DE69333669T2

DE69333669T2 - Mutagenese und selektionsmethoden in den selben wirtszellen

Info

Publication number: DE69333669T2
Application number: DE69333669T
Authority: DE
Inventors: Jacob N Wohlstadter
Original assignee: Wohlstadter, Jacob N.
Current assignee: WOHLSTADTER, JACOB N., GAITHERSBURG, MD., US
Priority date: 1992-03-16
Filing date: 1993-03-09
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2013-03-10
Also published as: WO1993019170A1; EP0631620B1; EP1477558A1; ATE280219T1; AU3808993A; AU687347B2; EP0631620A4; ZA931835B; US6087177A; IL105038A0; EP0631620A1; CA2132306A1; US6043093A; JPH08501201A; ES2231769T3; JP3691846B2; CA2132306C; US6162640A; JP2005270109A; DE69333669D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich im weiten Sinne auf rationelle Verfahren unter Verwendung von rekombinanten genetischen Techniken und Selektion, um Gene, die neue Proteasen mit einer gewünschten Wechselwirkung mit Substraten von Interesse aufweisen, zu isolieren oder zu schaffen oder ihre Entwicklung zu lenken.
Genauer bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Isolierung, Schaffung oder Entwicklung neuer Proteasen für die Verwendung in industriellen und therapeutischen Produkten.
Noch genauer bezieht sich die Erfindung auf Verfahren, worin Wirtszellen und/oder Viren, welche einen modulierten Wachstumsfaktor für den Wirt oder für das Virus, das funktionell mit einem Substrat von Interesse oder einem Analogon davon verbunden ist, und vielfache Kopien einer vermeintlich neuen Protease oder einer Vielzahl vermeintlich neuer Proteasen, die mit dem Substrat von Interesse oder Analogon in Wechselwirkung treten können, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern, exprimieren, Selektionsbedingungen oder evolutionären Selektionsbedingungen ausgesetzt werden, um Wirte oder Viren oder Mutationen davon zu selektieren, die das Gen tragen, welches die neue Protease von Interesse exprimiert.
Die Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um rationell Proteasen, die einen breiten Bereich von interessierenden Eigenschaften aufweisen, für eine Reihe von industriellen, Forschungs- oder therapeutischen Verwendungen zu schaffen.
In dieser Anmeldung wird auf zahlreiche Publikationen durch arabische Ziffern in Klammern Bezug genommen. Die vollständige Zitierung dieser Bezugnahmen werden an dem Ende der Spezifikation, den Ansprüchen unmittelbar vorausgehend, gefunden. Die Bezugnahmen beschreiben den Stand der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, ebenso wie gewisse Aspekte der Erfindung selber vollständiger.
Hintergrund der Erfindung
Im Allgemeinen gibt es drei Wege, auf denen ein Molekül mit neuen Eigenschaften erhalten werden kann. Ein erstes Verfahren, z. B. Protein Engineering, beruht auf bekannten Eigenschaften eines allgemeinen Molekültyps und auf theoretischen Modellen, die versuchen, die Konformation von Molekülen, die am wahrscheinlichsten die gewünschten Eigenschaften haben, zu definieren. Es erwiesen sich keine Modelle als allgemein genug oder genau genug, um geeignete Moleküle reproduzierbar zu gestalten.
Ein zweites Verfahren ist Screening. Screening erfordert, dass vielfache Permutationen von Molekülen hinsichtlich einer gegebenen Eigenschaft untersucht werden. Der gegenwärtige Stand der Screening-Technologie und die gewaltige Zahl unterschiedlicher Permutationen begrenzt die Nützlichkeit dieser Technik. Zum Beispiel hat eine Peptidsequenz aus 20 Aminosäuren 20²⁰ unterschiedliche Permutationen. Um Bakterien zu screenen, die unterschiedliche Permutationen an Peptiden signifikanter Länge erzeugen, würden Milliarden um Milliarden Petrischalen, jede in der Größenordnung von 1000 Kolonien benötigt werden. Das Screenen solch großer Populationen, um jene neuen Glieder zu finden, falls irgendwelche vorhanden sind, welche die gewünschten Eigenschaften haben, ist äußerst ineffizient. Screening-Techniken sind nicht für die realistische Ausführung solcher Aufgaben passend.
Ein drittes Verfahren verwendet die natürliche Selektion auf spezifischen, nicht verallgemeinerbaren Wegen. Zum Beispiel kann man, wenn einem einzelligen Organismus ein Enzym in einem kritischen Stoffwechselweg fehlt, versuchen, ein Molekül mit derselben Funktion wie das durch die Mutante verlorene zu selektieren. Diese Technik ist jedoch begrenzt durch die Reaktionen, die in dem Genom des Organismus kodiert werden und die innerhalb der Zelle ergänzt werden könnten. Weiterhin würde für jedes unterschiedliche Komplementationsexperiment ein neuer mutierter Stamm benötigt werden.
Der Stand der Technik
Verfahren für die Selektion von Organismen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Diese Verfahren schließen das Wachsen lassen von Wirtszellen in der Abwesenheit eines essenziellen Nährstoffes, einer organischen Verbindung, die nicht durch elterliche Stämme genutzt werden kann, oder in der Anwesenheit von toxischen Analoga, um auf Organismen zu selektieren, welche z. B. Moleküle exprimieren, die für das Zellwachstum essenziell sind. Solche Techniken sind primitiv, da es das Wachstum in der Abwesenheit eines essenziellen Nährstoffes dem Forscher nicht erlaubt, Vorgehen für die Selektion von Molekülen für irgendeinen spezifischen Reaktionstyp oder für irgendeinen bestimmten, zum Ziel genommenen Bereich innerhalb des Substrats rationell zu gestalten. Der auf dem Wachstum in Abwesenheit eines essenziellen Nährstoffes basierende Selektionsdruck ist rau dahingehend, dass kein vernunftsmäßig definierter Selektionsdruck, durch welchen ein Wachstumsvorteil oder -nachteil verliehen wird, auferlegt wird, und deswegen könnten Wirte selektiert werden, welche das Überleben durch die Expression von Molekülen mit einem Bereich von Funktionen erreichen. Dies begrenzt die Nützlichkeit solcher Verfahren, da es die Fähigkeit der Wirte reduziert, Moleküle mit spezifischen gewünschten Fähigkeiten zu isolieren oder zu schaffen.
Zum Beispiel ist das Wachstum auf organischen Verbindungen, die durch elterliche Stämme nicht genutzt werden können, begrenzt, da die Wirte nur auf der Basis ihrer Fähigkeit, die organische Verbindung zu nutzen, selektiert werden. Die Verwendung der organischen Verbindung kann durch irgendeine einer Reihe unterschiedlicher Reaktionen bewerkstelligt werden. Es gibt kein rationelles Verfahren, ein Molekül zu isolieren, zu schaffen oder seine Entwicklung zu lenken, das zu einer spezifischen Reaktion mit einem zum Ziel genommen Bereich in einem spezifischen Substrat in der Lage ist.
Dube et al., Biochemistry, Band 28, Nr. 14, 11. Juli 1989, offenbaren die Umgestaltung von Genen, die für β-Lactamase kodieren, indem DNS an der aktiven Stelle mit zufälligen Nucleotidsequenzen ersetzt wird. Die Oligonucleotidersetzung bewahrt gewisse Codons, die für die Aktivität kritisch sind, enthält jedoch Basenpaare chemisch synthetisierter zufälliger Sequenzen, die für mehr als eine Million Aminosäuresubstitutionen kodieren. Eine Population an E. coli wurde mit Plasmiden infiziert, die diese zufälligen Inserts enthalten, und die Population wurde in der Anwesenheit von Carbenicillin und gewissen verwandten Analoga von Carbenicillin inkubiert. Sieben neue Mutanten des aktiven Zentrums, die den E.-coli-Wirt resistent gegen Carbenicillin machten, wurden selektiert, wobei alle Multinucleotidsubstitutionen enthielten, die für unterschiedliche Aminosäuren kodieren. Jeder der Mutanten übte eine temperaturempfindliche β-Lactamase-Aktivität aus. Dube et al. ist folglich begrenzt auf die Verstärkung der bereits bekannten Funktion einer Enzymklasse.
Ein Prozess für die Herstellung neuer Moleküle und DNS- und RNS-Sequenzen durch Rekombinationstechniken und Selektion ist in Kauffman et al., UK, Patentanmeldung Nr. GB 2183661A, angemeldet am 17. Juni 1985, offenbart. Mutierte Gene werden in Wirtszellen eingeführt, wobei die modifizieren Wirte so wachsen gelassen werden, dass die mutierten Gene kloniert werden, wodurch die Produktion der Proteine, die durch diese Gene exprimiert werden, gefördert wird, die modifizierten Wirtszellen werden gescreent und/oder selektiert, um die Wirtszellstämme zu identifizieren, die neue Proteine mit einer gewünschte Eigenschaft produzieren, und die identifizierten Stämme werden wachsen gelassen, um ein neues Molekül mit der gewünschten Eigenschaft zu produzieren. Die in Kauffman et al. gelehrten Techniken, ähnlich wie in jene in Dube et al., sind auf Verfahren für die Modifikation der bekannten Funktion gewisser Molekülklassen beschränkt.
Schatz et al., Cell, Band 53, S. 107–115 (1988), beschreiben ein Verfahren für die Identifikation einer Fibroblastenzelllinie, die in der Lage ist, ein Gen zu exprimieren, welches ein Enzym mit einer bekannten Rekombinaseaktivität kodiert. Das Verfahren basiert auf einem Prozess der somatischen Rekombination, bei welchem weit beabstandete Gensegmente miteinander ligiert werden, um eine vollständige variable Region zu bilden (die variable Region wird zusammengebaut aus V-(variablen), J-(Verbindungs-) und in einigen Fällen D-(Diversitäts-)Gensegmenten in einer geordneten und stark regulierten Art). Der Gentransfer wird verwendet, um einer Fibroblaste stabil die Fähigkeit, V(D)J-Umordnungen durchzuführen, zu verleihen.
Auf Retroviren basierende DNS-Rekombinationssubstrate, die eine Genbibliothek umfassen, von denen einige das Rekombinasegen kodieren, das heißt das Gen, welches das (die) Enzym(e) exprimiert, die eine Rolle bei der V(D)J-Rekombination spielen, wurden in Wirtszellen transfiziert, welche ein Gen enthalten, das einen Wachstumsfaktor, der von den Rekombinase-Erkennungssequenzen flankiert wird, exprimiert. Anfänglich wurde das Gen, das den Wachstumsfaktor exprimiert, nicht transkribiert oder translatiert. Die Transkription und Translation des Wachstumsfaktors wurde jedoch aktiviert, wenn die Rekombinaseaktivität durch die Wechselwirkung von Rekombinase mit den Rekombinase-Erkennungssequenzen exprimiert wurde.
Bock et al., Nature, Band 355, S. 564–567 (1992), berichten von Anstrengungen, DNS-Moleküle mit neuen Funktionen zu selektieren. Aptamere, stochastisch erzeugte Oligonucleotide, die in der Lage sind, spezifische molekulare Ziele zu binden, wurden in zellfreien Selektionsvorgängen selektiert. Einzelsträngige DNS kann hinsichtlich Aptameren gescreent werden, die menschliches Thrombin binden, ein Protein mit keiner bekannten Nucleinsäurebindungsfunktion. Diese Prozesse, die tatsächlich zellfreie Screeningvorgänge darstellen, schließen das Screening und die Amplifikation von gewissen Mitgliedern einer Subpopulation ein. Die anderen Mitglieder werden verworfen.
Curtiss, PCT-Anmeldung Nr. WO89/03427, offenbart Verfahren und Techniken für die Expression rekombinanter Gene in Wirtszellen. Curtiss offenbart gentechnisch veränderte Wirtszellen, welche gewünschte Genprodukte exprimieren, da sie in einer genetisch stabilen Population gehalten werden. Die gentechnisch veränderten Zellen sind gekennzeichnet durch: (1) das Fehlen eines Gens, das ein Enzym kodiert, das wesentlich für das Wachstum der Zellwand ist, das heißt die Unfähigkeit, einen Schritt bei der Biosynthese einer essenziellen strukturellen Komponente der Zellwand zu katalysieren; (2) einem ersten rekombinanten Gen, das ein Enzym kodiert, welches die funktionelle Ersetzung des Enzyms ist, das wesentlich für das Zellwandwachstum ist; und (3) einem zweiten rekombinanten Gen, das ein gewünschtes Polypeptid kodiert, welches physikalisch mit dem ersten rekombinanten Gen gekoppelt ist. Verlust des ersten rekombinanten Gens bringt die Zellen dazu, zu lysieren, wenn sich die Zellen in einer Umgebung befinden, wo ein Produkt, das durch das erste rekombinante Gen exprimiert wird, fehlt, und wo die Zellen in einer Umgebung wachsen gelassen werden, so dass das Fehlen des ersten rekombinanten Gens die Zellen dazu bringt, zu lysieren.
Baum et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), Band 87, S. 10023–10027 (1990), beziehen sich auf ein Verfahren für die Überwachung von Spaltungswechselwirkungen durch eine Reihe von Proteasen. Es wird ein Fusionskonstrukt durch Inserieren einer Proteasespaltstelle, z. B. das Decapeptid der Protease-Erkennungssequenz des menschlichen Immunschwächevirus ("HIV"), in spezifische Örtlichkeiten der β-Galactosidase in E. coli geschaffen. Jene Konstruktgene, welche ihre enzymatische Aktivität trotz der Insertion der Spaltstelle behalten, werden in Plasmide subkloniert, welche Wildtyp- bzw. mutierte HIV-Protease kodieren. Von dem Fusionskonstrukt wurde gefunden, dass es durch Wildtyp-HIV-Protease gespalten wird und nicht durch mutierte HIV-Protease, sowohl bei in-vivo- als auch bei in-vitro-Experimenten.
Nach der Spaltung durch HIV-Protease wird die geänderte β-Galactosidase inaktiviert. Die Spaltungsreaktion wird durch Pepstatin A inhibiert, einem bekannten Inhibitor der HIV-Protease. Ein analoges Konstrukt wurde unter Verwendung einer Polioproteasespaltstelle entwickelt, welche durch Polioprotease gespalten wurde.
Paoletti et al., US-Patent Nr. 4,769,330, offenbaren Verfahren für die Modifikation des Genoms von Vacciniavirus, um Vacciniamutanten zu produzieren, besonders durch das Einführen exogener DNS in das Vacciniagenom. DNS-Sequenzen und unmodifizierte und genetisch modifizierte Mikroorganismen, die als Zwischenprodukte involviert sind, werden offenbart, ebenso wie Verfahren zum Infizieren von Zellen und Wirtstieren mit den Vacciniamutanten, um die exogene DNS und durch die exogene DNS kodierte Proteine zu amplifizieren. Diese Literaturstelle ist repräsentativ für im Stand der Technik bekannte Rekombinationstechniken, die verwendet werden, um sowohl Viren als auch Wirtszellen-Mikroorganismen zu modifizieren.
Murphy, US-Patent Nr. 5,080,898, bezieht sich auf die Verwendung von rekombinanten DNS-Techniken, um Analoga von Toxinmolekülen zu schaffen, und auf die Verwendung solcher Moleküle, um medizinische Störungen zu behandeln. Die Toxinmoleküle können mit irgendeinem spezifisch bindenden Liganden gekoppelt werden, ob es ein Peptid ist oder nicht, in einer Position, welche, wie zuvor bestimmt, dieselbe für jedes Toxinmolekül ist.
Anderson et al., US-Patent Nr. 4,403,035, offenbaren ein Verfahren für die Zufuhr und die Übertragung genetischer Information durch Packen eines DNS-Protein-Hybridkomplexes in einen viralen Vektor und dann Übertragen dieser genetischen Information von dem Hybridvirus in aufnahmefähige Mikroorganismen. Ein Organismus mit einer Funktion oder Fähigkeit, von der gewünscht wird, dass sie übertragen wird, wird ausgewählt und die DNS davon wird isoliert/gereinigt und gespalten, um die exogenen Gene abzutrennen, die die Funktion kontrollieren, von welcher gewünscht wird, dass sie übertragen oder kloniert wird. Diese exogenen Gene werden in die DNS eines Virus inseriert. Das resultierende Hybrid DNS-Protein wird in ein zellfreies Medium in vitro eingeführt, gemeinsam mit einer Quelle für eine virale Capsid-Vorläuferstruktur, das heißt Vor-Köpfe, und benötigten viralen Begleitstrukturen und Verpackungsproteinen, um ein infektiöses Hybridvirus, das die Hybrid-DNS einkapselt, zusammenzubauen.
Die virale Capsid-Vorläuferstruktur und die viralen Begleitstruktur- und Verpackungsproteine werden durch das Infizieren fähiger Mikroorganismen mit einer ersten viralen Mutante, die in der Lage ist, Capsid-Vorläuferstrukturen zu produzieren, ohne dass wenigstens ein Verpackungsprotein produziert wird, und durch das Infizieren kompatibler Mikroorganismen mit einer zweiten viralen Mutante, die in der Lage ist, virale Begleitstruktur- und Verpackungsproteine zu produzieren, ohne dass Capsid-Vorläuferstrukturen produziert werden, produziert. Diese infizierten Zellen werden dann vermischt und lysiert, um die Quelle an Virusbestandteilen für das in-vitro-Verpacken des DNS-Protein-Hybrids bereitzustellen.
Das Hybridvirus wird dann verwendet, um Mikroorganismen zu infizieren, die mit dem Virus kompatibel sind, um die infizierten Zellen so zu programmieren, dass sie die gewünschte Funktion der exogenen Gene und die Gene selber als Nucleinsäuren seriell reproduzieren.
Dulbecco, US-Patent Nr. 4,593,002, offenbart ein Verfahren für das Einbauen von DNS-Fragmenten in das DNS-Gen eines Virus. Die DNS-Fragmente kodieren für Proteine, welche spezifischen medizinischen oder kommerziellen Nutzen haben. Kleine Segmente eines Ausgangsproteins, das die gewünschten Funktionen zeigt, werden identifiziert und ein DNS-Fragment mit einer Nucleotidbasensequenz, die jenes Segment des Proteins kodiert, wird isoliert/gereinigt aus einem Organismus oder chemisch synthetisiert. Das isolierte/gereinigte DNS-Fragment wird in das DNS-Genom des Virus so inseriert, dass das inserierte DNS-Fragment sich selber als das Fremdsegment eines viralen Oberflächenproteins exprimiert, und so, dass weder die Funktion des Proteinsegmentes noch die Funktion irgendeines viralen Proteins, das kritisch für die virale Replikation ist, beeinträchtigt wird.
Keines der Verfahren des Standes der Technik bietet einen rationellen Ansatz an, der Selektionsvorgänge für die Isolierung, Schaffung oder das Schaffen durch gerichtete Evolution von neuen Molekülen mit einer spezifischen Funktion bezüglich eines gewählten Substrates von Interesse nutzt. Die Screening-Verfahren sind von Natur aus ineffizient, unwirtschaftlich und zeitraubend. Die primitiven Verfahren der Selektion, die im Stand der Technik offenbart werden, erlauben nicht das Schaffen z. B. von Molekülen mit hoher Spezifität, entweder als ein Binder oder als ein Katalysator, für eine bestimmte Erkennungssequenz. Sie erzeugen begrenzte Zahlen von Molekülen mit begrenzten Eigenschaften. Weiterhin lehrt keine der Literaturstellen des Standes der Technik Verfahren, die in ihrer Anwendbarkeit universell sind. Es gibt kein Verfahren des Standes der Technik für die Isolierung, das Schaffen oder die gerichtete Evolution von Genen, die unterschiedliche Moleküle exprimieren, wobei jedes eine rationell gestaltete Aktivität hinsichtlich eines Substrates von Interesse hat.
A. R. Oliphant (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 86, S. 9094–9098, beschreibt ein Verfahren für die Schaffung von Proteinen mit geänderten enzymatischen Eigenschaften.
Detaillierter, mutierte β-Lactamase-Proteine wurden zubereitet durch das Einführen einer mischbasigen Oligonucleotidsequenz in den Nucleinsäurebereich, der einen 17 Aminosäure langen Teil des aktiven Zentrums des Enzyms kodiert.
C. T. Chien (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 88, S. 9578–9582, beschreibt ein Zwei-Hybrid-System zum Nachweisen von Proteinen, die in der Lage sind, mit einem bekannten Protein in Wechselwirkung zu treten. Detaillierter, zwei Plasmide werden konstruiert, um zwei Hybrid-Proteine zu kodieren. Das erste Hybrid besteht aus der DNS-Bindungsdomäne eines transkriptorischen Hefeaktivatorproteins GAL4, das mit dem bekannten Protein fusioniert ist. Das zweite Hybrid besteht aus der GAL4-Aktivierungsdomäne, die mit einer Proteinsequenz verschmolzen ist, die durch eine Bibliothek aus genomischen Hefefragmenten kodiert wird. Folglich führt die Wechselwirkung zwischen dem bekannten Protein und einem Protein, das durch die Bibliothek kodiert wird, zu einer transkriptorischen Aktivierung eines Reportergens, der eine Bindungsstelle für GAL4 enthält.
Ziele der Erfindung
Es ist folglich ein primäres Ziel der Erfindung, neue Proteasen zu schaffen, die in der Lage sind, mit Substraten von Interesse in Wechselwirkung zu treten. Das Substrat von Interesse wird durch die Erkennungssequenz repräsentiert, wie detaillierter in der vorliegenden Beschreibung, insbesondere auf Seite 22, Zeilen 22 bis 23, beschrieben.
Es ist ein verwandtes Ziel der Erfindung, neue Proteasen zu schaffen, während die Zeit, der Aufwand und die Fehler, die mit dem Protein Engineering, Screening und Selektionsverfahren des Standes der Technik relativ verbunden sind, vermieden werden.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, die Kraft der Selektionsprozesse und rekombinanten Gentechniken nutzbar zu machen, um Proteasen zu erzeugen, die bis dahin noch nicht bekannt waren und die neue Funktionen oder verbesserte bekannte Funktionen bezüglich einer breiten Reihe an Substraten von Interesse haben.
Es ist noch ein weiteres und verwandtes Ziel dieser Erfindung, die Gene, welche neue Proteasen exprimieren, aus bestehenden Genpools zu isolieren, indem die interaktive Spezifität dieser neuen Proteasen für die Substrate von Interesse, für welche sie spezifisch sind, zur Übereinstimmung gebracht werden.
Es ist noch ein weiteres und verwandtes Ziel dieser Erfindung, neue Proteasen für die Wechselwirkung mit dem Substrat von Interesse durch die rationelle Gestaltung von auf Selektion basierenden Verfahren zu schaffen, welche spezifische exprimierbare Moleküle nutzen, die die Erkennungssequenzen des Substrates von Interesse einbauen.
Es ist noch ein weiteres und verwandtes Ziel dieser Erfindung, die schnelle Replikation von zellulären und viralen Genomen bei der Selektion von Genen, welche neue Proteasen von Interesse exprimieren, nutzbar zu machen.
Es ist noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung, evolutionären Druck auf zelluläre und virale Systeme zu kontrollieren und zu richten, um Gene zu schaffen und zu entwickeln, welche neue Proteasen von Interesse exprimieren, die bis dahin unbekannte physikalische und/oder chemische Wechselwirkungen mit Substraten von Interesse eingehen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung liegt in weitem Sinne bei rationellen Verfahren für die Isolierung, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, welches eine neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit einem Substrat von Interesse in der Lage ist. Das Verfahren involviert die Selektion von Wirten oder von Replikatoren in Wirten, welche neue Proteasen kodieren, basierend auf dem Zell- oder Replikatorwachstum, verursacht durch die gewünschte Wechselwirkung der neuen Protease mit einem Selektionsmolekül, das durch den Wirt exprimiert wird. Das Verfahren wird durchgeführt durch die Expression vielfacher Kopien der vermeintlich neuen Protease oder einer Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen in einer Population an Wirtszellen, die einen Zellwachstumsfaktor und/oder einen Replikator-(z. B. einen Virus-)Wachstumsfaktor und ein Substrat von Interesse oder ein Analogon davon, das funktionell mit diesem Wachstumsfaktor verbunden ist, enthalten, und durch das Auferlegen von Selektionsbedingungen an die Population aus Wirtszellen, um jene Wirte oder jene Replikatoren zu selektieren, die eine neue Protease exprimieren, welche mit dem Substrat von Interesse oder Analogon in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern.
Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf Anspruch 1 definiert.
Auswahl von Wirtverfahren
Die Isolation, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, das eine neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit einem Substrat von Interesse in der Lage ist, kann durch die Schritte der Expression von vielfachen Kopien einer vermeintlich neuen Protease oder einer Vielzahl an vermeintlich neuen Proteasen in einer Population aus Wirtszellen und des Hinzufügens oder Exprimierens eines Zellwachstumsfaktors, eines Substrates von Interesse oder Analogons davon mit einer Erkennungssequenz, die das Substrat von Interesse repräsentiert und welche funktionell in Verbindung steht mit dem Wachstumsfaktor, und wahlweise einer Wachstumsfaktor-Modulierungseinheit, und des Auferlegens von Selektionsbedingungen an die Population aus Wirtszellen, um für jene Wirte zu selektieren, die Gene enthalten, die zur Expression einer neuen Protease in der Lage sind, welche mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern, durchgeführt werden Die Reihenfolge der Expression der vermeintlich neuen Proteasen und die Reihenfolge der Expression und/oder Zugabe des Wachstumsfaktors, Substrates von Interesse oder Analogen davon und der Modulationseinheit relativ zueinander und zu der Expression der vermeintlich neuen Proteasen und die zeitliche Steuerung des Selektionsvorgangs bezüglich irgendeinem solcher Schritte ist eine Angelegenheit der Wahl. In einigen Ausführungsbeispielen kann es vorteilhaft sein, Selektionsbedingungen einer Population an Wirten oder Replikatoren vor der Modifikation des Wirts oder Replikators aufzuerlegen, um Wachstumsfaktoren, Erkennungssequenzen oder Modulierungseinheiten oder Selektionsmoleküle, die dieselben einschließen, zu exprimieren, um dadurch einen gewünschten Wirt- oder Replikatorstamm für die nachfolgende Selektion zu entwickeln.
Das Verfahren kann durchgeführt werden durch Einführen einer homogenen Population an Genen, welche vielfache Kopien vermeintlich neuer Protease exprimieren können, oder eine heterogene Population an Genen, welche eine Vielzahl an unterschiedlichen vermeintlich neuen Proteasen oder Proteasen mit einem evolutionären Potenzial exprimieren können, in eine Population an Wirtszellen, deren Genom künstlich geändert worden ist, um einen Zellwachstumsfaktor und eine Erkennungssequenz zu exprimieren, welches das Substrat von Interesse repräsentiert und welches funktionell mit dem Wachstumsfaktor verbunden ist, durch das Auflegen von Selektionsbedingungen, z. B. Kultivieren oder Inkubieren der Population an Wirtszellen unter Selektionsbedingungen, um für jene Wirte zu selektieren, die Gene enthalten, die in der Lage sind, eine neue Protease zu exprimieren, welche mit der Sequenz in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern, und durch das Isolieren/Reinigen des Gens von Interesse aus der ausgewählten Zellpopulation. Das Gen von Interesse kann dann verwendet werden, um zusätzliche Mengen der neuen Protease zu exprimieren.
Der Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz können als einzelne Moleküle oder Molekülgruppen vorhanden sein oder können zusammen in Molekülen verbunden sein, die beide einschließen. Die Wirtszellen, z. B. E. coli, können durch die Zugabe des Wachstumsfaktors und/oder der Erkennungssequenz von außen modifiziert werden oder der Wachstumsfaktor und/oder die Erkennungssequenz kann durch den Wirt exprimiert werden. Durch das Auferlegen von Selektionsbedingungen auf die Population an Wirtszellen ist es möglich, für jene Wirtszellen zu selektieren, die Gene oder Mutationen davon enthalten, die in der Lage sind, eine neue Protease zu exprimieren, welche die gewünschte Wechselwirkung mit der Erkennungssequenz hat und welche dadurch die Aktivität des Wachstumsfaktors beeinträchtigt.
Auswahl von Replikatorverfahren
Die Isolierung, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, welches eine neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit einem Substrat von Interesse in der Lage ist, kann auch durchgeführt werden durch das Exprimieren vielfacher Kopien einer vermeintlich neuen Protease oder einer Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen, die durch einen Replikator, z. B. ein Virus, kodiert werden, in einer Population an Wirtszellen, die Wachstumsfaktoren für den Replikator, ein Substrat von Interesse oder Analogon davon, welches eine Erkennungssequenz einbaut, die das Substrat von Interesse repräsentiert und die mit dem Wachstumsfaktor funktionell in Verbindung steht, und wahlweise eine Wachstumsfaktor-Modulierungseinheit enthält oder exprimiert, und durch das Auferlegen von Selektionsbedingungen an die Population von Wirtszellen, um für den Replikator, z. B. Virus, zu selektieren, der in der Lage ist, einen neue Protease zu exprimieren, welche mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern.
Diese Verfahren können z. B. durchgeführt werden durch Einführen eines Replikators, z. B. ein Virus, in eine Population an Wirtszellen, deren Genom künstlich geändert worden war, um einen Wachstumsfaktor für das Virus und eine Erkennungssequenz, die das Substrat von Interesse repräsentiert, welches funktionell mit dem Wachstumsfaktor in Verbindung steht, zu exprimieren, durch Kultivieren oder Inkubieren jener Population an Wirtszellen, um für die Viren zu selektieren, die in der Lage sind, die neue Protease zu exprimieren, welche mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität des Wachstumsfaktors zu ändern, und durch Isolieren/Reinigen des Gens von Interesse. Wie bei den Wirtsverfahren ist die Reihenfolge der Expression und/oder Zugabe der zahlreichen Bestandteile des Vorgangs und die Reihenfolge der Expression und/oder Zugabe relativ zu der Auferlegung von Selektionsbedingungen eine Frage der Wahl.
Bei solchen Verfahren wird eine homogene Population an Viren, die vielfache Kopien einer vermeintlich neuen Protease exprimiert, oder eine heterogene Population an Viren, die eine Vielzahl mutierter Gene enthält, wovon jedes eine andere vermeintlich neue Protease exprimieren kann, in eine Population modifizierter Wirtszellen eingeführt, welche einen funktionell herunterregulierten Wachstumsfaktor, der notwendig für das Wachstum und/oder die Replikation der Viren ist, und eine Erkennungssequenz enthalten, wie oben beschrieben. Jene Viren, welche neuen Proteasen exprimieren, die mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung treten und dadurch die Aktivität des Wachstumsfaktors herauf regulieren, werden innerhalb des Wirtes replizieren. Jene Viren, die neue Proteasen exprimieren, die nicht die gewünschte Wechselwirkung haben, werden nicht repliziert werden. Die Wirtszellen können dann unter Selektionsbedingungen inkubiert oder kultiviert werden, um die Population der Viren zu selektieren, welche die neuen Proteasen von Interesse exprimieren.
In einem bevorzugten Verfahren werden die Genome der Wirtszellen künstlich geändert, um ein Molekül oder Moleküle zu exprimieren, die den Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz einschließen, welche des Substrat von Interesse repräsentiert und welche funktionell verbunden ist mit dem Wachstumsfaktor. Die Population von Zellen wird dann durch einen Replikator, z. B. ein Virus, infiziert, dessen Genom in der Lage ist, vielfache Kopien einer Protease oder einer Vielzahl unterschiedlicher Proteasen zu exprimieren, welche mit dem Selektionsmolekül, das durch das rekombinante Genom der Wirtszelle exprimiert wird, in Wechselwirkung treten können. Jene neuen Proteasen, die mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung treten, um die Funktion des Wachstumsfaktors zu ändern, werden den Viren einen selektiven Wachstumsvorteil verleihen, welche die neue Protease der Wahl exprimieren. Die Population an Wirtszellen kann dann kultiviert oder inkubiert werden, um eine amplifizierte Population des gewünschten Virus zu schaffen.
Wie bei der Wirtsselektion werden die Genome der Wirtszellen künstlich geändert, um einen Wachstumsfaktor und eine Erkennungssequenz zu exprimieren, als einzelne Moleküle oder als physikalische oder chemische Assoziationen oder Kombinationen davon. Die Erkennungssequenz repräsentiert das Substrat von Interesse und ist funktionell mit dem Replikator-Wachstumsfaktor assoziiert. Wünschenswerterweise wird das Genom durch rekombinante Verfahren modifiziert, um ein Selektionsmolekül, z. B. ein Fusions- oder Deletionsprotein, zu exprimieren, welches sowohl den Wachstumsfaktor als auch die Erkennungssequenz einschließt. Der Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz können mit einer Selektionseinheit verbunden sein, welche die Aktivität des Wachstumsfaktors moduliert. Die Selektionseinheit kann ein einzelnes Moleküle) oder kann Teil eines Selektionsmoleküls(en), z. B. ein Fusions- oder Deletionsprotein, sein, welches auch den Wachstumsfaktor und die Erkennungssequenz einschließt.
Die zu erhaltende neue Protease kann durch eine Kaskade von Ereignissen wirken, das heißt sie kann mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung treten, um den gewünschten Effekt zu verursachen, oder die Wechselwirkung kann eine Kaskade aus Ereignissen mit irgendeiner Anzahl an Zwischenschritten starten, welche letztlich die Aktivität des Wachstumsfaktors beeinflusst. Jedes Molekül in der Kaskade kann ein natürliches oder bearbeitetes Substrat in der Wirtszelle oder ein von außen zugeführtes Substrat sein oder kann selber eine neue Protease sein.
Die Wirtsselektions- und Replikatorselektionsverfahren der Erfindung können verwendet werden, um einen breiten Bereich an neuen Proteasen zu schaffen, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit einer Protease-Erkennungssequenz in der Lage sind.
Das universale Selektionsverfahren verknüpft die Bildung von im Grunde genommen irgendeinem Produkt mit dem Wachstum einer Zelle. Zum Beispiel kann man in der Reaktion A + B → C (katalysiert durch X), wobei die Produktion von C mit der Wachstumsfähigkeit einer Zelle gekoppelt wird, obwohl C sogar gar keine Wirkung auf das Wachstum der Zelle direkt oder indirekt haben kann, jenes Mitglied einer Population an vermeintlich neuen Proteasen selektieren, welches in der Lage ist, die Reaktion zu katalysieren, oder welches in der Lage ist, in irgendeinem Wege zu wirken, um zu der Produktion von C beizutragen.
Die Erfindung bietet signifikante Vorteile gegenüber den Techniken des Standes der Technik. Sie bietet einen inhärenten Effizienzanstieg gegenüber dem Screening und legt die Last eher auf das experimentelle System als den Experimentator. Bei der Selektion bestimmen die Umgebungsbedingungen, welche Mitglieder einer Population lebensfähig sind. Durch die saubere Definition der Selektionsvorgänge und Bedingungen können jene Klone mit den gewünschten Eigenschaften aus einer großen Population erhalten werden. Die Selektionsvorgänge der Erfindung haben den Vorteil, dass sie verwendet werden können, um eine enorme Reihe neuer Proteasen zu erhalten, von denen jede hochspezifisch für eine gegebene Erkennungssequenz und Wechselwirkung ist. Im Gegensatz dazu sind die primitiven Selektionsverfahren des Standes der Technik roh und empirisch.
Detaillierte Beschreibung der Erfindungsdefinitionen
Gewisse hierin verwendete Begriffe werden wie folgt definiert:
Der Begriff "Isolierung" bedeutet das Hervorbringen eines in der Natur existierenden Gens aus einem bestehenden Gen.
Der Begriff "Schaffen" bedeutet das Hervorbringen eines Gens, das nicht in der Natur gefunden wird, welches ein neues Molekül kodiert.
Die Begriffe "gerichtete Evolution" und "Schaffen durch gerichtete Evolution" bedeutet das Hervorbringen eines Gens, das nicht in der Natur gefunden wird, welches ein neues Molekül durch das Mutieren von Genen unter rationell gestalteten Selektionsbedingungen und -drucken kodiert.
Der Begriff "neue Proteasen mit neuer Funktion" umfasst irgendeine Protease mit einer zuvor unbekannten Struktur und/oder Sequenz und/oder physikalischen/chemischen Eigenschaften.
Der Begriff "funktionell verstärkte neue Protease" umfasst Proteasen mit einer zuvor unbekannten Struktur und/oder Sequenz und/oder physikalischen chemischen Eigenschaften, deren Funktion und Spezifität bekannt oder realisiert sind, die sich jedoch in ihrem Grad der bekannten Funktion unterscheiden.
Der Begriff "neue Protease" schließt irgendeine Protease mit einer zuvor unbekannten Struktur und/oder Sequenz und/oder physikalischen/chemischen Eigenschaften oder eine neue Protease mit neuer Funktion oder eine funktionell verstärkte neue Protease ein und schließt Proteine, Peptide und irgendwelche substituierten oder modifizierten Versionen davon ein.
Die Begriffe "vermeintlich neue Protease", "vermeintlich funktionell verstärkte neue Protease" oder "vermeintlich neue Protease mit neuer Funktion" bedeutet irgendeine Protease, bekannt oder anderweitig, welche ein Fachmann als einen Kandidaten für die Isolierung, Schaffung oder gerichtete Evolution gemäß den Verfahren der Erfindung erachtet.
Der Begriff "Substrat von Interesse" schließt irgendein natürlich vorkommendes Molekül oder synthetisches Molekül, ob bekannt oder unbekannt, ein, von welchem eine chemische und/oder physikalische Wechselwirkung gewünscht wird. Das Substrat von Interesse kann organische oder anorganische Moleküle oder Biomoleküle, z. B. Proteine, Oligonucleotide, Lipide und Polysaccharide umfassen. Substrate von Interesse schließen z. B. Verbindungen, die bekannte Substrate für Enzymwirkung sind, Peptide, Polypeptide und Proteine verschiedener Beschreibung ein, die zur Reaktion zu bringen, zu spalten, zu koppeln, zu modifizieren oder zu substituieren sind oder die durch ein neues Molekül zu binden sind.
Der Begriff "Analogon des Substrates von Interesse" bedeutet ein Molekül oder einen Teil davon, der eine Erkennungssequenz enthält, welche es zu einem funktionellen Analogon des Substrates von Interesse macht.
Der Begriff "Gen" wird in seiner breitesten, allgemein verstandenen Bedeutung verwendet und schließt irgendeine Nucleinsäure, z. B. Oligonucleotide (DNS, RNS etc.) ein, die zur Expression fähig sind, und schließt weiter Kombinationen oder Sätze an Genen ein.
Der Begriff "Genom" bezieht sich auf das gesamte Komplement von Genen, die in der Lage sind, exprimiert zu werden, einschließlich chromosomaler Gene, Plasmide, Transposons und viraler DNS.
Der Begriff "Expression" hat seine allgemein verstandene wissenschaftliche Bedeutung und schließt die Replikation von Oligonucleotiden, Transkription, Translation und reverse Transkription ein.
Der Begriff "Expression durch den Wirt" bedeutet die Expression durch irgendeinen Teil des Wirtsgenoms.
Die Begriffe "Wechselwirkung" und "zur Wechselwirkung fähig" umfassen breit irgendwelche intermolekularen und/oder intramolekularen Wirkungen, einschließlich chemischer Reaktionen, Katalyse oder physikalischer Bindung. Die neuen Proteasen, die durch die Verfahren der Erfindung geschaffen werden sollen, können zur Reaktion mit der Erkennungssequenz fähig sein. Solche Reaktionen können auf Wechselwirkungen zwischen dem neuen Molekül und der Erkennungssequenz beschränkt werden. Wechselwirkungen können auch Katalysen einschließen, bei denen die neue Protease katalytisch auf die Erkennungssequenz wirkt, um Proteolyse zu bewirken.
Der Begriff "Wirtszelle" schließt einen lebenden Organismus ein, der einzellig, vielzellig, prokaryotisch oder eukaryotisch ist, z. B. Hefe, COS-Zellen, CHO-Zellen oder Hybridom-Zellen.
Der Begriff "Wachstumsfaktor", wie er hierin verwendet wird, ist ein Molekül bzw. sind Moleküle, die einen Wachstumsvorteil oder -nachteil gegenüber einer Wirtszelle oder einem Replikator verleihen. Typische Wachstumsfaktoren schließen Nährstoffe, Enzyme, die für den Metabolismus von Nährstoffen notwendig sind, und Bindungs- und Strukturproteine ein, und Proteine, die in die Replikation, den Metabolismus, die Bildung und Aufrechterhaltung von essenziellen strukturellen Bestandteilen oder in zelluläres und subzelluläres Wachstum verwickelt sind.
Der Begriff "Erkennungssequenz" wird in seinem universellsten chemischen Sinne verwendet und bedeutet irgendwelche chemischen Atom(e), Bindung(en), Molekül(e), submolekulare Gruppe(n), die Kombination von irgendeinem der Vorstehenden, oder irgendeinen physikalischen oder elektrischen Zustand oder Konfiguration davon, z. B. eine Aminosäuresequenz. Die Erkennungssequenz kann ein gesondertes Molekül oder kann ein submolekularer Teil eines komplexen Moleküls sein, das den Wachstumsfaktor und/oder die Selektionseinheit einschließt.
Es ist wesentlich, dass die Erkennungssequenz eine gewisse funktionelle Wechselwirkung entweder direkt oder indirekt mit dem Wachstumsfaktor und/oder der Selektionseinheit hat, der Gestalt, dass dann, wenn die gewünschte Wechselwirkung zwischen der neuen Protease und der Erkennungssequenz stattfindet, die Funktion des Wachstumsfaktors beeinflusst wird und einen Einfluss (positiv oder negativ) auf Zell- oder Replikatorwachstum hat. Die Funktion und/oder die Struktur der Selektionseinheit und/oder der Erkennungssequenz können kombiniert werden und die Funktion und/oder Struktur der Erkennungssequenz und des Wachstumsfaktors können ebenfalls kombiniert werden. Wie weiter unten beschrieben, sind Fusions- oder Deletionsproteine besonders nützlich bei den Selektionsverfahren der Erfindung und stellen ein Ausführungsbeispiel dar, bei dem alle drei Funktionen in einem einzelnen Molekül kombiniert werden.
Modifikationen der Erkennungssequenz ermöglichen die Selektion multipler neuer Proteasen. Zum Beispiel kann ein großes Protein, das ein Substrat von Interesse ist, in der Lage sein, die Insertion oder das Ersetzen einer Aminosäurestrecke zu tolerieren, ohne seine Funktion zu verlieren (29). Es ist möglich, in solch ein Protein eine Reihe unterschiedlicher möglicher proteolytischer Erkennungssequenzen einzufügen, um multiple Proteasen gewünschter Spezifität zu erhalten.
Es ist auch wesentlich, dass die Erkennungssequenz das Substrat von Interesse repräsentiert. Zum Beispiel kann die Erkennungssequenz eine Aminosäuresequenz eines Proteins sein, für das kein bekanntes oder zufrieden stellendes proteolytisches Enzym existiert. Der Einbau jener Aminosäuresequenz oder gewisser Analoga davon als Erkennungssequenzen bei den Verfahren der Erfindung wird zu der Schaffung neuer Proteasen mit Spezifität und/oder hoher Umsatzrate für die Proteolyse jener Aminosäuresequenz führen.
Der Begriff "Selektionseinheit" oder "Modulationseinheit" bezieht sich auf jedes Molekül, welches in physikalischer oder chemischer Verbindung mit einem Wachstumsfaktor entweder direkt oder indirekt die Funktion jenes Wachstumsfaktors entweder erhöht oder erniedrigt. Die Selektionseinheit kann z. B. ein sperriges Protein sein, welches wegen sterischer Behinderung und Konformationsänderungen die Wirkung eines Enzyms, das für das Zell- oder virale Wachstum notwendig ist, inaktiviert oder sie funktionell verleiht.
Die Begriffe "Selektionsmolekül" oder "universelles Selektionsmolekül" beziehen sich auf ein Molekül, welches einen Wachstumsfaktor und eine Erkennungssequenz und wahlweise eine Modulationseinheit einbaut.
Der Begriff "künstliches Selektionsmolekül" bedeutet ein erdachtes Selektionsmolekül, das eine Erkennungssequenz enthält, welche nicht ein innerer Teil eines natürlichen oder synthetischen Wachstumsfaktors ist.
Der Begriff "Replikator" bezieht sich auf subzelluläre Einheiten, die zur Reaktion fähig sind, z. B. Plasmide, Viren, Bakteriophagen, selbst-replizierende Oligonucleotide wie RNS-Moleküle, die Erkennungssequenzen für Replikase(n), Mycoplasma etc. haben. Replikatorexpression bezieht sich auf die Expression, die von einem Replikator durch die Verwendung von Wirts- und/oder Replikatorbestandteilen gelenkt wird.
Die Begriffe "Selektion", "Selektionsbedingungen" und "Selektionsdruck" beziehen sich auf allgemein bekannte, ebenso wie auf neue Vorgänge, um eine Population an Wirtszellen in der Abwesenheit eines essenziellen Nährstoffes auf Verbindungen, die nicht durch elterliche Stämme genutzt werden können, in der Anwesenheit von Toxinen, bei verschiedenen besonderen Umweltbedingungen, z. B. Temperatur, Licht, pH-Wert, oder in der Anwesenheit gemischter Kulturen wachsen zu lassen, was gewisse, jedoch nicht alle Mitglieder der Population dazu bringen wird, zu überleben und zu replizieren.
Ein "Nucleotid" ist eine der fünf Basen: Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil plus ein Zucker, Desoxyribose oder Ribose, plus ein Phosphat.
Ein "Oligonucleotid" ist eine Sequenz, die von wenigstens zwei Nucleotiden gebildet wird, und ein "Polynucleotid" ist ein langes Oligonucleotid und kann entweder RNS oder DNS mit oder ohne modifizierten Basen sein. Während der Begriff Oligonucleotid allgemein in der Technik verwendet wird, um kleinere Nucleinsäureketten zu bezeichnen, und "Polynucleotid" allgemein in der Technik verwendet wird, um größere Nucleinsäureketten, einschließlich DNS- oder RNS-Chromosomen oder Fragmente davon, zu bezeichnen, ist die Verwendung des einen oder des anderen Begriffes hierin keine Begrenzung oder Beschreibung der Größe, wenn es nicht ausdrücklich als solche festgestellt wird.
Der Begriff "Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Polynucleotid irgendeiner Länge, einschließlich DNS- oder RNS-Genomen oder Fragmenten davon, mit oder ohne modifizierte Basen, wie oben beschrieben.
Der Begriff "Isolation/Reinigung" bezieht sich auf Techniken für die Isolierung, Reinigung oder Extraktion, wie diese Begriffe üblicherweise verwendet werden, um Verfahren für die Wiedergewinnung eines Gens oder eines Moleküls aus einer Zelle und/oder einem Replikator und/oder einem Medium zu beschreiben.
Der Begriff "Mutagenese" bezieht sich auf Techniken für die Schaffung heterogener Populationen von Genen, z. B. durch Bestrahlung, chemische Behandlung, Replikation mit niedriger Genauigkeit, etc.
In den Zeichnungen
Die 1A und 1B sind schematische Darstellungen eines Ausführungsbeispiels eines Wirts-Selektionsverfahrens der Erfindung für die Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, das eine neue Protease kodiert.
Die 2A, 2B und 2C sind schematische Darstellungen eines Ausführungsbeispiels eines viralen Replikators der Erfindung für die Schaffung oder gerichtete Evolution eines Gens, das eine neue Protease kodiert.
3A und 3B sind schematische Darstellungen eines zellfreien Ausführungsbeispiels der Erfindung.
Mit Bezugnahme auf die 1A und 1B bezieht sich das Bezugszeichen 10 auf eine Wirtszelle (E. coli), die das Chromosom 12 aufweist. Die Zelle wird bearbeitet, wie anderswo beschrieben, um eine Deletionsmutante 14 zu sein, der die Fähigkeit fehlt, einen essenziellen Wachstumsfaktor zu exprimieren. Die Deletionsmutante 14 von E. coli wird weiter bearbeitet, wie beim Bezugszeichen 16 gezeigt, um ein Selektionsmolekül zu kodieren, welches den essenziellen Wachstumsfaktor für die Wirtszelle in einer herunterregulierten Form und eine Erkennungssequenz einschließt.
Bezugszeichen 18 bezieht sich auf ein Plasmid, das bearbeitet ist, wie bei Bezugszeichen 20 gezeigt, um den Replikationsstartpunkt des Bakteriophagen T7 und die T7-Replikationsmaschinerie mit geringer Genauigkeit zu kodieren. Das Plasmid 20 wird weiter bearbeitet, um eine heterogene Population an Genen zu kodieren, welche vermeintlich neue Proteasen exprimieren. Das so bearbeitete Plasmid wird beim Bezugszeichen 22 gezeigt.
Das Plasmid 22 wird in den transformierten, deletionsmutierten Wirt 16 eingeführt und in einer geeigneten Umgebung in einem nährstoffreichen, nicht begrenzenden Medium kultiviert, wie gezeigt beim Bezugszeichen 24. Plasmide, welche eine neue Protease mit der gewünschten funktionellen Wechselwirkung mit einem durch den deletionsmutierten Wirt 16 exprimierten Selektionsmolekül exprimieren, sind beim Bezugszeichen 26 gezeigt.
Inkubation in dem nährstoffreichen, nicht begrenzenden Medium im Inkubator 24 resultiert in dem Wachstum einer Population an Wirtszellen 60, welche die Plasmide 22 und das Plasmid 26 enthalten. Die Population transformierter Wirtszellen ist beim Bezugszeichen 30 gezeigt.
Die Population inkubierter Wirtszellen wird dann in einem Chemostaten in nährstoffbegrenzendem Medium selektiert. Dies verleiht jenen transformierten Wirtszellen 16 einen Wachstumsvorteil, welche die Plasmide 26 beherbergen, die neue Proteasen mit der gewünschten Funktion der Wechselwirkung mit dem Selektionsmolekül und des Heraufregulierens des Wachstumsfaktors haben. Die selektierte Population an Wirtszellen wird beim Bezugszeichen 32 gezeigt. Wie gesehen werden kann, hatten jene Zellen, die ein Plasmid beherbergen, welches eine neue Protease mit der gewünschten Funktion kodiert, einen bevorzugten Wachstumsvorteil.
Die Plasmide 26 werden dann aus der ausgewählten Population an Zellen 32 isoliert gereinigt. Die neuen Proteasegene werden kloniert, sequenziert und funktionell charakterisiert.
Mit Bezugnahme auf die 2A, 2B und 2C bezieht sich das Bezugszeichen 50 auf ein Plasmid, das funktionelle Gene des Bakteriophagen T7 trägt. Die Plasmide 50 werden in die E.-coli-Wirtszelle 52 mit dem Chromosom 54 eingeführt. Der transformierte Wirt wird beim Bezugszeichen 56 gezeigt.
Der Wildtyp-T7-Bakteriophage wird beim Bezugszeichen 58 gezeigt. Eine Population, 60, an deletionsmutierten Bakteriophagen, die nicht einen Wachstumsfaktor, der für das Replikatorwachstum oder die Replikation wesentlich sind, kodiert, wird bearbeitet, um vermeintlich neuen Proteasen zu kodieren.
Die heterogene Population an T7-Deletionsmutanten wird in die transformierte Wirtszelle 56 eingeführt, welche die Funktion der T7-Deletionsmutanten vervollständigt, und eine Population jener Deletionsmutanten wird inkubiert. Die Population der Deletionsmutanten ist beim Bezugszeichen 62 gezeigt. Die eine T7-Mutante in der Population, welche das Gen trägt, das eine neue Protease exprimiert, die zu der gewünschten Wechselwirkung fähig ist, ist beim Bezugszeichen 64 gezeigt.
Das Bezugszeichen 66 bezieht sich auf ein Plasmid, das die Gene trägt, welche ein Selektionsmolekül exprimieren, das den vom Phagen 60 und 64 deletierten Wachstumsfaktor, eine Erkennungssequenz und eine Modulationseinheit enthält. Das Plasmid 66 wird in die E.-coli-Wirtszelle 68 eingeführt, die das Chromosom 70 enthält, wodurch eine zweite Population transformierter E.-coli-Wirte gebildet wird, wie gezeigt beim Bezugszeichen 72.
Der T7-Deletionsmutanten-Population, die in der ersten Population an transformierten Wirtszellen, welche ihre Deletionen vervollständigen, aufgewachsen ist, wird dann ermöglicht, Zellen in der zweiten Population, welche die Selektionsmoleküle exprimiert, zu infizieren. Der Infektionsschritt wird beim Bezugszeichen 74 gezeigt und die Inkubation der infizierten zweiten Population an Wirtszellen wird beim Bezugszeichen 76 gezeigt. Die virale Replikation geschieht nur in jenen Wirtszellen, in welchen die neue Protease mit gewünschter Funktion exprimiert wird. Der Vorgang kann chargenweise durchgeführt werden oder zusätzliche Mengen an mutierten T7-Bakteriophagen können zu der zweiten Population transformierter Wirtszellen in einer kontinuierlichen Weise, wie gezeigt, hinzugefügt werden, bis Zelllyse beobachtet wird. Die Lyse einer Zelle in der inkubierten zweiten Population transformierter Wirtszellen wird beim Bezugszeichen 78 gezeigt. Wie gesehen werden kann, wurde die Population an T7-Deletionsmutanten 64, welche die neue Protease gewünschter Funktion kodiert, wesentlich vervielfacht, wie beim Bezugszeichen 80 gezeigt.
Die virale Population, welche die gewünschte neue Protease exprimiert, expandiert und infiziert andere Zellen nach der Zelllyse. Es wird kein neuer T7 zu der Kultur hinzugefügt. Die Expansion und Infektion anderer Zellen werden beim Bezugszeichen 82 gezeigt. Die Vielfachinfektionen rufen mehr Virionen, welche die gewünschte neue Protease tragen, ebenso wie jene, welche die neue Protease nicht tragen, hervor. Dies wird beim Bezugszeichen 84 gezeigt.
Die selektierte und amplifizierte virale Population, welche die neue Protease mit gewünschter Funktion kodiert, gezeigt beim Bezugszeichen 86, wird aus den kultivierten Wirtszellen isoliert/gereinigt und dann auf Zellen, welche das Selektionsmolekül exprimieren, in einer niedrigen Verdünnung hochgezogen. Dies separiert einzelne virale Klone, welche die Gene tragen, die die neue Protease mit gewünschter Funktion kodieren. Diese Isolation/Reinigung wird beim Bezugszeichen 88 gezeigt.
Detaillierte Beschreibung
Die bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung werden weiter unten mit Bezug auf etliche besondere Merkmale der Erfindung beschrieben.
I. Das Selektionsmolekül und seine Bestandteilsteile
Selektionsmoleküle werden verwendet, um den Selektionsdruck so zu lenken, dass ein gewünschtes Gen erhalten wird. Selektionsmoleküle schließen Wachstumsfaktoren und Erkennungssequenzen und wahlweise Modulationseinheiten ein. Einige sind in der Lage, verwendet zu werden, um vielfache unterschiedliche neue Gene durch Nutzen der Erkennungssequenz in einer kassettenartigen Weise zu selektieren. Wenn einmal eine rationelle Konfiguration der gewünschten Bestandteile etabliert worden ist, werden Schritte unternommen, um die Mutation des Selektionsmoleküls zu verhindern. Dies stellt ein konstantes Ziel für die Population neuer Proteasen bereit und dient dazu, die Selektion oder evolutionäre Vorgänge zu lenken.
A. Der Wachstumsfaktor
Wachstumsfaktoren sind alle Faktoren, die in der Lage sind, einer Zelle oder einem Replikator einen Wachstumsvorteil oder -nachteil zu verleihen. Wachstumsfaktoren schließen ein Nährstoffe wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Energiequellen, Phosphatquellen, anorganische Ionen, Nucleinsäuren, Aminosäuren etc.; Toxine wie Antibiotika, Inhibitoren von Enzymen, die für die Replikation kritisch sind, Detergenzien etc.; Enzyme, die essenziell sind für das Zell- oder Replikatorwachstum oder welche dem zellulären Wachstum einen Vorteil oder Nachteil verleihen, wie Polymerasen, Ligasen, Topoisomerasen, Enzyme, die Reaktionen bei der Biosynthese von Proteinen katalysieren etc.; Moleküle, deren Funktion nicht katalytisch, sondern eher strukturell oder basierend auf den Bindungseigenschaften der Moleküle ist, wie Actin, Lipide, Nucleosomen, Rezeptoren, Hormone, cyclisches AMP etc.; und Co-Enzyme oder Co-Faktoren wie Wasser, anorganische Ionen, NADPH, Co-Enzym A etc.
B. Die Erkennungssequenz
Die Erkennungssequenz ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das mit der neuen Protease in Wechselwirkung tritt. Als solche können Erkennungssequenzen eine Reihe unterschiedlicher Strukturen wie eine Sequenz aus Aminosäuren oder Nucleinsäuren sein. Diese Sequenz kann eine einzigartige Sequenz repräsentieren oder sie kann eine Klasse verwandter Sequenzen repräsentieren. Die Erkennungssequenz kann auch eine bestimmte Konformation oder Klasse an Konformationen verschiedener Moleküle sein, z. B. eine bestimmte dreidimensionale Struktur eines Proteins, anorganisches Moleküls, Lipids, Oligosaccharids etc. Zusätzlich dazu kann die Erkennungssequenz ein Analogon von irgendeinem der vorangegangenen sein.
Zusätzlich können die möglichen Erkennungssequenzen in Abhängigkeit von dem Selektionssystem auf einen sehr spezifischen Bereich, Konformation, Sequenz etc. begrenzt sein oder können ein breiter Satz möglicher Erkennungssequenzen sein. Zum Beispiel ist die wahre Erkennungssequenz durch die Verwendung spezifischer, multipler, redundanter Sequenzen, die einer Vielzahl von Selektionsmolekülen gemeinsam sind, mit welchen die gewünschte neue Protease in Wechselwirkung treten könnte, um das Wachstum zu modulieren, auf jene spezifische Sequenz begrenzt, die allen Selektionsmolekülen gemeinsam zu eigen ist. Auf der anderen Seite kann die mögliche Erkennungssequenz durch die Verwendung von nur einem Selektionsmolekül oder durch die Verwendung multipler Selektionsmoleküle mit großen Regionen, die allen gemeinsam sind, eine Reihe von Regionen, Konformationen, Sequenzen etc. innerhalb des einen Selektionsmoleküls oder innerhalb der multiplen Selektionsmolekülen zu eigenen großen Regionen sein. Erkennungssequenzen können folglich hochspezifisch für eine Region, Konformation, Sequenz etc. sein oder können für einen breiteren, doch definierten Satz an Regionen, Konformationen, Sequenzen etc. spezifisch sein.
C. Die Modulationseinheit
Zentral für die Erfindung ist das Konzept der Modulierung der Aktivität des Wachstumsfaktors. Es gibt viele Wege, biologische Aktivität zu modulieren, und die Natur hat eine Anzahl von Präzedenzfällen. Die Modulation der Aktivität kann durchgeführt werden durch Mechanismen, so kompliziert und schwierig wie die allosterisch induzierte quartäre Änderung auf die einfache Anwesenheit/Abwesenheit, z. B. Expressions-/Degradationssysteme. In der Tat wird die Repression/Aktivierung der Expression vieler biologischer Moleküle selber durch Moleküle vermittelt, deren Aktivitäten durch eine Reihe an Mechanismen moduliert werden können.
Eine Tabelle chemischer Modifikationen von bakteriellen Proteinen erscheint in (2) auf Seite 73. Wie in der Tabelle bemerkt, sind gewisse Modifikationen in den genauen Zusammenbau verwickelt und andere Modifikationen sind es nicht, in jedem Fall sind solche Modifikationen jedoch in der Lage, eine Modulation der Funktion zu bewirken.
In gewissen Beispielen kann die Modulation funktioneller Nützlichkeit einfach durch die genaue/ungenaue Lokalisierung des Moleküls vermittelt werden. Moleküle können nur tätig sein, um einen Wachstumsvorteil oder -nachteil bereitzustellen, falls sie auf eine bestimmte Örtlichkeit gerichtet sind. Zum Beispiel ist Stärke ein Makromolekül, welches typischerweise nicht von Bakterien aufgenommen wird, so ist es notwendig, Enzyme zu sezernieren, die für ihren Abbau verantwortlich sind, z. B. Amylasen, so dass sie in nützliche Energieformen umgewandelt werden kann. Folglich reguliert die Produktion und Zurückhaltung von Amylasen innerhalb der Bakterien ihre funktionelle Nützlichkeit herunter, wenn die Bakterien in einem Stärke begrenzenden Medium wachsen gelassen werden. Es ist nur dann, wenn die Amylasen abgesondert werden, der Fall, dass sie in der Lage sind, den Bakterien einen Wachstumsvorteil zu verleihen. Die inhärenten enzymatischen Fähigkeiten der Amylase können dieselben innerhalb oder außerhalb der Bakterien sein, ihre funktionelle Nützlichkeit wird jedoch dramatisch herunter moduliert, wenn sie intrazellulär zum Ziel genommen werden, im Vergleich zu dem extrazellulären Zum-Ziel-Genommen-Werden.
Das Lokalisierungstargeting von Proteinen, durchgeführt durch Abspalten von Signalpeptiden, ist ein Weg, bei welchem die Modulation funktioneller Nützlichkeit durch molekulares Targeting in dieser Erfindung verwendet wird. In diesem Fall wird die Selektion für eine spezifische katalytische Endoproteaseaktivität selektiert.
Die funktionelle Nützlichkeit von Enzymen kann auch durch Ändern ihrer Fähigkeit, eine Reaktion zu katalysieren, moduliert werden. Solch eine Modulation kann durchgeführt werden durch differenzielle Lokalisierung (das heißt permissive lokale Umgebung gegen nicht permissive), dies braucht jedoch nicht der Mechanismus zu sein. Erläuternde Beispiele modulierter Moleküle sind Zymogene, die Bildung/Disassoziation funktioneller Komplexe vielfacher Untereinheiten, Polyproteinketten von RNS-Virus, allosterische Wechselwirkungen, allgemeine sterische Behinderung (kovalent und nicht kovalent) und eine Reihe chemischer Modifikationen wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Adenylierung und Uridinylierung ((2), S. 73, 315).
Zymogene sind Beispiele natürlich vorkommender Proteinfusionen, welche die Modulation enzymatischer Aktivität bewirken. Zymogene sind eine Klasse an Proteinen, die durch begrenzte Proteolyse in ihren aktiven Zustand umgewandelt werden ((3), S. 54). Die Natur entwickelte einen Mechanismus der Herunterregulierung der Aktivität gewisser Enzyme wie Trypsin, indem diese Enzyme mit zusätzlichen "Leit"-Peptidsequenzen an ihren Aminotermini exprimiert werden. Mit der zusätzlichen Peptidsequenz befindet sich das Enzym in dem inaktiven Zymogenzustand. Nach der Abspaltung dieser Sequenz wird das Zymogen in seinen enzymatisch aktiven Zustand umgewandelt. Die Gesamtreaktionsraten des Zymogens sind "ungefähr 10⁵–10⁶-mal geringer als jene des entsprechenden Enzyms" ((3), S. 54).
Es ist deswegen möglich, die Funktion gewisser Enzyme herunter zu regulieren, einfach durch die Addition einer Peptidsequenz an einem seiner Enden. Zum Beispiel kann diese Fähigkeit in der Erfindung verwendet werden, um Endoproteasen mit gewünschten Eigenschaften zu selektieren.
Die Bildung oder Disassoziierung von Enzymen mit mehreren Untereinheiten ist ein weiterer Weg, durch welchen Modulation geschehen kann. Unterschiedliche Mechanismen können für die Modulation von Aktivität bis zur Bildung oder Disassoziation von Multi-Untereinheit-Enzymen verantwortlich sein. Zwei Mechanismen sind erläutert.
Die Tryptophansynthetase besteht aus zwei unterschiedlichen Untereinheit, Alpha und Beta, in einem Alpha-Beta-Alpha-Beta-Tetramer. Das Tetramer kann in zwei Alpha-Untereinheiten und eine Beta-Beta-Untereinheit dissoziieren, von der jede katalytische Aktivität zeigt, die unabhängigen Untereinheiten sind jedoch wesentlich weniger effizient als das tetramere Holoenzym. Von der Effizienzzunahme des Holoenzyms wird gedacht, dass sie zum Teil an der Bildung eines Tunnels zwischen den aktiven Zentren von Alpha und Beta liegt (4). Durch die Bestimmung der dreidimensionalen Kristallstruktur dieses Enzyms scheint es, dass der Tunnel den Verlust des Zwischenproduktes, der durch Alpha katalysierten Reaktion an das Lösungsmittel verhindert, indem es direkt zu dem aktiven Zentrum der Beta-Untereinheit geleitet wird, wodurch folglich die Effizienz erhöht wird.
Die Modulation der Aktivität nach der Bildung des Holoenzyms der Aspartattranscarbamoylase geschieht durch einen anderen Mechanismus. Bei dem Aspartattranscarbamoylase-Holoenzym werden die aktiven Zentren an der Schnittstelle katalytischer Untereinheiten gebildet. Sowohl bei der Aspartattranscarbamoylase als auch bei der Tryptophansynthetase ist die genaue spezifische Wechselwirkung verschiedener Untereinheiten kritisch für die effiziente Aktivität des Holoenzyms. Deswegen wird die sterische Hinderung der genauen, spezifischen Wechselwirkungen der Untereinheiten die katalytische Aktivität herunterregulieren. Solche Komplexe könnten in der Erfindung für die Selektion einer Reihe von Proteasen verwendet werden.
Andere Beispiele an Mechanismen, durch welche die Modulation der Funktion geschehen kann, sind RNS-Virus-Polyproteine, allosterische Effekte und allgemeine kovalente und nicht kovalente sterische Behinderung. Das HIV-Virus ist ein gut untersuchtes Beispiel eines RNS-Virus, der nicht-funktionelle Polyproteinkonstrukte exprimiert. In dem HIV-Virus werden "die gag-, pol- und env-Polyproteine verarbeitet, um die viralen Strukturproteine p17, p24 bzw. p15-reverse Transkriptase und Integrase – und die beiden Hüllproteine gp41 und gp120 zu ergeben" (5). Die genaue Spaltung der Polyproteine ist für die Replikation des Virus entscheidend und Virionen, die inaktive, mutierte HIV-Protease tragen, sind nicht infektiös (5). Dies ist ein weiteres Beispiel dafür, dass die Fusion von Proteinen ihre Aktivität herunterregulieren. Folglich ist es möglich, rekombinante Viren zu konstruieren, die sequenzabhängige Endoproteasen für die saubere Replikation benötigen.
Gewisse Enzyminhibitoren leisten gute Beispiele funktioneller Herunterregulation durch kovalente sterische Behinderung oder Modifikation. Suizidsubstrate, die irreversibel an das aktive Zentrum eines Enzyms an einer katalytisch wichtigen Aminosäure in dem aktiven Zentrum binden, sind Beispiele kovalenter Modifikationen, die sterisch das enzymatisch aktive Zentrum hemmen. Ein Beispiel eines Suizidsubstrates ist TPCK für Chymotrypsin (6). Diese Modulationsart kann in Ausführungsbeispielen der Erfindung verwendet werden, um Verbindungen zu selektieren, die in der Lage sind, kovalent an katalytisch aktive Zentren oder, Spaltungseinheiten eines nicht-aktiven katalytischen Zentrums zu binden, wodurch es in ein katalytisch aktives umgewandelt wird.
Es gibt auch Beispiele nicht-kovalenter sterischer Behinderung, einschließlich vieler Repressormoleküle. Der Lambda-Repressor ist von Interesse, da er gleichzeitig die Expression anderer Phagengene wie cro herunterreguliert, während er seine eigene Expression herauf reguliert. Er bewerkstelligt dies, indem er nicht-kovalent an DNS-Sequenzen bindet und sterisch die Wechselwirkung dieser Sequenzen mit RNS-Polymerase behindert, wodurch die RNS-Polymerase vom Transkribieren in Richtung der cro-Gene abgehalten wird, während gleichzeitig die RNS-Polymerase für die Transkription in der Gegenrichtung stimuliert wird. Folglich sind die Repressormoleküle zu sterischer Behinderung fähig und folglich zur Herunterregulation der Funktion der DNS-Sequenzen, indem bestimmte DNS-RNS-Polymerase-Wechselwirkungen verhindert werden.
Die Selektion nicht-kovalenter Bindungsverbindungen bietet Möglichkeiten und Vorteile, da Bindungsmoleküle basierend auf ihrer Fähigkeit, die Aktivitäten zahlreicher Substrate von Interesse zu modifizieren, geschaffen werden können.
Allosterische Wirkungen sind ein weiterer Weg, durch welchen Modulation in einigen biologischen Systemen durchgeführt wird. Aspartattranscarbamoylase ist ein gut charakterisiertes allosterisches Enzym. Regulatorische Domänen sind mit den katalytischen Untereinheiten wechselwirkend. Nach der Bindung an CTP oder UTP sind die regulatorischen Untereinheiten in der Lage, eine quartäre Strukturänderung in dem Holoenzym zu induzieren, wodurch die Herunterregulation der katalytischen Aktivität bewirkt wird. Im Gegensatz dazu ist die Bindung von ATP an regulatorische Untereinheiten in der Lage, die Heraufregulation katalytischer Aktivität zu bewirken (7). Unter Verwendung von Verfahren der Erfindung werden Proteasen selektiert, die in der Lage sind, zu binden und modulierende quartäre oder tertiäre Änderungen zu bewirken.
Zusätzlich kann eine Reihe chemischer Modifikationen, z. B. Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Adenylierung und Uridinylierung durchgeführt werden, um die Funktion zu modulieren. Es ist bekannt, dass Modifikationen wie diese wichtige Rollen bei der Regulation vieler wichtiger zellulärer Bestandteile spielen. Die Referenz ((2) S. 73) listet unterschiedliche bakterielle Enzyme auf, welche solche Modifikationen durchmachen. Zusätzlich machen viele Proteine, die in menschliche Erkrankung verwickelt sind, ebenfalls solche chemischen Modifikationen durch. Zum Beispiel wurde von vielen Oncogenen gefunden, dass sie durch Phosphorylierung modifiziert werden oder dass sie andere Proteine durch Phosphorylierung oder Dephosphorylierung modifizieren. Die Fähigkeit, Moleküle, basierend auf ihrer Fähigkeit, die Aktivität eines Wachstumsfaktors, z. B. durch Phosphorylierung, zu ändern, zu selektieren ist von Wichtigkeit.
D. Bevorzugte Selektionsmoleküle
(1) Fusions- oder Deletionsmoleküle
Fusionsproteine, die den Wachstumsfaktor, die Selektionseinheit und die Erkennungssequenz einbauen, sind bevorzugte Selektionsmoleküle. Fusionen können zwischen im Grunde allen Molekülen stattfinden und können die Fusion von zwei Molekülen oder von vielfachen Molekülen einschließen. Fusionen können Protein-Protein-Fusionen und Protein-Biomolekül-Fusionen einschließen. Das Molekül kann ein biologisches oder chemisches Molekül oder ein Ion sein. Zucker, Nucleotide, Nucleoside, Fettsäuren, kleine organische Moleküle und Metallionen, z. B. Mg, und zahlreiche Derivate und Vorläufer der vorstehenden können in Betracht gezogen werden. Andere Fusionen können Protein-Nucleinsäure, Protein-Ribonucleinsäure, Protein-Lipid, Protein-Oligosaccharid, Nucleinsäure-kleines-Molekül, kleines-Molekül-Protein-Lipid, Nucleinsäure-kleines-Molekül-Lipid einschließen, unter anderem.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann ein Fusionskonstrukt zwischen einem metabolisch wichtigen Enzym, das heißt dem Wachstumsfaktor, und der gewünschten Peptid-Erkennungssequenz und einem sperrigen Protein, das heißt der Modulationseinheit, genutzt werden. Wegen der sterischen Behinderung und/oder Konformationsänderungen, verursacht durch die Peptid-Erkennungssequenz in Verbindung mit dem sperrigen Protein, wird das metabolisch wichtige Enzym inaktiviert oder funktionell beeinträchtigt. In der Anwesenheit der zu gewinnenden Protease wird jedoch die Erkennungssequenz abgespalten und die Funktion des Enzyms wird herauf reguliert.
Das Untereinheiten-Ausführungsbeispiel und das Ausführungsbeispiel der alpha-beta-artigen Vervollständigung sind weitere Variationen von Fusionskonstrukten. Das Untereinheiten-Ausführungsbeispiel nutzt die komplexe Multi-Untereinheiten-Natur gewisser Moleküle aus. In gewisser Hinsicht sind Moleküle nicht funktionell als Monomere, erwerben jedoch Funktion in Komplexen mit mehrfachen Untereinheiten, die homogene oder heterogene Molekülgruppen umfassen. Man kann ein anderes Molekül mit irgendeiner Zahl unterschiedlicher Untereinheiten verschmelzen. Wegen den oftmals empfindlichen und komplexen Wechselwirkungen der Untereinheit in der aktiven Multi-Untereinheit-Form ist die Modulation der Funktion, die durch die Konstruktion der Fusion induziert wird, wahrscheinlich ziemlich stark.
Das Ausführungsbeispiel der Vervollständigung vom Alpha-Beta-Typ ist vom Konzept her ähnlich. Es ist bekannt, dass gewisse funktionelle Moleküle fragmentiert werden können und dass die Fragmente allein nicht funktionieren. Die Fragmente können jedoch erneut assoziiert werden und erhalten ihre Funktion wieder zurück. Falls die Fragmente in Fusionen eingebaut werden, werden diese Verknüpfungen verhindert und demgemäß sind diese Fusionen nützlich bei den Verfahren der Erfindung.
Ein Ausführungsbeispiel mit einer "Umkehr"-Untereinheit kann auch verwendet werden, um das Fusionskonstrukt zu schaffen. In diesem Fall fehlt den Multi-Untereinheit-Komplexen die Funktion und die Untereinheiten sind selber funktionell. Zum Beispiel ist es möglich, durch die Verwendung eines Proteins, dessen Funktion durch die Zugabe einer zusätzlichen Sequenz an einem seiner Enden verliehen wird, eine Multi-Untereinheiten-Kette solcher Proteine zu schaffen, die nicht funktionell sind. Indem eine Linkersequenz zwischen den Proteinen exakt gestaltet wird, können Proteasen mit gewünschter Spezifität erhalten werden.
Unter stringenten Selektionsbedingungen können sehr leichte Vorteile bei der effizienten Nutzung von Ressourcen differenzielle Selektion bewirken. Falls ein Mitglied der Wirtszell-Population überflüssige Proteine erzeugt, wodurch man sich folglich dem Aminosäurepool unnötigerweise nähert, wird ihr Wachstum benachteiligt werden. Die Verfahren der Umkehr-Untereinheit können effizient sein, da verschwendete Proteinsynthese in den Wirtszellen, welche die neue Protease erzeugen, eliminiert wird, weil jeder Teil der Untereinheit des Umkehr-Untereinheiten-Fusionsmoleküls genutzt wird.
Diese Fusionsproteine können viele unterschiedliche Konfigurationen annehmen und können aktiv oder inaktiv, heraufreguliert oder herunterreguliert sein. Sie können Proteingruppen oder andere Gruppen wie Phosphate oder Methylgruppen im Inneren oder an beiden Enden hinzugefügt oder deletiert haben. Zum Beispiel können Proteinsequenzen an eines oder beide der Enden oder zu dem Inneren eines Protein-Wachstumsfaktors hinzugefügt sein, um seine Funktion herauf- oder herabzuregulieren und/oder um dem Selektionsmolekül eine besonders gewünschte Erkennungssequenz zu übertragen.
Es kann eine Vielzahl unterschiedlicher Gruppen hinzugefügt werden. Zum Beispiel kann eine Multiproteinfusion, die aus einer großen, sterisch hinderlichen, modulierenden Gruppe besteht, die mit einer Erkennungssequenz gekoppelt ist, die mit einem Wachstumsfaktor gekoppelt ist, der mit einer Erkennungssequenz gekoppelt ist und die wiederum mit einer großen, sterisch hinderlichen, modulierenden Gruppe gekoppelt ist, verwendet werden.
Alternativ können Deletionen genutzt werden, um modulierte Wachstumsfaktoren zu konstruieren. Zum Beispiel kann ein Protein-Wachstumsfaktor, der eine Region hat, dessen Anwesenheit für die saubere Funktion des Wachstumsfaktors wichtig ist, in einer verkürzten oder deletierten Form, der diese Region fehlt, als ein modulierter Wachstumsfaktor verwendet werden. In einem anderen Beispiel kann ein Protein, das in seiner aktiven Form phosphoryliert ist, in seinem unphosphorylierten Zustand als ein modulierter Wachstumsfaktor genutzt werden. In beiden Fällen können normale Moleküle selektiert werden, die eine Einheiten) in den modulierten Wachstumsfaktor einführen.
(2) Allosterische Plattformen
Es können Selektionsmoleküle, die verwendet werden, um neue Proteasen, basierend auf ihren Bindungsfähigkeiten, zu erhalten, auf einer Vielzahl von Wegen gestaltet werden. Ein einfaches bindungsbasiertes Selektionsmolekül kann seine Funktion basierend auf der Bindung der neuen Protease an eine Erkennungssequenz auf dem Selektionsmolekül moduliert haben. Zum Beispiel kann eine neue Protease binden und/oder sterisch das aktive Zentrum eines enzymbasierten Selektionsmoleküls inhibieren.
Auf ein Selektionsmolekül, welches, wenn es ungebunden ist, eine konformatorische Änderung durchmacht, kann Bezug genommen werden als eine allosterische Plattform. Die Funktion des Wachstumsfaktors kann in einer allosterischen Weise moduliert werden. Folglich ist, falls die Erkennungssequenz entweder kovalent oder nicht kovalent gebunden wird, die Funktion der Wachstumseinheit geändert. Die Bindungsdomäne auf der Erkennungssequenz kann variiert werden, um die Selektion einer weiten Anordnung unterschiedlicher Liganden anzupassen. Die allosterische Plattform kann ein Molekül oder viele Moleküle sein und kann mit jedem der Verfahren der Erfindung verwendet werden.
Im Wege des Beispiels, ein Teil der allosterischen Plattform kann als ein Rezeptor für die Bindung einer neuen Protease dienen und ein anderer Teil kann dazu dienen, die allosterische Plattform mit einem Wachstumsfaktor zu koppeln. Nach dem Binden einer neuen Protease an den ersten Teil wird eine allosterische Änderung in dem Wachstumsfaktor in Heraufregulierungen oder Runterregulierungen in der Funktion resultieren. Die Änderung in der Funktion kann dann verwendet werden, um die neue Protease durch anderswo beschriebene Verfahren zu erhalten.
Die neue zu erhaltende Protease braucht nicht tatsächlich die Selektionsmoleküle binden, noch ist es notwendig, dass die Funktion des neuen zu selektierenden Moleküls bindend ist. Im Wege des Beispiels kann ein bindungsbasieres Selektionsmolekül verwendet werden, um für eine Protease zu selektieren. Indem das bindungsbasierte Selektionsmolekül das Produkt der durch die gewünschte neue Protease katalysierten Reaktion erkannt hat, kann jene neue Protease, ohne selbst mit dem Selektionsmolekül in Wechselwirkung zu treten, selektiert werden.
II. Selektionsverfahren
A. Im Allgemeinen
Die bei den Isolierungs-, Schaffungs- und Verfahren der gerichteten Evolution der Erfindung verwendeten Selektionstechniken können irgendeine von jenen sein, die bis jetzt im Stand der Technik genutzt worden sind, oder können neue Umgebungen, Bedingungen, Vorgänge und Selektionsdrucke einschließen. Anstrengungen sollten unternommen werden, um die Mutationen der Gene, die den Wachstumsfaktor, die Erkennungssequenz, die Modulierungseinheit oder die Selektionsmoleküle exprimieren, zu begrenzen, so dass ein Gen, welches eine neue Protease kodiert, die spezifisch für die Ausgangs- und gewünschte Erkennungssequenz ist, erhalten wird.
Dies gilt für die Isolierungs-, Schaffungs- und Verfahren der gerichteten Entwicklung der Erfindung. Bei der gerichteten Entwicklung ist es wünschenswert, die Gene mit evolutionärem Potenzial zu mutieren, um neue Proteasen durch Aussetzen an äußere Einflüsse, wie Bestrahlung oder mutationenauslösende Chemikalien, oder durch das Auferlegen von rationell gestalteten Selektionsbedingungen, die eine evolutionäre Richtung auf die vermeintlich neue Proteasepopulation auferlegen, zu kodieren. Diese Verfahren sind anderswo vollständiger beschrieben.
Es können negative oder positive Selektionsverfahren verwendet werden. Bei der positiven Selektion haben jene Mitglieder der Wirts- oder Replikatorpopulation mit der gewünschten Funktion einen selektierbaren Wachstumsvorteil. Bei der negativen Selektion ist das Umgekehrte richtig. Jene Mitglieder der Wirts- oder Replikatorpopulation mit der gewünschten Funktion haben einen selektierbaren Wachstumsnachteil. Bei der negativen Selektion exprimiert das Gen von Interesse eine Protease, welche mit dem Selektionsmolekül oder mit der Erkennungssequenz in Wechselwirkung tritt, um das Wachstum zu inhibieren. Verbindungen, z. B. gewisse Antibiotika, können an die Population verabreicht werden, die Mitglieder der Population abtöten oder anderweitig beeinträchtigen, falls sie zum Wachstum in der Lage sind. Diese Techniken können in bekannter cyclischer Weise wiederholt werden, um die gewünschten, nicht wachsenden Mitglieder der Population anzureichern.
Es ist wichtig, dass Selektionsverfahren auf die spezifischen Selektionseigenschaften von Interesse gerichtet werden, und es ist wichtig, dass das Selektionsvorgehen optimiert wird. Zum Beispiel kann es günstig sein, Selektionsdruck in einer cyclischen Weise anzulegen, wobei zwischen hohem und niedrigem Selektionsdruck cyclisiert wird, oder unterschiedliche Bedingungen zu verwenden, um für dieselben Eigenschaften zu selektieren.
Unterschiedliche Selektionsmoleküle und Selektionsverfahren werden unter unterschiedlichen Umständen verwendet. Zum Beispiel ist bei Genisolierungsverfahren, wo gedacht wird, dass das Gen, welches die neue Protease mit den gewünschten Eigenschaften kodiert, in einem bestehenden Genpool existiert, die einmalige Selektion oder wiederholte einmalige Selektion (Batch-Selektion) angemessen, um die Isolation zu erreichen. Unter solchen Umständen ist es wünschenswert, einen Wachstumsfaktor zu verwenden, der absolut notwendig für das Wachstum ist und der im Wesentlichen oder vollständig seine Funktion verliert (maximale Modulation der Funktion), wenn er in das Selektionskonstrukt eingebaut wird. Da angenommen wird, dass die gewünschte neue Protease oder eine sehr eng mit ihre verwandte neue Protease in der bestehenden heterogenen Population existiert und da nur ein oder eine sehr geringe Anzahl verwandter Klone selektiert wird, wird ein sehr stringenter Selektionsdruck an dem System angelegt.
Es werden viele Generations-Selektionstechniken verwendet, wo von der gewünschten neuen Protease angenommen wird, dass sie in der Population existiert und entwickelt zu werden braucht. In gewissen Beispielen ist es wünschenswert, einen Wachstumsfaktor zu verwenden; der absolut notwendig für das Wachstum ist, dessen Funktion jedoch nur teilweise moduliert wird, oder einen Wachstumsfaktor, der nicht absolut notwendig ist, der jedoch einen Wachstumsvorteil verleiht und vollständig moduliert werden kann. Dies ermöglicht Wachstum, während das Gen, welches die neue Protease exprimiert, entwickelt wird und dann wird, indem Moleküle mit Eigenschaften, die eng mit jenen der gewünschten neuen Protease in Beziehung stehen, produziert werden, ein selektiver Wachstumsfaktor verliehen.
Diese Unterschiede in der Stringenz des Selektionsdrucks durch die abwechselnde Selektionsmolekülgestaltung für unterschiedliche neue Protease-Ausgangspopulationen werden ebenfalls geschaffen, indem die Umweltbedingungen geändert werden. Zum Beispiel werden unter Verwendung desselben Selektionsmoleküls unterschiedliche Niveaus am Selektionsdruck geschaffen, einfach durch Verändern von Medien, Temperatur, pH-Wert etc. In einigen solche Beispielen vervollständigt die Wirkung der Umweltbedingungen die Funktion des Selektionsmoleküls und durch Ändern dieser Umweltbedingungen werden differenzielle Selektionsdrucke etabliert.
Ein alternatives Verfahren, durch welches die Selektionsmoleküle als der "Regelwiderstand" der Selektion verwendet werden, schließt die Änderung der Expressionsgrade der Selektionsmoleküle ein. Das einfache Erhöhen der Expressionsgrade der Selektionsmoleküle durch einen induzierbaren Promotor kann den Hintergrund in gewissen Fällen erhöhen und folglich den Selektionsdruck erniedrigen.
Zwei wichtige Techniken der Erfindung, die den Ausführungsbeispielen der Isolierung, Schaffung und gerichteten Evolution gemeinsam sind, sind die Kontrolle der Wirtszell-Mutationen und die Verwendung redundanter Selektionsmoleküle.
(1) Begrenzung ungewünschter Mutationen
Es ist wichtig, Wirtszell-Mutationen zu kontrollieren, welche die Expressionsgenauigkeit des Wachstumsfaktors und/oder der Erkennungssequenz und/oder der Modulationseinheit und/oder eines Selektionsmoleküls beeinflussen, um ein konstantes Ziel für die Wechselwirkung mit einer neuen Protease aufrecht zu erhalten. Es ist auch wichtig, Hintergrund-Mutationen, z. B. Mutationen in der DNS innerhalb des gewünschten Selektionssystems, zu begrenzen, welche die Selektion auf die gewünschte neue Protease komplizieren könnten. Nicht-nützliche Mutationen der Gene, welche das Selektionsmolekül oder Bestandteile davon exprimieren, schließen jene ein, die die Funktion des Wachstumsfaktors durch proteolytische Spaltung durch eine neue Protease verleihen. Solche Mutationen schließen auch unter anderem ein Mutationen des Wachstumsfaktorteils der Fusion, welche die Wirkungen der sperrigen Gruppe aufheben, Mutationen der sperrigen Gruppe, so dass sie ineffektiv wird, die Funktion des Wachstumsfaktors zu modulieren, die Transposition oder Rekombination der kodierenden Sequenz des Gens für den Wachstumsfaktor, was die Expression eines unerwünscht modulierten Wachstumsfaktors ermöglicht, Mutationen (Punktmutationen und Insertionen), die Promotoren vor dem Wachstumsfaktor schaffen, die Entwicklung der Fähigkeit posttranslationaler oder posttranskriptorischer Modifikationen des Selektionsmoleküls, um die Bestandteilsteile in einem nicht-nutzbaren Wege zu trennen, wodurch der Wachstumsfaktor freigesetzt wird, und Mutationen, die alternative Pfade oder mutierte Moleküle schaffen, welche dieselbe Funktion durchführen wie der Wachstumsfaktor.
Wichtige Überlegungen sind die Anzahl und die Rate spezifischer Mutationen und die Anzahl und Rate von Grobmutationen, die zu spezifischen Insertionen oder Deletionen führen, welche nicht-nützliche Arten hervorrufen, im Vergleich zu der Anzahl und Rate spezifischer und Grobmutationen, die notwendig sind, um eine gewünschte neue Protease zu erzeugen. Bei der gerichteten Entwicklung ist es wichtig, dass die Anzahl spezifischer Mutationen, die notwendig sind, um ein Gen zu erzeugen, welches eine nützliche neue Protease exprimiert, so niedrig als möglich ist, und dass die Mutationsrate vernünftig hoch ist im Vergleich mit der Anzahl an Mutationen und der Mutationsrate, welche nicht nützliche Mutanten hervorruft. Falls die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung einer nicht nützlichen Genmutation hundertmal so hoch ist wie die der Erzeugung einer nützlichen Genmutation, ist es immer noch möglich, indem man das Experiment hundertmal laufen lässt, ein Gen zu erhalten, welches eine nützliche neue Protease exprimiert. Dies liegt jedoch weit von der Ideale entfernt.
Bei gewissen Genen können die Deletionsraten so hoch sein wie 10^–4. Dies ist unter anderen Überlegungen abhängig von der besonderen Gensequenz und von den umgebenden Sequenzen und der resultierenden Sekundärstruktur. Die möglicherweise hohe Wahrscheinlichkeit für Deletionsmutationen erfordert die sorgfältige Gestaltung, um Erscheinungen zu verhindern, die nicht-nützliche Mutanten hervorrufen. Diese Erscheinungen können durch die saubere Selektion der Gensequenz und der Sekundärstruktur (beides innerhalb des Konstruktes und örtlich) oder durch Rec-A- und ähnlichen Mutationen, welche homologe Rekombinationshäufigkeiten 1000-fach reduzieren können, minimiert werden.
Zusätzlich kann eine Anti-Mutator-Replikationsmaschinerie mit hoher Genauigkeit verwendet werden, um die Häufigkeit der Mutation zu reduzieren. Es ist bekannt, dass gewisse Polymerasen so mutiert werden können, dass sie mit höherer Genauigkeit als die Wildtyp-Polymerase replizieren. Solche Polymerasen könnten verwendet werden, um die Fehlerrate während der Replikation zu reduzieren. Mutationen können auch kontrolliert werden, indem die Anzahl an Replikationen niedrig gehalten wird, oder alternativ, falls der Zellzyklus arretiert wird, um die weitere Replikation zu verhindern.
Indem die Gene, welche das Selektionsmolekül in gewissen Ausführungsbeispielen kodieren, segregiert werden, wird es einfach, die Selektionsmoleküle entwicklungsmäßig zurückzusetzen. Zum Beispiel ist es möglich, falls die Selektionsmoleküle in einer Wirtszelle kodiert werden und die neuen Moleküle durch einen Replikator kodiert werden, dem Selektionsvorgehen zu erlauben, die in den Replikatoren kodierten Gene zu entwickeln. Diese entwickelte Population kann dann in einem Selektionsvorgehen mit einer frischen Population an Wirtszellen aus einer Ausgangsstartkultur verwendet werden. Die Bestandteile des Selektionssystems, das durch die Wirtszelle, für welche Mutationen unerwünscht sind, kodiert wird, werden evolutionsmäßig zurückgesetzt, während der evolutionäre Fortschritt der neuen Proteasepopulation aufrechterhalten wird und ermöglicht wird, in einer statischen Selektionsumgebung fortzuschreiten.
(2) Verwendung mehrfach redundanter Selektionsmoleküle
Ein anderes Verfahren, die Selektion von Genen zu erhöhen, welche neue Proteasen im Gegensatz zu nicht-wünschenswerten Mutanten exprimieren, geschieht durch die simultane Verwendung mehrfach redundanter Selektionsmoleküle. In solchen Systemen bewirkt eine einzelne, unerwünschte Mutante wegen der Anwesenheit der anderen Selektionsmoleküle nicht unerwünschte Selektionen. Die Expression der genauen neuen Protease beeinträchtigt sämtliche Selektionsmoleküle und ermöglicht es einer nützlichen Selektion, stattzufinden.
Zum Beispiel wird eine Reihe unterschiedlicher Protein-Protein-Protein-Fusionen erzeugt, jede mit derselben proteolytischen Spaltungsstelle und verschiedenen, aber essenziellen Wachstumsfaktoren. Eine Mutation, die einen Wachstumsfaktor aus seiner Fusion befreit und seine Funktion verändert, wird keine unerwünschte Selektion bewirken oder wird in der marginalen Selektion resultieren, da die anderen Selektionsmoleküle nicht angegriffen werden. Falls eine neue Protease mit den angemessenen proteolytischen Eigenschaften erzeugt wird, wird jede der proteolytischen Spaltstellen geschnitten und jeder der Wachstumsfaktoren wird aus seiner jeweiligen Fusion befreit und Selektion geschieht.
Der Grad der Redundanz wird auch verwendet, um den Selektionsdruck zu modulieren. Durch unterschiedliche Redundanzgrade ist es möglich, die Gesamtzahl an Spaltungen, die für die Produktion einer gegebenen Art notwendig ist, zu ändern. Zum Beispiel sind mehr Spaltungen notwendig, falls sieben unterschiedliche Wachstumsfaktoren in sieben verschiedenen, redundanten Selektionsmolekülen komplexiert werden, als wenn nur drei von jenen sieben Bestandteilen verwendet werden.
Noch wichtiger ist sogar der Bestandteilstyp. Zum Beispiel sind einige Bestandteile im Replikationsvorgang von Bakteriophagen katalytisch und brauchen vergleichsweise wenige Gesamtkopien, um ihre Aufgabe zu bewerkstelligen. Andere Bestandteile sind nicht katalytisch und erfordern viel mehr Spaltungen. Beispiele solcher Bestandteile sind Kopf- und Schwanzproteine – Strukturproteine, die in die Funktion von Virionen verwickelt sind. Falls die Kopf- und Schwanzproteine in einem Selektionsmolekül komplexiert werden, würden hohe Zahlen an Spaltungen notwendig sein, da jedes Protein der zusammengebauten viralen Umhüllung gespalten werden müsste. Dieser Typ an Selektionskonstrukt würde auf die neuen Proteasen eine höhere Last legen, da ein höherer Umsatz notwendig wäre, um signifikante Mengen viraler Nachfahren zu erzeugen.
Zwei wichtige Aspekte der Erfindung, die den Ausführungsbeispielen der Schaffung und insbesondere der gerichteten Evolution gemeinsam sind, sind die Segregation der Gene, welche die Selektionsmoleküle kodieren und welche die vermeintlich neuen Proteasen kodieren, und das Bewirken der kontrollierten Mutation der letzteren, und die Nutzung etlicher evolutionärer Startpunkte für die Gene, welche vermeintlich neue Proteasen exprimieren.
(3) Segregation der Gene, welche das Selektionsmolekül kodieren und welche die vermeintlich neuen Proteasen kodieren und Bewirken der kontrollierten Mutation der Gene welche vermeintlich neue Proteasen kodieren
Es ist wünschenswert, die Selektionsverfahren durch Segregation der Gene, welche vermeintlich neue Proteasen bzw. das Selektionsmolekül kodieren, zu beeinflussen, z. B. in der Zeit oder im Raum oder durch unterschiedliche Erkennungssequenzen, auf einem Wege, um jedem zu ermöglichen, durch unterschiedliche Replikationssysteme, welche unterschiedliche Mutationsraten haben, repliziert zu werden. Dies ermöglicht es dem Genpool für mögliche neue Proteasen, in einer erhöhten Rate zu entwickeln oder zu evolvieren. Die Stabilität des Selektionsmoleküls wird aufrechterhalten, während den Genen, die neue Proteasen kodieren könnten, ermöglicht wird, sich zu entwickeln.
Die Gene, welche vermeintlich neue Proteasen kodieren, können anfänglich aus einem zu mutierenden Gen bestehen und können zu einem Gen entwickelt werden, welches eine neue Protease mit der gewünschten Funktion exprimiert, oder es kann eine Population an Genen mutiert und entwickelt werden, um ein Gen, welches eine Protease mit der gewünschten Funktion exprimiert, zu erhalten. Die molekulare Ausgangspopulation kann oder kann nicht strukturell oder anderweitig mit der letztlich gewünschten neuen Protease verwandt sein.
Die Verfahren der Erfindung können durch Verwendung einer Replikationsmaschinerie mit geringer Genauigkeit und durch Verwendung unterschiedlicher Arten an kodierenden Materialien und durch die Nutzung zahlreicher Prozessbedingungen, welche die Mutationsraten kontrollieren, durchgeführt werden. Es können ebenfalls Sequenzreparaturmechanismen, welche die Gene, die vermeintlich neue Proteasen und Selektionsmoleküle exprimieren, differenziell beeinflussen, verwendet werden. Es kann auch das Anlegen unterschiedlicher Umweltbedingungen wie Temperatur-, Druck-, pH-Wert-, Ionen- und Substratkonzentrationseffekte etc. verwendet werden, um diese Ziele zu erreichen. Die kontrollierte Mutationsrate kann auch durch die Verwendung gewisser kodierender Materialien geschaffen werden, z. B. bekannter "Hot Spots" in Chromosomen, wo Mutationsraten höher sind als in anderen Örtlichkeiten.
Physikalisch getrennte, kodierende Sequenzen mit verschiedenen Mutationsraten und/oder verschiedenen Replikationsmaschinerien werden ähnlich verwendet. Diese schließen unter anderem chromosomale Wirts-DNS, Plasmid-DNS (zirkulär oder selbst-replizierende kurze Sequenz), Viren (sowohl DNS- als auch RNS-Viren), kurze selbst-replizierende RNS-Sequenzen oder Plasmide und mitochondriale DNS ein. Diese und andere kodierende Sequenzen können in irgendeiner Kombination verwendet werden, um für die Selektionsmoleküle und die vermeintlich neuen Proteasen zu kodieren. Diese unterschiedlichen kodierenden Vehikel können mit unterschiedlichen Mutationsraten durch die Verwendung unterschiedlicher Replikationsmaschinerien mit verschiedenen spezifischen Replikationsstartpunkten repliziert werden.
Ein weiterer Weg, auf dem differenzielle Mutationsraten geschaffen werden können, geschieht durch das Timing der Replikation und des Replikationsumsatzes. Falls z. B. die Replikation mit einer schnelleren Rate für die Sequenz geschieht, welche die neue Protease kodiert, als für das Selektionsmolekül, wobei beide eine Replikationsmaschinerie derselben Genauigkeit verwenden, wird die neue Proteasepopulation höhere Mutationszahlen entwickeln. Zusätzlich kann das Timing der Synthese verschiedener Bestandteile für verschiedene Replikationsmaschinerien verwendet werden, um verschiedene Mutationsraten zu schaffen. Zum Beispiel ist es bekannt, dass das Chromosom von E. coli in einer kontrollierten Weise repliziert wird und dass gewisse Proteine wie DnaA gebraucht werden, um die Replikation zu initiieren. Deswegen kann es möglich sein, ein System zu haben, in welchem zwei DNS-Polymerasen mit unterschiedlichen Mutationsraten durch induzierbare oder cyclisch aktivierte Promotoren kontrolliert werden. Die Synthese der Polymerasen und der Proteine vom DnaA-Typ kann zeitlich abgestimmt werden, so dass eine Polymerase mit hoher Genauigkeit das Selektionsmolekül z. B. auf dem Wirtchromosom repliziert und dass eine Polymerase mit niedriger Genauigkeit die neue Protease auf einem viralen Chromosom repliziert. Bei gewissen Ausführungsbeispielen kann solch ein System identische Replikationsstartpunkte haben.
(4) Anzahl evolutionärer Startpunkte und Mutation von Genpopulationen
Etliche unterschiedliche Verfahren können verwendet werden, um eine Population an Genen, die neue Proteasen exprimiert, zu entwickeln. Es können keine evolutionären Startpunkte, ein evolutionärer Startpunkt und multiple evolutionäre Startpunkte verwendet werden.
Selektionssysteme, die ohne evolutionäre Startpunkte gestaltet sind, können verwendet werden, um die gewünschten Gene von Interesse zu selektieren, basierend einfach auf den in den Wirt eingeführten Selektionsmolekülen. Solche Verfahren selektieren natürlich vorkommende Gene in den Bestandteilen des Selektionssystems, z. B. Gene aus der Wirtszelle oder dem Replikator. Bei diesem Verfahren verlegt man sich mehr auf das in dem Wirt oder Replikator innewohnende evolutionäre Potenzial als auf das Einführen spezifischer Molekül(e), die als evolutionäre Startpunkte verwendet werden. Ein anderes Verfahren, das keinen evolutionären Startpunkt verwendet, umfasst das Einführen einer Population an Molekülen, die insgesamt oder teilweise stochastisch erzeugt werden und die folglich bis dahin unbekannt sind. In diesem Fall wird das evolutionäre Potenzial dieser stochastisch erzeugten Moleküle bei der Produktion von Genen, die eine neue Protease exprimieren, ausgenutzt.
Zwei Beispiele an Verfahren, die einen evolutionären Startpunkt nutzen, sind jene, wo ein Fremdgen gewählt wird und in den Wirt oder Replikator basierend auf dem evolutionären Potenzial jenes Gens eingeführt wird, und wo ein Gen gemeinsam mit Mitgliedern der Unterarten des Gens, z. B. eng verwandte Varianten davon, gewählt wird.
Letztlich können multiple evolutionäre Startpunkte genutzt werden. In diesem Fall werden multiple Gene basierend auf ihrem evolutionären Potenzial gewählt. Die Gene können so mutiert werden, dass sie in Unterarten diversifizieren. Diese ermöglicht die Schaffung einer neuen Genpopulation, welche heterogen ist, die jedoch zur selben Zeit eine hoch fokussierte, rationell gestaltete Population ist, basierend auf gewünschten evolutionären Potenzialen.
Als Beispiel, bei der Entwicklung eines Katalysators mit einem bestimmten Reaktionstyp und -spezifität wählt man evolutionäre Startpunkte, die am wahrscheinlichsten das höchste evolutionäre Potenzial haben, den gewünschten Katalysator hervorzurufen. Man wählt Gene, die Proteasen exprimieren, welche bereits Eigenschaften besitzen, die ähnlich sind mit jenen des gewünschten Katalysators, z. B. Protease(n), mit ähnlicher Spezifität für Erkennungssequenzen wie jene des gewünschten Katalysators. Alternativ wählt man Moleküle) desselben oder eines ähnliches Reaktionstyps (z. B. Proteolyse) wie der gewünschte Katalysator. Indem rationelle Auswahl der Typen an evolutionären Startpunkten gemacht wird, wird ein größeres evolutionäres Potenzial für die Genpopulation und deswegen eine kürzere evolutionäre Distanz, um das gewünschte Gen zu erreichen, erzielt, das heißt weniger Mutationen werden benötigt, um bei dem gewünschten Gen anzukommen. Geeignete evolutionäre Startpunkte sind Enzyme, Antikörper, katalytische Antikörper, T-Zell-Rezeptoren und MHC-Moleküle.
Unterschiedliche Mutationsverfahren existieren und können alleine oder in Verbindung miteinander verwendet werden. Ein Verfahren ist die Verwendung von Verbindungen oder Bedingungen, die Mutationen auslösen, wie chemische Mutagenese oder UV-Bestrahlung. Alternativ können ortsgerichtete Mutagenesetechniken verwendet werden. Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese sind beschrieben in (1). Andere Verfahren, die Mutationszahl in der Population zu erhöhen, schließen die Verwendung einer Replikationsmaschinerie mit niedriger Genauigkeit und hohe Replikationsraten ein.
Bei einer anderen Technik können kurze stochastische Sequenzen von DNS um den kodierenden Bereich des aktiven Zentrums eines Enzyms eingeführt werden und die Population kann chemischer und/oder UV-Bestrahlung ausgesetzt werden. Diese Population kann dann durch eine Replikationsmaschinerie mit niedriger Genauigkeit mit einer hohen Frequenz repliziert werden, um schnell eine hochheterogene Population zu schaffen.
Bei einem anderen Beispiel werden die neuen Proteasen auf einem viralen Genom kodiert und eine große Population solcher Viren wird einem Mutagen(en) oder Mutationen auslösenden Bedingungen ausgesetzt, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf in vitro stattfindende chemische Mutagenese, ortsgerichtet Mutagenese, Rekombination, Transposition, UV- oder lichtinduzierte Mutation, PCR-vermittelte Mutation, stochastisch erzeuge Mutation (wie beschrieben in der UK-Spezifikation Nr. GB 2183661 A), Replikation mit niedriger Genauigkeit und hoher Replikationsfrequenz. Die virale Population kodiert dann für eine Vielzahl unterschiedlicher neuer Proteasen.
Bei einem anderen Beispiel wird einem nicht-lytischen Phagen, z. B. M13, der die neue Protease kodiert, erlaubt, mit einer Polymerase niedriger Genauigkeit zu replizieren, während DnaA nicht erzeugt wird. Die Expression der Polymerase mit niedriger Genauigkeit wird abgeschaltet und die Expression einer Polymerase mit hoher Genauigkeit und von DnaA wird angeschaltet und das E.-coli-Chromosom, das die Fusion kodiert, wird ebenfalls repliziert. Dieser Vorgang wird in einer cyclischen Weise wiederholt, um kontinuierlich eine höhere Mutationsrate in der neuen Proteasepopulation zu fördern.
(5) Andere Verfahren für die Kontrolle des Selektionsdruckes um die gerichtete Evolution zu fördern
Es ist auch günstig, die Gene, welche die neue Proteasepopulation kodieren, zwischen hohen und niedrigen Selektionsbedingungen oder sogar zwischen Selektionsbedingungen und permissiven Bedingungen im Kreislauf zu führen, um die Evolution der Gene zu fördern. Zum Beispiel werden modifizierte Viren cyclisch zwischen zwei Stämmen von E. coli, einem Hochselektionsdruckstamm und einem Niederselektionsdruckstamm, inkubiert, so dass, falls marginales Wachstum in dem Hochselektionsdruckstamm geschieht, durch die Produktion einer neuen Protease mit niedriger Spezifität oder niedriger Umsatzrate die Population in dem Niederselektionsdruckstamm expandiert wird, mutiert wird und dann wiederum einem hohen Selektionsdruck ausgesetzt wird. Dieser Zyklus wird wiederholt, um dabei zu unterstützen, die Evolution der neuen Proteasepopulation in Richtung der gewünschten Spezifität zu fördern.
In Abhängigkeit von der Stabilität des Hochselektionsdruckstammes und der Mutationsrate der Selektionsmoleküle wird ein kontinuierliches oder ein semi-kontinuierliches System entwickelt. In einem kontinuierlichen System werden modifizierte Viren kontinuierlich in dem Niederselektionsdruckstamm erzeugt. Freie Virionen werden gesammelt, mutiert und ein Teil wird in die Inkubationskammer mit niedrigem Selektionsdruck erneut eingeführt, um die Heterogenität der neuen Proteasepopulation über das Maß hinaus zu steigern, das durch die Replikation mit niedriger Genauigkeit allein entstehen könnte. Der Rest wird mit dem Hochselektionsdruckstamm inkubiert. Die Inkubationskammer des Niederselektionsdruckstamms wird periodisch mit frischen Bakterien erneut beimpft oder die Bedingungen werden so kontrolliert, dass sie der Gestalt sind, dass die Replikationsrate jenes Stammes im Vergleich mit jener des Virus ausreichend ist, um die bakterielle Population aufrecht zu erhalten.
In gewissen Ausführungsbeispielen, in welchen Wachstumsfaktoren, die für die Replikation des Virus essenziell sind, herunterreguliert werden, brauchen die Hochselektionsdruckbakterien in einem kontinuierlichen System nicht aufgefüllt zu werden, bis eine neue Protease mit einem gewissen Grad der gewünschten Spezifität produziert worden ist. Dies liegt daran, dass die Infektion eines modifizierten Virus mit einem Gen, welches eine neue Protease kodiert, das nicht die Fähigkeit hat, das Selektionsmolekül zu spalten, abortiv ist. Es geschieht nur dann, wenn die Selektionskonstrukte gespalten werden und die Funktion in der Virus-Replikationsmaschinerie zurück gewonnen wird, dass die Infektion durch den lytischen Zyklus fortschreitet. Wenn erst einmal eine neue Protease mit gewissen Fähigkeiten der gewünschten Protease erzeugt worden ist, wird das virale Wachstum gefördert. Die Selektion wird in Richtung der gewünschten Spezifität, Reaktionstyp und Umsatzrate durch die kontinuierliche Zugabe von frischen Hochselektionsdruckbakterien zu der Inkubationskammer fortgesetzt. Die hinzugefügten Hochselektionsdruckbakterien werden direkt aus Aliquoten der Ursprungs-Hochselektionsdruckbakterien gezogen, so dass die bakterielle Population evolutionsmäßig zurückgesetzt wird. Alternativ dazu können Selektionsverfahren einen nicht-lytischen Phagen verwenden.
Für die gerichtete Evolution wird die neue Proteasepopulation auf der Sequenz für eine Protease basiert, die Eigenschaften hat, welche mit jenen des gewünschten neuen Moleküls am ähnlichsten sind, z. B. Aktivität, Spezifität, Umsatz etc. Da in gewissen Ausführungsbeispielen die Genpopulation, die die neue Protease kodiert, aus einer einzigen Quelle abgeleitet werden kann, sind Mutagenese und Replikation mit niedriger Genauigkeit wichtig für die Entwicklung einer geeigneten heterogenen Population. Zusätzlich kann der Selektionsdruck anpassbar und/oder cyclisch sein, um die Evolution von Genen zu unterstützen, welche die gewünschte neue Protease kodieren. Andere wichtige Techniken für die Förderung der gerichteten Evolution sind die Erhöhung der Heterogenität der neuen Proteasepopulation durch Erhöhen der Gesamtanzahl an Replikationen von Genen, die die Population kodieren, und die Verwendung von Mutatorpolymerasen mit niedriger Genauigkeit.
Als Beispiel, der evolutionäre Startpunkt für die neue Protease kann eine bestimmte Protease sein, welche eine spezifische Sequenz erkennt, die für das System nicht schädlich ist. In gewissen Ausführungsbeispielen ist es jedoch vorteilhaft, multiple neue Proteasestartpunkte zu haben. Folglich können etliche unterschiedliche Proteasen derselben oder unterschiedlicher Familien anfänglich in den modifizierten Viren kodiert werden. Falls multiple neue Proteasestartpunkte verwendet werden, dann können Startpunkte, die in der Nähe der gewünschten katalytischen Aktivität oder Spezifität oder von beiden liegen, eingebaut werden.
B. Wirts-Selektionsverfahren
(1) Positive Selektion
Positive zelluläre Selektion kann auf einer Reihe von Wegen geschehen. In einem Beispiel wird ein zellulärer Wachstumsfaktor, der der Zelle einen Wachstumsvorteil verleiht, funktionell herunterreguliert. Der herunterregulierte zelluläre Wachstumsfaktor wird in einem Selektionsmolekül komplexiert, so dass der Wachstumsfaktor nach der Produktion der gewünschten neuen Protease funktionell heraufreguliert wird. Folglich geschieht die Selektion der gewünschten neuen Protease durch positive zelluläre Selektion.
Alternativ dazu wird ein Toxin in ein Selektionsmolekül eingebaut, so dass seine Funktion aufrechterhalten oder heraufreguliert wird. Das funktionell aufrechterhaltene oder heraufregulierte Toxin wird in einem Selektionsmolekül komplexiert, so dass nach der Produktion der gewünschten neuen Protease der Wachstumsfaktor funktionell herunterreguliert wird. Die Selektion der gewünschten neuen Protease geschieht wiederum durch positive zelluläre Selektion.
Solche positiven zellulären Wachstumsselektionstechniken können in einer Reihe unterschiedlicher Geräte durchgeführt werden, einschließlich Chemostaten, Turbidostaten, in einfachen Inkubationskammern mit geeigneten Medien und unter den richtigen Bedingungen etc.
(2) Negative Selektion
Negative zelluläre Selektion kann auf einer Reihe an Wegen geschehen. Ein zellulärer Wachstumsfaktor, der der Zelle einen Wachstumsvorteil verleiht, hat seine Funktion aufrechterhalten oder heraufreguliert, wenn er in einem Selektionsmolekül komplexiert ist. Nach der Produktion der gewünschten neuen Protease unter Wechselwirkung derselben mit dem Selektionsmolekül, wird der Wachstumsfaktor funktionell herunterreguliert. Folglich geschieht die Selektion der gewünschten neuen Protease durch negative zelluläre Selektion.
In einem anderen Beispiel wird ein Toxin in ein Selektionsmolekül eingebaut, so dass seine Funktion herunterreguliert wird. Nach der Produktion der gewünschten neuen Protease wird das Toxin jedoch funktionell heraufreguliert. Wiederum geschieht die Selektion der gewünschten neuen Protease durch negative zelluläre Selektion.
Negative zelluläre Selektion wird durchgeführt unter Verwendung von Verfahren wie Wachstum in der Anwesenheit eines Moleküls wie einem Antibiotikum, das vorzugsweise wachsende Zellen abtötet. Indem die Zellen cyclisch von Antibiotika enthaltenden Medien in Wachstumsmedien, die keine Antibiotika enthalten, überführt werden, können Zellen, die zum Wachstum nicht in der Lage sind, selektiert werden.
C. Replikatorselektionsverfahren
(1) Positive Replikatorselektion
In Ausführungsbeispielen der Erfindung, welche die positive Selektion für Replikatoren, z. B. Viren, ausnutzen, werden das zu isolierende, schaffende oder entwickelnde Gen und sein Genpool oder seine Mutationen in der Population an Replikatoren kodiert. Der viralen Population wird ermöglicht, Wirtszellen zu infizieren. Jenen Viruspartikeln mit dem Gen, welches die neue Protease exprimiert, werden ein bevorzugter Wachstumsvorteil (lytischer Weg) oder Integrationsvorteil (lysogener Weg) gegeben. Falls die virale Replikation das selektierbare Merkmal ist, kann ein Selektionsmolekül unter Verwendung von essenziellen, in die virale Replikation verwickelten Proteinen, die funktionell in dem Selektionsmolekül herunterreguliert sind, gemacht werden. Ein Gen, das eine neue Protease kodiert, wird dann basierend auf seiner Wechselwirkung mit einer Erkennungssequenz und der resultierenden Heraufregulation des Wachstumsfaktors und der anschließenden viralen Replikation erhalten.
Positive virale Selektion bietet eine Reihe innewohnender Vorteile. Viren sind hocheffiziente Träger riesiger Zahlen kodierender Sequenzen und stellen einen bequemen Weg bereit, physikalisch kodierendes Material zu segregieren. Zusätzlich können, da gewisse Viren ihre eigenen Replikationsmaschinerien und Replikationsstartpunkte kodieren, Replikationssysteme mit hoher und niedriger Genauigkeit gleichzeitig tätig sein (eines für das Virus und eines für den Wirt). Viren replizieren auch mit schnelleren Geschwindigkeiten als Bakterien. Dies ermöglicht große Unterschiede in der Anzahl an Replikationen pro Zeiteinheit zwischen dem Wirt und dem Virus, was einen Unterschied in der Gesamtzahl an Mutationen bewirken kann. Es ist deswegen möglich, positive Selektion und Variabilität, das heißt hohe Mutationsrate in der Population, die das neue Molekül kodiert, und Homogenität, das heißt niedrige Mutationsrate in der Population, die die Selektionsmoleküle kodiert, zu fördern, wodurch die Selektion nicht-nützlicher Mutanten minimiert wird.
Ein Verfahren der Erfindung, welches positive Selektion des Virus und negative Selektion der Wirtszelle ausnutzt, kann durchgeführt werden durch Schaffen eines modifizierten Bakteriophagen, der die neue Protease kodiert, und eines ersten modifizierten Stammes von E. coli, welcher das Selektionsmolekül kodiert. Der modifizierte Phage kodiert nicht sämtliche der notwendigen Bestandteile für seine Replikation. Jene Replikationsbestandteile, die in dem modifizierten Phagen nicht kodiert sind, werden in dem ersten modifizierten E.-coli-Stamm in Selektionsmolekülen, die deren Funktion modulieren, kodiert.
Die modifizierten Phagen, die die vermeintlich neuen Proteasen kodieren, werden in einem zweiten modifizierten Stamm von E. coli vor der Selektion mit dem ersten Stamm erzeugt. Ein modifizierter Bakteriophage, dem entscheidende Bestandteile) für seine Replikation fehlen, wird in einer typischen Wirtszelle nicht repliziert und deswegen wird der zweiten Stamm, der den (die) in dem modifizierten Phagen fehlenden Bestandteile) kodiert und produziert, geschaffen, um eine große Population modifizierter Phagen für die Selektion mit dem ersten Stamm zu produzieren.
Selektionsdruck kann den Viren in einer kontinuierlichen oder semi-kontinuierlichen Durchflusszellkultur auferlegt werden oder alternativ dazu können Standard-Virustests durchgeführt werden. Falls die Bedingungen und/oder die Verdünnungen stimmen, kann auch negative Zellselektion verwendet werden. In diesem Fall haben die Viren, welche das Gen tragen, das die zu isolierende, schaffende oder entwickelnde Protease exprimiert, einen selektiven Vorteil in den Wirtszellen, was der Wirtszelle einen selektiven Nachteil auferlegen kann. Die für die negative Selektion beschriebenen Verfahren können dann verwendet werden, um hinsichtlich der infizierten Zellen zu selektieren.
(2) Negative Replikatorselektion mit positiver Wirts-Selektion
Selektion des Gens von Interesse kann durch negative Selektion für das Replikatorwachstum und/oder Replikation und/oder positive Selektion für das Wirtszell-Wachstum durchgeführt werden. Es können lytische Viren verwendet werden mit Wirtszellen, welche einen viralen Wachstumsfaktor kodieren; welcher dem Virus einen Wachstumsfaktor verleiht, wenn es in einem Selektionsmolekül komplexiert wird, der jedoch dem Virus einen selektiven Nachteil verleiht, wenn die gewünschte neue Protease exprimiert wird und mit dem Selektionsmolekül in Wechselwirkung tritt, um den Wachstumsfaktor freizusetzen. Solch ein Selektionsmolekül kann ein Enzym sein, das für die virale Replikation essenziell ist, mit einer in das Enzym eingefügten Erkennungssequenz, welche die Aktivität des Enzyms nicht herunterreguliert. Nach der Wechselwirkung mit der gewünschten neuen Protease und Abspalten der Erkennungssequenz wird das virale Replikationsenzym funktionell herunterreguliert. Die Viren werden negativ selektiert und die Wirtszellen machen eine positive Selektion durch.
D. Verfahren mit multiplen Replikatoren
Multiple Replikatoren können auch in demselben Wirt verwendet werden, das heißt die unterschiedlichen Bestandteile des Selektionsverfahrens können durch verschiedene Populationen an Replikatoren kodiert werden. Zum Beispiel können unterschiedliche Replikatoren eines oder mehre der Folgenden kodieren: die vermeintlich neue Proteasepopulation, die Erkennungssequenz, die Modulationseinheit, das Selektionsmolekül etc. Unterschiedliche Viren und Plasmide können in Verbindung miteinander verwendet werden, um eine heterogene Population an Genen zu schaffen, die neue Proteasen kodieren.
Solche Verfahren für die Isolation, Schaffung oder gerichtete Evolution eines Genes, welches eine neue Protease kodiert, die zu einer gewünschten Wechselwirkung mit einem Substrat von Interesse in der Lage ist, umfasst:
das Exprimieren in einer oder mehreren Populationen an Replikatoren innerhalb einer Population an Wirtszellen von vielfachen Kopien einer vermeintlich neuen Protease oder einer Vielzahl vermeintlich neuer Proteasen, eines Wachstumsfaktors für eine oder mehrere dieser Populationen an Replikatoren, welche diese neue Proteasen exprimieren, und
ein Substrat von Interesse oder Analogon davon, das funktionell mit diesem Wachstumsfaktor verbunden ist, und, wahlweise, eine Modulationseinheit für diesen Replikator-Wachstumsfaktor, und
Auferlegen von Selektionsbedingungen, z. B. Inkubieren der Population an Wirtszellen unter Selektionsbedingungen, um Replikatoren zu selektieren, welche eine Protease exprimieren, die mit diesem Analogon in Wechselwirkung tritt, um die Aktivität dieses Wachstumsfaktors zu ändern.
Die Reihenfolge der Expression der zahlreichen Bestandteile ist eine Frage der Wahl, ebenso wie es die relative zeitliche Abstimmung der Expression und die Auferlegung der Selektionsbedingungen ist. Es ist auch möglich, wie in anderen Ausführungsbeispielen der Erfindung, von außen einen oder mehrere Wachstumsfaktor(en), Erkennungssequenz(en) oder Modulationseinheit(en) hinzuzufügen.
E. Auf Erkrankungszellen basierende Selektion
Selektionsverfahren können auch direkt in Zellen im Erkrankungszustand durchgeführt werden. Zum Beispiel können Krebszellen als Wirte verwendet werden, welche ein Selektionsmolekül kodieren, was wiederum die Selektion für neue Proteasen mit verzögertem Krebszellwachstum erlaubt. Im Wege der Erläuterung kann eine krebsartige Zelle, die ein wichtiges zelluläres Enzym bei der Kontrolle des Zellzyklus unsàuber phosphoryliert, wodurch der krebsartige Phänotyp hervorgerufen wird, als ein Wirt verwendet werden. Selektion kann für neue Proteasen durchgeführt werden, die in der Lage sind, den krebsartigen Phänotypen umzukehren. Die demzufolge selektierten neuen Proteasen können dann in normalen Zellen desselben Typs wie die krebsartigen Zellen hinsichtlich Toxizität oder schädlichen Nebenwirkungen untersucht werden. Die Verfahren der Erfindung können in Zellen im Erkrankungszustand verwendet werden, um Proteasen zu selektieren, welche den Erkrankungszustand zu normalen Phänotypen umkehren.
F. Kontrolle der Aktivitätsspiegel neuer Proteasen durch Kontrolle der Expressionsspiegel vermeintlich neuer Proteasen
Der Selektionsdruck für die neue Protease kann durch Einstellen des Expressionsmaßes der vermeintlich neuen Proteasen kontrolliert werden. Falls ein Enzym gewünschter Funktion entwickelt werden soll, kann man das Expressionsmaß der vermeintlich neuen Proteasen verwenden, um die gewünschte Umsetzungsrate der neuen Protease zu lenken. Falls für eine hohe Umsatzrate selektiert werden soll, wird die Expression der vermeintlich neuen Proteasen auf einem niedrigen Maß kontrolliert. Alternativ wird, falls eine niedrige Umsatzrate gewünschte wird, die Expression der vermeintlich neuen Proteasen auf einem hohen Maß kontrolliert. Sogar noch genauer, falls eine hohe Umsatzrate gewünscht wird, kann ein Selektionsmolekül verwendet werden, das sicherstellt, dass eine hohe Anzahl neuer Proteasereaktionsereignisse, im Vergleich zu der Zahl in dem System zu irgendeinem Zeitpunkt vorhandenen neuen Proteasen (unter Berücksichtigung von ebenfalls ihrer Syntheserate und Abbaurate), pro Zeiteinheit benötigt wird, um Selektionsfähigkeit zu verleihen. Folglich kann Selektionsdruck durch geeignetes Einstellen der Zahl vermeintlichr neuer Proteasen, die zu irgendeinem gegebenen Zeitpunkt vorhanden sind, ausgeübt werden.
G. Selektion gewisser Proteasen
Die Wirtszell- oder Replikatorselektionsverfahren der Erfindung können durchgeführt werden, um neue Proteasen, die in der Lage sind, gewisse Substrate von therapeutischem Interesse zu spalten, zu isolieren oder zu schaffen oder ihre Entwicklung zu lenken.
Beispiele solcher Erkennungssequenzen sind Epitope von Influenza-Hämagglutinin. Die folgenden Sequenzen können unter anderem in ein Selektionsmolekül eingebaut werden.
Stelle A, Aminosäuren 140–146,
Lys-Arg-Gly-Pro-Gly-Ser-Gly
oder Lys-Arq-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly
oder Lys-Arg-Gly-Pro-Asp-Asn-Gly, oder
Stelle B, Aminosäuren 187–196,
Thr-Asp-Gln-Glu-Gln-Thr-Ser-Leu-Tyr-Val
oder Thr-Asn-Gln-Glu-Gln-Thr-Ser-Leu-Tyr-Val
oder Thr-Asn-Lys-Glu-Gln-Thr-Asn-Leu-Tyr-Val, oder
Stelle C; Aminosäuren 273–279,
Pro-Ile-Asp-Thr-Cys-Ile-Ser
oder Pro-Ile-Gly-Thr-Cys-Ile-Ser
oder Pro-Ile-Asp-Thr-Cys-Ser-Ser, oder
Aminosäuren 52–54
Cys-Asn-Asn
oder Cys-Asp-Asn
oder Cys-Asn-Lys
Andere Beispiele solcher Erkennungssequenzen sind die folgenden Stellen von HIV-gp120

(a) variable Region 3, Aminosäuren 271–295,
(b) konservierte Domäne 4, Aminosäuren 392–402 Q-F-I-N-M-W-Q-E-V-G-K
(c) konservierte Domäne 5, Aminosäuren 452–474 E-L-Y-K-Y-K-V-V-K-I-E-P-L-G-V-A-P-T-K-A-K-R-R

Proteasen für Varianten solcher Sequenzen können erzeugt werden. Alternativ können redundante Selektionsmoleküle mit derselben Basenkonformation solcher Sequenzen verwendet werden, um die Proteasen zu selektieren, die allgemein spezifisch für ihre Gesamtkonformation sind.
H. Verwendung von Kombinationen von Erkennungssequenzen und Genen, welche vermeintlich neue Proteasen exprimieren
Kombinationen aus Erkennungssequenzen und Genen, die vermeintlich neue Proteasen exprimieren, können verwendet werden. Zwei unterschiedliche Erkennungssequenzen können in jedem der beiden redundanten Sätze an Selektionsmolekülen gemeinsam mit Genen, die zwei vermeintlich neue Proteasepopulationen exprimieren, die durch ihre evolutionären Startpunkte unterschieden werden, verwendet werden. Eine neue Protease wird aus der ersten Population erhalten, welche mit einer der Erkennungssequenzen reagiert, und eine neue Protease wird aus der anderen Population erhalten, welche mit der anderen Erkennungssequenz reagiert.
In einem anderen Beispiel wird ein Selektionsmolekül, das zwei eng verwandte Erkennungssequenzen, A und A', einbaut, verwendet. Es wird die Wechselwirkung mit beiden Erkennungssequenzen durch die gewünschte neue Protease benötigt, um einen gewissen Grad an Selektierbarkeit zu verleihen. Selektion kann hinsichtlich der Reaktivität auf beide Erkennungssequenzen gleichzeitig durchgeführt werden. Dies kann durch die Selektion einer Protease mit einer breiten Spezifität für A und A' oder von zwei Proteasen, eine mit einer Spezifität für A und die andere für A', geschehen. In jedem Fall wird die Reaktivität sowohl für A als auch für A' gleichzeitig selektiert. In einem ähnlichen Verfahren können multiple Selektionsmoleküle verwendet werden, bei welchen ein Satz Selektionsmoleküle A enthält und ein anderer A' in multiplen redundanten Selektionsmolekülen enthält.
I. Zellfreie Verfahren
Die Erfindung kann auch in zellfreien Verfahren durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines zellfreien Verfahrens wird in den 3A und 3B offenbart.
Mit Bezugnahme auf die 3A und 3B identifiziert das Bezugszeichen 200 DNS, die multiple Kopien vermeintlich neuer Proteasen oder eine Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen kodiert. Die DNS 200 wird der Mutagenese ausgesetzt, wodurch eine heterogene Population an DNS, die eine Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen 202 kodiert, gebildet wird. Die Population 202 wird transkribiert und translatiert, um eine Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen 204 zu exprimieren. Das Bezugszeichen 206 identifiziert eine neue Protease von Interesse in jener Population.
Das Bezugszeichen 208 bezieht sich auf DNS, die ein Selektionsmolekül kodiert, das Actin als eine Wachstums-Modulationseinheit und eine Erkennungssequenz, welche das Substrat von Interesse ist oder repräsentiert, einschließt. Die DNS-Population 208 wird transkribiert und translatiert, um eine Population an Selektionsmolekülen 210 zu exprimieren.
Die Population 204 vermeintlich neuer Proteasen wird dann mit der Population an Selektionsmolekülen 210 in einem Inkubator 212 inkubiert. Die Inkubation der vermeintlich neuen Proteasen und der Selektionsmoleküle resultiert in enzymatischer Spaltung der Erkennungsstelle innerhalb der Selektionsmoleküle durch die gewünschte neue Protease 206, wodurch das Actinmonomer 214 aus dem Selektionsmolekül freigesetzt wird. Nachdem die Reaktion zum Abschluss gekommen ist, wird DNase 216 zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und die Mischung wird im Inkubator 218 für eine Zeit inkubiert, die ausreichend ist, dem freigesetzten Actin, falls vorhanden, zu erlauben, die DNase zu inhibieren. Ein Überschuss der inkubierten Mischung aus dem Inkubator 212 wird bezüglich der DNase 216 verwendet, um sicherzustellen, dass die gesamte DNase inhibiert wird. Die Actinmonomere inhibieren die DNase, wie gezeigt am Bezugszeichen 220. Dann, nachdem Actin inhibiert worden ist, wird die heterogene Population mutierter DNS, die eine Population unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen 202 kodiert, zu der inkubierten Mischung aus der Vielzahl unterschiedlicher vermeintlich neuer Proteasen, dem actin-basierten Selektionsmolekül und DNase hinzugefügt und jene Mischung wird weiter im Inkubator 218 inkubiert. Die Anwesenheit der gewünschten neuen Protease wird durch die Anwesenheit nicht abgebauter DNS untersucht.
Die DNS kann isoliert gereinigt, partitioniert, exprimiert und erneut für die gewünschten Funktionen der neuen Protease untersucht werden. In einem bevorzugten Verfahren wird die isolierte/gereinigte DNS amplifiziert, z. B. durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und die amplifizierte DNS wird einer oder mehreren Wiederholungen des Verfahrens ausgesetzt, um die gewünschte DNS zu selektieren.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
BEISPIEL I
Schaffung einer neuen Protease(n) für eine Decapeptidsequenz von HIV-gp120 durch die Verwendung künstlicher Zymogene und viraler positiver Selektion
Beispiel I beschreibt ein Verfahren, um eine Endopeptidase(n) zu schaffen, die spezifisch für eine Decapeptid-Erkennungssequenz von gp120 ist. Das Verfahren verwendet Genfusionen, die proteinbasierte Selektionsmoleküle kodieren. Neue Proteasen, die in einer viralen Population kodiert sind, spalten die Decapeptid-Erkennungssequenz, wodurch Proteine freigesetzt werden, die für die virale Replikation notwendig sind. Dieses Beispiel ist erläuternd für die virale positive Selektion. Eine vereinfachte Darstellung ist in den 2A, 2B und 2C dargelegt.
E. coli B, ein Wirtsstamm für den Bakteriophagen T7, wird durch das Einführen eines Plasmids transformiert, um T7-Deletionsmutanten zu vervollständigen. Zwei unterschiedliche deletionsmutierte T7-Stämme werden gemacht und so werden zwei korrespondierende komplementäre E.-coli-Transformanten erzeugt, wie unten aufgelistet:

1) E.-coli-Transformante 1 (ET1) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression der T7-Gene gp1 (RNS-Polymerase), gp 4 (Primase/Helicase) und mutiertes gp 5 (DNS-Polymerase) mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt. Dieser transformierte Wirt ermöglicht nach der induzierten Expression dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante (T7A) für die Gene gp 1, 4 und 5.
2) E.-coli-Transformante 2 (ET2) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression der T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität und zusätzlich die Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein) und 18 (DNS-Reifungsprotein) trägt. Dieser transformierte Wirt erlaubt nach der induzierten Expression dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante (T7B) für die Gene 1, 4, 5, 10A, 13 und 18.

Zusätzlich werden zwei E.-coli-Selektionstransformanten (EST1 und EST2) produziert. Diese transformierten Zelllinien unterscheiden sich von ET1 und ET2 dahingehend, dass die T7-Gene, die in diesen Zellen kodiert werden, als Genfusionen komplexiert werden. Zusätzlich werden diese Stämme für Proteasefehler selektiert (z. B. Stämme wie lon, hfl oder htpR) (1) und (20). Diese beiden Transformanten sind unten beschrieben:

1) E.-coli-Selektionstransformante 1 (EST1) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die Expression der T7-Gene gp1, gp 4 und mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt, wobei sämtliche jener Sequenzen Modulationseinheiten (strukturelle Hüllproteine des Virions aus T4) mit sowohl ihren Amino- als auch ihren Carboxyenden verschmolzen haben, wie umrissen in der Tabelle unten, verbunden durch eine gp120-Protease-Erkennungssequenz.
2) E.-coli-Selektionstransformante 2 (EST2) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression der T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität und zusätzlich die Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein) und 18 (DNS-Reifungsprotein) trägt, wobei alle jene Sequenzen Modulationseinheiten (strukturelle Hüllproteine der Virionen von T4) mit sowohl ihren Amino- als auch ihren Carboxyenden verschmolzen haben, wie umrissen in der Tabelle unten, verbunden durch eine gp120-Protease-Erkennungssequenz.

Die vollständige Sequenz von T7 ist in (21) beleuchtet. Unter Verwendung der Information aus der T7-Sequenz werden Primer chemisch für die PCR-vermittelte Amplifikation der in die Plasmide einzuführenden Gene synthetisiert. Beispiele von PCR-Primern für jedes Gen sind unten aufgelistet, wobei die Nummern der in (21) wiedergegebenen T7-DNS-Sequenz entsprechen.
PCR-Amplifikation jedes dieser Gene wird durch Standardtechniken wie jene, die in (1) beschrieben sind, durchgeführt. T7-Wildtypphagen und ihre DNS, die als eine Matrize verwendet werden, werden durch das folgende Verfahren, wie beschrieben durch (22) und (23), isoliert/gereinigt.
Die T7-Gene werden, wenn sie erst einmal amplifiziert sind, in Plasmidvektoren mit induzierbaren Promotoren wie p-KK177-3, einem Vektor, der den tac-Promotor nutzt, ligiert. Der tac-Promotor wird in E.-coli-Stämmen abgeschaltet, die hohe Spiegel des lac-Repressors exprimieren. Der Promotor wird durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. p-KK177-3, ebenso wie der tac-Promotor werden in (1) diskutiert. Die Ligierung der durch PCR amplifizierten T7-Gene in ein Plasmid, das einen induzierbaren Promotor wie p-KK177-3 enthält, kann durch in (1) beschriebene Standard-Ligierungstechniken durchgeführt werden. Die rekombinanten Plasmide werden dann verwendet, um einen E.-coli-B-Stamm, der hohe Spiegel des lac-Repressors exprimiert, durch Techniken wie Elektrotransformation oder unter Verwendung von Calciumchlorid zu transformieren. Protokolle für diese Techniken sind in (1) beschrieben.
Genfusionen werden gewöhnlich in der Molekularbiologie verwendet und eine Reihe unterschiedlicher Verfahren für die Konstruktion von β-Galactosidase-Fusionsproteinen wurde beschrieben in (24). Diese Verfahren oder die in (1) beschriebenen Verfahren, auf die früher Bezug genommen wurden, werden verwendet, um ein sauber ligiertes Selektionsmolekül zu bilden, das zusammengesetzt ist aus einem T7-Gen mit einem T4-Hüllprotein-Strukturgen, angeheftet an sowohl das Amino- als auch das Carboxyende, so dass die Leseraster durch das Konstrukt hindurch aufrecht erhalten werden. Folglich wird jedes der T7-Gene in EST1 und EST2 ohne Stopp-Codons kodiert, die verfrüht das Fusionsprotein beenden, oder inserierte oder deletierte Basen, die das Leseraster verschieben. Die T4-DNS-Sequenzen können unter Verwendung der in (25) reproduzierten T4-Genomkarte lokalisiert und isoliert/gereinigt werden. Die benötigten Gene werden dann mit PCR amplifiziert für die Verwendung in Ligationsvorgängen, wie es kürzlich für die T7-Gene beschrieben worden war. DNS-Moleküle, die die Fusionen kodieren, können dann wiederum in pKK177-3-Plasmid-DNS unter der Kontrolle des tac-Promotors ligiert werden.
Die Protease-Erkennungssequenz ist ein Decapeptid um Trp 397 des vierten konstanten Bereichs von gp120 des HIV-Virus herum. Diese Aminosäure ist sehr wichtig für das Binden von gp120 an CD4, da Mutanten von gp120 an dieser Position die CD4-Bindung abschaffen. Aus der Sequenz von gp120 aus (26) kann eine gewünschte proteolytische Erkennungssequenz bestimmt werden, wie FINMWQEVGK (Phenylalanin-Isoleucin-Asparagin-Methionin-Tryptophan-Glutamin-Glutaminsäure-Valin-Glycin-Lysin). Die kodierende Nucleotidsequenz wird aus (27) erhalten, in welcher die Nucleotidsequenzen aus fünf unterschiedlichen HIV-Klonen beschrieben werden, von denen jeder Trp 397 aufweist.
Es gibt wenigstens vier verschiedene Verfahren, die verwendet werden können, um die T7-Deletionsmutanten zu erzeugen. Diese Verfahren schließen die Verwendung spezifischer Restriktionsenzyme, falls dies angemessen ist, die Schaffung einzigartiger Restriktionsstellen durch oligonucleotid-vermittelte Mutagenese, die Deletion durch oligonucleotid-vermittelte "Loop-Out"-Mutagenese und die Erzeugung systematischer Deletionen ein. Diese Techniken werden in (1) umrissen. Das virale T7-Genom wird erhalten, wie kürzlich beschrieben in (22) und (23). Die deletionsmutierten T7-Genome werden dann in vitro unter Befolgung der Protokolle von (28) in Virionen verpackt.
Die Ausgangspopulation neuer Moleküle wird auf etlichen bekannten Proteasen basiert. Dies berücksichtigt etliche unterschiedliche evolutionäre Startpunkte, aus denen die gewünschte neue Protease entstehen kann. Die Proteasen sind HIV-Protease, Polio3C-Protease und Subtilisin BPN'. Die Sequenzen für diese Proteasen wurden in E. coli eingeführt und als funktionelle Enzyme oder als Enzyme mit funktionellem Potenzial im Zymogenzustand exprimiert (29) und (30).
Um eine große und heterogene vermeintlich neue Proteasepopulation zu schaffen, wird jedes Proteasegen ortsgerichteter Mutagenese ebenso wie in vitro chemischer Mutagenese ausgesetzt. Verfahren für ortsgerichtete Mutagenese sind gegeben in (1). Verfahren für in vitro chemische Mutagenese sind ebenfalls in (1) gegeben.
Die mutierten neuen Proteasesequenzen werden dann durch früher diskutierte Verfahren mit einem Promotor wie die PR- oder PL-Promotoren des Bakteriophagen Lambda (für die Verwendung in Wirten, die keinen Lambda-Repressor exprimieren, um die neue Molekülproduktion herunter zu regulieren) oder einem T7-Promotor ligiert. Die Population aus Promotor und neuem Molekül wird dann unter Befolgung der obigen Vorgänge in eine deletionsmutierte T7-A-Population ligiert, die in ET1-Wirtszellen wachsen gelassen wurde. Wenn dieses Vorgehen einmal vervollständigt ist, wird eine heterogene deletionsmutierte T7-A-Population erzeugt, die hochheterogen auf Grund der Tatsàche ist, dass sie einen heterogenen mutierten Pool neuer Moleküle kodiert. Auf diese Population wird unten Bezug genommen als T7A/neues Molekül.
Die T7A/neues-Molekül-Population wird dann auf ET1 Wirtszellen herangezogen und auf EST1-Wirtszellen übertragen. Die EST1-Wirtszellen für die T7A/neues-Molekül-Population werden in der stationären, nicht replizierenden Wachstumsphase gehalten. Nur jene T7A/neues-Molekül-Virionen, die in der Lage sind, eine neue Protease zu produzieren, welche die gp1-, gp-4- und gp-5-Funktion durch Abspalten der gp120-Decapeptid-Protease-Erkennungssequenz wiederherstellt, sind dann fähig, die strukturellen Hüllproteingruppen des T4-Virions aus dem Selektionsmolekül freizusetzen, wodurch das Wachstum in diesen Zellen ermöglicht wird. T7A/neues Molekül werden in einer kontinuierlichen Weise unter Verwendung eines Zellstaten, wie beschrieben in (31), oder in einem semi-kontinuierlichen Batch-Vorgang, wobei wiederholte Aliquoten des T7A/neuen Moleküls zu den EST1-Wirten hinzugefügt werden, hinzugefügt. Wenn erst einmal die virale Replikation geschieht, werden die resultierenden Virionen geerntet und ihre DNS wird isoliert/gereinigt, wie beschrieben in (22) und (23). Die neue Proteasesequenz wird entweder durch PCR-Amplifikation erhalten, falls die Erkennungssequenzen der Primer nicht untragbar mutiert worden sind, durch Isolation/Reinigung der Fragmente des T7/neue-Protease-Gens, die in der Lage sind, mit neue Proteasen vom Wildtyp kodierender DNS zu hybridisieren, oder durch Isolation/Reinigung von Fragmenten, die in der Lage sind, Proteasen mit der gewünschten Funktion zu exprimieren.
Die Sequenz, die für die Protease aus dem T7/neues-Molekül-Virion kodiert, das zum Wachstum in EST1 in der Lage ist, wird dann in irgendeiner Anzahl von Expressionssystemen exprimiert, (1), und die Protease kann dann genauer funktionell charakterisiert werden. Falls weitere Selektion notwendig ist, wird die Sequenz für die neue Protease aus dem T7A/neues-Molekül-Virion, das zum Wachstum in EST1 in der Lage ist, in T7B ligiert. Dementsprechende Vorgänge werden durchgeführt, wie zuvor, mit der Ausnahme, dass T7B anstelle von T7A verwendet wird, ET2 anstelle von ET1 verwendet wird und EST2 anstelle von EST1 verwendet werden wird.
Das Vorgehen von Beispiel I erlaubt folglich die Entwicklung von neuen Proteasen, die für die Decapeptid-Sequenz von gp120 spezifisch sind.
BEISPIEL II
Schaffung einer neuen Protease(n) für β-Galactosidase durch die Verwendung künstlicher Zymogene
Beispiel II beschreibt ein Verfahren zur Schaffung von Endopeptidase(n) mit einem Spezifitätsbereich für Erkennungssequenzen um den Carboxyterminus von β-Galactosidase herum. Das Verfahren verwendet eine Genfusion, die β-Galactosidase und ein T7-Gen involviert.
Das Selektionsvorgehen wird auf einem neuen Molekül (Protease) basiert, das die β-Galactosidase spaltet, welche die für die virale Replikation notwendige T7-Produktfunktion herauf reguliert. Deswegen repräsentiert dieses Beispiel ein positives virales Selektionsvorgehen. Das Vorgehen ist allgemein in den 2A, 2B und 2C wiedergegeben.
Genauer wird β-Galactosidase in dem korrekten Leseraster an den Aminoterminus jedes der T7-Gene, die in EST1 und EST2 kodiert sind, ohne Stopp-Codons, welche das Fusionsprotein verführt beenden, ligiert. Die DNS, welche die Fusionen kodieren, werden dann in das pKK177-3-Plasmid unter der Kontrolle des tac-Promotors inseriert.
E. coli B, ein Wirtsstamm für den Bakteriophagen T7, wird durch das Einführen von Plasmiden, welche T7-Gene kodieren, transformiert, um T7-Deletionsmutanten zu vervollständigen. Dies berücksichtigt das Wachstum und die Amplifikation dieser T7-Deletionsmutanten. Zwei unterschiedliche deletionsmutierte T7-Stämme werden gemacht und so werden zwei korrespondierende komplementäre E.-coli-Transformanten produziert, wie beschrieben in Beispiel I. Zusätzlich werden dann die korrespondieren Selektionsstämme, EST1 und EST2, jedoch mit β-Galactosidase an den Aminotermini der verwendeten T7-Gene verschmolzen, in den Selektionsvorgängen genutzt.
Es liegen keine Beschränkungen auf den Proteasen, andere als die, genügend β-Galactosidase zu spalten, um die Funktion der T7-Gene in den Konstrukten freizusetzen.
Diesbezüglich ist die gewünschte neue Protease "semi-spezifisch". Die Protease selber kann jedoch für eine bestimmte Erkennungssequenz spezifisch sein. Ein Fachmann würde erkennen, dass diese Technik verwendet werden könnte, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen mit anderen Proteinen als β-Galactosidase zu entwickeln.

1) E.-coli-Transformante 1 (ET1) wird mit dem E.-coli-Plasmid PKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression der T7-Gene gp1 (RNS-Polymerase), gp 4 (Primase/Helicase) und mutiertes gp 5 (DNS-Polymerase) mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt. Dieser transformierte Wirt erlaubt nach der induzierten Expression dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante (T7A) für die Gene gp 1, 4 und 5.
2) E.-coli-Transformante 2 (ET2) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die induzierbare Expression der T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität und zusätzlich die Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein) und 18 (DNS-Reifungsprotein) trägt. Dieser transformierte Wirt erlaubt nach der induzierten Expression dieser Gene das Wachstum einer T7-Deletionsmutante (T7B) für die Gene 1, 4, 5, 10A, 13 und 18.

Zusätzlich werden zwei E.-coli-Selektionstransformanten (EST1 und EST2) produziert. Diese transformierten Zelllinien unterscheiden sich von ET1 und ET2 dahingehend, dass die T7-Gene, die in diesen Zellen kodiert werden, als Genfusionen komplexiert werden. Zusätzlich werden diese Stämme für Proteasefehler selektiert (z. B. Stämme wie lon, hf1 oder htpR) (1) und (20). Diese beiden Transformanten werden unten beschrieben:

1) E.-coli-Selektionstransformante 1 (EST1) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die T7-Gene gp1, gp 4 und mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonucleaseaktivität trägt, wobei jedes davon mit β-Galactosidase ligiert wird, so dass nach der Expression die Modulationseinheit β-Galactosidase mit ihren Aminoenden verschmolzen wird.
2) E.-coli-Selektionstransformante 2 (EST2) wird mit dem E.-coli-Plasmid pKK177-3 transformiert, das die Sequenz für die T7-Gene gp1, gp 4, mutiertes gp 5 mit niedriger Genauigkeit und reduzierter 3'-5'-Exonuclease und zusätzlich die Gene 10A (Hauptkopfprotein), 13 (inneres Virionenprotein) und 18 (DNS-Reifungsprotein) trägt, wobei jedes davon mit β-Galactosidase ligiert wird, so dass nach der Expression die Modulationseinheit der β-Galactosidase mit ihren Aminoenden verschmolzen wird.

Die vollständige Sequenz von T7 wird in (21) beleuchtet. Unter Verwendung der Information aus der T7-Sequenz können Primer für die PCR-vermittelte Amplifikation der in die Plasmide einzuführenden Gene chemisch synthetisiert werden. Beispiele an PCR-Primern für jedes Gen sind unten aufgelistet, wobei die Nummer der in (21) gegebenen T7-DNS-Sequenz entspricht.
PCR-Amplifikation jedes dieser Gene kann durch Standardtechniken wie jene in (1) beschriebenen durchgeführt werden. T7-Wildtypphagen und ihre DNS, welche als eine Matrize verwendet werden wird, können durch die folgenden Verfahren isoliert/gereinigt werden, wie beschrieben durch (22) und (23).
Die T7-Gene, wenn sie erst einmal amplifiziert sind, können in Plasmidvektoren mit induzierbaren Promotoren wie p-KK177-3, einem Vektor, der den tac-Promotor nutzt, ligiert werden. Der tac-Promotor wird in E.-coli-Stämmen abgeschaltet, welche hohe Spiegel des lac-Repressors exprimieren. Der Promotor wird durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. p-KK177-3 ebenso wie der tac-Promotor werden in (1) diskutiert. Ligation der durch PCR amplifizierten T7-Gene in ein Plasmid, das einen induzierbaren Promotor wie p-KK177-3 enthält, kann durch in (1) beschriebene Standard-Ligationsstechniken durchgeführt werden. Die rekombinanten Plasmide werden dann verwendet, um einen E.-coli-B-Stamm, der hohe Spiegel des lac-Repressors exprimiert, durch Techniken wie Elektrotransformation oder unter Verwendung von Calciumchlorid zu transformieren. Protokolle für diese Techniken werden in (1) beschrieben.
β-Galactosidase ist ein in der Molekularbiologie üblicherweise verwendetes Gen und eine Reihe unterschiedlicher Verfahren für die Konstruktion von β-Galactosidase-Fusionsproteinen wurden beschrieben (24). Diese Verfahren oder die in (1) beschriebenen Verfahren, auf die früher Bezug genommen worden ist, können verwendet werden, um eine in dem korrekten Leseraster an den Aminoterminus jedes der T7-Gene sauber ligierte β-Galactosidase zu bilden, die in EST1 und EST2 ohne Stopp-Codons, welche das Fusionsprotein frühzeitig beenden, codiert werden. Die Fusionen kodierender DNS-Moleküle können dann wiederum in pKK177-3-Plasmid-DNS unter der Kontrolle des tac-Promotors ligiert werden.
Es gibt wenigstens vier unterschiedliche Verfahren, die verwendet werden können, um die T7-Deletionsmutanten zu erzeugen. Diese Verfahren schließen die Verwendung spezifischer Restriktionsenzyme, falls geeignet, die Schaffung geeigneter Restriktionsstellen durch oligonucleotid-vermittelte Mutagenese, die Deletion durch oligonucleotid-vermittelte "Loop-Out"-Mutagenese und die Schaffung systematischer Deletionen ein. Diese Techniken werden in (1) umrissen. Das virale T7-Genom wird erhalten, wie kürzlich beschrieben in (22) und (23). Die deletionsmutierten T7-Genome werden dann sauber in vitro unter Befolgung der Protokolle von (28) in Virionen verpackt.
Die Population neuer Moleküle wird auf zahlreichen bekannten Proteasen basiert. Dies berücksichtigt etliche unterschiedliche evolutionäre Startpunkte, aus welchen die gewünschte neue Protease entstehen könnte. Die zu verwendenden Proteasen sind HIV-Protease, Polio3C-Protease und Subtilisin-BPN'. Die Sequenzen für diese Proteasen wurden in E. coli eingeführt und als funktionelle Enzyme oder als Enzyme mit funktionellem Potenzial exprimiert, (29) und (30).
Um eine große und heterogene vermeintlich neue Proteasepopulation zu erzeugen, wird jedes Proteasegen ortsgerichteter Mutagenese ebenso wie in vitro chemischer Mutagenese ausgesetzt. Verfahren für die ortsgerichtete Mutagenese und Verfahren für die in vitro chemische Mutagenese werden in (1) gegeben.
Die mutierten neuen Moleküle werden dann in einen Promotor wie die PR- oder PL-Promotoren des Bakteriophagen Lambda (für die Verwendung in Wirten, die keinen Lambda-Repressor exprimieren, um die Produktion neuer Moleküle herunter zu regulieren) oder in einen T7-Promotor unter Verwendung der früher diskutierten Verfahren ligiert. Die Population aus Promotor/neues Molekül wird dann in die deletionsmutierte T7-A-Population, die in ET1-Wirtszellen wachsen gelassen wurde, nach den obigen Vorgängen ligiert. Wenn dieses Verfahren einmal vervollständigt worden ist, wird eine heterogene deletionsmutierte T7-A-Population (T7A/neues Molekül) produziert, welche hochheterogen ist auf Grund der Tatsache, dass sie einen heterogenen mutierten Pool neuer Moleküle kodiert.
Die Population aus T7A/neues Molekül wird dann auf ET1 Wirtszellen herangezogen und auf EST1-Wirtszellen übertragen. Die EST1-Wirtszellen für die Population aus T7A/neues Molekül werden in der stationären, nicht replizierenden Wachstumsphase gehalten. Nur jene T7A/neues-Molekül-Virionen, die in der Lage sind, eine neue Protease zu produzieren, welche die gp1-, gp-4- und gp-5-Funktion durch Abspalten der β-Galactosidasegruppen von dem Selektionsmolekül wiederherstellt, sind fähig, in diesen Wirten zu wachsen. Die T7A/neues-Molekül-Virionen werden in einer kontinuierlichen Weise unter Verwendung eines Zellstaten, wie beschrieben in (31), oder in einem semi-kontinuierlichen Batch-Vorgang, wobei wiederholte Aliquoten der T7A/neues-Molekül-Virionen zu den EST1-Wirten hinzugefügt werden, hinzugefügt. Wenn erst einmal die virale Replikation geschieht, werden die resultierenden Virionen geerntet und ihre DNS wird isoliert/gereinigt, wie beschrieben durch (22) und (23). Die Sequenz des neuen Moleküls wird entweder durch PCR-Amplifikation erhalten, falls die Erkennungssequenzen der Primer nicht verbotenerweise mutiert worden sind, durch Isolation/Reinigung der Fragmente des T7/neuen-Proteasegens, die in der Lage sind, mit DNS, die neue Moleküle vom Wildtyp kodiert, zu hybridisieren, oder durch Isolation/Reinigung von Fragmenten, die in der Lage sind, Proteasen mit der gewünschten Funktion zu exprimieren. Die Sequenz, die die Protease aus dem T7/neues-Molekül-Virion kodiert, das in der Lage ist, in EST1 zu wachsen, wird dann in irgendeiner einer Anzahl an Expressionssystemen exprimiert, (1), und die Protease kann dann genauer funktionell charakterisiert werden. Falls weitere Selektion notwendig ist, wird die Sequenz für das neue Molekül aus dem T7A/neues-Molekül-Virion, das in der Lage ist, in EST1 zu wachsen, in T7B ligiert. Folglich werden Vorgänge durchgeführt, wie zuvor, mit der Ausnahme, dass T7B anstelle von T7A verwendet wird, ET2 anstelle von ET1 verwendet wird und EST2 anstelle von EST1 verwendet wird.
Dieses Vorgehen ermöglicht die Entwicklung einer Protease, die allgemein spezifisch ist, um den carboxyterminalen Bereich von β-Galactosidase abzuspalten.
BEISPIEL III
Verfahren um neue Protease(n) die spezifisch für ein Epitop von Influenza-Hämagglutinin ist (sind), zu selektieren
Beispiel III beschreibt ein Verfahren, eine Endopeptidase zu schaffen, welche spezifisch eine Heptapeptid-Sequenz der Stelle A des Influenza-Hämagglutinins (HA) (Aminosäuren 140 bis 146) spaltet (32). Das Verfahren verwendet Genfusionen, einschließend T7-Gene (deren Funktion herunterreguliert wird, wenn sie in der Fusion komplexiert sind) und Gene von anderen Bakteriophagen. Das Selektionsvorgehen wird auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert, das die Influenza-HA-Heptapeptid-Erkennungssequenz abspaltet und dadurch die Funktion des T7-Produktes, das für die virale Replikation notwendig ist, heraufreguliert. Dieses Beispiel stellt ein positives virales Selektionsvorgehen dar. Eine vereinfachte Darstellung des Verfahrens erscheint in den 2A, 2B und 2C.
Die Heptapeptid-Erkennungssequenz ist aus den Aminosäuren 140 bis 146 eines Influenza-HA, AICHI/2/68, zusammengesetzt. Die Sequenz ist Lys-Arg-Gly-Pro-Gly-Ser-Gly. Zwei Stämme EST1* und EST2* werden erzeugt, welche die Heptapeptidsequenz als Erkennungslinker kodiert, verwendet in der Art, in welcher die Faktor-X-Erkennungssequenz (33) und das V8-Erkennungssequenzsystem (34) verwendet werden. Zusätzlich werden dieses Stämme dahingehend selektiert, dass sie protease-effizient sind. In diesen Systemen werden spezifische Sequenzen für bestimmte Proteasen zwischen zwei zu spaltende Gene platziert. Die Konstrukte für EST1* und EST2* werden auf den in Beispiel 1 beschriebenen EST1 und EST2 basiert, jedoch mit der oben beschriebenen spezifischen Influenza-HA-Heptapeptidsequenz. Die Fusionen und neuen Proteasepopulationen werden, wie früher beschrieben, konstruiert und exprimiert. Es wird dann ähnlichen Selektionsprotokollen gefolgt.
Folglich werden die T7-Gene nach der Produktion eines neuen Moleküls, das zur Spaltung des Influenza-HA-Heptapeptids in der Lage ist, aus ihren Konstrukten freigesetzt. Da die Heptapeptid-Erkennungssequenz die einzige gemeinsame Sequenz zwischen sämtlichen Fusionen ist, wird die Selektion der neuen Protease in Richtung zu Proteasen gelenkt, die nur für das Influenza-HA-Heptapeptid spezifisch sind. Als Erstes werden neue Proteasen auf EST1* selektiert, gefolgt von der Selektion auf EST2*, wie beschrieben in Beispiel 1 für EST1 und EST2. Die in T7B getragenen resultierenden neuen Proteasen werden isoliert/gereinigt und charakterisiert. Ein Fachmann wird realisieren, dass diese Technik verwendet werden kann, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen zu entwickeln, anders als jene in diesem Beispiel verwendeten.
BEISPIEL IV
Ein Verfahren zur Schaffung einer neuen Endopeptidase unter Verwendung von positiver zellulärer Selektion
Beispiel IV beschreibt ein Verfahren zur Schaffung einer Endopeptidase, welche spezifisch eine Decapeptid-Sequenz von gp120 spaltet. Eine vereinfachte Darstellung erscheint in den 1A und 1B.
Das Verfahren verwendet Genfusionen, die drei zelluläre Gene, Aspartattranscarbamoylase, Glutaminsynthetase und Tryptophansynthetase (deren Funktionen heruntermoduliert werden, wenn sie in der Fusion komplexiert sind), in Selektionsmolekülen mit zahlreichen Genen aus anderen Bakteriophagen involviert. Das Selektionsvorgehen ist auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert, die die gp120-Decapeptid-Erkennungssequenz abspaltet und folglich die Funktionen der drei zellulären Gene heraufreguliert und deshalb den Zellen, die die Endopeptidase mit der gewünschten Funktion enthalten, einen Wachstumsfaktor unter Selektionsbedingungen verleiht. Dieses Beispiel stellt ein positives zelluläres Selektionsvorgehen dar.
Die Gene für die Virionenhüllproteine 24 und 28 des Bakteriophagen T4 werden jeweils mit den Amino- und Carboxyenden der Glutaminsynthetase durch eine Proteasepeptid-Erkennungssequenz von gp120, das in Beispiel I verwendet worden ist, verschmolzen. Ähnliche Virionenhüllproteine 27 und 20 werden mit dem gp120-Linker jeweils mit den Amino- und Carboxyenden der Alpha-Untereinheit der Tryptophansynthetase verschmolzen und das Gen 12 von T7 und das Gen F von phiXl74 werden mit dem gp120-Linker jeweils mit den Amino- und Carboxyenden der Beta-Untereinheit der Tryptophansynthetase verschmolzen. Zuletzt werden Proteine der Gene 23 und 15 des Bakteriophagen T4 mit dem gp120-Linker an jeweils die Amino- und Carboxyenden der katalytischen Untereinheit der Aspartattranscarbamoylase verschmolzen und Proteine des Gens 27 des Bakteriophagen T4 und des Gens 16 des Bakteriophagen T7 werden mit dem gp120-Linker an den jeweiligen Amino- und Carboxyenden der regulatorischen Untereinheit der Aspartattranscarbamoylase verschmolzen. Aspartattranscarbamoylase katalysiert die Bildung von N-Carbamoylaspartat aus Carbamoylphosphat und Aspartat.
Diese Konstrukte können mit geeigneten Promotoren hergestellt und unter Verwendung von in Beispiel I beschriebenen Ligierungstechniken exprimiert werden und dann in das E.-coli-Chromosom eines E.-coli-Stammes eingebaut werden, der eine Deletionsmutante für die Aspartattranscarbamoylase-, Glutaminsynthetase- und Tryptophansynthetasegene ist. Diese E. coli werden zusätzlich auf das Erfordernis funktionell aktiver Aspartattranscarbamoylase, Glutaminsynthetase und Tryptophansynthetase für effizientes Wachstum selektiert und werden auch selektiert für Proteasedefizienz.
Diese E. coli werden dann in glutamin-, tryptophan- und pyrimidinreichem Medium wachsen gelassen. Die neuen Molekülgene, basierend auf den drei Proteasen aus Beispiel I, werden mutiert wie zuvor. In diesem Beispiel wird jedoch die resultierende heterogene Population an Genen, welche vermeintlich neue Moleküle exprimieren, in ein Plasmid mit hoher Kopienzahl wie die PUC-Vektoren (z. B. pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119), beschrieben in (1), ligiert, das unter der Kontrolle einer mutierten T7-Replikationsmaschinerie mit geringer Genauigkeit steht. Plasmide, deren Replikation sich unter der Kontrolle der T7-Replikationsmaschinerie befindet, sind beschrieben in (37).
In diesem Beispiel kodiert das Plasmid multiple neue Molekülgene pro Plasmid ebenso wie die für die T7-Replikation benötigten Gene (38) mit der mutierten DNS-Polymerase von Gen 5. Dies ermöglicht einer differenziellen Mutationsrate zwischen der Population an DNS, die die Konstrukte auf dem E.-coli-Chromosom kodiert, und der vermeintlichen Population an neuen Molekülen, die auf dem Plasmid kodiert sind, zu existieren. Selektion wird dann in glutamin-, tryptophan- und pyrimidin-begrenzenden Medien in einem Chemostaten, wie beschrieben in (39) und (40), durchgeführt. Der Selektionsdruck wird dann zwischen Umgebungen mit hohem und niedrigem Selektionsdruck in dem Chemostaten cyclisiert (z. B. niedrige Spiegel an Glutamin, Tryptophan und Pyrimidinen in den Medien für einen hohen Selektionsdruck und hohe Spiegel an Glutamin, Tryptophan und Pyrimidinen in den Medien für einen niedrigen Selektionsdruck), wie in (41) beschrieben, um auf unterschiedliche Unterarten der Gene zu selektieren, was wiederum dabei hilft, Mutanten mit einer höheren Aktivität für eine gewünschte Reaktion zu erhalten.
Schließlich kann evolutionäres Zurücksetzen verwendet werden, um weiter die Selektionsmolekülkonstrukte über die Zeit zu stabilisieren. Während der Inkubation werden Zellen periodisch auf ihre Fähigkeit, in drei unterschiedlichen Medien, pyrimidin-begrenzenden Medien, enthaltend Glutamin und Tryptophan (Test für eine Mutation, die Aspartattranscarbamoylasefunktion hervorruft), glutamin-begrenzende Medien, die Pyrimidine und Tryptophan enthalten (Test für eine Mutation, die Glutaminsynthetasefunktion hervorruft) und tryptophan-begrenzende Medien, enthaltend Pyrimidine und Glutamin (Test für Mutation, die Tryptophansynthetasefunktion hervorruft), zu wachsen, untersucht. Unter Verwendung dieser Verfahren kann die Bildung nicht-nützlicher Mutanten getestet werden.
Jedes Mal, wenn von einer Selektionsmolekülmutante gefunden wird, dass sie vorkommt, werden die Plasmide isoliert/gereinigt, wie in vorangegangenen Beispielen beschrieben, und dann verwendet, um eine Aliquote der E. coli, die das Ausgangsselektionsmolekül kodieren, zu transformieren. Dies erlaubt es, die Selektionsmolekülkonstrukte evolutionsmäßig zurückzusetzen, während der evolutionäre Fortschritt der neuen Molekül-Population beibehalten wird. Die zurückgesetzte Population kann in den Chemostaten erneut eingeführt werden. Wenn das neue Molekül der beschriebenen Spezifität exprimiert wird, werden jene Zellen, die das Gen tragen, welches das gewünschte neue Molekül kodiert, in dem Chemostaten selektiert und das Plasmid, das das neue Molekül trägt, kann, wie früher beschrieben, isoliert/gereinigt werden.
Andere Enzyme oder Pfade, die in der Lage sind, den Bedarf für die durch Aspartattranscarbamoylase, Glutaminsynthetase und Tryptophansynthetase synthetisierten Verbindungen aufzubauen oder abzuschaffen, sollten, vorzugsweise durch Deletion, nicht-funktionellgemacht werden. Zum Beispiel sollten Deletionsmutanten der Glutamin-Ketosäure-Transaminase verwendet werden, da das Enzym die Synthese von Glutamin aus zwei 2-Ketoglutamat katalysiert. Ebenfalls sollte es keinen Mechanismus für die Synthese von Tryptophan aus Indolpyruvat oder Serin geben. Die gewünschte Wirtszelle für die Selektion wird nur effizient wachsen, wenn Glutamin, Tryptophan und Pyrimidine zu dem Medium hinzugefügt werden. Nach der Selektion werden die Gene für die Endoprotease von Interesse isoliert/gereinigt, kloniert und ihre Expressionsprodukte werden charakterisiert.
Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen, anders als die in dem Beispiel verwendeten, zu entwickeln.
BEISPIEL V
Ein Verfahren zur Schaffung einer neuen Endopeptidase unter Verwendung von negativer zellulärer Selektion
Beispiel V beschreibt ein Verfahren, zur Schaffung einer Endopeptidase, welche spezifisch eine Decapeptidsequenz von gp120 mit einer niedrigeren Umsatzrate als die Wildtyp-HIV-Protease spaltet. Das Verfahren nutzt eine rekombinante β-Galactosidase mit einer Decapeptid-Erkennungssequenz. Das Selektionsvorgehen wird auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert, das eine gp120-Decapeptid-Erkennungssequenz spaltet und folglich die β-Galactosidaseaktivität herunterreguliert und deswegen den Zellen, welche die Endopeptidase mit der gewünschten HIV-Proteaseaktivität enthalten, einen Wachstumsnachteil unter Selektionsbedingungen verleiht. Das Beispiel stellt ein negatives zelluläres Selektionsvorgehen dar.
Es gibt viele bekannte einzelne Aminosäureänderungen der HIV-Protease, die in der Lage sind, die Protease enzymatisch inaktiv zu machen, (5) und (42). Eine dieser inaktiven Fehlsinn-HIV-Proteasen oder ein Cocktail von jenen werden mutiert. Dieses Beispiel nutzt enzymatischaktive β-Galactosidase, die eine HIV-Protease-Decapeptid-Erkennungssequenz enthält, welche nach der Spaltung das β-Galactosidasemolekül inaktiv macht (29).
Es werden Stämme unter Befolgung der Protokolle aus (29) für die Produktion des E.-coli-MC1061-Stammes entwickelt, welcher Plasmide enthält, die das β-Galactosidasekonstrukt und eine mutierte inaktive HIV-Protease (z. B. Asp-29→Gly) tragen. Als Erstes werden unter Verwendung dieser Verfahren Stämme produziert, die eine der in (5) oder (42) beschriebenen inaktiven HIV-Proteasemutanten oder Kombinationen von mehr als einer von diesen tragen. Diese Zelllinien werden dann wachsen gelassen, um die Isolation/Reinigung der Plasmide zu erlauben, (1). Die Plasmid-DNS wird dann der Mutagenese ausgesetzt, wie früher beschrieben, (1), oder durch Transfizieren der Plasmide in Stämme wie E.-coli-Stamm LE30 mutD, die hohe Mutationsraten haben (42).
Dann werden die mutierten Plasmide in den E.-coli-Stamm MC1061 transfiziert (1), welcher das gewünschte β-Galactosidasekonstrukt trägt (29). Diese Zellen werden dann für negatives zelluläres Wachstum selektiert, wie beschrieben in (43).
Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann, um Proteasen zu entwickeln, mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen, anders als die in dem Beispiel verwendete.
BEISPIEL VI
Ein Verfahren zur Schaffung einer neuen Endopeptidase unter Verwendung von positiver zellulärer Selektion
Beispiel VI beschreibt ein Verfahren, eine Endopeptidase zu erhalten, welche spezifisch eine Decapeptidsequenz von gp120 mit einer niedrigeren Umsatzrate als Wildtyp-HIV-Protease spaltet. Das Verfahren nutzt ein Fusionsprotein der katalytischen Untereinheit von Aspartattranscarbamoylase. Das Selektionsvorgehen ist auf einem neuen Molekül (Endoprotease) basiert, das eine gp120-Decapeptid-Erkennungssequenz spaltet und die Aspartattranscarbamoylaseaktivität heraufreguliert und deswegen den Zellen, welche die Endopeptidase mit der gewünschten HIV-Proteaseaktivität enthalten, einen Wachstumsvorteil unter Selektionsbedingungen verleiht. Das Beispiel stellt ein positives zelluläres Selektionsvorgehen dar.
Wie in dem vorangegangenen Beispiel werden Moleküle mit HIV-Proteasefunktion aus einer oder einer Kombination an Einzel-Aminosäuremutanten der HIV-Protease, die enzymatisch inaktiv sind und die der Mutagenese unterzogen worden sind (wie oben beschrieben), erhalten. In diesem Beispiel wird jedoch eine Fusion aus der katalytischen Untereinheit von Aspartattranscarbamoylase, an deren Aminoende durch das HIV-Protease-Erkennungs-Decapeptid aus (29) β-Galactosidase angeheftet ist, und dem Gen 10 (Capsidprotein) aus dem Bakteriophagen T7, angeheftet an ihr Carboxyende durch das HIV-Protease-Erkennungs-Decapeptid (1), geschaffen.
Die mutierte Population an HIV-Fehlsinn-Mutanten wird in modifizierte MC1061-Zellen transfiziert, welche Deletionsmutanten für die katalytische Untereinheit der Aspartattranscarbamoylase sind und welche die Aspartattranscarbamoylasefusion enthalten, die auf dem Wirtschromosom unter Verwendung von in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Techniken genau gefördert wird. Zusätzlich werden diese Wirtszellen für das Erfordernis einer funktionellen Aspartattranscarbamoylase für effizientes Wachstum selektiert und werden selektiert für Proteasedefizienz. Die Selektion für die Expression von Molekülen, die in der Lage sind, die Fusion zu spalten und die enzymatische Aktivität der Aspartattranscarbamoylase freizusetzen, wird dann in einem Chemostaten durchgeführt (39). Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen, anders als die in dem Beispiel verwendeten, zu entwickeln.
BEISPIEL VII
Ein Verfahren zur Schaffung einer neuen HIV-Protease unter Verwendung von negativer zellulärer Selektion
Dieses Beispiel ist ähnlich wie Beispiel V. In diesem Beispiel wird jedoch Wildtyp-HIV-Protease als ein Startpunkt anstelle von enzymatisch inaktiven Fehlsinn-Mutanten verwendet. Zusätzlich wird die HIV-Decapeptid-Erkennungssequenz zu einer der folgenden Sequenzen geändert, von denen jede in einem gesonderten Selektionslauf parallel verwendet werden soll: Tabelle 1. Relative Spaltung von HIV-Peptidsubstraten

IN: Integraseprotein.

Von den Sequenzen von BI-P-140, BI-P-138, BI-P-144, BI-P-127 und BI-P-102 (Sequenzsatz A) wurde gezeigt, dass sie durch HIV-Protease in unterschiedlichen Raten gespalten werden, alle jedoch in viel geringeren Raten als die des Decapeptids von BI-P-136, falls eine Spaltungsrate überhaupt nachweisbar ist (44). Negative zelluläre Selektion wird dann durchgeführt unter Verwendung von Decapeptid-Erkennungssequenzen aus dem Sequenzsatz A. Vier der fünf Sequenzen sind natürliche Substrate für HIV-Protease, werden jedoch durch das Enzym mit einem Bruchteil der Rate des BI-P-136-Substrat-Decapeptids verarbeitet. Zellen werden zubereitet, welche diese vier Sequenzen in β-Galactosidase inseriert enthalten (in einer analogen Weise zu (29)), und die exprimierte HIV-Proteasen enthalten. Diese Zellen können als "durchlässige" Auxotrophe in verschiedener Hinsicht betrachtet werden. Als solche wird β-Galactosidase anfänglich gespalten werden und deshalb in variierenden Graden in den Zellen, die diese Konstrukte tragen, inaktiviert werden. Die fünfte Sequenz, eine Erkennungssequenz aus dem Vogel-Sarkom-Leukose-Virus, wird nicht spezifisch durch HIV-Protease gespalten, (44) und (45). Zusätzlich werden diese Stämme selektiert hinsichtlich des Erfordernisses einer funktionellen β-Galactosidase für das effiziente Wachstum und hinsichtlich der Proteasedefizienz. HIV-Protease-Mutanten werden mit erhöhten Umsatzraten für die zahlreichen Substrat-Decapeptide unter negativen Selektionsbedingungen mit variierenden Konzentrationen an Antibiotikum und Lactose erhalten.
Die Verwendung höherer Konzentrationen an Lactose und Antibiotika erfordert einen strengeren negativen Selektionsdruck, indem den durchlässigeren Auxotrophen ermöglicht wird, unter Verwendung der Lactose zu wachsen und dann durch das Penicillin getötet zu werden. Dies selektiert HIV-Protease-Mutanten mit höheren Umsatzraten für die Konstrukte von Interesse. Die mutierten Proteasen aus den selektierten Zellen werden dann in in-vitro-Untersuchungen charakterisiert, wie beschrieben in (29). Jene zellulären Klone mit der gewünschten Spezifität werden dann heran gezogen und ihre Plasmide, welche die gewünschte Funktion tragen, isoliert/gereinigt, wie oben beschrieben.
Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen, anders als die in dem Beispiel verwendete, zu entwickeln.
BEISPIEL VIII
Ein Verfahren für die Schaffung einer neuen HIV-Protease unter Verwendun von positiver zellulärer Selektion Dieses Beispiel ist ähnlich wie Beispiel VI. In diesem Beispiel wird Wildtyp-HIV-Protease als ein Startpunkt anstelle von enzymatisch-inaktiven Fehlsinn-Mutanten verwendet. Zusätzlich wird die HIV-Decapeptid-Erkennungssequenz zu einer der folgenden Sequenzen geändert (44), von denen jede in einem gesonderten Selektionslauf parallel verwendet werden soll: Tabelle 1. Relative Spaltung von HIV-Peptidsubstraten

IN: Integraseprotein.

Von den Sequenzen von BI-P-140, BI-P-138, BI-P-144, BI-P-127 und BI-P-102 (Sequenzsatz A) wurde gezeigt, dass sie durch HIV-Protease in unterschiedlichen Raten gespalten werden, alle jedoch in viel langsameren Raten als jene des Decapeptids von BI-P-136, falls die Spaltungsrate überhaupt nachweisbar ist (44). Positive zelluläre Selektion wird dann in einem Chemostaten (kürzlich beschrieben) unter zahlreichen Verdünnungsraten und Selektionsdrucken durchgeführt, um Zellen zu selektieren, die Proteasen exprimieren, welche in der Lage sind, enzymatische Aktivität von Aspartattranscarbamoylase durch die Spaltung des Fusionskonstruktes mit den gewünschten Umsatzraten freizusetzen. Die mutierten HIV-Proteasen in den selektierten zellulären Klonen können dann weiter unter Verwendung des in (29) beschriebenen in-vitro-Tests charakterisiert werden. Jene zellulären Klone mit der gewünschten Spezifität werden dann heran gezogen und ihre Plasmide, welche die gewünschte Funktion kodieren, isoliert/gereinigt, wie kürzlich beschrieben.
Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Technik verwendet werden kann, um Proteasen mit einer Spezifität für Erkennungssequenzen, anders als jene in dem Beispiel verwendeten, zu entwickeln.
BEISPIEL IX Zellfreie Selektion
Dieses Beispiel erläutert, wie zahlreiche Schritte in kontrollierten zellfreien Umgebungen durchgeführt werden.
Die verwendete Endopeptidase ist eine Fehlsinn-Mutante der HIV-Protease wie Asn-25, (5) und (42). Die Gene für diese Enzyme werden auf Plasmiden kodiert und unter Verwendung von irgendeinem der in den früheren Beispielen beschriebenen Verfahren der Mutagenese unterzogen, einschließlich chemischer Mutagenese, ortsgerichteter Mutagenese und Replikation mit niedriger Genauigkeit (z. B. Wachsen lassen in MutD-Stamm).
Die mutierte Enzym-Population wird in E. coli, wie zuvor, erzeugt und dann isoliert/gereinigt (unter Verwendung von Techniken, wie beschrieben in (1)). Die Plasmide, welche die Endopeptidase-Population enthalten, werden isoliert/gereinigt, (1). Ähnliche Protokolle werden verwendet, um ein Fusionsprotein von Actin zu exprimieren, das an seinem Aminoende an β-Galactosidase mit einer HIV-Protease-Erkennungssequenz, (29), und an das Gen 10 von T7 an seinem Carboxyende durch dieselbe HIV-Protease-Erkennungssequenz gekoppelt ist. Das exprimierte Fusionskonstrukt wird isoliert/gereinigt, wie zuvor beschrieben. Alternativ dazu können die vermeintlich neuen Protease- und Actinfusionsgene unter Verwendung von PCR, wie beschrieben in (48), amplifiziert und exprimiert werden. Dies würde die Verwendung lebender Zellen in jedem Aspekt des Vorgehens eliminieren.
Die exprimierten, vermeintlich neuen Protease-Proteine werden mit den isolierten/gereinigten Actinfusionsproteien inkubiert, wodurch der neuen Protease mit der gewünschten Funktion ermöglicht wird, die Erkennungssequenz zu spalten. Die resultierende Mischung aus der vermeintlich neuen Protease und der Actinfusionsinkubation wird dann gemeinsam in der Anwesenheit von isolierter/gereinigter DNase I inkubiert. Von DNase ist bekannt, dass sie durch die 1 : 1-Komplexierung mit Actinmonomeren inhibiert wird (46, 47). Das Actinmonomer ist sterisch frei, an das DNase-I-Enzym nach der sauberen Abspaltung der HIV-Protease-Erkennungssequenz zu binden.
Das isolierte/gereinigte Plasmid (oder PCR-DNS), das die vermeintlich neue Proteasepopulation kodiert, wird dann zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und inkubiert. Die resultierende DNS wird aus der Inkubationsmischung unter Verwendung von in (1) beschriebenen Verfahren isoliert/gereinigt. Die DNS wird dann unter Verwendung von Gelelektrophorese charakterisiert.
Nach der Identifikation einer DNS-Bande, die einem unverdauten Plasmid entspricht, welches eine vermeintlich neue Protease kodiert, wird die DNS aus dieser Bande isoliert/gereinigt (1) und gleichmäßig in 100 Proben aufgeteilt. Jede Probe wird amplifiziert und die vermeintlich neuen Proteasen werden exprimiert und ihre Funktion wird, wie zuvor, untersucht, um zu bestimmen, welche Probe neue Protease kodiert, die in der Lage ist, DNase I zu inhibieren. Die weitere Partitionierung der Proben, welche die enzymatische Aktivität kodieren, wird durchgeführt, bis der gewünschte Klon erhalten wird und wird wahlweise amplifiziert. An diesem Punkt werden die neuen Proteasen hinsichtlich zahlreicher Attribute wie Umsatzrate charakterisiert.
Falls die Eigenschaften der neuen Proteasen wie gewünscht sind, ist keine weitere Entwicklung notwendig. Falls sie es nicht sind, werden die neuen Proteasen evolutionsmäßig weiter entwickelt. Unter Verwendung der diese neuen Proteasen kodierenden DNS wird der Vorgang durch erneute Mutierung der Genpopulation der neuen Proteasen, Amplifizierung und dann wiederum Untersuchung hinsichtlich der gewünschten Funktion in den exprimierten Proteinen wiederholt. Auf diesem Wege kann die DNS, welche die neue Proteasepopulation kodiert, einen evolutionären Fortschritt durchmachen, um eine neue Protease mit den bevorzugten Eigenschaften zu erhalten.
BEISPIEL X
Gerichtete Entwicklung einer neuen Protease, spezifisch für ein Epitop von Influenza-Hämagglutinin (HA), kodiert in einem M13-Vektor unter Verwendung eines auf Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase (ASD) basierten Selektionsmoleküls in E. coli in einem Batch-Vorgang, durchgeführt in einem Chemostaten
Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase (ASD) katalysiert die Produktion von Aspartat-4-semialdehyd aus Aspartyl-4-phosphat in E. coli. Die Reaktion ist NADPH-abhängig und setzt eine Phosphatgruppe frei. Die Produktion von Aspartat-4-semialdehyd ist eine Verzweigungsstelle, aus welcher die Vorläufer der vier Aminosäuren Methionin, Threonin, Isoleucin und Lysin erzeugt werden. Folglich wird, falls ASD nicht funktionell in der Zelle ist und falls die Zellen so selektiert werden, dass es keine alternativen Pfade für die Produktion von Aspartat-4-semialdehyd oder irgendeinem der anderen wichtigen Metaboliten stromabwärts von Aspartat-4-semialdehyd gibt, die Zelle nicht in der Lage sein, ohne die Zugabe der vier Aminosäuren in den Medien zu wachsen. Zusätzlich werden die Zellen selektiert, proteasedefizient zu sein.
Ein ASD-basiertes Selektionskonstrukt wird durch Schaffung eines Fusionsproteins erzeugt. β-Galactosidase wird stromabwärts der ASD-Sequenz kodiert und Asparaginsynthetase wird stromabwärts kodiert. β-Galactosidase und Asparaginsynthetase werden an ASD durch eine Decapeptid-Erkennungssequenz der Influenza-HA-Stelle B (32), Thr-Asp-Gln-Glu-Gln-Thr-Ser-Leu-Tyr-Val, gekoppelt. Das Fusionsprotein wird auf dem E.-coli-Chromosom unter der Kontrolle des stärksten Promotors, von dem gezeigt wird, dass er eine annehmbare Hintergrund-ASD-Aktivität verleiht, kodiert. Mit der maximalen Anzahl an zugänglichen Fusionsproteinen haben neue Moleküle mit niedrigerem Umsatz, jedoch der korrekten proteolytischen Spezifität einen selektiven Vorteil.
Dieses Verfahren erlaubt das Wachstum von Zellen und Replikatoren in einem Chemostaten, wobei es eine Trennung der kodierenden Sequenzen für Selektionsmoleküle und vermeintlich neue Moleküle gibt, wodurch differenzielle Mutationsraten ermöglicht werden. Die Selektion beruht auf der zweifachen Selektion der Zellen und der Replikatoren in einer symbiotischen Beziehung.
Der evolutionäre Startpunkt des neuen Moleküls ist eine Protease, welche eine spezifische Sequenz erkennt und die für das System nicht schädlich ist, z. B. Collagenase aus Achoromobacter iophagus und Clostridium histolyticium, welche vorwiegend an X-gly und pro-X-gly-pro spaltet, und wird in dem Genom eines Phagen wie M13 kodiert. Große Zahlen von M13-Phagen, welche das neue Molekül kodieren, werden starken Mutagenen wie Ethylmethansulfonat, Nitrosoguanidin und Bestrahlung ausgesetzt. Mutation ruft eine heterogene Population hervor, welche dann in einem Chemostaten mit E. coli inkubiert wird, die das Selektionskonstrukt in Minimalmedien ohne die vier Aminosäuren kodieren. Zufällige Mutagenese verleiht der neuen Proteasepopulation im Vergleich mit den Selektionskonstrukten einen evolutionären Vorsprung. Zusätzlich wird das M13-Genom in einer höheren Rate repliziert als das E.-coli-Chromosom, wodurch weiter die Mutationszahl in dem M13-Genom im Vergleich zu dem E.-coli-Chromosom erhöht wird. Jene M13-Moleküle mit der höchsten Aktivität werden basierend auf ihrem selektiven Wachstumsvorteil erhalten. Die Gene, welche die vielversprechendsten neuen Proteasen kodieren, werden aus der Population isoliert/gereinigt und diese können wiederum mutiert werden und mit einer evolutionsmäßig zurückgesetzten Population an E.-coli-Zellen, die für ein Fusionsprotein-Selektionskonstrukt kodieren, in einem wiederholbaren Vorgang vom Batch-Typ inkubiert werden. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung der besten neuen Proteasen, während das Fusionsprotein stabil gehalten wird, indem seine Population oftmals wieder aufgefrischt wird.
BEISPIEL XI
Gerichtete Evolution einer neuen Protease, spezifisch für eine Erkennungssequenz aus HIV-gp120, kodiert in einem M13-Vektor unter Verwendung von Selektionskonstrukten, die Enzyme enthalten, welche bei der Synthese von Chorismat in E. coli wichtig sind, unter Verwendung von differenzieller Mutationsrate, Redundanz und einer heterogenen Anfangspopulation
Chorismat ist ein Verzweigungspunkt bei der Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan. Seine Produktion wird durch die enzymatische Wirkung der Chorismatsynthase auf 3-Enolpyruvylshikimat-5-phosphat katalysiert. Die Produktion von Chorismat folgt einem linearen, unverzweigten Weg aus 3-Desoxy-7-phospho-D-arabinoheptulosonat. Der Pfad, einschließlich Chorismat und 3-Desoxy-7-phospho-D-arabinoheptulosonat, enthält sieben Mitglieder und wird durch sechs unterschiedliche Enzyme katalysiert, von denen eines Chorismatsynthase ist.
Jedes der sechs Enzyme wird in einem unterschiedlichen Proteinfusions-Selektionskonstrukt verwendet, kodiert auf dem E.-coli-Chromosom eines Stammes, der dahingehend selektiert ist, dass er Chorismat für effizientes Wachstum benötigt und selektiert ist, dass er protease-defizient ist. Die kodierenden Sequenzen für jedes Enzym, flankiert auf beiden Seiten mit der proteolytischen Erkennungssequenz von Interesse, die Aminosäuren 271–295 des variablen Bereichs 3 von HIV gp120
(N-N-T-R-K-S-I-R-I-Q-R-G-P-G-R-A-F-V-T-I-G-K-I-G-N), werden zwischen geeigneten sperrigen Gruppen wie β-Galactosidase, einer der drei Phospho-2-3-desoxyheptonat-Aldolasen und Proteinen von Bakteriophagen, wie beschrieben in anderen Beispielen, eingeschlossen. Die Fusionsproteine werden auf dem E.-coli-Chromosom unter der Kontrolle des stärksten Promotors kodiert, von dem gezeigt wird, dass er eine annehmbare Hintergrundaktivität verleiht. Es ist bevorzugt, Modulationseinheiten zu verwenden, von denen jede nicht homolog ist und welche keine Homologen mit Genen in dem E.-coli-Chromosom haben. Modulationsmoleküle werden gewählt, welche die sechs Enzyme, einschließlich Chorismatsynthase wirksam herunterregulieren. Diese redundanten Selektionsmoleküle kanalisieren die Entwicklung einer Protease, die für die Erkennungssequenz von gp120 spezifisch ist, welche die einzige gemeinsame Sequenz aller Fusionen ist.
Die produzierte E.-coli-Zelllinie kodiert alle sechs fusionsbasierten Selektionskonstrukte, wodurch ein redundantes System geschaffen wird. In diesem System wird die Biosynthese von Chorismat gehemmt, sogar wenn fünf der sechs Proteinfusionen nicht-nützliche Deletionen durchmachen. Zusätzlich arbeitet das redundante System sogar, falls die Herunterregulation der enzymatischen Funktionen in den zahlreichen Proteinen nicht vollständig ist. Da jedes der Enzyme eine Reaktion in demselben Pfad katalysiert, hat die Herunterregulierung jedes innerhalb ihren Fusionen eine kumulative Wirkung auf die Produktion von Chorismat.
Die vermeintlich neue Proteasepopulation wird in einem M13-Phagen kodiert. Die evolutionären Startpunkte für das neue Molekül schließen HIV-Protease-Subtilisin BPN, Polio-3C-Protease und Collagenasen von Achromobacter iophagus und Clostridium histolyticium ein. Eine große Population solcher Phagen werden der Mutation unterzogen, um der vermeintlich neuen Molekülpopulation einen evolutionären Vorsprung zu verleihen.
Differentielle Mutationsraten für die Selektionskonstrukte und die neuen Proteasen werden durch die Verwendung unterschiedlicher Replikationsstartpunkte und ihrer entsprechenden Replikationsmaschinerie geschaffen. Die Selektionskonstrukte werden einzig durch den natürlichen E.-coli-Holoenzymkomplex repliziert, während die neuen Proteasen durch die T7-DNS-Replikationsmaschinerie repliziert werden können.
Um einen M13-Phagen zu schaffen, bei dem die Replikation der vermeintlich neuen Proteasepopulation durch die T7-Maschinerie gelenkt wird, wird ein zweifacher Replikationsmechanismus eingeführt. M13 wird auf einem zirkulären, einzelsträngigen DNS-Genom kodiert. T7 ist in linearer, doppelsträngiger DNS-Phage. Während seiner Replikation wird M 13 jedoch in einer doppelsträngigen Form produziert. Der normale M13 wird intakt gehalten, um den Phagen in seine doppelsträngige Form zu bringen, und dann kann ein T7-Replikationssystem zum Ziel genommen werden, um Gene auf dem M13-Genom zu replizieren.
Um dies zu tun, werden für die Replikation benötigte T7-Gene, einschließlich mutierten T7-DNS-Polymerasen mit niedriger Genauigkeit, von entweder dem M13-Genom, dem bakteriellen Chromosom oder einem Plasmid exprimiert. Diese Gene schließen eine modifizierte T7-DNS-Polymerase (Gen 5) mit niedriger Genauigkeit, die T7-RNS-Polymerase und die T7-Gyrase (Gen 4) ein (38). Die T7-Replikationsmaschinerie befindet sich unter der Kontrolle eines starken Promotors, so dass eine hohe Kopienzahl erreicht wird. Das M13-Genom enthält eine Anzahl an T7-Replikationsstartpunkten, so dass, wenn M13 erst einmal doppelsträngig ist, die große Kopiezahl der T7-Replikationsmaschinerie erfolgreich mit dem E.-coli-Holoenzym (welches in sehr geringen Kopiezahlen in einer Zelle vorhanden ist) um die Replikation des M13-Genoms konkurriert. Die vermeintlich neue Protease oder Proteasen sind in der Nähe des T7-Replikationsstartpunktes lokalisiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass, falls sowohl ein bakterielles Holoenzym als auch eine T7-DNS-Polymerase aktiv dasselbe M13-Genom replizieren, die modifizierte T7-Polymerase mit geringer Genauigkeit die neue Protease replizieren wird.
Die differenzielle Mutationsrate wird ebenfalls erhöht, indem die Kopiezahl vermeintlich neuer Molekülsequenzen auf dem M13-Genom erhöht wird. Diese Sequenzen können oder können nicht vollständig sein. Zum Beispiel können mehrfache Kopien der vollständigen vermeintlich neuen Protease zu günstigen homologen Rekombinationen führen. Zusätzlich können kurze Strecken an DNS, insbesondere jene, die wichtige Teile der neuen Protease wie das katalytische Zentrum kodieren, zufällig in das M13-Genom eingebaut werden, so dass erhöhte Zahlen kleiner Rekombinationen um wichtige Stellen herum geschehen werden. Diese kleinen Sequenzen werden auch wahrscheinlich in gewisse Bruchteile der Rekombinationen zufällige flankierende Sequenzen einbringen (da sie in dem Genom zufällig verteilt sind).
Die das redundante System enthaltenden E. coli und die oben beschriebene heterogene Startpopulation aus M13, welche die neuen Proteasen kodiert, werden in einem Chemostaten wachsen gelassen. Der Selektionsdruck wird moduliert, konstant gehalten oder regelmäßig durch Anpassen der Chemostatumgebung, insbesondere der Konzentration der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan und der Durchflussgeschwindigkeit, cyclisiert. Proben des M13-Bakteriophagen werden regelmäßig entnommen und auf die Fähigkeit, neue Proteasen mit der gewünschten proteolytischen Aktivität zu produzieren, untersucht.
ZITATE

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Claims

Verfahren zum Mutieren einer ersten Nukleinsäuresequenz, kodierend ein mögliches Peptid oder Proteinmolekül, zu einer zweiten Nukleinsäuresequenz, kodierend ein zweites Peptid oder Proteinmolekül, welches zweite Peptid oder Proteinmolekül eine Protease ist und zur Bindung an und proteolytischen Spaltung von einer Erkennungssequenz befähigt ist, das Verfahren umfassend: (a) das Exprimieren mehrerer Kopien des möglichen Peptids oder Proteinmoleküls, kodiert von der ersten Nukleinsäuresequenz, in einer Population von Wirtszellen, enthaltend als einzelnes Polypeptidfusionsprotein: (i) einen Wachstumsfaktor, der zum Verleihen eines Wachstumsvorteils oder Nachteils an die Wirtszellen oder an Replikatoren innerhalb der Wirtszellen befähigt ist, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Nährstoffen, Toxinen, Proteinen, die in die Replikation oder den Metabolismus von Wirtszelle oder Replikator involviert sind, und Proteinen, die in die Bildung und den Erhalt essentieller Strukturkomponenten der Wirtszelle oder des Replikators involviert sind, und (ii) eine Erkennungssequenz, umfassend eine Aminosäuresequenz, wobei die Erkennungssequenz eine Bindungsstelle bereitstellt, an die das zweite Peptid oder Protein bindet und diese katalytisch spaltet; (b) Kultivieren der Wirtszellen und/oder Replikatoren unter mutagenen und selektiven Bedingungen, um sicherzustellen, dass: (i) mindestens ein Replikator und/oder eine Wirtszelle in der Population mindestens einen Zyklus der Zellteilung und/oder Replikation durchläuft; (ii) die erste Nukleinsäuresequenz zur zweiten Nukleinsäuresequenz mutiert wird, welche das zweite Peptid oder Proteinmolekül kodiert; (iii) das zweite Peptid oder Proteinmolekül an die Erkennungssequenz bindet, welche Bindung die Erkennungssequenz proteolytisch spaltet und den vom Wachstumsfaktor verliehenen Wachstumsvorteil aufmoduliert oder den vom Wachstumsfaktor verliehenen Wachstumsnachteil herabmoduliert; und (iv) ein selektiver Vorteil für diejenigen Wirtszellen, enthaltend das zweite Peptid oder Proteinmolekül, und/oder Replikatoren in den Wirtszellen gegeben ist, wodurch diejenigen Wirtszellen identifiziert werden, die das zweite Peptid oder Proteinmolekül enthalten, und/oder der Replikatoren in den Wirtszellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Zellwachstumsfaktor und einem Replikatorwachstumsfaktor.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die mutagenen und Selektionsbedingungen nacheinander auf die Wirtszellpopulation angelegt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das mögliche Peptid oder die Proteinmoleküle homogen sind und/oder worin dem möglichen Peptid oder den Proteinmolekülen die katalytische Bindungsaktivität des zweiten Peptids oder Proteinmoleküls fehlt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das zweite Peptid oder Proteinmolekül eine größere katalytische Aktivität hat als das mögliche Peptid oder Proteinmolekül.