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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung bezieht sich im weiten Sinne auf rationelle Verfahren
unter Verwendung von rekombinanten genetischen Techniken und Selektion,
um Gene, die neue Proteasen mit einer gewünschten Wechselwirkung mit
Substraten von Interesse aufweisen, zu isolieren oder zu schaffen
oder ihre Entwicklung zu lenken.
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Genauer
bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Isolierung, Schaffung
oder Entwicklung neuer Proteasen für die Verwendung in industriellen
und therapeutischen Produkten.
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Noch
genauer bezieht sich die Erfindung auf Verfahren, worin Wirtszellen
und/oder Viren, welche einen modulierten Wachstumsfaktor für den Wirt
oder für
das Virus, das funktionell mit einem Substrat von Interesse oder
einem Analogon davon verbunden ist, und vielfache Kopien einer vermeintlich
neuen Protease oder einer Vielzahl vermeintlich neuer Proteasen,
die mit dem Substrat von Interesse oder Analogon in Wechselwirkung
treten können,
um die Aktivität
des Wachstumsfaktors zu ändern,
exprimieren, Selektionsbedingungen oder evolutionären Selektionsbedingungen
ausgesetzt werden, um Wirte oder Viren oder Mutationen davon zu
selektieren, die das Gen tragen, welches die neue Protease von Interesse
exprimiert.
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Die
Verfahren der Erfindung können
verwendet werden, um rationell Proteasen, die einen breiten Bereich
von interessierenden Eigenschaften aufweisen, für eine Reihe von industriellen,
Forschungs- oder therapeutischen Verwendungen zu schaffen.
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In
dieser Anmeldung wird auf zahlreiche Publikationen durch arabische
Ziffern in Klammern Bezug genommen. Die vollständige Zitierung dieser Bezugnahmen
werden an dem Ende der Spezifikation, den Ansprüchen unmittelbar vorausgehend,
gefunden. Die Bezugnahmen beschreiben den Stand der Technik, auf
den sich diese Erfindung bezieht, ebenso wie gewisse Aspekte der
Erfindung selber vollständiger.
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Hintergrund der Erfindung
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Im
Allgemeinen gibt es drei Wege, auf denen ein Molekül mit neuen
Eigenschaften erhalten werden kann. Ein erstes Verfahren, z. B.
Protein Engineering, beruht auf bekannten Eigenschaften eines allgemeinen Molekültyps und
auf theoretischen Modellen, die versuchen, die Konformation von
Molekülen,
die am wahrscheinlichsten die gewünschten Eigenschaften haben,
zu definieren. Es erwiesen sich keine Modelle als allgemein genug
oder genau genug, um geeignete Moleküle reproduzierbar zu gestalten.
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Ein
zweites Verfahren ist Screening. Screening erfordert, dass vielfache
Permutationen von Molekülen hinsichtlich
einer gegebenen Eigenschaft untersucht werden. Der gegenwärtige Stand
der Screening-Technologie und die gewaltige Zahl unterschiedlicher
Permutationen begrenzt die Nützlichkeit
dieser Technik. Zum Beispiel hat eine Peptidsequenz aus 20 Aminosäuren 2020 unterschiedliche Permutationen. Um Bakterien
zu screenen, die unterschiedliche Permutationen an Peptiden signifikanter
Länge erzeugen,
würden
Milliarden um Milliarden Petrischalen, jede in der Größenordnung
von 1000 Kolonien benötigt
werden. Das Screenen solch großer
Populationen, um jene neuen Glieder zu finden, falls irgendwelche
vorhanden sind, welche die gewünschten
Eigenschaften haben, ist äußerst ineffizient.
Screening-Techniken
sind nicht für
die realistische Ausführung
solcher Aufgaben passend.
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Ein
drittes Verfahren verwendet die natürliche Selektion auf spezifischen,
nicht verallgemeinerbaren Wegen. Zum Beispiel kann man, wenn einem
einzelligen Organismus ein Enzym in einem kritischen Stoffwechselweg
fehlt, versuchen, ein Molekül
mit derselben Funktion wie das durch die Mutante verlorene zu selektieren.
Diese Technik ist jedoch begrenzt durch die Reaktionen, die in dem
Genom des Organismus kodiert werden und die innerhalb der Zelle
ergänzt
werden könnten.
Weiterhin würde
für jedes
unterschiedliche Komplementationsexperiment ein neuer mutierter
Stamm benötigt
werden.
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Der Stand
der Technik
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Verfahren
für die
Selektion von Organismen sind im Stand der Technik wohl bekannt.
Diese Verfahren schließen
das Wachsen lassen von Wirtszellen in der Abwesenheit eines essenziellen
Nährstoffes,
einer organischen Verbindung, die nicht durch elterliche Stämme genutzt
werden kann, oder in der Anwesenheit von toxischen Analoga, um auf
Organismen zu selektieren, welche z. B. Moleküle exprimieren, die für das Zellwachstum
essenziell sind. Solche Techniken sind primitiv, da es das Wachstum
in der Abwesenheit eines essenziellen Nährstoffes dem Forscher nicht
erlaubt, Vorgehen für
die Selektion von Molekülen
für irgendeinen spezifischen
Reaktionstyp oder für
irgendeinen bestimmten, zum Ziel genommenen Bereich innerhalb des Substrats
rationell zu gestalten. Der auf dem Wachstum in Abwesenheit eines
essenziellen Nährstoffes
basierende Selektionsdruck ist rau dahingehend, dass kein vernunftsmäßig definierter
Selektionsdruck, durch welchen ein Wachstumsvorteil oder -nachteil
verliehen wird, auferlegt wird, und deswegen könnten Wirte selektiert werden,
welche das Überleben
durch die Expression von Molekülen
mit einem Bereich von Funktionen erreichen. Dies begrenzt die Nützlichkeit
solcher Verfahren, da es die Fähigkeit
der Wirte reduziert, Moleküle
mit spezifischen gewünschten
Fähigkeiten
zu isolieren oder zu schaffen.
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Zum
Beispiel ist das Wachstum auf organischen Verbindungen, die durch
elterliche Stämme
nicht genutzt werden können,
begrenzt, da die Wirte nur auf der Basis ihrer Fähigkeit, die organische Verbindung
zu nutzen, selektiert werden. Die Verwendung der organischen Verbindung
kann durch irgendeine einer Reihe unterschiedlicher Reaktionen bewerkstelligt
werden. Es gibt kein rationelles Verfahren, ein Molekül zu isolieren, zu
schaffen oder seine Entwicklung zu lenken, das zu einer spezifischen
Reaktion mit einem zum Ziel genommen Bereich in einem spezifischen
Substrat in der Lage ist.
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Dube
et al., Biochemistry, Band 28, Nr. 14, 11. Juli 1989, offenbaren
die Umgestaltung von Genen, die für β-Lactamase kodieren, indem DNS
an der aktiven Stelle mit zufälligen
Nucleotidsequenzen ersetzt wird. Die Oligonucleotidersetzung bewahrt
gewisse Codons, die für
die Aktivität
kritisch sind, enthält
jedoch Basenpaare chemisch synthetisierter zufälliger Sequenzen, die für mehr als
eine Million Aminosäuresubstitutionen kodieren.
Eine Population an E. coli wurde mit Plasmiden infiziert, die diese
zufälligen
Inserts enthalten, und die Population wurde in der Anwesenheit von
Carbenicillin und gewissen verwandten Analoga von Carbenicillin
inkubiert. Sieben neue Mutanten des aktiven Zentrums, die den E.-coli-Wirt
resistent gegen Carbenicillin machten, wurden selektiert, wobei
alle Multinucleotidsubstitutionen enthielten, die für unterschiedliche
Aminosäuren
kodieren. Jeder der Mutanten übte
eine temperaturempfindliche β-Lactamase-Aktivität aus. Dube
et al. ist folglich begrenzt auf die Verstärkung der bereits bekannten
Funktion einer Enzymklasse.
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Ein
Prozess für
die Herstellung neuer Moleküle
und DNS- und RNS-Sequenzen durch Rekombinationstechniken und Selektion
ist in Kauffman et al., UK, Patentanmeldung Nr. GB 2183661A, angemeldet
am 17. Juni 1985, offenbart. Mutierte Gene werden in Wirtszellen
eingeführt,
wobei die modifizieren Wirte so wachsen gelassen werden, dass die
mutierten Gene kloniert werden, wodurch die Produktion der Proteine,
die durch diese Gene exprimiert werden, gefördert wird, die modifizierten
Wirtszellen werden gescreent und/oder selektiert, um die Wirtszellstämme zu identifizieren,
die neue Proteine mit einer gewünschte
Eigenschaft produzieren, und die identifizierten Stämme werden
wachsen gelassen, um ein neues Molekül mit der gewünschten
Eigenschaft zu produzieren. Die in Kauffman et al. gelehrten Techniken, ähnlich wie
in jene in Dube et al., sind auf Verfahren für die Modifikation der bekannten
Funktion gewisser Molekülklassen
beschränkt.
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Schatz
et al., Cell, Band 53, S. 107–115
(1988), beschreiben ein Verfahren für die Identifikation einer Fibroblastenzelllinie,
die in der Lage ist, ein Gen zu exprimieren, welches ein Enzym mit
einer bekannten Rekombinaseaktivität kodiert. Das Verfahren basiert
auf einem Prozess der somatischen Rekombination, bei welchem weit
beabstandete Gensegmente miteinander ligiert werden, um eine vollständige variable
Region zu bilden (die variable Region wird zusammengebaut aus V-(variablen),
J-(Verbindungs-) und in einigen Fällen D-(Diversitäts-)Gensegmenten in einer geordneten
und stark regulierten Art). Der Gentransfer wird verwendet, um einer
Fibroblaste stabil die Fähigkeit,
V(D)J-Umordnungen durchzuführen,
zu verleihen.
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Auf
Retroviren basierende DNS-Rekombinationssubstrate, die eine Genbibliothek
umfassen, von denen einige das Rekombinasegen kodieren, das heißt das Gen,
welches das (die) Enzym(e) exprimiert, die eine Rolle bei der V(D)J-Rekombination
spielen, wurden in Wirtszellen transfiziert, welche ein Gen enthalten,
das einen Wachstumsfaktor, der von den Rekombinase-Erkennungssequenzen
flankiert wird, exprimiert. Anfänglich
wurde das Gen, das den Wachstumsfaktor exprimiert, nicht transkribiert
oder translatiert. Die Transkription und Translation des Wachstumsfaktors
wurde jedoch aktiviert, wenn die Rekombinaseaktivität durch
die Wechselwirkung von Rekombinase mit den Rekombinase-Erkennungssequenzen
exprimiert wurde.
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Bock
et al., Nature, Band 355, S. 564–567 (1992), berichten von
Anstrengungen, DNS-Moleküle mit neuen
Funktionen zu selektieren. Aptamere, stochastisch erzeugte Oligonucleotide,
die in der Lage sind, spezifische molekulare Ziele zu binden, wurden
in zellfreien Selektionsvorgängen
selektiert. Einzelsträngige
DNS kann hinsichtlich Aptameren gescreent werden, die menschliches
Thrombin binden, ein Protein mit keiner bekannten Nucleinsäurebindungsfunktion.
Diese Prozesse, die tatsächlich
zellfreie Screeningvorgänge
darstellen, schließen
das Screening und die Amplifikation von gewissen Mitgliedern einer
Subpopulation ein. Die anderen Mitglieder werden verworfen.
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Curtiss,
PCT-Anmeldung Nr. WO89/03427, offenbart Verfahren und Techniken
für die
Expression rekombinanter Gene in Wirtszellen. Curtiss offenbart
gentechnisch veränderte
Wirtszellen, welche gewünschte Genprodukte
exprimieren, da sie in einer genetisch stabilen Population gehalten
werden. Die gentechnisch veränderten
Zellen sind gekennzeichnet durch: (1) das Fehlen eines Gens, das
ein Enzym kodiert, das wesentlich für das Wachstum der Zellwand
ist, das heißt
die Unfähigkeit,
einen Schritt bei der Biosynthese einer essenziellen strukturellen
Komponente der Zellwand zu katalysieren; (2) einem ersten rekombinanten
Gen, das ein Enzym kodiert, welches die funktionelle Ersetzung des
Enzyms ist, das wesentlich für
das Zellwandwachstum ist; und (3) einem zweiten rekombinanten Gen,
das ein gewünschtes
Polypeptid kodiert, welches physikalisch mit dem ersten rekombinanten
Gen gekoppelt ist. Verlust des ersten rekombinanten Gens bringt die
Zellen dazu, zu lysieren, wenn sich die Zellen in einer Umgebung
befinden, wo ein Produkt, das durch das erste rekombinante Gen exprimiert
wird, fehlt, und wo die Zellen in einer Umgebung wachsen gelassen
werden, so dass das Fehlen des ersten rekombinanten Gens die Zellen
dazu bringt, zu lysieren.
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Baum
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), Band 87, S. 10023–10027 (1990),
beziehen sich auf ein Verfahren für die Überwachung von Spaltungswechselwirkungen
durch eine Reihe von Proteasen. Es wird ein Fusionskonstrukt durch
Inserieren einer Proteasespaltstelle, z. B. das Decapeptid der Protease-Erkennungssequenz
des menschlichen Immunschwächevirus
("HIV"), in spezifische Örtlichkeiten
der β-Galactosidase
in E. coli geschaffen. Jene Konstruktgene, welche ihre enzymatische
Aktivität
trotz der Insertion der Spaltstelle behalten, werden in Plasmide
subkloniert, welche Wildtyp- bzw. mutierte HIV-Protease kodieren.
Von dem Fusionskonstrukt wurde gefunden, dass es durch Wildtyp-HIV-Protease
gespalten wird und nicht durch mutierte HIV-Protease, sowohl bei
in-vivo- als auch bei in-vitro-Experimenten.
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Nach
der Spaltung durch HIV-Protease wird die geänderte β-Galactosidase inaktiviert.
Die Spaltungsreaktion wird durch Pepstatin A inhibiert, einem bekannten
Inhibitor der HIV-Protease. Ein analoges Konstrukt wurde unter Verwendung
einer Polioproteasespaltstelle entwickelt, welche durch Polioprotease
gespalten wurde.
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Paoletti
et al., US-Patent Nr. 4,769,330, offenbaren Verfahren für die Modifikation
des Genoms von Vacciniavirus, um Vacciniamutanten zu produzieren,
besonders durch das Einführen
exogener DNS in das Vacciniagenom. DNS-Sequenzen und unmodifizierte
und genetisch modifizierte Mikroorganismen, die als Zwischenprodukte
involviert sind, werden offenbart, ebenso wie Verfahren zum Infizieren
von Zellen und Wirtstieren mit den Vacciniamutanten, um die exogene
DNS und durch die exogene DNS kodierte Proteine zu amplifizieren.
Diese Literaturstelle ist repräsentativ
für im
Stand der Technik bekannte Rekombinationstechniken, die verwendet
werden, um sowohl Viren als auch Wirtszellen-Mikroorganismen zu modifizieren.
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Murphy,
US-Patent Nr. 5,080,898, bezieht sich auf die Verwendung von rekombinanten
DNS-Techniken, um Analoga von Toxinmolekülen zu schaffen, und auf die
Verwendung solcher Moleküle,
um medizinische Störungen
zu behandeln. Die Toxinmoleküle
können
mit irgendeinem spezifisch bindenden Liganden gekoppelt werden,
ob es ein Peptid ist oder nicht, in einer Position, welche, wie
zuvor bestimmt, dieselbe für
jedes Toxinmolekül
ist.
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Anderson
et al., US-Patent Nr. 4,403,035, offenbaren ein Verfahren für die Zufuhr
und die Übertragung genetischer
Information durch Packen eines DNS-Protein-Hybridkomplexes in einen
viralen Vektor und dann Übertragen
dieser genetischen Information von dem Hybridvirus in aufnahmefähige Mikroorganismen.
Ein Organismus mit einer Funktion oder Fähigkeit, von der gewünscht wird,
dass sie übertragen
wird, wird ausgewählt
und die DNS davon wird isoliert/gereinigt und gespalten, um die
exogenen Gene abzutrennen, die die Funktion kontrollieren, von welcher
gewünscht
wird, dass sie übertragen
oder kloniert wird. Diese exogenen Gene werden in die DNS eines
Virus inseriert. Das resultierende Hybrid DNS-Protein wird in ein
zellfreies Medium in vitro eingeführt, gemeinsam mit einer Quelle
für eine
virale Capsid-Vorläuferstruktur,
das heißt Vor-Köpfe, und
benötigten
viralen Begleitstrukturen und Verpackungsproteinen, um ein infektiöses Hybridvirus,
das die Hybrid-DNS einkapselt, zusammenzubauen.
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Die
virale Capsid-Vorläuferstruktur
und die viralen Begleitstruktur- und Verpackungsproteine werden durch
das Infizieren fähiger
Mikroorganismen mit einer ersten viralen Mutante, die in der Lage
ist, Capsid-Vorläuferstrukturen
zu produzieren, ohne dass wenigstens ein Verpackungsprotein produziert
wird, und durch das Infizieren kompatibler Mikroorganismen mit einer
zweiten viralen Mutante, die in der Lage ist, virale Begleitstruktur- und Verpackungsproteine
zu produzieren, ohne dass Capsid-Vorläuferstrukturen produziert werden,
produziert. Diese infizierten Zellen werden dann vermischt und lysiert,
um die Quelle an Virusbestandteilen für das in-vitro-Verpacken des
DNS-Protein-Hybrids bereitzustellen.
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Das
Hybridvirus wird dann verwendet, um Mikroorganismen zu infizieren,
die mit dem Virus kompatibel sind, um die infizierten Zellen so
zu programmieren, dass sie die gewünschte Funktion der exogenen
Gene und die Gene selber als Nucleinsäuren seriell reproduzieren.
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Dulbecco,
US-Patent Nr. 4,593,002, offenbart ein Verfahren für das Einbauen
von DNS-Fragmenten in
das DNS-Gen eines Virus. Die DNS-Fragmente kodieren für Proteine,
welche spezifischen medizinischen oder kommerziellen Nutzen haben.
Kleine Segmente eines Ausgangsproteins, das die gewünschten
Funktionen zeigt, werden identifiziert und ein DNS-Fragment mit einer
Nucleotidbasensequenz, die jenes Segment des Proteins kodiert, wird
isoliert/gereinigt aus einem Organismus oder chemisch synthetisiert.
Das isolierte/gereinigte DNS-Fragment wird in das DNS-Genom des
Virus so inseriert, dass das inserierte DNS-Fragment sich selber als das Fremdsegment
eines viralen Oberflächenproteins
exprimiert, und so, dass weder die Funktion des Proteinsegmentes
noch die Funktion irgendeines viralen Proteins, das kritisch für die virale
Replikation ist, beeinträchtigt
wird.
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Keines
der Verfahren des Standes der Technik bietet einen rationellen Ansatz
an, der Selektionsvorgänge
für die
Isolierung, Schaffung oder das Schaffen durch gerichtete Evolution
von neuen Molekülen
mit einer spezifischen Funktion bezüglich eines gewählten Substrates
von Interesse nutzt. Die Screening-Verfahren sind von Natur aus
ineffizient, unwirtschaftlich und zeitraubend. Die primitiven Verfahren
der Selektion, die im Stand der Technik offenbart werden, erlauben
nicht das Schaffen z. B. von Molekülen mit hoher Spezifität, entweder
als ein Binder oder als ein Katalysator, für eine bestimmte Erkennungssequenz.
Sie erzeugen begrenzte Zahlen von Molekülen mit begrenzten Eigenschaften.
Weiterhin lehrt keine der Literaturstellen des Standes der Technik
Verfahren, die in ihrer Anwendbarkeit universell sind. Es gibt kein
Verfahren des Standes der Technik für die Isolierung, das Schaffen
oder die gerichtete Evolution von Genen, die unterschiedliche Moleküle exprimieren,
wobei jedes eine rationell gestaltete Aktivität hinsichtlich eines Substrates
von Interesse hat.
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A.
R. Oliphant (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 86, S. 9094–9098, beschreibt
ein Verfahren für
die Schaffung von Proteinen mit geänderten enzymatischen Eigenschaften.
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Detaillierter,
mutierte β-Lactamase-Proteine
wurden zubereitet durch das Einführen
einer mischbasigen Oligonucleotidsequenz in den Nucleinsäurebereich,
der einen 17 Aminosäure
langen Teil des aktiven Zentrums des Enzyms kodiert.
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C.
T. Chien (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 88, S. 9578–9582, beschreibt
ein Zwei-Hybrid-System zum Nachweisen von Proteinen, die in der
Lage sind, mit einem bekannten Protein in Wechselwirkung zu treten.
Detaillierter, zwei Plasmide werden konstruiert, um zwei Hybrid-Proteine
zu kodieren. Das erste Hybrid besteht aus der DNS-Bindungsdomäne eines
transkriptorischen Hefeaktivatorproteins GAL4, das mit dem bekannten
Protein fusioniert ist. Das zweite Hybrid besteht aus der GAL4-Aktivierungsdomäne, die
mit einer Proteinsequenz verschmolzen ist, die durch eine Bibliothek
aus genomischen Hefefragmenten kodiert wird. Folglich führt die
Wechselwirkung zwischen dem bekannten Protein und einem Protein,
das durch die Bibliothek kodiert wird, zu einer transkriptorischen
Aktivierung eines Reportergens, der eine Bindungsstelle für GAL4 enthält.
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Ziele der
Erfindung
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Es
ist folglich ein primäres
Ziel der Erfindung, neue Proteasen zu schaffen, die in der Lage
sind, mit Substraten von Interesse in Wechselwirkung zu treten.
Das Substrat von Interesse wird durch die Erkennungssequenz repräsentiert,
wie detaillierter in der vorliegenden Beschreibung, insbesondere
auf Seite 22, Zeilen 22 bis 23, beschrieben.
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Es
ist ein verwandtes Ziel der Erfindung, neue Proteasen zu schaffen,
während
die Zeit, der Aufwand und die Fehler, die mit dem Protein Engineering,
Screening und Selektionsverfahren des Standes der Technik relativ
verbunden sind, vermieden werden.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, die Kraft der Selektionsprozesse
und rekombinanten Gentechniken nutzbar zu machen, um Proteasen zu
erzeugen, die bis dahin noch nicht bekannt waren und die neue Funktionen
oder verbesserte bekannte Funktionen bezüglich einer breiten Reihe an
Substraten von Interesse haben.
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Es
ist noch ein weiteres und verwandtes Ziel dieser Erfindung, die
Gene, welche neue Proteasen exprimieren, aus bestehenden Genpools
zu isolieren, indem die interaktive Spezifität dieser neuen Proteasen für die Substrate
von Interesse, für
welche sie spezifisch sind, zur Übereinstimmung
gebracht werden.
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Es
ist noch ein weiteres und verwandtes Ziel dieser Erfindung, neue
Proteasen für
die Wechselwirkung mit dem Substrat von Interesse durch die rationelle
Gestaltung von auf Selektion basierenden Verfahren zu schaffen,
welche spezifische exprimierbare Moleküle nutzen, die die Erkennungssequenzen
des Substrates von Interesse einbauen.
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Es
ist noch ein weiteres und verwandtes Ziel dieser Erfindung, die
schnelle Replikation von zellulären und
viralen Genomen bei der Selektion von Genen, welche neue Proteasen
von Interesse exprimieren, nutzbar zu machen.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung, evolutionären Druck
auf zelluläre
und virale Systeme zu kontrollieren und zu richten, um Gene zu schaffen
und zu entwickeln, welche neue Proteasen von Interesse exprimieren,
die bis dahin unbekannte physikalische und/oder chemische Wechselwirkungen
mit Substraten von Interesse eingehen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung liegt in weitem Sinne bei rationellen Verfahren für die Isolierung,
Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, welches eine neue
Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit einem
Substrat von Interesse in der Lage ist. Das Verfahren involviert
die Selektion von Wirten oder von Replikatoren in Wirten, welche
neue Proteasen kodieren, basierend auf dem Zell- oder Replikatorwachstum,
verursacht durch die gewünschte
Wechselwirkung der neuen Protease mit einem Selektionsmolekül, das durch den
Wirt exprimiert wird. Das Verfahren wird durchgeführt durch
die Expression vielfacher Kopien der vermeintlich neuen Protease
oder einer Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen
in einer Population an Wirtszellen, die einen Zellwachstumsfaktor
und/oder einen Replikator-(z. B. einen Virus-)Wachstumsfaktor und ein
Substrat von Interesse oder ein Analogon davon, das funktionell
mit diesem Wachstumsfaktor verbunden ist, enthalten, und durch das
Auferlegen von Selektionsbedingungen an die Population aus Wirtszellen,
um jene Wirte oder jene Replikatoren zu selektieren, die eine neue
Protease exprimieren, welche mit dem Substrat von Interesse oder
Analogon in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern.
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Die
Erfindung wird durch Bezugnahme auf Anspruch 1 definiert.
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Auswahl von Wirtverfahren
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Die
Isolation, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, das eine
neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit
einem Substrat von Interesse in der Lage ist, kann durch die Schritte der
Expression von vielfachen Kopien einer vermeintlich neuen Protease
oder einer Vielzahl an vermeintlich neuen Proteasen in einer Population
aus Wirtszellen und des Hinzufügens
oder Exprimierens eines Zellwachstumsfaktors, eines Substrates von
Interesse oder Analogons davon mit einer Erkennungssequenz, die
das Substrat von Interesse repräsentiert
und welche funktionell in Verbindung steht mit dem Wachstumsfaktor,
und wahlweise einer Wachstumsfaktor-Modulierungseinheit, und des
Auferlegens von Selektionsbedingungen an die Population aus Wirtszellen,
um für
jene Wirte zu selektieren, die Gene enthalten, die zur Expression
einer neuen Protease in der Lage sind, welche mit der Erkennungssequenz
in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern, durchgeführt werden
Die Reihenfolge der Expression der vermeintlich neuen Proteasen
und die Reihenfolge der Expression und/oder Zugabe des Wachstumsfaktors,
Substrates von Interesse oder Analogen davon und der Modulationseinheit
relativ zueinander und zu der Expression der vermeintlich neuen
Proteasen und die zeitliche Steuerung des Selektionsvorgangs bezüglich irgendeinem
solcher Schritte ist eine Angelegenheit der Wahl. In einigen Ausführungsbeispielen
kann es vorteilhaft sein, Selektionsbedingungen einer Population
an Wirten oder Replikatoren vor der Modifikation des Wirts oder
Replikators aufzuerlegen, um Wachstumsfaktoren, Erkennungssequenzen
oder Modulierungseinheiten oder Selektionsmoleküle, die dieselben einschließen, zu
exprimieren, um dadurch einen gewünschten Wirt- oder Replikatorstamm
für die
nachfolgende Selektion zu entwickeln.
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Das
Verfahren kann durchgeführt
werden durch Einführen
einer homogenen Population an Genen, welche vielfache Kopien vermeintlich
neuer Protease exprimieren können,
oder eine heterogene Population an Genen, welche eine Vielzahl an
unterschiedlichen vermeintlich neuen Proteasen oder Proteasen mit
einem evolutionären
Potenzial exprimieren können,
in eine Population an Wirtszellen, deren Genom künstlich geändert worden ist, um einen
Zellwachstumsfaktor und eine Erkennungssequenz zu exprimieren, welches
das Substrat von Interesse repräsentiert
und welches funktionell mit dem Wachstumsfaktor verbunden ist, durch das
Auflegen von Selektionsbedingungen, z. B. Kultivieren oder Inkubieren
der Population an Wirtszellen unter Selektionsbedingungen, um für jene Wirte
zu selektieren, die Gene enthalten, die in der Lage sind, eine neue Protease
zu exprimieren, welche mit der Sequenz in Wechselwirkung tritt,
um die Aktivität
des Wachstumsfaktors zu ändern,
und durch das Isolieren/Reinigen des Gens von Interesse aus der
ausgewählten
Zellpopulation. Das Gen von Interesse kann dann verwendet werden,
um zusätzliche
Mengen der neuen Protease zu exprimieren.
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Der
Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz können als einzelne Moleküle oder
Molekülgruppen
vorhanden sein oder können
zusammen in Molekülen
verbunden sein, die beide einschließen. Die Wirtszellen, z. B.
E. coli, können
durch die Zugabe des Wachstumsfaktors und/oder der Erkennungssequenz
von außen
modifiziert werden oder der Wachstumsfaktor und/oder die Erkennungssequenz
kann durch den Wirt exprimiert werden. Durch das Auferlegen von
Selektionsbedingungen auf die Population an Wirtszellen ist es möglich, für jene Wirtszellen
zu selektieren, die Gene oder Mutationen davon enthalten, die in
der Lage sind, eine neue Protease zu exprimieren, welche die gewünschte Wechselwirkung
mit der Erkennungssequenz hat und welche dadurch die Aktivität des Wachstumsfaktors
beeinträchtigt.
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Auswahl von
Replikatorverfahren
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Die
Isolierung, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, welches
eine neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit
einem Substrat von Interesse in der Lage ist, kann auch durchgeführt werden
durch das Exprimieren vielfacher Kopien einer vermeintlich neuen
Protease oder einer Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer
Proteasen, die durch einen Replikator, z. B. ein Virus, kodiert
werden, in einer Population an Wirtszellen, die Wachstumsfaktoren
für den
Replikator, ein Substrat von Interesse oder Analogon davon, welches
eine Erkennungssequenz einbaut, die das Substrat von Interesse repräsentiert
und die mit dem Wachstumsfaktor funktionell in Verbindung steht,
und wahlweise eine Wachstumsfaktor-Modulierungseinheit enthält oder
exprimiert, und durch das Auferlegen von Selektionsbedingungen an
die Population von Wirtszellen, um für den Replikator, z. B. Virus,
zu selektieren, der in der Lage ist, einen neue Protease zu exprimieren,
welche mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um die
Aktivität
des Wachstumsfaktors zu ändern.
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Diese
Verfahren können
z. B. durchgeführt
werden durch Einführen
eines Replikators, z. B. ein Virus, in eine Population an Wirtszellen,
deren Genom künstlich
geändert
worden war, um einen Wachstumsfaktor für das Virus und eine Erkennungssequenz,
die das Substrat von Interesse repräsentiert, welches funktionell mit
dem Wachstumsfaktor in Verbindung steht, zu exprimieren, durch Kultivieren
oder Inkubieren jener Population an Wirtszellen, um für die Viren
zu selektieren, die in der Lage sind, die neue Protease zu exprimieren, welche
mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors
zu ändern, und
durch Isolieren/Reinigen des Gens von Interesse. Wie bei den Wirtsverfahren
ist die Reihenfolge der Expression und/oder Zugabe der zahlreichen
Bestandteile des Vorgangs und die Reihenfolge der Expression und/oder
Zugabe relativ zu der Auferlegung von Selektionsbedingungen eine
Frage der Wahl.
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Bei
solchen Verfahren wird eine homogene Population an Viren, die vielfache
Kopien einer vermeintlich neuen Protease exprimiert, oder eine heterogene
Population an Viren, die eine Vielzahl mutierter Gene enthält, wovon
jedes eine andere vermeintlich neue Protease exprimieren kann, in
eine Population modifizierter Wirtszellen eingeführt, welche einen funktionell
herunterregulierten Wachstumsfaktor, der notwendig für das Wachstum
und/oder die Replikation der Viren ist, und eine Erkennungssequenz
enthalten, wie oben beschrieben. Jene Viren, welche neuen Proteasen
exprimieren, die mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung treten
und dadurch die Aktivität
des Wachstumsfaktors herauf regulieren, werden innerhalb des Wirtes replizieren.
Jene Viren, die neue Proteasen exprimieren, die nicht die gewünschte Wechselwirkung
haben, werden nicht repliziert werden. Die Wirtszellen können dann
unter Selektionsbedingungen inkubiert oder kultiviert werden, um
die Population der Viren zu selektieren, welche die neuen Proteasen
von Interesse exprimieren.
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In
einem bevorzugten Verfahren werden die Genome der Wirtszellen künstlich
geändert,
um ein Molekül
oder Moleküle
zu exprimieren, die den Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz
einschließen,
welche des Substrat von Interesse repräsentiert und welche funktionell
verbunden ist mit dem Wachstumsfaktor. Die Population von Zellen
wird dann durch einen Replikator, z. B. ein Virus, infiziert, dessen
Genom in der Lage ist, vielfache Kopien einer Protease oder einer
Vielzahl unterschiedlicher Proteasen zu exprimieren, welche mit dem
Selektionsmolekül,
das durch das rekombinante Genom der Wirtszelle exprimiert wird,
in Wechselwirkung treten können.
Jene neuen Proteasen, die mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung
treten, um die Funktion des Wachstumsfaktors zu ändern, werden den Viren einen
selektiven Wachstumsvorteil verleihen, welche die neue Protease
der Wahl exprimieren. Die Population an Wirtszellen kann dann kultiviert
oder inkubiert werden, um eine amplifizierte Population des gewünschten
Virus zu schaffen.
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Wie
bei der Wirtsselektion werden die Genome der Wirtszellen künstlich
geändert,
um einen Wachstumsfaktor und eine Erkennungssequenz zu exprimieren,
als einzelne Moleküle
oder als physikalische oder chemische Assoziationen oder Kombinationen
davon. Die Erkennungssequenz repräsentiert das Substrat von Interesse
und ist funktionell mit dem Replikator-Wachstumsfaktor assoziiert.
Wünschenswerterweise
wird das Genom durch rekombinante Verfahren modifiziert, um ein
Selektionsmolekül,
z. B. ein Fusions- oder Deletionsprotein, zu exprimieren, welches
sowohl den Wachstumsfaktor als auch die Erkennungssequenz einschließt. Der
Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz können mit einer Selektionseinheit
verbunden sein, welche die Aktivität des Wachstumsfaktors moduliert.
Die Selektionseinheit kann ein einzelnes Moleküle) oder kann Teil eines Selektionsmoleküls(en),
z. B. ein Fusions- oder Deletionsprotein, sein, welches auch den Wachstumsfaktor
und die Erkennungssequenz einschließt.
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Die
zu erhaltende neue Protease kann durch eine Kaskade von Ereignissen
wirken, das heißt
sie kann mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung treten, um
den gewünschten
Effekt zu verursachen, oder die Wechselwirkung kann eine Kaskade
aus Ereignissen mit irgendeiner Anzahl an Zwischenschritten starten, welche
letztlich die Aktivität
des Wachstumsfaktors beeinflusst. Jedes Molekül in der Kaskade kann ein natürliches
oder bearbeitetes Substrat in der Wirtszelle oder ein von außen zugeführtes Substrat
sein oder kann selber eine neue Protease sein.
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Die
Wirtsselektions- und Replikatorselektionsverfahren der Erfindung
können
verwendet werden, um einen breiten Bereich an neuen Proteasen zu
schaffen, die zu einer gewünschten
Wechselwirkung mit einer Protease-Erkennungssequenz in der Lage
sind.
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Das
universale Selektionsverfahren verknüpft die Bildung von im Grunde
genommen irgendeinem Produkt mit dem Wachstum einer Zelle. Zum Beispiel
kann man in der Reaktion A + B → C
(katalysiert durch X), wobei die Produktion von C mit der Wachstumsfähigkeit
einer Zelle gekoppelt wird, obwohl C sogar gar keine Wirkung auf
das Wachstum der Zelle direkt oder indirekt haben kann, jenes Mitglied
einer Population an vermeintlich neuen Proteasen selektieren, welches
in der Lage ist, die Reaktion zu katalysieren, oder welches in der
Lage ist, in irgendeinem Wege zu wirken, um zu der Produktion von
C beizutragen.
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Die
Erfindung bietet signifikante Vorteile gegenüber den Techniken des Standes
der Technik. Sie bietet einen inhärenten Effizienzanstieg gegenüber dem
Screening und legt die Last eher auf das experimentelle System als
den Experimentator. Bei der Selektion bestimmen die Umgebungsbedingungen,
welche Mitglieder einer Population lebensfähig sind. Durch die saubere
Definition der Selektionsvorgänge
und Bedingungen können
jene Klone mit den gewünschten
Eigenschaften aus einer großen
Population erhalten werden. Die Selektionsvorgänge der Erfindung haben den
Vorteil, dass sie verwendet werden können, um eine enorme Reihe neuer
Proteasen zu erhalten, von denen jede hochspezifisch für eine gegebene
Erkennungssequenz und Wechselwirkung ist. Im Gegensatz dazu sind
die primitiven Selektionsverfahren des Standes der Technik roh und
empirisch.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindungsdefinitionen
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Gewisse
hierin verwendete Begriffe werden wie folgt definiert:
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Der
Begriff "Isolierung" bedeutet das Hervorbringen
eines in der Natur existierenden Gens aus einem bestehenden Gen.
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Der
Begriff "Schaffen" bedeutet das Hervorbringen
eines Gens, das nicht in der Natur gefunden wird, welches ein neues
Molekül
kodiert.
-
Die
Begriffe "gerichtete
Evolution" und "Schaffen durch gerichtete
Evolution" bedeutet
das Hervorbringen eines Gens, das nicht in der Natur gefunden wird,
welches ein neues Molekül
durch das Mutieren von Genen unter rationell gestalteten Selektionsbedingungen
und -drucken kodiert.
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Der
Begriff "neue Proteasen
mit neuer Funktion" umfasst
irgendeine Protease mit einer zuvor unbekannten Struktur und/oder
Sequenz und/oder physikalischen/chemischen Eigenschaften.
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Der
Begriff "funktionell
verstärkte
neue Protease" umfasst
Proteasen mit einer zuvor unbekannten Struktur und/oder Sequenz
und/oder physikalischen chemischen Eigenschaften, deren Funktion
und Spezifität bekannt
oder realisiert sind, die sich jedoch in ihrem Grad der bekannten
Funktion unterscheiden.
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Der
Begriff "neue Protease" schließt irgendeine
Protease mit einer zuvor unbekannten Struktur und/oder Sequenz und/oder
physikalischen/chemischen Eigenschaften oder eine neue Protease
mit neuer Funktion oder eine funktionell verstärkte neue Protease ein und
schließt
Proteine, Peptide und irgendwelche substituierten oder modifizierten
Versionen davon ein.
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Die
Begriffe "vermeintlich
neue Protease", "vermeintlich funktionell
verstärkte
neue Protease" oder "vermeintlich neue
Protease mit neuer Funktion" bedeutet
irgendeine Protease, bekannt oder anderweitig, welche ein Fachmann
als einen Kandidaten für
die Isolierung, Schaffung oder gerichtete Evolution gemäß den Verfahren
der Erfindung erachtet.
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Der
Begriff "Substrat
von Interesse" schließt irgendein
natürlich
vorkommendes Molekül
oder synthetisches Molekül,
ob bekannt oder unbekannt, ein, von welchem eine chemische und/oder
physikalische Wechselwirkung gewünscht
wird. Das Substrat von Interesse kann organische oder anorganische
Moleküle
oder Biomoleküle,
z. B. Proteine, Oligonucleotide, Lipide und Polysaccharide umfassen.
Substrate von Interesse schließen
z. B. Verbindungen, die bekannte Substrate für Enzymwirkung sind, Peptide,
Polypeptide und Proteine verschiedener Beschreibung ein, die zur
Reaktion zu bringen, zu spalten, zu koppeln, zu modifizieren oder
zu substituieren sind oder die durch ein neues Molekül zu binden
sind.
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Der
Begriff "Analogon
des Substrates von Interesse" bedeutet
ein Molekül
oder einen Teil davon, der eine Erkennungssequenz enthält, welche
es zu einem funktionellen Analogon des Substrates von Interesse macht.
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Der
Begriff "Gen" wird in seiner breitesten,
allgemein verstandenen Bedeutung verwendet und schließt irgendeine
Nucleinsäure,
z. B. Oligonucleotide (DNS, RNS etc.) ein, die zur Expression fähig sind,
und schließt weiter
Kombinationen oder Sätze
an Genen ein.
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Der
Begriff "Genom" bezieht sich auf
das gesamte Komplement von Genen, die in der Lage sind, exprimiert
zu werden, einschließlich
chromosomaler Gene, Plasmide, Transposons und viraler DNS.
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Der
Begriff "Expression" hat seine allgemein
verstandene wissenschaftliche Bedeutung und schließt die Replikation
von Oligonucleotiden, Transkription, Translation und reverse Transkription
ein.
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Der
Begriff "Expression
durch den Wirt" bedeutet
die Expression durch irgendeinen Teil des Wirtsgenoms.
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Die
Begriffe "Wechselwirkung" und "zur Wechselwirkung
fähig" umfassen breit irgendwelche
intermolekularen und/oder intramolekularen Wirkungen, einschließlich chemischer
Reaktionen, Katalyse oder physikalischer Bindung. Die neuen Proteasen,
die durch die Verfahren der Erfindung geschaffen werden sollen,
können
zur Reaktion mit der Erkennungssequenz fähig sein. Solche Reaktionen
können
auf Wechselwirkungen zwischen dem neuen Molekül und der Erkennungssequenz
beschränkt
werden. Wechselwirkungen können auch
Katalysen einschließen,
bei denen die neue Protease katalytisch auf die Erkennungssequenz
wirkt, um Proteolyse zu bewirken.
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Der
Begriff "Wirtszelle" schließt einen
lebenden Organismus ein, der einzellig, vielzellig, prokaryotisch oder
eukaryotisch ist, z. B. Hefe, COS-Zellen, CHO-Zellen oder Hybridom-Zellen.
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Der
Begriff "Wachstumsfaktor", wie er hierin verwendet
wird, ist ein Molekül
bzw. sind Moleküle,
die einen Wachstumsvorteil oder -nachteil gegenüber einer Wirtszelle oder einem
Replikator verleihen. Typische Wachstumsfaktoren schließen Nährstoffe,
Enzyme, die für
den Metabolismus von Nährstoffen
notwendig sind, und Bindungs- und Strukturproteine ein, und Proteine,
die in die Replikation, den Metabolismus, die Bildung und Aufrechterhaltung
von essenziellen strukturellen Bestandteilen oder in zelluläres und
subzelluläres Wachstum
verwickelt sind.
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Der
Begriff "Erkennungssequenz" wird in seinem universellsten
chemischen Sinne verwendet und bedeutet irgendwelche chemischen
Atom(e), Bindung(en), Molekül(e),
submolekulare Gruppe(n), die Kombination von irgendeinem der Vorstehenden,
oder irgendeinen physikalischen oder elektrischen Zustand oder Konfiguration
davon, z. B. eine Aminosäuresequenz.
Die Erkennungssequenz kann ein gesondertes Molekül oder kann ein submolekularer
Teil eines komplexen Moleküls
sein, das den Wachstumsfaktor und/oder die Selektionseinheit einschließt.
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Es
ist wesentlich, dass die Erkennungssequenz eine gewisse funktionelle
Wechselwirkung entweder direkt oder indirekt mit dem Wachstumsfaktor
und/oder der Selektionseinheit hat, der Gestalt, dass dann, wenn die
gewünschte
Wechselwirkung zwischen der neuen Protease und der Erkennungssequenz
stattfindet, die Funktion des Wachstumsfaktors beeinflusst wird
und einen Einfluss (positiv oder negativ) auf Zell- oder Replikatorwachstum
hat. Die Funktion und/oder die Struktur der Selektionseinheit und/oder
der Erkennungssequenz können
kombiniert werden und die Funktion und/oder Struktur der Erkennungssequenz
und des Wachstumsfaktors können
ebenfalls kombiniert werden. Wie weiter unten beschrieben, sind
Fusions- oder Deletionsproteine besonders nützlich bei den Selektionsverfahren
der Erfindung und stellen ein Ausführungsbeispiel dar, bei dem
alle drei Funktionen in einem einzelnen Molekül kombiniert werden.
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Modifikationen
der Erkennungssequenz ermöglichen
die Selektion multipler neuer Proteasen. Zum Beispiel kann ein großes Protein,
das ein Substrat von Interesse ist, in der Lage sein, die Insertion
oder das Ersetzen einer Aminosäurestrecke
zu tolerieren, ohne seine Funktion zu verlieren (29). Es ist möglich, in
solch ein Protein eine Reihe unterschiedlicher möglicher proteolytischer Erkennungssequenzen
einzufügen,
um multiple Proteasen gewünschter
Spezifität
zu erhalten.
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Es
ist auch wesentlich, dass die Erkennungssequenz das Substrat von
Interesse repräsentiert.
Zum Beispiel kann die Erkennungssequenz eine Aminosäuresequenz
eines Proteins sein, für
das kein bekanntes oder zufrieden stellendes proteolytisches Enzym
existiert. Der Einbau jener Aminosäuresequenz oder gewisser Analoga
davon als Erkennungssequenzen bei den Verfahren der Erfindung wird
zu der Schaffung neuer Proteasen mit Spezifität und/oder hoher Umsatzrate
für die
Proteolyse jener Aminosäuresequenz
führen.
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Der
Begriff "Selektionseinheit" oder "Modulationseinheit" bezieht sich auf
jedes Molekül,
welches in physikalischer oder chemischer Verbindung mit einem Wachstumsfaktor
entweder direkt oder indirekt die Funktion jenes Wachstumsfaktors
entweder erhöht
oder erniedrigt. Die Selektionseinheit kann z. B. ein sperriges
Protein sein, welches wegen sterischer Behinderung und Konformationsänderungen
die Wirkung eines Enzyms, das für
das Zell- oder virale Wachstum notwendig ist, inaktiviert oder sie
funktionell verleiht.
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Die
Begriffe "Selektionsmolekül" oder "universelles Selektionsmolekül" beziehen sich auf
ein Molekül, welches
einen Wachstumsfaktor und eine Erkennungssequenz und wahlweise eine
Modulationseinheit einbaut.
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Der
Begriff "künstliches
Selektionsmolekül" bedeutet ein erdachtes
Selektionsmolekül,
das eine Erkennungssequenz enthält,
welche nicht ein innerer Teil eines natürlichen oder synthetischen
Wachstumsfaktors ist.
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Der
Begriff "Replikator" bezieht sich auf
subzelluläre
Einheiten, die zur Reaktion fähig
sind, z. B. Plasmide, Viren, Bakteriophagen, selbst-replizierende
Oligonucleotide wie RNS-Moleküle, die
Erkennungssequenzen für
Replikase(n), Mycoplasma etc. haben. Replikatorexpression bezieht
sich auf die Expression, die von einem Replikator durch die Verwendung
von Wirts- und/oder Replikatorbestandteilen gelenkt wird.
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Die
Begriffe "Selektion", "Selektionsbedingungen" und "Selektionsdruck" beziehen sich auf
allgemein bekannte, ebenso wie auf neue Vorgänge, um eine Population an
Wirtszellen in der Abwesenheit eines essenziellen Nährstoffes
auf Verbindungen, die nicht durch elterliche Stämme genutzt werden können, in
der Anwesenheit von Toxinen, bei verschiedenen besonderen Umweltbedingungen,
z. B. Temperatur, Licht, pH-Wert, oder in der Anwesenheit gemischter
Kulturen wachsen zu lassen, was gewisse, jedoch nicht alle Mitglieder
der Population dazu bringen wird, zu überleben und zu replizieren.
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Ein "Nucleotid" ist eine der fünf Basen:
Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil plus ein Zucker, Desoxyribose
oder Ribose, plus ein Phosphat.
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Ein "Oligonucleotid" ist eine Sequenz,
die von wenigstens zwei Nucleotiden gebildet wird, und ein "Polynucleotid" ist ein langes Oligonucleotid
und kann entweder RNS oder DNS mit oder ohne modifizierten Basen sein.
Während
der Begriff Oligonucleotid allgemein in der Technik verwendet wird,
um kleinere Nucleinsäureketten
zu bezeichnen, und "Polynucleotid" allgemein in der
Technik verwendet wird, um größere Nucleinsäureketten,
einschließlich
DNS- oder RNS-Chromosomen
oder Fragmente davon, zu bezeichnen, ist die Verwendung des einen
oder des anderen Begriffes hierin keine Begrenzung oder Beschreibung
der Größe, wenn
es nicht ausdrücklich
als solche festgestellt wird.
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Der
Begriff "Nucleinsäure" bezieht sich auf
ein Polynucleotid irgendeiner Länge,
einschließlich
DNS- oder RNS-Genomen oder Fragmenten davon, mit oder ohne modifizierte
Basen, wie oben beschrieben.
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Der
Begriff "Isolation/Reinigung" bezieht sich auf
Techniken für
die Isolierung, Reinigung oder Extraktion, wie diese Begriffe üblicherweise
verwendet werden, um Verfahren für
die Wiedergewinnung eines Gens oder eines Moleküls aus einer Zelle und/oder
einem Replikator und/oder einem Medium zu beschreiben.
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Der
Begriff "Mutagenese" bezieht sich auf
Techniken für
die Schaffung heterogener Populationen von Genen, z. B. durch Bestrahlung,
chemische Behandlung, Replikation mit niedriger Genauigkeit, etc.
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In den Zeichnungen
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Die 1A und 1B sind
schematische Darstellungen eines Ausführungsbeispiels eines Wirts-Selektionsverfahrens
der Erfindung für
die Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, das eine neue
Protease kodiert.
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Die 2A, 2B und 2C sind
schematische Darstellungen eines Ausführungsbeispiels eines viralen
Replikators der Erfindung für
die Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, das eine neue
Protease kodiert.
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3A und 3B sind
schematische Darstellungen eines zellfreien Ausführungsbeispiels der Erfindung.
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Mit
Bezugnahme auf die 1A und 1B bezieht
sich das Bezugszeichen 10 auf eine Wirtszelle (E. coli),
die das Chromosom 12 aufweist. Die Zelle wird bearbeitet,
wie anderswo beschrieben, um eine Deletionsmutante 14 zu
sein, der die Fähigkeit
fehlt, einen essenziellen Wachstumsfaktor zu exprimieren. Die Deletionsmutante 14 von
E. coli wird weiter bearbeitet, wie beim Bezugszeichen 16 gezeigt,
um ein Selektionsmolekül
zu kodieren, welches den essenziellen Wachstumsfaktor für die Wirtszelle
in einer herunterregulierten Form und eine Erkennungssequenz einschließt.
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Bezugszeichen 18 bezieht
sich auf ein Plasmid, das bearbeitet ist, wie bei Bezugszeichen 20 gezeigt, um
den Replikationsstartpunkt des Bakteriophagen T7 und die T7-Replikationsmaschinerie
mit geringer Genauigkeit zu kodieren. Das Plasmid 20 wird
weiter bearbeitet, um eine heterogene Population an Genen zu kodieren,
welche vermeintlich neue Proteasen exprimieren. Das so bearbeitete
Plasmid wird beim Bezugszeichen 22 gezeigt.
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Das
Plasmid 22 wird in den transformierten, deletionsmutierten
Wirt 16 eingeführt
und in einer geeigneten Umgebung in einem nährstoffreichen, nicht begrenzenden
Medium kultiviert, wie gezeigt beim Bezugszeichen 24. Plasmide,
welche eine neue Protease mit der gewünschten funktionellen Wechselwirkung
mit einem durch den deletionsmutierten Wirt 16 exprimierten
Selektionsmolekül
exprimieren, sind beim Bezugszeichen 26 gezeigt.
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Inkubation
in dem nährstoffreichen,
nicht begrenzenden Medium im Inkubator 24 resultiert in
dem Wachstum einer Population an Wirtszellen 60, welche
die Plasmide 22 und das Plasmid 26 enthalten.
Die Population transformierter Wirtszellen ist beim Bezugszeichen 30 gezeigt.
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Die
Population inkubierter Wirtszellen wird dann in einem Chemostaten
in nährstoffbegrenzendem Medium
selektiert. Dies verleiht jenen transformierten Wirtszellen 16 einen
Wachstumsvorteil, welche die Plasmide 26 beherbergen, die
neue Proteasen mit der gewünschten
Funktion der Wechselwirkung mit dem Selektionsmolekül und des
Heraufregulierens des Wachstumsfaktors haben. Die selektierte Population
an Wirtszellen wird beim Bezugszeichen 32 gezeigt. Wie
gesehen werden kann, hatten jene Zellen, die ein Plasmid beherbergen,
welches eine neue Protease mit der gewünschten Funktion kodiert, einen
bevorzugten Wachstumsvorteil.
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Die
Plasmide 26 werden dann aus der ausgewählten Population an Zellen 32 isoliert
gereinigt. Die neuen Proteasegene werden kloniert, sequenziert und
funktionell charakterisiert.
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Mit
Bezugnahme auf die 2A, 2B und 2C bezieht
sich das Bezugszeichen 50 auf ein Plasmid, das funktionelle
Gene des Bakteriophagen T7 trägt.
Die Plasmide 50 werden in die E.-coli-Wirtszelle 52 mit dem
Chromosom 54 eingeführt.
Der transformierte Wirt wird beim Bezugszeichen 56 gezeigt.
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Der
Wildtyp-T7-Bakteriophage wird beim Bezugszeichen 58 gezeigt.
Eine Population, 60, an deletionsmutierten Bakteriophagen,
die nicht einen Wachstumsfaktor, der für das Replikatorwachstum oder
die Replikation wesentlich sind, kodiert, wird bearbeitet, um vermeintlich
neuen Proteasen zu kodieren.
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Die
heterogene Population an T7-Deletionsmutanten wird in die transformierte
Wirtszelle 56 eingeführt,
welche die Funktion der T7-Deletionsmutanten vervollständigt, und
eine Population jener Deletionsmutanten wird inkubiert. Die Population
der Deletionsmutanten ist beim Bezugszeichen 62 gezeigt.
Die eine T7-Mutante in der Population, welche das Gen trägt, das
eine neue Protease exprimiert, die zu der gewünschten Wechselwirkung fähig ist,
ist beim Bezugszeichen 64 gezeigt.
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Das
Bezugszeichen 66 bezieht sich auf ein Plasmid, das die
Gene trägt,
welche ein Selektionsmolekül exprimieren,
das den vom Phagen 60 und 64 deletierten Wachstumsfaktor,
eine Erkennungssequenz und eine Modulationseinheit enthält. Das
Plasmid 66 wird in die E.-coli-Wirtszelle 68 eingeführt, die
das Chromosom 70 enthält,
wodurch eine zweite Population transformierter E.-coli-Wirte gebildet
wird, wie gezeigt beim Bezugszeichen 72.
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Der
T7-Deletionsmutanten-Population, die in der ersten Population an
transformierten Wirtszellen, welche ihre Deletionen vervollständigen,
aufgewachsen ist, wird dann ermöglicht,
Zellen in der zweiten Population, welche die Selektionsmoleküle exprimiert,
zu infizieren. Der Infektionsschritt wird beim Bezugszeichen 74 gezeigt
und die Inkubation der infizierten zweiten Population an Wirtszellen
wird beim Bezugszeichen 76 gezeigt. Die virale Replikation
geschieht nur in jenen Wirtszellen, in welchen die neue Protease
mit gewünschter
Funktion exprimiert wird. Der Vorgang kann chargenweise durchgeführt werden
oder zusätzliche
Mengen an mutierten T7-Bakteriophagen können zu der zweiten Population
transformierter Wirtszellen in einer kontinuierlichen Weise, wie
gezeigt, hinzugefügt
werden, bis Zelllyse beobachtet wird. Die Lyse einer Zelle in der inkubierten
zweiten Population transformierter Wirtszellen wird beim Bezugszeichen 78 gezeigt.
Wie gesehen werden kann, wurde die Population an T7-Deletionsmutanten 64,
welche die neue Protease gewünschter Funktion
kodiert, wesentlich vervielfacht, wie beim Bezugszeichen 80 gezeigt.
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Die
virale Population, welche die gewünschte neue Protease exprimiert,
expandiert und infiziert andere Zellen nach der Zelllyse. Es wird
kein neuer T7 zu der Kultur hinzugefügt. Die Expansion und Infektion
anderer Zellen werden beim Bezugszeichen 82 gezeigt. Die
Vielfachinfektionen rufen mehr Virionen, welche die gewünschte neue
Protease tragen, ebenso wie jene, welche die neue Protease nicht
tragen, hervor. Dies wird beim Bezugszeichen 84 gezeigt.
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Die
selektierte und amplifizierte virale Population, welche die neue
Protease mit gewünschter
Funktion kodiert, gezeigt beim Bezugszeichen 86, wird aus
den kultivierten Wirtszellen isoliert/gereinigt und dann auf Zellen,
welche das Selektionsmolekül
exprimieren, in einer niedrigen Verdünnung hochgezogen. Dies separiert
einzelne virale Klone, welche die Gene tragen, die die neue Protease
mit gewünschter
Funktion kodieren. Diese Isolation/Reinigung wird beim Bezugszeichen 88 gezeigt.
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Detaillierte
Beschreibung
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Die
bevorzugten Ausführungsbeispiele
der Erfindung werden weiter unten mit Bezug auf etliche besondere
Merkmale der Erfindung beschrieben.
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I. Das Selektionsmolekül und seine
Bestandteilsteile
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Selektionsmoleküle werden
verwendet, um den Selektionsdruck so zu lenken, dass ein gewünschtes Gen
erhalten wird. Selektionsmoleküle
schließen
Wachstumsfaktoren und Erkennungssequenzen und wahlweise Modulationseinheiten
ein. Einige sind in der Lage, verwendet zu werden, um vielfache
unterschiedliche neue Gene durch Nutzen der Erkennungssequenz in
einer kassettenartigen Weise zu selektieren. Wenn einmal eine rationelle
Konfiguration der gewünschten
Bestandteile etabliert worden ist, werden Schritte unternommen,
um die Mutation des Selektionsmoleküls zu verhindern. Dies stellt
ein konstantes Ziel für
die Population neuer Proteasen bereit und dient dazu, die Selektion
oder evolutionäre
Vorgänge
zu lenken.
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A. Der Wachstumsfaktor
-
Wachstumsfaktoren
sind alle Faktoren, die in der Lage sind, einer Zelle oder einem
Replikator einen Wachstumsvorteil oder -nachteil zu verleihen. Wachstumsfaktoren
schließen
ein Nährstoffe
wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Energiequellen, Phosphatquellen,
anorganische Ionen, Nucleinsäuren,
Aminosäuren
etc.; Toxine wie Antibiotika, Inhibitoren von Enzymen, die für die Replikation
kritisch sind, Detergenzien etc.; Enzyme, die essenziell sind für das Zell-
oder Replikatorwachstum oder welche dem zellulären Wachstum einen Vorteil
oder Nachteil verleihen, wie Polymerasen, Ligasen, Topoisomerasen,
Enzyme, die Reaktionen bei der Biosynthese von Proteinen katalysieren
etc.; Moleküle,
deren Funktion nicht katalytisch, sondern eher strukturell oder
basierend auf den Bindungseigenschaften der Moleküle ist,
wie Actin, Lipide, Nucleosomen, Rezeptoren, Hormone, cyclisches
AMP etc.; und Co-Enzyme oder Co-Faktoren
wie Wasser, anorganische Ionen, NADPH, Co-Enzym A etc.
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B. Die Erkennungssequenz
-
Die
Erkennungssequenz ist ein Molekül
oder ein Teil eines Moleküls,
das mit der neuen Protease in Wechselwirkung tritt. Als solche können Erkennungssequenzen
eine Reihe unterschiedlicher Strukturen wie eine Sequenz aus Aminosäuren oder
Nucleinsäuren
sein. Diese Sequenz kann eine einzigartige Sequenz repräsentieren
oder sie kann eine Klasse verwandter Sequenzen repräsentieren.
Die Erkennungssequenz kann auch eine bestimmte Konformation oder
Klasse an Konformationen verschiedener Moleküle sein, z. B. eine bestimmte
dreidimensionale Struktur eines Proteins, anorganisches Moleküls, Lipids,
Oligosaccharids etc. Zusätzlich
dazu kann die Erkennungssequenz ein Analogon von irgendeinem der
vorangegangenen sein.
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Zusätzlich können die
möglichen
Erkennungssequenzen in Abhängigkeit
von dem Selektionssystem auf einen sehr spezifischen Bereich, Konformation,
Sequenz etc. begrenzt sein oder können ein breiter Satz möglicher
Erkennungssequenzen sein. Zum Beispiel ist die wahre Erkennungssequenz
durch die Verwendung spezifischer, multipler, redundanter Sequenzen,
die einer Vielzahl von Selektionsmolekülen gemeinsam sind, mit welchen
die gewünschte
neue Protease in Wechselwirkung treten könnte, um das Wachstum zu modulieren,
auf jene spezifische Sequenz begrenzt, die allen Selektionsmolekülen gemeinsam
zu eigen ist. Auf der anderen Seite kann die mögliche Erkennungssequenz durch
die Verwendung von nur einem Selektionsmolekül oder durch die Verwendung
multipler Selektionsmoleküle
mit großen
Regionen, die allen gemeinsam sind, eine Reihe von Regionen, Konformationen,
Sequenzen etc. innerhalb des einen Selektionsmoleküls oder
innerhalb der multiplen Selektionsmolekülen zu eigenen großen Regionen
sein. Erkennungssequenzen können folglich
hochspezifisch für
eine Region, Konformation, Sequenz etc. sein oder können für einen
breiteren, doch definierten Satz an Regionen, Konformationen, Sequenzen
etc. spezifisch sein.
-
C. Die Modulationseinheit
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Zentral
für die
Erfindung ist das Konzept der Modulierung der Aktivität des Wachstumsfaktors.
Es gibt viele Wege, biologische Aktivität zu modulieren, und die Natur
hat eine Anzahl von Präzedenzfällen. Die
Modulation der Aktivität
kann durchgeführt
werden durch Mechanismen, so kompliziert und schwierig wie die allosterisch
induzierte quartäre Änderung
auf die einfache Anwesenheit/Abwesenheit, z. B. Expressions-/Degradationssysteme.
In der Tat wird die Repression/Aktivierung der Expression vieler
biologischer Moleküle
selber durch Moleküle
vermittelt, deren Aktivitäten
durch eine Reihe an Mechanismen moduliert werden können.
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Eine
Tabelle chemischer Modifikationen von bakteriellen Proteinen erscheint
in (2) auf Seite 73. Wie in der Tabelle bemerkt, sind gewisse Modifikationen
in den genauen Zusammenbau verwickelt und andere Modifikationen
sind es nicht, in jedem Fall sind solche Modifikationen jedoch in
der Lage, eine Modulation der Funktion zu bewirken.
-
In
gewissen Beispielen kann die Modulation funktioneller Nützlichkeit
einfach durch die genaue/ungenaue Lokalisierung des Moleküls vermittelt
werden. Moleküle
können
nur tätig
sein, um einen Wachstumsvorteil oder -nachteil bereitzustellen,
falls sie auf eine bestimmte Örtlichkeit
gerichtet sind. Zum Beispiel ist Stärke ein Makromolekül, welches
typischerweise nicht von Bakterien aufgenommen wird, so ist es notwendig,
Enzyme zu sezernieren, die für
ihren Abbau verantwortlich sind, z. B. Amylasen, so dass sie in
nützliche
Energieformen umgewandelt werden kann. Folglich reguliert die Produktion
und Zurückhaltung
von Amylasen innerhalb der Bakterien ihre funktionelle Nützlichkeit
herunter, wenn die Bakterien in einem Stärke begrenzenden Medium wachsen
gelassen werden. Es ist nur dann, wenn die Amylasen abgesondert
werden, der Fall, dass sie in der Lage sind, den Bakterien einen
Wachstumsvorteil zu verleihen. Die inhärenten enzymatischen Fähigkeiten der
Amylase können
dieselben innerhalb oder außerhalb
der Bakterien sein, ihre funktionelle Nützlichkeit wird jedoch dramatisch
herunter moduliert, wenn sie intrazellulär zum Ziel genommen werden,
im Vergleich zu dem extrazellulären
Zum-Ziel-Genommen-Werden.
-
Das
Lokalisierungstargeting von Proteinen, durchgeführt durch Abspalten von Signalpeptiden,
ist ein Weg, bei welchem die Modulation funktioneller Nützlichkeit
durch molekulares Targeting in dieser Erfindung verwendet wird.
In diesem Fall wird die Selektion für eine spezifische katalytische
Endoproteaseaktivität
selektiert.
-
Die
funktionelle Nützlichkeit
von Enzymen kann auch durch Ändern
ihrer Fähigkeit,
eine Reaktion zu katalysieren, moduliert werden. Solch eine Modulation
kann durchgeführt
werden durch differenzielle Lokalisierung (das heißt permissive
lokale Umgebung gegen nicht permissive), dies braucht jedoch nicht
der Mechanismus zu sein. Erläuternde
Beispiele modulierter Moleküle
sind Zymogene, die Bildung/Disassoziation funktioneller Komplexe
vielfacher Untereinheiten, Polyproteinketten von RNS-Virus, allosterische
Wechselwirkungen, allgemeine sterische Behinderung (kovalent und
nicht kovalent) und eine Reihe chemischer Modifikationen wie Phosphorylierung,
Methylierung, Acetylierung, Adenylierung und Uridinylierung ((2),
S. 73, 315).
-
Zymogene
sind Beispiele natürlich
vorkommender Proteinfusionen, welche die Modulation enzymatischer
Aktivität
bewirken. Zymogene sind eine Klasse an Proteinen, die durch begrenzte
Proteolyse in ihren aktiven Zustand umgewandelt werden ((3), S.
54). Die Natur entwickelte einen Mechanismus der Herunterregulierung
der Aktivität
gewisser Enzyme wie Trypsin, indem diese Enzyme mit zusätzlichen "Leit"-Peptidsequenzen
an ihren Aminotermini exprimiert werden. Mit der zusätzlichen
Peptidsequenz befindet sich das Enzym in dem inaktiven Zymogenzustand.
Nach der Abspaltung dieser Sequenz wird das Zymogen in seinen enzymatisch
aktiven Zustand umgewandelt. Die Gesamtreaktionsraten des Zymogens
sind "ungefähr 105–106-mal geringer als jene des entsprechenden
Enzyms" ((3), S.
54).
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Es
ist deswegen möglich,
die Funktion gewisser Enzyme herunter zu regulieren, einfach durch
die Addition einer Peptidsequenz an einem seiner Enden. Zum Beispiel
kann diese Fähigkeit
in der Erfindung verwendet werden, um Endoproteasen mit gewünschten
Eigenschaften zu selektieren.
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Die
Bildung oder Disassoziierung von Enzymen mit mehreren Untereinheiten
ist ein weiterer Weg, durch welchen Modulation geschehen kann. Unterschiedliche
Mechanismen können
für die
Modulation von Aktivität
bis zur Bildung oder Disassoziation von Multi-Untereinheit-Enzymen verantwortlich
sein. Zwei Mechanismen sind erläutert.
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Die
Tryptophansynthetase besteht aus zwei unterschiedlichen Untereinheit,
Alpha und Beta, in einem Alpha-Beta-Alpha-Beta-Tetramer. Das Tetramer
kann in zwei Alpha-Untereinheiten
und eine Beta-Beta-Untereinheit dissoziieren, von der jede katalytische
Aktivität
zeigt, die unabhängigen
Untereinheiten sind jedoch wesentlich weniger effizient als das
tetramere Holoenzym. Von der Effizienzzunahme des Holoenzyms wird
gedacht, dass sie zum Teil an der Bildung eines Tunnels zwischen
den aktiven Zentren von Alpha und Beta liegt (4). Durch die Bestimmung
der dreidimensionalen Kristallstruktur dieses Enzyms scheint es,
dass der Tunnel den Verlust des Zwischenproduktes, der durch Alpha
katalysierten Reaktion an das Lösungsmittel
verhindert, indem es direkt zu dem aktiven Zentrum der Beta-Untereinheit
geleitet wird, wodurch folglich die Effizienz erhöht wird.
-
Die
Modulation der Aktivität
nach der Bildung des Holoenzyms der Aspartattranscarbamoylase geschieht
durch einen anderen Mechanismus. Bei dem Aspartattranscarbamoylase-Holoenzym
werden die aktiven Zentren an der Schnittstelle katalytischer Untereinheiten
gebildet. Sowohl bei der Aspartattranscarbamoylase als auch bei
der Tryptophansynthetase ist die genaue spezifische Wechselwirkung
verschiedener Untereinheiten kritisch für die effiziente Aktivität des Holoenzyms.
Deswegen wird die sterische Hinderung der genauen, spezifischen
Wechselwirkungen der Untereinheiten die katalytische Aktivität herunterregulieren.
Solche Komplexe könnten
in der Erfindung für
die Selektion einer Reihe von Proteasen verwendet werden.
-
Andere
Beispiele an Mechanismen, durch welche die Modulation der Funktion
geschehen kann, sind RNS-Virus-Polyproteine, allosterische Effekte
und allgemeine kovalente und nicht kovalente sterische Behinderung.
Das HIV-Virus ist ein gut untersuchtes Beispiel eines RNS-Virus, der nicht-funktionelle
Polyproteinkonstrukte exprimiert. In dem HIV-Virus werden "die gag-, pol- und
env-Polyproteine verarbeitet, um die viralen Strukturproteine p17,
p24 bzw. p15-reverse
Transkriptase und Integrase – und
die beiden Hüllproteine
gp41 und gp120 zu ergeben" (5).
Die genaue Spaltung der Polyproteine ist für die Replikation des Virus
entscheidend und Virionen, die inaktive, mutierte HIV-Protease tragen,
sind nicht infektiös
(5). Dies ist ein weiteres Beispiel dafür, dass die Fusion von Proteinen
ihre Aktivität
herunterregulieren. Folglich ist es möglich, rekombinante Viren zu
konstruieren, die sequenzabhängige
Endoproteasen für
die saubere Replikation benötigen.
-
Gewisse
Enzyminhibitoren leisten gute Beispiele funktioneller Herunterregulation
durch kovalente sterische Behinderung oder Modifikation. Suizidsubstrate,
die irreversibel an das aktive Zentrum eines Enzyms an einer katalytisch
wichtigen Aminosäure
in dem aktiven Zentrum binden, sind Beispiele kovalenter Modifikationen,
die sterisch das enzymatisch aktive Zentrum hemmen. Ein Beispiel
eines Suizidsubstrates ist TPCK für Chymotrypsin (6). Diese Modulationsart
kann in Ausführungsbeispielen
der Erfindung verwendet werden, um Verbindungen zu selektieren,
die in der Lage sind, kovalent an katalytisch aktive Zentren oder,
Spaltungseinheiten eines nicht-aktiven katalytischen Zentrums zu
binden, wodurch es in ein katalytisch aktives umgewandelt wird.
-
Es
gibt auch Beispiele nicht-kovalenter sterischer Behinderung, einschließlich vieler
Repressormoleküle.
Der Lambda-Repressor ist von Interesse, da er gleichzeitig die Expression
anderer Phagengene wie cro herunterreguliert, während er seine eigene Expression
herauf reguliert. Er bewerkstelligt dies, indem er nicht-kovalent
an DNS-Sequenzen bindet und sterisch die Wechselwirkung dieser Sequenzen
mit RNS-Polymerase behindert, wodurch die RNS-Polymerase vom Transkribieren in Richtung
der cro-Gene abgehalten wird, während
gleichzeitig die RNS-Polymerase für die Transkription in der
Gegenrichtung stimuliert wird. Folglich sind die Repressormoleküle zu sterischer
Behinderung fähig
und folglich zur Herunterregulation der Funktion der DNS-Sequenzen,
indem bestimmte DNS-RNS-Polymerase-Wechselwirkungen verhindert werden.
-
Die
Selektion nicht-kovalenter Bindungsverbindungen bietet Möglichkeiten
und Vorteile, da Bindungsmoleküle
basierend auf ihrer Fähigkeit,
die Aktivitäten
zahlreicher Substrate von Interesse zu modifizieren, geschaffen
werden können.
-
Allosterische
Wirkungen sind ein weiterer Weg, durch welchen Modulation in einigen
biologischen Systemen durchgeführt
wird. Aspartattranscarbamoylase ist ein gut charakterisiertes allosterisches
Enzym. Regulatorische Domänen
sind mit den katalytischen Untereinheiten wechselwirkend. Nach der
Bindung an CTP oder UTP sind die regulatorischen Untereinheiten
in der Lage, eine quartäre
Strukturänderung
in dem Holoenzym zu induzieren, wodurch die Herunterregulation der
katalytischen Aktivität
bewirkt wird. Im Gegensatz dazu ist die Bindung von ATP an regulatorische
Untereinheiten in der Lage, die Heraufregulation katalytischer Aktivität zu bewirken
(7). Unter Verwendung von Verfahren der Erfindung werden Proteasen
selektiert, die in der Lage sind, zu binden und modulierende quartäre oder
tertiäre Änderungen
zu bewirken.
-
Zusätzlich kann
eine Reihe chemischer Modifikationen, z. B. Phosphorylierung, Methylierung,
Acetylierung, Adenylierung und Uridinylierung durchgeführt werden,
um die Funktion zu modulieren. Es ist bekannt, dass Modifikationen
wie diese wichtige Rollen bei der Regulation vieler wichtiger zellulärer Bestandteile
spielen. Die Referenz ((2) S. 73) listet unterschiedliche bakterielle
Enzyme auf, welche solche Modifikationen durchmachen. Zusätzlich machen
viele Proteine, die in menschliche Erkrankung verwickelt sind, ebenfalls
solche chemischen Modifikationen durch. Zum Beispiel wurde von vielen
Oncogenen gefunden, dass sie durch Phosphorylierung modifiziert
werden oder dass sie andere Proteine durch Phosphorylierung oder
Dephosphorylierung modifizieren. Die Fähigkeit, Moleküle, basierend
auf ihrer Fähigkeit,
die Aktivität
eines Wachstumsfaktors, z. B. durch Phosphorylierung, zu ändern, zu
selektieren ist von Wichtigkeit.
-
D. Bevorzugte Selektionsmoleküle
-
(1) Fusions- oder Deletionsmoleküle
-
Fusionsproteine,
die den Wachstumsfaktor, die Selektionseinheit und die Erkennungssequenz
einbauen, sind bevorzugte Selektionsmoleküle. Fusionen können zwischen
im Grunde allen Molekülen
stattfinden und können
die Fusion von zwei Molekülen
oder von vielfachen Molekülen
einschließen.
Fusionen können Protein-Protein-Fusionen
und Protein-Biomolekül-Fusionen
einschließen.
Das Molekül
kann ein biologisches oder chemisches Molekül oder ein Ion sein. Zucker,
Nucleotide, Nucleoside, Fettsäuren,
kleine organische Moleküle
und Metallionen, z. B. Mg, und zahlreiche Derivate und Vorläufer der
vorstehenden können
in Betracht gezogen werden. Andere Fusionen können Protein-Nucleinsäure, Protein-Ribonucleinsäure, Protein-Lipid, Protein-Oligosaccharid,
Nucleinsäure-kleines-Molekül, kleines-Molekül-Protein-Lipid,
Nucleinsäure-kleines-Molekül-Lipid
einschließen,
unter anderem.
-
In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kann ein Fusionskonstrukt zwischen einem metabolisch wichtigen Enzym,
das heißt
dem Wachstumsfaktor, und der gewünschten
Peptid-Erkennungssequenz
und einem sperrigen Protein, das heißt der Modulationseinheit,
genutzt werden. Wegen der sterischen Behinderung und/oder Konformationsänderungen,
verursacht durch die Peptid-Erkennungssequenz in Verbindung mit
dem sperrigen Protein, wird das metabolisch wichtige Enzym inaktiviert
oder funktionell beeinträchtigt.
In der Anwesenheit der zu gewinnenden Protease wird jedoch die Erkennungssequenz
abgespalten und die Funktion des Enzyms wird herauf reguliert.
-
Das
Untereinheiten-Ausführungsbeispiel
und das Ausführungsbeispiel
der alpha-beta-artigen
Vervollständigung
sind weitere Variationen von Fusionskonstrukten. Das Untereinheiten-Ausführungsbeispiel
nutzt die komplexe Multi-Untereinheiten-Natur gewisser Moleküle aus.
In gewisser Hinsicht sind Moleküle
nicht funktionell als Monomere, erwerben jedoch Funktion in Komplexen
mit mehrfachen Untereinheiten, die homogene oder heterogene Molekülgruppen
umfassen. Man kann ein anderes Molekül mit irgendeiner Zahl unterschiedlicher
Untereinheiten verschmelzen. Wegen den oftmals empfindlichen und komplexen
Wechselwirkungen der Untereinheit in der aktiven Multi-Untereinheit-Form
ist die Modulation der Funktion, die durch die Konstruktion der
Fusion induziert wird, wahrscheinlich ziemlich stark.
-
Das
Ausführungsbeispiel
der Vervollständigung
vom Alpha-Beta-Typ ist vom Konzept her ähnlich. Es ist bekannt, dass
gewisse funktionelle Moleküle
fragmentiert werden können
und dass die Fragmente allein nicht funktionieren. Die Fragmente
können
jedoch erneut assoziiert werden und erhalten ihre Funktion wieder zurück. Falls
die Fragmente in Fusionen eingebaut werden, werden diese Verknüpfungen
verhindert und demgemäß sind diese
Fusionen nützlich
bei den Verfahren der Erfindung.
-
Ein
Ausführungsbeispiel
mit einer "Umkehr"-Untereinheit kann
auch verwendet werden, um das Fusionskonstrukt zu schaffen. In diesem
Fall fehlt den Multi-Untereinheit-Komplexen die Funktion und die
Untereinheiten sind selber funktionell. Zum Beispiel ist es möglich, durch
die Verwendung eines Proteins, dessen Funktion durch die Zugabe
einer zusätzlichen
Sequenz an einem seiner Enden verliehen wird, eine Multi-Untereinheiten-Kette
solcher Proteine zu schaffen, die nicht funktionell sind. Indem
eine Linkersequenz zwischen den Proteinen exakt gestaltet wird,
können
Proteasen mit gewünschter
Spezifität
erhalten werden.
-
Unter
stringenten Selektionsbedingungen können sehr leichte Vorteile
bei der effizienten Nutzung von Ressourcen differenzielle Selektion
bewirken. Falls ein Mitglied der Wirtszell-Population überflüssige Proteine erzeugt, wodurch
man sich folglich dem Aminosäurepool
unnötigerweise
nähert,
wird ihr Wachstum benachteiligt werden. Die Verfahren der Umkehr-Untereinheit können effizient
sein, da verschwendete Proteinsynthese in den Wirtszellen, welche
die neue Protease erzeugen, eliminiert wird, weil jeder Teil der
Untereinheit des Umkehr-Untereinheiten-Fusionsmoleküls genutzt
wird.
-
Diese
Fusionsproteine können
viele unterschiedliche Konfigurationen annehmen und können aktiv oder
inaktiv, heraufreguliert oder herunterreguliert sein. Sie können Proteingruppen
oder andere Gruppen wie Phosphate oder Methylgruppen im Inneren
oder an beiden Enden hinzugefügt
oder deletiert haben. Zum Beispiel können Proteinsequenzen an eines
oder beide der Enden oder zu dem Inneren eines Protein-Wachstumsfaktors
hinzugefügt
sein, um seine Funktion herauf- oder herabzuregulieren und/oder
um dem Selektionsmolekül
eine besonders gewünschte
Erkennungssequenz zu übertragen.
-
Es
kann eine Vielzahl unterschiedlicher Gruppen hinzugefügt werden.
Zum Beispiel kann eine Multiproteinfusion, die aus einer großen, sterisch
hinderlichen, modulierenden Gruppe besteht, die mit einer Erkennungssequenz
gekoppelt ist, die mit einem Wachstumsfaktor gekoppelt ist, der
mit einer Erkennungssequenz gekoppelt ist und die wiederum mit einer
großen,
sterisch hinderlichen, modulierenden Gruppe gekoppelt ist, verwendet
werden.
-
Alternativ
können
Deletionen genutzt werden, um modulierte Wachstumsfaktoren zu konstruieren. Zum
Beispiel kann ein Protein-Wachstumsfaktor, der eine Region hat,
dessen Anwesenheit für
die saubere Funktion des Wachstumsfaktors wichtig ist, in einer
verkürzten
oder deletierten Form, der diese Region fehlt, als ein modulierter
Wachstumsfaktor verwendet werden. In einem anderen Beispiel kann
ein Protein, das in seiner aktiven Form phosphoryliert ist, in seinem
unphosphorylierten Zustand als ein modulierter Wachstumsfaktor genutzt
werden. In beiden Fällen
können
normale Moleküle
selektiert werden, die eine Einheiten) in den modulierten Wachstumsfaktor
einführen.
-
(2) Allosterische Plattformen
-
Es
können
Selektionsmoleküle,
die verwendet werden, um neue Proteasen, basierend auf ihren Bindungsfähigkeiten,
zu erhalten, auf einer Vielzahl von Wegen gestaltet werden. Ein
einfaches bindungsbasiertes Selektionsmolekül kann seine Funktion basierend
auf der Bindung der neuen Protease an eine Erkennungssequenz auf
dem Selektionsmolekül
moduliert haben. Zum Beispiel kann eine neue Protease binden und/oder
sterisch das aktive Zentrum eines enzymbasierten Selektionsmoleküls inhibieren.
-
Auf
ein Selektionsmolekül,
welches, wenn es ungebunden ist, eine konformatorische Änderung
durchmacht, kann Bezug genommen werden als eine allosterische Plattform.
Die Funktion des Wachstumsfaktors kann in einer allosterischen Weise
moduliert werden. Folglich ist, falls die Erkennungssequenz entweder
kovalent oder nicht kovalent gebunden wird, die Funktion der Wachstumseinheit
geändert.
Die Bindungsdomäne auf
der Erkennungssequenz kann variiert werden, um die Selektion einer
weiten Anordnung unterschiedlicher Liganden anzupassen. Die allosterische
Plattform kann ein Molekül
oder viele Moleküle
sein und kann mit jedem der Verfahren der Erfindung verwendet werden.
-
Im
Wege des Beispiels, ein Teil der allosterischen Plattform kann als
ein Rezeptor für
die Bindung einer neuen Protease dienen und ein anderer Teil kann
dazu dienen, die allosterische Plattform mit einem Wachstumsfaktor
zu koppeln. Nach dem Binden einer neuen Protease an den ersten Teil
wird eine allosterische Änderung
in dem Wachstumsfaktor in Heraufregulierungen oder Runterregulierungen
in der Funktion resultieren. Die Änderung in der Funktion kann
dann verwendet werden, um die neue Protease durch anderswo beschriebene
Verfahren zu erhalten.
-
Die
neue zu erhaltende Protease braucht nicht tatsächlich die Selektionsmoleküle binden,
noch ist es notwendig, dass die Funktion des neuen zu selektierenden
Moleküls
bindend ist. Im Wege des Beispiels kann ein bindungsbasieres Selektionsmolekül verwendet
werden, um für eine
Protease zu selektieren. Indem das bindungsbasierte Selektionsmolekül das Produkt
der durch die gewünschte
neue Protease katalysierten Reaktion erkannt hat, kann jene neue
Protease, ohne selbst mit dem Selektionsmolekül in Wechselwirkung zu treten,
selektiert werden.
-
II. Selektionsverfahren
-
A. Im Allgemeinen
-
Die
bei den Isolierungs-, Schaffungs- und Verfahren der gerichteten
Evolution der Erfindung verwendeten Selektionstechniken können irgendeine
von jenen sein, die bis jetzt im Stand der Technik genutzt worden sind,
oder können
neue Umgebungen, Bedingungen, Vorgänge und Selektionsdrucke einschließen. Anstrengungen
sollten unternommen werden, um die Mutationen der Gene, die den
Wachstumsfaktor, die Erkennungssequenz, die Modulierungseinheit
oder die Selektionsmoleküle
exprimieren, zu begrenzen, so dass ein Gen, welches eine neue Protease
kodiert, die spezifisch für
die Ausgangs- und gewünschte
Erkennungssequenz ist, erhalten wird.
-
Dies
gilt für
die Isolierungs-, Schaffungs- und Verfahren der gerichteten Entwicklung
der Erfindung. Bei der gerichteten Entwicklung ist es wünschenswert,
die Gene mit evolutionärem
Potenzial zu mutieren, um neue Proteasen durch Aussetzen an äußere Einflüsse, wie
Bestrahlung oder mutationenauslösende
Chemikalien, oder durch das Auferlegen von rationell gestalteten
Selektionsbedingungen, die eine evolutionäre Richtung auf die vermeintlich
neue Proteasepopulation auferlegen, zu kodieren. Diese Verfahren
sind anderswo vollständiger
beschrieben.
-
Es
können
negative oder positive Selektionsverfahren verwendet werden. Bei
der positiven Selektion haben jene Mitglieder der Wirts- oder Replikatorpopulation
mit der gewünschten
Funktion einen selektierbaren Wachstumsvorteil. Bei der negativen
Selektion ist das Umgekehrte richtig. Jene Mitglieder der Wirts-
oder Replikatorpopulation mit der gewünschten Funktion haben einen
selektierbaren Wachstumsnachteil. Bei der negativen Selektion exprimiert
das Gen von Interesse eine Protease, welche mit dem Selektionsmolekül oder mit der
Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um das Wachstum zu inhibieren.
Verbindungen, z. B. gewisse Antibiotika, können an die Population verabreicht
werden, die Mitglieder der Population abtöten oder anderweitig beeinträchtigen,
falls sie zum Wachstum in der Lage sind. Diese Techniken können in
bekannter cyclischer Weise wiederholt werden, um die gewünschten,
nicht wachsenden Mitglieder der Population anzureichern.
-
Es
ist wichtig, dass Selektionsverfahren auf die spezifischen Selektionseigenschaften
von Interesse gerichtet werden, und es ist wichtig, dass das Selektionsvorgehen
optimiert wird. Zum Beispiel kann es günstig sein, Selektionsdruck
in einer cyclischen Weise anzulegen, wobei zwischen hohem und niedrigem
Selektionsdruck cyclisiert wird, oder unterschiedliche Bedingungen
zu verwenden, um für
dieselben Eigenschaften zu selektieren.
-
Unterschiedliche
Selektionsmoleküle
und Selektionsverfahren werden unter unterschiedlichen Umständen verwendet.
Zum Beispiel ist bei Genisolierungsverfahren, wo gedacht wird, dass
das Gen, welches die neue Protease mit den gewünschten Eigenschaften kodiert,
in einem bestehenden Genpool existiert, die einmalige Selektion
oder wiederholte einmalige Selektion (Batch-Selektion) angemessen,
um die Isolation zu erreichen. Unter solchen Umständen ist
es wünschenswert,
einen Wachstumsfaktor zu verwenden, der absolut notwendig für das Wachstum
ist und der im Wesentlichen oder vollständig seine Funktion verliert
(maximale Modulation der Funktion), wenn er in das Selektionskonstrukt
eingebaut wird. Da angenommen wird, dass die gewünschte neue Protease oder eine
sehr eng mit ihre verwandte neue Protease in der bestehenden heterogenen
Population existiert und da nur ein oder eine sehr geringe Anzahl
verwandter Klone selektiert wird, wird ein sehr stringenter Selektionsdruck
an dem System angelegt.
-
Es
werden viele Generations-Selektionstechniken verwendet, wo von der
gewünschten
neuen Protease angenommen wird, dass sie in der Population existiert
und entwickelt zu werden braucht. In gewissen Beispielen ist es
wünschenswert,
einen Wachstumsfaktor zu verwenden; der absolut notwendig für das Wachstum ist,
dessen Funktion jedoch nur teilweise moduliert wird, oder einen
Wachstumsfaktor, der nicht absolut notwendig ist, der jedoch einen
Wachstumsvorteil verleiht und vollständig moduliert werden kann.
Dies ermöglicht Wachstum,
während
das Gen, welches die neue Protease exprimiert, entwickelt wird und
dann wird, indem Moleküle
mit Eigenschaften, die eng mit jenen der gewünschten neuen Protease in Beziehung
stehen, produziert werden, ein selektiver Wachstumsfaktor verliehen.
-
Diese
Unterschiede in der Stringenz des Selektionsdrucks durch die abwechselnde
Selektionsmolekülgestaltung
für unterschiedliche
neue Protease-Ausgangspopulationen werden ebenfalls geschaffen,
indem die Umweltbedingungen geändert
werden. Zum Beispiel werden unter Verwendung desselben Selektionsmoleküls unterschiedliche
Niveaus am Selektionsdruck geschaffen, einfach durch Verändern von
Medien, Temperatur, pH-Wert etc. In einigen solche Beispielen vervollständigt die
Wirkung der Umweltbedingungen die Funktion des Selektionsmoleküls und durch Ändern dieser
Umweltbedingungen werden differenzielle Selektionsdrucke etabliert.
-
Ein
alternatives Verfahren, durch welches die Selektionsmoleküle als der "Regelwiderstand" der Selektion verwendet
werden, schließt
die Änderung
der Expressionsgrade der Selektionsmoleküle ein. Das einfache Erhöhen der
Expressionsgrade der Selektionsmoleküle durch einen induzierbaren
Promotor kann den Hintergrund in gewissen Fällen erhöhen und folglich den Selektionsdruck
erniedrigen.
-
Zwei
wichtige Techniken der Erfindung, die den Ausführungsbeispielen der Isolierung,
Schaffung und gerichteten Evolution gemeinsam sind, sind die Kontrolle
der Wirtszell-Mutationen
und die Verwendung redundanter Selektionsmoleküle.
-
(1) Begrenzung ungewünschter
Mutationen
-
Es
ist wichtig, Wirtszell-Mutationen zu kontrollieren, welche die Expressionsgenauigkeit
des Wachstumsfaktors und/oder der Erkennungssequenz und/oder der
Modulationseinheit und/oder eines Selektionsmoleküls beeinflussen,
um ein konstantes Ziel für
die Wechselwirkung mit einer neuen Protease aufrecht zu erhalten.
Es ist auch wichtig, Hintergrund-Mutationen, z. B. Mutationen in
der DNS innerhalb des gewünschten Selektionssystems,
zu begrenzen, welche die Selektion auf die gewünschte neue Protease komplizieren
könnten.
Nicht-nützliche
Mutationen der Gene, welche das Selektionsmolekül oder Bestandteile davon exprimieren, schließen jene
ein, die die Funktion des Wachstumsfaktors durch proteolytische
Spaltung durch eine neue Protease verleihen. Solche Mutationen schließen auch
unter anderem ein Mutationen des Wachstumsfaktorteils der Fusion,
welche die Wirkungen der sperrigen Gruppe aufheben, Mutationen der
sperrigen Gruppe, so dass sie ineffektiv wird, die Funktion des
Wachstumsfaktors zu modulieren, die Transposition oder Rekombination der
kodierenden Sequenz des Gens für
den Wachstumsfaktor, was die Expression eines unerwünscht modulierten
Wachstumsfaktors ermöglicht,
Mutationen (Punktmutationen und Insertionen), die Promotoren vor
dem Wachstumsfaktor schaffen, die Entwicklung der Fähigkeit
posttranslationaler oder posttranskriptorischer Modifikationen des
Selektionsmoleküls,
um die Bestandteilsteile in einem nicht-nutzbaren Wege zu trennen,
wodurch der Wachstumsfaktor freigesetzt wird, und Mutationen, die
alternative Pfade oder mutierte Moleküle schaffen, welche dieselbe
Funktion durchführen
wie der Wachstumsfaktor.
-
Wichtige Überlegungen
sind die Anzahl und die Rate spezifischer Mutationen und die Anzahl
und Rate von Grobmutationen, die zu spezifischen Insertionen oder
Deletionen führen,
welche nicht-nützliche
Arten hervorrufen, im Vergleich zu der Anzahl und Rate spezifischer
und Grobmutationen, die notwendig sind, um eine gewünschte neue
Protease zu erzeugen. Bei der gerichteten Entwicklung ist es wichtig,
dass die Anzahl spezifischer Mutationen, die notwendig sind, um
ein Gen zu erzeugen, welches eine nützliche neue Protease exprimiert,
so niedrig als möglich
ist, und dass die Mutationsrate vernünftig hoch ist im Vergleich
mit der Anzahl an Mutationen und der Mutationsrate, welche nicht
nützliche
Mutanten hervorruft. Falls die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung
einer nicht nützlichen
Genmutation hundertmal so hoch ist wie die der Erzeugung einer nützlichen
Genmutation, ist es immer noch möglich,
indem man das Experiment hundertmal laufen lässt, ein Gen zu erhalten, welches
eine nützliche
neue Protease exprimiert. Dies liegt jedoch weit von der Ideale
entfernt.
-
Bei
gewissen Genen können
die Deletionsraten so hoch sein wie 10–4.
Dies ist unter anderen Überlegungen
abhängig
von der besonderen Gensequenz und von den umgebenden Sequenzen und
der resultierenden Sekundärstruktur.
Die möglicherweise
hohe Wahrscheinlichkeit für
Deletionsmutationen erfordert die sorgfältige Gestaltung, um Erscheinungen
zu verhindern, die nicht-nützliche
Mutanten hervorrufen. Diese Erscheinungen können durch die saubere Selektion
der Gensequenz und der Sekundärstruktur
(beides innerhalb des Konstruktes und örtlich) oder durch Rec-A- und ähnlichen
Mutationen, welche homologe Rekombinationshäufigkeiten 1000-fach reduzieren
können,
minimiert werden.
-
Zusätzlich kann
eine Anti-Mutator-Replikationsmaschinerie mit hoher Genauigkeit
verwendet werden, um die Häufigkeit
der Mutation zu reduzieren. Es ist bekannt, dass gewisse Polymerasen
so mutiert werden können,
dass sie mit höherer
Genauigkeit als die Wildtyp-Polymerase
replizieren. Solche Polymerasen könnten verwendet werden, um
die Fehlerrate während
der Replikation zu reduzieren. Mutationen können auch kontrolliert werden,
indem die Anzahl an Replikationen niedrig gehalten wird, oder alternativ,
falls der Zellzyklus arretiert wird, um die weitere Replikation
zu verhindern.
-
Indem
die Gene, welche das Selektionsmolekül in gewissen Ausführungsbeispielen
kodieren, segregiert werden, wird es einfach, die Selektionsmoleküle entwicklungsmäßig zurückzusetzen.
Zum Beispiel ist es möglich,
falls die Selektionsmoleküle
in einer Wirtszelle kodiert werden und die neuen Moleküle durch
einen Replikator kodiert werden, dem Selektionsvorgehen zu erlauben,
die in den Replikatoren kodierten Gene zu entwickeln. Diese entwickelte
Population kann dann in einem Selektionsvorgehen mit einer frischen
Population an Wirtszellen aus einer Ausgangsstartkultur verwendet
werden. Die Bestandteile des Selektionssystems, das durch die Wirtszelle,
für welche
Mutationen unerwünscht
sind, kodiert wird, werden evolutionsmäßig zurückgesetzt, während der
evolutionäre
Fortschritt der neuen Proteasepopulation aufrechterhalten wird und
ermöglicht
wird, in einer statischen Selektionsumgebung fortzuschreiten.
-
(2) Verwendung mehrfach
redundanter Selektionsmoleküle
-
Ein
anderes Verfahren, die Selektion von Genen zu erhöhen, welche
neue Proteasen im Gegensatz zu nicht-wünschenswerten Mutanten exprimieren,
geschieht durch die simultane Verwendung mehrfach redundanter Selektionsmoleküle. In solchen
Systemen bewirkt eine einzelne, unerwünschte Mutante wegen der Anwesenheit
der anderen Selektionsmoleküle
nicht unerwünschte
Selektionen. Die Expression der genauen neuen Protease beeinträchtigt sämtliche
Selektionsmoleküle
und ermöglicht
es einer nützlichen
Selektion, stattzufinden.
-
Zum
Beispiel wird eine Reihe unterschiedlicher Protein-Protein-Protein-Fusionen
erzeugt, jede mit derselben proteolytischen Spaltungsstelle und
verschiedenen, aber essenziellen Wachstumsfaktoren. Eine Mutation,
die einen Wachstumsfaktor aus seiner Fusion befreit und seine Funktion
verändert,
wird keine unerwünschte
Selektion bewirken oder wird in der marginalen Selektion resultieren,
da die anderen Selektionsmoleküle
nicht angegriffen werden. Falls eine neue Protease mit den angemessenen
proteolytischen Eigenschaften erzeugt wird, wird jede der proteolytischen
Spaltstellen geschnitten und jeder der Wachstumsfaktoren wird aus
seiner jeweiligen Fusion befreit und Selektion geschieht.
-
Der
Grad der Redundanz wird auch verwendet, um den Selektionsdruck zu
modulieren. Durch unterschiedliche Redundanzgrade ist es möglich, die
Gesamtzahl an Spaltungen, die für
die Produktion einer gegebenen Art notwendig ist, zu ändern. Zum
Beispiel sind mehr Spaltungen notwendig, falls sieben unterschiedliche
Wachstumsfaktoren in sieben verschiedenen, redundanten Selektionsmolekülen komplexiert
werden, als wenn nur drei von jenen sieben Bestandteilen verwendet
werden.
-
Noch
wichtiger ist sogar der Bestandteilstyp. Zum Beispiel sind einige
Bestandteile im Replikationsvorgang von Bakteriophagen katalytisch
und brauchen vergleichsweise wenige Gesamtkopien, um ihre Aufgabe
zu bewerkstelligen. Andere Bestandteile sind nicht katalytisch und
erfordern viel mehr Spaltungen. Beispiele solcher Bestandteile sind
Kopf- und Schwanzproteine – Strukturproteine,
die in die Funktion von Virionen verwickelt sind. Falls die Kopf-
und Schwanzproteine in einem Selektionsmolekül komplexiert werden, würden hohe
Zahlen an Spaltungen notwendig sein, da jedes Protein der zusammengebauten
viralen Umhüllung
gespalten werden müsste.
Dieser Typ an Selektionskonstrukt würde auf die neuen Proteasen
eine höhere
Last legen, da ein höherer
Umsatz notwendig wäre,
um signifikante Mengen viraler Nachfahren zu erzeugen.
-
Zwei
wichtige Aspekte der Erfindung, die den Ausführungsbeispielen der Schaffung
und insbesondere der gerichteten Evolution gemeinsam sind, sind
die Segregation der Gene, welche die Selektionsmoleküle kodieren
und welche die vermeintlich neuen Proteasen kodieren, und das Bewirken
der kontrollierten Mutation der letzteren, und die Nutzung etlicher
evolutionärer
Startpunkte für
die Gene, welche vermeintlich neue Proteasen exprimieren.
-
(3) Segregation der Gene,
welche das Selektionsmolekül
kodieren und welche die vermeintlich neuen Proteasen kodieren und
Bewirken der kontrollierten Mutation der Gene welche vermeintlich
neue Proteasen kodieren
-
Es
ist wünschenswert,
die Selektionsverfahren durch Segregation der Gene, welche vermeintlich
neue Proteasen bzw. das Selektionsmolekül kodieren, zu beeinflussen,
z. B. in der Zeit oder im Raum oder durch unterschiedliche Erkennungssequenzen,
auf einem Wege, um jedem zu ermöglichen,
durch unterschiedliche Replikationssysteme, welche unterschiedliche
Mutationsraten haben, repliziert zu werden. Dies ermöglicht es dem
Genpool für
mögliche
neue Proteasen, in einer erhöhten
Rate zu entwickeln oder zu evolvieren. Die Stabilität des Selektionsmoleküls wird
aufrechterhalten, während
den Genen, die neue Proteasen kodieren könnten, ermöglicht wird, sich zu entwickeln.
-
Die
Gene, welche vermeintlich neue Proteasen kodieren, können anfänglich aus
einem zu mutierenden Gen bestehen und können zu einem Gen entwickelt
werden, welches eine neue Protease mit der gewünschten Funktion exprimiert,
oder es kann eine Population an Genen mutiert und entwickelt werden,
um ein Gen, welches eine Protease mit der gewünschten Funktion exprimiert,
zu erhalten. Die molekulare Ausgangspopulation kann oder kann nicht
strukturell oder anderweitig mit der letztlich gewünschten
neuen Protease verwandt sein.
-
Die
Verfahren der Erfindung können
durch Verwendung einer Replikationsmaschinerie mit geringer Genauigkeit
und durch Verwendung unterschiedlicher Arten an kodierenden Materialien
und durch die Nutzung zahlreicher Prozessbedingungen, welche die
Mutationsraten kontrollieren, durchgeführt werden. Es können ebenfalls
Sequenzreparaturmechanismen, welche die Gene, die vermeintlich neue
Proteasen und Selektionsmoleküle
exprimieren, differenziell beeinflussen, verwendet werden. Es kann
auch das Anlegen unterschiedlicher Umweltbedingungen wie Temperatur-,
Druck-, pH-Wert-, Ionen- und Substratkonzentrationseffekte etc.
verwendet werden, um diese Ziele zu erreichen. Die kontrollierte
Mutationsrate kann auch durch die Verwendung gewisser kodierender
Materialien geschaffen werden, z. B. bekannter "Hot Spots" in Chromosomen, wo Mutationsraten höher sind
als in anderen Örtlichkeiten.
-
Physikalisch
getrennte, kodierende Sequenzen mit verschiedenen Mutationsraten
und/oder verschiedenen Replikationsmaschinerien werden ähnlich verwendet.
Diese schließen
unter anderem chromosomale Wirts-DNS, Plasmid-DNS (zirkulär oder selbst-replizierende
kurze Sequenz), Viren (sowohl DNS- als auch RNS-Viren), kurze selbst-replizierende
RNS-Sequenzen oder Plasmide und mitochondriale DNS ein. Diese und
andere kodierende Sequenzen können
in irgendeiner Kombination verwendet werden, um für die Selektionsmoleküle und die
vermeintlich neuen Proteasen zu kodieren. Diese unterschiedlichen
kodierenden Vehikel können
mit unterschiedlichen Mutationsraten durch die Verwendung unterschiedlicher
Replikationsmaschinerien mit verschiedenen spezifischen Replikationsstartpunkten
repliziert werden.
-
Ein
weiterer Weg, auf dem differenzielle Mutationsraten geschaffen werden
können,
geschieht durch das Timing der Replikation und des Replikationsumsatzes.
Falls z. B. die Replikation mit einer schnelleren Rate für die Sequenz
geschieht, welche die neue Protease kodiert, als für das Selektionsmolekül, wobei
beide eine Replikationsmaschinerie derselben Genauigkeit verwenden,
wird die neue Proteasepopulation höhere Mutationszahlen entwickeln.
Zusätzlich
kann das Timing der Synthese verschiedener Bestandteile für verschiedene
Replikationsmaschinerien verwendet werden, um verschiedene Mutationsraten
zu schaffen. Zum Beispiel ist es bekannt, dass das Chromosom von
E. coli in einer kontrollierten Weise repliziert wird und dass gewisse
Proteine wie DnaA gebraucht werden, um die Replikation zu initiieren.
Deswegen kann es möglich sein,
ein System zu haben, in welchem zwei DNS-Polymerasen mit unterschiedlichen
Mutationsraten durch induzierbare oder cyclisch aktivierte Promotoren
kontrolliert werden. Die Synthese der Polymerasen und der Proteine
vom DnaA-Typ kann zeitlich abgestimmt werden, so dass eine Polymerase
mit hoher Genauigkeit das Selektionsmolekül z. B. auf dem Wirtchromosom
repliziert und dass eine Polymerase mit niedriger Genauigkeit die
neue Protease auf einem viralen Chromosom repliziert. Bei gewissen
Ausführungsbeispielen
kann solch ein System identische Replikationsstartpunkte haben.
-
(4) Anzahl evolutionärer Startpunkte
und Mutation von Genpopulationen
-
Etliche
unterschiedliche Verfahren können
verwendet werden, um eine Population an Genen, die neue Proteasen
exprimiert, zu entwickeln. Es können
keine evolutionären
Startpunkte, ein evolutionärer
Startpunkt und multiple evolutionäre Startpunkte verwendet werden.
-
Selektionssysteme,
die ohne evolutionäre
Startpunkte gestaltet sind, können
verwendet werden, um die gewünschten
Gene von Interesse zu selektieren, basierend einfach auf den in
den Wirt eingeführten
Selektionsmolekülen.
Solche Verfahren selektieren natürlich
vorkommende Gene in den Bestandteilen des Selektionssystems, z.
B. Gene aus der Wirtszelle oder dem Replikator. Bei diesem Verfahren
verlegt man sich mehr auf das in dem Wirt oder Replikator innewohnende
evolutionäre
Potenzial als auf das Einführen
spezifischer Molekül(e),
die als evolutionäre
Startpunkte verwendet werden. Ein anderes Verfahren, das keinen
evolutionären
Startpunkt verwendet, umfasst das Einführen einer Population an Molekülen, die
insgesamt oder teilweise stochastisch erzeugt werden und die folglich
bis dahin unbekannt sind. In diesem Fall wird das evolutionäre Potenzial
dieser stochastisch erzeugten Moleküle bei der Produktion von Genen,
die eine neue Protease exprimieren, ausgenutzt.
-
Zwei
Beispiele an Verfahren, die einen evolutionären Startpunkt nutzen, sind
jene, wo ein Fremdgen gewählt
wird und in den Wirt oder Replikator basierend auf dem evolutionären Potenzial
jenes Gens eingeführt wird,
und wo ein Gen gemeinsam mit Mitgliedern der Unterarten des Gens,
z. B. eng verwandte Varianten davon, gewählt wird.
-
Letztlich
können
multiple evolutionäre
Startpunkte genutzt werden. In diesem Fall werden multiple Gene
basierend auf ihrem evolutionären
Potenzial gewählt.
Die Gene können
so mutiert werden, dass sie in Unterarten diversifizieren. Diese
ermöglicht
die Schaffung einer neuen Genpopulation, welche heterogen ist, die
jedoch zur selben Zeit eine hoch fokussierte, rationell gestaltete
Population ist, basierend auf gewünschten evolutionären Potenzialen.
-
Als
Beispiel, bei der Entwicklung eines Katalysators mit einem bestimmten
Reaktionstyp und -spezifität
wählt man
evolutionäre
Startpunkte, die am wahrscheinlichsten das höchste evolutionäre Potenzial
haben, den gewünschten
Katalysator hervorzurufen. Man wählt
Gene, die Proteasen exprimieren, welche bereits Eigenschaften besitzen,
die ähnlich
sind mit jenen des gewünschten
Katalysators, z. B. Protease(n), mit ähnlicher Spezifität für Erkennungssequenzen
wie jene des gewünschten
Katalysators. Alternativ wählt
man Moleküle)
desselben oder eines ähnliches
Reaktionstyps (z. B. Proteolyse) wie der gewünschte Katalysator. Indem rationelle
Auswahl der Typen an evolutionären
Startpunkten gemacht wird, wird ein größeres evolutionäres Potenzial
für die
Genpopulation und deswegen eine kürzere evolutionäre Distanz,
um das gewünschte
Gen zu erreichen, erzielt, das heißt weniger Mutationen werden
benötigt,
um bei dem gewünschten
Gen anzukommen. Geeignete evolutionäre Startpunkte sind Enzyme,
Antikörper,
katalytische Antikörper,
T-Zell-Rezeptoren und MHC-Moleküle.
-
Unterschiedliche
Mutationsverfahren existieren und können alleine oder in Verbindung
miteinander verwendet werden. Ein Verfahren ist die Verwendung von
Verbindungen oder Bedingungen, die Mutationen auslösen, wie
chemische Mutagenese oder UV-Bestrahlung. Alternativ können ortsgerichtete
Mutagenesetechniken verwendet werden. Verfahren der ortsgerichteten
Mutagenese sind beschrieben in (1). Andere Verfahren, die Mutationszahl
in der Population zu erhöhen,
schließen
die Verwendung einer Replikationsmaschinerie mit niedriger Genauigkeit
und hohe Replikationsraten ein.
-
Bei
einer anderen Technik können
kurze stochastische Sequenzen von DNS um den kodierenden Bereich
des aktiven Zentrums eines Enzyms eingeführt werden und die Population
kann chemischer und/oder UV-Bestrahlung ausgesetzt werden. Diese
Population kann dann durch eine Replikationsmaschinerie mit niedriger
Genauigkeit mit einer hohen Frequenz repliziert werden, um schnell
eine hochheterogene Population zu schaffen.
-
Bei
einem anderen Beispiel werden die neuen Proteasen auf einem viralen
Genom kodiert und eine große
Population solcher Viren wird einem Mutagen(en) oder Mutationen
auslösenden
Bedingungen ausgesetzt, einschließlich, jedoch nicht begrenzt
auf in vitro stattfindende chemische Mutagenese, ortsgerichtet Mutagenese,
Rekombination, Transposition, UV- oder lichtinduzierte Mutation,
PCR-vermittelte Mutation, stochastisch erzeuge Mutation (wie beschrieben
in der UK-Spezifikation
Nr. GB 2183661 A), Replikation mit niedriger Genauigkeit und hoher
Replikationsfrequenz. Die virale Population kodiert dann für eine Vielzahl
unterschiedlicher neuer Proteasen.
-
Bei
einem anderen Beispiel wird einem nicht-lytischen Phagen, z. B.
M13, der die neue Protease kodiert, erlaubt, mit einer Polymerase
niedriger Genauigkeit zu replizieren, während DnaA nicht erzeugt wird.
Die Expression der Polymerase mit niedriger Genauigkeit wird abgeschaltet
und die Expression einer Polymerase mit hoher Genauigkeit und von
DnaA wird angeschaltet und das E.-coli-Chromosom, das die Fusion
kodiert, wird ebenfalls repliziert. Dieser Vorgang wird in einer
cyclischen Weise wiederholt, um kontinuierlich eine höhere Mutationsrate
in der neuen Proteasepopulation zu fördern.
-
(5) Andere Verfahren für die Kontrolle
des Selektionsdruckes um die gerichtete Evolution zu fördern
-
Es
ist auch günstig,
die Gene, welche die neue Proteasepopulation kodieren, zwischen
hohen und niedrigen Selektionsbedingungen oder sogar zwischen Selektionsbedingungen
und permissiven Bedingungen im Kreislauf zu führen, um die Evolution der
Gene zu fördern.
Zum Beispiel werden modifizierte Viren cyclisch zwischen zwei Stämmen von
E. coli, einem Hochselektionsdruckstamm und einem Niederselektionsdruckstamm,
inkubiert, so dass, falls marginales Wachstum in dem Hochselektionsdruckstamm
geschieht, durch die Produktion einer neuen Protease mit niedriger
Spezifität
oder niedriger Umsatzrate die Population in dem Niederselektionsdruckstamm
expandiert wird, mutiert wird und dann wiederum einem hohen Selektionsdruck
ausgesetzt wird. Dieser Zyklus wird wiederholt, um dabei zu unterstützen, die
Evolution der neuen Proteasepopulation in Richtung der gewünschten
Spezifität
zu fördern.
-
In
Abhängigkeit
von der Stabilität
des Hochselektionsdruckstammes und der Mutationsrate der Selektionsmoleküle wird
ein kontinuierliches oder ein semi-kontinuierliches System entwickelt.
In einem kontinuierlichen System werden modifizierte Viren kontinuierlich
in dem Niederselektionsdruckstamm erzeugt. Freie Virionen werden
gesammelt, mutiert und ein Teil wird in die Inkubationskammer mit
niedrigem Selektionsdruck erneut eingeführt, um die Heterogenität der neuen
Proteasepopulation über
das Maß hinaus
zu steigern, das durch die Replikation mit niedriger Genauigkeit
allein entstehen könnte.
Der Rest wird mit dem Hochselektionsdruckstamm inkubiert. Die Inkubationskammer
des Niederselektionsdruckstamms wird periodisch mit frischen Bakterien
erneut beimpft oder die Bedingungen werden so kontrolliert, dass
sie der Gestalt sind, dass die Replikationsrate jenes Stammes im
Vergleich mit jener des Virus ausreichend ist, um die bakterielle
Population aufrecht zu erhalten.
-
In
gewissen Ausführungsbeispielen,
in welchen Wachstumsfaktoren, die für die Replikation des Virus essenziell
sind, herunterreguliert werden, brauchen die Hochselektionsdruckbakterien
in einem kontinuierlichen System nicht aufgefüllt zu werden, bis eine neue
Protease mit einem gewissen Grad der gewünschten Spezifität produziert
worden ist. Dies liegt daran, dass die Infektion eines modifizierten
Virus mit einem Gen, welches eine neue Protease kodiert, das nicht
die Fähigkeit
hat, das Selektionsmolekül
zu spalten, abortiv ist. Es geschieht nur dann, wenn die Selektionskonstrukte
gespalten werden und die Funktion in der Virus-Replikationsmaschinerie
zurück
gewonnen wird, dass die Infektion durch den lytischen Zyklus fortschreitet.
Wenn erst einmal eine neue Protease mit gewissen Fähigkeiten
der gewünschten
Protease erzeugt worden ist, wird das virale Wachstum gefördert. Die
Selektion wird in Richtung der gewünschten Spezifität, Reaktionstyp
und Umsatzrate durch die kontinuierliche Zugabe von frischen Hochselektionsdruckbakterien
zu der Inkubationskammer fortgesetzt. Die hinzugefügten Hochselektionsdruckbakterien
werden direkt aus Aliquoten der Ursprungs-Hochselektionsdruckbakterien
gezogen, so dass die bakterielle Population evolutionsmäßig zurückgesetzt
wird. Alternativ dazu können
Selektionsverfahren einen nicht-lytischen
Phagen verwenden.
-
Für die gerichtete
Evolution wird die neue Proteasepopulation auf der Sequenz für eine Protease
basiert, die Eigenschaften hat, welche mit jenen des gewünschten
neuen Moleküls
am ähnlichsten
sind, z. B. Aktivität,
Spezifität,
Umsatz etc. Da in gewissen Ausführungsbeispielen
die Genpopulation, die die neue Protease kodiert, aus einer einzigen
Quelle abgeleitet werden kann, sind Mutagenese und Replikation mit
niedriger Genauigkeit wichtig für
die Entwicklung einer geeigneten heterogenen Population. Zusätzlich kann
der Selektionsdruck anpassbar und/oder cyclisch sein, um die Evolution
von Genen zu unterstützen,
welche die gewünschte
neue Protease kodieren. Andere wichtige Techniken für die Förderung
der gerichteten Evolution sind die Erhöhung der Heterogenität der neuen
Proteasepopulation durch Erhöhen
der Gesamtanzahl an Replikationen von Genen, die die Population
kodieren, und die Verwendung von Mutatorpolymerasen mit niedriger Genauigkeit.
-
Als
Beispiel, der evolutionäre
Startpunkt für
die neue Protease kann eine bestimmte Protease sein, welche eine
spezifische Sequenz erkennt, die für das System nicht schädlich ist.
In gewissen Ausführungsbeispielen
ist es jedoch vorteilhaft, multiple neue Proteasestartpunkte zu
haben. Folglich können
etliche unterschiedliche Proteasen derselben oder unterschiedlicher
Familien anfänglich
in den modifizierten Viren kodiert werden. Falls multiple neue Proteasestartpunkte
verwendet werden, dann können
Startpunkte, die in der Nähe der
gewünschten
katalytischen Aktivität
oder Spezifität
oder von beiden liegen, eingebaut werden.
-
B. Wirts-Selektionsverfahren
-
(1) Positive Selektion
-
Positive
zelluläre
Selektion kann auf einer Reihe von Wegen geschehen. In einem Beispiel
wird ein zellulärer
Wachstumsfaktor, der der Zelle einen Wachstumsvorteil verleiht,
funktionell herunterreguliert. Der herunterregulierte zelluläre Wachstumsfaktor
wird in einem Selektionsmolekül
komplexiert, so dass der Wachstumsfaktor nach der Produktion der gewünschten
neuen Protease funktionell heraufreguliert wird. Folglich geschieht
die Selektion der gewünschten
neuen Protease durch positive zelluläre Selektion.
-
Alternativ
dazu wird ein Toxin in ein Selektionsmolekül eingebaut, so dass seine
Funktion aufrechterhalten oder heraufreguliert wird. Das funktionell
aufrechterhaltene oder heraufregulierte Toxin wird in einem Selektionsmolekül komplexiert,
so dass nach der Produktion der gewünschten neuen Protease der
Wachstumsfaktor funktionell herunterreguliert wird. Die Selektion
der gewünschten
neuen Protease geschieht wiederum durch positive zelluläre Selektion.
-
Solche
positiven zellulären
Wachstumsselektionstechniken können
in einer Reihe unterschiedlicher Geräte durchgeführt werden, einschließlich Chemostaten,
Turbidostaten, in einfachen Inkubationskammern mit geeigneten Medien
und unter den richtigen Bedingungen etc.
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(2) Negative Selektion
-
Negative
zelluläre
Selektion kann auf einer Reihe an Wegen geschehen. Ein zellulärer Wachstumsfaktor,
der der Zelle einen Wachstumsvorteil verleiht, hat seine Funktion
aufrechterhalten oder heraufreguliert, wenn er in einem Selektionsmolekül komplexiert
ist. Nach der Produktion der gewünschten
neuen Protease unter Wechselwirkung derselben mit dem Selektionsmolekül, wird
der Wachstumsfaktor funktionell herunterreguliert. Folglich geschieht
die Selektion der gewünschten
neuen Protease durch negative zelluläre Selektion.
-
In
einem anderen Beispiel wird ein Toxin in ein Selektionsmolekül eingebaut,
so dass seine Funktion herunterreguliert wird. Nach der Produktion
der gewünschten
neuen Protease wird das Toxin jedoch funktionell heraufreguliert.
Wiederum geschieht die Selektion der gewünschten neuen Protease durch
negative zelluläre Selektion.
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Negative
zelluläre
Selektion wird durchgeführt
unter Verwendung von Verfahren wie Wachstum in der Anwesenheit eines
Moleküls
wie einem Antibiotikum, das vorzugsweise wachsende Zellen abtötet. Indem
die Zellen cyclisch von Antibiotika enthaltenden Medien in Wachstumsmedien,
die keine Antibiotika enthalten, überführt werden, können Zellen,
die zum Wachstum nicht in der Lage sind, selektiert werden.
-
C. Replikatorselektionsverfahren
-
(1) Positive Replikatorselektion
-
In
Ausführungsbeispielen
der Erfindung, welche die positive Selektion für Replikatoren, z. B. Viren, ausnutzen,
werden das zu isolierende, schaffende oder entwickelnde Gen und
sein Genpool oder seine Mutationen in der Population an Replikatoren
kodiert. Der viralen Population wird ermöglicht, Wirtszellen zu infizieren.
Jenen Viruspartikeln mit dem Gen, welches die neue Protease exprimiert,
werden ein bevorzugter Wachstumsvorteil (lytischer Weg) oder Integrationsvorteil
(lysogener Weg) gegeben. Falls die virale Replikation das selektierbare Merkmal
ist, kann ein Selektionsmolekül
unter Verwendung von essenziellen, in die virale Replikation verwickelten
Proteinen, die funktionell in dem Selektionsmolekül herunterreguliert
sind, gemacht werden. Ein Gen, das eine neue Protease kodiert, wird
dann basierend auf seiner Wechselwirkung mit einer Erkennungssequenz
und der resultierenden Heraufregulation des Wachstumsfaktors und
der anschließenden
viralen Replikation erhalten.
-
Positive
virale Selektion bietet eine Reihe innewohnender Vorteile. Viren
sind hocheffiziente Träger
riesiger Zahlen kodierender Sequenzen und stellen einen bequemen
Weg bereit, physikalisch kodierendes Material zu segregieren. Zusätzlich können, da
gewisse Viren ihre eigenen Replikationsmaschinerien und Replikationsstartpunkte
kodieren, Replikationssysteme mit hoher und niedriger Genauigkeit
gleichzeitig tätig
sein (eines für
das Virus und eines für
den Wirt). Viren replizieren auch mit schnelleren Geschwindigkeiten
als Bakterien. Dies ermöglicht
große
Unterschiede in der Anzahl an Replikationen pro Zeiteinheit zwischen
dem Wirt und dem Virus, was einen Unterschied in der Gesamtzahl
an Mutationen bewirken kann. Es ist deswegen möglich, positive Selektion und
Variabilität,
das heißt
hohe Mutationsrate in der Population, die das neue Molekül kodiert,
und Homogenität,
das heißt
niedrige Mutationsrate in der Population, die die Selektionsmoleküle kodiert,
zu fördern,
wodurch die Selektion nicht-nützlicher
Mutanten minimiert wird.
-
Ein
Verfahren der Erfindung, welches positive Selektion des Virus und
negative Selektion der Wirtszelle ausnutzt, kann durchgeführt werden
durch Schaffen eines modifizierten Bakteriophagen, der die neue Protease
kodiert, und eines ersten modifizierten Stammes von E. coli, welcher
das Selektionsmolekül
kodiert. Der modifizierte Phage kodiert nicht sämtliche der notwendigen Bestandteile
für seine
Replikation. Jene Replikationsbestandteile, die in dem modifizierten
Phagen nicht kodiert sind, werden in dem ersten modifizierten E.-coli-Stamm
in Selektionsmolekülen,
die deren Funktion modulieren, kodiert.
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Die
modifizierten Phagen, die die vermeintlich neuen Proteasen kodieren,
werden in einem zweiten modifizierten Stamm von E. coli vor der
Selektion mit dem ersten Stamm erzeugt. Ein modifizierter Bakteriophage,
dem entscheidende Bestandteile) für seine Replikation fehlen,
wird in einer typischen Wirtszelle nicht repliziert und deswegen
wird der zweiten Stamm, der den (die) in dem modifizierten Phagen
fehlenden Bestandteile) kodiert und produziert, geschaffen, um eine
große
Population modifizierter Phagen für die Selektion mit dem ersten
Stamm zu produzieren.
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Selektionsdruck
kann den Viren in einer kontinuierlichen oder semi-kontinuierlichen
Durchflusszellkultur auferlegt werden oder alternativ dazu können Standard-Virustests
durchgeführt
werden. Falls die Bedingungen und/oder die Verdünnungen stimmen, kann auch
negative Zellselektion verwendet werden. In diesem Fall haben die
Viren, welche das Gen tragen, das die zu isolierende, schaffende
oder entwickelnde Protease exprimiert, einen selektiven Vorteil
in den Wirtszellen, was der Wirtszelle einen selektiven Nachteil
auferlegen kann. Die für
die negative Selektion beschriebenen Verfahren können dann verwendet werden,
um hinsichtlich der infizierten Zellen zu selektieren.
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(2) Negative Replikatorselektion
mit positiver Wirts-Selektion
-
Selektion
des Gens von Interesse kann durch negative Selektion für das Replikatorwachstum und/oder
Replikation und/oder positive Selektion für das Wirtszell-Wachstum durchgeführt werden.
Es können lytische
Viren verwendet werden mit Wirtszellen, welche einen viralen Wachstumsfaktor
kodieren; welcher dem Virus einen Wachstumsfaktor verleiht, wenn
es in einem Selektionsmolekül
komplexiert wird, der jedoch dem Virus einen selektiven Nachteil
verleiht, wenn die gewünschte
neue Protease exprimiert wird und mit dem Selektionsmolekül in Wechselwirkung
tritt, um den Wachstumsfaktor freizusetzen. Solch ein Selektionsmolekül kann ein
Enzym sein, das für
die virale Replikation essenziell ist, mit einer in das Enzym eingefügten Erkennungssequenz,
welche die Aktivität
des Enzyms nicht herunterreguliert. Nach der Wechselwirkung mit
der gewünschten
neuen Protease und Abspalten der Erkennungssequenz wird das virale
Replikationsenzym funktionell herunterreguliert. Die Viren werden
negativ selektiert und die Wirtszellen machen eine positive Selektion durch.
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D. Verfahren mit multiplen
Replikatoren
-
Multiple
Replikatoren können
auch in demselben Wirt verwendet werden, das heißt die unterschiedlichen Bestandteile
des Selektionsverfahrens können
durch verschiedene Populationen an Replikatoren kodiert werden.
Zum Beispiel können
unterschiedliche Replikatoren eines oder mehre der Folgenden kodieren:
die vermeintlich neue Proteasepopulation, die Erkennungssequenz,
die Modulationseinheit, das Selektionsmolekül etc. Unterschiedliche Viren
und Plasmide können
in Verbindung miteinander verwendet werden, um eine heterogene Population
an Genen zu schaffen, die neue Proteasen kodieren.
-
Solche
Verfahren für
die Isolation, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Genes,
welches eine neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten
Wechselwirkung mit einem Substrat von Interesse in der Lage ist,
umfasst:
das Exprimieren in einer oder mehreren Populationen
an Replikatoren innerhalb einer Population an Wirtszellen von vielfachen
Kopien einer vermeintlich neuen Protease oder einer Vielzahl vermeintlich
neuer Proteasen, eines Wachstumsfaktors für eine oder mehrere dieser
Populationen an Replikatoren, welche diese neue Proteasen exprimieren,
und
ein Substrat von Interesse oder Analogon davon, das funktionell
mit diesem Wachstumsfaktor verbunden ist, und, wahlweise, eine Modulationseinheit
für diesen
Replikator-Wachstumsfaktor, und
Auferlegen von Selektionsbedingungen,
z. B. Inkubieren der Population an Wirtszellen unter Selektionsbedingungen,
um Replikatoren zu selektieren, welche eine Protease exprimieren,
die mit diesem Analogon in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität dieses
Wachstumsfaktors zu ändern.
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Die
Reihenfolge der Expression der zahlreichen Bestandteile ist eine
Frage der Wahl, ebenso wie es die relative zeitliche Abstimmung
der Expression und die Auferlegung der Selektionsbedingungen ist.
Es ist auch möglich,
wie in anderen Ausführungsbeispielen
der Erfindung, von außen
einen oder mehrere Wachstumsfaktor(en), Erkennungssequenz(en) oder
Modulationseinheit(en) hinzuzufügen.
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E. Auf Erkrankungszellen
basierende Selektion
-
Selektionsverfahren
können
auch direkt in Zellen im Erkrankungszustand durchgeführt werden.
Zum Beispiel können
Krebszellen als Wirte verwendet werden, welche ein Selektionsmolekül kodieren,
was wiederum die Selektion für
neue Proteasen mit verzögertem
Krebszellwachstum erlaubt. Im Wege der Erläuterung kann eine krebsartige
Zelle, die ein wichtiges zelluläres
Enzym bei der Kontrolle des Zellzyklus unsàuber phosphoryliert, wodurch
der krebsartige Phänotyp
hervorgerufen wird, als ein Wirt verwendet werden. Selektion kann
für neue
Proteasen durchgeführt
werden, die in der Lage sind, den krebsartigen Phänotypen
umzukehren. Die demzufolge selektierten neuen Proteasen können dann
in normalen Zellen desselben Typs wie die krebsartigen Zellen hinsichtlich
Toxizität
oder schädlichen
Nebenwirkungen untersucht werden. Die Verfahren der Erfindung können in
Zellen im Erkrankungszustand verwendet werden, um Proteasen zu selektieren,
welche den Erkrankungszustand zu normalen Phänotypen umkehren.
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F. Kontrolle der Aktivitätsspiegel
neuer Proteasen durch Kontrolle der Expressionsspiegel vermeintlich
neuer Proteasen
-
Der
Selektionsdruck für
die neue Protease kann durch Einstellen des Expressionsmaßes der
vermeintlich neuen Proteasen kontrolliert werden. Falls ein Enzym
gewünschter
Funktion entwickelt werden soll, kann man das Expressionsmaß der vermeintlich
neuen Proteasen verwenden, um die gewünschte Umsetzungsrate der neuen
Protease zu lenken. Falls für
eine hohe Umsatzrate selektiert werden soll, wird die Expression
der vermeintlich neuen Proteasen auf einem niedrigen Maß kontrolliert.
Alternativ wird, falls eine niedrige Umsatzrate gewünschte wird,
die Expression der vermeintlich neuen Proteasen auf einem hohen
Maß kontrolliert.
Sogar noch genauer, falls eine hohe Umsatzrate gewünscht wird,
kann ein Selektionsmolekül verwendet
werden, das sicherstellt, dass eine hohe Anzahl neuer Proteasereaktionsereignisse,
im Vergleich zu der Zahl in dem System zu irgendeinem Zeitpunkt
vorhandenen neuen Proteasen (unter Berücksichtigung von ebenfalls
ihrer Syntheserate und Abbaurate), pro Zeiteinheit benötigt wird,
um Selektionsfähigkeit
zu verleihen. Folglich kann Selektionsdruck durch geeignetes Einstellen
der Zahl vermeintlichr neuer Proteasen, die zu irgendeinem gegebenen
Zeitpunkt vorhanden sind, ausgeübt
werden.
-
G. Selektion gewisser
Proteasen
-
Die
Wirtszell- oder Replikatorselektionsverfahren der Erfindung können durchgeführt werden,
um neue Proteasen, die in der Lage sind, gewisse Substrate von therapeutischem
Interesse zu spalten, zu isolieren oder zu schaffen oder ihre Entwicklung
zu lenken.
-
Beispiele
solcher Erkennungssequenzen sind Epitope von Influenza-Hämagglutinin.
Die folgenden Sequenzen können
unter anderem in ein Selektionsmolekül eingebaut werden.
Stelle
A, Aminosäuren
140–146,
Lys-Arg-Gly-Pro-Gly-Ser-Gly
oder
Lys-Arq-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly
oder Lys-Arg-Gly-Pro-Asp-Asn-Gly,
oder
Stelle B, Aminosäuren
187–196,
Thr-Asp-Gln-Glu-Gln-Thr-Ser-Leu-Tyr-Val
oder
Thr-Asn-Gln-Glu-Gln-Thr-Ser-Leu-Tyr-Val
oder Thr-Asn-Lys-Glu-Gln-Thr-Asn-Leu-Tyr-Val,
oder
Stelle C; Aminosäuren
273–279,
Pro-Ile-Asp-Thr-Cys-Ile-Ser
oder
Pro-Ile-Gly-Thr-Cys-Ile-Ser
oder Pro-Ile-Asp-Thr-Cys-Ser-Ser,
oder
Aminosäuren
52–54
Cys-Asn-Asn
oder
Cys-Asp-Asn
oder Cys-Asn-Lys
-
Andere
Beispiele solcher Erkennungssequenzen sind die folgenden Stellen
von HIV-gp120
- (a) variable Region 3, Aminosäuren 271–295,
- (b) konservierte Domäne
4, Aminosäuren
392–402
Q-F-I-N-M-W-Q-E-V-G-K
- (c) konservierte Domäne
5, Aminosäuren
452–474
E-L-Y-K-Y-K-V-V-K-I-E-P-L-G-V-A-P-T-K-A-K-R-R
-
Proteasen
für Varianten
solcher Sequenzen können
erzeugt werden. Alternativ können
redundante Selektionsmoleküle
mit derselben Basenkonformation solcher Sequenzen verwendet werden,
um die Proteasen zu selektieren, die allgemein spezifisch für ihre Gesamtkonformation
sind.
-
H. Verwendung von Kombinationen
von Erkennungssequenzen und Genen, welche vermeintlich neue Proteasen
exprimieren
-
Kombinationen
aus Erkennungssequenzen und Genen, die vermeintlich neue Proteasen
exprimieren, können
verwendet werden. Zwei unterschiedliche Erkennungssequenzen können in
jedem der beiden redundanten Sätze
an Selektionsmolekülen
gemeinsam mit Genen, die zwei vermeintlich neue Proteasepopulationen
exprimieren, die durch ihre evolutionären Startpunkte unterschieden
werden, verwendet werden. Eine neue Protease wird aus der ersten
Population erhalten, welche mit einer der Erkennungssequenzen reagiert, und
eine neue Protease wird aus der anderen Population erhalten, welche
mit der anderen Erkennungssequenz reagiert.
-
In
einem anderen Beispiel wird ein Selektionsmolekül, das zwei eng verwandte Erkennungssequenzen,
A und A', einbaut,
verwendet. Es wird die Wechselwirkung mit beiden Erkennungssequenzen
durch die gewünschte
neue Protease benötigt,
um einen gewissen Grad an Selektierbarkeit zu verleihen. Selektion
kann hinsichtlich der Reaktivität
auf beide Erkennungssequenzen gleichzeitig durchgeführt werden.
Dies kann durch die Selektion einer Protease mit einer breiten Spezifität für A und
A' oder von zwei
Proteasen, eine mit einer Spezifität für A und die andere für A', geschehen. In jedem
Fall wird die Reaktivität
sowohl für
A als auch für A' gleichzeitig selektiert.
In einem ähnlichen
Verfahren können
multiple Selektionsmoleküle
verwendet werden, bei welchen ein Satz Selektionsmoleküle A enthält und ein
anderer A' in multiplen
redundanten Selektionsmolekülen
enthält.
-
I. Zellfreie Verfahren
-
Die
Erfindung kann auch in zellfreien Verfahren durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
eines zellfreien Verfahrens wird in den 3A und 3B offenbart.
-
Mit
Bezugnahme auf die 3A und 3B identifiziert
das Bezugszeichen 200 DNS, die multiple Kopien vermeintlich
neuer Proteasen oder eine Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich
neuer Proteasen kodiert. Die DNS 200 wird der Mutagenese
ausgesetzt, wodurch eine heterogene Population an DNS, die eine Vielzahl
unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen 202 kodiert,
gebildet wird. Die Population 202 wird transkribiert und
translatiert, um eine Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer
Proteasen 204 zu exprimieren. Das Bezugszeichen 206 identifiziert
eine neue Protease von Interesse in jener Population.
-
Das
Bezugszeichen 208 bezieht sich auf DNS, die ein Selektionsmolekül kodiert,
das Actin als eine Wachstums-Modulationseinheit und eine Erkennungssequenz,
welche das Substrat von Interesse ist oder repräsentiert, einschließt. Die
DNS-Population 208 wird transkribiert und translatiert,
um eine Population an Selektionsmolekülen 210 zu exprimieren.
-
Die
Population 204 vermeintlich neuer Proteasen wird dann mit
der Population an Selektionsmolekülen 210 in einem Inkubator 212 inkubiert.
Die Inkubation der vermeintlich neuen Proteasen und der Selektionsmoleküle resultiert
in enzymatischer Spaltung der Erkennungsstelle innerhalb der Selektionsmoleküle durch die
gewünschte
neue Protease 206, wodurch das Actinmonomer 214 aus
dem Selektionsmolekül
freigesetzt wird. Nachdem die Reaktion zum Abschluss gekommen ist,
wird DNase 216 zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und die
Mischung wird im Inkubator 218 für eine Zeit inkubiert, die
ausreichend ist, dem freigesetzten Actin, falls vorhanden, zu erlauben,
die DNase zu inhibieren. Ein Überschuss
der inkubierten Mischung aus dem Inkubator 212 wird bezüglich der
DNase 216 verwendet, um sicherzustellen, dass die gesamte
DNase inhibiert wird. Die Actinmonomere inhibieren die DNase, wie
gezeigt am Bezugszeichen 220. Dann, nachdem Actin inhibiert
worden ist, wird die heterogene Population mutierter DNS, die eine
Population unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen 202 kodiert,
zu der inkubierten Mischung aus der Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich
neuer Proteasen, dem actin-basierten Selektionsmolekül und DNase
hinzugefügt
und jene Mischung wird weiter im Inkubator 218 inkubiert.
Die Anwesenheit der gewünschten
neuen Protease wird durch die Anwesenheit nicht abgebauter DNS untersucht.
-
Die
DNS kann isoliert gereinigt, partitioniert, exprimiert und erneut
für die
gewünschten
Funktionen der neuen Protease untersucht werden. In einem bevorzugten
Verfahren wird die isolierte/gereinigte DNS amplifiziert, z. B.
durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und die amplifizierte
DNS wird einer oder mehreren Wiederholungen des Verfahrens ausgesetzt,
um die gewünschte
DNS zu selektieren.
-
Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
-
BEISPIEL I
-
Schaffung einer neuen
Protease(n) für
eine Decapeptidsequenz von HIV-gp120 durch die Verwendung künstlicher
Zymogene und viraler positiver Selektion
-
Beispiel
I beschreibt ein Verfahren, um eine Endopeptidase(n) zu schaffen,
die spezifisch für
eine Decapeptid-Erkennungssequenz von gp120 ist. Das Verfahren verwendet
Genfusionen, die proteinbasierte Selektionsmoleküle kodieren. Neue Proteasen,
die in einer viralen Population kodiert sind, spalten die Decapeptid-Erkennungssequenz,
wodurch Proteine freigesetzt werden, die für die virale Replikation notwendig
sind. Dieses Beispiel ist erläuternd für die virale
positive Selektion. Eine vereinfachte Darstellung ist in den 2A, 2B und 2C dargelegt.
-
E.
coli B, ein Wirtsstamm für
den Bakteriophagen T7, wird durch das Einführen eines Plasmids transformiert,
um T7-Deletionsmutanten zu vervollständigen. Zwei unterschiedliche
deletionsmutierte T7-Stämme werden
gemacht und so werden zwei korrespondierende komplementäre E.-coli-Transformanten
erzeugt, wie unten aufgelistet:
- 1) E.-coli-Transformante
1 (ET1) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das
die Sequenz für die
induzierbare Expression der T7-Gene gp1 (RNS-Polymerase), gp 4 (Primase/Helicase)
und mutiertes gp 5 (DNS-Polymerase) mit niedriger Genauigkeit und
reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt. Dieser transformierte
Wirt ermöglicht
nach der induzierten Expression dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante
(T7A) für
die Gene gp 1, 4 und 5.
- 2) E.-coli-Transformante 2 (ET2) wird mit dem E.-coli-Plasmid
pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression
der T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit
und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität und zusätzlich die
Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein) und 18 (DNS-Reifungsprotein)
trägt.
Dieser transformierte Wirt erlaubt nach der induzierten Expression
dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante (T7B) für die Gene 1, 4, 5, 10A, 13 und 18.
-
Zusätzlich werden
zwei E.-coli-Selektionstransformanten (EST1 und EST2) produziert.
Diese transformierten Zelllinien unterscheiden sich von ET1 und
ET2 dahingehend, dass die T7-Gene,
die in diesen Zellen kodiert werden, als Genfusionen komplexiert
werden. Zusätzlich
werden diese Stämme
für Proteasefehler
selektiert (z. B. Stämme
wie lon, hfl oder htpR) (1) und (20). Diese beiden Transformanten
sind unten beschrieben:
- 1) E.-coli-Selektionstransformante
1 (EST1) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das
die Sequenz für
die Expression der T7-Gene gp1, gp 4 und mutiertes gp 5 mit niedriger
Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt, wobei
sämtliche
jener Sequenzen Modulationseinheiten (strukturelle Hüllproteine
des Virions aus T4) mit sowohl ihren Amino- als auch ihren Carboxyenden
verschmolzen haben, wie umrissen in der Tabelle unten, verbunden
durch eine gp120-Protease-Erkennungssequenz.
- 2) E.-coli-Selektionstransformante 2 (EST2) wird mit dem E.-coli-Plasmid
pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression
der T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und
reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität und zusätzlich die
Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein)
und 18 (DNS-Reifungsprotein)
trägt,
wobei alle jene Sequenzen Modulationseinheiten (strukturelle Hüllproteine
der Virionen von T4) mit sowohl ihren Amino- als auch ihren Carboxyenden verschmolzen
haben, wie umrissen in der Tabelle unten, verbunden durch eine gp120-Protease-Erkennungssequenz.
-
-
Die
vollständige
Sequenz von T7 ist in (21) beleuchtet. Unter Verwendung der Information
aus der T7-Sequenz werden Primer chemisch für die PCR-vermittelte Amplifikation
der in die Plasmide einzuführenden Gene
synthetisiert. Beispiele von PCR-Primern für jedes Gen sind unten aufgelistet,
wobei die Nummern der in (21) wiedergegebenen T7-DNS-Sequenz entsprechen.
-
-
PCR-Amplifikation
jedes dieser Gene wird durch Standardtechniken wie jene, die in
(1) beschrieben sind, durchgeführt.
T7-Wildtypphagen und ihre DNS, die als eine Matrize verwendet werden,
werden durch das folgende Verfahren, wie beschrieben durch (22)
und (23), isoliert/gereinigt.
-
Die
T7-Gene werden, wenn sie erst einmal amplifiziert sind, in Plasmidvektoren
mit induzierbaren Promotoren wie p-KK177-3, einem Vektor, der den
tac-Promotor nutzt, ligiert. Der tac-Promotor wird in E.-coli-Stämmen abgeschaltet,
die hohe Spiegel des lac-Repressors exprimieren. Der Promotor wird
durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM induziert. p-KK177-3, ebenso wie
der tac-Promotor werden in (1) diskutiert. Die Ligierung der durch
PCR amplifizierten T7-Gene in ein Plasmid, das einen induzierbaren
Promotor wie p-KK177-3 enthält,
kann durch in (1) beschriebene Standard-Ligierungstechniken durchgeführt werden.
Die rekombinanten Plasmide werden dann verwendet, um einen E.-coli-B-Stamm,
der hohe Spiegel des lac-Repressors exprimiert, durch Techniken
wie Elektrotransformation oder unter Verwendung von Calciumchlorid
zu transformieren. Protokolle für
diese Techniken sind in (1) beschrieben.
-
Genfusionen
werden gewöhnlich
in der Molekularbiologie verwendet und eine Reihe unterschiedlicher Verfahren
für die
Konstruktion von β-Galactosidase-Fusionsproteinen
wurde beschrieben in (24). Diese Verfahren oder die in (1) beschriebenen
Verfahren, auf die früher
Bezug genommen wurden, werden verwendet, um ein sauber ligiertes
Selektionsmolekül
zu bilden, das zusammengesetzt ist aus einem T7-Gen mit einem T4-Hüllprotein-Strukturgen,
angeheftet an sowohl das Amino- als auch das Carboxyende, so dass
die Leseraster durch das Konstrukt hindurch aufrecht erhalten werden.
Folglich wird jedes der T7-Gene in EST1 und EST2 ohne Stopp-Codons
kodiert, die verfrüht
das Fusionsprotein beenden, oder inserierte oder deletierte Basen,
die das Leseraster verschieben. Die T4-DNS-Sequenzen können unter
Verwendung der in (25) reproduzierten T4-Genomkarte lokalisiert
und isoliert/gereinigt werden. Die benötigten Gene werden dann mit
PCR amplifiziert für
die Verwendung in Ligationsvorgängen,
wie es kürzlich
für die
T7-Gene beschrieben worden war. DNS-Moleküle, die die Fusionen kodieren,
können
dann wiederum in pKK177-3-Plasmid-DNS unter der Kontrolle des tac-Promotors
ligiert werden.
-
Die
Protease-Erkennungssequenz ist ein Decapeptid um Trp 397 des vierten
konstanten Bereichs von gp120 des HIV-Virus herum. Diese Aminosäure ist
sehr wichtig für
das Binden von gp120 an CD4, da Mutanten von gp120 an dieser Position
die CD4-Bindung abschaffen. Aus der Sequenz von gp120 aus (26) kann
eine gewünschte
proteolytische Erkennungssequenz bestimmt werden, wie FINMWQEVGK
(Phenylalanin-Isoleucin-Asparagin-Methionin-Tryptophan-Glutamin-Glutaminsäure-Valin-Glycin-Lysin).
Die kodierende Nucleotidsequenz wird aus (27) erhalten, in welcher
die Nucleotidsequenzen aus fünf
unterschiedlichen HIV-Klonen
beschrieben werden, von denen jeder Trp 397 aufweist.
-
Es
gibt wenigstens vier verschiedene Verfahren, die verwendet werden
können,
um die T7-Deletionsmutanten
zu erzeugen. Diese Verfahren schließen die Verwendung spezifischer
Restriktionsenzyme, falls dies angemessen ist, die Schaffung einzigartiger
Restriktionsstellen durch oligonucleotid-vermittelte Mutagenese, die
Deletion durch oligonucleotid-vermittelte "Loop-Out"-Mutagenese und die Erzeugung systematischer
Deletionen ein. Diese Techniken werden in (1) umrissen. Das virale
T7-Genom wird erhalten, wie kürzlich
beschrieben in (22) und (23). Die deletionsmutierten T7-Genome werden
dann in vitro unter Befolgung der Protokolle von (28) in Virionen
verpackt.
-
Die
Ausgangspopulation neuer Moleküle
wird auf etlichen bekannten Proteasen basiert. Dies berücksichtigt
etliche unterschiedliche evolutionäre Startpunkte, aus denen die
gewünschte
neue Protease entstehen kann. Die Proteasen sind HIV-Protease, Polio3C-Protease
und Subtilisin BPN'.
Die Sequenzen für
diese Proteasen wurden in E. coli eingeführt und als funktionelle Enzyme
oder als Enzyme mit funktionellem Potenzial im Zymogenzustand exprimiert
(29) und (30).
-
Um
eine große
und heterogene vermeintlich neue Proteasepopulation zu schaffen,
wird jedes Proteasegen ortsgerichteter Mutagenese ebenso wie in
vitro chemischer Mutagenese ausgesetzt. Verfahren für ortsgerichtete
Mutagenese sind gegeben in (1). Verfahren für in vitro chemische Mutagenese
sind ebenfalls in (1) gegeben.
-
Die
mutierten neuen Proteasesequenzen werden dann durch früher diskutierte
Verfahren mit einem Promotor wie die PR- oder PL-Promotoren des
Bakteriophagen Lambda (für
die Verwendung in Wirten, die keinen Lambda-Repressor exprimieren,
um die neue Molekülproduktion
herunter zu regulieren) oder einem T7-Promotor ligiert. Die Population
aus Promotor und neuem Molekül
wird dann unter Befolgung der obigen Vorgänge in eine deletionsmutierte
T7-A-Population ligiert, die in ET1-Wirtszellen wachsen gelassen
wurde. Wenn dieses Vorgehen einmal vervollständigt ist, wird eine heterogene
deletionsmutierte T7-A-Population
erzeugt, die hochheterogen auf Grund der Tatsàche ist, dass sie einen heterogenen
mutierten Pool neuer Moleküle
kodiert. Auf diese Population wird unten Bezug genommen als T7A/neues
Molekül.
-
Die
T7A/neues-Molekül-Population
wird dann auf ET1 Wirtszellen herangezogen und auf EST1-Wirtszellen übertragen.
Die EST1-Wirtszellen für
die T7A/neues-Molekül-Population
werden in der stationären, nicht
replizierenden Wachstumsphase gehalten. Nur jene T7A/neues-Molekül-Virionen,
die in der Lage sind, eine neue Protease zu produzieren, welche
die gp1-, gp-4-
und gp-5-Funktion durch Abspalten der gp120-Decapeptid-Protease-Erkennungssequenz
wiederherstellt, sind dann fähig,
die strukturellen Hüllproteingruppen des
T4-Virions aus dem Selektionsmolekül freizusetzen, wodurch das
Wachstum in diesen Zellen ermöglicht wird.
T7A/neues Molekül
werden in einer kontinuierlichen Weise unter Verwendung eines Zellstaten,
wie beschrieben in (31), oder in einem semi-kontinuierlichen Batch-Vorgang,
wobei wiederholte Aliquoten des T7A/neuen Moleküls zu den EST1-Wirten hinzugefügt werden,
hinzugefügt.
Wenn erst einmal die virale Replikation geschieht, werden die resultierenden
Virionen geerntet und ihre DNS wird isoliert/gereinigt, wie beschrieben
in (22) und (23). Die neue Proteasesequenz wird entweder durch PCR-Amplifikation
erhalten, falls die Erkennungssequenzen der Primer nicht untragbar
mutiert worden sind, durch Isolation/Reinigung der Fragmente des
T7/neue-Protease-Gens,
die in der Lage sind, mit neue Proteasen vom Wildtyp kodierender
DNS zu hybridisieren, oder durch Isolation/Reinigung von Fragmenten,
die in der Lage sind, Proteasen mit der gewünschten Funktion zu exprimieren.
-
Die
Sequenz, die für
die Protease aus dem T7/neues-Molekül-Virion kodiert, das zum Wachstum
in EST1 in der Lage ist, wird dann in irgendeiner Anzahl von Expressionssystemen
exprimiert, (1), und die Protease kann dann genauer funktionell
charakterisiert werden. Falls weitere Selektion notwendig ist, wird
die Sequenz für
die neue Protease aus dem T7A/neues-Molekül-Virion, das zum Wachstum
in EST1 in der Lage ist, in T7B ligiert. Dementsprechende Vorgänge werden
durchgeführt,
wie zuvor, mit der Ausnahme, dass T7B anstelle von T7A verwendet
wird, ET2 anstelle von ET1 verwendet wird und EST2 anstelle von
EST1 verwendet werden wird.
-
Das
Vorgehen von Beispiel I erlaubt folglich die Entwicklung von neuen
Proteasen, die für
die Decapeptid-Sequenz von gp120 spezifisch sind.
-
BEISPIEL II
-
Schaffung einer neuen
Protease(n) für β-Galactosidase
durch die Verwendung künstlicher
Zymogene
-
Beispiel
II beschreibt ein Verfahren zur Schaffung von Endopeptidase(n) mit
einem Spezifitätsbereich für Erkennungssequenzen
um den Carboxyterminus von β-Galactosidase
herum. Das Verfahren verwendet eine Genfusion, die β-Galactosidase
und ein T7-Gen involviert.
-
Das
Selektionsvorgehen wird auf einem neuen Molekül (Protease) basiert, das die β-Galactosidase spaltet,
welche die für
die virale Replikation notwendige T7-Produktfunktion herauf reguliert.
Deswegen repräsentiert
dieses Beispiel ein positives virales Selektionsvorgehen. Das Vorgehen
ist allgemein in den 2A, 2B und 2C wiedergegeben.
-
Genauer
wird β-Galactosidase
in dem korrekten Leseraster an den Aminoterminus jedes der T7-Gene, die
in EST1 und EST2 kodiert sind, ohne Stopp-Codons, welche das Fusionsprotein
verführt
beenden, ligiert. Die DNS, welche die Fusionen kodieren, werden
dann in das pKK177-3-Plasmid
unter der Kontrolle des tac-Promotors inseriert.
-
E.
coli B, ein Wirtsstamm für
den Bakteriophagen T7, wird durch das Einführen von Plasmiden, welche T7-Gene
kodieren, transformiert, um T7-Deletionsmutanten zu vervollständigen.
Dies berücksichtigt
das Wachstum und die Amplifikation dieser T7-Deletionsmutanten. Zwei unterschiedliche
deletionsmutierte T7-Stämme
werden gemacht und so werden zwei korrespondierende komplementäre E.-coli-Transformanten produziert,
wie beschrieben in Beispiel I. Zusätzlich werden dann die korrespondieren
Selektionsstämme, EST1
und EST2, jedoch mit β-Galactosidase
an den Aminotermini der verwendeten T7-Gene verschmolzen, in den
Selektionsvorgängen
genutzt.
-
Es
liegen keine Beschränkungen
auf den Proteasen, andere als die, genügend β-Galactosidase zu spalten, um die Funktion
der T7-Gene in den Konstrukten freizusetzen.
-
Diesbezüglich ist
die gewünschte
neue Protease "semi-spezifisch". Die Protease selber
kann jedoch für
eine bestimmte Erkennungssequenz spezifisch sein. Ein Fachmann würde erkennen,
dass diese Technik verwendet werden könnte, um Proteasen mit einer
Spezifität
für Erkennungssequenzen
mit anderen Proteinen als β-Galactosidase
zu entwickeln.
- 1) E.-coli-Transformante 1 (ET1)
wird mit dem E.-coli-Plasmid PKK177-3 transformiert, das die Sequenz
für die
induzierbare Expression der T7-Gene gp1 (RNS-Polymerase), gp 4 (Primase/Helicase)
und mutiertes gp 5 (DNS-Polymerase) mit niedriger Genauigkeit und
reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt. Dieser transformierte
Wirt erlaubt nach der induzierten Expression dieser Gene das Wachstum
einer T7-Deletionsmutante (T7A) für die Gene gp 1, 4 und 5.
- 2) E.-coli-Transformante 2 (ET2) wird mit dem E.-coli-Plasmid
pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression
der T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit
und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität und zusätzlich die
Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein) und 18 (DNS-Reifungsprotein)
trägt.
Dieser transformierte Wirt erlaubt nach der induzierten Expression
dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante (T7B) für die Gene 1, 4, 5, 10A, 13 und 18.
-
Zusätzlich werden
zwei E.-coli-Selektionstransformanten (EST1 und EST2) produziert.
Diese transformierten Zelllinien unterscheiden sich von ET1 und
ET2 dahingehend, dass die T7-Gene,
die in diesen Zellen kodiert werden, als Genfusionen komplexiert
werden. Zusätzlich
werden diese Stämme
für Proteasefehler
selektiert (z. B. Stämme
wie lon, hf1 oder htpR) (1) und (20). Diese beiden Transformanten
werden unten beschrieben:
- 1) E.-coli-Selektionstransformante
1 (EST1) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das
die Sequenz für
die T7-Gene gp1, gp 4 und mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit
und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt, wobei
jedes davon mit β-Galactosidase ligiert
wird, so dass nach der Expression die Modulationseinheit β-Galactosidase
mit ihren Aminoenden verschmolzen wird.
- 2) E.-coli-Selektionstransformante 2 (EST2) wird mit dem E.-coli-Plasmid
pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes
gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonuclease
und zusätzlich
die Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein)
und 18 (DNS-Reifungsprotein) trägt, wobei jedes davon mit β-Galactosidase ligiert
wird, so dass nach der Expression die Modulationseinheit der β-Galactosidase mit
ihren Aminoenden verschmolzen wird.
-
Die
vollständige
Sequenz von T7 wird in (21) beleuchtet. Unter Verwendung der Information
aus der T7-Sequenz können
Primer für
die PCR-vermittelte Amplifikation der in die Plasmide einzuführenden
Gene chemisch synthetisiert werden. Beispiele an PCR-Primern für jedes
Gen sind unten aufgelistet, wobei die Nummer der in (21) gegebenen
T7-DNS-Sequenz entspricht.
-
-
PCR-Amplifikation
jedes dieser Gene kann durch Standardtechniken wie jene in (1) beschriebenen durchgeführt werden.
T7-Wildtypphagen und ihre DNS, welche als eine Matrize verwendet
werden wird, können
durch die folgenden Verfahren isoliert/gereinigt werden, wie beschrieben
durch (22) und (23).
-
Die
T7-Gene, wenn sie erst einmal amplifiziert sind, können in
Plasmidvektoren mit induzierbaren Promotoren wie p-KK177-3, einem
Vektor, der den tac-Promotor nutzt, ligiert werden. Der tac-Promotor
wird in E.-coli-Stämmen
abgeschaltet, welche hohe Spiegel des lac-Repressors exprimieren. Der Promotor
wird durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) auf eine
Endkonzentration von 1 mM induziert. p-KK177-3 ebenso wie der tac-Promotor
werden in (1) diskutiert. Ligation der durch PCR amplifizierten
T7-Gene in ein Plasmid, das einen induzierbaren Promotor wie p-KK177-3
enthält,
kann durch in (1) beschriebene Standard-Ligationsstechniken durchgeführt werden.
Die rekombinanten Plasmide werden dann verwendet, um einen E.-coli-B-Stamm,
der hohe Spiegel des lac-Repressors exprimiert, durch Techniken
wie Elektrotransformation oder unter Verwendung von Calciumchlorid
zu transformieren. Protokolle für
diese Techniken werden in (1) beschrieben.
-
β-Galactosidase
ist ein in der Molekularbiologie üblicherweise verwendetes Gen
und eine Reihe unterschiedlicher Verfahren für die Konstruktion von β-Galactosidase-Fusionsproteinen
wurden beschrieben (24). Diese Verfahren oder die in (1) beschriebenen
Verfahren, auf die früher
Bezug genommen worden ist, können
verwendet werden, um eine in dem korrekten Leseraster an den Aminoterminus
jedes der T7-Gene sauber ligierte β-Galactosidase zu bilden, die
in EST1 und EST2 ohne Stopp-Codons, welche das Fusionsprotein frühzeitig
beenden, codiert werden. Die Fusionen kodierender DNS-Moleküle können dann
wiederum in pKK177-3-Plasmid-DNS unter der Kontrolle des tac-Promotors
ligiert werden.
-
Es
gibt wenigstens vier unterschiedliche Verfahren, die verwendet werden
können,
um die T7-Deletionsmutanten zu erzeugen. Diese Verfahren schließen die
Verwendung spezifischer Restriktionsenzyme, falls geeignet, die
Schaffung geeigneter Restriktionsstellen durch oligonucleotid-vermittelte
Mutagenese, die Deletion durch oligonucleotid-vermittelte "Loop-Out"-Mutagenese und die Schaffung systematischer
Deletionen ein. Diese Techniken werden in (1) umrissen. Das virale
T7-Genom wird erhalten, wie kürzlich
beschrieben in (22) und (23). Die deletionsmutierten T7-Genome werden
dann sauber in vitro unter Befolgung der Protokolle von (28) in
Virionen verpackt.
-
Die
Population neuer Moleküle
wird auf zahlreichen bekannten Proteasen basiert. Dies berücksichtigt etliche
unterschiedliche evolutionäre
Startpunkte, aus welchen die gewünschte
neue Protease entstehen könnte.
Die zu verwendenden Proteasen sind HIV-Protease, Polio3C-Protease
und Subtilisin-BPN'.
Die Sequenzen für
diese Proteasen wurden in E. coli eingeführt und als funktionelle Enzyme
oder als Enzyme mit funktionellem Potenzial exprimiert, (29) und
(30).
-
Um
eine große
und heterogene vermeintlich neue Proteasepopulation zu erzeugen,
wird jedes Proteasegen ortsgerichteter Mutagenese ebenso wie in
vitro chemischer Mutagenese ausgesetzt. Verfahren für die ortsgerichtete
Mutagenese und Verfahren für
die in vitro chemische Mutagenese werden in (1) gegeben.
-
Die
mutierten neuen Moleküle
werden dann in einen Promotor wie die PR- oder PL-Promotoren des Bakteriophagen
Lambda (für
die Verwendung in Wirten, die keinen Lambda-Repressor exprimieren, um die Produktion
neuer Moleküle
herunter zu regulieren) oder in einen T7-Promotor unter Verwendung
der früher
diskutierten Verfahren ligiert. Die Population aus Promotor/neues
Molekül
wird dann in die deletionsmutierte T7-A-Population, die in ET1-Wirtszellen wachsen
gelassen wurde, nach den obigen Vorgängen ligiert. Wenn dieses Verfahren
einmal vervollständigt
worden ist, wird eine heterogene deletionsmutierte T7-A-Population (T7A/neues
Molekül)
produziert, welche hochheterogen ist auf Grund der Tatsache, dass
sie einen heterogenen mutierten Pool neuer Moleküle kodiert.
-
Die
Population aus T7A/neues Molekül
wird dann auf ET1 Wirtszellen herangezogen und auf EST1-Wirtszellen übertragen.
Die EST1-Wirtszellen für
die Population aus T7A/neues Molekül werden in der stationären, nicht
replizierenden Wachstumsphase gehalten. Nur jene T7A/neues-Molekül-Virionen,
die in der Lage sind, eine neue Protease zu produzieren, welche
die gp1-, gp-4- und gp-5-Funktion durch Abspalten der β-Galactosidasegruppen
von dem Selektionsmolekül
wiederherstellt, sind fähig,
in diesen Wirten zu wachsen. Die T7A/neues-Molekül-Virionen werden in einer
kontinuierlichen Weise unter Verwendung eines Zellstaten, wie beschrieben
in (31), oder in einem semi-kontinuierlichen Batch-Vorgang, wobei
wiederholte Aliquoten der T7A/neues-Molekül-Virionen zu den EST1-Wirten
hinzugefügt
werden, hinzugefügt.
Wenn erst einmal die virale Replikation geschieht, werden die resultierenden
Virionen geerntet und ihre DNS wird isoliert/gereinigt, wie beschrieben
durch (22) und (23). Die Sequenz des neuen Moleküls wird entweder durch PCR-Amplifikation erhalten,
falls die Erkennungssequenzen der Primer nicht verbotenerweise mutiert
worden sind, durch Isolation/Reinigung der Fragmente des T7/neuen-Proteasegens,
die in der Lage sind, mit DNS, die neue Moleküle vom Wildtyp kodiert, zu
hybridisieren, oder durch Isolation/Reinigung von Fragmenten, die
in der Lage sind, Proteasen mit der gewünschten Funktion zu exprimieren.
Die Sequenz, die die Protease aus dem T7/neues-Molekül-Virion
kodiert, das in der Lage ist, in EST1 zu wachsen, wird dann in irgendeiner
einer Anzahl an Expressionssystemen exprimiert, (1), und die Protease
kann dann genauer funktionell charakterisiert werden. Falls weitere
Selektion notwendig ist, wird die Sequenz für das neue Molekül aus dem
T7A/neues-Molekül-Virion,
das in der Lage ist, in EST1 zu wachsen, in T7B ligiert. Folglich
werden Vorgänge
durchgeführt,
wie zuvor, mit der Ausnahme, dass T7B anstelle von T7A verwendet
wird, ET2 anstelle von ET1 verwendet wird und EST2 anstelle von
EST1 verwendet wird.
-
Dieses
Vorgehen ermöglicht
die Entwicklung einer Protease, die allgemein spezifisch ist, um
den carboxyterminalen Bereich von β-Galactosidase abzuspalten.
-
BEISPIEL III
-
Verfahren um neue Protease(n)
die spezifisch für
ein Epitop von Influenza-Hämagglutinin
ist (sind), zu selektieren
-
Beispiel
III beschreibt ein Verfahren, eine Endopeptidase zu schaffen, welche
spezifisch eine Heptapeptid-Sequenz der Stelle A des Influenza-Hämagglutinins
(HA) (Aminosäuren
140 bis 146) spaltet (32). Das Verfahren verwendet Genfusionen,
einschließend
T7-Gene (deren Funktion herunterreguliert wird, wenn sie in der
Fusion komplexiert sind) und Gene von anderen Bakteriophagen. Das
Selektionsvorgehen wird auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert, das
die Influenza-HA-Heptapeptid-Erkennungssequenz abspaltet und dadurch
die Funktion des T7-Produktes, das für die virale Replikation notwendig
ist, heraufreguliert. Dieses Beispiel stellt ein positives virales
Selektionsvorgehen dar. Eine vereinfachte Darstellung des Verfahrens
erscheint in den 2A, 2B und 2C.
-
Die
Heptapeptid-Erkennungssequenz ist aus den Aminosäuren 140 bis 146 eines Influenza-HA, AICHI/2/68, zusammengesetzt.
Die Sequenz ist Lys-Arg-Gly-Pro-Gly-Ser-Gly. Zwei Stämme EST1*
und EST2* werden erzeugt, welche die Heptapeptidsequenz als Erkennungslinker
kodiert, verwendet in der Art, in welcher die Faktor-X-Erkennungssequenz
(33) und das V8-Erkennungssequenzsystem
(34) verwendet werden. Zusätzlich
werden dieses Stämme
dahingehend selektiert, dass sie protease-effizient sind. In diesen
Systemen werden spezifische Sequenzen für bestimmte Proteasen zwischen
zwei zu spaltende Gene platziert. Die Konstrukte für EST1*
und EST2* werden auf den in Beispiel 1 beschriebenen EST1 und EST2
basiert, jedoch mit der oben beschriebenen spezifischen Influenza-HA-Heptapeptidsequenz.
Die Fusionen und neuen Proteasepopulationen werden, wie früher beschrieben,
konstruiert und exprimiert. Es wird dann ähnlichen Selektionsprotokollen
gefolgt.
-
Folglich
werden die T7-Gene nach der Produktion eines neuen Moleküls, das
zur Spaltung des Influenza-HA-Heptapeptids in der Lage ist, aus
ihren Konstrukten freigesetzt. Da die Heptapeptid-Erkennungssequenz
die einzige gemeinsame Sequenz zwischen sämtlichen Fusionen ist, wird
die Selektion der neuen Protease in Richtung zu Proteasen gelenkt,
die nur für
das Influenza-HA-Heptapeptid spezifisch sind. Als Erstes werden
neue Proteasen auf EST1* selektiert, gefolgt von der Selektion auf
EST2*, wie beschrieben in Beispiel 1 für EST1 und EST2. Die in T7B
getragenen resultierenden neuen Proteasen werden isoliert/gereinigt
und charakterisiert. Ein Fachmann wird realisieren, dass diese Technik
verwendet werden kann, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen
zu entwickeln, anders als jene in diesem Beispiel verwendeten.
-
BEISPIEL IV
-
Ein Verfahren
zur Schaffung einer neuen Endopeptidase unter Verwendung von positiver
zellulärer
Selektion
-
Beispiel
IV beschreibt ein Verfahren zur Schaffung einer Endopeptidase, welche
spezifisch eine Decapeptid-Sequenz von gp120 spaltet. Eine vereinfachte
Darstellung erscheint in den 1A und 1B.
-
Das
Verfahren verwendet Genfusionen, die drei zelluläre Gene, Aspartattranscarbamoylase,
Glutaminsynthetase und Tryptophansynthetase (deren Funktionen heruntermoduliert
werden, wenn sie in der Fusion komplexiert sind), in Selektionsmolekülen mit
zahlreichen Genen aus anderen Bakteriophagen involviert. Das Selektionsvorgehen
ist auf einem neuen Molekül
(Endoprotease) basiert, die die gp120-Decapeptid-Erkennungssequenz
abspaltet und folglich die Funktionen der drei zellulären Gene
heraufreguliert und deshalb den Zellen, die die Endopeptidase mit
der gewünschten
Funktion enthalten, einen Wachstumsfaktor unter Selektionsbedingungen
verleiht. Dieses Beispiel stellt ein positives zelluläres Selektionsvorgehen
dar.
-
Die
Gene für
die Virionenhüllproteine 24 und 28 des
Bakteriophagen T4 werden jeweils mit den Amino- und Carboxyenden
der Glutaminsynthetase durch eine Proteasepeptid-Erkennungssequenz von gp120, das in
Beispiel I verwendet worden ist, verschmolzen. Ähnliche Virionenhüllproteine 27 und 20 werden
mit dem gp120-Linker jeweils mit den Amino- und Carboxyenden der
Alpha-Untereinheit der Tryptophansynthetase verschmolzen und das
Gen 12 von T7 und das Gen F von phiXl74 werden mit dem
gp120-Linker jeweils mit den Amino- und Carboxyenden der Beta-Untereinheit
der Tryptophansynthetase verschmolzen. Zuletzt werden Proteine der
Gene 23 und 15 des Bakteriophagen T4 mit dem gp120-Linker
an jeweils die Amino- und Carboxyenden
der katalytischen Untereinheit der Aspartattranscarbamoylase verschmolzen und
Proteine des Gens 27 des Bakteriophagen T4 und des Gens 16 des
Bakteriophagen T7 werden mit dem gp120-Linker an den jeweiligen
Amino- und Carboxyenden der regulatorischen Untereinheit der Aspartattranscarbamoylase verschmolzen.
Aspartattranscarbamoylase katalysiert die Bildung von N-Carbamoylaspartat
aus Carbamoylphosphat und Aspartat.
-
Diese
Konstrukte können
mit geeigneten Promotoren hergestellt und unter Verwendung von in
Beispiel I beschriebenen Ligierungstechniken exprimiert werden und
dann in das E.-coli-Chromosom
eines E.-coli-Stammes eingebaut werden, der eine Deletionsmutante
für die
Aspartattranscarbamoylase-, Glutaminsynthetase- und Tryptophansynthetasegene
ist. Diese E. coli werden zusätzlich
auf das Erfordernis funktionell aktiver Aspartattranscarbamoylase,
Glutaminsynthetase und Tryptophansynthetase für effizientes Wachstum selektiert
und werden auch selektiert für
Proteasedefizienz.
-
Diese
E. coli werden dann in glutamin-, tryptophan- und pyrimidinreichem
Medium wachsen gelassen. Die neuen Molekülgene, basierend auf den drei
Proteasen aus Beispiel I, werden mutiert wie zuvor. In diesem Beispiel
wird jedoch die resultierende heterogene Population an Genen, welche
vermeintlich neue Moleküle exprimieren,
in ein Plasmid mit hoher Kopienzahl wie die PUC-Vektoren (z. B.
pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119), beschrieben in (1), ligiert, das
unter der Kontrolle einer mutierten T7-Replikationsmaschinerie mit
geringer Genauigkeit steht. Plasmide, deren Replikation sich unter
der Kontrolle der T7-Replikationsmaschinerie befindet,
sind beschrieben in (37).
-
In
diesem Beispiel kodiert das Plasmid multiple neue Molekülgene pro
Plasmid ebenso wie die für
die T7-Replikation benötigten
Gene (38) mit der mutierten DNS-Polymerase von Gen 5. Dies ermöglicht einer
differenziellen Mutationsrate zwischen der Population an DNS, die
die Konstrukte auf dem E.-coli-Chromosom kodiert, und der vermeintlichen
Population an neuen Molekülen,
die auf dem Plasmid kodiert sind, zu existieren. Selektion wird
dann in glutamin-, tryptophan- und pyrimidin-begrenzenden Medien
in einem Chemostaten, wie beschrieben in (39) und (40), durchgeführt. Der
Selektionsdruck wird dann zwischen Umgebungen mit hohem und niedrigem
Selektionsdruck in dem Chemostaten cyclisiert (z. B. niedrige Spiegel
an Glutamin, Tryptophan und Pyrimidinen in den Medien für einen
hohen Selektionsdruck und hohe Spiegel an Glutamin, Tryptophan und
Pyrimidinen in den Medien für
einen niedrigen Selektionsdruck), wie in (41) beschrieben, um auf unterschiedliche
Unterarten der Gene zu selektieren, was wiederum dabei hilft, Mutanten
mit einer höheren Aktivität für eine gewünschte Reaktion
zu erhalten.
-
Schließlich kann
evolutionäres
Zurücksetzen
verwendet werden, um weiter die Selektionsmolekülkonstrukte über die
Zeit zu stabilisieren. Während
der Inkubation werden Zellen periodisch auf ihre Fähigkeit,
in drei unterschiedlichen Medien, pyrimidin-begrenzenden Medien,
enthaltend Glutamin und Tryptophan (Test für eine Mutation, die Aspartattranscarbamoylasefunktion
hervorruft), glutamin-begrenzende Medien, die Pyrimidine und Tryptophan
enthalten (Test für
eine Mutation, die Glutaminsynthetasefunktion hervorruft) und tryptophan-begrenzende
Medien, enthaltend Pyrimidine und Glutamin (Test für Mutation,
die Tryptophansynthetasefunktion hervorruft), zu wachsen, untersucht.
Unter Verwendung dieser Verfahren kann die Bildung nicht-nützlicher
Mutanten getestet werden.
-
Jedes
Mal, wenn von einer Selektionsmolekülmutante gefunden wird, dass
sie vorkommt, werden die Plasmide isoliert/gereinigt, wie in vorangegangenen
Beispielen beschrieben, und dann verwendet, um eine Aliquote der
E. coli, die das Ausgangsselektionsmolekül kodieren, zu transformieren.
Dies erlaubt es, die Selektionsmolekülkonstrukte evolutionsmäßig zurückzusetzen,
während
der evolutionäre
Fortschritt der neuen Molekül-Population
beibehalten wird. Die zurückgesetzte
Population kann in den Chemostaten erneut eingeführt werden. Wenn das neue Molekül der beschriebenen
Spezifität
exprimiert wird, werden jene Zellen, die das Gen tragen, welches
das gewünschte
neue Molekül
kodiert, in dem Chemostaten selektiert und das Plasmid, das das
neue Molekül
trägt,
kann, wie früher
beschrieben, isoliert/gereinigt werden.
-
Andere
Enzyme oder Pfade, die in der Lage sind, den Bedarf für die durch
Aspartattranscarbamoylase, Glutaminsynthetase und Tryptophansynthetase
synthetisierten Verbindungen aufzubauen oder abzuschaffen, sollten,
vorzugsweise durch Deletion, nicht-funktionellgemacht werden. Zum Beispiel
sollten Deletionsmutanten der Glutamin-Ketosäure-Transaminase verwendet werden, da das
Enzym die Synthese von Glutamin aus zwei 2-Ketoglutamat katalysiert. Ebenfalls
sollte es keinen Mechanismus für
die Synthese von Tryptophan aus Indolpyruvat oder Serin geben. Die
gewünschte
Wirtszelle für
die Selektion wird nur effizient wachsen, wenn Glutamin, Tryptophan
und Pyrimidine zu dem Medium hinzugefügt werden. Nach der Selektion
werden die Gene für
die Endoprotease von Interesse isoliert/gereinigt, kloniert und
ihre Expressionsprodukte werden charakterisiert.
-
Ein
Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann,
um Proteasen mit einer Spezifität
für Erkennungssequenzen,
anders als die in dem Beispiel verwendeten, zu entwickeln.
-
BEISPIEL V
-
Ein Verfahren zur Schaffung
einer neuen Endopeptidase unter Verwendung von negativer zellulärer Selektion
-
Beispiel
V beschreibt ein Verfahren, zur Schaffung einer Endopeptidase, welche
spezifisch eine Decapeptidsequenz von gp120 mit einer niedrigeren
Umsatzrate als die Wildtyp-HIV-Protease
spaltet. Das Verfahren nutzt eine rekombinante β-Galactosidase mit einer Decapeptid-Erkennungssequenz.
Das Selektionsvorgehen wird auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert,
das eine gp120-Decapeptid-Erkennungssequenz spaltet und folglich
die β-Galactosidaseaktivität herunterreguliert
und deswegen den Zellen, welche die Endopeptidase mit der gewünschten
HIV-Proteaseaktivität
enthalten, einen Wachstumsnachteil unter Selektionsbedingungen verleiht.
Das Beispiel stellt ein negatives zelluläres Selektionsvorgehen dar.
-
Es
gibt viele bekannte einzelne Aminosäureänderungen der HIV-Protease,
die in der Lage sind, die Protease enzymatisch inaktiv zu machen,
(5) und (42). Eine dieser inaktiven Fehlsinn-HIV-Proteasen oder ein Cocktail von
jenen werden mutiert. Dieses Beispiel nutzt enzymatischaktive β-Galactosidase,
die eine HIV-Protease-Decapeptid-Erkennungssequenz enthält, welche
nach der Spaltung das β-Galactosidasemolekül inaktiv macht
(29).
-
Es
werden Stämme
unter Befolgung der Protokolle aus (29) für die Produktion des E.-coli-MC1061-Stammes entwickelt,
welcher Plasmide enthält,
die das β-Galactosidasekonstrukt
und eine mutierte inaktive HIV-Protease (z. B. Asp-29→Gly) tragen.
Als Erstes werden unter Verwendung dieser Verfahren Stämme produziert,
die eine der in (5) oder (42) beschriebenen inaktiven HIV-Proteasemutanten
oder Kombinationen von mehr als einer von diesen tragen. Diese Zelllinien
werden dann wachsen gelassen, um die Isolation/Reinigung der Plasmide
zu erlauben, (1). Die Plasmid-DNS wird dann der Mutagenese ausgesetzt,
wie früher
beschrieben, (1), oder durch Transfizieren der Plasmide in Stämme wie
E.-coli-Stamm LE30 mutD, die hohe Mutationsraten haben (42).
-
Dann
werden die mutierten Plasmide in den E.-coli-Stamm MC1061 transfiziert
(1), welcher das gewünschte β-Galactosidasekonstrukt
trägt (29).
Diese Zellen werden dann für
negatives zelluläres
Wachstum selektiert, wie beschrieben in (43).
-
Ein
Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann,
um Proteasen zu entwickeln, mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen, anders
als die in dem Beispiel verwendete.
-
BEISPIEL VI
-
Ein Verfahren zur Schaffung
einer neuen Endopeptidase unter Verwendung von positiver zellulärer Selektion
-
Beispiel
VI beschreibt ein Verfahren, eine Endopeptidase zu erhalten, welche
spezifisch eine Decapeptidsequenz von gp120 mit einer niedrigeren
Umsatzrate als Wildtyp-HIV-Protease spaltet. Das Verfahren nutzt
ein Fusionsprotein der katalytischen Untereinheit von Aspartattranscarbamoylase.
Das Selektionsvorgehen ist auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert, das
eine gp120-Decapeptid-Erkennungssequenz spaltet und die Aspartattranscarbamoylaseaktivität heraufreguliert
und deswegen den Zellen, welche die Endopeptidase mit der gewünschten
HIV-Proteaseaktivität
enthalten, einen Wachstumsvorteil unter Selektionsbedingungen verleiht.
Das Beispiel stellt ein positives zelluläres Selektionsvorgehen dar.
-
Wie
in dem vorangegangenen Beispiel werden Moleküle mit HIV-Proteasefunktion
aus einer oder einer Kombination an Einzel-Aminosäuremutanten
der HIV-Protease, die enzymatisch inaktiv sind und die der Mutagenese
unterzogen worden sind (wie oben beschrieben), erhalten. In diesem
Beispiel wird jedoch eine Fusion aus der katalytischen Untereinheit
von Aspartattranscarbamoylase, an deren Aminoende durch das HIV-Protease-Erkennungs-Decapeptid aus (29) β-Galactosidase
angeheftet ist, und dem Gen 10 (Capsidprotein) aus dem
Bakteriophagen T7, angeheftet an ihr Carboxyende durch das HIV-Protease-Erkennungs-Decapeptid (1), geschaffen.
-
Die
mutierte Population an HIV-Fehlsinn-Mutanten wird in modifizierte
MC1061-Zellen transfiziert, welche Deletionsmutanten für die katalytische
Untereinheit der Aspartattranscarbamoylase sind und welche die Aspartattranscarbamoylasefusion
enthalten, die auf dem Wirtschromosom unter Verwendung von in den
vorangegangenen Beispielen beschriebenen Techniken genau gefördert wird.
Zusätzlich
werden diese Wirtszellen für
das Erfordernis einer funktionellen Aspartattranscarbamoylase für effizientes
Wachstum selektiert und werden selektiert für Proteasedefizienz. Die Selektion
für die
Expression von Molekülen,
die in der Lage sind, die Fusion zu spalten und die enzymatische
Aktivität
der Aspartattranscarbamoylase freizusetzen, wird dann in einem Chemostaten
durchgeführt
(39). Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann,
um Proteasen mit einer Spezifität
für Erkennungssequenzen,
anders als die in dem Beispiel verwendeten, zu entwickeln.
-
BEISPIEL VII
-
Ein Verfahren zur Schaffung
einer neuen HIV-Protease unter Verwendung von negativer zellulärer Selektion
-
Dieses
Beispiel ist ähnlich
wie Beispiel V. In diesem Beispiel wird jedoch Wildtyp-HIV-Protease als ein Startpunkt
anstelle von enzymatisch inaktiven Fehlsinn-Mutanten verwendet.
Zusätzlich
wird die HIV-Decapeptid-Erkennungssequenz zu einer der folgenden
Sequenzen geändert,
von denen jede in einem gesonderten Selektionslauf parallel verwendet
werden soll: Tabelle
1. Relative Spaltung von HIV-Peptidsubstraten
- IN
- Integraseprotein.
-
Von
den Sequenzen von BI-P-140, BI-P-138, BI-P-144, BI-P-127 und BI-P-102
(Sequenzsatz A) wurde gezeigt, dass sie durch HIV-Protease in unterschiedlichen
Raten gespalten werden, alle jedoch in viel geringeren Raten als
die des Decapeptids von BI-P-136, falls eine Spaltungsrate überhaupt
nachweisbar ist (44). Negative zelluläre Selektion wird dann durchgeführt unter
Verwendung von Decapeptid-Erkennungssequenzen aus dem Sequenzsatz
A. Vier der fünf
Sequenzen sind natürliche
Substrate für
HIV-Protease, werden jedoch durch das Enzym mit einem Bruchteil
der Rate des BI-P-136-Substrat-Decapeptids verarbeitet. Zellen werden
zubereitet, welche diese vier Sequenzen in β-Galactosidase inseriert enthalten
(in einer analogen Weise zu (29)), und die exprimierte HIV-Proteasen
enthalten. Diese Zellen können
als "durchlässige" Auxotrophe in verschiedener
Hinsicht betrachtet werden. Als solche wird β-Galactosidase anfänglich gespalten
werden und deshalb in variierenden Graden in den Zellen, die diese
Konstrukte tragen, inaktiviert werden. Die fünfte Sequenz, eine Erkennungssequenz
aus dem Vogel-Sarkom-Leukose-Virus, wird nicht spezifisch durch HIV-Protease
gespalten, (44) und (45). Zusätzlich
werden diese Stämme
selektiert hinsichtlich des Erfordernisses einer funktionellen β-Galactosidase für das effiziente
Wachstum und hinsichtlich der Proteasedefizienz. HIV-Protease-Mutanten werden mit
erhöhten
Umsatzraten für
die zahlreichen Substrat-Decapeptide unter negativen Selektionsbedingungen
mit variierenden Konzentrationen an Antibiotikum und Lactose erhalten.
-
Die
Verwendung höherer
Konzentrationen an Lactose und Antibiotika erfordert einen strengeren
negativen Selektionsdruck, indem den durchlässigeren Auxotrophen ermöglicht wird,
unter Verwendung der Lactose zu wachsen und dann durch das Penicillin
getötet
zu werden. Dies selektiert HIV-Protease-Mutanten mit höheren Umsatzraten
für die
Konstrukte von Interesse. Die mutierten Proteasen aus den selektierten
Zellen werden dann in in-vitro-Untersuchungen charakterisiert, wie
beschrieben in (29). Jene zellulären
Klone mit der gewünschten
Spezifität
werden dann heran gezogen und ihre Plasmide, welche die gewünschte Funktion
tragen, isoliert/gereinigt, wie oben beschrieben.
-
Ein
Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann,
um Proteasen mit einer Spezifität
für Erkennungssequenzen,
anders als die in dem Beispiel verwendete, zu entwickeln.
-
BEISPIEL VIII
-
Ein
Verfahren für
die Schaffung einer neuen HIV-Protease unter Verwendun von positiver
zellulärer Selektion
Dieses Beispiel ist ähnlich
wie Beispiel VI. In diesem Beispiel wird Wildtyp-HIV-Protease als
ein Startpunkt anstelle von enzymatisch-inaktiven Fehlsinn-Mutanten
verwendet. Zusätzlich
wird die HIV-Decapeptid-Erkennungssequenz zu einer der folgenden
Sequenzen geändert
(44), von denen jede in einem gesonderten Selektionslauf parallel
verwendet werden soll: Tabelle
1. Relative Spaltung von HIV-Peptidsubstraten
- IN
- Integraseprotein.
-
Von
den Sequenzen von BI-P-140, BI-P-138, BI-P-144, BI-P-127 und BI-P-102
(Sequenzsatz A) wurde gezeigt, dass sie durch HIV-Protease in unterschiedlichen
Raten gespalten werden, alle jedoch in viel langsameren Raten als
jene des Decapeptids von BI-P-136, falls die Spaltungsrate überhaupt
nachweisbar ist (44). Positive zelluläre Selektion wird dann in einem
Chemostaten (kürzlich
beschrieben) unter zahlreichen Verdünnungsraten und Selektionsdrucken
durchgeführt,
um Zellen zu selektieren, die Proteasen exprimieren, welche in der
Lage sind, enzymatische Aktivität
von Aspartattranscarbamoylase durch die Spaltung des Fusionskonstruktes
mit den gewünschten
Umsatzraten freizusetzen. Die mutierten HIV-Proteasen in den selektierten
zellulären
Klonen können
dann weiter unter Verwendung des in (29) beschriebenen in-vitro-Tests
charakterisiert werden. Jene zellulären Klone mit der gewünschten
Spezifität
werden dann heran gezogen und ihre Plasmide, welche die gewünschte Funktion
kodieren, isoliert/gereinigt, wie kürzlich beschrieben.
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Ein
Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann,
um Proteasen mit einer Spezifität
für Erkennungssequenzen,
anders als jene in dem Beispiel verwendeten, zu entwickeln.
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BEISPIEL IX
Zellfreie Selektion
-
Dieses
Beispiel erläutert,
wie zahlreiche Schritte in kontrollierten zellfreien Umgebungen
durchgeführt werden.
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Die
verwendete Endopeptidase ist eine Fehlsinn-Mutante der HIV-Protease
wie Asn-25, (5) und (42). Die Gene für diese Enzyme werden auf Plasmiden
kodiert und unter Verwendung von irgendeinem der in den früheren Beispielen
beschriebenen Verfahren der Mutagenese unterzogen, einschließlich chemischer
Mutagenese, ortsgerichteter Mutagenese und Replikation mit niedriger
Genauigkeit (z. B. Wachsen lassen in MutD-Stamm).
-
Die
mutierte Enzym-Population wird in E. coli, wie zuvor, erzeugt und
dann isoliert/gereinigt (unter Verwendung von Techniken, wie beschrieben
in (1)). Die Plasmide, welche die Endopeptidase-Population enthalten,
werden isoliert/gereinigt, (1). Ähnliche
Protokolle werden verwendet, um ein Fusionsprotein von Actin zu exprimieren,
das an seinem Aminoende an β-Galactosidase
mit einer HIV-Protease-Erkennungssequenz, (29), und an das Gen 10 von
T7 an seinem Carboxyende durch dieselbe HIV-Protease-Erkennungssequenz gekoppelt
ist. Das exprimierte Fusionskonstrukt wird isoliert/gereinigt, wie
zuvor beschrieben. Alternativ dazu können die vermeintlich neuen
Protease- und Actinfusionsgene unter Verwendung von PCR, wie beschrieben in
(48), amplifiziert und exprimiert werden. Dies würde die Verwendung lebender
Zellen in jedem Aspekt des Vorgehens eliminieren.
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Die
exprimierten, vermeintlich neuen Protease-Proteine werden mit den
isolierten/gereinigten Actinfusionsproteien inkubiert, wodurch der
neuen Protease mit der gewünschten
Funktion ermöglicht
wird, die Erkennungssequenz zu spalten. Die resultierende Mischung
aus der vermeintlich neuen Protease und der Actinfusionsinkubation
wird dann gemeinsam in der Anwesenheit von isolierter/gereinigter
DNase I inkubiert. Von DNase ist bekannt, dass sie durch die 1 :
1-Komplexierung mit Actinmonomeren inhibiert wird (46, 47). Das Actinmonomer
ist sterisch frei, an das DNase-I-Enzym nach der sauberen Abspaltung
der HIV-Protease-Erkennungssequenz
zu binden.
-
Das
isolierte/gereinigte Plasmid (oder PCR-DNS), das die vermeintlich
neue Proteasepopulation kodiert, wird dann zu der Reaktionsmischung
hinzugefügt
und inkubiert. Die resultierende DNS wird aus der Inkubationsmischung
unter Verwendung von in (1) beschriebenen Verfahren isoliert/gereinigt.
Die DNS wird dann unter Verwendung von Gelelektrophorese charakterisiert.
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Nach
der Identifikation einer DNS-Bande, die einem unverdauten Plasmid
entspricht, welches eine vermeintlich neue Protease kodiert, wird
die DNS aus dieser Bande isoliert/gereinigt (1) und gleichmäßig in 100
Proben aufgeteilt. Jede Probe wird amplifiziert und die vermeintlich
neuen Proteasen werden exprimiert und ihre Funktion wird, wie zuvor,
untersucht, um zu bestimmen, welche Probe neue Protease kodiert,
die in der Lage ist, DNase I zu inhibieren. Die weitere Partitionierung
der Proben, welche die enzymatische Aktivität kodieren, wird durchgeführt, bis
der gewünschte
Klon erhalten wird und wird wahlweise amplifiziert. An diesem Punkt
werden die neuen Proteasen hinsichtlich zahlreicher Attribute wie
Umsatzrate charakterisiert.
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Falls
die Eigenschaften der neuen Proteasen wie gewünscht sind, ist keine weitere
Entwicklung notwendig. Falls sie es nicht sind, werden die neuen
Proteasen evolutionsmäßig weiter
entwickelt. Unter Verwendung der diese neuen Proteasen kodierenden
DNS wird der Vorgang durch erneute Mutierung der Genpopulation der
neuen Proteasen, Amplifizierung und dann wiederum Untersuchung hinsichtlich
der gewünschten Funktion
in den exprimierten Proteinen wiederholt. Auf diesem Wege kann die
DNS, welche die neue Proteasepopulation kodiert, einen evolutionären Fortschritt
durchmachen, um eine neue Protease mit den bevorzugten Eigenschaften
zu erhalten.
-
BEISPIEL X
-
Gerichtete Entwicklung
einer neuen Protease, spezifisch für ein Epitop von Influenza-Hämagglutinin (HA), kodiert in
einem M13-Vektor unter Verwendung eines auf Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase
(ASD) basierten Selektionsmoleküls
in E. coli in einem Batch-Vorgang, durchgeführt in einem Chemostaten
-
Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase
(ASD) katalysiert die Produktion von Aspartat-4-semialdehyd aus Aspartyl-4-phosphat
in E. coli. Die Reaktion ist NADPH-abhängig und setzt eine Phosphatgruppe
frei. Die Produktion von Aspartat-4-semialdehyd ist eine Verzweigungsstelle,
aus welcher die Vorläufer
der vier Aminosäuren
Methionin, Threonin, Isoleucin und Lysin erzeugt werden. Folglich
wird, falls ASD nicht funktionell in der Zelle ist und falls die
Zellen so selektiert werden, dass es keine alternativen Pfade für die Produktion
von Aspartat-4-semialdehyd oder irgendeinem der anderen wichtigen
Metaboliten stromabwärts
von Aspartat-4-semialdehyd gibt, die Zelle nicht in der Lage sein,
ohne die Zugabe der vier Aminosäuren
in den Medien zu wachsen. Zusätzlich
werden die Zellen selektiert, proteasedefizient zu sein.
-
Ein
ASD-basiertes Selektionskonstrukt wird durch Schaffung eines Fusionsproteins
erzeugt. β-Galactosidase
wird stromabwärts
der ASD-Sequenz kodiert und Asparaginsynthetase wird stromabwärts kodiert. β-Galactosidase
und Asparaginsynthetase werden an ASD durch eine Decapeptid-Erkennungssequenz
der Influenza-HA-Stelle B (32), Thr-Asp-Gln-Glu-Gln-Thr-Ser-Leu-Tyr-Val, gekoppelt.
Das Fusionsprotein wird auf dem E.-coli-Chromosom unter der Kontrolle
des stärksten
Promotors, von dem gezeigt wird, dass er eine annehmbare Hintergrund-ASD-Aktivität verleiht,
kodiert. Mit der maximalen Anzahl an zugänglichen Fusionsproteinen haben
neue Moleküle
mit niedrigerem Umsatz, jedoch der korrekten proteolytischen Spezifität einen
selektiven Vorteil.
-
Dieses
Verfahren erlaubt das Wachstum von Zellen und Replikatoren in einem
Chemostaten, wobei es eine Trennung der kodierenden Sequenzen für Selektionsmoleküle und vermeintlich
neue Moleküle
gibt, wodurch differenzielle Mutationsraten ermöglicht werden. Die Selektion
beruht auf der zweifachen Selektion der Zellen und der Replikatoren
in einer symbiotischen Beziehung.
-
Der
evolutionäre
Startpunkt des neuen Moleküls
ist eine Protease, welche eine spezifische Sequenz erkennt und die
für das
System nicht schädlich
ist, z. B. Collagenase aus Achoromobacter iophagus und Clostridium
histolyticium, welche vorwiegend an X-gly und pro-X-gly-pro spaltet,
und wird in dem Genom eines Phagen wie M13 kodiert. Große Zahlen
von M13-Phagen, welche das neue Molekül kodieren, werden starken
Mutagenen wie Ethylmethansulfonat, Nitrosoguanidin und Bestrahlung
ausgesetzt. Mutation ruft eine heterogene Population hervor, welche
dann in einem Chemostaten mit E. coli inkubiert wird, die das Selektionskonstrukt in
Minimalmedien ohne die vier Aminosäuren kodieren. Zufällige Mutagenese
verleiht der neuen Proteasepopulation im Vergleich mit den Selektionskonstrukten
einen evolutionären
Vorsprung. Zusätzlich
wird das M13-Genom in einer höheren
Rate repliziert als das E.-coli-Chromosom, wodurch weiter die Mutationszahl
in dem M13-Genom im Vergleich zu dem E.-coli-Chromosom erhöht wird.
Jene M13-Moleküle
mit der höchsten Aktivität werden
basierend auf ihrem selektiven Wachstumsvorteil erhalten. Die Gene,
welche die vielversprechendsten neuen Proteasen kodieren, werden
aus der Population isoliert/gereinigt und diese können wiederum
mutiert werden und mit einer evolutionsmäßig zurückgesetzten Population an E.-coli-Zellen,
die für
ein Fusionsprotein-Selektionskonstrukt kodieren, in einem wiederholbaren
Vorgang vom Batch-Typ inkubiert werden. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung
der besten neuen Proteasen, während
das Fusionsprotein stabil gehalten wird, indem seine Population
oftmals wieder aufgefrischt wird.
-
BEISPIEL XI
-
Gerichtete Evolution einer
neuen Protease, spezifisch für
eine Erkennungssequenz aus HIV-gp120,
kodiert in einem M13-Vektor unter Verwendung von Selektionskonstrukten,
die Enzyme enthalten, welche bei der Synthese von Chorismat in E.
coli wichtig sind, unter Verwendung von differenzieller Mutationsrate,
Redundanz und einer heterogenen Anfangspopulation
-
Chorismat
ist ein Verzweigungspunkt bei der Biosynthese von Phenylalanin,
Tyrosin und Tryptophan. Seine Produktion wird durch die enzymatische
Wirkung der Chorismatsynthase auf 3-Enolpyruvylshikimat-5-phosphat
katalysiert. Die Produktion von Chorismat folgt einem linearen,
unverzweigten Weg aus 3-Desoxy-7-phospho-D-arabinoheptulosonat.
Der Pfad, einschließlich
Chorismat und 3-Desoxy-7-phospho-D-arabinoheptulosonat, enthält sieben
Mitglieder und wird durch sechs unterschiedliche Enzyme katalysiert,
von denen eines Chorismatsynthase ist.
-
Jedes
der sechs Enzyme wird in einem unterschiedlichen Proteinfusions-Selektionskonstrukt
verwendet, kodiert auf dem E.-coli-Chromosom eines Stammes, der
dahingehend selektiert ist, dass er Chorismat für effizientes Wachstum benötigt und
selektiert ist, dass er protease-defizient ist. Die kodierenden
Sequenzen für jedes
Enzym, flankiert auf beiden Seiten mit der proteolytischen Erkennungssequenz
von Interesse, die Aminosäuren
271–295
des variablen Bereichs 3 von HIV gp120
(N-N-T-R-K-S-I-R-I-Q-R-G-P-G-R-A-F-V-T-I-G-K-I-G-N),
werden zwischen geeigneten sperrigen Gruppen wie β-Galactosidase,
einer der drei Phospho-2-3-desoxyheptonat-Aldolasen
und Proteinen von Bakteriophagen, wie beschrieben in anderen Beispielen,
eingeschlossen. Die Fusionsproteine werden auf dem E.-coli-Chromosom
unter der Kontrolle des stärksten
Promotors kodiert, von dem gezeigt wird, dass er eine annehmbare
Hintergrundaktivität
verleiht. Es ist bevorzugt, Modulationseinheiten zu verwenden, von
denen jede nicht homolog ist und welche keine Homologen mit Genen
in dem E.-coli-Chromosom haben. Modulationsmoleküle werden gewählt, welche
die sechs Enzyme, einschließlich
Chorismatsynthase wirksam herunterregulieren. Diese redundanten
Selektionsmoleküle kanalisieren
die Entwicklung einer Protease, die für die Erkennungssequenz von gp120
spezifisch ist, welche die einzige gemeinsame Sequenz aller Fusionen
ist.
-
Die
produzierte E.-coli-Zelllinie kodiert alle sechs fusionsbasierten
Selektionskonstrukte, wodurch ein redundantes System geschaffen
wird. In diesem System wird die Biosynthese von Chorismat gehemmt,
sogar wenn fünf
der sechs Proteinfusionen nicht-nützliche Deletionen durchmachen.
Zusätzlich
arbeitet das redundante System sogar, falls die Herunterregulation
der enzymatischen Funktionen in den zahlreichen Proteinen nicht
vollständig
ist. Da jedes der Enzyme eine Reaktion in demselben Pfad katalysiert,
hat die Herunterregulierung jedes innerhalb ihren Fusionen eine
kumulative Wirkung auf die Produktion von Chorismat.
-
Die
vermeintlich neue Proteasepopulation wird in einem M13-Phagen kodiert.
Die evolutionären
Startpunkte für
das neue Molekül
schließen
HIV-Protease-Subtilisin BPN, Polio-3C-Protease und Collagenasen von Achromobacter
iophagus und Clostridium histolyticium ein. Eine große Population
solcher Phagen werden der Mutation unterzogen, um der vermeintlich
neuen Molekülpopulation
einen evolutionären
Vorsprung zu verleihen.
-
Differentielle
Mutationsraten für
die Selektionskonstrukte und die neuen Proteasen werden durch die Verwendung
unterschiedlicher Replikationsstartpunkte und ihrer entsprechenden
Replikationsmaschinerie geschaffen. Die Selektionskonstrukte werden
einzig durch den natürlichen
E.-coli-Holoenzymkomplex repliziert, während die neuen Proteasen durch
die T7-DNS-Replikationsmaschinerie
repliziert werden können.
-
Um
einen M13-Phagen zu schaffen, bei dem die Replikation der vermeintlich
neuen Proteasepopulation durch die T7-Maschinerie gelenkt wird,
wird ein zweifacher Replikationsmechanismus eingeführt. M13 wird
auf einem zirkulären,
einzelsträngigen
DNS-Genom kodiert.
T7 ist in linearer, doppelsträngiger
DNS-Phage. Während
seiner Replikation wird M 13 jedoch in einer doppelsträngigen Form
produziert. Der normale M13 wird intakt gehalten, um den Phagen
in seine doppelsträngige
Form zu bringen, und dann kann ein T7-Replikationssystem zum Ziel genommen
werden, um Gene auf dem M13-Genom zu replizieren.
-
Um
dies zu tun, werden für
die Replikation benötigte
T7-Gene, einschließlich
mutierten T7-DNS-Polymerasen mit niedriger Genauigkeit, von entweder
dem M13-Genom, dem bakteriellen Chromosom oder einem Plasmid exprimiert.
Diese Gene schließen
eine modifizierte T7-DNS-Polymerase (Gen 5) mit niedriger
Genauigkeit, die T7-RNS-Polymerase und die T7-Gyrase (Gen 4) ein (38). Die
T7-Replikationsmaschinerie befindet sich unter der Kontrolle eines
starken Promotors, so dass eine hohe Kopienzahl erreicht wird. Das
M13-Genom enthält
eine Anzahl an T7-Replikationsstartpunkten, so dass, wenn M13 erst
einmal doppelsträngig
ist, die große
Kopiezahl der T7-Replikationsmaschinerie erfolgreich mit dem E.-coli-Holoenzym
(welches in sehr geringen Kopiezahlen in einer Zelle vorhanden ist)
um die Replikation des M13-Genoms konkurriert. Die vermeintlich
neue Protease oder Proteasen sind in der Nähe des T7-Replikationsstartpunktes
lokalisiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass, falls sowohl ein
bakterielles Holoenzym als auch eine T7-DNS-Polymerase aktiv dasselbe
M13-Genom replizieren,
die modifizierte T7-Polymerase mit geringer Genauigkeit die neue
Protease replizieren wird.
-
Die
differenzielle Mutationsrate wird ebenfalls erhöht, indem die Kopiezahl vermeintlich
neuer Molekülsequenzen
auf dem M13-Genom erhöht
wird. Diese Sequenzen können
oder können
nicht vollständig
sein. Zum Beispiel können
mehrfache Kopien der vollständigen
vermeintlich neuen Protease zu günstigen
homologen Rekombinationen führen.
Zusätzlich
können
kurze Strecken an DNS, insbesondere jene, die wichtige Teile der
neuen Protease wie das katalytische Zentrum kodieren, zufällig in
das M13-Genom eingebaut werden, so dass erhöhte Zahlen kleiner Rekombinationen
um wichtige Stellen herum geschehen werden. Diese kleinen Sequenzen
werden auch wahrscheinlich in gewisse Bruchteile der Rekombinationen
zufällige
flankierende Sequenzen einbringen (da sie in dem Genom zufällig verteilt
sind).
-
Die
das redundante System enthaltenden E. coli und die oben beschriebene
heterogene Startpopulation aus M13, welche die neuen Proteasen kodiert,
werden in einem Chemostaten wachsen gelassen. Der Selektionsdruck
wird moduliert, konstant gehalten oder regelmäßig durch Anpassen der Chemostatumgebung, insbesondere
der Konzentration der Aminosäuren
Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan und der Durchflussgeschwindigkeit,
cyclisiert. Proben des M13-Bakteriophagen werden regelmäßig entnommen
und auf die Fähigkeit,
neue Proteasen mit der gewünschten
proteolytischen Aktivität
zu produzieren, untersucht.
-
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