JPH06500928A - 慢性疲労免疫不全症候群を診断および処置する方法ならびにそのための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １ｇ、ＣＡＶポリペプチドおよび薬学的に許容しうる担体を含有する組成物。

１９、ポリペプチドか免疫反応を生成させうるちのである請求項１８に記載の組 成物。

２０、ワクチン組成物である請求項１９に記載の組成物。

２１、　（ａ）ポリクローナル抗体の精製調製物：（ｂ）モ／りａ−ナル抗体組 成物；または（ｃ）組換え抗体組成物である、ＣＡＭポリペプチドの抗原決定基 に結合する抗体を含有する抗ＣＡＶ抗体組成物。

２２、所望により検出可能な１ｍまたは固体支持体に結合している請求項２１に 記載の抗体組成物。

２３、ＣＦＩＤＳの症状を示す患者の体液においてＣＡＶのポリヌクレオチド配 列の全部または一部の存在を検出することからなるＣＦＩＤＳを診断するための 方法。

２４、検出行程が、ＣＡＶポリヌクレオチド配列またはその相補体の全部または フラグメントを、インビトロで患者の体液の試料について行なうポリメラーゼ連 鎖反応におけるプライマーとして使用することからなり、配列の増幅がＣＦＩＤ Ｓの病因学的物質の存在を示す請求項２３に記載の方法。

２５、検出行程が、ＣＡＶポリヌクレオチド配列の全部またはフラグメントを、 インビトロで患者の体液の試料について行なうハイブリダイゼーション検定にお けるハイブリダイゼーションプローブとして使用することからなり、配列のハイ ブリダイゼー／ＮンがＣＦ　ＩＤＳの病因学的物質の存在を示す請求項２３に記 載の方法。

２６、ＣＦＩＤＳの症状を示す患者の体液において抗ＣＡＶ抗体の存在を検出す ることからなるＣＦｒＤＳを診断するための方法。

２７、検出行程が、ＣＦ■ＤＳ患者からの体液を、抗ＣＡＶ抗体と抗原−抗体コ ンブレノクスを形成しうる抗原性部位を提示するＣＡＶポリペプチドまたはタン パク質と接触させることからなる請求項２６に記載の方法。

２８　検出行程が、ＣＦＩＤＳ患者からの体液を、抗ＣＡＶ抗体に結合しつる抗 原性部位てあってＨＴＬＶ　ＩとＣＡＶの間またはＨＴＬＶ　ＩＩとＣＡＶの間 で共通する抗原性部位をフードしているＨＴＩ、ＶｌまたはＨＴＬＶＩＩ由宋の ペプチドまたはタンパク質と接触させることからなる請求項２６に記載の方法。

２９、ＣＡＶポリヌクレオチド配列または抗ＣＡ　Ｖ抗体について大量の血液か らの試料をスクリーニングし、該スクリーニングにおいて陰性と試験された試料 を選択し、該選択した試料に対応する血液部分から血液製品を調製することから なるＣＡＭによる感染のない血液製品を製造するための方法。

明　細　書 慢性疲労免疫不全症候群を診断および処置する方法ならびにそのための組成物本 明細書にて説明する発明は、健康およびヒト行政機関である米国国立衛生研究所 の認可および決定の下になされた研究結果である。

発明の背景 慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）は、免疫学および神経学的異常などの無 数の症状を特徴とする疾患である。しかし、ＣＦＩＤＳの症状は多くの他の状態 の症状と類似しているため、ＣＦｆＤＳの患者は心身症などの何等かの他の疾患 であると誤診されることが多い。実際、以下に掲げるＣＦＩＤＳの症状の幾つか またはそのすべてを特徴とする疾患は、慢性の活性エプスタイン・バールウィル ス感染症候群、慢性単球増加症、ウィルス後疲労症候群、低天然キラー細胞症候 群［Ｄ、　ＢｕｃｈｖａｌｄおよびＡ几、ＫｏｍａｒｏｆｆのＲｅｖ、　Ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓ、　、　＋３（捕１）：　５Ｉ２−W（１９ ９１）］、ローヤル・フリー病（Ｒｏｙａｌ　Ｆｒｅｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）、「 ユノビー病（ｙｕｐｐｉｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）」、神経衰弱症、および筋肉痛脳 を髄炎と診断されてきた［例えば、Ｌ、Ｗｉｌｌｉａ＋ｍｓのＴｉｍｅ、　１９ ９０年５月１４日、６６頁；　Ｌ　ＢｏｌｙのＨｉｐｐｏｃｒａｔｅｓ、　１９ ８７年７７８月、３１−４０頁；　Ｈ，Ｊ盾■■ ｓｏｎのＲｏｌｌｉｎｇ　５ｔｏｎｅ、　５６頁：およびＧ、　Ｐ、　ＨｏＬｎ ｅｓらのＡｎｎａｌｓ　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、　、　１O８：３８７− ３８９（１９８ｇ）を参照のこと］。

ＣＦ　Ｉ　ＤＳの実際の症例定義は最近になって規定された［Ｈｏｌｍｅｓら、 前掲コ。ＣＦｒＤＳの実際の症例定義（ｗｏｒｋｉｎｇ　ｃａｓｅ　ｄｅｆｉｎ ｉｔｉｏｎ）を満足するには、２つの主要な基準、および６つまたはそれ以上の 症状基準と２つまたはそれ以上の身体基準および８つまたはそれ以上の症状基準 を満たさなければならない。２つの主要な基準とは、寝床休息では回復せず、日 常活動が少なくとも半分に減退する程に重篤である持続的な再発または疲れ易さ であり、先夜する精神医学疾患などの他の慢性的臨床症状が排除されるものであ る。副次的基準には、穏やかな発熱または悪寒、咽頭癌、リッパ節痛、不明な全 身性筋肉虚弱、筋肉不快、筋肉痛、通常の運動レベル後における長期（２４時間 以上）全身疲労、新たな全身性頭痛（ｎｅｗｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｈｅａｄ ａｃｈｅｓ）、移動性非炎症関節痛、およびまぶしがり症、一時的視野暗点、健 忘症、過度興奮性、錯乱、思考困難症、集中不能およびうつ病などの神経心理学 症候群、睡眠障害、並びに急性または亜急性としての症状の初期発現などがある 。身体基準には、低度発熱、非滲出性咽頭炎、および触知可能のまたは敏感な前 方または後方頚部または腋窩リンパ節などがある。

最初に刊行物になったＣＦＩＤＳ様流行病は５０年以上も前にロサンゼルスで発 生した。１９４８年にはアイスランドにて１，１３６人が重篤な流行病にかかり 、米国、カナダおよびニューシーラントでは１９８４年に１００．０００人もの 人が罹患した。その後、ＣＦ［）Ｓ様の新たな大流行が着々と報告された。

ＣＦＩＤＳの症状はそれ以外の症状に類似しており、その診断には他の症状の存 在を排除させることが多いので、ＣＦＩＤＳの診断は困難かつ経費が高くなる。

エプスタイン・バールウィルス、特定のエンテロウィルスおよび６型ヒトヘルペ スウイルスなどの幾つかの特定の物質をこれまでＣＦＩＤＳ様疾患と関連付けて きたが、この症候群を適確に指摘するための特異的試験およびＣＦＩＤＳの病因 物質は現在のところ、確定的に同定されていない。

レトロウィルスは３つの亜科のＯｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ、　Ｓｐｕｍａｖｉｒｉ ｎａｅおよびＬｅｎｔｉｖｉｒｉｎ８ｅからなる球形包被ウィルス科のウィルス である。このウィルスはピリオンの特定の構造的特徴によってＢ型、Ｃ型または Ｄ型と命名される。報告されているこの特徴の中には、中心ヌクレオイドの位置 、低分子量ｇａｇ遺伝子タンパク質の存在、５’ＬＴＲにおけるトランスファー ＲＮＡプライマー結合部位（ＰＢＳ）のＤＮＡ配列、および感染宿主においてウ ィルスが誘起する症状がある。

哺乳動物ウィルス、マウス乳房オンコウイルス（Ｍ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　）などのＢ型 ウィルスは中心からずれた位置に配置する中心ヌクレオイドを有しており、成熟 ピリオンの細胞内および細胞外が電子顕微鏡によって見ることができる。

すべての既知のヒトレトロウィルスはＣ型ウィルスであり、オンコウイルス（Ｈ ＴＬＶ　Ｉおよび■）およびレンチウィルス（ＨＩＶＩおよびＨＩＶ２）は共に Ｃ型であって、この中心ヌクレオイドは同心的に局在し、成熟ビ１７オンは通常 細胞外にて認められる。外因性オンコウィルスおよびレンチウィルスはを椎動物 間に広く存在し、多くの疾患と関係している。

Ｃ型オンコウィルスとしては、ＨＴＬＶ　Ｉおよび■なとのヒトＴ細胞リンパ趨 向性ウィルス（ＨＴＬＶ）などがある。これらのＨＴＬＶウィルスは、特定の稀 なヒトＴ細胞悪性腫瘍とリンクしている。ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−Ｉ関連を髄 障害（ＨＡＭ）または局所痙彎性不全対麻痺（ＴＳＰ）と呼ばれる中枢神経系の 慢性脱髄疾患と関係している［Ｅ、　ＤｅＦｒｅｉｔａｓらのＡＩＤＳ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、　３（１）：１ ９−３１（１９８７）コ。ＨＴＬＶ−１および■の両者はＡＩＤＳの多くの症例 においてＨＩＶとの同時感染として報告されている。この科の一員である２つの ＨＴＬＶ　ＩおよびＨＴＬＶ　Ｉｔはクローンされ、配列決定されており、進化 論的には開数ウィルスサブグループを代表すると思われる。ＨＴＬＶ　ｌの配列 はＭ、５ｅｉＴＬＶ　ＩＩのヌクレオチド配列はに、　Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏら のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ｌ　ｕ、　ｓ、＾A。

影３１ＱＬ−３１０５（１９８５）に開示されている。

Ｃ型レンチウィルスにはヒトレトロウィルス、ＨＩＶ−１（ＡＩＤＳの原因物質 ）およびＨＩＶ−２、並びにウマ感染貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）などがある。

現在までのところ、他の非Ｃ型レトロウィルスまたはＤ型レトロウィルスが霊長 類動物にて同定されているが、それはヒトではない。マラソン・ファイザー・サ ルウィルス（ＭＰＭＶ）は、新生児のサルに接種した場合に後脚の麻痺およびリ ンパ細胞の枯渇を貸すＤ型ウィルスである［Ｄ、ＦｉｎｅらのＣａｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ、　、　３８：３１２３−３１３９（１９７８月。Ｄ型ウィルスはヒ）Ｔお よびＢ細胞への感染能によっても特徴付けられる。〔例えば、Ｍ、　Ｄ、　Ｄａ ｎｉｅｌらの５ｃｉｅｎｃｅ、　２２３：６０２−６０５（１９８４）　；　Ｃ ，Ｓ、　Ｂａｒｋｅｒら■uｉ ｒｏｌ、　、　１５３：２０！−２１４（１９８６）　：　Ａ、＾几ａｃｋｎｅ ｒらのＣｕｒｒ、　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　Ｉ高高浮獅盾戟A　＋ 　１６０ ニア７−９６（１９９０）を参照のことコ。

スブーマ（Ｓ　ｐｕｍａ）ウィルスの亜科には、フォーミー（Ｆ　ｏａｍｙ）ウ ィルスがある［ＪＪ、　ＨｏｏｋｓらのＢａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　、　 ３９゜１６９−１８５（１９７５）二かある。フォーミーウィルスの１０ｇの血 清型は種々の旧世界および新世界サルにて同定されているが、これは試験されだ すへての動物において非病原性であるらしい。

ＣＦＩＤＳの出現を検出するための、患者を適切に診断できる診断法、および感 染症を処置し、および／または望ましくは感染症を予防するための治療用および ワクチン物質がめられている。

発明の概要 本発明は、以下、ＣＡＭと弥する、実質的に単離された新規な慢性疲労免疫不全 症６！群−関連ウイルスに関する。ＣＡＶのポリヌクレオチド配列およびＣＡＶ のポリペプチドはＣＦＩＤＳ、１者の診断における診断試剤として有用である。

ＣＡＶのポリヌクレオチド配列およびＣＡＶのポリペプチド配列は、ＣＦＩＤＳ を処置または予防するための治療用またはワクチン組成物として有用である。

本発明はさらに、ＣＦｆＤＳを者を診断し、および／または処置するための方法 および検定方法を開示するものである。ＣＡＶ抗原領域に対する抗体およびＣＡ Ｍポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含有するインビトロ細胞も開示す る。

本発明の他の目的および好都合な点は以下の詳細な説明の項にてさらに詳しく説 明する。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢは、ＣＡＶの可能性あるＤＮＡ配列断片を説明するものである 。このＤＮＡ配列の一方の鎖は図面ＩＡに示し、その相補配列は図ＩＢに示して いる。

図２八から２Ｆは、図ＩＡおよびＩＢの推定ＣＡＶポリヌクレオチド配列の可能 性ある６つの解読枠を説明するものである。

図３は、ＣＡＶによって感染されたヒトＨ−９リンパ芽腫Ｔ細胞の、実施例１で 説明している電子顕微鏡写真である。

図４は、ＣＡＶによって感染されたヒトＢ　−Ｊ　ａｂリンパ芽１ＩＩＢ細胞の 、実施例１で説明しているもう１つの電子顕微鏡写真である。

発明の詳細な説明 本発明は、慢性疲労免疫不全症候群と呼ばれる疾磨を誘起するか、または少なく ともそれに寄与するウィルスによる、ヒトおよびことによるとその他の哺乳動物 の感染を検出、処置および予防するための方法および組成物に関する。本発明は 、明らかに未知のＣＦＩＤＳ−関連ウィルス、ＣＡＭの本発明者らによる発見、 およびその実質的な単離に関係している。

ＣＦＩＤＳ症状を示すヒトおよび動物の患者の少なくとも数パーセントはＣＡＶ に感染されていると考えられる。この疾患に通常伴われる身体的症状、例えば臨 床症状のパターンを伴う慢性疾患の存在、免疫学的異常、ヘルペスウィルスの活 性化および中枢神経系の異常に基づけば、このウィルスは統計的に宵意な数の被 疑ヒトＣＦＩＤＳ患者の体液中に存在している。このウィルスの存在が陽性だと 試験されない被疑ＣＦＩＤＳ患者とは、彼らが別の疾患に罹患しているか、また は検定した体液中のウィルスの感染レベルが現在のところ検出不能であるか、の いずれと考えられる。このウィルスはまた、上記のＣＦＩＤＳ症状に類似した症 状を伴う別の疾患の原因物質であるとも考えられるが、これらの疾患は別の名称 によって知られている。

ＣＦＩＤＳ症状を伴うヒト患者の体液中の細胞に見いだせるＣＡＶおよびそのポ リペプチドは、そのウィルスおよびそのポリペプチドが天然供給源に同時に存在 している夾雑物から実質的に単離されている。ＣＡＶまたはそのポリペプチドは 、その生産手段、例えば組換え法または化学合成に伴われる夾雑物からも、実質 的に単離することができる。このような天然供給源および／または生産供給源に は、ヒト細胞または細胞成分、ＣＡＶに感染した他の任意の動物の細胞または細 胞成分、宿主細胞発現系、細胞培養上清、化学的精製溶出液などがある。

ＣＡＶまたはＣＡＶポリペプチドに関して本明細書に使用している「実質的に単 離」または「精製」なる用語は、以下のように規定される。ＣＡＶまたはそのポ リペプチドの組成物は、供給源に対するそのＣＡＶまたはそのポリペプチドのパ ーセンテイジが池の夾雑物とは無関係に重量百分率で少なくとも１０％である天 然または生産供給源から、上述のように実質的に単離される。天然または生産供 給源から［実質的に単離される−という定義は、重量百分率で少なくとも２５％ の精製バーセンテイジを達成することをも包含する。同様に、ＣＡＶまたはその ポリペプチドの組成物は、供給源に対するそのＣＡＶまたはそのポリペプチドの バーセンテイジが他の夾雑物とは無関係に重量百分率で少なくとも４０％である 天然または生産供給源から、上述のように実質的に単離される。実質的に単離さ れる、の定義には、重量百分率で少なくとも６０％の精製バーセンチイノを包含 することができる。

このウィルスは以下の形態学的、物理学的または生物学的特徴の１つによって特 徴付けることができる。このウィルスはまた、本発明のＣＡＶ始原型ウィルスの ２つまたはそれ以上の上記の特徴の組みによって特徴付けることもできる。

ｒＣＡＶｊなる用語はウィルスの分類学者が理解しているところによると、本明 細書にて説明する始原型単離体によって特徴付けられる全ウィルス種を包含する ものである。ＣＡＶは以下で説明する始原型単離体および他の単離体の両者を包 含すると考えられる。分類学者が新規なＣＡＶ単離体を同定し、分類分けするた めに使用できるであろう始原型単離体の多くの特徴か存在する。以下の実施例で 特別に例示している始原型ウィルスに基づけば、ＣＡＶはレトロウィルス、特に ヒトに感染できる非Ｃ型レトロウィルスであると形態学的に特性化できる。感染 されたヒト細ｌ１８培養内に形成されるウィルス粒子の電子顕微鏡によれば（図 ３および４を参照のこと）、ＣＡＶはその直径、形態、細胞内ピリオンの形成お よび局在から、非Ｃ型レトロウィルスであることが示される。さらに詳細には、 実施例１にて示されているように、ＣＡＶ感染細胞は電子−集密な円形ピリオン によって特性化でき、粗面小胞体および細胞内の大きく異常に膨張したミトコン ドリアに関連してその幾つかは電子−ルーセン）　（ｌｕｓｃｅｎｔ）なコアで あり、また電子−集密なコアであるものもある。すへての粒子は同じ形と大きさ である［４６−５０ｒ＋ｍ（４６０−５００人）：。細胞外ウィルスは観察され ない。細胞質膜からの出芽形成も観察されない、従って、ＣＡＶ！ｉｉ！ｌ＋東 細胞も、細胞質内粒子の存在によって特性化することかできよう。

ＣＡ、　Ｖは従来ＣＦＩＤＳに同定されていたウィルス、即ちエプスタイン−バ ールウィルス、ＨＨＶ−６および種々のエンテロウィルスとは明確に区別される と考えられる。ＣＡＶの形態学も、それをヒトＣ型レトロウィルス、ＨＴＬＶｒ およびＨＴＬＶ　［１と明らかに区別する。ＣＡＶは、そのピリオンのミトコン ドリア内における見かけの局在がＨＩＶと異なっている。

ＣＡＭの１つの特徴は、ヒトのＢおよびＴ細胞の両者を感染できるその感染能の ようである。実施例１にてより詳細に説明するように、このウィルスは、ＣＦＩ ＤＳ患者由来の白血球を２つの型のヒトセルライン、Ｈ９リンパ芽ＷＴ細胞およ びＢ　−Ｊ　ａｂリンパ芽腫Ｂ細胞と混合することにより、培養物中にて明らか に増殖された。これらのセルラインはそれぞれＨＴＬＶ　ＩおよびＨＴＬＶ　ｌ ｌにとっても許容的である。これら両セルラインは、ゼノトロピノク霊長類り型 ウィルス、例えばマソン・ファイザー・サルウィルス（ＭＰＭＶ）、およびフォ ミー（スブーマ）ウィルスにとって許容的である［Ｆｉｎｅら、Ｄａｎｉｅｌら 、Ｂａｒｋｅｒら、およびＨｏｏｋｓらの前掲を参照のこと］。

ＣＡＭを特性化できる可能性ある別の特徴は、その見かけのｔＲＮＡプライマー 結合部位（ＰＢＳ）優先性である。レトロウィルスは、特定のタイプのアミノ酸 のためのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に結合するその５’ＬＴＲのＵ５領 域内におけるＤＮＡ配列によって分類することができる［例えば、Ｐ、　Ｈａｒ ａｄａらのＪｐｎ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、　８１　：２３２−２３７（１９９０）を参照のこ とコ。例えば、ＨＴＬＶ　ＩまたはＨなどのＣ型ウィルスは、プロリンのための ｔＲＮＡと結合するｔＲＮＡプライマー結合部位・ＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣ ＧＧＧＡＴを有している。実際、すべての哺乳動物Ｃ型ウィルスはＨＩＶを除い てプロリンのためのｔＲＮＡ部位を使用している。実施例７に詳細に説明するよ うに、そのｔＲＮＡ結合部位を決定するためにＣＡＶのＵ５領域を増幅するには 、ＰＣＲ法を利用した。この実験の結果から、プライマー結合部位はリジンのｔ ＲＮＡのためのものであることが示された。

この結果はさらにＣＡＭか非Ｃ型レトロウィルスであることを示している。

分類学者がＣＡＭを特性化できるさらに別の方法は、低分子量ｇａｇタンパク質 、ｐｉｔ−１２、ｐ１３−１４、ｐ２７−２８の存在に基つくものである。実施 例８にて詳細に説明するように、ＨＴＬＶ　ｌ、［１およびサルＴ細胞すンパ趨 同ウィルス（Ｓ　Ｔ　Ｌ　Ｖ）のｇａｇタンパク質における抗原決定基を認識す るマウスモノクローナル抗体（Ｍ　Ａ　ｂ　）Ｋ−１１，ＤｅＦｒｅｉｔａｓら のＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ 、　３：　１９−３２（１９８７）の２６頁第２表にてＨＴＬＶ　ｔ　ＭＡｂと して記載されているコを使用し、上記の分子量の見かけＣＡＶ　ｇａｇタンパク 質を、ＣＦＩＤＳ患者の白血球から免疫沈降させた。霊長類および非霊長類動物 のレトロウィルスのクラスはこのように特徴的なサイズのｇａｇタンパク質を有 している［Ｊ、ＬｅｉｓらのＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　６２　：　１８０８−１ ８０９（１９８ｇ）Ｅ、。

このウィルスは、それが感染した細胞の核および細胞質内にウィルスｇａｇタン パク質の存在を誘起させる能力を有しているようである。従って、ＣＡＭはまた 、ＫＩＭＡｂを使用するＣＦＩＤＳ白血球の免疫組繊化学的染色によっても、感 染細胞の核および細胞質内に局在するウィルスｇａｇタンパク質を有するものと して特性化できる。このウィルスｇａｇタンパク質局在の特性も非Ｃ型レトロウ ィルスを示すものである。このウィルスはまた、ＨＴＬＶ　ＩおよびＨＴＬＶＨ のｇａｇａ（Ｅ、子配列とは異なるｇａｇ遺伝子配列の存在によっても特性化す ることかできる。

以下の第１表および第２表は、上述のウィルス特性に基づいてＣＡＶおよび他の 既知のヒトおよび他の動物レトロウィルス間の相違を比較し、既知のレトロウィ ルスが感染官主内で誘発させる症候を説明するものである。

第１表 ＬＲＮＡリジン　核内に生成さ　ｇａｇタンパク質ヒトＴ及びＢ　ＥＭによる　 ブライナーの　れるｇ　ａ　ｇ　９　ｐＨ−１２，９１３−１４゜ウィルス　細 胞の感染性　細胞質内粒子　使用　ンパク質　ｐ２７〜２８　（Ｍｒ）ＭＭＴＶ 　Ｏ’　−＋　Ｑ　＋ ｑ型（オンコウイルス） １類　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　。

ＥＩＡＶ　Ｏ−＋−＋　Ｏ＋ １）プラス（４−）は、文献に報告されていること、または本出願においてＣＦ ＩＤＳとして報告している２）ゼロ（０）は、本発明者らの知る限りでは文献に 報告されていないことを意味する。

３）ｇａｇタンパク質の特性は文献には報告されていないが、ＤＮＡの配列決定 によって推定したものである。

第２表 ＣＦＩＤＳレトロウィルスと既知型ウィルスとの相関関係報告された総合的症状 ウィルス　の形成　免疫担専１　神経学的不全　疲労／困憑　ヘルペスの反応性 ＭＭＴＶ　ＯＯＯＯＯ ｑを（オンフウィルス） 鳥類　Ｑ　＋　＋　＋　＋ （）ＩＴＩＪ　Ｉおよび■） Ｅ＋ＡＶ　Ｏ＋　Ｑ　＋　Ｑ ４）神経組織から単離 ＣＡＶまたはそのウィルスのサブタイプは、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかのポリ ヌクレオチド配列の存在によって特徴付けることができ、その配列は、実質的に 単離されたウィルスを含有する供給源にポリメラーゼ鎖反応法（ＰＣＲ）などの 標準的な配列決定法を適用することによって入手でき、またそのヌクレオチドを 同定することができる。本明細書に記載の手法および配列を使用することにより 、実質的に単離されたウィルスのポリヌクレオチド配列をその供給源から入手す ることは当業者にとって常套手段である。このような供給源は天然供給源または 生産供給源として既述したものである。

故に、ＣＡＶまたはそのサブタイプウィルスのポリヌクレオチド配列は本発明の 一部を構成する。ＣＡＶの配列とは１つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なっ ているが、ＣＡＶと相同的な配列をコードしている配列も、本発明の範囲内に包 含される。ＲＮＡのウィルス複製の転写誤差は高率であることがら、ＣＡＭのポ リヌクレオチド配列は単離体間の特定の変動によって特性化され、および超可変 領域またはドメイン間もあり得るがその特定の変動によっても特性化され得る。

別個のＣＡＶサブタイプは、本明細書に記載している始原型ウィルスの配列とは 異なっているが、ゲノム構造体および保存配列の大きな領域を共有している配列 によって特性化することができる。具体的には、ウィルスにコードされている酵 素の配列は、ＣＡＭのサブタイプ間では類似していると期待される。ＣＡＶサブ タイプ間のアミノ酸レベルでのウィルス相同性は少な（とも４０％であると期待 できる。より具体的には、このような相同性は約４０％から約９５％であると期 待される。サブタイプ間の相同性は少なくとも５０％と言える。他のサブタイプ のＣＡＶは少なくとも６０％またはそれ以上のアミノ酸相同性を存することがで きる。幾つかの単離体は少なくとも７０％の相同性を有し、また少なくとも８０ ％または９０％の相同性を有するものもある。

ＣＡＶポリヌクレオチド配列は厳しいまたは緩やかなハイブリダイゼーンジン条 件下ＥＴ、　ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（＾Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ窒奄獅■ ）１ａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９１１２）、　３８７−３８９頁］ にて、天然のＣＡＭヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤ　Ｎ　Ａ　）配列とハイブリ ダイズする配列を包含すると考えられる。好ましくは、ＣＡＭ配列のハイブリク イセーノヨンのために高いストリンノエンンーの条件を用いる。本発明のポリヌ クレオチド配列は、ＣＡＶの抗原部位をコードするポリヌクレオチド配列と厳し い条件下でハイブリダイズすることもできる。厳しいハイブリダイゼーンジン条 件としては、６５°Ｃにおける４ＸＳＳＣのハイブリダイセー／ヨンの後に６５ °ＣにてＱ、１ｘｓｓｃで１時間洗浄することが例示される。あるいは、厳しい ハイブリグイゼーション条件の例として、５０゛Ｃにおける５０％ホルムアミド 、ＪＸＳＳＣ中のものか挙げられる。

ポリヌクレオチド配列は緩やかなハイブリダイゼーション条件下にて天然のＣＡ Ｖ配列とハイブリクイズできる。このような厳しくないハイブリダイゼーション 条件の例は、５０’Ｃの４ＸＳＳＣまたは４２°Ｃで３０−４０％ホルムアミド を用いるハイブリダイゼー／ｇンである。

本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重によって上記のＣＡＶポ リヌクレオチド配列とは異なる場合もある。さらに、本発明のポリヌクレオチド 配列は、ＣＡ　Ｖポリヌクレオチド配列の相補物（ｃｏａ＋ｐｌｅｍｅｎｔ）で ある配列である場合がある。ＣＡＶのポリヌクレオチド配列はＨＴＬＶ　ｌまた はＨＴＬＶ　ｆｆには見いだされない配列を含有すると期待される。

ＣＡＶのＤＮＡ配列のアレル変異体（アミノ酸の変動を賀すまたは貸さない場合 もある種集合における天然に存在する塩基の変動）、およびその同族体または誘 導体も本発明に包含される。同様に、ＣＡＶペプチドまたは抗原部位をコードす るＤ　Ｎ　Ａ配列であるが、遺伝子コードの縮重、または点突然変異またはそれ によってコードされているペプチドの活性、半減期若しくは生産性を増強するた めの誘発修飾に起因するＣＡＭのＤＮＡ配列の変動、によってそのコドンの配列 が異なっているＤＮＡ配列も、本発明に包含される。

ＣＡＭ配列内における目的の修飾として、コード化配列内で選択されたヌクレオ チド（１！＄）またはアミノ酸残基（群）の置換、挿入または欠失が挙げられる 。例えば、構造遺伝子の操作は、正しいアミノ酸（群）を保持させると同時に、 個々のヌクレオチドを変動させることによって行うことかでき、あるいはそのヌ クレオチドは生物学的活性を喪失させることなく、アミノ酸配列を変化させるよ うに改変することができる。このような置換、挿入または欠失のための突然変異 手法、例えばインビトロ突然変異およびプライマー修復は当業者に周知である［ 例えば、米国特許第４，５］８，５８４号を参照のことつ。

ＣＡＶのポリヌクレオチド配列の１つの可能性ある供給源は、ヒトＣＦＩＤＳ患 者由来の白血球と同時培養した組織培養細胞からの抽出上清から入手されるＤＮ Ａである。このＤＮＡは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ タペスト条約の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・フレクション（ＡＴＣ Ｃ）、米［Ｅ１２０８５２メリーランド、ロックビル、バークローン・ドライブ １２３０１に１９９１年８月２８日に寄託され、ＡＴＣＣＮｏ　と番号付けされ た。

ＣＡＶポリヌクレオチド配列は、断頭されたＣＡＶを含をする５ａｕ３ＡｔＰ！ ｉ化したゲノムＤＮＡのラムタＦｉｘ増幅ファージライブラリーにｌ１ｌＩ的な 配列決定法を適用することにより入手でき、そのヌクレオチドも同定でき、これ も同様にＡＴＣＣへ１９９１年８月２８日に寄託され、ＡＴＣＣＮｏ　と番号付 けされた。

標準的な配列決定法を適用して入手できるＣＡＶポリヌクレオチド配列の可能性 ある供給源の別のものは、断頭されたＣＡＶを含有するＢａＬＩＩＨＩ消化した ゲノムＤＮＡのＥ　、　ｃｏｌ　ｉ枕内ブルースクリプト・プラスミド・ライブ ラリーであり、これも１９９１年８月２８日にＡＴＣＣへ同様に寄託され、ＡＴ ＣＣＮｏ、−□と番号付けされた。

ＣＡＶポリヌクレオチド配列は、上記のＡＴＣＣ寄託物のいずれかから入手され る核酸配列を含有することができる。ＣＡＶまたはそのサブタイプは、以下の図 ］ＡおよびＩＢに示しているＤＮＡ配列のすべてまたはその一部を含有するもの としても特性化することができる。これに加え、他のＣＡＶ配列は上記の寄託物 または他の動物の細胞供給源から入手でき、および／または作製できる。本発明 のＤ　Ｎ　Ａ配りｆｌは、上記のＡＴＣＣ供給源のいずれが由来のＤＮＡ配列と 厳しい条件Ｆでハイブリダイズすることもできる。本発明のＤＮＡ配列はまた、 図ＩＡおよびＩＢのＤＮＡ配列と厳しい条件下でハイブリダイズできる。

ＣＡＭは、図１または図２の配列を含有するものに限定されない。ＣＡＶの最終 的特徴は、本明細書に記載している始原型単離体に関係するウィルス分類学者の 技術的範囲内にある。既述した１つまたはそれ以上の特徴はいずれも、新たな単 離体をＣＡＭと分類するのに十分であり得る。

本発明のさらに別の態様は、実質的な単離型のＣＡＶポリペプチドである。ＣＡ Ｍまたはそのサブタイプウィルスのポリペプチド配列も本発明の一部を構成する 。ＣＡＶポリペプチドは既述のＣＡＶポリペプチド配列によってコードされ得る 。ＣＡＭポリペプチドはＣＡＶのゲノムによってコードされている少なくとも１ ０個のアミノ酸配列を含有しているものが好ましい。ＣＡＶポリペプチドはＣＡ Ｖ抗原決定基のすべてまたはその断片も含有することができる。また、ＣＡＶポ リペプチドは構造ウィルスタンパク質のすべてまたはその断片を含有することも できる。ＣＡＶポリペプチドはさらに、ウィルスの非構造タンパク質のすべてま たはその断片も含有できる。

ＣＡＶのポリペプチド配列とは異なる１つまたはそれ以上のアミノ酸変異を含有 するポリペプチド配列であって、ＣＡＶとのアミノ酸レベルでの相同性を共有し ている配列をフードするポリペプチド配列も、本発明に包含される。既述のよう に、ウィルス復製の転写誤差により特定の超可変アミノ酸領域またはドメインに よって特性化されるＣＡＶポリペプチド配列が産生される場合がある。別個のＣ ＡＶサブタイプの特徴は、本明細書に記載している始原型ウィルスのポリペプチ ドと異なっているポリペプチド配列であって、本明細書記載の始原型ウィルスと 全構造（−次、二次および三次）組織体および保存配列の大きな領域を共有する ポリペプチド配列であり得る。具体的には、ウィルスによりコードされている酵 素配列はＣＡＶのサブタイプ間で類似していると期待される。

ＣＡＶサブクイブについてのアミノ酸しヘルでのウィルス相同性は少なくとも４ ０％と期待されろうより具体的には、このような相同性は約４０％から約９０％ の範囲内にあると期待される。サブタイプ間の相同性は少なくとも５０％であり 得る。他のＣＡＶのサブタイプは少なくとも６０％またはそれ以上、例えば７０ ％または８０％のアミノ酸相同性を有することができる。この相同性は、全ゲノ ム、またはその別個の断片、例えば個々のウィルスタンパク質コード化ドメイン 、特に保存（非〜構造）タンパク質、または本明細書に記載している配列のいず Ｉ　。

れかにわたって評価することができる。

本発明の他のポリペプチド配列として、厳しい条件下でＣＡＶアミノ酸配列配列 イブリダイズできる配列を挙げることができる。本発明のポリペプチド配列はま た、ＣＡＶの抗原部位をコードするアミノ酸配列とも厳しい条件下でハイブリダ イズできる。ＣＡＶのポリペプチド配列はＨＴＬＶ　ＩまたはＨＴＬＶ　ＩＩに 見いだされない配列を含有していると期待される。

修飾ＣＡＶポリペプチド、その同族体または誘導体も本発明に包含される。ＣＡ Ｖポリペプチド同族体には、ＣＡＶと少なくとも４０％の相同性を有する突然変 異または修飾タンパク質またはポリペプチドなどがあり得る。さらに詳細には、 修飾ＣＡＶタ／バク質は天然ＣＡＶポリペプチドと約６０％の相同性を有するこ とができ、最も好ましくは約８０％以上の相同性を有するものである。

通常、ＣＡＭポリペプチド同族体は１．２．３、または４つだけのコドンが異な っている。例示すれば、天然のＣＡＭポリペプチドのアミノ酸配列、または上記 のＣＡＶポリペプチドのいずれかと若干のアミノ酸変動しが有していないＣＡＶ ボッペプチド、特に保存的アミノ酸置換を有するＣＡＶポリペプチドが挙げられ る。保存的置換とは、その側鎖に関連があるアミノ酸のグループ内で起こる置換 である。遺伝子的にフードされているアミノ酸は一般に４つのグループに分類さ れる。　（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、 アルキニン、ヒスチジン；（３）　非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソ ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および （４）　非＝ｉ極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システィン、セリ ン、スレオニン、チロ７ン。フェニルアラニ／、トリプトファンおよびチロシン は芳香族アミノ酸として一括分類される場合が時にある。例えば、ロイノンをイ ンロイノンまたはバリンと、アスパラギン酸をグルタミン酸と、スレオニンをセ リンと、単離して置き換えることを、またはあるアミノ酸を構造的に関連するア ミノ酸と同様に保存置換してらＣＡＶポリペプチドに対して大きな作用を与えな いと、期待するのは妥当である。

ＣＡＶおよびポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を単離し、同定できれば 、ウェスターン・プロ、ト、ＥＬＩＳＡまたは池の診断検定、免疫学的または治 療学的組成物および抗体およびワクチン組成物を作成するための免疫学的組成物 に有用である診断用試薬およびプローブを開発することも可能になる。これらの 組成物はＣＦＩＤＳまたはその関連疾患の診断、処置および予防に有用であり得 る。

このように本発明は別の態様として、ＣＦＩＤＳまたはその関連疾患の診断に有 用である診断用試薬を提供するものである。以下でさらに詳細に説明するように 、このような試薬は、ＣＡＶポリヌクレオチド配列、例えばその相補的配列およ び上述の他の配列を含有することができる。このような試薬は上述のＣＡＶポリ ペプチド配列も含有することができる。ＣＡＭ配列は要すれば、診断可能なリガ ンド、治療学的または毒素分子を伴うことができる。

本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド試薬はＨＴＬＶ　Ｕ　ｇａｇタン パク質内に存在する配列およびＣＡＭ内に存在する配列と結合できる。この試薬 はＣＡＶに対する抗体とハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列をも含有で きる。この試薬は患者のＣＡＭを検出するためのハイブリダイゼーションプロー ブの形態であることができる。また、この試薬はＣＡＶの他の配列を増幅できる ＰＣＲプライマーの形態であることができる。さらに、この試薬はＣＡＶ配列の エピトープまたは抗原性部位に対する抗体であってもよい。

本発明の試薬としてＣＡＶポリヌクレオチド配列を使用するＰＣＲプライマー配 列は通常のＰＣＲ手法に従って、少なくとも約５０塩基長であり、その間に少な くとも１００塩基から１５００塩基もの大きさの介在配列を伴う。約３０ヌクレ オチドまでの比較的大きな配列か実際的な上限として使用できる。しかし、これ よりも大きいかまたは小さい配列長もＰＣＲ手法を改変させる上で有用な場合が ある。本発明においては、プライマーの長さは本明細書の開示によって限定され ない。

同様に、本発明のハイブリダイゼーションプローブは現在の技術に基づけば、少 なくとも１０塩基長のものが望ましい。通常、このようなプローブ配列は約５０ 塩基長よりも大きくない。プローブの長さは１５がら３ｏ塩基の長さのものがよ り好ましい場合がある。しかし、本発明の方法および組成物では、それよりも小 さなおよび大きなプローブ配列が有用な場合もある。プローブの長さは本発明を 限定するものでなく、当業者ならば、適当な長さのプローブを設計できる知識を 有していると憩われる。本発明のハイブリダイゼーションプローブは上述のよう に、検出可能な襟識物を伴うものが望ましいことがある。

本発明のプライマーおよびプローブは、通常の検定方法、および下記の検定方法 で使用するため、標的ＣＡＶ配列と選択的にハイブリダイズできる。本明細書で 使用する「選択的ハイブリダイゼーションＪとは、プローブが、感染患者から入 手した臨床試料中の標的ＣＡＶ配列と適切なストリンジエンシーの下に検出可能 にハイブリダイズできるが、ＣＡＶとは無関係な試料中の他の配列とは検出可能 にハイブリダイズできないことを意味するものといえる。この要件を備えた配列 は、当業者ならば、プローブ配列と所望の標的ＣＡＶ配列との間の相同性の機能 レベルに基づいて設計できる。目的とした用途にとって充分な長さと相同性を有 しているプローブのみが選択的にハイブリダイズし、許容される非適合の数がプ ローブの長さに伴って増大する。通常、プローブは少なくとも１５ヌクレオチド の長さのものであり、より好ましくは少なくとも２ｏ、普通は少な（とも２５ヌ クレオチド長のものである。

本明細書中に記載した全てのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、 それらが診断もしくは治療用の試薬として使用するためのものであるが、または 研究もしくはその他のためのものであるかを問わず、当業者に既知の方法によっ て調製することができる。このような方法には、化学合成法（酵素合成法を含む ）、組換え遺伝子操作法（ＰＣＲを含む）、またはこれら既知の方法の種々の組 合せが含まれる。

本発明のポリペプチド配列の合成を、Ｍｅｒｒｉｒ　１ｅｌｄ［Ｊ、＾、Ｃ，Ｓ 、、　８５：　２１４９−２１５４　（＋９６３）］が記載している固相合成法 に従って行なうのが好都合である。この方法はよく知られており、ペプチド調製 用には普通の方法である。ペプチド合成のための別の方法を、Ｂ　ｏｄａｎｓｚ ｋｙらＣＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　ａｎｄ　５ｏｎｓ：　１９７６）］が記載している。例えば、本発明のペプチ ドを標準溶液ペプチド合成法を用いて合成することもできるが、この方法は化学 もしくは酵素法のアミド結合形成を用いてアミノ酸もしくはペプチドフラグメン トを段階的もしくはプロ、り結合させることからなる［例えば、Ｈ，Ｄ、Ｊａｋ ｕｂｋｅ、　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、＾ｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔ７中、 　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７）＋　ｐ、　 １０３−１６５；　Ｊ、Ｄ、Ｇ１ａｓ＋＋。

同書、　Ｉ）ｐ、１７６−１８４：および欧州特許０３２４６５９　Ａ２　（酵 素によるペプチド合成法を記載）を参照］。これらの文献はツ照として本明細書 の一部を構成する。

また、本発明の全てのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を、通常の 遺伝子操作法によって調製することができ、そして所望により修飾することがで きる。ペプチドを既知の組換えＤＮＡ法で調製することができるが、これには選 択したペプチドの暗号配列を担持するＤＮＡフラグメントを宿主微生物または細 胞内でクローニングおよび発現させることが含まれる。種々の微生物および細胞 （例えば、細菌、哺乳動物細胞、酵母、バキュロウィルスおよび昆虫細胞を含む ）中で選択したポリペプチドをクローニングおよび発現させるための系は既知で あり、公的および非公的な研究所および寄託所から、ならびに市販供給元から入 手することができる［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）をも磐照］。

上記のようにして得たか、または上記のようにして修飾したＣＡＶ　ＤＮＡを選 択した発現ベクターに導入して、Ｃ、Ａ　Ｖポリペプチドを発現させる方法に使 用するための組換え分子またはベクターを作成することができる。移しい種類の 適切な発現ベクターが、通常の分子生物学的方法にょる哺乳動物（ヒトを含む） 発現、昆虫細胞発現、酵母における発現、菌類における発現および細菌発現用に 当分野で知られている。

これらのベクターおよびベクター構築物は、本発明のＣＡＶポリペプチド（その 抗原性または免疫原性フラグメントを含む）をフードしている本明細書記載のＣ ＡＶ　ＤＮＡ配列を含有している。また、本方法に使用するベクターは、本発明 のＣＡＶ　ＤＮＡ暗号配列と機能的に結合した選択した調節配列を含有している 。選択したベクター中に存在しているのが好ましい調節配列には、プロモーター フラグメント、ターミネータ−フラグラント、ポリアデニル化配列、エンハンサ −配列、マーカー遺伝子、および適当な宿主細胞においてタンパク質の発現を指 令する他の適当な配列が含まれる。また、機能的なスプライス供与および受容部 位を有するイントロンおよびリーダー配列を、所望により発現構築物中に含有さ せてもよい。得られたベクターは、選択した宿主細胞中でＣＡＶの複製および発 現を指令することができる。発現構築物は、選択した宿主中で安定に維持されう る染色体外要素（例えば、プラスミド）などのレプリコン中に維持されることが 多い。

使用される形質転換法は形質転換される宿主に依存し、種々の方法が当分野で既 知である。ＣＡＭタンパク質またはポリペプチドの発現を得るためには、形質転 換体から導いた組換え宿主細胞を、組換えＣＡＶタンパク質またはポリペプチド をコードしている配列を発現させる条件のもとてインキュベートする。これらの 条件は選択した宿主細胞に依存して変化するであろう。しかし、これら条件は、 当業者にとって確かめるのは容易である。

得られたＣＡＶタンパク質またはポリペプチド産物を、クロマトグラフィー（例 えば、ＨＰＬＣ，親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーな ど）：電気泳動、密度勾配遠心：溶媒抽出などの方法によって精製することがで きる。必要なら生成物をさらに適切に精製して、培地中に分泌されたがまたは宿 主細胞の溶解によって生成したあらゆる宿主細胞タンパク質を実質的に除去し、 少なくとも宿主残骸（例えば、タンパク質、脂質および多糖）を実質的に含まな い生成物を得ることができる。

哺乳動物細胞においてＣＡＶペプチドまたはタンパク質を発現させるためには、 発現ベクターを当業者に周知の方法によって合成することができる。ベクターの 成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロモーター、マーカー 遺伝子などは、天然供給源から得ることができるか、または既知の方法によって 合成することができる［Ｋａｕｆｍａｎら、　Ｊ、５ｔｏ１．Ｂｉｏｌ、、１５ ９：　５１１−５２１　（１９８２）：およびＫａｕｆｍａｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌ１ＳＡ、　８２：　６ｇ９−６９３　（１９８５ ）を参照コ。別法によればA ベクターＤＮＡはウンバピローマウィルスゲノムｇＬｕｓｋｙら、　Ｃｅ１ｌ、 　３６＋　３９１−４０１（１９８４）］の全部または一部を含有していてよく 、また、Ｃ１２７マウス細胞などのセルライン中に安定なエビソーム要素として 保持されていてよい。

哺乳動物細胞の発現のために選択されるプロモーターには、広い宿主範囲を存す る多量に発現される哺乳動物ウィルス遺伝子をコードしている配列、例えば、５ Ｖ４Ｑ初期プロモーター、マウス乳腫瘍つィルスＬＴＲプロモーター、アゾ／ウ ィルス主後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬ　Ｐ）、および単純庖疹ウィルスプロモ ーターが含まれうる。また、ネズミメタロチオネイン遺伝子などの非ウィルス遺 伝子配列も宵用なプロモーター配列を与える。エンハンサ−要素の例には、５Ｖ ４Ｑ初期遺伝子エンハンサーＪＤｉｊｋｅｍａら、邸坦しし±＋　７６１　（１ １１８５）コ、ならびにラウス肉腫ウィルスの長末端反１（Ｌ　Ｔ　Ｒ）　［Ｇ ｏｒｍａｎら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　７９：　８７７ ７（１９８２）］から、およびヒトサイトメガロウィルス［Ｂｏｇｈａｒｔら、 蝕旦、　４１：　５２１　（１ｇ８５）コから導いたエンハンサ−／プロモータ ーが含まれるＬまた、５ａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓ　ｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ、　 Ｔｒｅｎｄｓ　ＧｅｎｅＬ、　’ｉ：　２１５　（１９＋１６）：　Ｍａｎｉａ ｔｉｓら＋　５ｃｉｅｎｃｅ、　Q３８：　１ ２３７　（１９８７）；およびＡｆｂｅｒｔｓら、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、第２版（１９８９）をも参照コ。

転写クーミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、５Ｖ４Ｑから導かれる ものが含まれる［ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記コ。

哺乳動物細胞系には動物ウィルスから導かれる系が含まれ、これは復製のために トランス作用性の因子を必要とする。哺乳動物レプリコンの例には、つ／パピロ ーマウィルスおよびエプスタイン−バーウィルス、バーウィルス、例えばＳＶ　 ４０１Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ−１２３：　１７５　（１９８１）ｌまたは ポリオーマウィルスから導かれるレプリコンが含まれる。このような哺乳動物− 細菌のシャトルベクターの例には、ｐＭ　Ｔ　２　［Ｋａｕｆａｎら、　Ｍｏ１ ．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　３：　９４６　（１９８９）］およびｐＨＥ　Ｂ　 Ｏ［Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　ｑ：　１０７４　（ １９８６）Ｅが含まれる。

異種のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は当分野で既知 であり、デキストラン媒介のトランスフェクション、リン酸カル／ウム沈澱法、 ポリブレン媒介のトランスフェクション、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、 リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、および核中へのＤＮＡの直接マイク ロインジェクションが含まれる。

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物セルラインは当分野で既知であり、 ＡＴＣＣから入手可能な多数の永久セルラインが含まれる。これらには、チャイ ニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼ハムスター腎（ＢＨ Ｋ＞細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、 および多数の他のセルラインが含まれるが、これらに限定はされない。

また、ＣＡＶタンパク質またはポリペプチドフラグメントをコードしているポリ ヌクレオチドを適当な昆虫発現ベクター中に挿入し、該ベクター中の制御要素に 機能的に結合することができる。ベクターの構築には当分野で既知の方法を用い る。一般的に、発現系の成分には、移転ベクター、通常はバキュロウィルスゲノ ムの７ラグメントおよび発現させようとする異種の遺伝子または遺伝子群の挿入 のための好都合な制限部位の両方を含有する細菌性プラスミド：バキュロウィル スゲノム中への異種遺伝子の相同組換えを可能にする移転ベクター中のバキュロ ウィルス特異的なフラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウィルス； ならびに適当な昆虫宿主細胞および増殖培地が含まれる。

バ牛ユロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、ｌｎｖｉ ＬｒｏｇｅＪＳａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ＾］のキット形式の市販品から入手する ことができる（”ＭａにＢａａ”キット）。これらの方法は当業者に広く知られ ており、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ　ＬＴｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ ｒａｌ　ＥｘｐｅｒＩｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　 １５５５　（１９８７）］に十分■燒■ されている（以降においては’ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ”）。

昆虫細胞移転ベクターは、好ましくは、プロモーター、リーダー（所望による） 、１またはそれ以上のＣＡＶ暗号配列、および転写終止配列を含有している。ま た、このプラスミドは、大腸菌中での選択および増殖のための原核性アンピシリ ン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点ならびにポリへドリンポリアデニル化シ グナルＣＭｉ１１ｅｒら、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．、４２：　１ ７７　（１９８８＞］を含存しているのが普通である。

最近では、ＡｃＮＰＶ中に外来遺伝子を導入するための最も普通に用いられる移 転ベクターはｐＡｃ３７３である。また、ｐＶＬ９８５を含む当業者に既知の多 数の他のベクターが設計されている［ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕ＋ｏｍｅｒｓ、　 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１７：　３１　（１９８９）を参照］。

プロモーターの例には、ウィルス性ポリヘトリンタンパク質をコードしている遺 伝子［Ｆｒ１ｅａｅｎら、″バキュｃ１ウィルス遺伝子発現の調節”、　Ｔｈｅ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ中 αａｌｔｅｒ　ＤｏｅｒｆｌｅｒＪｇ）　（１９８６）：　Ｅ　ＰＯ公開Ｎｏ、 　１２７８３X および１５５４７８］およびｐ１０タンパク質をコードしている遺伝子［Ｖｌａ ｋら、　Ｊ、Ｇｅｎ。

■ｒｏｔ、、　６９：　７６５　（１９８８）］から導いた配列が含まれる。

適当なシグナル配列をコードしているＤＮＡは、分泌型の昆虫またはバキ二ロウ イルスタンパク質のための遺伝子、例えばバキュロウィルスポリヘトリン遺伝子 から導くことができるＩＣａｒｂｏｎｅｌ　ｌら、譚匣、リ　４０９　（１９８ Ｂ）コ。別法では、非昆虫起源のリーダー、例えば、ヒトα−インターフェロン ［Ｍａｅｄａら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１５：　５９２　（１９８５）］　；ヒ トガストリン放出ペプチドＣＬｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、　Ｍｏ１ｅ ｃ、Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　８：　３１２９　（１９８８）］　；ヒトＩ　Ｌ　−２ＥＳｍｉ ｔｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａむ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳ`、　８２： ８４０４　（１９８５）コニマウスＩ　Ｌ−３１Ｍｉｙａｊｉｍａら、　Ｇｅｎ ｅ、５８：　２７３　（１９８７）コ；およびヒトグルコセレブロシダーゼ［Ｍ ａｒｔｉｎら、喝、ヱ：　９９　（１９８８）］をコードしている遺伝子から得 たリーダーを用いて、昆虫において分泌を得ることもできる。

異種のＤＮＡをバキュロウィルス中の所望の部位に導入するための方法は、当分 野で既知である（ＳｕａｒｔｒｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８ ７）、上記ＨＳｍ１ｔｈら、輩ｏｆ、　Ｃａｔ　１．　Ｂｉｏｌ、　、ジ：　２ １５６　（１９８３）；およびＬｕｃｋｏｖおよびＳｕ＋１ＩＩｌｌｅｒｓ　（ １９８９）{上記を 参照コ。ＣＡＶポリペプチドまたはタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を移 転ベクター中に挿入した後、このベクターおよび野生型ウィルスゲノムを昆虫宿 主細胞中にトランスフエフシランし、そこでベクターとウィルスゲノムを組換え させる。次いで、この新たに生成させたバキュロウィルス発現ベクターを感染性 組換えバキュロウィルス中にバ・７ケージングさせる。組換えウィルスを同定す るために、当業者に既知の方法により昆虫細胞の単層上にトランスフェクンヨン 上清をプラーク形成させることによって視覚的なスクリーニングを実施する［” Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｋ１ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＹ’、 第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）、　１６．８　（Ｓｕｐｐ、　ｔｏ、@１９９ ０）；　Ｓｕ＋ｕｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、上記：　Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９ ）、上記コ。屈折性の吸収体の存在によって組換えウィルスを同定する。

組換えバキュロウィルス発現ベクターが、数種の昆虫細胞への感染用に開発され ている。例えば、特に＾ｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ、　Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　 ｃａｌ汀ｏｒｎｉｃａ％Ｂｏｍｂｙｘ　５ｏｒｉ。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓＬｅｒＳＳｐｏｄｏｐｔａｒａ　ｆ ｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕ８ｉａ　ｎ奄■ ための組換えバキュロウィルスが開発されている［ＰＣＴ公開Ｎｏ、　１０８９ １０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌ　Ｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５６：　１５ ３　（１９８５）　；　ｆｒｉｇｈｔ、！１ａｔｕｒｅ、３２１：　７１８@（ １９８６） ：　Ｓｍ１ｔｈら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、ジ：　２１５６　（１９ ８３）　；および一般的にはＦｒａｓｅｒら、工Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．Ｄｅｖ 、Ｂｉｏｌ、、　２５：　２２５　（１９８９）を参照］。

また、細菌発現法および発現系成分も当分野で既知である。細菌性発現ベクター または構築物の成分には、細菌性プロモーター、転写開始領域、ＲＮＡポリメラ ーゼ結合部位、転写終止配列、シグナル配列およびオペレーターならびに所望の ＣＡＭ配列が含まれる。構成性の発現は、オペレーターなどの陰性調節要素の非 存在下で起こりつる。さらに、陽性の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列 によって達成されうる。遺伝子活性化タンパク質の例はカタボライト活性化タン パク質（ＣＡＰ）であり、これは大腸菌におけるｌａｃオペロンの転写の開始を 助ける［Ｒａ１ｂａｕｄら、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ＧｅｎｅＬ、、１８：　１７３ 　（１９８４）Ｆ。従って、調節された発現は陽性または陰性のいずれかであっ てよく、これによって転写が増強または減温される。

プロモーター配列の例には、ガラクトース、ラクトース（Ｉａｃ）　ＣＣｈａｎ ｇら、跳叩ｒｅ、　１９８：　１０５６　（１９７７）］およびマルトースなど の糖代謝酵素から得られる配列；トリプトファン（ｉｒｐ）などの生合成酵素か ら得られる配列［Ｇｏｅｄｄｅｌら、　１ｌｕｃ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、邑：　 ４０５７　（１９８０）；　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら＋　Ｎｕｃｌ、人ｃｉｄｓ　 Ｒｅｓ、、　９−：　７３１　（１９８１j：　米国 特許Ｎｏ、　４．７３８．９２１；　Ｅ　Ｐ○公開Ｎｏ、０３６７７６および１ ２１７７５ｉ　：　ｇ−ラクタマーゼ（ｂＩａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍ ａｎｎ、　’インターフェロンおよび他の誤認物のクローニング”＋　Ｉｎｔｅ ｒ４ｅｒｏｎ　３　（１，Ｇｒｅｓｓｅｒｍ）（１９ｇ＋）コ；バクテリオファ ージλＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９２：　１２８　（ １９８１）コおよびＴ５［米国特許Ｎｏ、　４．６８９．４０６］が含まれる。

天然にはない合成プロモーター、例えば、米国特許Ｎｏ、４．５５１．４３３に 記載されているハイブリ、ドブロモーター、およびｔａｃプロモーター［Ａｍａ ｎｎら、　Ｇｅｎｅ、　２５：１６７　（１９８３）；　ｄｅ　Ｂｏｅｒら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８０：　２１　（１９８３）］が 有用であるB 細菌性プロモーターは非細菌起源の天然プロモーター、例えばバクテリオファー ジＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系［５ｔｕｄｉｅｒら、Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、、１８９川１３　（１９８６）＋　Ｔａｂｏｒら、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、　８２：　１０７４　（１９８５）；　Ｅ　ＰＯ 公開mｏ。

２６７８５１をも参照］を含有することができる。

機能的なプロモーター配列に加えて、効果的なリポソーム結合部位も原核生物中 での外来遺伝子の発現に宵月である［例えば、大腸菌のシャインーダルガルノ（ ＳＤ）配列；　５ｈｉｎｅら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５４：　３４　（１９７５ ）］。

細菌中で外来タンパク質の分泌を与える適当なシグナル配列をコードしているＤ ＮＡを、分泌型細菌タンパク質の遺伝子、例えば大腸菌の外層膜タンパク質遺伝 子（ｏｍｐＡ）［Ｍａｓｕｉら＋　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌ ａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（P９８３） ；　Ｇｈｒａｙｅｂら、　ＥｋｌＢＯＪ、、　３：　２４３７　（１９８４月お よび大腸菌アルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ　）［Ｏｋａら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８２：　７２１２　（１９８５） ：米国特許Ｎｏ、　４．３３６．３３６をも参照］から導くことができる。追加 の例として、種々のＢａｃ　１ｆｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナ ル配列を用いて、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓがら異種タンパク質を分泌させること ができるＵＰａｌｖａら、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　Ｕ ＳＡ、グ：　５５ｇ２　（１９Ｂ２＞：　Ｅ　ＰＯ公開Ｎｏ、　２４４　（１４ ２］。また、シグナルペプチド配列フラグメントを有する融合タンパク質をフー ドするキメラＤＮＡ分子を創製することによって、ＣＡＶタンパク質を細胞から 分泌させることができる。

転写終止配列の例は、強力なプロモーターを有する遺伝子から得た配列、例え発 現構築物を、宿主細胞において安定に維持されつる染色体外要素（例えば、高ま たは低コピー数プラスミド）などのレプリコン中に維持することができる。

別法によれば、発現構築物を、組込みベクターによって細菌ゲノム中に組込むこ とができる。組込みベクターは、通常、ベクターの組込みを可能にする細菌染色 体に相同な配列を少なくとも１つ含有している。組込みは、ベクター中の相同な りＮＡと細菌染色体の間の組換えによって生じるようである［例えば、ＥＰＯ公 開Ｎｏ、１２７３２８を参照］。また、組込みベクターは、バクテリオファージ またはトランスポゾン配列からなっていてもよい。

別法によれば、上記成分のいくつかを共に形質転換ベクター中に設置することが できる。通常、形質転換ベクターは、レプリコン中に維持されるかまたは組込み ベクター中に展開される選択マーカーを含有している。選択マーカーは細菌宿主 中で発現可能であり、これにはアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロ マイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリンなどの薬物に 対して細菌を耐性にする遺伝子が含まれうる［Ｄａｖｉｅｓら、　Ａｎｎｕ、Ｒ ｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

３２：　４６９　（１９７８）］。また、選択マーカーは、生合成遺伝子、例え ばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路における生合成遺伝子 を含有していてもよい。

細菌の発現および形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組込みベクター のいずれか）が、多数の細菌の形質転換用に開発されている［例えば、Ｆａｌｖ ａら１Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ｕｓ＾、７９：　 ５５Ｂ２　（１９８２）；　５ｈｉＩｌｌａｔａｋｅら、Ｎａｔｕ窒■A２９２ ：　１２ｇ （１９８１）；　Ｐｏｗｅｌｌら、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、、５４：　６５５　（１９８Ｂ）；　ＰｏｗｅｌｌらAＡＰＰ ｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　５４：　６５５　（１９８８） および米国特許Ｎｏ、　４．７４５．０５６に記載されているベクターをオ照］ 。

外性ＤＮＡを細菌宿主中に導入する方法は当分野で周知であり、これら方法には 代表的にＣａＣＬまたは他の試薬（二価のカチオンおよびＤＭＳＯなど）で処理 された細菌の形質転換が含まれる。また、Ｄ　Ｎ　Ａを電気穿孔法によって細菌 細胞中に導入することもできる。形質転換法は、形質転換しようとする細菌種に よって変化するのが普通である。例えば、Ｍａｓｓｏｎら、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、１．ｅｔｔ、、　６０：　２７３　（１９１ｔ９）；　Ｍｉｌｌ ｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８５：　８５６　（１９８ ８）；　Ｃｈａｓｓｙら１■ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｌｅｔｔ、、　４４：　１７３　（１９８７）＋　Ａｕｇ ｕｓｔｉｎら、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、ＬｅｔｔA、明、２ ０３　（１９９０）および当分野で既知の他の多数の参考文献を参照。

また、酵母発現系も当業者には既知である。通常の酵母発現用のベクターまたは 発現構築物は、プロモーター、リーダー（所望による）、ＣＡＶ暗号配列および 転写終止配列を含有している。酵母プロモーターは、転写開始領域、ＲＮＡポリ メラーゼ結合部位（“ＴＡＴＡボックス”）、転写開始部位、上流活性化配列（ ＵＡＳ）［１節された（誘導性の）発現を可能にする］を含有している。構成性 の発現は、ＵＡＳが存在しないときに起こる。調節された発現は陽性または陰性 のいずれであってもよく、これによって転写が増強または減温される。

特に有用なプロモーター配列には、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤ Ｈ）［ＥＰＯ公開Ｎｏ、２８４０４４］、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコ ース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート −デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＣ，ＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフ ルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルベートキナーゼ （ＰｙＫ）［ＥＰＯ公開Ｎｏ、　３２９２０３］が含まれる。また、酸ホスファ ターゼをコードしている酵母ＰＨ０５遺伝子も有用なプロモーター配列を与える ［Ｍｙａｌｌｏｈａｒａら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、人Ｃ合成ハイブリッドプロ モーターには、ＧＡＰ転写活性化領域に結合したＡＤＨ調節配列［米国特許Ｎｏ 、　４．８７６、１９７および４．　ａｇｏ、　７３４］、ＣＡＰまたはＰｙＫ などのグルツース分解酵素遺伝子の転写活性化領域と結合したＡＤＨ２、Ｇ’Ａ Ｌ４、ＧＡＬＩＯまたはＰＨ０５遺伝子の調節配列［ＥＰＯ公開Ｎｏ、　１６４ ５５６］が含まれる。

非酵母起源の配列がプロモーターとして機能することもある［例えば、Ｃｏｈｅ ｎら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１３＾、　７７：　１０７ ｇ　（１９８０）；および）Ｉｅｎｉｋｏｆｆら、　Ｎａｔ浮窒■A　２８４ ８３５　（１９ｇ＋）を１シ照コ。

酵母における細胞内発現のためには、プロモーター配列をＤＮＡ分子と直接結合 させてよい。発現したタンパク質の分泌のために、適切なシグナル配列をコード しているＤＮＡを、酵母インベルターゼ遺伝子［ＥＰＯ公開Ｎｏ、０１２８７３ ＨＥＪ本特許公開Ｎｏ、　６２．０９６．０８６］およびＡ因子遺伝子［米国特 許Ｎｏ、　４．５８８．６８４］などの分泌型酵母タンパク質の遺伝子から導く ことができる。さらに、酵母において分泌を与えるインターフェロンリーダーな どの非酵母起源のリーダーが存在する［ＥＰＯ公開Ｎｏ、０６００５７］。好ま しい種類の分泌リーダーは酵母α−因子遺伝子の７ラグメントを用いる［例えば 、米国特許Ｎｏ、　４．５４６．０８３および４，８７０，００８：　ＥＰＯ公 開ｊｌｏ、３２４２７４；およびＰＣＴ公開１１ｏ、　ｔｏ　８９１０２４６３ を参照コ。

発現構築物はレプリコン（例えば、高または低コピー数プラスミド）中に維持さ れていることが多く、このレプリコンは２つの複製系を冑していることがあり、 発現のために酵母中にならびにクローニングおよび増幅のために原核宿主中に維 持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例には、 別法によれば、発現構築物を組込みベクターにより酵母ゲノム中に組込むことが できる。この組込みベクターは、通常、ベクターの組込みを可能にする酵母染色 体に相同な少なくとも１つの配列を含有しているが、発現構築物を囲む２つの相 同な配列を含有しているのが好ましい［０ｒｒ−ｆｅａｖｅｒら、　Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０１：　２２８−２４５　（＋９８３）Ｆ。

通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能 にする選択マーカーを含有する。この選択マーカーには、酵母宿主中で発現する ことができる生合成遺伝子、例えばＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰＩお よびＡｌＯ２、ならびにＧ４１８耐性遺伝子が含まれる。さらに、適切な選択マ ーカーは、金属などの毒性化合物の存在下で増殖する能力を酵母に与えることが できる。例えば、ＣＵＰ　Ｉの存在は、酵母が銅イオンの存在下で増殖すること を可能にするｒＢｕｔｔら、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、、　５１：　３５ １　（１９８７）］。

さらに、上記成分のいくつかを、上記のように組込みベクター中に展開されるか またはレプリコン中に維持される選択マーカーを通常は含有している形質転換ベ クター中に一緒に設置することができる。

発現および形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいず れか）が、多数の酵母株への形質転換用に開発されている［例えば、Ｋｕｒｔｚ ら、！！分野で既知の他の多数の参考文献を参照］。

外性ＤＮＡを酵母宿主中に導入する方法は当分野で周知であり、通常はアルカリ カチオンで、処理した無傷の酵母細胞の形質転換またはスフェロプラストの形質 転換のいずれかを包含する。形質転換法は、形質転換しようとする酵母の種によ って変化するのが普通である「例えば、特にＫｕｒｔｚら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１ ．Ｂｉｏｌ、、　３：　１４２　（１９８６）　；　Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ、Ｇ ｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ、、１３２：　３４５９　（１９８６）　；Ｃｒｅｇ ｇら、Ｍｏ１．ＣｅP１．Ｂｉ 銀ユ１塁：　３３７６　（１９８５）を参照］。

融合タンパク質は、酵母、哺乳動物、バキユロウィルス、および細菌発現系にお いてＣＡＶタンパク質およびポリペプチドを直接発現させるための別の方法を与 える。通常、内生タンパク質（宿主に依存する）または他の安定なタンノ（り質 のＮ−末端部分をコードしているＤＮＡ配列を、異種の暗号配列の５゛末端に融 合させる。発現させるとこの構築物は、２つのアミノ酸配列の融合体を与えるで あろう。得られた融合タンパク質は、所望により、ＣＡＶ遺伝子から宿主細胞タ ンノ＜り質を切断するプロセシング酵素のための切断配列を２つのアミノ酸配列 の連結点に保持している［例えば、Ｎａｇａｉら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０９： 　８１０　（１９８４）およびＥＰＯ公開Ｎｏ、　１９６０５６を参照］。１つ の例はユビキチン融合タンパク質であり、これはＣＡＶタンパク質からユビキチ ンを切断するプロセシング酵素のための部位を保持しているのが好ましい。この 方法により、天然のＣＡＶタンパク質を単離することができる［例えば、Ｍｉｌ ｌｅｒら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　７：　６９８　（１９８９）を 参照］。

別法では、選択した宿主細胞からのＣＡＶタンパク質の分泌を与えるリーダー配 列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を創製 することによって、ＣＡＶタンパク質またはポリペプチドを選択した宿主細胞か ら増殖培地に分泌させることができる。アデノウィルスの２分節リーダーが、哺 乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列の例である［Ｂ ｉｒｎｓｔｉｅ！ら、（旦、　４１：　３４９　（１９８５）　；　Ｐｒｏｕｄ ｆｏｏｔおよびＹｈｉｔｅｌａｖ、　”真核性ＲＮＡの終止および３゛末端プロ セシング’、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ中（Ｂ、 　Ｄ、　Ｉ（ａｇｅｓおよびり、Ｍ、Ｇ１ｏｖｅｒＸ１９８ｇ）　；　Ｐｒｏｕ ｄｆｏｏｔ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、、　１４：　１０５　 （P９８９）］。

インビボまたはインビトロで切断すること力呵能な、リーダーフラグメントと外 来遺伝子の間にフードされたプロセシング部位が存在しているのが好ましい。こ のようなリーダー配列フラグメントは、上記の種々の選択した宿主細胞に対して 当業者には既知である。

ＣＡＶポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の同定ならびに全ＣＡＶ配 列の最終的な配列決定は、常法によって得られる適切なＣＡＶ−特異的な抗体の 開発を可能にする。診断または研究用試薬として、これらＣＡＶ配列に対して生 成させた抗体は、ＣＡＶタンパク質をさらに精製するためのアフィニティーカラ ムなどにおいて有用であろう。本発明の抗体を、例えば検出可能な標識または標 識系と結合させることにより、インビボおよびインビトロの診断用に利用するこ とができる。また、これら抗体を、例えば当業者に既知のある種の毒性またＣｔ 治療用化合物または部分（例えば、す／ン）と結合させることにより、インビボ およびインビトロの治療用に用いることができる。

ＣＡＶ配列によってコードされているペプチドに、具体的には本発明の検定で用 いるための該ペプチド中の抗原性部位に対する抗体には、既知の方法によって生 成させたモノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにキメラ抗体または ”組換え“抗体が含まれうる。さらに、合成により設計されたＭＡｂを既知の遺 伝子操作法［１，Ｄ、　Ｒｕ５ｅら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６：　１２７５ −１２８１　（１９８９）］によって作成することができ、本明細書中に記載し た方法において使用することができる。簡潔にするため、Ｍａｂなる用語を以降 の本明細書中で使用するが、ある種のポリクローナル抗体、特に高力価のポリク ローナル抗体および組換え抗体をその代わりに用いることもできる。標的特異性 の増加のためには、本発明の検定においておよび可能性ある治療薬物として、モ ノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いるのが一般に望ましい。また、既知の方法の いずれかによって非ヒトＭａｂを”ヒト化”するのが好ましいこともある［例え ば、米国特許Ｎｏ、　４．６３４．６６４および４．６３４．６６６を参照］。

（ａ）ポリクローナル抗体の精製調製物；（ｂ）モノクローナル抗体組成物、ま たは（ｃ）組換え抗体組成物である本発明の抗ＣＡＶ抗体組成物は、ＣＡＶポリ ペプチドの抗原決定基に結合する抗体を含有しているのが好ましい。

好ましくは、本発明は、例えばＨＴＬＶ　ＩＩなどの他のヒトレトロウィルスと 反応しない、ＣＡＶに対するＭＡｂを開発することを意図している。１つの態様 においては、この抗体は、上記のＣＡＶ　ＤＮＡ配列によってコードされている ＣＡＶ抗原性部位を同定またはそれに結合することができる。このような抗体を スクリーニング試験に用いることができる。

ＭＡｂは、現在では周知のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法およびそ の改良法によって生成させることができ、ＣＡＶポリペプチド上の１またはそれ 以上の抗原性部位に指向させることができる。例えば、ＨＴＬＶ　ＩおよびＨＴ ＬＶ　ＩＩならびに他のウィルスの配列とは十分に異なっている、単離したＣＡ Ｖ配列または抗原性部位をコードしているウィルス配列の一部を、ＭＡｂを得る ための常法において抗原として供することかできる。次いで、ＣＡＶ上のエピト ープのみを認識し、ＨＴＬＶ　Ｉもしくは］１または他のあらゆるレトロウィル ス上のエピトープを認識しない抗体を分泌するセルラインをこの用途に同定する ことができる。同様に、他のウィルス上のどのエピトープよりもＣＡＶエピトー プにさらに強く結合して適切な条件のもとて抗体がウィルス間を区別することを 可能にする抗体を分泌するセルラインも有用であろう。当業者なら、ＣＡＶポリ ペプチド配列を免疫原として用い、本明細書中の教示を用いて多数のＭａｂを作 成することができる。

また、ＣＡＶ上のエピトープに特異的な抗体を標的化試薬として治療学的に用い て、ウィルス毒性または感染細胞毒性薬物を感染細胞に放出することができる。

診断用の標識と結合させる代わりに、治療剤は、ウィルスの復製機序を無力にす るかまたはウィルス感染した細胞を破壊することができる薬物またはリガンドに 結合させた抗体を用いる。このような薬物にはす／ン、ジフテリア毒素または他 の既知の毒性薬物が含まれるが、これらに限定されるものではない。個々の毒性 リガンドは本発明を限定するものではない。ＣＡＶ配列によってコードされてい るペプチドに対する好ましい抗体は、カナダ特許出願２．０１６．８３０−７（ １９９０年１１月１６日公開）に詳細に記載されているように、感染細胞中に内 在化し、そして細胞内にリガンドを供給する能力によってスクリーニングするこ とができる。この文献は、当分野で既知のスクリーニング法を説明するものとし て参照文献として本明細書の一部を構成する。

本発明の抗体およびプローブの両方を、通常の検出可能な標識と結合させること ができる。また、本発明の検定において有用な抗体（または、上記のプローブ） に結合させるための検出可能なラベルは、診断検定の分野の当業者によって容易 に選択することができる。本発明の１以上の試薬（例えば、プローブまたは抗体 ）を診断法において使用するときには、この標識は検出可能なシグナルを生成す るように相互作用するのが望ましい。最も望ましい標識は視覚的に、例えば比色 計によって検出できる標識である。また、本発明の診断検定において有用な本発 明の試薬に結合させるための検出可能な標識は、診断検定の分野の当業者によっ て容易に選択することかできる。／グナルか迅速であり、読取りか容易であるこ とから、臨床に適用する際に使用するためには視覚的に検出できる標識が好まし い。

比色検出のためには、適切に作用する種々の酵素系が当分野で記載されている。

比色酵素系には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカ ルホスファターゼ（ＡＰ）が含まれる。他のこのような近接した酵素系は当業者 に知られており、これにはグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼと組 合せたヘキソキナー七か含まれる。さらに、生物発光または化学発光を、それぞ れ、ル／フェラーゼおよび基質ＮＡＤＨおよびＦＭＮと共にＮＡＤオ牛ンドレタ クターゼまたはルミノールおよび基質ペルオキシドと共にベルオキシダーゼを用 いて検出することができる。

使用することができる他の通常の標識系には、蛍光化合物、放射活性化合物もし くは元素、または免疫電極が含まれる。これらおよびその他の適切な標識系は当 業者に既知である。

同様に、本発明の抗体、ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列試薬を診 断で使用するために、多種多様の既知および通常の成分を用いて、所望の場所に 試薬を固定化することができる。このような固定化媒体には、通常の固体支持体 、例えば微ｊｌ′ａ定プレート、プラスチック、セルロース片、ビーズ（例えば 、ラテックス）が含まれる。抗体または核酸またはペプチド配列の固定化に用い ることができる当分野で既知のあらゆる組成物が、主に診断用途、精製法などの ために、本発明の抗体および配列で同じように有用であろう。

また、本発明のＣＡＶポリヌクレオチド配列およびポリペプチド、ならびに抗Ｃ ＡＶ抗体を、ＣＡＶによる感染のない血液または血液製品を製造するための工業 的方法において用いることができる。ＣＡＶに感染した血液試料をスクリーニン グする能力は、血液製品の製造元および販売元（例えば、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｒ ｅｄ　Ｃｒｏｓｓ）が、輸血に、または血漿、治療学的に有用な血液タンパク質 および血球の単離に使用することが意図されている献血試料を同定し、廃棄する ことを可能にする。

スクリーニングされないと、このような血液および血液由来製品の使用によって ＣＦＩＤＳの広まりの原因となりうる。

従って、本発明の別の態様は、ＣＡＶの存在または非存在を示すことができるＣ ＡＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドプローブまたはその相補体によって血 液製品のＣＡＶの存在をスクリーニングすることにより、ＣＡＶによる感染のな い血液および血液製品を製造する方法である。同様の方法は、ＣＡＶの存在また は非存在を示すことができる抗ＣＡＶ抗体によって血液試料をスクリーニングす ることにより、ＣＡＶによる感染のない血液または血液製品を製造することから なる。

所望により検出可能に標識されたこれらＣＡＶ配列および／または抗ＣＡＶ抗体 を、ＣＡＶを含む血液試料を同定するための診断用に本明細書中に記載した検定 方式と実質的に同一の通常の検定形式において用いることができる。例えば、１ つのスクリーニング法は、ＣＡＶポリヌクレオチド配列の全部もしくはフラグメ ントまたはその相補体を、血液試料で行われるポリメラーゼ連鎖反応におけるプ ライマーとして用いることができる（該配列の増幅はＣＦＩＤＳの病因学的物質 の存在を示す）。

別のスクリーニング行程は、ＣＡＶポリヌクレオチド配列の全部もしくはフラグ メントを、血液試料で行われるハイブリダイゼーション検定における／％４ブリ ダイゼー７ヨンブローブとして用いることからなる（該配列の）＼イブリダイゼ ーンヨンはＣＦＩＤＳの病因学的物質の存在を示す）。さらに別のスクリーニン グ行程は、血液試料をＣＡＶポリペプチドまたはタンノ（り質と接触させること からなる（該ペプチドまたはタンパク質は、試料中のいずれかの抗ＣＡＶ抗体と 抗原−抗体コンプレツクスを形成することができる抗原性部位を示す）。このよ うな検定またはその改良法の使用は、本明細書の開示を得た当業者の技術的範囲 内（こある。

本発明のさらに別の態様は、ＣＡＭポリヌクレオチド配列を含有するインビトロ の細胞培養物である。このような細胞培養物は、ＣＡＶに感染した哺乳動物細胞 、細菌細胞、酵母または昆虫細胞であってよい。このような細胞培養物は、選択 したＣＡＶポリヌクレオチド配列だけを含有していて、そこでウィルスか複製す ることができない組換え宿主細胞であってよい。

また、本発明によって提供されるのは、既知の方法により、選択した哺乳動物に ＣＡＶポリペプチドまたはそのフラグメントを抗原として供し、次いでこの動物 の細胞をある種の癌細胞と融合させて永久化セルラインを創製することによって 得たハイブリドーマセルラインである。このようなセルラインおよび本発明のヒ トＣＡＶタンパク質または組換えポリペプチドの全部または一部に対して指向性 の抗体も本発明に包含される。

さらに、本発明は、ＣＡＶに感染し、感染性のＣＡＶの子孫を生成することがで きる許容セルラインを包含する。実施例１に詳細に記載したように、インビトロ で感染性のウィルス子孫を産生ずる２種類のヒトセルライン、即ちＴ細胞リンパ 芽球様およびＢ細胞リンパ芽球様セルラインを開発した。また、別のセルライン であるヒトマクロファージ単球セルラインＵ９３７（ＡＴＣＣから入手可能）も ＣＡＶの増殖を支持するものと同定された、このようなセルラインを通常の適切 な条件下で培養すると、一層の研究およびワクチン開発用に大量のウィルスを得 ることが可能になる。

本発明のさらに別の態様として、疑われているＣＦＩＤＳの診断を確認する方法 を、今では上記のＣＦＴＤＳヌクレオチド配列、ポリペプチド配列および抗体の 存在に基づ（ことができる。ＣＡＶの存在は、ウィルスを検出するために当分野 で知られている種々の検定および免疫学的方法を利用して検出することができる （これらウィルスタンパク質、核酸、およびこのウィルスに対して指向性の抗体 を検出することを含む）。他のレトロウィルスの相当する遺伝子配列との相同性 を十分に欠いているＣＡＶポリヌクレオチドのフラグメントは、疑われているＣ Ｆ　Ｉ　ＤＳの患者の体組織および体液中のそのようなヌクレオチド配列（また は、それによってコードされているペプチド）の同定を可能にし、感染の診断の 確認を可能にするであろう。

本明細書で用いる”体液“なる用語は、次の細胞含有物質を含むものと定義する （限定するものではない）全血もしくはその分画、血清、尿、精液、腟分泌物、 唾液、涙、脳を髄液および乳。また、この定義に含まれるのは、Ｔ細胞および非 Ｔ細胞を含む選択したヒトの細胞種である（完全にするため）。予備的なデータ は、このウィルスの存在が顆粒球、好酸球または好塩基球においても検出されう ろことを示している。また、このウィルスは筋肉および皮膚組織試料においても 検出可能であるａ後記の本発明の説明は体液として血清試料および末梢血液単核 細胞（ＰＢＭＣ）について言及するものであるが、本発明の方法および組成物の 適用はこれら特定の液体に限定されるものではない。

しかし、ＣＡＶの存在を検出するのに有用な診断法の好ましい憶様は、特にポリ メラーゼ連鎖反応の技術［５ａｉｋｉら、ジ違狙凹、用　４８７〜４９１　（１ ９８Ｂ）］およびハハイブリダイゼーション検定例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒ’　ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａビ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ窒ｂ盾秩A第２ 版（１９８９）を参照］を利用する。これらの文献は、ＰＣＲおよび検定の方法 を説明するものとして参考文献として本明細書の一部を構成する。特に望ましい ハイブリダイゼーション検定にはサザーンプロットと液体ハイブリダイゼーショ ンが含まれるが、この方法は後者文献中の説明によって示されるように当分野で 既知である。

上記の検定方式は、本発明のＣＡＶポリヌクレオチド配列に由来するＰＣＲプラ イマーまたはハイブリダイゼーションプローブと共に本発明の方法において使用 るのが好ましい。

本発明の方法の１つの態様は、当業者には既知であるＰＣＲ法ならびにその改良 法が関与している。この態様によると、選択した患者の体液試料を集める。無症 状の患者も試験することができるが、ＣＦｒＤＳに関連していると認められてい る症状を有することにより、患者をこのような診断試験に選択するのが望ましい であろう。選択した体液、例えば白血球からＤＮＡを抽出する。このような抽出 物を調製する方法は当分野で周知である［例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを 参照］。

この試料ＤＮＡを鋳型として用い、ＣＡＶ配列から導いたプライマーをＰＣＲ法 において用いる。

例を挙げると、実施例３に記載したように、ある種のＨＴＬＶ　Ｉｆ　ｇａｇ遺 伝子配列がいくつかの推定のＣＡＶポリヌクレオチド配列と高度な相同性を有し ているようであることが初めて観察された。ＰＣＲプライマーおよびハイブリダ イゼーションプローブとして有用であると思われるいくつかの望ましい配列が、 ＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド＃８１３から＃Ｉ２１４にまたが るヌクレオチド配列内に見い出される。これらの配列を初めて使用してＣＡＶ配 列を増幅し、患者の体液からウィルスを単離した。例えば、以下の第３表に示す ように、ヌクレオチド１２１４から＃１１８７までのＨＴＬＶ　Ｉｆ　ｇａｇ配 列は、ＰＣＲのための好ましいアンチセンスプライマーとして有用であろう。こ のプライマーはｇ−２−１として知られる。ヌクレオチド＃８１３から＃８３８ までのＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇ配列は、ＰＣＲのｇａｇセンスプライマーとして 有用である。このプライマーはｇ−２−２と呼ばれる。ヌクレオチド１０８０か ら１１０５までのＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇｓｇの配列は、ハイブリダイゼーションプ ローブとして有用である。

（以下、余白） 第３表 ｇａｇアンチセンスブライ７−　ＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡ ＧＧｇａｇセンスブライ７−　ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧ ＣＴＩＯ８０１１Ｏ１ ｇａｇプローブ　ＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＧＣＣ＾ｔａｘアンチ センスプライｖ　−ＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＧＧＧＡしａｘセン スプライ７−　ＣＡＡ丁ＣＡＣＴＣＡ丁ＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡ本明細書全体に おいてＨＴＬＶ　ＩＩゲゲノ配列のヌクレオチド配列、＜す／グは前記の完全プ ロウィルスＨＴＬＶＩＩゲノムに関してに、　Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏらにより開 示されたナンバリング／ステムと同じである。以下の実施例に記載するＨＴＬＶ ■のヌクレオチド配列は、前記のＭ、Ｓａ山らに従ってナンノくリングする。後 者の２つの文献は当業者に公知かつ入手可能な配列情報源として本明細書の一部 を構成する。

他のレトロウィルスに基づくプライマーまたはプローブ、例えば、第１図に同定 されるもののようなＨＴＬＶ　ｌ由来のプローブ、または非ハイブリダイズＨＴ ＬＶ　Ｉ＋ｌ由来プローブ、またはＭＰＭＶ等の公知の非Ｃ型レトロウィルスの 配列に基づくプローブを対照として用いてもよい。例えば、ＰＣＲ技術を用いた 他の診断法ではｔＲＮＡリンン結合部位５°ＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧ ＧＣ３’を「センス」プライマーとして用いてもよいし、ＭＰＭＶ由来のプライ マー５’　ＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＴＴＧ　３’を「アンチセンス 」プライマーとして用いてもよい。５’　ＧＡＴＡＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＧＴＴ ＴＣＣＧＣＡ　３’配列を有するＭＰＭＶ介在領域由来のプローブをノ＼イブリ ダイゼーシゴンに用いてもよい。

このようなＰＣＲ反応もヒトのＭＰＭＶ感染を示すであろうが、現在はＭＰＭＶ はヒトに感染しないと考えられている。別の方法は、特異的なハイブリダイゼー ション条件下でＣＡＶ配列と相同でない別のＭＰＭＶ配列とハイブリダイゼーシ ョンし、ＭＰＭＶ感染を除外する。ＣＡＶが試料から単離されたＤＮＡ中に存在 する場合、ＣＡＶポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは増幅されるが 、対照ヌクレオチド配列は増幅されない。

しかし、既に記載したように、他の公知のレトロウィルスを疑ＣＦＩ［Ｓ患者の 体液において単離または同定されたウィルスと区別するために別の方法を用０な ければならないので、ＨＴＬＶ　Ｉ＋配列または診断法においてＣＡＶと幾分相 同性を膏するＭＰＭＶなどの他のレトロウィルス配列を用いることは余り好まし くない。前記ＨＴＬＶ　Ｉｔｌ由来プローブおよびプライマー配列と異なる他の ＨＴＬＶ　Ｉ＋配列を用いてＨＴＬＶ　１１感染の存在を除外することができる 。ＰＣＲを用いる本発明の方法は、ＨＴＬＶ　１１配列およびＨＴＬＶ　Ｉ配列 を用いて続いて行ってもよいか、これにより、患者の試料ＤＮＡ、たとえばＣＡ Ｖと相同でなく、ＣＦＩＤＳ患者において検出できないＨＴＬＶＩＩｔａｘ由来 の配列を用いて増幅された生成物が得られない。

ＣＡＶに特有かつ他のウィルスと結合しないＣＡＶプライマー配列がこのような 検定において好ましい。このような配列はウィルス分類学者により同定されうる 。

ＰＣＲ増幅に続いて、標識したＣＡＶポリヌクレオチド由来のハイブリダイゼー ションプローブを用いたサザンブロソトまたは池のハイブリダイゼーション技術 を用いてもよい。すでに記載したように、望ましくないプローブは、ＨＴＬＶＩ Ｉ　ｇａｇ遺伝子中のヌクレオチド配列と相同な配列を含む。

ＰＣＲ増幅の産物を用いたプローブのハイブリダイゼーションは体液中のＣＡＶ ヌクレオチド配列の存在下に起こる。入手可能なデータベースにおいて報告され た他のレトロウィルス配列と明らかに相同でないＣＡＶ核酸配列の非存在下には ハイブリダイゼーションは起こらない。陽性の診断は、前記配列の患者試料への ハイブリダイゼーションは望ましくは約９０％以上である。ハイブリダイゼーシ ョンの発生は、ＣＦｒＤＳの診断の確認を示すであろう。

ＣＡＶ感染の存在を決定する本発明の診断法の他の具体例は、患者試料をＣＡＶ 　ＲＮＡ配列の存在に関してスクリーンするためのその場でのハイブリダイゼー ションである。後記の実施例５に更に詳細に記載するが、細胞、典型的にはＰＢ ＭＣを患者から単離する。ＰＢＭＣが試料である場合には、細胞を前記のように して活性化する。細胞を通常の条件下で培養し、ＣＡＶのｍＲＮＡの発現を調べ る。

ＣＡＶのポリヌクレオチド配列、またはその相捕的配列をこの方法において用い てもよい。このハイブリダイゼーション技術のためのプローブは、実施例４に詳 細に記載するように、プラスミド中のＣＡＶの転写から得てもよいし、また本明 細書ですでに記載した他の方法により得てもよい。／％イブリダイゼー／ヨンお よびプライマー配列に関してすでに記載したように、ある種のＨＴＬＶ　ｌ由来 のｇａｇ遺伝子ヌクレオチド配列は本発明の方法のこの具体例に従って、このＣ ＡＶウィルスｍＲＮＡを同定するのに有用であることも証明される。

高度に厳密な条件を用いて、ＣＡＶ配列の標識されたプローブを用いて、試料ｍ ＲＮＡをプローブすることができる。好ましい厳密な条件としては、５２℃で培 養をする。すでに記載したように通常の標識もこの具体例に用いてもよい。現在 好ましい標識は、３５Ｓである。以下の実施例５に詳細に記載された具体例では 、ＨＴＬＶ　Ｉ＋ｌ由来配列を用いる。このその場での試験により、他のＰＣＲ および免疫学的試験と組合わせて、陽性のＣＦＩＤＳの結果を確認する。

ＣＡＶペプチドフラグメントならびに前記のようにして得られるＰＣＲプライマ ーは、血清認識に対する標的としてのタンパク免疫原に依存した診断法において 用いてもよい。例えば、本発明は、ＣＦＩＤＳ患者を同定するのに有用な診断薬 として本発明のＣＡＶペプチドを用いる方法を提供する。１つの検定形式におい ては、ＣＡＶペプチドのＣＦＩＤＳ患者の生物学的液体または細胞との反応性を 、ウェスタンプロットにより検定することができる。この検定は、好ましくは患 者の血清に関して用いられるが、他の適当な液体または細胞、例えば、マクロフ ァージまたは白血球に関して行うために応用することもできる。ウェスタンプロ ット技術において、調製的ゲルにより精製・単離されたＣＡＶペプチドを、ニト ロセルロースに移し、複数の細片に切断する。この細片を次にＣＦＩＤＳ患者由 来の血清または対照を用いて調べる。ＣＦＩＤＳ血清のタンパク質への結合は、 適当に標識された抗体、例えばアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、 続いて酵素基質ＢＣＩ　Ｐ／ＮＢＴを用いて培養することにより検出される。発 色は、試験片を水中で洗浄することにより停止させる。ＣＦＩＤＳ患者の血清の みが、ペプチドと反応する。健康な人はＣＡＶペプチドと反応しない。

他の具体例において、本発明はＣＡＶに暴露された証拠を患者由来の細胞含有体 液試料を調べることによりＣＡＶの存在を決定する方法を提供する。ＣＡＶペプ チドを診断法において用いて、ＣＦＩＤＳ患者の体液中のＣＡＶに対する抗体を 検出することができる。例えば、本発明のＣＡＶペプチドをＥＬＩＳＡに基つく 検定に用いてもよい。典型的なＥＬＩＳＡ法では、抗原（例えば、ＣＡＭペプチ ド）のトレーのウェルへの接着が含まれる。試験する血清を次に添加する。血清 が抗原に対する抗体を含有する場合には、それが結合する。反応の特異性は、プ レートに吸着される抗原により決定される。ＣＦ　Ｉ　ＤＳ患者由来の血清のみ がプレートに結合し、健康な患者由来の血清は結合しない。

ＣＦＩＤＳ患者の体液はウェスタンプロットによりＨＴＬＶ　Ｉの抗原との反応 性を示す。患者の体液試料、例えば血清試料または髄液を、ＣＦＩＤＳを有する 疑いのある患者から単離することができる。例えば、これらの試料をタン、＜り 質免疫プロット（代表的にはウェスタンプロ１トと称する）においてＨＴＬＶ　 ＩおよびＨＴＬＶ　Ｉ＋ウィルスタンパクと共に用いることができる。電気泳動 により分離されたウィルスタンパク質を試料体液に接触させる。

当分針において公知の通常の方法を用いて、試料中の抗体と免疫反応性または交 差反応性のウィルスタンパク質をゲル上のバンドとして可視化する。後記の実施 例３に記載するように、ＣＦＩＤＳ患者由来の体液試料、例えば血液または血清 試料は少なくとも２種のＨＴＬＶ遺伝子、ｇａｇおよびｅｎｖの生成物であるプ ロ・７ト上の少なくとも３つのタンパク質バンドと反応する抗体を含有する。更 に、ＣＦＩＤＳ患者の大部分は、ＨＴＬＶ−Ｔウェスタンプロ・ノドにおいてＰ ２７タンパク質に対する血清抗体を有する。Ｐ２７はｔａｘ遺伝子の産物と考え られる。

ＰＢＭＣは、フィトヘマグルチニン、ホルボールミリスチン酸、フンカナ７　Ｎ ＋リンＡおよび○ＫＴ３ＭＡｂ等の当業界において公知の手段を用いて活性化す ることができる。標準的免疫学的試験法、好ましくは周知の免疫組織化学的試験 法を用いて、好ましい抗体と反応する抗原の存在を決定することができる。この ような適切の抗体の一例としては、Ｋ　−１（Ｄｒ、　Ｆｕ！ｖｉａ　Ｖｅｒｏ ｎｅｇｅから入手冗Ｅ、　ＤｅＦｒｅｉｔａＳら、、　ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅｒａ ｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、上記］があるＯこのに −１モノクローナル抗体は、ＨＴＬＶ　ＩおよびＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇ遺伝子 生成物と反応することができる。

患者のＰＢＭＣまたは他の細胞種が抗体（それ自体ＨＴＬＶ　［および１１のｇ ａｇを認識することが知られている）により認識される抗原を有し、ＣＡＶの存 在の可能性を示す場合、ＣＡＶ配列またはこれらの配列によりコードされるエピ トープに対して特異的な抗体を用いた別の試験を行なって、抗原がＨＴＬＶ　Ｉ またはＨＴＬＶ　ＩＩのｇａｇ遺伝子である可能性を除く。例えば、抗体応答源 としてのＨＴＬＶ　Ｉの存在を除去するには、ＨＴＬＶ　ｒ　ｇａｇタンパク質 に対して特異的であり、かつＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇと交差反応しないＭＡｂを この方法において用いてよい。適切な抗体は、１３Ｂ１２である［例えば、Ｔ、 　Ｊ、　Ｐａ１ｋｅｒら＋　Ｊ、ｌ＋ｕｕｎｏ１．、１３６：　２３９３〜２３ ９７（１９８６）を膠照］。この抗体は、体液、例えば、血清が免疫プロットに ついて最低３種のＨＴＬＶタンパク質と反応する抗体を含有する患者のＰＢＭＣ を試験するのに用いることができる。

ＨＴＬＶ　Ｉに感染した患者の体液から得た細胞中のウィルスタンパク質はこの ような特異的抗体と免疫反応する。対照的に、ＣＡＶに感染したＣＦＩ［Ｓ患者 からはＨＴＬＶ　Ｉ特異抗体と免疫反応するＰＢＭＣは得られない。この同種の 除去段階を本発明の方法においてＨＴＬＶ　ＩＩ上のＨＴＬＶ　ＴまたはＣＡＭ 上に存在しないエピトープを認識することができる抗体と共に用いることができ る。

このような抗体は現在入手できないが、適当な抗体、好ましくはＭＡｂの開発が 本発明により意図されており、本方法に用いることができる。

本発明の試薬を用いるＣＦＩＤＳの診断に有用な更に別の検定形式は、粒子凝集 （ＰＡ）検定であり、現在３種類ある。これらの検定法は支持体に被覆された場 合のウィルス抗原に対する抗体の定性的検出に用いられる。あるいは、ＣＡＶ抗 原部位に対する抗体を支持体に被覆してもよい。前者の場合、試料をＣＡＶ抗原 に対する抗体の存在に関して試験する。後者の場合、臨床試料を抗ＣＡＶ抗体と 結合できる抗原の存在に関して試験する。以下の議論では前者の場合に関して記 載する。しカル、当業者は同様に検定を行なって抗体を支持体上に固定し、試料 中の抗原の存在を検出することができる。

第一の原形の検定は赤血球（ＲＢＣ）を用いた凝集検定である。凝集検定におい ては、抗原（または抗体）をＲＢＣに受動的に吸着させることによりＲＢＣを増 感する。この検定を行うためには、感作赤血球を９６ウ工ル微量滴定プレートに 入れる。少量の血清希釈液を各ウェルに添加し、次に所定のウェル中に試験およ び対照血清を添加する。患者から得た試験血清をウェルに添加した場合、血清中 に特異的抗原抗体が存在するならば、抗原抗体相互作用により精製抗原で被覆さ れた赤血球が凝集する。結果は肉眼で判断できる。抗原で被覆された赤血球およ び添加された血清試料間に、重力により固体の丸い点が９６ウエルプレート中に 観察できるような反応が起こらない場合を陰性とする。陽性の結果は、抗体が抗 原で被覆された赤血球と相互作用し、１以上の抗原で被覆された赤血球と結合し て、したがって、赤血球は互いに離れた場所に保たれるため幾分法がったパター ンで示される。非常に強い反応性があり、クランプ（凝集）の明確なパターンが 存在する場合、強い陽性結果が得られる。

感作赤血球で起こりうる非特異性反応を除くために、２種の人工担体が開発され ている。これらのうち最も一般的なものは、ラテックス粒子であり、これらはい ろいろな大きさおよび色のものが入手可能であるが、一般的には白色である。

最新技術では、ゼラチン凝集法を用い、この例としては、ＨＩＶ抗体の検出用の Ｓ　ｅｒｏｄｉａ−ＨＩ　Ｖキット（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ　Ｉｎｃ、）がある。

これらの人工担体に関する原理は担体として精製抗原で被覆されたラテックスま たはゼラチン粒子のいずれかを用いた受動的凝集に基づく。実際の検定は赤血球 に基づく検定において既述し　。

た方法と同様の方法で行ない採点する。

Ｋｏｂａｙａｓ　ｉら［Ｃｌ１ｎ、　Ｙｉｒｏｌｏｇｙ、　１４：　４５４〜４ ５１３（１９８６）］により行なわれた対照試験において、ゼラチン凝集法を、 免疫蛍光（Ｉ　Ｆ）および市販のＥＬ、ＩＳＡと共に試験した。ゼラチン凝集試 験法は１回の検定で優れた再現性、ならびにＩＰおよびＥＬＩＳＡと良好な相関 関係を示し、はとんど不一致はなかった。ゼラチン凝集の結果は特別な装置また は設備を用いなくても得られ、２時間で信頼性の高い結果が得られた。

更に別の態様においては、本発明は後記の実施例１０に記載したように、通常の 逆転写酵素検定により患者試料においてＣＡＶを検出するための診断法を提供す る。この検定法はポリリナアデニレート鋳型プライマーおよび２価のカチオンＭ ｎ”を用いてＣＦＩＤＳの疑いのある患者の体液に対して行われる。この検定法 においてこのプライマーまたはカチオンを用いる他のヒトレトロウィルスは知ら れていない。

本明細書に記載の方法、プローブ、プライマーおよび抗体は診断牛ノドの組立て において有効に用いることができ、ＣＦＪＤＳの診断および／または治療のため に健康管理を行なう人により用いられる。このような診断キットは、ＣＦＩＤＳ の疑いのある唐者の体液試料中のＣＡＶ核酸の検出に関してすでに記載した１以 上の検定法を行なうのに必要な成分を含む。このように、例えばこのようなキッ トは前記のように、体液試料に関してＰＣＲを行うためのＣＡＶ配列またはその フラグメント、あるいはＭＰＭＶなどの他のレトロウィルスの配列を含むプライ マー配列を含んでもよい。キットは、サザンブロノト、液体ハイブリダイゼーシ ョンまたは他のハイブリダイゼーション技法を行なうために前記のようなノ）イ ブリダイゼーションブローブ配列を含んでもよい。本発明の診断キットの別の成 分は、これらの特異的ウィルスの存在の可能性を除去するのに用いるための他の レトロウィルス遺伝子（ＨＴＬＶ　ＩおよびＩＩ、ならびにＭＰＭｖ）のヌクレ オチド配列を含んでらよい。

本発明の診断キットの更に別の成分は、ＣＡＶポリペプチド、ＣＡＶのエピトー プに特異的な抗体、ＨＴＬＶ　［およびＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇに対する抗体、 またはＣＡＶエピトープに結合しない他のレトロウィルスに特異的な抗体を含む 。

ハイブリダイゼーション検定のための陽性（ポジティブ）および陰性（ネガティ ブ）対照、バイアルおよび標識システムの様な他の通常の診断キット試薬は、Ｐ ＣＲ技術を行うために必要な酵素および池の試薬と共に含まれてもよい。キｙ） 中に存在する検出可能な標識が非可視性検出、例えばラジオイムノアッセイ用に 設計されている場合、この検定に必要な襟章的成分（対照、標準など）もキット 中に含まれる。

本発明の別の態様は、完全ＣＡＶの検出および単離を含む。この態様に従って、 前記のようにしてＰＣＲ技術により得られたＣＡＶの増幅および単離されたヌク レオチド配列は、それ自体側のプライマーの設計に用いられる。実施例４はすで に同定したプライマーｇ−２−１およびｇ−２−２を用いて得られた推定のＣＡ Ｖフラグメントの配列決定を記載するものである。予め同定したＣＡＶウィルス フラグメントを、別のＣＡＶ配列を入手および同定するためのプライマーまたは プローブとして用いることができる。

例えば、Ｏ，０ｈａｒａら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　８６　：　５６７３〜５６７７（１９８９）］およ■g９ Ｏｃｈｍａｎら［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２０　：　６２１〜６２３（１９８ｇ） ］に記載されているような逆ＰＣＲ技術を用いてウィルス配列のより大きな部分 を単離するためにこのプライマーを用いる。当分野で公知であり、通常行われて いるこのような技術を用いて、ＣＡＶの核酸配列の全体の単離および特性化が可 能である。

他の態様において、本発明はＣＡＶ感染に対する宿主免疫系からのＴ細胞または Ｂ細胞の応答を誘起させることができる非感染性ＣＡＶ　ＤＮＡまたはペプチド 配列の有効量を含むワクチン組成物を提供する。このワクチンはまた本明細書中 で記載するＣＡＭ　ＤＮＡ配列またはペプチドの全部または一部を含む。ＣＡＶ ポリペプチド配列（またはそのフラグメント）の少なくとも１種は抗原性または 免疫原性ペプチドのいずれかを与える。これらのペプチドを同定した上でワクチ ン成分として用いる。

ワクチンを生成するためのシステムの一例は欧州特許出願第２９０２４６号に記 載されており、ここで、ＣＡＶ　ＤＮＡ配列によりコードされるペプチドを脂肪 酸、リポソームおよびアジュバントを用いるワクチン組成物中のペプチドと置換 することができる。他のワクチン構築物は当業者には公知であり、ＣＡＭのペプ チドを用いて調製してＣＦＩＤＳワクチンを得ることができる。前記公開欧州特 許出願はワクチン組成物の例を開示するものとして本明細書の一部を構成する。

本発明の他のワクチン物質は、ＣＡＶ核酸配列に対して得られたアンチセンスＲ ＮＡ配列である。この配列は当業者には容易に合成できる。このようなアンチセ ンスＲＮＡ配列を感染した患者に投与すると、ウィルスのＲＮＡと結合すること ができ、それにより細胞中のウィルス復製を防止することができる。別のワクチ ン物質には、ウィルスのエンベロープタンパク質に対して産生される合成ペプチ ドが含まれる。これらのペプチドは、全ＣＡＶが配列決定されたときに容易に開 発することができる。ウィルスが完全に配列決定された場合のワクチン開発の別 の考え方には、ＣＡＶの宿主レセプターに結合できる合成ペプチドの合成が含Ｃ ＡＶ感染に対してヒトをワクチン化する方法も本発明に含まれる。本明細書に記 載の１またはそれ以上のペプチドを含むワクチンｍ製物を適切な用量で投与する 。ワクチンは非経口的にまたは他の通常の手段により投与してよい。

ｐＨ１等張性、安定性などの規制のある医薬上許容されるワクチンの調製は、当 業者の技術範囲内である。水酸化アルミニウムゲルなどの通常のアジュバントを ワクチン組成物において用いてもよい。ワクチン接種に関連した投与量および処 方は種々の宿主および環境的要因、例えば患者の年令、投与回数および地理的位 置ならびに環境を考慮して決定される。

以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものである。実施例１には、ＣＡ Ｖを産生ずる許容細胞培養物ならびに感染細胞中のＣＡＶの生物形態計測分析を 記載する。実施例２には、ウェスタン免疫プロットによる精製ＨＴＬＶ　Ｉに対 する抗体の二重盲検スクリーニングを記載する。実施例３には、プライマー配列 由来のＨＴＬＶ　ｌよび１ｌｌｉいたＰＣＲｌｉｎよるＣＦＩＤＳ患者のＰＢＭ Ｃ中のレトロウィルスＤＮＡの検出を記載する。実施例４には、ＣＦＩＤＳ患者 の増幅ＤＮＡ由来の推定の部分的ウィルス配列を得るために用いた精製法および 配列決定法を記載する。実施例５には、ＣＦＩＤＳ患者由来の活性化ＰＢＭＣ中 のＨＴＬＶ　Ｉおよび１１に関連した細胞ＲＮＡのその場でのハイブリダイゼー ションによる検出を記載する。実施例６には、ＭＡｂおよび免疫組織化学的染色 法により検出される、インビトロの発現されたＨＴＬＶ特異的ｇａｇタンパク質 の、特定のＣＦＩＤＳ患者由来の活性化ＰＢＭＣにおける検出を記載する。実施 例７には、みかけのＣＡＶ　ｔＲＮＡ　ＲＢＳの決定法を記載する。実施例８に は可能性ある特徴的なＣＡＶのｇａｇタンパク質を記載し、実施例９にはＣＡＶ の推定ｇａｇタンパク質の核の位置を示す。実施例１０には、ＣＡＶが非Ｃ型レ トロウィルスの特徴を有することを示す逆転写酵素検定を記載する。

これらの実験を行なうために、患者の体液試料をノースカリフォルニアおよびニ ューヨークの臨床診療から得た。各実験において試料に番号を付すことにより調 査員はすべて盲検することとした。

実施例Ｉ　ＣＦＩＤＳレトロウィルスの生物形態計測分析Ｈ−９（第３図）リン パ芽球様子細胞［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンｉン（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、　Ｍｅｒｙｌａｎｄ）より入手］■ よびＢ　−Ｊ　ａｂ（第４図）リンパ芽球様Ｂ細胞［ウィリアム・ホール医学博 士（ｌｌｉｌｌｉａｍＨａｌｌ、　Ｍ、Ｄ、Ｐｈ、Ｄ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｅｌｌ　 １Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より入手コの両者を２１日間３７℃にて５％Ｃｏ、／ ９５％空気中、ＲＰＭＩ　１６４０培地中、１０％ウシ胎仔血清およびＣＦＩＤ Ｓ患者の白血球と共培養する。

細胞を固定化した後、透過型電子顕微鏡で調べる（第３および４図参照）。ウィ ルス粒子を両タイプの共培養物において可視化する。電子高密度の円形ウィルス 粒子（一部は電子低密度の核を有し、他のものは電子高密度の核を有する）は、 粗小胞体および内側の大きな異常に膨張したミトコンドリアと結合して観察され る。

すべての粒子は同じ形状および大きさし４６〜５０ｎ＠（４６０〜５００人）］ である。

細胞外ウィルスは観察されなかった。細胞質膜から伸び出た形態は観察されなか った。

これらの観察により、次の３つの理由からＣＡＶは、非Ｃ型動物レトロウィルス であることが示唆される：第一に、ＨＴＬｖ　■およびＨＴＬＶ　Ｉｔなどのヒ トＣ型ウィルスは細胞内ピリオンを形成しない。細胞内粒子を形成するヒトＣ型 のみがＨＩＶであり、これらは小脳延髄槽内に閉状の形態と関連してみられる。

通常、円形Ｃ型ピリオンは細胞の細胞質膜由来のウィルス芽として形成される。

第二に、ＨＴＬＶＩ、］１、またはＨＩＶピリオンのいずれもミトコンドリア内 で見られない。第三に、これらのピリオンの直径および形態学から、これらは霊 長ｌｉＤ型レ型口トロウィルスはＳ　ｐｕ＋＋＋ａウィルスであることがわかる 。

実施例２　ウェスタンプロット転移 スクロース−バンド化した精製ウィルス由来のＨＴＬＶ　ｒのタンパク質は、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動により分離される。電気泳動による分離の後、タ ンパク質をＴ　ｒａｎｓｂｌｏｔ電気泳動セル（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）中、６０ボルト、０２５アンペア−で４時間製造元の指示に従って ニトロセルロース紙に移す。ニトロセルロース紙を短冊状に切断し、洗浄してフ リーな結合部位を２０ｍ１ＭＴｒｉｓ、５００ＩＩＩＭ　ＮａＣＩ（ｐＨ７，５ ）および３％ゼラチンを含有する遮蔽緩衝液で飽和させる。このシートを抗ウイ ルス抗体（１３Ｂ１２）または患者血清またはＣ３Ｆと４℃にて一夜反応させる 。

２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｖｅｅｎ−２０（ ＴＢＳ）でよく洗浄した後、細片を結合体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス または抗ヒトＩＫＧ）と室温にて１時間反応させる。細片をもう一変洗浄し、新 たに調製した１部のメタノール中４−クロロー１−ナフトール（０，３％）、５ 部の１００ｍＭ　Ｔｒｉｇ（＋）Ｈ７，６）およびＨ，Ｏ，（最終濃度１　：　 ３０００ンを含有する溶液で１０〜１５分間展開させる。この系により、１１０ ０ｎ未満の特定のタンパク質を検出することができる。分子量マーカーを有する 細片を用いてウィルス性タンパク質の分子量を測定する。

以下の第４表に成人ＣＦＩＤＳ患者におけるこのウェスタン免疫プロットによる ＨＴＬＶ　ｆに対する血清抗体の検出を示す。陽性の結果がＣＦＩＤＳ去者の４ １％（１５／３７）において観察された。対照血清は、患者の６％（１／１６） Ｌか陽性を示さなかった。陽性の健康な対照試料は本研究において唯一の非白人 である。陽性率はアメリカ赤十字の抗体反応性の標準を用いて少なくとも２種の ウィルス遺伝子産物に関して決定した。

ＣＦＩＤＳ患者（３７人）　１５＊　２２ＡＶレトａウィルス配列 ）（ＴＬＶ　ｆ−およびＩＩ−由来のプライマー配列を用いたポリメラーゼ連鎖 反応によりＣＦＴＤＳ患者のＰＢＭＣにおいて存在しろるＣＡＶレトロウィルス ＤＮＡの検出を行った。ＨＴＬＶ　Ｉ　ｔａｒ領域（７５７５〜７７０１ｂｐ） および他の領域（ＨＴＬＶ　Ｔ　ｇａｇ、　ＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇおよびＨＴ ＬＶ　ＩＩ　ｔａｘ）をＣＦ［ＤＳ患者の血液から増幅する。これらのプライマ ーおよびプローブの配列を第３表に示す。ＴＳＰ患者番号１３−４から得たＨＴ ＬＶ　Ｉ感染白血球から得たＤＮＡを陽性の対照として用いる。ＨＴＬＶ　ＩＩ ヒヒトセルラインＭｏ−Ｔおよびレトロウィルス陰性セルラインＵ９３７から得 たＤＮＡ（両方ともＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌａ、　ｊｌｅｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡより入手可能）を陰性対 照として用いた。

細胞のＳＤＳ／プロテイナーゼーに消化、続いてフェノールークロロホルムおよ びエタノール沈殿によりセルラインからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度をＹａｒ ｂｕｒｇの式［ｆａｒｂｕｒｇ、　Ｄ　＆　Ｃｈｒｉｓｉｅｍｙ、Ｗ、、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ　２３１０　：　３８４（１９４２）］を用いて３２０ｎＩＢでの基 底値に関して補正した２６０および２８０ｎ■での吸収を測定することにより評 価した。２μｇのＤＮＡを９５℃で１分間培養し、５５°Ｃで１分間培養し、７ ２°Ｃで２分間培養する３段階のサイクルを３０回繰り返して増幅した。増幅は すべてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ 中で行なった。ＰＣＲ反応混合物１００μｍは試料ＤＮＡ　２μｇ、ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２７８＠Ｍ、各プライマー０．８ｍＭ 、Ｉ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，３）、５０＋ａＭＫＣ１，１、５ｍＭ　Ｍｇ ＣＩｔ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンおよび２．５単位のサーマスアクアテイ カス（丁ｈｅｒｍｕｓ　Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ（Ｔａｑ）酵素（Ｐ ｅｒｋｉｎ　ＥｌｌＩｅｒ、ＣｅＬｕ５）を含有する。

反応混合物を鉱油で覆って蒸発を予防し、Ｔａｑポリメラーゼを添加する前に９ ４℃にて７分間変性させる。プライマー対はヌクレオチド１７５７５〜７６９６ （＋）、ヌクレオチド＃７７０１〜７６８０であり、ヌクレオチド＃　７６５２ 〜７６７７オリゴヌクレオチドブローブで分析した（第１表を参照）。

増幅したＤＮＡを１．２％アガロースゲル上の電気泳動により分析し、Ｎｙｔｒ ａｎナイロン膜（Ｓ＆Ｓ　Ｎｙｔｒａｎ）にプロッティングにより移す。濾紙を ２ｘＳＳＣに５分間室温にて浸漬し、８０°Ｃにて２時間真空下に焼成した。プ レハイブリダイゼーシタン緩衝液は５ｘＳＳＣ，１，０％ＳＤＳ、５０％ホルム アミド、５ｘデンハード溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）およ びＩ　５０　μｇ／ｍｌニシン精液ＤＮＡからなる。

フィルターを３７℃にて一夜プレハイブリダイゼーションに付し、次にプレハイ ブリダイゼーション緩衝液中１２ｘ１０６ｃｐｍの３ＩＰ標識オリゴプローブで 一夜プレハイブリダイゼーションに付す。次いで、フィルターを、（１）０．２ ｘＳＳＣおよび０，１％５ＤＳ（室温で２０分、２回）、（２）０．２ｘＳＳＣ および０，１％５ＤＳ（室温で２０分）、（３）０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ ５ＤＳ（３７°Ｃで３０分）で洗浄し、５〜７日間オートラジオグラフィーに付 す。

成人ＣＦＩＤＳ患者から得た血液試料の同様のＰＣＲ分析の結果を、患者と一緒 に生活しているかまたは親密な友人、例えば同室者および友人（暴露対照と称す る）と比較する。非暴露対照者は、ＣＦ■ＤＳ患者と接触しておらず、ＣＦｒＤ Ｓに関連した症候を経験したことのないランダムに選択された健康な人である。

ウィルス対照は、ヒトセルラインＭｏ−Ｔ（ＨＴＬＶ　ＩＩ感染）およびＭＴ− ２（ＨＴＬＶ　Ｉ感染）を含む。両方のセルラインはＡＴＣＣより入手可能であ る。これらの結果を、以下の第５表に示す。同様のＰＣＲ分析を以下の第６表に 示すように小児ＣＦＩＤＳ患者に関して行った。レトロウィルスＤＮＡを標識オ リゴヌクレオチドを用いてサザノブロ、ティングで検出した。

このデータは、Ｈ丁ＬＶＩＩｇａｇに関連するが、ＨＴＬＶ　ｌ　ｇａｇまたは ｔａｘと関係ないレトロウィルス配列がＣＦＴＤＳ、ｅ者において検出されたこ とを示す。

更に、暴露対照において観察された陽性の結果は、このＣＡＶは多くの非ヒトレ トロウィルスの場合のように、非感染個人に偶発的に伝播する可能性があること を支持する。これらのデータはまた、ＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇ配列の存在は症候 性患者のみを同定しないことを示す。

第５表 ＰＣｌ３　ｏ　。

陽性比　０／ＩＩ　９／１１（８２％）　０／ＩＩ　５／１１（３６％ン第６表 陽性比　０／１９　１４／１９（７４％）　Ｉ）／１９　１１／１９（５８％） ■−−■■−−−−曜−−−岡−−−噂−−一−実施例４　ＤＮＡ精製および配 列決定 第３表のＨＴＬＶ　ＩＩ　ｇａｇ特異性プライマーｇ−２−１およびｇ−２−２ を用いてＣＦＩ［Ｓ患者ＮＹ　ト１２から以下に記載する方法により、部分的ウ ィルスＤＮＡ配列を得た。

ＤＮＡ精製は、以下に記載するように、ジーン・クリーン・キット［Ｇｅｎｅ　 Ｃ１ｅａｎ　Ｋｉｔ　（Ｂｉｏ　１０１．　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ＾）］を用 いて実施例３で既に記載した方法を少し変更してＰＣＲ増幅ＤＮＡについて行な った。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは１ｘＴＡＥ緩衝液中３％ＷｕｓＩｅｖｅ（ＦＭＣ，Ｒ ｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）アガロースミニゲル中に付した。長い波長の紫外線光 を用いて、バンドを可視化し、励起する。励起したバンドを次にあらかじめ秤量 した１、５１の試験管中に入れ、アガロースの重量を測定した。

ジーン・クリーン・キットの７ｍｌのねし蓋の試験管の液体を１４０ｍ１の蒸留 脱イオン化（ｄｄ）水に添加し、１５５ａ＋ｌの１００％ＥｔＯＨと混合して溶 液の水分含量を５０％未満にする。この溶液を使用しない間は冷凍庫中−２０℃ にて貯蔵することができる。

すぐ使用する場合は、２．５〜３容積のＮａ＋ストック（６Ｍ）溶液をアガロー スに添加し、混合物を４５°Ｃ〜５５℃にて５分間培養して、２分後撹拌してア ガロースを溶解させる。ガラスミルク懸濁液（５μｌ）を添加し、混合物を水上 に５分間置き、１〜２分ごとに混合して、ガラスミルクを懸濁した状態に保つ。

結合ＤＮＡを有するシリカマトリックスを５秒間微量遠心によりベレ・ノド化す る。Ｎａ■上清を次に別の試験管に移す。未溶解のアガロースが残存する場合、 ベレットをＮａｌで再び洗浄する。ベレットを次に水冷したＮａＣ１／ＥｔＯＨ ／Ｈ，○（ＮＥＷ）（１０〜５０容積または２００〜７００μｍ）で洗浄する。

ペレ・ノドをピベ・ノドの先で突きながらピペッティングして再懸濁する。３回 目の洗浄で得た上清を除去した後、ベレットを再び懸濁させ、最後の洗浄液を先 の細いピペットで除去する。

洗浄した白色ベレットを次にベレ、トとほぼ同容積のＴｒｉｇ−ＥＤＴＡ（ＴＥ Ｘ水または低濃度塩緩衝溶液にかえてもよい）（通常約７μｌ）を用いて再懸濁 する。混合物を４４〜５５°Ｃにて２〜３分間培養し、３０分間遠心分離にかけ て堅いベレットを得る。ＤＮＡを含有する上清を次に除去し、ＴＥを用いた再懸 濁、培養、遠心分離および上清の除去の工程を繰り返す。

配列決定反応のためのアニーリング鋳型およびプライマーを得るために、１μｌ のプライマー（２０ｎｇ／μｌ）および前記のようにして得られた８μｌの遺伝 子浄化したＤＮＡを遠心分離用試験管内で合わせ、３分間沸騰させ、６０秒間氷 水中で急冷する。次いで、１μｌの１０ｘ反応緩衝液を合したプライマーおよび ＤＮＡに添加し、撹拌により混合し、室温にて１０分間放置する。

９６ウエルプレートで、列をＧ、Ａ、ＴまたはＣとラベルしたものにおいて、Ｇ とラベルしたウェルに２．５μｍのｄｄＧＴＰターミネーンコンミ、７クスを添 加する。同量のＡＴＰ、ＴＴＰおよびＣＴＰをそれぞれＡＳＴおよびＣとラベル したウェルに添加する。プレートを次に３７℃に最低１分間予備加熱する。

標識混合物を１：５０の濃度に希釈し、シーケナーゼを水冷した１ｘＴＥｃｐｌ ：８の濃度に希釈する。次のような成分＝１μｍのアルファ”Ｐ−ＡＴＰ、２μ ｌの標識混合物の１＝５０希釈液、１μｍのＯ，ＬＭ　ＤＴＴおよび２μｌのシ ーケナーゼのに８希釈液をアニールした鋳型プライマーおよび緩衝液混合物に添 加し、よく混合し、室温にて５分間培養して、標識反応を完了する。

標識反応が終了したら、３．５μｌの反応混合物を別のチップを用いて、［Ｇ。

Ａ、Ｔ、Ｃ］とラベルしたウェルに分配する。培養を合計３〜５分間、最高３０ 分まで続ける。反応を次に６μｌの１０ｍＭＥＤＴＡを添加することにより停止 させ、１〜２日間（”Ｐ）または１ｉ！１間（”Ｓ）、−２０℃にて貯蔵する。

９６ウエルのＭ上で、１．５μｍの反応液を２μｍのホルムアミド染料と混合す る。蓋を次に水浴上８０°Ｃにて培養し、氷水上で冷却し、６％アクリルアミド ゲルを加える。

０．６ｘＴＢＥをランニング緩衝液として用いて、ゲルを使用前に５０℃まで加 熱するために流す。これは、９０Ｗの一定電力（電圧限界＝２９００Ｖ、’Ｉ流 限界−５０ｍＡ）で流すことにより行う。試料を順次Ｏ１２および４．５時間ロ ードし、９ＱＷの一定電力で走行させる。Ｒ後のローディングの後、ゲルを更に ９００分間置させ（合計流動時間＝６時間）、ゲル装置を正面の（短いはう）ガ ラスプレートを倒してベンチ上に平に置（。後ろのガラスプレートを除去し、Ｗ 　ｈ　ａ　ｔ　ｍ　ａ　ｎｎ＃］ｉｌ！紙をゲル上に置き、蒸留水を噴霧するこ とにより湿らせる。ゲルが付着した濾紙を除去し、サランラップで覆い、コダノ クＸＡＲフィルムにさらすために用いる。暴露は適切には一７０℃にて１２〜７ ２時間行う。次にオートラジオグラフィーを読み取る。

第１Ａ図および１８図は、得られた部分的な推定されるＣＡＶウィルスＤＮＡ配 列を示す。Ｇ　ｅｎ　Ｂ　ａｎｋおよびＥＭＢＬでの分析により、第１Ａ図およ び１８図のＣΔ■配列はいかなる公知のレトロウィルスの配列とも明かに似てい ない。従って、これらの配列により、ＣＡＶは公知のヒトまたは動物ウィルスと 同定されないことが解る。

しかし、第１Ａ図および１８図の配列は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、患者 の体Ｍｉ織および体液から得たウィルスを増幅させるために最初に用いたＨＴＬ Ｖ　ＩＩ　ｇａｇ遺伝子配列の一部と明かに相同性を有する（８１．５％相同） 。これらのヌクレオチドフラグメントは他のレトロウィルスのｇａｇ遺伝子配列 と相同性が９２％未満であり、ＣＦＩＤＳの疑いのある患者の体組織および体液 においてこのようなヌクレオチド配列（または、それによりコードされるペプチ ド）を同定することにより感染の診断を確かめることができる。第１Ａ図および １８図の完全な配列は本発明に従ってＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼー シヨンプローブを得るために用いられる。

ＣＡＶペプチドは第１Ａ図または１８図のＤＮＡ配列の全部またはフラグメント によりコードされる。第１Ａ図または１８図のヌクレオチド配列は、一部には、 ＣＡＶのペプチドまたはタンパク質の暗号配列であると考えられる。箪２人図か ら第２Ｆ図の６つの推定されるＣＡＭペプチド配列は第１Ａ図または第１Ｂ図の ヌクレオチド配列をそれぞれ５“ヌクレオチド１．２、または３からはじめて各 配列に関する３つのリーディングフレームに翻訳することにより決定する。第２ Ａ図は、第１Ａ図のヌクレオチド１で始まるリーディングフレームである。第２ Ｂ図は、第１Ａ図のヌクレオチド２で始まるリーディングフレームである。第２ Ｃ図は、第１Ａ図のヌクレオチド３で始まるリーディングフレームである。第２ Ｄ図は、第１Ｂ図のヌクレオチド１で始まるリーディングフレームを示す。第２ Ｅ図は、第１Ｂ図のヌクレオチド２で始まるリーディングフレームを示ス。第２ Ｆ図は、第１Ｂ図のヌクレオチド３で始まるリーディングフレームを示す。

第２Ａ図からＦ図において、星印は推定される終止コドンを示す。第１Ａ図また は第２Ｂ図のヌクレオチドのリーディングにおける１つの塩基エラーか終止コド ンを示す可能性がある（そこでは、天然アミノ酸のコドンがコードされるはずで ある）。従って、ＣＡＶペプチド配列は終止コドン間に存在する以下のコードさ れた配列のフラグメントならびにその小フラグメントからなる。

第１Ａ図または第１Ｂ図のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つ のペプチド配列（またはそのフラグメント）により、抗原性または免疫原性ペプ チドのいずれかが得られると考えられる。第２Ａ図から第２Ｆ図に示されるこれ らのペプチドならびにＣＡＶの完全な配列決定により同定される他のペプチドを ワクチン成分として用いてもよい。

実施例５　その場でのハイブリダイゼーションＨＴＬＶ　Ｉおよび１１に関連し たウィルスＲＮＡは、以下のように、ＣＦＩＤＳ患者から得た活性化ＰＢＭＣに おいてその場でのハイブリダイゼーションにより同定されるが、対照は同定され ない。

新たに単離したＰＢＭＣを、ＲＰＭｆ　１６４０中、最適なマイトジェン濃度の 精製ＯＫＴ　３　ＭＡｂ（Ｏｒｔｈｏ）およびＩＯＵ／ｍｌの組換え体ＩＬ２を 含有する１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）とともにクラスタープレート中で培養す る。細胞濃度を完全増殖培地中５０ｎｇ／ｍｌの組み換え体Ｉ　Ｌ　２　（Ｓａ ｎｄｏｚ、　Ｖｉｅｎｎａ、＾ｕｓｔｒｉａ）で７日間２　ｘ　１０’ｍｌ−’ に調整し、次にパラホルムアルデヒドで固定したガラススライド上で回転させ、 １００％エタノール中に貯蔵する。

その場でのハイブリダイゼーションをＨＴＬＶ　Ｉおよび１１の５′領域（ｇａ ｇ）に特異的な３ｓＳ４識ＲＮＡプローブを用いて行った。転写された標識リボ プローブの大きさはＨＴＬｖ　Ｉに関しては５０６ｂｐ、ＨＴＬＶ　ＩＩに関し ては４００ｂｐであった。プローブを１〜２　Ｘ　１０　”ｄｐｉ／ａｔで、５ ２℃の温度にてハイブリダイゼーションし、４〜８日間オートラジオグラフィー に付す。すべてのセルラインを同じ条件を用いて、同じ実験室内でハイブリダイ ゼーションし、細胞を二重盲フードを用いて調べる。

第７表１；！ＨＴ　ＬＶ　Ｉ　ｇａｇプローブおよびＨＴＬＶ　Ｉｔ　ｇａｇプ ローブを用イタソの場でのハイブリダイゼーションによる成人ＣＦＩＤＳ患者お よび暴露対照におけるレトロウィルスの検出に関するデータを示す。

鼻り老　成人ＣＦＩＤＳ＊由来の活性化ＰＢＭＣのその場でのハイブリＰＣｌ３ 　０　０　０ ＰＣ１４０００ ＰＣ１５０００ 陽性比　１１５（２０％） ウィルス対照 ＭＴ−２細胞（ＨＴＬｖＩ）＋４　０　０Ｍｏ−Ｔ細胞（ｌ（ＴＩＪＩＩ）　０ 　４４　０３＋＝　５０〜１％の陽性細胞：２＋＝１〜０，１％の陽性細胞：１ ＋＝１〜０．０１％の陽性細胞、０＝＜０．０１％の陽性細胞。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ　ｍ　ＲＮ　Ａ陽性細胞は、ＨＴＬＶｌ１ｇａｇブσ−ブを用いた 場合、試験した成人ＣＦＩＤＳも者の４５％において検出された。５人の対照の うち１人だけがこれらの感染細胞を含存していた。１１人のＣＦ［ｌＳ患者のう ち２人からのＰＢＭＣもＨＴＬＶ　Ｉ　ｇａｇプローブと反応するＲＮＡを含有 し、一方５人の対照のうち１人も含存しなかった。これらのデータにより、ＣＦ ＩＤＳ患者から得たＰＢＭＣはインビトロで、ウィルス性ｇａｇｍＲＮＡを転写 することがわかる。

このＲＮＡは大部分の、ｔ−者においてＨＴＬＶ　ｆｌ　ｇａｇとより相同性で あるが、数人の患者においてはＨＴＬＶ　Ｉ　ｇａｇに対しても相同性を示す。

プロトタイプＨＴＬＶ　Ｉ（ＭＴ−２）またはプロトタイプＨＴ　Ｌ　Ｖ　Ｉ　 Ｉ（Ｍｏ−Ｔ　）に感染した対照細胞はこのようなｇａｇ■ＲＮＡ交差反応性を 示さない。このことは、このＣＡＶがＨＴＬＶ　ｆまたはＨＴＬＶ　ＩＩでない ことを示している。

実施例６　抗体によるＨＴＬＶｇａｇタンパク質の検出抗体を用いて、ＣＦＩＤ Ｓの疑いのある史書のＰＢＭＣにおけるＣＡＶヌクレオチド配列を検出するため に、前記のＤｅＦｒｅｉｔａｓら記載の方法を行なう。

サイトスパン細胞を２時開風乾し、１０分間冷アセトンで固定する。これを次に ３０分間２０μｌの最適に希釈したＨＴＬＶ　Ｔ　ｐ２４に対するＭ　Ａ　ｂ［ Ｄｒ、　Ｆｕｌｖｉａ　Ｖｅｒｏｎｅｔｒｅ　（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂ：ｏｎｅｔｒ ｃｓ、　Ｂｅｔｈｅｇｄａ、　ＭＤ）から］、ＨＴＬＶ　ＩＩ　ｐ２４またはＨ ＩＶｐ１５タンパク質ＩｈｏＩｌａｓ　Ｐａ１ｋｅｒ　（Ｄｕｋｅ　ＩＪｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ、　Ｄｕｒｈａｍ、　Ｅ）からコを含有する腹水を用いて培養する 。

さらに、ＨＩＶｐ２４に対するＭＡｂを、叶、Ｍｉｃａｈ　Ｐｏｐｏｖｉｃ　（ ＮＣＩ、　Ｂｅｔｈｅ＋＋ｄａ。

ＭＤ）から得た。陽性の対照細胞は、それぞれＨＴＬＶ　Ｉ、ＨＴＬＶ　１１お よびＨＩＶに感染したＭＴ２、Ｍｏ−Ｔ２およびＨ９−Ｔ細胞を含む。細胞をア ルカリホスファターゼの免疫コンプレツクまたは抗アルカリホスファターゼ（Ａ ＰＡＡＰ）で、　Ｊ、　Ｃｏｒｄｅｌｌら［Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙ ｔｏｃｈｅｍ、、　３２：２１９〜２２５（１９８４）Ｅの方法（こ従■ て、Ｄａｋｏ［５ａｎＬａ　Ｂａｒｂａｒａ、　ＣＡ３から得た試薬を用いて標 識する。健康なドナーから得た未感染Ｈ９細胞および髄液由来のＴセルラインは 陰性の細胞対照の役割を果たす。第２抗体およびＡＰＡＡＰ？’！合体の非特異 的結合に関する試験も行なう。

第８表および第９表はこの検定の結果を示す。

ＨＴＬＶ　ｌおよびＨＴＬＶ　Ｉｔ　１（ＴＬＶ　ＩＰＣ６０ ＰＣＩＯ＋ｌ　０ ＰＣ１６００ ＭＴ−２（ＨＴＬＶ　Ｉ）　＋４　＋４■＋−１〜Ｇ、０１にの陽性細胞：Ｏ＝ ＜Ｑ。０１％の陽性細胞。

１９８　免疫組織化学による小児ＣＦＩＤＳ患者がらの活性化ＰＢ１８−２３（ ２）　Ｑ　Ｏ ＭＴ−２（ＨＴＬＶ　Ｉ）　＋４　＋４ＨＴ　Ｌ　Ｖ特異的なｇａｇタンパク質 を、免疫組織化学的染色法を用い、ＨＴＬＶ！およびＩＩのｇａｇ領域に特異的 なＭＡｂＫｌにより、ＣＦＩＤＳ患者から得た不活性化ＰＭＢＣにおいて低頻度 で検出した。ＨＴ　Ｌ　Ｖ　ｌ　ｇａｇ（１３ＢＩ２）特異的なＭＡｂはＣＦＩ ＤＳ患者由来のいかなる細胞とも反応しない。このことはウィルス遺伝子生成物 が少なくともＣＦＩＤ５４Ｆ、者のサブ集団中に発現され、このタンパク質がＨ ＴＬＶ　Ｉコードされていないことを意味する。

実施例７　ｔＲＮＡプライマー結合部位２のプライマーをＰＣＲ技術において用 いるために設計する：センスプライマーはプロリンに関するｔＲＮＡ部位のＤＮ Ａ配列（＃７６８〜７８３）であり、アンチセンスはＨＴＬＶ　Ｉ１ｇａｇ領域 塩基（＃　１１８７〜１２１１．）である。セルラインＭＴ−２（ＨＴＬＶ　ｌ ）、Ｍｏ−Ｔ　（ＨＴＬＶ　ＩＩ）および２０Å以上のＣＦＩＤＳ患者から生成 した生成物を、両ウィルスのための２つのプライマーの開にあるＤＮＡ配列に対 応する放射標識したＩ　８−ｍａｒのプローブを用いたサザンブロソトノーイブ リダイゼーンジンによりプローブする。

この結果、ＭＴ−２およびＭｏ−Ｔ　ＤＮＡはプロリンのｔＲＮＡ結合部位によ り増幅されることが示され、すべてのＣＡＭ　ＤＮＡ試料は陰性であることが示 された。従って、ＣＡＶは明かに公知のヒトＣ型ウィルスでない（ＨＩ　Ｖを除 く）。

同様の実験をり７ンに関するｔＲＮＡプライマー結合部位をＰＣＨに関する「セ ンス」プライマー鎖（５’　ＴＧＧＣＧＣＣＣ＾＾ＣＧＴＧＧＧＧＣ３°）とし て用いて行ない、「アンチセンス」鎖プライマーをプロトタイプサルＤ型レトロ ウィルス（Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｖ　Ｘ５’　ＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＴＴ Ｇ　３’）から得た場合、プライマーはＭＰＭｖ由来の介在オ１７ゴヌクレオチ ド（ＧＡＴＡＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＣＣＧＣＡ）を用いてプローブした ときに可視化されるＭＰＭＶ感染細胞から得た２種の異なる大きさの生成物を増 幅する。生成物は３６０ｂｐおよび２５０ｂｐである。このシステムを用いて増 幅し、プローブした１０人のＣＦＩＤＳ患者のＤＮＡ試料のうちの１０が同じ大 きさの生成物であった。

このように、ＣＦｆＤＳレトロウィルス、ＣＡＶは明らかにリシンのｔＲＮＡの プライマー結合部位を有する。この結果は、ＣＡＶｆｉＨＴＬＶ　Ｉまたは！１ でないことがわかり、レンチウィルス、霊長類り型レトロウィルス、またはＦ　 ｏａｍｙ（Ｓｐｕｍａ）ウィルスのいずれかであることを示し、これらはすべて ｔＲＮＡリシンプライマーを使用する。

実施例８　ＣＡＶのｇａｇタンパク質の特性化末梢血白血球をＯＫ　Ｔ　３　Ｍ ａｂ（Ｏｒｔｈｏ　ＰｈａｒｍａｃｅｕＬｉｃａｌｓ）および組換えＩＬ−２を 用いて５日間培地中で活性化する。６日目に完全培地をシスティンおよびメチオ ニンを含まない培地で置き換えた後、細胞を３３８−メチオニンおよびシスティ ンで１６〜１８時間標識する。細胞を破砕した後、ｇａｇ抗原決定基を含有する 標識タンパク質をＨＴＬＶ　Ｉ、１■、５ＴＬＶおよび５ｔａｐｈＡのｇａｇタ ンパク質と反応するマウスＭａｂ　Ｋ　１で沈殿させる。

沈殿をＳＤＳ中で沸騰させ、５ＬａｐｈＡから抗原−抗体コンブレノクスを除去 し、タンパク質複合体を１２％〜１５％ポリアクリルアミドゲル中領１％ＳＤ中 細よび２−メルカプトエタノールを用いて１６〜１８時間一定電流で電気泳動に 付す。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに１２〜１５日間さらしたのち、ＣＦＩＤＳ 患者および対照から得た放射標識したタンパク質の大きさを共電気泳動に付した 標識した分子量マーカーを用いて得られた１３１曲線から計算する。

この結果から、１２％ＰＡＧＥ中ＨＴＬＶ　Ｉおよび１１感染セルラインから得 た沈殿したｇａｇタンパク質は、２４ｋＤおよび４５ｋＤであることがわかる。

同じゲルに関して、１０のＣＦＴＤＳ由来のＣＡＶｇａｇタンパク質のうちの１ ０は２７〜２８ｋＤ、４５ｋＤ、５５〜５６ｋＤおよび７６ｋＤである。健康な 対照からはｇａｇタンパク質は沈殿しなかった。

１５％ＰＡＧＥで、低分子量のｇａｇタンパク質はＣＦＩＤＳ患者から可視化す ることができた。ｐ２７〜２８の他にに、ｐ１１〜１２（１１〜１２ｋＤ）およ びｐ１３〜＋４（１３〜１４ｋＤ）も可視化された。このようなバンドはＭＴ− ２またはＭｏ−Ｔ中、あるいは健康な対照には存在しない。

これらのデータから、ＣＦＩＤＳレトロウィルスＣＡＶはＨＴＬＶ　［または１ １でないことがわかる。これらの分子量のｇａｇタンパク質を発現することが示 されている動物レトロウィルスは＝７ｉ長類り型レトロウィルス；霊長類Ｃ型、 例えば５ＳＡＶＳＧＡＬＶおよびＢａＥＶ；レンチウィルス、例えばＥＬＡＶ（ ただし、ＨＩＶでな（す；マウスＢ型、たとえばＭＭＴＶ　：　）すＣ型レトロ ウィルス、例えばＡＳＬＶ、ＲＥＶ、ならびに恐らくはＦ　ｏａｍｙ（Ｓ　ｐｕ ｍａ）ウィルスであるが、この後者のグループのｇａｇタンパク質は直接分析さ れず、ＤＮＡ配列外挿により分前記ＣＦＩＤＳ患者試料から得た白血球をに−Ｉ 　Ｍａｂと反応させ、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）で免 疫染色する。試験した患者試料の５０％以上（および対照の０％）はｇａｇタン パク質に関して細胞が染色された。もつと重要なことは、染色は陽性細胞の細胞 質および核の両方に見られることである。

ウィルスタンパク質に関して核染色を呈することが知られている唯一のレトロウ ィルスはＦ　ｏｎｔａｙウィルスのグループである。

実施ｆｌ＋　１０　逆転写酵素検定 以下のようｌこして逆転写酵素検定を行った。ＣＡＶをセルラインＢ−ＪａｂＨ −９およびＶ−９３７中で培養した（ＨＴＬＶ〜ｌ１ｇａｇ領域に関するＰＣＲ によるとすべて陽性）。ウィルスを一８０℃での冷却を３サイクル行なって収穫 する。培養液を次に解凍し、１１００Ｏｘにて１０分間４℃にて遠心分離して無 傷細胞を除去する。

ウィルス粒子を２５，０ＯＯｒｐＩ１１の速度で９０分間Ｂ　ｅｃｋｍａｎ　Ｓ 　Ｗ　２８０−ターにかけてベレット化する。ベレットを５００μＩ（ｆｉｌｔ −を１００ｘにするため）のＴＮＥ緩衝液（１０ａＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ］ｐＨ８ ，０、１００＋ａＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に懸濁する。緩衝液をす ぐ試験するかまたは一２０’Ｃにて貯蔵する。

以下の第１Ｏ表に示すように、２５μｌまたは５０μｌの緩衝液中の溶解液を各 検定試験管中に用いる。

１００μｌ中の逆転写酵素活性の反応混合物［１，Ｍ、　Ｙｅｒｍａ、　Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌ、　、　１５　：　８４３−８５４　（１９７５）　：　１．Ｍ、Ｙ ｅｒｍａ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　１５　：　１２１〜１２６　（１９７５）］ は、５ＱａＭ　ＴｒｉhＩ／ ＨＣｌ５ｐＨ８，ｏ、４０ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　ジチオトレイトール、０．０ ５％Ｔｒ４ｔｏｎ　Ｘ−１００，０，２％Ｎｏｍ１ｄｅＬ　Ｐ−４０，ｌ　ＱＱ μｇ／＋ａｌウシ血清アルブミン、４０μｇ／ｍｌ鋳型−プライマー複合体およ び種々の量の二価カチオン（Ｍ　ｇ　”またはＭｎ”）を含存し、以下の第９表 に示すような濃度を達成する。

外因性の鋳型−プライマー攬合体をポリリボアデニレート−オリゴデオキシチミ ンレート（ポリ・ｒＡ−オリゴ・ｄＴ）またはポリリボントシレート−オリゴデ オキシグアニジレート（ポリ・ｒＣ−オリゴ・ｄＧ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　 Ｐｉｓｃａｔａｗａｙａ、　ＮＪ）のいずれかから選択する。

水上５分後、１．５ｍＭの［’Ｈ］＃Ｍ謙デオキジデオキシチミジントリホスフ ェートＴＰ；４３Ｃｉ／ｍモル）または６．６ｍＭの［’Ｈ］標識標識デオキシ グアノシントリフスフ（ｄＧＴＰ　；　１１ｃｉ／ｍモル）（＾ｍｅｒｓｈａｍ 、υｎ１ｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）を混合物中に添加で１５分後、この反応で合 成された沈殿した［３Ｈ］標識ポリシチミジン（ポリＴ）およびポリグアニジン （ポリＧ）を予め５％ＴＣＡ予備浸漬したガラスミクロファイバーフィルター（ Ｗｈａｔｍａｎｎ　ＧＦ／Ｃ１２，４ｃａ＋）上に集める。フィルターを水冷し た５％ＴＣＡで１０回洗浄し、乾燥する。”Ｈ−ＴＣＡ−沈殿性物質（即ち、２ 重鎖核ために、独自の外因性鋳型プライマー、２価カチオン（Ｍｇ”またはＭｎ ”）、およ好むようである。ＣＡＶ［ポリγＡオリゴ（ｄＴ）鋳型プライマーお よびＭ　ｎ　”選択性］と同じＲＴの特徴を示すレトロウィルス−はＳ　ｐｕｌ ＋ａ（ｆｏａｍｙ）ウィルスおよびサルＤ型レトロウィルスである。

２５μＩ　ポリγ＾−オワゴー（６丁）　Ｍｇ”（５ｍＭ）　’Ｈ−ＴＴＰ（１ ，５μｍ）　１．５７２５０μｍ　ポリγ＾−オリゴ−ＣｄＴ＞　Ｍｇ”（５ｄ ）　３Ｍ−丁ＴＰ（１，５μ議）７５２２５μｌ　ポリγ＾−オリゴ−（ｄＴ） 　Ｍｇ”（１０ｄ）　’Ｈ−丁ＴＰ（１，５μｍ）　８６２５０μｌ　ポリγＡ −オリゴ−（ｄＴ）　Ｍｇ”（１（ｌｄ）　”Ｈ−丁ＴＰ（１，５μｍ）　４３ ０２５μｍ　ボリアＡ−オリゴ−（ｄＴ）　Ｍｎ’″（０，５ｓＭ）　’Ｈ−Ｔ ＴＰ（１，５μｍ）　２０．７３７５０μｌ　ボリアＡ−オリゴ−（ｄＴ）　Ｍ ｎ”（０，５ａ＋Ｍ）　’Ｆｌ−ＴＴＰ（１，５μｍ）　１３．０１１本発明の 多くの修正および変法も本発明に含まれるが、これらは当業者には明ゼーシコン プライマーおよびプローブとして用いること１、ならびに他の検定技術および抗 体、ならびに治療薬用の他のウィルス性ペプチドの使用も考えられる。

本発明の組成物および方法のこのような修飾および変更は、本発明の特許請求の 範囲内にあるものと考えられる。

ＦＩＧ＋　ＩＡ ＴＧＡＧＧＡＣＴ’ＴＴ　Ｇ　３’ Ｆｉｇ、２Ａ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 ｌｌｌｍ７〜−一一−Ｎ＠、ｌｃｒ〜噛ｓｔｍフロントページの続き （５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５１０４　 ８６１９−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ １５／４８　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４ ＢＺ　７８２３−４８ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ ／／Ｃ０７Ｋ　９９：００ ８９３１−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＵ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　Ｋ Ｐ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、 ＳＵ ＦＩ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ （７２）発明者　ヒラード、ブレンダンアメリカ合衆国ペンシルベニア１９００ ３、アートモアー、ベルモント・アベニュー２３２３番

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＦＩＤＳ関連のウイルスＣＡＶ。
2. ２．天然の供給源に存在する不純物から実質的に単離した請求項１に記載のウイ ルス。
3. ３．ＣＡＶポリヌクレオチド配列。
4. ４．ＣＡＶのゲノムまたはその相補体に選択的にハイプリダイズすることができ るヌクレオチドの連続配列を含有する請求項３に記載の配列。
5. ５．ＤＮＡポリヌクレオチドである請求項３に記載の配列。
6. ６．ＲＮＡポリヌクレオチドである請求項３に記載の配列。
7. ７．検出可能な標識と結合した請求項３に記載の配列。
8. ８．固体支持体に固定された請求項３に記載の配列。
9. ９．ＣＡＶの抗原決定基をコードしているヌクレオチド配列を含有する請求項３ に記載の配列。
10. １０．ＣＡＶアミノ酸配列を含有する実質的に単離されたポリペプチド。
11. １１．ＣＡＶの抗原性部位を含有する請求項１０に記載のポリペプチド。
12. １２．組換え法によって製造される請求項１θに記載のポリペプチド。
13. １３．化学合成によって製造される請求項１０に記載のポリペプチド。
14. １４．固体支持体に固定されている請求項１０に記載のポリペプチド。
15. １５．免疫反応を生成させるに十分な量のポリペプチドを哺乳動物に投与するこ とからなる抗ＣＡＶ抗体を調製する方法において使用するための請求項１０に記 載のポリペプチド。
16. １６．ＣＡＶポリヌクレオチドを含む暗号配列を含有する組換えベクター。
17. １７．暗号配列が暗号配列の発現を指令することができる適当な調節制御配列に 機能的に結合している請求順応に記載の組換えベクターによって形質転換された 宿主細胞。
18. １８．ＣＡＶポリペプチドおよび薬学的に許容しうる担体を含有する組成物。
19. １９．ポリペプチドが免疫反応を生成させうるものである請求項１８に記載の組 成物。
20. ２０．ワクチン組成物である請求項１９に記載の組成物。
21. ２１．（ａ）ポリクローナル抗体の精製調製物；（ｂ）モノクローナル抗体組成 物；または（ｃ）組換え抗体組成物である、ＣＡＶポリペプチドの抗原決定基に 結合する抗体を含有する抗ＣＡＶ抗体組成物。
22. ２２．所望により検出可能な標識または固体支持体に結合している請求項２１に 記載の抗体組成物。
23. ２３．ＣＦＩＤＳの症状を示す患者の体液においてＣＡＶのポリヌクレオチド配 列の全部または一部の存在を検出することからなるＣＦＩＤＳを診断するための 方法。
24. ２４．検出行程が、ＣＡＶポリヌクレオチド配列またはその相補体の全部または フラグメントを、インビトロで患者の体液の試料について行なうポリメラーゼ連 鎖反応におけるプライマーとして使用することからなり、配列の増幅がＣＦＩＤ Ｓの病因学的物質の存在を示す請求項２３に記載の方法。
25. ２５．検出行程が、ＣＡＶポリヌクレオチド配列の全部またはフラグメントを、 インビトロで患者の体液の試料について行なうハイブリダイゼーシヨン検定にお けるハイブリダイゼーションプローブとして使用することからなり、配列のハイ ブリダイゼーシヨンがＣＦＩＤＳの病因学的物質の存在を示す請求項２３に記載 の方法。
26. ２６．ＣＦＩＤＳの症状を示す患者の体液において抗ＣＡＶ抗体の存在を検出す ることからなろＣＦＩＤＳを診断するための方法。
27. ２７．検出行程が、ＣＦＩＤＳ患者からの体液を、抗ＣＡＶ抗体と抗原一抗体コ ンプレックスを形成しうる抗原性部位を提示するＣＡＶポリペプチドまたはタン パク質と接触させることからなる請求項２６に記載の方法。
28. ２８．検出行程が、ＣＦＩＤＳ患者からの体液を、抗ＣＡＶ抗体に結合しうる抗 原性部位であってＨＴＬＶＩとＣＡＶの間またはＨＴしＶｌｌとＣＡＶの間で共 通する抗原性部位をコードしているＨＴＩＶＩまたはＨＴＬＶＨ由来のペプチド またはタンパク質と接触させることからなる請求項２６に記載の方法。 ２９、ＣＡＶポリヌクレオチド配列または抗ＣＡＶ抗体について大量の血液から の試料をスクリーニングし、該スクリーニングにおいて陰性と試験された試料を 選択し、該選択した試料に対応する血液部分から血液製品を調製することからな るＣＡＶによる感染のない血液製品を製造するための方法。