Hintergrund der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft allgemein Agenzien und Verfahren zur
Vorbeugung und Behandlung retroviraler Erkrankungen und
insbesondere eine virale Präparation ohne äußere Hülle zur Verwendung
bei der Vakzinierung gegen Human Immunodeficiency Virus und die
Immuntherapie desselben.
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Das erworbene Immunschwächesyndrom (Acquired Immune Deficiency
Syndrom), auch als AIDS bekannt, wurde als moderne Seuche
beschrieben. In den sieben Jahren seit seiner ersten Beschreibung
im Jahre 1981 hat es nahezu 60 000 Opfer gefordert, und es war
alleine in den Vereinigten Staaten der Grund für mehr als 32 000
Todesfälle. Jedoch sind die wiklichen Auswirkungen der Kranheit
erst jetzt zu spüren. Das Virus kann in infizierten Individuen
für fünf oder mehr Jahre latent bleiben, bevor Symptome
auftreten. Viele Amerikaner können ohne ihr Wissen infiziert sein und
können andere infizieren, die mit ihren Körperflüssigkeiten in
Kontakt kommen könnten. Somit werden die persönlichen, sozialen
und ökonomischen Auswirkungen von AIDS enorm sein, sofern nicht
Einhalt geboten wird.
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Das verursachende Agens von AIDS ist das Retrovirus Human
Immunodeficiency Virus (HIV). Retroviren zeichnen sich durch die
Tatsache aus, daß ihr genetisches Material, das RNA ist, die
Information für die virale Replikation kodiert. Bei Infektion
einer Wirtszelle, wirkt es als Templat für die Transkription in
DNA, welche von einem als reverse Transkriptase bezeichneten
Enzym katalysiert wird. Die so hergestellte DNA dringt in den
Zellkern ein, wo sie als Provirus in die Wirts-DNA integriert
wird. Bei geeigneter Aktivierung wird die retroviral-abgeleitete
DNA transkribiert und zur Herstellung von RNA-enthaltenden
Virionen translatiert, die dann durch einen Knospungsprozeß aus
der Zelle freigesetzt werden.
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Bestimmte Viren, einschließlich Retroviren, können über Monate
oder Jahre hinweg in einem latenten Status verbleiben, bevor sie
aktiviert werden und Virionen produziert werden. Auch wenn ein
Wirt asymptomatisch ist, kann er trotzdem das Virus in einer
proviralen Form beherbergen und somit möglicherweise das Risiko
einer Erkrankung oder das der Infektion anderer tragen.
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Wenn ein Individuum mit HIV infiziert wird, bindet das Virus
vorzugsweise an eine als T4-Lymphozyten bezeichnete Zellklasse,
die durch das Vorhandensein eines als CD4 bezeichneten
Zelloberflächen-Markers gekennzeichnet ist, und es dringt in sie ein.
Diese weißen Blutzellen spielen eine integrale Rolle im
Immunsystem, da sie als kritische Komponenten sowohl einer humoralen
als auch zellulären Immunantwort wirken. Ein Großteil des
zerstörerischen Effekts von HIV kann der Unterdrückung der Funktion
oder der Zerstörung von T4-Lymphozyten zugeschrieben werden.
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Das intakte HIV-Virion ist annähernd rund und hat einen
Durchmesser von ungefähr 110 nin. Das Virion besitzt eine äußere
Membran, die mit Knöpfen oder Dornen bedeckt ist, die aus dem
Glykoprotein gp160/120 bestehen. Zusätzlich existiert ein als gp41
bezeichnetes Transmembran-Protein. Im Innern des Virions gibt es
zwei Struktur-Proteine: eine äußere Schale, die aus dem
Phosphoprotein p17 zusammengesetzt ist und ein aus dem Phosphoprotein
p24 bestehendes inneres Nukleoid oder Zentralkern. Die virale
RNA liegt im Innern des Kerns zusammen mit zwei Kopien des
Enzyms Reverse Transkriptase, p66/51, vor, das zur Synthese
viraler DNA aus dem RNA-Templat erforderlich ist. Eine schematische
Darstellung von HIV ist in Figur 1 gezeigt.
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Wie in Figur 2 gezeigt, kodiert das HIV RNA-Genom drei
Haupt-Strukturgene: gag, pol und env, die an jedem Ende durch long
terminal repeat (LTR)-Sequenzen flankiert sind. Das gag-Gen
kodiert für die gruppenspezifischen Kern-Proteine p55, p39, p24,
p17 und p15. Die pol-Gene kodieren für die Reverse Transkriptase
p66/p51 und die Protease p31. Die env-Gene kodieren das äußere
Hüll-Glykoprotein gp120 und dessen Vorläufer gp160 und das
Transmembran-Glykoprotein gp41. Einige der Gene, insbesondere
die env-Gene, neigen dazu, höchst variabel zu sein. Zusätzlich,
gibt es fünf andere Gene, die andere Retroviren nicht gemeinsam
haben, die entweder an der Regulation der Transkription oder
Translation beteiligt sind oder andere Strukturproteine
kodieren. Das gesamte HIV-Genom wurde nunmehr sequenziert. Vergleiche
Ratner et al., Nature 313:277 (1985).
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Das HIV bindet an Wirtszellen durch eine Interaktion der Hüll-
Glykoproteine mit einem Zell-Oberflächenrezeptor. Es scheint,
daß bei Kontakt von HIV mit einer T4-Zelle gp120 mit dem CD4-
Rezeptor wechselwirkt. Die virale Hülle verschmilzt dann mit der
Zellmembran und der innere Kern des Virus dringt in die
infizierte Zelle ein, wo die Transkription der RNA in ein
DNA-Provirus durch Reverse Transkriptase katalysiert wird. Das Provirus
kann in der Zelle für einige Monate oder Jahre in einer latenten
Form verbleiben, wobei das infizierte Individuum während dieser
Zeit asymptomatisch ist. Wenn das Virus jedoch später aktiviert
wird, was eine virale Replikation und Immunsuppression
verursacht, wird das Individuum dann für die mit AIDS assoziierten
opportunistischen Infektionen, einschließlich Krebs, anfällig.
Andere humane Retroviren besitzen äußere Hüll-Proteine.
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Bislang ist keine Vakzine oder eine Behandlung bekannt, die
gegenüber dem AIDS-Syndrom wirksam ist. Versuche, Vakzinen zu
entwickeln, sind bislang gescheitert. Bis heute wurde ein Teil
des HTLV-III (HIV)-Genoms erfolgreich kloniert und in Form eines
15K-Peptid exprimiert. Das 15K-Peptid detektierte
anti-HIV-Antikörper in von AIDS-Patienten isolierten Seren; Nature 315:151
(1985). Bestimmte Antikörper, die mit HIV reagieren, vor allem
anti-gp160/120 und Virus-neutralisierende Antikörper, sind
sowohl während der asymptomatischen als auch der symptomatischen
Phasen der HIV-Infektion in hohen Anteilen präsent, was
nahelegt, daß solche Antikörper, statt eine protektive Rolle zu
spielen, eigentlich das Binden und die Penetration des Virus in
die Wirtszelle hinein fördern können.
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Es existiert somit ein Bedarf an effektiven Reagenzien, die zur
Vorbeugung und Therapie retroviraler Infektionen, insbesondere
der auf HIV zurückzuführenden, verwendet werden. Die vorliegende
Erfindung löst diese Aufgabe und beinhaltet ferner entsprechende
Vorteile.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein nicht-infektiöses Immunogen
zur Verfügung, das retrovirale Partikel enthält, die keine
äußeren Hüll-Proteine besitzen, oder das ausgewählte Antigene
enthält, die aus einem Retrovirus isoliert wurden. In einer
Hinsicht ist das Immunogen letztlich zur Immunisierung eines
Individuums nützlich, das mit einem Retrovirus, einschließlich HIV,
infiziert ist, um immunprotektive Faktoren zu induzieren, die
einer Progression der Infektion vorbeugen. Ferner ist das
Immunogen nützlich zur Vakzinierung eines Individuums, das zuvor
nicht mit HIV infiziert worden ist, um einer späteren Infektion
vorzubeugen. Ferner wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt,
mit dem ein virales Immunogen nicht-infektiös gemacht wird. Das
Immunogen kann auch zur Herstellung von Antikörpern zur passiven
Immuntherapie, entweder alleine oder in Verbindung mit aktiver
Immuntherapie, in Individuen verwendet werden, die mit einem
Retrovirus, einschließlich HIV, infiziert sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Figur 1 ist eine schematische Darstellung von HIV, die das
Arrangement der verschiedenen Gen-Produkte zeigt.
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Figur 2 ist eine Darstellung der HIV-Gene und der darin
kodierten Gene-Produkte.
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Figur 3 ist eine schematische Darstellung des Anteils
bestimmter Antikörper und Antigene, die bei der Progression
von einem asymptomatischen Status bis zum ARC und zu
AIDS in HIV-seropositiven Individuen, der HIV-Infektion
bis zu AIDS, vorhanden sind.
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Figur 4 zeigt Western Blots des nach Beispiel 1 hergestellten
Immunogens, die beim Screening mit homologen und
heterologen Seren, die hohe Antikörper-Titer für die
äußeren Hüll-Proteine enthalten, zeigen, daß das Immunogen
keine äußeren Hüll-Proteine enthält. A: Kommerzielle
HIV Western Blot-Streifen, die mit heterologen
Schimpansen-Seren gescreent wurden; B: Western Blot-Streifen
mit Immunogen, der mit heterologen Schimpansen-Seren
gescreent wurden; C: kommerzielle HIV Western Blot-
Streifen, die mit homologen Human-Seren gescreent
wurden; D: Western Blot-Streifen mit Immunogen, die mit
homologen Human-Seren gescreent wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung stellt ein wirksames Mittel bereit zur Vorbeugung
einer HIV-Infektion und eines nachfolgenden, durch HIV
verursachten AIDS Related Complex (ARC) und AIDS und zur Behandlung
nach Exposition, um die Progression retroviraler Infektionen,
einschließlich HIV, zu hemmen. Individuen, die dem HIV-Virus
ausgesetzt waren, exprimieren in ihrem Serum bestimmte für HIV
spezifische Antikörper. Diese Individuen werden als
HIV-"seropositiv" bezeichnet, im Gegensatz zu Individuen, die "seronegativ"
sind. Das Vorliegen HIV-spezifischer Antikörper kann durch
kommerziell erhältliche Assay-Systeme ermittelt werden. Der Anteil
dieser Antikörper ist ein Indiz für die Progression des AIDS-
Syndroms.
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In Figur 3 ist schematisch gezeigt, daß hohe Anteile an Anti-
gp160/120 (äußere Hülle)-Antikörpern, die in der
asymptomatischen
Phase der HIV-Infektion vorhanden sind, auch in der
symptomatischen Phase persistieren. Ebenso enthalten
HIV-seropositive Seren ein Antikörper, das die Funktion der Reversen
Transkriptase inhibiert (anti-RT-Antikörper oder RTI). In Individuen,
bei denen RTI in hohen Anteilen vorhanden ist, sind Versuche zur
Virus-Isolation weniger häufig erfolgreich als bei denjenigen,
bei denen es fehlt. Es scheint somit, daß der Rückgang
zellulärer und humoraler immunprotektiver Faktoren, wie z.B. T&sub4;-Zellen
und anti-GAG-Antikörpern, einschließlich anti-p24 und anti-POL-
Antikörpern einschließlich RTI, mit der Progression der HIV-
Infektion zu AIDS assoziiert ist.
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Die Produktion immunprotektiver Faktoren kann durch Vakzinierung
eines Individuums mit einem effektiven Immunogen induziert
werden. In der Vergangenheit wurden Versuche unternommen, eine
Vakzine zu entwickeln, die auf bestimmten viralen Proteinen, wie
z.B. den Hüll-Proteinen, basiert. Die vorliegende Erfindung
betrifft ein Immunogen, das HIV-Gen-Produkte mit Ausnahme der
äußeren Hüll-Proteine enthält und das nützlich ist, um die
Produktion von immunprotektiven Faktoren zu stimulieren, die
wirksam sind, um einer Infektion in nicht-infizierten Individuen
vorzubeugen und um die Progression der HIV-Infektion zu AIDS in
infizierten Individuen zu verlangsamen oder der Progression
vorzubeugen. Das Immunogen umfaßt intakte virale Partikel, bei
denen die äußere Hülle entfernt wurde, oder es umfaßt ein oder
mehrere HIV-Gen-Produkte, ausgenommen gp120 oder gp160.
A. Definitionen
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Der Ausdruck "Retrovirus" betrifft in der im folgenden
verwendeten Form ein Virus, der als genetisches Material
Ribonukleinsäure (RNA) besitzt, die in DNA transkribiert und in das Wirtsgenom
insertiert wird. Beispiele für Retroviren schließen HTLV-I,
HTLV-II STLV-I und die Lentivirus-Familie ein, einschließlich
HIV, Visna-Virus, Equines Virus der infektiösen Anämie, Felines
Immundefizienzvirus und Bovines Immundefizienzvirus. Diese sind
in Fauci, Science 239:617 (1988) und in darin genannten
Literaturzitaten beschrieben.
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In der Form, in der der Begriff im folgenden verwendet wird,
schließt "HIV" die Typen 1 und 2 ein und ist mit HTLV-III und
LAV-1 und LAV-2 synonym. HIV betrifft allgemein das Virus und
schließt alle Formen, Subtypen und Variationen ein. Verschiedene
Zellinien, die mit dem HIV-Virus permanent infiziert sind,
wurden entwickelt und bei der ATCC hinterlegt, einschließlich
derjenigen, die die Zugangsnummern CCL 214, TIB 161, CRL 1552 und
CRL 8543 besitzen und die alle im US-Patent Nr. 4,725,669 sowie
in Gallo, Scientific American 256:46 (1987) beschrieben sind.
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Der Begriff "äußeres Hüllprotein" betrifft in der im folgenden
verwendeten Form denjenigen Teil des Membran-Glykoproteins eines
Retrovirus, der, im Gegensatz zum Transmembran-Protein gp41, aus
der Membran hervorsteht. Das äußere Hüll-Protein ist bei HIV
synonym mit gp120 und dessen Vorläufer gp160.
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Der Begriff "von der äußeren Hülle befreit" bzw. "ohne äußere
Hülle", betrifft in der hier verwendeten Form eine Präparation
retroviraler Partikel oder retroviraler Gen-Produkte, denen die
äußeren Hüll-Proteine fehlen.
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Der Begriff "gp 120" oder "gp160/120" betrifft in der hier
verwendeten Form Glykoproteine, die entweder die antigene
Spezifität oder die biologische Funktion des äußeren Hüll-Proteins
besitzen; es wird davon ausgegangen, daß gp160 der Vorläufer von
gp120 ist.
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In der im folgenden verwendeten Form betrifft "AIDS" das
erworbene Immundefizienzsyndrom (Acquired Immune Deficiency
Syndrome), wie es von Adler, Brit. Med. J. 294:1145 (1987) beschrieben
wurde. Es ist durch Tumoren und eine Serie opportunistischer
Infektionen charakterisiert. "ARC" betrifft den AIDS-Related
Complex, wie er von Adler, Supra, beschrieben wurde. Die
symptomatische
Phase der HIV-Infektion betrifft den Ausbruch von
Symptomen, die für ARC oder AIDS charakteristisch sind. Das
"AIDS-Syndrom" schließt sowohl AIDS als auch ARC ein.
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Der Begriff "Gen-Produkt" betrifft in der hier verwendeten Form
ein Polypeptid oder Protein, das von einem Gen kodiert wird. Der
Begriff soll Protein-Derivate, wie z.B. Glykoproteine,
einschließen. Es wird angenommen, daß begrenzte Modifikationen in
der Aminosäure-Sequenz des Genprodukts vorgenommen werden
können, ohne die biologische Funktion oder die Immunogenität des
Genprodukts zu zerstören, und daß nur ein Teil der primären
Sequenz zur Auslösung einer Immunantwort benötigt wird.
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Der Begriff HIV-infiziert oder nicht HIV-infiziert betrifft in
der hier verwendeten Form Menschen, bei denen das HIV-Virus oder
-Provirus vorhanden bzw. nicht vorhanden ist.
Retrovirus-infiziert oder nicht Retrovirus-infiziert betrifft Individuen, bei
denen ein Retrovirus oder Provirus vorhanden bzw. nicht
vorhanden ist. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind serologische Tests zur
Bestimmung des Vorliegens von Antikörpern gegen das Virus das am
meisten verwendete Verfahren zum Nachweis einer Infektion.
Solche Verfahren können jedoch sowohl zu falsch negativen
Resultaten führen, z.B. wenn ein Individuum das Virus aufgenommen aber
bislang keine Immunantwort entwickelt hat, als auch zu falsch
positiven Resultaten, z.B. wenn ein Fötus die Antikörper
erwerben kann, die Viren der Mutter aber nicht besitzt. Andere
Verfahren zum Nachweis des Virus sind verfügbar geworden oder
können verfügbar werden. In Fällen, in denen serologische Tests ein
Indiz für eine Infektion darstellen, kann es erforderlich sein,
anzunehmen, daß all diejenigen, die seropositiv getestet sind,
tatsächlich infiziert sind. Ferner können bestimmte der als
seronegativ ermittelten Individuen tatsächlich so behandelt
werden als wären sie infiziert, wenn bestimmte andere Indizien
einer Infektion, wie z.B. Kontakt mit einem bekannten Träger,
erfüllt sind. Während die Begriffe "seropositiv" und
"seronegativ" im folgenden als am leichtesten verfügbare Indikationen
einer Infektion verwendet werden können, sollen sie als mit den
Begriffen "infiziert" bzw. "nicht-infiziert" synonym angesehen
werden.
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Die Identifizierung HIV-spezifischer Gene und Genprodukte
basiert auf der Terminologie des HIV-Typs 1, wie er in Figur 1
dargestellt ist. Ein Verweis auf ein spezifisches Gen oder Gen-
Produkt des HIV-Typs 1, basierend auf seinem Molekulargewicht,
soll jedoch auch die betreffenden Gene oder Gen-Produkte des
HIV-Typs 2 einschließen, und für den Fall, daß ein homologes Gen
vorhanden ist, auch andere Retroviren einschließen. Die
Gen-Produkte anderer Typen und Spezies können leicht unterschiedliche
Molekulargewichte aufweisen. Zum Beispiel ist HIV-Typ 1 gp41 mit
gp36 des Typs 2 äquivalent, während gp120 des Typs 1 gp130 des
Typs 2 entspricht. Gene werden durch kursiv und klein
geschriebene Bezeichnungen, wie z.B. gag identifiziert, während
das entsprechende Gen-Produkt durch eine groß geschriebene
Bezeichnung, wie z.B. GAG, identifiziert wird. Das gesamte HIV-Gen
wurde sequenziert. Vergleiche Ratner et al. Nature 313:277
(1985).
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HIV kann aus Proben von peripherem Blut infizierter Individuen
kultiviert werden. Zum Beispiel können mononukleäre Zellen aus
dem peripheren Blut, wie z.B. Lymphozyten, durch Schichten einer
Probe von heparinisiertem venösen Blut über einen Ficoll-Hypaque
Dichtegradienten und Zentrifugieren der Probe erhalten werden.
Die mononukleären Zellen werden dann gesammelt, aktiviert, wie
z.B. mit Phytohämagglutinin für zwei bis drei Tage, und in einem
geeigneten Medium kultiviert, das vorzugsweise mit Interleukin
2 supplementiert ist. Das Virus kann entweder durch einen Assay
auf Reverse Transkriptase, durch einen Antigen-Capture-Assay für
p24, durch Immunfluoreszenz oder Elektronenmikroskopie
nachgewiesen werden, um die Gegenwart viraler Partikel in Zellen
nachzuweisen, wobei alle Verfahren allen auf diesem Gebiet tätigen
Fachleuten gut bekannt sind. Nach der Isolierung kann das Virus
auf andere Zellen übertragen werden.
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Es ist wichtig, eine nicht-infektiöse Vakzine zu verwenden, um
zu verhindern, daß die Infektion in einen Wirt eingeführt wird.
Verschiedene Verfahren sind gut bekannt, um ein Pathogen
nichtinfektiös zu machen. Siehe z.B. Hanson, MEDICAL VIROLOGY II
(1983) (de la Maza und Peterson, Hrsg.) Elsevier, N.Y. Das Virus
kann entweder inaktiviert werden oder seine Replikation kann
gestört werden. Vorzugsweise wird es jedoch mit einer
Kombination von beta-Propiolacton und gamma-Strahlung behandelt. Was
die hierin verwendeten Mengen anbetrifft, muß beta-Propiolacton
mit dem Virus für mindestens 2,5 Stunden in Kontakt sein. Um den
gesamten Rest an beta-Propiolacton vollständig zu eliminieren,
muß beta-Propiolacton für mindestens fünf Stunden bei 37ºC in
Lösung verbleiben.
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Das isolierte Virus wird dann so behandelt, daß man die äußeren
Hüll-Proteine entfernt. Diese Entfernung wird vorzugsweise durch
wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus in Verbindung mit
physikalischen Methoden erreicht, die das Schwellen und die
Kontraktion der viralen Partikel verursachen, obwohl andere
physikalische oder nicht-physikalische Verfahren, wie z.B.
Beschallung, entweder einzeln oder miteinander kombiniert
ebenfalls angewendet werden können.
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Alternativ können im wesentlichen gereinigte Gen-Produkte des
Retrovirus, wie z.B. HIV, ausgenommen die äußeren Hüll-Proteine,
als Immunogen verwendet werden. Diese Gen-Produkte schließen
diejenigen Produkte ein, die von den gag-Genen kodiert werden
(p55, p39, p24, p17 und p15), die von den pol-Genen kodiert
werden (p66/p51 und p31-34) und das Transmembran-Glykoprotein
gp41. Diese Gen-Produkte können entweder einzeln oder
miteinander kombiniert verwendet werden. Alternativ können die Gen-
Produkte der übrigen fünf Gene des HIV-Genoms verwendet werden.
Die Gen-Produkte können aus dem Virus isoliert und gereinigt
werden, oder sie können durch Klonieren und Exprimieren der
geeigneten Gene in einem Wirtsorganismus, wie z.B. Bakterien-,
Pilz- oder Säugerzellen, durch in der Technik gut bekannte
Verfahren
hergestellt werden. Alternativ können die Antigene unter
Verwendung von in der Technik gut bekannten Verfahren, wie z.B.
automatisierter Peptid-Synthese, synthetisiert werden. Die
Aminosäure-Sequenz der Gen-Produkte wurde aus der Nukleotid-Sequenz
abgeleitet.
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Ein Teil der Individuen, bei denen retrovirale Infektionen, wie
z.B. HIV, nachgewiesen wurden, können durch aktive Immuntherapie
unter Verwendung eines nicht-infektiösen Immunogens, das aus dem
Retrovirus hergestellt wurde, effektiv behandelt werden. Tiere,
bei denen man weiß, daß sie eine retrovirale Infektion haben,
können auch mit Hilfe dieser Verfahren behandelt werden. Im Fall
von HIV wird ein seropositives Individuum mit einem Immunogen,
das von der äußeren Hülle befreit ist, immunisiert, wobei das
Immunogen vorzugsweise in einem Adjuvans aufgenommen wird. Die
Dosis wird so ausgewählt, daß sie immunologisch wirksam ist, und
sie liegt im allgemeinen zwischen etwa 1 bis 100 µg Protein,
vorzugsweise etwa 30 µg Protein.
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Aktive Immunisierung wird implementiert und vorzugsweise einmal
bei einem Mindestintervall von mindestens 90 Tagen wiederholt,
obwohl aufgrund von Veränderungen im Immunkompetenz-Anteil, die
z.B. auf einer Abnahme von Antikörpern auf HIV-Gen-Produkte
ausgenommen die äußeren Hüll-Proteine, basieren, zusätzliche
Boosts angebracht sein können. Eine solche Immunisierung wird
vorzugsweise initial durch intramuskuläre Injektion, gefolgt von
intradermaler Injektion, erreicht, obwohl jede Kombination
intradermaler und intramuskulärer Injektionen angewendet werden
kann.
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Vorzugsweise wird die Fähigkeit zur Entwicklung einer
Immunantwort oder Immunkompetenz des seropositiven Individuums bestimmt,
bevor die Immunisierung erfolgt, um einen geeigneten Fortgang
der Therapie festzulegen. Als Nachweisverfahren werden die Seren
des Individuums auf das Vorliegen von Antikörpern gegen p24
(z.B. mittels ELISA), auf RTI-Antikörper und/oder auf den Anteil
an T&sub4;-Zellen mit Hilfe von in der Technik wohlbekannte Verfahren
gescreent. Individuen, die Anzeichen geringer Immunkompetenz
aufweisen, wie z.B. geringe p24- oder RTI-Antikörper-Titer oder
geringe T&sub4;-Zell-Zahlen, sind geeignete Kandidaten zur passiven
Immuntherapie, vorzugsweise in Verbindung mit aktiver
Immuntherapie, die entweder vorab oder begleitend erfolgt.
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Seronegative Individuen können vakziniert werden, um
immunprotektive Faktoren zu induzieren und einer Infektion vorzubeugen.
Vorzugsweise wird die Vakzine initial durch intramuskuläre
Injektion verabreicht, der eine entweder intramuskulär oder
intradermal gegebene Booster-Injektion folgt. Eine physiologisch
wirksame Dosis, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 µg und
bevorzugter etwa 30 µg des Immunogens werden pro Dosis zur Ver
fügung bereitgestellt. Vorzugsweise wird die Vakzine in
Verbindung mit einem Adjuvans verabreicht, wobei ein Adjuvans des
Wasser-in-Öl-Typs am meisten bevorzugt wird. Verschiedene
geeignete Adjuvantien sind in der Technik wohlbekannt und von
Warren und Chedid, CRC Critical Reviews in Immunology 8:83
(1988), in Form einer Übersicht dargestellt.
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Zusätzlich können diese spezifischen Antikörper aus einer mit
HIV infizierten Person vor der Immuntherapie entfernt werden, da
Antikörper gegen gp160/120 die Virus-Absorption an Zellen
erleichtern können. Immunosorbens-Säulen, die aus
Cellulose-Hohlfasern zusammengesetzt sind, werden modifiziert, um Liganden,
die mit anti-gp-160/120-Antikörpern reagieren, kovalent zu
binden. Solche Liganden schließen gp160/120-Antigene ein, die aus
gereinigten Glykoproteinen, die aus frisch geernteten Virus-
Partikeln oder aus dem Kultur-Überstand von HIV-produzierenden
T&sub4;-Lymphozyten erhalten wurden, hergestellt sind. Alternativ
können solche Liganden durch rekombinante DNA-Methoden unter
Verwendung transfizierter Zellen hergestellt werden. Alternativ
können anti-Idiotypen verwendet werden, die mit anti-gp160/120-
Antikörpern reagieren. Solche anti-Idiotyp Antikörper können
durch in der Technik wohlbekannte Verfahren hergestellt werden,
wie z.B. Riott et al. Lancet, 9. Mai 1981, Seite 1041 ff.
Verfahren zur Verwendung solcher Säulen zur extrakorporalen
Entfernung gewonnener Antikörper sind in Larue et al., Symp. on Plasma
Exchange in Nephrology; Int'l J. of Art. Organs 8:23 (1984),
beschrieben.
B. Beispiele
Beispiel 1
Herstellung der viralen Partikel ohne äußere Hülle
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Mit HIV infizierte Zellen wurden in Medium A gezüchtet, das aus
RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FBS), 25 mM HEPES, 50
µg/ml Gentamicin und 100 µg/ml Streptomycin bestand.
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Die Kulturen wurden expandiert, indem Stammzellen
Rotationskolben zugegeben wurden und das Volumen mit vorgewärmtem Medium A
auf ungefähr 8 l gebracht wurde. Das Teilungsverhältnis (split
ratio) betrug 1:5. Ein zweiter Teil wurde wie vorstehend
behandelt, mit einem Teilungsverhältnis von 1:3.
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Der Überstand einer 5 bis 7 Tage alten Suspension der
HIV-infizierten Zellen wurde durch ein 0,45 Mikrometer-Filter (Prostack;
Millipore Corporation, Bedford, MA), filtriert. Eine 1:40
Stammlösung von beta-Propiolacton (Sigma Chemical Corporation, St.
Louis, MO) wurde vor der Verwendung frisch hergestellt und zu
dem Überstand bis zu einer End-Konzentration von 1:4000
hinzugegeben. Die Lösung wurde für 5 Stunden bei 37ºC inkubiert, und
der pH-Wert wurde bei 7,2-7,4 gehalten.
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Nach 5 Stunden wurden 20 ml der überstehenden Lösung entfernt,
um den Grad der Infektiosität und die Menge an verbliebenem
beta-Propiolacton zu ermitteln. Der Überstand wurde dann bei
-70ºC eingefroren. Der gefrorene Überstand wurde anschließend
4,5 mR &sup6;&sup0;Cobalt gamma-Bestrahlung (Radiation Sterilizers Inc,
Tustin, CA) ausgesetzt.
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Die überstehende Lösung wurde dann aufgetaut und unter
Verwendung des Millipore Pellicon Systems mit Polysulfon-Filtern mit
einem Rückhaltevermögen von 100 000 MW entsprechend den vom
Hersteller mitgelieferten Instruktionen 40X konzentriert. Das
Konzentrat wurde in T-21 Zentrifugen-Flaschen (Beckman Instruments,
Brea, CA) gegeben, die zuvor mit 70% Isopropylalkohol (IPA)
behandelt wurden, und es wurde für eine Stunde bei 28 000 U/min
zentrifugiert. Der Überstand wurde aus den Röhrchen entfernt,
und die Pellets wurden in Natrium-Tris-EDTA (NTE) bis zu einem
Endvolumen von ungefähr 24 ml NTE resuspendiert. 4 ml dieser
Suspension wurden über 8 ml 30%iger Sucrose in
Polyallomer-Röhrchen geschichtet, die zuvor mit 70% IPA behandelt wurden, und es
wurde für eine Stunde bei 28 000 U/min zentrifugiert. Der
Überstand wurde von der 30%igen Sucrose abgesaugt, und die Pellets
wurden in NTE gründlich resuspendiert.
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In hochreinen Zentrifugenröhrchen, die zuvor mit 70% IPA
behandelt wurden, wurde durch Zugeben von 3 ml 45%iger Sucrose in das
Röhrchen und Überschichten mit 6 ml 30%iger Sucrose ein Gradient
erzeugt. 3 ml der oben genannten Suspension wurden
daraufgeschichtet. Die Röhrchen wurden für 60 Minuten bei 28 000 U/min
zentrifugiert.
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Die Lösung oberhalb der Banden an der 35%-Grenzfläche wurde
abpipettiert und verworfen. Die Banden aller Röhrchen wurden in
einem konischen Röhrchen vereinigt und mit Phosphat gepufferter
Salzlösung (PBS) 1:10 verdünnt. Die Lösung wurde in Polyallomer-
Röhrchen, die mit 70% IPA vorbehandelt waren, für eine Stunde
bei 28 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt,
und die Pellets wurden in PBS bei einer Konzentration von 1 ml
pro 10 l Startmaterial resuspendiert.
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Alternativ, insbesondere wenn das Immunogen in großen Mengen
hergestellt wird, kann der Bestrahlungsschritt durchgeführt
werden, nachdem die Banden vereinigt worden sind. Danach wird
das Virus an einem 15-50% Sucrose-Gradienten in Form von Banden
erhalten. Die Virus-Banden wurden vereinigt und in PBS
resuspendiert. Das Virus wurde bei 28 000 U/min für 1 Stunde pelletiert
und in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml
resuspendiert.
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Die vorliegende Proteinmenge wurde gemäß dem Verfahren von
Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976), ermittelt. Das Protein wurde
auf eine Endkonzentration von 1,0 mg/ml in PBS verdünnt.
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Der Anteil an restlichem B-Propiolacton im nach dem Verfahren
gemäß Beispiel I hergestellten Immunogen wurde mit Hilfe eines
Kapillar-Gas-Flüssig-Chromatographen (Carlo ERBA Series 4100),
gemäß den Instruktionen des Herstellers bestimmt.
Standard-Lösungen von B-Propiolacton und Buttersäure, die Konzentrationen
zwischen 1 ppm und 500 ppm besaßen, wurden hergestellt. Zwei µl-
Proben wurden in den Kapillar-Chromatographen injiziert, wobei
die vom Hersteller mitgelieferten Instruktionen befolgt wurden.
Die Nachweisgrenze wurde zu 0,1 ppm bestimmt. Es wurde
nachgewiesen, daß das Immunogen weniger als 0,05 ppm B-Propiolacton
enthielt.
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Acht Proben des gemäß der oben genannten Vorschrift
hergestellten Immunogens wurden mittels Kapillar-Gaschromatographie auf
den Gehalt an beta-Propiolacton analysiert, wobei Buttersäure
als interner Standard verwendet wurde. Die chromatographischen
Bedingungen waren wie folgt: Säule: 30 m x 0,25 mm offene
Quarzglas-Kapillare (fused silica open tubular); stationäre Phase:
100% Cyclopropylsilikon, Injektortemperatur: 140ºC;
Temperaturprogramm 70ºC/1 Minute, 20ºC/Minute bis 130ºC;
Injektionstechnik: ungeteilt. Unter den oben genannten Bedingungen betrugen
die Retentionszeiten von beta-Propiolacton und Buttersäure 7,52
Minuten bzw. 6,70 Minuten. Eine Injektion von 2 µl einer 1
ppm-Lösung
von beta-Propiolacton erzeugte einen quantitativ
erfaßbaren Peak. Die Konzentration der 1 ppm-Lösung auf ein Zehntel
seines Volumens durch Lösungsmittel-Verdampfung bei 40ºC unter
vermindertem Druck verursachte keinen nennenswerten Verlust an
beta-Propiolacton. Die Nachweisgrenze nach der Aufkonzentrierung
betrug 0,1 ppm (0,1 µg/ml).
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Um zu bestätigen, daß das Immunogen frei von äußeren
Hüll-Proteinen war, wurde das Immunogen zuerst an 11,0% SDS-PAGE-Gelen
gemäß dem Verfahren von Laemmli, U.K., Nature 227:680 (1970)
getrennt. Das getrennte Material wurde dann auf ein
Nitrocellulose-Papier gemäß dem Verfahren von Towbin et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 76:4350 (1979) überführt und gemäß dem Verfahren von
Tsang et al., Meth. Enzymology 92:377 (1983) immun-farbmarkiert.
Wie Figur 4 entnommen werden kann, besaßen die von dem Immunogen
so erhaltenen Western Blots keine Bande, die gp120/160
entsprach, wie die Kontrollen bei Reaktion mit Seren, die hohe
Titer an anti-gp160/120 enthielten, zeigten.
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Wie in Figur 4 gezeigt, waren kommerzielle Western Blot-Streifen
mit darauf befindlichen HIV-Proteinen (Bio-Rad, Richmond, CA)
("Kommerzielle Western-Blot-Streifen"), die mit heterologen
Seren (Schimpanse A86-C und A-3) gescreent waren und hohe
Antikörper-Titer gegen äußere Hüll-Proteine gp160/120 enthielten,
negativ (nicht-reaktiv) auf Western Blot-Streifen, die mit
Immunogen ohne äußere Hülle gemäß dem Verfahren nach Beispiel I
hergestellt waren. Homologe Human-Seren (003 und 010), die hohe
Antikörper-Titer gegen äußere Hüll-Proteine gp160/120
enthielten, reagierten mit kommerziellen Western Blot-Streifen, aber
waren auf den Western Blot-Streifen, die aus dem Immunogen ohne
äußere Hülle hergestellt waren, nicht-reaktiv. Sowohl die
homologen als auch heterologen Seren reagierten mit anderen HIV-Gen-
Produkten.
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Das Fehlen äußerer Hüll-Proteine auf den Immunogen-Partikeln
wurde mittels Elektronenmikroskopie bestätigt. Die Immunogen-
Präparation wurde mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert, mit OsO&sub4;
nachfixiert, mit Hilfe einer abgestuften Serie von Ethanol-Lösungen
dehydratisiert und in EPON-812 eingebettet. Dünne Schnitte
wurden mit einem LKB-Microtome (LKB, Uppsala, Schweden) unter
Verwendung eines Diamant-Messers präpariert. Die Dicke der Schnitte
betrug 60 nm. Die Schnitte wurden mit Uranylacetat und
Bleicitrat gefärbt und mit einem Zeiss 109 Elektronenmikroskop
betrachtet und fotografiert. Die HIV-infizierten Zellen wurden
nach demselben Verfahren präpariert wie die Kontrollen. Bei dem
Immunogen zeigte sich, daß die dunkle Färbung der äußeren
Schicht, die die Kontrollen aufwiesen und die gp160/120 auf der
viralen Oberfläche darstellen, fehlte.
Beispiel II
Immuntherapie seropositiver Individuen
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Neun HIV-seropositive Individuen wurden mittels Immuntherapie
behandelt. Ein Immunogen, das nicht-infektiöse HIV-Partikel ohne
äußere Hüll-Proteine umfaßt, wurde gemäß dem Verfahren nach
Beispiel I hergestellt. Das Immunogen wurde in einem 1:1
Verhältnis in unvollständigem Freund'schen Adjuvans (IFA) in einem
Emulgator (Spex 8000 Mixer Mill; Spex Industries Inc., Edison,
N.J.) emulgiert. 1,0 ml der Lösung, die 100 µg Protein enthielt,
wurde intramuskulär verabreicht. Ein Booster von 100 µg Protein
ohne Adjuvans wurde 90 Tage später mittels einer intradermalen
Injektion verabreicht.
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Das Vorliegen von HIV-Virus in peripheren Blut-Lymphozyten des
Patienten wurde sowohl vor als auch nach der Immunisierung durch
Cokultivierung mit frisch bereitgestellten peripheren
Blut-Lymphozyten bestimmt, die mit PHA und Interleukin-2 (IL-2) nach dem
Verfahren von Gallo et al., J. Clin. Microb. 25:1291 (1987)
stimuliert wurden. Kits zum Nachweis von HIV-Antigenen, wie z.B.
p24, sind kommerziell erhältlich (z.B., HIV p24 Assay; E. I.
DuPont & DeNemours Co., Inc., Wilmington, DE). Jeder Patient
wurde dreimal vor der Immunisierung und in den Wochen 2, 4, 6,
8, 12 und 14 nach der Immunisierung getestet.
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Tabelle I stellt die Ergebnisse der Virus-Isolierung aus den
Patienten dar. Die Patienten 010 und 003, von denen HIV jeweils
vor der Immunisierung isoliert wurde, wiesen bis zur 12. Woche
nach Immunisierung keinen isolierbaren Virus auf. Die Patienten
008 und 009 waren bis zur 8. Woche nach Immunisierung hindurch
Virus-frei, wie durch Kultivierung nachgewiesen wurde. Alle 4
der genannten Patienten wiesen vor der Immunisierung hohe Titer
an anti-p24 (> 1:5000) und RTI (> 1:1000) auf. Die übrigen fünf
Patienten, die vor der Immunisierung geringere anti-p24 und RTI-
Titer aufwiesen, zeigten nach der Immunisierung weiterhin
isolierbaren Virus.
TABELLE I
IMMUNOLOGISCHE UND VIROLOGISCHE PROFILE VON SEROPOSITIVEN
VIRÄMISCHEN ARC-PATIENTEN VOR UND NACH IMMUNISIERUNG
Cytologish
Immunologish
Virologish
Patient
T-4 vorher
nachher
Anti-p24
nachher (Wochen)
N.A. betrifft neutralisierenden Antikörper