpz-ant-, anti- HIV-1- oder anti-HIV-2-Antikörpern und dem verwendeten Antigen/den verwendeten Antigenen nachgewiesen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis des immunologischen Konjugats durch Umsetzung des immunologischen Konjugats mit einem markierten Reagens, das unter anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörpern oder dem bakteriellen Protein A oder Protein G ausgewählt ist, und Nachweis des zwischen dem Konjugat und dem Reagens gebildeten Komplexes erreicht wird.

14. Reagenssatz zum Nachweis von anti-SIVcpz-ant-, anti-HIV-1- oder anti-HIV-2-Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit, umfassend

- eine Zusammensetzung, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist, oder ein Antigen, wie es in einem der Ansprüche 6 bis 11 definiert ist, und

- Mittel zum Nachweis des gebildeten immunologischen Komplexes.

15. Reagenssatz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Nachweis des immunologischen Komplexes ein anti-Mensch-Immunglobulin/anti-Mensch-Immunglobuline oder Protein A und ein Mittel zum Nachweis des zwischen den anti-SIVcpz-ant-, anti-HIV-1- oder anti-HIV-2- Antikörpern, die im nachgewiesenen immunologischen Konjugat enthalten sind, gebildeten Komplexes umfaßt.

16. Immunogene Zusammensetzung, enthaltend ein Hüllglykoprotein des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1 oder einen Teil des Glykoproteins in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, der sich zur Konstitution von Vaccinen, die wirksam gegen SIVcpz-ant, HIV-1 oder HIV-2 sind, eignet.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Teil eines Glykoproteins, das das Proteingrundgerüst des Hüllproteins oder eines Teil davon umfaßt, wie es in einem der Ansprüche 10 oder 11 definiert ist.

18. Monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen die Antigene erzeugt wurden, wie sie in einem der Ansprüche 8 bis 11 definiert sind.

19. Hybridome, die die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 18 absondern.

20. Nucleinsäuren oder Fragmente davon, die wahlweise markiert sind und aus RNA des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1 abgeleitet sind.

21. Nucleinsäure nach Anspruch 20, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Teil der cDNA, die der gesamten genomischen RNA des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1 entspricht.

22. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu einer rekombinanten Nucleinsäure umgesetzt wird, die eine Nucleinsäure aus einem Vektor mit der cDNA oder einem Teil der cDNA darin inseriert umfaßt.

23. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie markiert ist.

24. Verfahren zum Nachweis des SIVcpz-ant-Retrovirus oder seiner RNA in einer biologischen Flüssigkeit oder einem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure, die in der biologischen Probe oder dem Gewebe vorhanden ist, mit einer Sonde in Kontakt gebracht wird, die eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 20 bis 23 enthält, und zwar unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, daß das gebildete Hybrid mit einer Lösung unter Aufrechterhaltung der stringenten Bedingungen gewaschen wird und daß das gebildete Hybrid nachgewiesen wird.

25. Verfahren zur Herstellung des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Züchten menschlicher T4-Lymphozyten oder permanenter Zellinien, die daraus abgeleitet wurden und die den T4-Phänotyp aufweisen, mit Lymphozyten oder Zellinien, die zuvor mit einer Isolierung des SIVcpz-ant-Retrovirus infiziert wurden, sowie Gewinnung und Reinigung des Retrovirus aus dem Kulturmedium.

26. Verfahren zur Herstellung von Antigenen des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Lyse des Retrovirus und Gewinnung des Lysats, das die Antigene enthält.

27. Verfahren zur Herstellung einer Hybridisierungssonde zum Nachweis von RNA des SIVcpz-ant-Retrovirus nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Insertion der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 20 bis 23 in einen Klonierungsvektor durch in vitro-Rekombination, Klonieren des erhaltenen modifizierten Vektors in einen geeigneten zellulären Wirt und Gewinnung der Hybridisierungssonde.

28. Verfahren zum Nachweis von Antigen von SIVcpz, gekennzeichnet durch Beschichten einer Oberfläche mit einer Immunglobulinfraktion, die gegen SIVcpz-ant nach Anspruch 1 erzeugt wurde, Kontaktieren einer zu analysierenden Körper- oder Kulturflüssigkeit mit den Immunglobulinen und Nachweis der zwischen den Immunglobulinen und dem Antigen gebildeten Komplexe.

29. Verwendung eines Modellsystems, bestehend aus nicht-menschlichen Primaten, die persistent mit SIVcpz-ant nach Anspruch 1 infiziert sind, bei einem Verfahren zur Simulierung von HIV-Infektionen in Menschen.

30. Verwendung des Modellsystems nach Anspruch 29 bei einem Verfahren zur Bewertung möglicher HIV-Vaccine.

31. Verwendung des Modellsystems nach Anspruch 29 bei einem Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit antiviraler chemotherapeutischer Mittel.