FI95871C - Menetelmä HIV-hiukkasimmunogeenin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi - Google Patents

Description

95871

Menetelmä HIV-hiukkasimmunogeenin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee menetelmää immunogeenin val mistamiseksi, joka käsittää ei-infektiivisiä HIV-hiukka-sia, joista ulomman vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 puuttuvat, ja menetelmää vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat yhden tai useamman HIV-proteiinin kanssa, 10 mutta eivät reagoi mainitun viruksen ulomman vaipan proteiinien kanssa. Immunogeenia ja vasta-ainetta voidaan käyttää HIV-sairauden ehkäisyyn ja hoitoon, erityisemmin rokotukseen ja immunoterapiaan ihmisen immuunipuutosvirus-ta vastaan 15 Hankittua immuunipuutosoireyhtymää, joka tunnetaan myös AIDS:ina, on kuvattu nykyajan rutoksi. Seitsemän vuoden aikana sen jälkeen, kun se oli ensimmäistä kertaa kuvattu v. 1981, se on vaatinut lähes 60 000 uhria ja ollut syynä yli 32 000 kuolemantapaukseen yksin Yhdysvalloissa.

20 Kuitenkin sairauden todellinen vaikutus on vielä kokematta. Virus voi pysyä piilevänä tartunnan saaneissa yksilöissä viiden tai useamman vuoden ajan, ennen kuin oireet ilmaantuvat. Monet amerikkalaiset voivat tietämättään saada tartunnan ja tartuttaa muita, jotka joutuvat heidän . : : 25 ruumiinnesteidensä kanssa tekemisiin. Täten, ilman valvon taa, AIDS:in henkilökohtainen, sosiaalinen ja taloudellinen vaikutus tulee olemaan valtava.

AIDS:in aiheuttava tekijä on ihmisen immuunipuutos-virus-niminen retrovirus (HIV). Retrovirukset tunnistetaan 30 sen seikan perusteella, että niiden geneettinen materiaali, joka on RNA:ta, koodittaa virusreplikaatioon tarvittavat tiedot. Isäntäsolun infektoituessa se toimii mallina DNA:n transkriptioille, jota katalysoi käänteistranskrip-taasientsyymi. Näin tuotettu DNA tulee solun tumaan, jossa 35 se liittyy isännän DNA:hän proviruksena. Oikein aktivoitu- 2 95871 na retroviruksen DNA:ta transkriboidaan ja translatoidaan RNA:ta sisältävien virionien tuottamiseksi, jotka sitten vapautuvat solusta silmikoitumalla.

Tietyt virukset, retrovirukset mukaan luettuina, 5 voivat pysyä piilevässä tilassa kuukausia tai vuosia ennen kuin ne aktivoituvat ja virioneja tuotetaan. Vaikkakin oireettomana, isännällä voi joka tapauksessa olla virus provirusmuodossa ja hän voi täten olla mahdollisesti vaarassa sairastua ja tartuttaa muita.

10 Kun yksilö infektoituu HIV:llä, virus kiinnittyy ja tunkeutuu mieluiten tietyn linjan soluihin, T4-lymfosyyt-teihin, jotka tunnistetaan siitä, että niillä on CD4:ksi nimetty solunpinnan merkkimolekyyli. Näillä valkoisilla verisoluilla on olennainen osa immuunijärjestelmässä, ne 15 toimivat tärkeinä osina sekä humoraalisessa että soluvälitteisessä immuunivasteessa. Suuri osa HIV:n haitallisesta vaikutuksesta voidaan laskea T4-lymfosyyttien toiminnan huononemisen tai solujen tuhoutumisen syyksi.

Ehjä HIV-virioni on karkeasti ottaen pyöreä ja noin 20 110 nm läpimitaltaan. Virionilla on ulkokalvo, jota peit tävät glykoproteiinin, gp 160/120:n muodostamat nupit tai piikit. Lisäksi siinä on kalvon läpi ulottuva proteiini, joka on nimetty gp 41:ksi. Vironin sisällä on kaksi raken-neproteiinia: ulompi kuori, joka koostuu fosfoproteiinista , 25 pl7 ja sisempi nukleoidi tai sisempi ydin, joka muodostuu fosfoproteiinista p24. Viruksen RNA on ytimen sisällä, kahden käänteistranskriptaasientsyymimolekyylin, p66/51, kanssa, jotka ovat tarpeen virus-DNA:n syntetisoinnissa RNA-mallin mukaan. HIV:n kaavamainen malli on esitetty 30 kuviossa 1.

·· Kuten kuviossa 2 on esitetty, HIV:n RNA-genomi koo- : ‘ dittaa kolmea päärakennegeeniä: gag, pol ja env, joita reunustavat kummassakin päässä pitkät toistuvat terminaa-lisekvenssit (long terminal repeat sequences, LTR). Gag-35 geeni koodittaa ryhmäspesifisiä ytimen proteiineja p55, •.

3 95871 p39, p24, pl7 ja pl5. Pol-geenit koodittavat käänteisko-pioijaentsyymiä p66/p51 ja proteaasia p31. Env-geenit koodittavat ulomman vaipan glykoproteiinia gpl20 ja sen esimuotoa gpl60 ja kalvon läpi ulottuvaa glykoproteiinia 5 gp41. Joillakin geeneistä on taipumusta olla hyvin vaih- televia, erityisesti env-geeneillä. Lisäksi on viisi muuta geeniä, joita ei ole muilla retroviruksilla, jotka vaikuttavat joko transkription tai translaation säätelyyn tai koodittavat muita rakenneproteiineja. Koko HIV:n genomi on 10 nyt sekvensoitu. Ks. Ratner et ai., Nature 313 (1985) 277, joka on liitetty tähän viitteeksi.

HIV kiinnittyy isäntäsoluun vaipan glykoproteiinin vuorovaikutuksella solunpinnan reseptorin kanssa. Vaikuttaa siltä, että kun HIV joutuu kosketukseen T4-solun kans-15 sa, gpl20 joutuu vuorovaikutukseen CD4-reseptorin kanssa. Viruksen vaippa yhtyy solukalvoon ja viruksen sisempi ydin pääsee infektoituneeseen soluun, jossa käänteiskopioija-entsyymi katalysoi RNA:n transkription DNA-provirukseksi. Provirus voi pysyä solussa piilevässä muodossa muutamia 20 kuukausia tai vuosia, jona aikana tartunnan saanut yksilö on oireeton. Jos virus kuitenkin myöhemmin aktivoituu ja aiheuttaa viruksen replikaation ja immunosupression, yksilö on tällöin altis opportunistisille infektioille, syöpä mukan luettuna, jotka liittyvät AIDS:iin. Muilla ihmisen 25 retroviruksilla on ulomman vaipan proteiineja.

Toistaiseksi ei tunneta AIDS-oireyhtymään tehokasta rokotetta tai hoitoa. Yritykset kehittää rokotteita ovat tähän asti epäonnistuneet. Tiettyjä vasta-aineita, jotka reagoivat HIV:n kanssa, varsinkin anti-gpl60/120- ja vi-30 rusta neutraloivia vasta-aineita esiintyy suuria määriä HIV-infektion sekä oireettoman että oireellisen vaiheen aikana, mikä viittaa siihen, että suojaavan vaikutuksen sijasta tällaiset vasta-aineet voivat itse asiassa edistää viruksen kiinnittymistä ja tunkeutumista isäntäsoluun.

4 95871 Täten on olemassa tarve tehokkaille vaikuttaville aineille, joita käytetään retrovirusinfektioiden, erityisesti HIV:n aiheuttamien, ehkäisyyn ja hoitoon. Tämä keksintö tyydyttää nämä tarpeet ja tarjoaa myös asiaan kuulu-5 via etuja.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän valmistaa ei-infektiivistä immunogeenia, joka sisältää HIV-hiukka-sia, joissa ei ole ulomman vaipan proteiineja. Menetelmälle) le on tunnusomaista, että mainittua virusta viljellään, eristetään ja saatetaan ei-infektiiviseksi ja poistetaan siitä ulomman vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 sinänsä tunnetulla tavalla. Immunogeeni on käyttökelpoinen HIV-tartunnan saaneen yksilön immunisointiin, infektion etene-15 miseltä suojaavien immunoprotektiivisten tekijöiden ai kaansaamiseksi. Toisaalta immunogeeni on käyttökelpoinen sellaisen yksilön rokottamiseen myöhemmän infektion ehkäisemiseksi, joka ei aikaisemmin ole saanut HIV-tartuntaa. Immunogeeniä voidaan myös käyttää vasta-aineiden tuottami-20 seen passiivista immunoterapiaa varten, yksin tai aktiivisen immunoterapian yhteydessä HIV-tartunnan saaneissa yksilöissä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle vasta-aineiden määrittämiseksi on tunnusomaista, että immunisoidaan yksilö, joka on muu kuin ihminen, patenttivaatimuksessa 1 mai-25 nitulla immunogeenillä ja kerätään muodostuneet vasta-ai neet talteen.

Lvhvt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 on kaaviokuva HIVistä, joka esittää eri geenituotteiden järjestyksen.

30 Kuvio 2 on kaaviokuva HIV:n geeneistä ja niiden • koodittamista geenituotteista.

Kuvio 3 tarjoaa kaavamaisen esityksen tiettyjen vasta-aineiden ja antigeenien tasosta, joita esiintyy HIV-infektion edetessä AIDS:iksi seropositiivisilla yksilöillä 35 oireettoman tilan edetessä ARC:ksi ja AIDS:ksi.

95871 5

Kuvio 4 esittää Western Blot -kuvaa immunogeenistä, joka on valmistettu, kuten esimerkissä I, joka osoittaa, että se on vapaa ulomman vaipan proteiineista testattaessa homologisella ja heterologisella seerumilla, jotka sisäl-5 tävät korkeita tiittereitä vasta-aineita ulomman vaipan proteiineille. A: Kaupalliset HIV-Western Blot -liuskat, jotka on testattu heterologisella simpanssin seerumilla; B: Western Blot -liuska, jossa on immunogeeniä, testattu heterologisella simpanssin seerumilla; C: Kaupalliset HIV-10 Western Blot -liuskat testattuna homologisella ihmisen seerumilla; D: Western Blot -liuskat, joissa on immunogeeniä testattuna homologisella ihmisen seerumilla.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Keksintö tarjoaa tehokkaan keinon HIV-infektion ja 15 sitä seuraavan HIV:n aiheuttaman AIDS:iin liittyvän oireyhtymän (AIDS Related Complex, ARC) ja AIDS:in ehkäisyyn ja tartunnan jälkeiseen hoitoon HIV-infektioiden etenemisen pysäyttämiseen. Yksilöillä, jotka ovat altistuneet HIV-virukselle, on seerumissaan tiettyjä HIV:lie spesifi-20 siä vasta-aineita. Näitä yksilöitä nimitetään HIV:n suhteen "seropositiivisiksi", vastakohtana niille, jotka ovat "seronegatiivisia". HIV:lie spesifisten vasta-aineiden esiintyminen voidaan määrittää kaupallisesti saatavissa oleville määritysmenetelmillä. Näiden vasta-aineiden taso 25 antaa viitteitä AIDS-oireyhtymän etenemisestä.

Kuten kuvio 3 kaavamaisesti esittää, korkeat pitoisuudet anti-gpl60/120 (ulomman vaipan) -vasta-ainetta, joita esiintyy myös HIV-infektion oireettomassa vaiheessa, säilyvät myös oireellisessa vaiheessa. Anti-p24-vasta-ai-30 neen määrä on korkea oireettomassa vaiheessa, mutta näyttää laskevan oireellisessa vaiheessa. Samoin HIV-seroposi-tiiviset seerumit sisältävät vasta-aineen, joka estää käänteistranskriptaasin toiminnan (anti-RT-vasta-aine tai RTI). Yksilöillä, joilla RTI esiintyy suurina määrinä, 35 yritykset viruksen eristämiseksi ovat harvemmin positiivi- 6 95871 siä kuin niillä, joilta se puuttuu. Sen vuoksi vaikuttaa siltä, että soluvälitteisten ja humoraalisten immunopro-tektiivisen tekijöiden, kuten T4-solujen ja anti-GAG-vas-ta-aineiden, mukaan luettuna anti-p24 ja anti-POL-vasta-5 aineiden, mukaan luettuna RTI, väheneminen liittyy HIV-infektion etenemiseen AIDS:iksi.

Immunoprotektiivisten tekijöiden tuotanto voidaan saada aikaan rokottamalla yksilöä tehokkaalla immunogee-nillä. Aiemmin on tehty yrityksiä kehittää rokote, joka 10 perustuu tiettyihin viruksen proteiineihin, esimerkiksi vaipan proteiineihin. Tämä keksintö koskee menetelmää im-munogeenin valmistamiseksi, joka sisältää HIV-geenituotteita, lukuun ottamatta vaipan proteiineja, jota voidaan käyttää kiihottamaan immunoprotektiivisten tekijöiden tuo-15 tantoa, jotka ovat tehokkaita ei-infektoituneiden yksilöiden tartunnan ehkäisyyn tai hidastamaan tai ehkäisemään tartunnan saaneiden yksilöiden HIV-infektion etenemistä AIDS:iksi. Immunogeeni koostuu ehjistä virushiukkasista, joista ulompi vaippa on poistettu tai yhdestä tai useam-20 masta muista kuin gpl20 tai gpl60 HIV-geenituotteesta.

A. Määritelmiä Tässä käytettynä nimitys ’’retrovirus" viittaa virukseen, jonka geneettinen materiaali on ribonukleiinihap-pona (RNA), joka transkriboidaan DNA:ksi, joka liitetään 25 isännän genomiin. Esimerkkeihin retroviruksista kuuluvat *“ HTLV-I, HTLV-II STLV-I ja lentivirusheimo, mukaan luettui na HIV, visna-virus, hevosen tarttuva anemiavirus, kissan immuunipuutosvirus ja naudan immuunipuutosvirus. Näitä kuvataan Faucin artikkelissa, Science 239 (1988) 617 ja 30 siihen kuuluvissa viitteissä, joista jokainen on liitetty ” tähän viitteeksi.

Tässä käytettynä nimitys "HIV" sisältää tyypit 1 ja 2 ja merkitsee samaa kuin HTLV-III ja LAV-1 ja LAV-2. HIV viittaa virussukuun ja sisältää kaikki muodot, alatyypit 35 ja muunnokset. On kehitetty useita HIV-viruksen pysyvästi 7 95871 infektoimia solulinjoja ja sijoitettu ne ATCC-talletuslai-tokseen, mukaan luettuina numeroilla CCL 214, TIB 161, CRL 1552 ja CRL 8543 saatavissa olevat, jotka kaikki on kuvattu US-patentissa nro 4 725 669 ja Gallon artikkelissa, 5 Scientific American 256 (1987) 46, jotka on molemmat liitetty tähän viitteiksi.

Tässä käytettynä nimitys "ulomman vaipan proteiini" viittaa siihen osaan retroviruksen kalvon glykoproteiinis-sa, joka pistää esiin kalvosta vastakohtana kalvon läpi 10 ulottuvalle proteiinille gp41. Ulomman vaipan proteiini tarkoittaa HIV:ssä samaa kuin gpl20 ja sen esimuoto gpl60.

Tässä käytettynä nimitys "ulommasta vaipasta vapaa" viittaa retroviruksen osista koostuvaan valmisteeseen tai retroviruksen geenituotteisiin, joista puuttuvat ulomman 15 vaipan proteiinit.

Tässä käytettynä nimitys "gpl20" tai "gpl60/120" viittaa glykoproteiineihin, joilla on joko ulomman vaipan proteiinin antigeeninen spesifisyys tai biologinen toiminta; gpl60:n uskotaan olevan gpl20:n esimuoto.

20 Tässä käytettynä nimitys "AIDS" viittaa hankittuun immunipuutosoireyhtymään, jonka Adler on kuvannut, Brit.

Med. J. 294 (1987) 1145. Sitä luonnehtivat kasvaimet ja opportunististen infektioiden sarja. "ARC" viittaa AIDS:iin liittyvään oireyhtymään, jonka Adler, yllä, on 25 kuvannut. HIV-infektion oireellinen vaihe viittaa ARC:lie tai AIDS:ille tyypillisten oireiden alkamiseen "AIDS-oire-yhtymä" sisältää sekä AIDS:in että ARC:n.

Tässä käytettynä nimitys "geenituote" viittaa geenin koodittamaan polypeptidiin tai proteiiniin. Nimityksen 30 on tarkoitus sisältää proteiinin johdannaiset, kuten gly-koproteiinit. On selvää, että voidaan tehdä rajoitettuja « muutoksia geenituotteen aminohappojärjestykseen tuhoamatta geenituotteen biologista toimintaa tai immunogeenisyyttä ja että ehkä vain osaa alkuperäisestä sekvenssistä tarvi-35 taan immunogeenisyyteen.

8 95871 Tässä käytettynä nimitys HIV-tartunnan saanut tai ei-HIV-tartuntaa saanut viittaavat ihmisiin, joilla on HIV-virus tai provirus tai joilla ei vastaavasti niitä ole. Retrovirustartunnan saanut tai ei-retrovirustartuntaa 5 saanut viittaavat yksilöihin, joilla on retrovirus tai provirus tai joilla ei vastaavasti niitä ole. Nykyisin tartunnan määrittämiseen eniten käytetyt menetelmät ovat serologiset kokeet virusvasta-aineiden toteamiseksi. Nämä menetelmät voivat kuitenkin johtaa sekä vääriin negatiivi-10 siin, kuten silloin, kun yksilö on saanut viruksen, muttei vielä ole pannut toimeen immuunivastetta, että vääriin positiivisiin, kuten siinä tapauksessa, että sikiö saattaa saada äidiltä vasta-aineet muttei virusta. Muita menetelmiä viruksen toteamiseksi on tullut tai saattaa tulla saa-15 taville. Silloin kun serologiset testit antavat viitteitä tartunnasta, saattaa olla tarpeen pitää kaikkia seroposi-tiivisia itse asiassa tartunnan saaneina. Edelleen tiettyjä niistä yksilöistä, jotka todetaan seronegatiivisiksi, voidaan itse asiassa pitää tartunnan saaneina, jos tietyt 20 muut viitteet tartunnasta, kuten kosketus tunnetun kantajan kanssa, ovat olemassa. Kun nimityksiä "seropositiivi-nen" ja "seronegatiivinen" voidaan käyttää tässä helpoiten saatavina tartunnan osoittajina, niiden on tarkoitus olla synonyymisiä "tartunnan saaneen" tai "ei-tartuntaa saa-25 neen" kanssa, vastaavasti.

HIV-spesifisten geenien ja geenituotteiden tunnistaminen perustuu HIV tyyppi l:n terminologiaan, joka on esitetty kuviossa 1. On kuitenkin tarkoitus, että viite tiettyyn HIV tyyppi l:n geeniin tai geenituotteeseen, joka 30 perustuu sen molekyylipainoon, sisältää myös HIV tyyppi 2:n ja muiden retrovirusten, joilla on homologinen geeni, * vastaavan geenin tai geenituotteen. Muiden tyyppien ja lajien geenituotteilla voi olla hieman eri molekyylipai-not. Esimerkiksi HIV tyyppi l:n gp41 on vastaava kuin 35 tyyppi 2:n gp36 ja tyypin 1 gpl20 vastaa tyypin 2 • 4 9 95871 gpl30:tä. Geenit tunnistetaan kursivoidusta alaosan merkinnästä, kuten gag, kun taas vastaava geenituote tunnistetaan yläosan merkinnästä, kuten GAG. Koko HIV:n geeni on sekvensoitu. Ks. Ratner et ai., Nature 313 (1985) 277, 5 joka on liitetty tähän viitteeksi.

HIV voidaan viljellä tartunnan saaneen yksilön perifeerisestä verinäytteestä. Esimerkiksi perifeerisen veren mononukleaarisia soluja, kuten esimerkiksi lymfosyyttejä, voidaan saada kerrostamalla heparinisoitua laskimo-10 verta Ficoll-Hypaque-tiheysgradientin päälle ja sentrifu- goimalla tämä. Mononukleaariset solut kerätään, aktivoidaan esimerkiksi fytohemagglutiinilla kahdesta kolmeen päivään ja viljellään sopivassa ravintonesteessä, johon on mieluiten lisätty interleukiini 2:ta. Virus voidaan havai-15 ta joko käänteistranskriptaasimäärityksellä, p24-antigee- nin kiinnittymismäärityksellä, immunofluoresenssillä tai toteamalla virushiukkaset soluissa elektronimikroskopialla, jotka kaikki ovat alan ammattilaisten hyvin tuntemia menetelmiä. Kun virus on eristetty, se voidaan siirtää 20 muihin soluihin.

On tärkeää käyttää ei-infektoivaa rokotetta, jotta vältettäisiin infektion siirtäminen isäntään. Monia menetelmiä patogeenin saattamiseksi ei-infektoiviksi tunnetaan hyvin. Ks. esimerkiksi Hanson, MEDICAL VIROLOGY II (1983) 25 (toim. de la Maza ja Peterson) Elsevier, N.Y. Virus voidaan inaktivoida tai tehdä replikaatioon kykenemättömäksi. Kuitenkin, edullisesti, sitä käsitellään β-propiolaktonin ja gammasäteilyn yhdistelmällä. Tässä käytettävien määrien β-propiolaktonia täytyy olla viruksen kanssa kosketuksissa 30 vähintään 2,5 tuntia. Jotta kaikki jäännös-fi-propiolaktoni saataisiin poistetuksi, β-propiolaktonin täytyy pysyä ’ “ liuoksessa vähintään viisi tuntia 37 °C:ssa.

Eristettyä virusta käsitellään seuraavaksi ulomman vaipan proteiinien poistamiseksi proteiinit voidaan edul-35 lisesti poistaa viruksen toistuvalla jäädytys-sulatuskä- • 10 95871 sittelyllä yhdistettynä fysikaalisiin menetelmiin, jotka aiheuttavat virushiukkasten turpoamista ja kutistumista, vaikkakin muita fysikaalisia tai ei-fysikaalisia menetelmiä, kuten sonikoimista, voidaan myös käyttää yksin tai 5 yhdistelmänä.

Vaihtoehtoisesti, riittävästi puhdistettuja retro-virusten, kuten HIV:n, geenituotteita, muita kuin ulomman vaipan proteiineja, voidaan käyttää immunogeeninä. Näihin geenituotteisiin kuuluvat gag-geenien koodittamat tuotteet 10 (p55, p39, p24, pl7 ja pl5), pol-geenien koodittamat tuot teet (p66/p51 ja p31-34) ja kalvon läpi ulottuva glykopro-teiini gp41. Näitä geenituotteita voidaan käyttää yksin tai yhdistelmänä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää HIV-genomin viittä jäljelle jäävää geeniä. Geenituotteet voi-15 daan eristää ja puhdistaa viruksesta tai niitä voidaan tuottaa kloonaamalla ja ilmentämällä haluttu geeni isäntä-eliössä, kuten bakteeri-, sieni- tai nisäkässoluissa, alan hyvin tunnettujen menetelmien mukaan. Vaihtoehtoisesti antigeenit voidaan syntetisoida käyttäen hyvin tunnettuja 20 alan menetelmiä, kuten automatisoitua peptidisynteesiä. Geenituotteiden aminohappojärjestys on johdettu nukleotidi järjestyksestä.

Osaa niistä yksilöistä, joilla on todettu retrovi-rusinfektioita, kuten HIV, voidaan hoitaa tehokkaasti ak-25 tiivisella immunoterapialla käyttäen ei-infektiivistä im- • < munogeeniä, joka on valmistettu retroviruksesta. Myös eläimiä, joilla on todettu retrovirusinfektio, voidaan hoitaa näillä menetelmillä. HIV:n ollessa kyseessä, sero-positiivista yksilöä immunisoidaan ulommasta vaipasta va-30 paalia immunogeenillä, mieluiten liitettynä adjuvanttiin.

; Vaihtoehtoisesti immunogeeni voidaan antaa veteen liuote tussa muodossa ilman adjuvanttia. Annos valitaan niin, että se olisi immunologisesti tehokas ja se on yleensä 1 - 100 μg proteiinia, edullisesti noin 30 μg proteiinia.

11 95871

Aktiivinen immunisaatio toteutetaan ja edullisesti toistetaan kerran vähintään 90 päivän väliajalla, vaikka lisäpistokset voivat olla tarkoituksenmukaisia johtuen immunokompetenssitason muutoksista ja perustua esimerkiksi 5 muiden HIV-geenituotteiden kuin ulomman vaipan proteiinien vasta-aineiden vähenemiseen. Tällainen immunisointi suoritetaan edullisesti aluksi lihaksensisäisellä pistoksella ja sen jälkeen ihonalaisesti, vaikkakin mitä tahansa ihonalaisten ja lihaksensisäisten pistosten yhdistelmää voi-10 daan käyttää.

Seropositiivisen yksilön immuunivaste tai immuno-kompetenssi määritetään mieluiten ennen immunisointia, jotta voitaisiin määrätä oikea ajoitus hoidolle. Määritysten menetelmänä yksilöiden seerumeista tutkitaan vasta-15 aineet p24:lle (ELISAA käyttäen), RTI-vasta-aineet ja/tai T4-solujen taso alan hyvin tunnettujen menetelmien mukaan. Yksilöt, joilla esiintyy matalan immuunivastaan merkkejä, kuten matalat p24- tai RTI-vasta-aineiden määrät tai matalat määrät T4-soluja, ovat sopivia ehdokkaita passiivisel- 20 le immunoterapialle, edullisesti yhdistettynä aktiivisen immunoterapian kanssa, ennen sitä tai samanaikaisesti sen kanssa.

Seronegatiivisia yksilöitä voidaan rokottaa tartuntaa ehkäisevien immunoprotektiivisten tekijöiden aikaan-25 saamiseksi. Edullisesti rokote anntaan aluksi lihaksensi- •' säisenä pistoksena, jota seuraa lisäpistos joko lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti annettuna. Fysiologisesti tehokas annos, edullisesti 1 - 100 /xg, edullisemmin noin 30 Mg immunogeeniä annetaan annosta kohden. Edullisesti 30 rokote annetaan yhdessä adjuvantin kanssa, edullisimmin ” vesi-öljy-emulsiotyyppisen adjuvantin. Tunnetaan useita φ sopivia tällaisia adjuvantteja, joista Warren ja Chedid ovat kirjoittaneet katsauksen, CRC Critical Reviews in Immunology 8 (1988) 83, joka on liitetty tähän viitteeksi.

12 95871

Koska vasta-aineet gpl60/l20:lie saattavat helpottaa viruksen tarttumista soluihin, nämä spesifiset vasta-aineet voidaan lisäksi poistaa HIV-tartunnan saaneelta henkilöltä ennen immunoterapiaa. Immunoadsorptiopylväät, 5 jotka koostuvat ontoista selluloosakuiduista, muunnetaan niin, että niihin liittyy kovalenttisesti anti-gpl60/120-vasta-aineiden kanssa reagoivia ligandeja. Näihin ligan-deihin kuuluvat gpl60/120-antigeenit, jotka on valmistettu puhdistetuista glykoproteiineista, jotka on saatu juuri 10 kerätyistä virushiukkasista HIV:a tuottavien T4-lymfosyyt-tien viljelmän ravintonesteestä. Vaihtoehtoisesti näitä ligandeja voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-menetelmillä käyttäen transfektoituja soluja. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää anti-gpl60/120-vasta-aineiden kanssa regoivia 15 anti-idiotyyppejä. Näitä anti-idiotyyppivasta-aineita voi daan valmistaa alan hyvin tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi Riott et ai., Lancet, 9. toukokuuta, 1981, s. 1041 ynnä seuraavat, jotka on liitetty tähän viitteeksi. Tällaisten pylväiden käyttöön liittyviä menetelmiä synty-20 neiden vasta-aineiden elimistön ulkopuolelta tapahtuvaa poistamista varten ovat esimerkiksi Laruen et ai. kuvaamat, Symp. on Plasma Exchange in Nephrology; Int'l. J. of Art Organs 8 (1984) 23, joka on liitetty tähän viitteeksi.

B. Esimerkkejä 25 Seuraavat esimerkit on tarkoitettu valaisemaan mut- •« tei rajoittamaan keksintöä. Vaikka ne ovat tyypillisiä esimerkkejä niistä, joita saatettaisiin käyttää, muita alan ammattilaisten tuntemia menetelmiä voidaan vaihtoehtoisesti käyttää.

30 Esimerkki 1

Ulommasta vaipasta vapaiden virushiukkasten valmis- « tus HIV:llä infektoituja soluja kasvatettiin ravinto-neste A:ssa, joka koostuu RPMI-1640:stä, johon on lisätty 35 10 % naudan sikiön seerumia, (FBS, fetal bovine serum), 25 13 95871 mM HEPES: iä, 50 Mg/ml gentaroisiiniä ja 100 Mg/ml streptomysiiniä.

viljelmät laajennettiin lisäämällä varastoviljelmän soluja pyöriviin viljelypulloihin ja tilavuus laajennet-5 tiin noin 8 l:ksi esilämmitetyllä ravintoneste A:11a. Laimennussuhde oli noin 1:5. Toinen laimennus tehtiin samoin kuin edellä laimennussuhteella 1:3.

Ravintoneste 5 - 7:n päivän ikäisistä HIV:n infektoimien solujen suspensioista suodatettiin 0,45 mikronin 10 suodattimen läpi (Prostack; Millipore Corporation,

Bedford, MA). Tuore 1:40-varastoliuos B-propiolaktonista (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) valmistettiin juuri ennen käyttöä ja lisättiin ravintonesteeseen lopulliseksi pitoisuudeksi 1:4 000. Liuosta inkuboitiin viisi 15 tuntia 37 °C:ssa ja pH pidettiin välillä 7,2 - 7,4.

Viiden tunnin kuluttua poistettiin 20 ml liuoksesta infektiivisyystason ja jäljellä olevan ft-propiolaktonin määrittämiseksi. Sen jälkeen liuos jäädytettiin -70 "esseen. Jäätynyt liuos altistettiin sitten 4,5 mR 60koboltin 20 gammasäteilytykselle (Radiation Sterilizers Inc., Tustin, CA) .

Supernatanttiliuos sulatettiin sen jälkeen ja konsentroitiin 40-kertaiseksi käyttäen Millipore Pellicon -järjestelmää 100 000 molekyylipainorajan polysulfonisuo-25 dattimilla, seuraten valmistajan antamia ohjeita. Konsent-raatti pantiin T-21-roottoripulloihin (Beckman Instruments, Brea, CA) , jotka oli aikaisemmin käsitelty 70-%:isella isopropyylialkoholilla (IPA) ja sentrifugoitiin 28 000 rpm yhden tunnin ajan. Supernatantti poistettiin 30 putkista ja kiinteät jäännökset suspendoitiin natrium-tris-EDTA:han (NTE) noin 24 ml:n lopulliseen NTE-tilavuu- * teen. 4 ml tätä suspensiota kerrostettiin 8 ml:n päälle 30-%:ista sakkaroosia polyalloroeeriputkiin, jotka oli aiemmin käsitelty 70-%:isella IPA:11a ja sentrifugoitiin 35 28 000 rpm yhden tunnin ajan. Liuos valutettiin 30-%:ises- 1 14 95871 ta sakkaroosista ja kiinteä jäännös suspendoitiin huolellisesti NTE:hen.

Valmistettiin gradientti ultrapuhtaisiin sentrifu-giputkiin, jotka oli aiemmin käsitelty 70-%:isella IPA:-5 11a, lisäämällä 3 ml 45-%:ista sakkaroosia putkeen ja ker rostamalla sen päälle 6 ml 30-%:ista sakkaroosia. 3 ml yllä olevaa suspensiota kerrostettiin päällimmäiseksi. Putkia sentrifugoitiin 0 minuuttia 28 000 rpm.

Liuos 35 %:n rajapinnalla olevien vyöhykkeiden 10 päältä pipetoitiin pois ja heitettiin menemään. Vyöhykkeet kaikista putkista yhdistettiin yhteen v-pohjaiseen putkeen ja laimennettiin 1:10 fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Liuos sentrifugoitiin polyallomeeriput-kissa, jotka oli esikäsitelty 70-%:isella IPA:lla yhden 15 tunnin ajan 28 000 rpm. Liuos heitettiin pois ja kiinteä jäännös suspendoitiin PBS:ään konsentraatioksi 1 ml 10 litraa aloitusmateriaalia kohti.

Vaihtoehtoisesti, erityisesti silloin, kun immuno-geeniä valmistetaan suurissa erissä, säteilytys voidaan 20 tehdä vyöhykkeiden yhdistämisen jälkeen. Sen jälkeen virus kerrostetaan 15 - 50 %:n sakkaroosigradientin päälle. Vi-rusvyöhykkeet yhdistettiin ja suspendoitiin PBS:ään. Virus sentrifugoitiin pohjaan 28 000 rpm:llä yhden tunnin ajan ja suspendoitiin PBS:ään 1,0 mg/ml:n lopulliseksi konsent- '··' 25 raatioksi.

• · <.

Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin et ai. menetelmän mukaan (Anal. Biochem. 72 (1976) 248), joka on liitetty tähän viitteeksi proteiini laimennettiin PBS:ään lopulliseksi konsentraatioksi 1,0 mg/ml.

30 Esimerkin 1 menetelmän mukaan valmistetun immuno- geenin sisältämä B-propiolaktonijäännöksen pitoisuus mää- • · . - .

ritettiin käyttämällä kapillaari-kaasu-nestekromatograf iaa (Carlo ERBA Series 4100) valmistajan ohjeiden mukaan. Valmistettiin B-propiolaktoni- ja voihappovakioliuokset, joi-35 den konsentraatiot olivat 1 - 500 ppm. Kahden μ1:η näyt- 15 95871 teet ruiskutettiin kapillaarikromatografiin valmistajan ohjeiden mukaan. Erotusraja määritettiin 0,1 ppm:ksi. Im-munogeenin sisältämä β-propiolaktonin pitoisuus määritettiin vähemmäksi kuin 0,05 ppm:ksi.

5 β-propiolaktonipitoisuus määritettiin kapillaari- kaasukromatografialla kahdeksasta näytteestä yllä olevan protokollan mukaan valmistettua immunogeeniä käyttäen voi-happoa sisäisenä vakiona. Kromatografiän olosuhteet olivat seuraavat: pylväs: 30 m x 0,25 mm silikageeli - avoin put-10 kimainen; kiinteä faasi: 100 5:n syaanipropyylisilikoni; injektorin lämpötila 140 °C; lämpötilaohjelma 70 °C/1 min, 20 °C/min 130 °C:seen; injektiotekniikka: keskeytyksetön. Yllä esitetyissä olosuhteissa β-propiolaktonin ja voihapon viivästymääjät olivat 7,52 minuuttia ja 6,70 minuuttia, 15 vastaavasti. 2 μ1:η injektio 1 ppm:n pitoista fi-propiolak-toniliuosta tuotti piikin, joka voitiin kvantitoida.

1 ppm:n liuoksen konsentroituminen yhteen kymmenesosaan tilavuudestaan liuottimen haihtumisen seurauksena 40 °C:ssa alipaineessa ei aiheuttanut mainittavaa β-pro-20 piolaktonin menetystä. Erotusraja konsentroitumisen jälkeen oli 0,1 ppm (0,1 /big/ml) .

Sen varmistamiseksi, että immunogeeni ei sisällä ulomman vaipan proteiineja, immunogeeni erotettiin ensin 11,0 %:n SDS-PAGE-geelissä U.K. Laemmiin menetelmän mu-.. 25 kaan, Nature 227 (1970) 680, joka on liitetty tähän viit teeksi. Eristetty materiaali siirrettiin sen jälkeen nit-roselluloosapaperille Towbinin et ai. menetelmän mukaan, Proc. Natl. Acad. Sei. 76 (1979) 4350, joka on liitetty tähän viitteeksi ja immunovärjättiin Tsangin et ai. mene-30 telmän mukaan, Meth. Enzymology 92 (1983) 377, joka on liitetty tähän viitteeksi. Kuten voidaan nähdä kuviosta 4, näin saaduissa Western Blot -kuvissa immunogeenissä ei ole gpl20/160:tä vastaavaa vyöhykettä, kuten korkeita pitoisuuksia anti-gpl60/120:tä sisältävällä seerumilla käsi-35 tellyt kontrollit osoittavat.

16 95871

Kuten kuvio 4 osoittaa, kaupalliset Western Blot -liuskat, joissa on HIV:n proteiineja (Bio-Rad, Richmond, CA) ("kaupalliset Western Blot -liuskat") seulottuna hete-rologisilla seerumeilla (simpanssin A86-C ja A-3), jotka 5 sisältävät vasta-aineita, joilla on korkea tiitteri ulomman vaipan proteiineille, gpl60/120, olivat negatiivisia (ei-reaktiivisia) Western Blot -liuskoilla, jotka oli valmistettu esimerkin 1 menetelmän mukaan ulommasta vaipasta vapaasta immunogeenistä. Homologiset ihmisen seerumit (003 10 ja 010), jotka sisältävät korkeita pitoisuuksia vasta-aineita ulomman vaipan proteiineille gpl60/120 olivat reaktiivisia kaupallisten Western Blot -liuskojen kanssa, mutteivät reagoineet ulommasta vaipasta vapaasta immunogeenistä valmistettujen Western Blot -liuskojen kanssa. Sekä 15 homologiset että heterologiset seerumit reagoivat muiden HIV-geenituotteiden kanssa.

Ulomman vaipan proteiinien puuttuminen immunogeeni-hiukkasista varmistettiin elektronimikroskopialla. Immuno-geenivalmiste fiksoitiin 2,5 %:n glutaraldehydillä, jälki-20 fiksoitiin 0s04:llä, dehydratoitiin nousevan etanolisarjän kautta ja valettiin EPON-812:een. Ohutleikkeitä valmistettiin LKB-mikrotomilla (LKB, Uppsala, Ruotsi) käyttäen ti-manttiveistä. Leikkeiden paksuus oli 60 nm. Leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla ja tutkit-25 tiin ja valokuvattiin Zeiss 109 -elektronimikroskoopilla- > · HIV-infektoituneet solut käsiteltiin samoin kuin kontrollit. Immunogeenistä nähtiin puuttuvan tummaksi värjäytyvän ulomman kuoren, joka esiintyi kontrollissa, joka kuvaa gpl60/120:tä viruksen pinnalla.

30 Esimerkki 2

Seropositiivisten yksilöiden immunoterapia « · * Yhdeksää HIV-seropositiivista yksilöä hoidettiin immunoterapialla. Valmistettiin esimerkin 1 menetelmän mukaan ei-infektiivisistä HIV-hiukkasista koostuva immuno-35 geeni, josta ulomman vaipan proteiinit puuttuivat. Immuno- 17 95871 geeni emulgoitiin suhteessa 1:1 epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin (incomplete Freund's adjuvant, IFA) emulgoin-tilaitteella (Spex 8000 Mixer Mill; Spec Industries, Inc., Edison, N.J.). 1,0 ml liuosta, joka sisälsi 100 Mg pro-5 teiinia, annosteltiin lihakseen. 100 M9 sisältävä uusin-tapistos ilman adjuvanttia annettiin 90 päivää myöhemmin ihonalie.

HIV-viruksen läsnäolo potilaan perifeerisen veren lymfosyyteissä määritettiin sekä ennen että jälkeen immu-10 nisoinnin viljelemällä yhdessä PHA:lla ja interleukiini 2:11a (IL-2) Gallon et ai. menetelmän mukaan stimuloituja juuri eristettyjä perifeerisen veren lymfosyyttejä, J. Clin. Microb. 25 (1987) 1291, joka on liitetty tähän viitteeksi. HIV-antigeenien osoittamiseen tarkoitettuja pak-15 kauksia, kuten p24 on kaupallisesti saatavissa (esimerkiksi HIV p24 Assays; E.I. DuPont & DeNemours Co., Inc., Wilmington, DE). Jokainen potilas testattiin kolme kertaa ennen immunisointia ja viikoilla 2, 4, 6, 8, 12 ja 14 immunisaation jälkeen.

20 Taulukko I esittää potilaiden viruseristyksen tu lokset. Potilailta 010 ja 003, joilta molemmilta HIV oli eristetty ennen immunisointia, ei löytynyt eristettävää virusta 12 viikon ajan immunisoinnin jälkeen. Potilaat 008 ja 009 todettiin viljelyllä vapaiksi viruksesta kahdeksan ·; 25 viikon ajan immunisoinnin jälkeen. Kaikilla neljällä näis tä potilaista oli ollut ennen immunisointia korkeat pitoisuudet anti-p24:ää (>1:5 000) ja RTI:tä (>1:1 000). Jäljelle jäävillä viidellä potilaalla, joilla oli matalammat anti-p24- ja RTI-pitoisuudet ennen immunisointia, esiintyi 30 edelleen eristettävää virusta immunisoinnin jälkeen.

Vaikka keksintöä on kuvattu viittaamalla tällä het- •« .

kellä parhaana pidettyyn tietojen koosteeseen, pitäisi olla selvää, että voidaan tehdä useita muunnoksia keksinnön hengestä poikkeamatta.

18 95871

Taulukko I

Seropositiivisten vireemisten ARC-potilaiden immunologiset ja virologiset profiilit g Sytologiset Immunologiset_ Virologiset

Poti- T-4 Anti- RTI N.A. Ennen Jälkeen (vk) las hn~ ral~ p24 2 4 6 8 12 14 _ nen keen c_ _ _ 003 518 671 250 000 2 560 40 +-- ------ 010 229 297 500 000 10 240 80 ++- ____ 10 008 288 371 16 000 2 560 80 -+- - - - - + 009 219 261 8 000 2 560 80 -+- 006 296 283 3 200 640 40 +-++++--+ 001 237 198 3 200 20 40 +++ 15 004 261 277 400 <20 20 007 180 259 200 80 10 +++ ++-++ 005 228 98 170 <20 14 -- + + + + + + + N.A. viittaa neutraloivaan vasta-aineeseen 20

Claims (2)

95871

1. Förfarande för framställning av en immunogen, som innehäller icke-infektiva HIV-partiklar, som saknar ytterhöljets proteiner gp 120 och gpl60, känne- 25 tecknat därav, att nämnda virus odlas, isoleras och görs icke-infektivt och därur tas bort ytterhöljesprotein-erna gp 120 och gp 160 pä i och för sig känt sätt.

1. Menetelmä immunogeenin valmistamiseksi, joka käsittää ei-infektiivisiä HIV-hiukkasia, joista ulomman 5 vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 puuttuvat, tunnettu siitä, että mainittua virusta viljellään, eristetään ja saatetaan ei-infektiiviseksi ja poistetaan siitä ulomman vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 sinänsä tunnetulla tavalla.

2. Menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat yhden tai useamman HIV-proteiinin kanssa, mutta eivät reagoi mainitun viruksen ulomman vaipan proteiinien kanssa, tunnettu siitä, että immunisoidaan yksilö, joka on muu kuin ihminen, patenttivaatimuksessa 1 mai- 15 nitulla immunogeenillä ja kerätään muodostuneet vasta-ai neet talteen.

20 Patentkrav

2. Förfarande för framställning av antikroppar, som reagerar med ett eller flere HIV-protein, men som inte 30 reagerar med ytterhöljesproteinerna av nämnda virus, kännetecknat därav, att man immuniserar en in-divid, som inte är en mänska, med en immunogen enligt patentkrav 1 och tar tillvara antikropparna som bildats.