DE202010004193U1 - Testbestecks zur Bestimmung von neuroregulatorischen und psychischen Störungen - Google Patents

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Abstract

Testbestecks zur Bestimmung von neuroregulatorischen und psychischen Störungen, bestehend aus Assays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie zur Messung der Konzentrationen von Neurotransmittern in Blutzellen.

Description

  • Die Erfindung betrifft Testbestecks zur Bestimmung neuroregulatorischer gesundheitlicher Störungen und insbesondere die Messung von Neurotransmittern, vor allem von biogenen Aminen, in Zellen aus Patientenblut, Thrombozyten und/oder Lymphozyten (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells/mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) zur Feststellung von Neuroregulationsstörungen und psychischen Erkrankungen. Dabei dienen die Blutzellen als Surrogat für die synaptische Neurotransmitterfunktion im (zentralen) Nervensystem.
  • Zu diesen Störungen/Erkrankungen gehören alle Formen von Neurostress, etwa das Burn-Out-Syndrom, das Chronische Müdigkeitssyndrom (Chronic Fatigue Syndrom – CFS), die zentrale Fatigue (Erschöpfung), Schlafstörungen/Insomnie, Fibromyalgie (FMS), MCS – die multiple Chemikalienüberempfindlichkeit (multiple chemical sensitivity), Migräne, Depressionen, PTSD (Post-Traumatische Stresserkrankung) oder die Winter-/Frühjahrsdepresssion, auch das PMS/Prämestruelle Syndrom, Menopausebeschwerden, Parkinsonsyndrom, RLS/Restless Legs Syndrom (Wittmaack-Ekbom-Syndrom der ”ruhelosen Beine”, eine neurologische Erkrankung mit Gefühlsstörungen und unwillkürlichen Bewegungen in den Beinen), ADS/ADHS (Aufmerksamkeits-Defizit/Hyperaktivitäts-Syndrom), Autismus, Bulimie, Anorexie, Reizdarmsyndrom (Jason LA et al., Chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, and multiple chemical sensitivities in a community-based sample of persons with chronic fatigue syndromelike symptoms, Psychosom Med 2000; 62: 655–63), primäre und sekundäre Depressionen oder das Burn-Out-Syndrom (Larson et al. 2001, Brain Behaviour Immunity, 15: 371–387).
  • Patienten mit dem Beschwerdebild einer multiplen Chemikalienüberempfindlichkeit (multiple chemical sensitivity – MCS) etwa zeigen bei geringer Chemikalienexposition ein obligates systemisches Beschwerdebild. Die betroffenen Personen klagen über Gedächtnisstörungen, Schwäche, Schwindel, Kopfschmerzen, Schweißausbrüche, Atemnot, Zittern, Gelenk- und Muskelschmerzen o. ä.. Die Reaktion wird durch verschiedenste Substanzen (z. B. Autoabgase, Parfüme, Farben, Lacke, Holzschutzmittel) ausgelöst, meist unabhängig von deren chemischer Struktur und bei sehr niedrigen Konzentrationen, die normalerweise auf den Menschen keine subjektiv wahrnehmbaren Auswirkungen haben.
  • Diese ungewöhnlichen Reaktionen wurden im Laufe der letzten 20 Jahre mit Begriffen wie Sick Building Syndrom (SBS), Enviromental somatisation syndrome, Building related illness o. ä. umschrieben. Weder sind bis heute die Ursachen dieses Krankheitsbildes bekannt, noch gibt es gesicherte diagnostische Parameter dafür. In der Regel lassen sich bei den betroffenen Personen keine erhöhten Chemikalienspiegel nachweisen. Es sind weder neurologische oder internistische Auffälligkeiten feststellbar; die klassischen Laborparameter sind ebenfalls normal. Ebenso wenig gibt es Anhaltspunkte dafür, dass allergische Reaktionen eine Rolle spielen. Immer wieder diskutiert wurde u. a. eine Hyperreaktivität des Immunsystems als Ursache dieses Krankheitsbildes, wobei bisher keine experimentellen oder klinischen Anhaltspunkte für diese Hypothese aufgezeigt werden konnten (Ashford, N.A.: Toxicology and Industrial Health, 1999, Nr. 3 S. 1–7 und dort zitierte Dokumente).
  • Das Chronic Fatigue Syndrome (CFS) ist ein klinisch definiertes Krankheitsbild, das durch schwere, lähmende Erschöpfung mit mehr als 50% Einschränkung der normalen Leistungsfähigkeit und eine Kombination von Symptomen charakterisiert wird, bei denen Konzentrationsschwäche und Merkfähigkeitsstörung, Schlafstörungen, Muskel- und Gliederschmerzen im Vordergrund stehen (Holmes GP, Kaplan JE, Gantz NM, Komaroff AL, Schonberger LB, Straus SE et al., Chronic fatigue syndrome: a working case definition, Ann Intern Med. 1988; 108: 387–9; Prins JB, van der Meer JWM, Bleijenberg G, Chronic Fatigue Syndrome, Lancet 2006; 367: 346–355).
  • In der Patentliteratur ist die Diagnose von Krankheiten wie CFS mehrfach beschrieben worden. So wird gemäß der Offenlegungsschrift WO 93/13419 die Anwesenheit des Zytokins Interleukin-1 als Diagnosemarker für CFS verwendet. Auch der lösliche Interleukin-2-Rezeptor, ein Indikator für die Aktivierung von Interleukin-2, wird als Diagnosemarker eingesetzt ( WO 93/14226 ). In der Schrift WO 97/14963 wird ein Testkit zur Erkennung von CFS bzw. Fibromyalgie auf der Basis eines antipolymeren Antikörpers beschrieben. Eine Diagnose von CFS durch Analyse der peripheren Blutzellen ist Gegenstand des US-Patents 5,538,856 . Eine positive Diagnose von CFS liege demnach dann vor, wenn in CD8+-Zellen die Zell-Marker CD38 oder HLA-DR zunehmen oder die CD11b-Marken abnehmen. Das Dokument WO 96/30759 berichtet über eine Methode zur Diagnose von CFS mittels statistischer Untersuchungen an roten Blutzellen.
  • Weiterhin wird in der Patentliteratur über die Bestimmung eines etwa 30 kDa großen Rnase-L-Moleküls berichtet ( US 5,985,565 ), das aus peripheren Blutzellen extrahiert wird. Im US-Patent 5,853,996 wird beschrieben, dass in peripheren Blut-Monozyten zur Diagnose von CFS die p68-Kinase-Aktivität, mRNA-Levels, Apoptose und Zell-Zyklus-Analysen bestimmt werden und mit den Werten von gesunden Individuen verglichen werden. Die Diagnose von CFS mittels des 2'-5'A/RNase P-pathway, einschließlich der Messung des 2'-5'A Oligonucleotid-Levels in peripheren Leukozyten, ist Gegenstand der Schrift WO 91/00097 (des Proteins RNAse L der WO 98/015646 – DE 69729204 T2 : Bestimmung der RNAse L in PBMC-Extrakten).
  • Auch die Bestimmung eines (seinerzeit neuen) CFIDS(Chronic Fatigue Immunodysfunction Syndrome)-Virus wurde zur Diagnose von CFIDS vorgeschlagen ( WO 92/05760 ). Andere Dokumente berichten über die Bestimmung der spezifischen Dopamin-beta-Hydroxylase-Aktivität ( WO 98/58076 ) oder über Zusammenhänge zwischen Variationen im Arginin-Vasopressin-Receptor-Gen-2 (AVPR2; WO 98/37239 ).
  • Zu den wichtigsten Mediatoren der pathologischen Stress-Antwort wird das inflammatorische Zytokin IL1 gerechnet (Konsman et al, Trends Neurosci 25: 154–159, 2002; Koo JW, Duman RS. IL-1β is an essential mediator of the antineurogenic and anhedonic effects of stress. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 751–56). Es besteht demnach ein neuroendokrin-immunologischer Regelkreis: Nervenzellen weisen Rezeptoren für Zytokin wie IL-1 oder TNF-alpha auf, und umgekehrt verfügen Immunzellen über Rezeptoren für biogene Amine wie Adrenalin, Noradrenalin, Dopamin oder Serotonin (Haas, Schauenstein, Allergy 56: 470–477, 2001). So stimuliert IL1 die Freisetzung von Cortisol, IFN-gamma hemmt die Serotoninsynthese über die Aktivierung des Enzyms IDO (Indolamin-2,3-Dioxygenase) mit verstärktem Abbau von Tryptophan zu Kynurenin (Munn et al, J Exp Med, 189: 1363–1372, 1999). Unter chronischem Stress nimmt die Ausschüttung von biogenen Aminen ab, auch durch die eingeschränkte Verfügbarkeit von Vorläufermolekülen wie Tyrosin (4-Hydroxy-phenyl-alanin) oder Tryptophan (Indolyl-(3)-alanin). Erkrankungen mit pathologischer Stress-Response – wie das Bum-Out-Syndrom oder die sog. Sickness-Behaviour – gehen deshalb mit einer inflammatorischen Dysregulation der Immunabwehr einher (Larson et al. 2001, Brain Behaviour Immunity, 15: 371–387; Dowlati Y, Herrmann N, et al. A meta-analysis of cytokines in major depression. Biol Psychiatry 2010; 67: 446–57).
  • In zahlreichen Publikationen sind wiederholt Zusammenhänge zwischen Fatigue, CFS, FMS, MCS (Abkürzungsverzeichnis hinter den Beispielen) und anderen umweltassoziierten Gesundheitsstörungen sowie pathologischen Veränderungen der Neurostresshormone CRH (Corticotropin-Relasing Hormon), Cortisol, DHEAS, Prolactin, Wachstumshormon, Melatonin und der Neurotransmitter Katecholamine, Serotonin, PEA beschrieben worden (Friedman EM, Lawrence DA, Environmental stress mediates changes in neuroimmunological interactions; Toxicol Sci 2002; 67: 4–10).
  • Der Zusammenhang zwischen Stress, Depression, Motivation, Kognition, Aufmerksamkeit, Schlaf, Ängsten, Appetitverhalten, Energiestoffwechsel, Schmerzempfindungen einerseits und neuroendokrinen Regelmechanismen andererseits ist Gegenstand intensiver Forschung. Hypercortisolismus gilt als das zentrale biochemische Kriterium der primären Depression (Majordepression), Burn-Out als pathologische Spätmanifestation des chronischen Stress (Gold PW, Chrousos GP; Organization of the stress system and its dysregulation in melancholic and atypical depression: high versus low CRH/NE states, Mol Psychiatry 2002; 7: 254–75; de Kloet ER, Joels M, Holsboer F; Stress and the brain: from adaptation to disease. Nat Rev 2005; 6: 463–75; Charmandari E, Tsigos C, Chrousos G: Endocrinology of the stress response, Annu Rev Physiol 2005; 67: 259–84; Chrousos GP. Stress and disorders of the stress system. Nat Rev Endocrinol. 2009 Jul; 5(7): 374–81).
  • Zentrale Fatigue gilt als Hauptkriterium des CFS und zahlreicher durch Aktivierung proinflammatorischer Mechanismen geprägter Erkrankungen wie chronische Infektionen, Autoimmunerkrankungen, Tumoren, umwelttoxische Syndrome oder Folge von Therapie mit proinflammatorischen Zytokinen und Mediatoren (Chaudhuri A, Behan PO, Fatigue in neurological disorders, Lancet 2004; 363: 978–88; Patarca R, Cytokines and chronic fatigue syndrome Ann NY Acad Sci 2002: 185–202).
  • Der Zusammenhang zwischen Stress, neuroendokrinen Reaktionen und Inflammation wird als zentrales Element der genannten Krankheitsprozesse gesehen (Turnbull AT, Rivier CL, Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis by cytokines: actions and mechanisms of action. Physiol Rev 1999; 79: 1–83).
  • Eine Aktivierung der neuroendokrinen Achse führt zur Aktivierung der Neurotransmitter, insbesondere der biogenen Amine – und umgekehrt. Synthese, Abbau und Aktion auf Rezeptorebene sind bei den Neurotransmittern eng miteinander vernetzt (O'Connor TM, O'Halloran DJ, Shanahan F, The stress response and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis: from molecule to melancholic, QJ Med 2000, 93: 323–33; van Praag HM, Crossroads of corticotropin releasing hormone, corticosteroids and monoamines, Neurotox Res 2002; 4: 531–55). CRH (Corticotropin-Relasing Hormon) aktiviert Noradrenalin im Locus coeruleus und Serotonin, Dopamin sowie Glutamat. Umgekehrt aktiviert Noradrenalin das hypothalamische CRH und die Stresshormonachse. Außerdem wird über Noradrenalin das Sympathikussystem und Adrenalin aus dem Nebennierenmark aktiviert. GABA hemmt die Aktivierung. Bei chronischem Stress ändert sich das Aktivitätsmuster. Die Stresshormonachse mit CRH-ACTH-Cortisol und Noradrenalin sind daueraktiviert, Serotonin wird gehemmt, GABA und Glutamat sind in erhöhtem Aktivitätsgrad. Bei lang anhaltendem Stresszustand und entsprechender individueller Disposition kann schließlich die Aktivität aller Systeme des Neuroendokriniums abgesenkt sein (Burnout).
  • Unter ”psychischen Störungen” werden im Rahmen dieser Erfindung verstanden: Verwirrungszustände, Depressionen, bipolare Depressionen, Schizophrenie; Alkohol-, Nikotin- oder Drogenabhängigkeit; Sozialphobie, Panikstörungen, Angststörungen oder Zwangsstörungen (s. a. Internationale Klassifikation psychischer Störungen – International Classification of Diseases ICD 10), Appetitstörungen, Aufmerksamkeitsstörungen.
  • ”NeuroStress” ist ein zunehmend gebräuchlicher Sammelbegriff für psychische und psychovegetative Gesundheitsstörungen, die sich bei übermäßiger Stressbelastung (Intensität bzw. Dauer) entwickeln, wobei die individuelle Disposition (Belastbarkeit) mit entscheidend für das Ausmaß der Störungen ist. Individuell disponierende Faktoren sind genetische Varianten von Enzymen, Rezeptoren, Transportern, Umweltfaktoren, Ernährung, etc. und einschneidende traumatische Erfahrungen.
  • Zu den psychischen Störungen, die weniger durch Dauerbelastung als durch akute traumatische Belastungen ausgelöst werden, zählt das PTSD (Post-Traumatic Stress Disorder), das z. B. nach Unfällen, schweren Verletzungen, Verlust von Angehörigen oder nach Kriegserlebnissen (”Golfkriegs-Syndrom”) auftreten kann und durch eine Insuffizienz der neuroregulatorischen Hormon- und Nervensysteme gekennzeichnet ist (Reul JMHM, Nutt DS. Glutamate and cortisol – a critical confluence in PTSD? J Psychopharmacol 2008; 22: 469–72).
  • ”Migräne” ist eine Erkrankung mit familiärer Häufung, die bis zu 18% der Frauen und 6% der Männer, vorwiegend im Alter zwischen 30 und 50 Jahren, trifft. Störungen des serotoninergen Systems sind ursächlich (Goadsby PJ, Lipton RB, Ferrari MD. Migraine – current understanding and treatment.. Ne Engl J Med 2002; 346: 257–70). Kopfschmerz kommt durch Aktivierung des Trigeminussystems zustande, wobei neuroinflammatorische Peptide wie Substanz P (ein Neuropeptid), CGRP (Calcitonin-Gene-Related Peptide) oder Neurokinine freigesetzt werden. Repetitive neurogene Inflammation steigert die Erregbarkeit sensorischer Neurone und die Kopfschmerzbereitschaft. Serotonin hemmt die Schmerzentwicklung über spezifische 5-HT-Rezeptoren (5-HT: 5-Hydroxytryptamin, Serotonin) auf den Trigeminusfasern. Bei Migräne liegen genetische Veränderungen der 5HT-Rezptoren vor. Neue Ergebnisse weisen auch auf eine Beteiigung anderer Neurotransmitter bei der Migraine hin. (Nagata E, Shibata M, et al. Plasma 5-hydroxytryptamine (5-HT) in migraine during an attack-free period. Headache 2006; 46: 592–96; Charbit AR, Akerman S. Goadsby PJ. Dopamine: what's new in migraine? Curr Opin Neurol 2010: epub ahead of print) Außerdem finden sich Hinweise für eine immunallergische Komponente. Inflammatorische Mediatoren sind nicht beteiligt, sodass immunologisch ein klares TH2-Aktivitätsmuster (TH2 – TH2-T-Zellen im Th2-Funktionsstatus) dominiert
  • Das ”posttraumatische Stresssyndrom” (PTSD: ”Post traumatic Stress Disorder”) ist durch gravierende Störungen der HPT-HVL-NNR-Achse (HPT-HVL-NNR: Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse) gekennzeichnet, die sich als Hypoaktivität von CRH-ACTH-Cortisol (ACTH: adrenocorticotropes Hormon) und Einschränkung der exzitatorischen Neurotransmission mit verminderten Katecholaminen und Serotoninmangel manifestiert. Die inflammatorische Aktivität ist erhöht.
  • Der Nachteil bisheriger Lösungen liegt darin, dass es sich um vorwiegend deskriptive Diagnoseverfahren handelt, die keine charakteristischen neurophysiologischen Kriterien liefern.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Lösungen zu beseitigen und neue Möglichkeiten zur Diagnose von neuroregulatorischen gesundheitlichen Störungen, insbesondere von Neurotransmitter-Ungleichgewichten des neuroregulatorischen Regelkreises, bereitzustellen.
  • Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass Testbestecks entwickelt wurden, denen der Nachweis von Neurotransmitter und insbesondere von biogenen Aminen in Blutzellen zugrunde liegt. Die erfindungsgemäßen Bestimmungen von neuroregulatorischen gesundheitlichen Störungen bestehen darin, dass Neurotransmitter – wie Katecholamine (Adrenalin, Noradrenalin, Dopamin) oder Serotonin – in Thrombozyten oder in PBMC aus Patientenblut mit Hilfe von Immunoassays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie gemessen werden.
  • Als PBMC (Peripheral Blond Mononuclear Cells – mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) werden einkernige Blutzellen mit einem runden Zellkern bezeichnet, zum Beispiel Lymphozyten und Monozyten (Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Bøyum, A. Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl, 97, 77–89, 1968).
  • Die erfindungsgemäßen Testbestecks dienen der Analyse und Erforschung von Neurostresszuständen durch Bestimmung von Neurotransmittern und insbesondere von biogenen Aminen in Thrombozyten oder PBMC. Sie bestehen aus Immunoassays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie/HPLC. Diese Testkits stellen Analysekits für medizinische und veterinärmedizinische Zwecke dar. Sie bestehen aus biochemischen Reagenzien für die Analyse von Neurostresszuständen aufgrund von Neuroregulationsstörungen mit Stresshormon- und/oder Neurotransmitter-Defiziten, -Überschüssen bzw. -Störungen des neuroregulatorischen Gleichgewichts. Sie bestehen in ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assays)-Tests, Chemolumineszenztests, Durchflusszytometrieassays oder in chromatographischen Nachweisverfahren (HPLC – High Pressure Liquid Chromatographie, LC-MSMS – Liquid Chromatographie mit Massenspektrometerdetektion in zwei Schritten) zum Nachweis von Neurotransmittern in Thrombozyten oder PBMC, bedarfsweise zusammen mit der Bestimmung von Stresshormonen oder proentzündlichen Zytokinen (Interleukin-1, Interleukin-6 oder Tumor-Nekrosefaktor-alpha) im Speichel.
  • Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass durch den Nachweis von biogenen Aminen und anderen Neurotransmittern in Blutzellen Rückschlüsse auf Art und Ausmaß neuroregulatorischer Störungen des neurovegetativen Regulationsgleichgewichts und die damit verbundenen Erkrankungen möglich sind. Es überrascht ferner, dass die Messung der Konzentrationen biogener Amine sowie anderer Neurotransmitter in Blutzellen zur Feststellung von Neuroregulationsstörungen und psychischen Erkrankungen zu verwenden sind, wobei Thrombozyten oder PBMC als Surrogat für die synaptischen Neurotransmitter-Funktionseinheiten im Nervensystem dienen.
  • Neurone (serotoninerge, katecholaminerge Neurone) bilden intraneuronal Neurotransmitter (Katecholamine, Serotonin, etc), speichern diese in Vesikeln und schütten sie bei Bedarf als Signalstoff an der Synapse aus. Überschüssige NT (Neurotransmitter) werden durch einen spezifischen Transporter in der synaptischen Membran wieder in das Neuron rückresorbiert, wo sie entweder abgebaut oder erneut in Vesikeln gespeichert und wiederverwendet werden. Dieser Reuptake-Transporter von Thrombozyten, Lymphozyten und Synapse ist identisch, was u. a. für Serotonin und die Katecholamine (Dopamin, Noradrenalin, Adreanlin) gezeigt wurde (Lesch KP, Wolozin BL, Murphy DL, Reiderer P: Primary structure of the human platelet serotonin uptake site: identity with the brain serotonin transporter. J Neurochem 1993; 60: 2319–2322; Marazziti D, Dell-Osso MC, et al. Alterations of the dopamine transporter in resting lymphocytes of patients with different psychotic idsorders. Psychiatry Res 2010; 175: 54–57; Franco R, Pacheco R, et al. The emergence of neurotransmitters as immune modulators. Trends Immunol 20007; 28: 400–407; Eskandari F, Sternberg EM. Neural-immune interactions in health and disease. Ann N Y Acad Sci 2002; 966: 20–27; Ottaviani E, Malagoli D, Franceschi C. Common evolutionary origin of the immune and neuroendocrine systems: from morphological to in silico approaches. Trends Immunol 2007; 28: 497–502). Auch aus anderen Gründen (NT-Synthese, -speicherung, -metabolismus) ähnelt der Thrombozyt und Lymphozyt der Synapse, sodass Thrombozyten und seit kurzem auch Lymphozyten immer wieder als Analogmodell der neuronalen Synapsen herangezogen wurden, z. B. in Untersuchungen des Serotoninsystems bei Autismus, Depressionen, Schizophrenie und auch bei Studien zur Wirksamkeit von Antidepressiva (Cook, E., Arora, R., Anderson, G., Berry-Kravis, E., Yan, S.-Y., Yeoh, H., Sklena, P., Charak, D., and Leventhal, B. Platelet serotonin studies in hyperserotonemic relatives of children with autistic disorder; Life Sci. 52, 2005–2015 (1993); Axelson DA et al. Platelet serotonin reuptake inhibition and response to SSRIs in depressed adolescents; Am J Psychiatry 2005; 162: 802–14; Maurer-Spurej E, Dyker K, Gahl WA, Devine DV. A novel immunocytochemical assay for the detection of serotonin in platelets. Br J Haematol 2002; 116, 604–611).
  • In Lymphozyten wurde bisher vorwiegend die Funktion der Neurotransmitter-Transporter bei verschiedenen neuropsychiatrischen Störungen untersucht (Caronti B, Antonini G, et al. Dopamine transporter immunoreactivity in peripheral blood lymphocytes in Parkinson's disease. J Neural Transm 2001; 108: 803–807; Barkan T, Peled A, et al. Serotonin transporter characteristics in lymphocytes and platelets of male aggressive schizophrenia patients compared to non-aggressive schizophrenia patients. Eur Neuropsychopharmacol 2006; 16: 572–79; Gonzales A, Fazzino F, et al. Serotonin, 5-HT1A serotonin receptors and proliferation of lymphocytes in major depression patients. Neuroimmunomodulation 2007: 14: 8–15).
  • Erfindungsgemäß werden Messungen von Konzentrationen biogener Amine (Serotonin, Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin) in Thrombozyten oder PBMC aus Patientenblut vorgenommen.
  • Die erfindungsgemäßen Testbestecks eignen sich zur Bestimmung von neuroregulatorischen und psychischen Störungen und damit von Neurostresszuständen und allen anderen Störungen der neuroendokrinen Stressachse.
  • Diese Testbestecks bestehen aus mindestens einem antikoagulierten Blutröhrchen, vorzugsweise mit Citrat oder EDTA bzw. Heparinat (Na-, Li- oder NH4-Heparinat) als Antikoagulans, Probennahme-Anleitung, Etiketten, Versandbesteck, standardisiertem Anamnese- und Untersuchungsbogen sowie den für die Immunoassay-Verfahren (ELISA-, FIA- oder CLIA; FIA – Fluorenszenzimmunoassay, CLIA – Chemolumineszenz-Immunoassay), Durchflusszytometrie oder chromatographischen Verfahren (HPLC- bzw. LC-MSMS oder LCMS – Liquid Chromatography mit Doppel- oder Einfach-Massenspektrometer-Detektion) benötigten spezifischen Kontrollen.
  • Die Patienten-Thrombozyten werden aus dem antikoagulierten Blut durch low-speed Zentrifugation angereichert (s. Beispiel 1), das so gewonnene Plättchen-reiche Plasma (PRP: Platelet-rich Plasma) anschließend bei höherer Geschwindigkeit zentrifugiert, mit Detergens- und EGTA-haltigem (EGTA – ethylene glycol tetraacetic acid) Puffer gewaschen, erneut zentrifugiert und im Counter die Plättchenzahl gemessen. Nach Einstellung auf 2–5 × 108 Zellen/ml wird die Suspension fraktioniert bis zur Messung eingefroren. Alternativ wird das PRP nach Zugabe monoklonaler Antikörper (mAb) gegen die einzelnen biogenen Amine im Durchflusszytometer gemessen.
  • Die Patienten-PBMC werden aus antikoaguliertem Blut mittels Zentrifugation im Ficoll-Hypaque Gradienten isoliert, in isotonischem BSA/HEPES-Puffer (BSA – Rinder-Serum-Albumin, Bovine serum abumin; HEPES – N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) gewaschen und im Counter gezählt (s. Beispiel 2). Nach Einstellung auf 0,5–1,0 × 107 Zellen/ml wird die Zellsuspension fraktioniert bis zur Messung eingeforen. Alternativ werden die intrazellulären biogenen Amine mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
  • Die Messung der Neurotransmitter erfolgt mittels Enzymimmunoassay, alternativ mittels HPLC nach Proteinfällung und Derivatisierung oder nach Addition von monoklonalem Antikörper und sekundärem Fluoreszenz-markierten mAb mittels Durchflusszytometer.
  • Mit den erfindungsgemäßen Testbestecks können neuroregulatorische und psychische Störungen, Neurostresszustände bzw. Störungen der neuroregulatorischen Stressachse wie
    • a) Chronisches Müdigkeitssyndrom (Chronic Fatigue Syndrom, CFS bzw. CFIDS)
    • b) Multiple Chemikalienüberempfindlichkeit (multiple chemical sensitivity MCS)
    • c) Neurostress
    • d) Depressionen
    • e) Burn-Out-Syndrom
    • f) Fibromyalgie
    • g) die zentrale Fatigue (Erschöpfung)
    • h) Schlafstörungen/Insomnie
    • i) Migräne
    • j) Post-traumatische Stresserkrankung (PTSD)
    • k) Winter-/Frühjahrsdepresssion
    • l) PMS/Prämenstruelles Syndrom
    • m) Menopausebeschwerden
    • n) AD(H)S
    • o) Autismus
    • p) Schizophrenie
    • q) Parkinson Syndrom/Krankheit
    • r) RLS/Restless Leg-Syndrom
    • s) Reizdarmsyndrom
    • t) Essstörungen (Bulimie, Anorexie, Craving, Adipositas)
    erstmals neurochemisch charakterisiert werden.
  • Die erfindungsgemäße Bestimmung von neuroregulatorischen und psychischen Störungen sowie die erfindungsgemäße Diagnostik bestehen darin, dass biogene Amine (Serotonin, Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin) in Thrombozyten oder PBMC aus Patientenblut gemessen werden.
  • Die erfindungsgemäßen Testbestecks bestehen aus Immunoassays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie/HPLC zur Messung von biogenen Aminen (Serotonin, Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin) in Thrombozyten oder PBMC aus Patientenblut.
  • Die verwendeten Assays stellen Chemolumineszenz-, Fluoreszenz-, Enzymimmunoassays oder Durchflusszytometriemessungen dar. Sie bestehen aus Immunoassays zur Bestimmung/Messung biogener Amine.
  • Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Das Wesen der Erfindung besteht in einer Kombination aus bekannten (Bestimmung einzelner biogener Amine) und neuen Elementen (ihre kombinierte Messung in Zellen), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass erstmals eine neurochemische Diagnose von neuroregulatorischen und psychische Störungen – im Unterschied zur Ausschlussdiagnostik – bereitgestellt wird. Damit ist eine Nachweismöglichkeit gefunden worden, mit der Neurotransmitter-Störungen und damit verbundene Neuroregulations-Störungen biochemisch verifiziert und dann spezifisch behandelt werden können.
  • Das Wesen der Erfindung besteht darin, die Messung der Konzentrationen biogener Amine (Serotonin, Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin) sowie ggf. Melatonin (Serotoninmetabolit) in Zellen aus Patientenblut für die Feststellung von Neuroregulationsstörungen und psychischen Erkrankungen zu verwenden, wobei Thrombozyten als Surrogat für die synaptische Neurotransmitteraktivität im zentralen Nervensystem dienen.
  • Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
  • Ausführungsbeispiele
  • Beispiel 1: Anreicherung der Patienten-Thrombozyten
  • Die Patienten-Thrombozyten werden aus dem antikoagulierten Blut durch low-speed Zentrifugation angereichert (1000 rpm, 15 min), das so gewonnene Plättchen-reiche Plasma (PRP: Platelet-rich Plasma) anschließend bei höherer Geschwindigkeit zentrifugiert (3600 rpm, 15 min), mit low-dose Detergens- (Triton X-100), L-Cystein- und EGTA-haltigem Puffer (EGTA = ethylene glycol tetraacetic acid) gewaschen, erneut zentrifugiert, in Cystein-HEPES-Puffer aufgenommen und im Counter (Zellzählautomat, Coulter Counter) die Plättchenzahl gemessen. Nach Einstellung auf 2–5 × 108 Zellen/ml wird die Plättchen-Suspension in Cysteinpuffer mit TCA (Trichloressigsäure) präzipitiert, zentrifugiert und fraktioniert bis zur Messung eingefroren. Alternativ wird das PRP mit Paraformaldehyd in PBS (Phosphate-buffered Saline) 30 min fixiert, mit Detergens (Triton X-100) permeabilisiert, in HEPES-Puffer gewaschen, zentrifugiert (500 g, 5 min) und monoklonaler Antikörper (mAb) gegen die einzelnen biogenen Amine zugegeben. Nach erneutem Waschen und Zentrifugieren wird ein zweiter Fluoereszenz-markierter mAb zugegeben und die Messung der Plättchen-gebundenen Fluoreszenz im Durchflusszytometer durchgeführt.
  • Beispiel 2: Isolierung der Patienten-PBMC
  • Die Patienten-PBMC werden aus dem antikoagulierten Blut mittels Zentrifugation im Ficoll-Hypaque Gradienten isoliert, in isotonischem BSA/HEPES-Puffer gewaschen und im Counter gezählt. Nach Einstellung auf 0,5–1,0 × 107 Zellen/ml wird die Zellsuspension im Detergens/Cystein/EGTA-Puffer mit TCA päzipitiert, erneut zentrifugiert und fraktioniert bis zur Messung eingeforen. Alternativ werden die intrazellulären biogenen Amine mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die gewaschenen PBMC werden mit Paraformaldehyd fixiert, mit Detergens permeabilisiert und mit Anti-Neurotransmitter-Antikörper inkubiert. Anschließend werden die markierten PBMC gewaschen, mit sekundärem fluoreszierendem mAb markiert und im Durchflusszytometer gemessen.
  • Beispiele 3: Bestimmung von neuroregulatorischen und psychischen Störungen
  • Bei Patienten mit derartigen Störungen werden biogene Amine sowie andere Neurotransmitter in Thrombozyten oder PBMC gemessen.
  • Als biogene Amine werden Serotonin, Noradrenalin, Adrenalin und Dopamin in Thrombozyten oder PBMC aus Patientenblut gemessen.
  • Die Messung der Neurotransmitter erfogt mittels Enzymimmunoassays (Fa. LDN, Nordhorn) oder mittels HPLC und elektrochemischer Detektion nach Derivatisierung.
  • Die ermittelten Werte an biogenen Aminen und/oder Neurotransmittern ermöglichen Rückschlüsse auf das Vorliegen oder auf ein Nichtvorliegen von neuroregulatorischen und psychischen Störungen.
  • Dabei wird von folgenden Werten ausgegangen:
    NORMWERTE: Die ermittelten Werte werden mit denen im Urin verglichen
    Urin Thrombozyten Lymphozyten
    Dopamin 150–280 μg/g Krea 8–12 pg/109 plt 74–137 pg/107 Ly
    Adrenalin 4–10 μg/g Krea 167–28 pg/109 plt 12–38 pg/107 Ly
    Noradrenalin 32–58 μg/g Krea 132–195 pg/109 plt 29–93 pg/107 Ly
    Serotonin 148–230 μg/g Krea 176–350 ng/109 plt 0,6–2,3 μg/107 Ly
  • Testbestecks:
  • Sie bestehen aus Immunoassays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie/HPLC zur Messung von biogenen Aminen sowie Neurotransmittern in Thrombozyten bzw. Lymphozyten.
  • Die Testbestecks bestehen aus Röhrchen, die Stabilisatoren – EDTA, Citrat oder Heparinat – enthalten, ferner aus Probennahme-Anleitungen, Etiketten, standardisiertem Anamnese- und Untersuchungsbogen und aus den in den ELISA- oder RIA-Verfahren, der Chemolumineszenz oder der HPLC benötigten spezifischen Kontrollen.
  • Beispiel 3.1: MCS (multiple chemical sensitivity)
  • Die Diagnostik der multiplen Chemikalienüberempfindlichkeit (multiple chemical sensitivity, MCS), besteht darin, dass biogene Amine sowie andere Neurotransmitter in Thrombozyten gemessen werden.
  • Bei Patienten mit MCS zeigte sich ein Abfall von Serotonin in Thrombozyten (14–42%) und Lymphozyten (8–26%). Auch Noradrenalin (–25%) und Adrenalin (–10% im Mittel) waren vermindert. Dopamin war nicht signifikant verändert. In Lymphozyten war der Effekt ähnlich, Serotonin war signifikant um 33,5–72% reduziert, die Katecholamine Noradrenalin um 7–31%, Adrenalin um 11–42%, Dopamin war nicht signifikant verändert (–13% im Mittel).
  • Beispiel 3.2: CFS (Chronic Fatigue Syndrom)
  • Bei Patienten mit CFS zeigte sich ein Abfall von Serotonin in Thrombozyten und Lymphozyten bis zu 66% des Normalgehaltes. Auch Dopamin (–22%), Noradrenalin (–35%) und Adrenalin (–18% im Mittel) waren vermindert.
  • In Lymphozyten war der Effekt ebenso deutlich, Serotonin war signifikant um 22,5–64% reduziert, die Katecholamine Noradrenalin um 0–39%, Adreanlin um 14–52%, Dopamin war nicht signifikant verändert (–13% im Mittel).
  • Beispiel 3.3: Depressionen
  • Bei Patienten mit Depressionen zeigte sich ein Abfall von Serotonin in Thrombozyten von 44–85% und in Lymphozyten von 36–59% des Normalgehaltes. Noradrenalin (5–37%) Dopamin (11–28%) und Adrenalin (21–39%) waren ebenfalls vermindert.
  • In Lymphozyten war der Effekt weniger deutlich, Serotonin war signifikant um 22,5% reduziert.
  • Abkürzungsverzeichnis
    • ACTH
      adrenocorticotropes Hormon
      ADS/ADHS
      Aufmerksamkeits-Defizit/Hyperaktivitäts-Syndrom
      BSA
      Rinder-Serum-Albumin (Bovine serum abumin)
      CA
      Kanadische Patentschrift
      CFIDS
      Chronisches Müdigkeitssyndrom (CFS bzw. CFIDS) Chronic Fatigue Immunodysfunction Syndrome
      CFS
      Chronisches Müdigkeitssyndrom (Chronic Fatigue Syndrom)
      CGRP
      Calcitonin-Gene-Related Peptide
      CLIA
      Chemoluminesnzenz-Immunoassay
      CRH
      Corticotropin-Relasing Hormon
      CSF
      Liquor (CSF: Cerebro Spinal Fluid)
      DE-OS
      Deutsche Offenlegungsschrift
      DHEA
      Dehydroepiandrosteron
      DHEAS
      DHEA(S) Dehydroepiandrosteron(sulfat)
      EDTA
      Ethylendiamintetraessigsäure
      EGTA
      ethylene glycol tetraacetic acid
      ELISA
      Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Enzym-Immunoassay
      EP
      Europäische Patentschrift
      FIA
      Fluoreszenz-Immunoassay
      FMS
      Fibromyalgie Syndrom
      GABA
      Gamma-Aminobuttersäure
      HCl
      Salzsäure
      HEPES
      N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]
      ICD 10
      International Classification of Diseases (Int. Klassifik. psych. Störungen)
      HPLC
      Hochdruckflüssigkeitschromatographie High Performance/High Pressure Liquid Chromatography
      HPT
      Hypothalamus
      HPT-HVL-NNR-Achse
      Hypothalamus-Hypophyse-Nebennierenrinden-Achse
      5-HT
      5-Hydroxytryptamin, Serotonin
      HVL
      Hypophyse
      LC-MSMS
      Liquid Chromatographie mit Massenspektrometerdetektion in zwei Schritten
      mAb
      monoklonale(r) Antikörper (mAk)
      MCS
      multiple Chemikalienüberempfindlichkeit (multiple chemical sensitivity)
      μmol/g
      Mikromol pro Gramm
      NE
      Norepinephrin
      ng/ml
      Nanogramm pro Milliliter
      NNR
      Nebennierenrinde
      NT
      Neurotransmitter
      OS
      Offenlegungsschrift
      PBMC
      Peripheral Blood Mononuclear Cells – mononukleare Zellen des peripheren Blutes
      PEA
      Phenylethylamin
      pg/ml
      Pikogramm pro Milliliter
      plt
      platelets – Blutplättchen
      PMS
      Prämestruelle Syndrom
      PRP
      platelet rich plasma – Plättchenreiches Plasma
      PTSD
      Post-Traumatische Stresserkrankung
      RIA
      Radioimmunoassay
      RLS
      Restless Legs Syndrom
      SBS
      Sick Building Syndrom
      SSRI
      Selective Serotonin Reuptake Inhibitor – Selekt. Serotonin-Wiederaufnahmehemmer
      TCA
      Trichloressigsäure
      TH2
      TH2-T-Zellen im Th2-Funktionsstatus
      WIPO
      Weltorganisation für Geistiges Eigentum/World Intellectual Property Organization
      WO
      Internationale Patentschrift (der WIPO)
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Claims (7)

  1. Testbestecks zur Bestimmung von neuroregulatorischen und psychischen Störungen, bestehend aus Assays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie zur Messung der Konzentrationen von Neurotransmittern in Blutzellen.
  2. Testbestecks nach Anspruch 1, bestehend aus Chemolumineszenz-, Fluoreszenz-, Enzymimmuno- oder Durchflusszytometrieassays, aus Immunoassays und/oder Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie/HPLC zur Messung von biogenen Aminen und/oder Serotonin und/oder Katecholaminen in Thrombozyten und/oder PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells – mononukleare Zellen des peripheren Blutes).
  3. Testbestecks nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunoassays ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assays)-Tests, Chemolumineszenztests, Durchflusszytometrieassays und die chromatographischen Nachweisverfahren HPLC (High Pressure Liquid Chromatographie) oder LC-MSMS (Liquid Chromatographie mit Massenspektrometerdetektion in zwei Schritten) Anordnungen zur Messung der Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und/oder Dopamin darstellen.
  4. Testbestecks nach Anspruch 1 und 2 zur Messung/Bestimmung der Neurotransmitter und zusätzlich von Stresshormonen oder proentzündlichen Zytokinen – Interleukin-1, Interleukin-6 oder Tumor-Nekrosefaktor-alpha – im Speichel, bestehend aus mindestens einem antikoagulierten Blutröhrchen, vorzugsweise mit Citrat oder EDTA oder Heparinat (Na-, Li- oder NH4-Heparinat) als Antikoagulans, aus Sammelanleitung, Etiketten, Versandbesteck, standardisiertem Anamnese- und Untersuchungsbogen sowie aus den für die Immunoassays (ELISA-, FIA- oder CLIA-) oder chromatographischen Verfahren (HPLC oder LC-MSMS) spezifischen Kontrollen.
  5. Testbestecks nach Anspruch 1 und 2 zur Bestimmung von Neurotransmittern in Patienten-Thrombozyten, die 5.1. aus antikoaguliertem Blut durch low-speed Zentrifugation angereichert wurden, das daraus gewonnene Plättchen-reiche Plasma (PRP) bei höherer Geschwindigkeit zentrifugiert, mit lowdose Detergens-, L-Cystein- und EGTA-haltigem Puffer gewaschen, erneut zentrifugiert, in Cystein-HEPES-Puffer aufgenommen und im Counter (Zellzählautomat) die Plättchenzahl gemessen und nach Einstellung auf 2–5 × 108 Zellen/ml die Plättchen-Suspensionen in Cysteinpuffer mit TCA präzipitiert, zentrifugiert und fraktioniert bis zur Messung eingefroren worden sind 5.2. zu PRP aufbereitet wurden, das PRP mit Paraformaldehyd in PBS fixiert, mit Detergens permeabilisiert, in HEPES-Puffer gewaschen, zentrifugiert und monoklonale Antikörper (mAb) gegen die einzelnen biogenen Amine zugegeben und die Messungen der Plättchen-gebundenen Fluoreszenz im Durchflusszytometer erfolgen.
  6. Testbestecks nach Anspruch 1 und 2 zur Bestimmung von Neurotransmittern in Patienten-PBMC, die 6.1. aus antikoaguliertem Blut mittels Zentrifugation im Ficoll-Hypaque Gradienten isoliert, in isotonischem BSA/HEPES-Puffer gewaschen und im Counter gezählt, nach Einstellung auf 0,5–1,0 × 10 Zellen/ml die Zellsuspension im Detergens/Cystein/EGTA-Puffer mit TCA präzipitiert, erneut zentrifugiert und fraktioniert bis zur Messung eingeforen 6.2. zu PRP aufbereitet, das PRP mit Paraformaldehyd fixiert, mit Detergens permeabilisiert und mit Anti-Neurotransmitter-Antikörper inkubiert, anschließend die markierten PBMC gewaschen, mit sekundärem fluoreszierenden mAb markiert und im Durchflusszytometer gemessen worden sind.
  7. Testbestecks nach Anspruch 1 und 2, bestehend aus Immunoassays oder aus Anordnungen für die Flüssigkeitschromatographie/HPLC zur Messung von Neurotransmittern, biogenen Aminen und der Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin in Thrombozyten und/oder PBMC zur Erkennung von Krankheiten der Art a) Chronisches Müdigkeitssyndrom (Chronic Fatigue Syndrom, CFS bzw. CFIDS) b) Multiple Chemikalienüberempfindlichkeit (multiple chemical sensitivity MCS) c) Neurostress d) Depressionen e) Burn-Out-Syndrom f) Fibromyalgie g) die zentrale Fatigue (Erschöpfung) h) Schlafstörungen/Insomnie i) Migräne j) Post-traumatische Stresserkrankung (PTSD) k) Winter-/Frühjahrsdepresssion l) PMS/Prämenstruelles Syndrom m) Menopausebeschwerden n) AD(H)S o) Autismus p) Schizophrenie q) Parkinson Syndrom/Krankheit r) RLS/Restless Leg-Syndrom s) Reizdarmsyndrom t) Essstörungen (Bulimie, Anorexie, Craving, Adipositas).
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