JP2002510502A

JP2002510502A - 発現可能な遺伝子配列のライブラリーの産生方法

Info

Publication number: JP2002510502A
Application number: JP2000542477A
Authority: JP
Inventors: フェルナンデス、ジョセフ、マヌエル; ヘイマン、ジョン、アラステアー; ホーフラー、ジェームズ、ポール; − ハル、ヒーザー、リンマークス; シンディシ、ミシェル、リン
Original assignee: インビトロジェンコーポレイション
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2002-04-09
Also published as: AU754276B2; WO1999051766A1; EP1066404A1; EP1066404A4; CA2324514A1; AU3548299A

Abstract

(57)【要約】本発明は、発現可能な遺伝子配列のライブラリーの産生方法を含む。本発明の方法は、複数の遺伝子配列の同時操作を可能にし、従ってライブラリーを効率的に高処理能力で作成することを可能にする。証明された遺伝子配列を含有する発現ベクターは、組換えタンパク質の産生のために細胞をトランスフェトするのに使用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生される発現可能な遺伝子配列のライブラリーと、該ライブラリーの作製で使用される発現ベクターとをさらに含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ゲノム学（genomics）と分子生物学の分野に関する。さらに詳しく
は本発明は、発現された遺伝子配列のライブラリーを作成するための新しい高処
理能力法と、該方法を使用して作成されるライブラリーに関する。るキットに関する。

【０００２】（発明の背景）核酸配列決定技術の最近の革新により、種々の生物（ヒトを含む）の全ゲノム
の配列決定が可能になった。完全なゲノム配列の利点は多くあると考えられ、医
学での応用から進化過程のより深い理解にわたる。しかしこれらの利点は、これ
らの新たに配列決定された遺伝子がどこで以下に機能するかの理解無しには、完
全に実現することはできない。

【０００３】伝統的に、機能的理解は、活性の理解、その活性に関連するタンパク質の単離
、次にそのタンパク質をコードする遺伝子の同定と単離から始まった。目的の各
遺伝子が、同定され、単離され、別々に発現されたが、それぞれ時間がかかる工
程である。

【０００４】最近、高処理能力ＤＮＡ配列決定技術の革新により、大量の遺伝子配列情報が
公に入手できるようになった。しかし研究のためにこれらの配列を発現させてこ
れらにコードされるタンパク質を産生する方法では、いまだに各配列を１回に１
つずつ操作しなければならない。従って大量の遺伝子配列を迅速に同時に発現す
るための方法の開発に対するニーズが存在する。本発明は、この点と、明細書の
請求の範囲から明らかになる関連するニーズに関する。

【０００５】（発明の簡単な説明）本発明は、発現可能な遺伝子配列のライブラリーの産生方法を含む。本発明の
方法は、複数の遺伝子配列の同時操作を可能にし、従ってライブラリーを効率的
に高処理能力で作成することを可能にする。証明された遺伝子配列を含有する発
現ベクターは、組換えタンパク質の産生のために細胞をトランスフェトするのに
使用される。本発明は、発現可能な遺伝子配列のライブラリーの産生のための効
率的高処理能力手段を作成するように、公知の技術を利用する。

【０００６】本発明はさらに、本発明の方法を使用して産生される発現可能な遺伝子配列の
ライブラリーと、このようなライブラリーライブラリーの作製に使用される発現
ベクターを含む。

【０００７】（発明の詳細な説明）本発明は、発現可能な遺伝子配列のライブラリーの産生方法を含む。本発明は
、以下の工程を含む：複数の遺伝子配列を増幅する工程、増幅された遺伝子配列
を精製する工程、各精製遺伝子配列を発現ベクターに挿入する工程、および挿入
された遺伝子配列のサイズと配向を証明する工程。

【０００８】第１の工程において、発現される遺伝子配列が増幅される。「増幅」とは、遺
伝子配列のコピー数が増加することを意味する。通常使用される１つの方法は、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。簡単に説明すると、スターターＤＮＡ
を熱変性して１本鎖にする。２つの合成オリゴヌクレオチド（１つは、目的のＤ
ＮＡセグメントのセンス鎖の３’末端の配列に相補的であり、他の１つは目的の
ＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖の３’末端の配列に相補的である）を、増幅
すべきＤＮＡ配列に過剰に加え、温度を５０〜６０℃に低下させる。特異的オリ
ゴヌクレオチドは、ＤＮＡ中の相補配列とハイブリダイズし、次にＤＮＡ鎖合成
のプライマーとして機能する（これは、デオキシヌクレオチドとＴａｑポリメラ
ーゼ（７２℃までの温度でプライマーを伸長させることができる）のような温度
耐性ＤＮＡポリメラーゼを供給を必要とする）。合成が完了したら、混合物全体
をさらに加熱（９５℃まで）して、新たに形成したＤＮＡ２本鎖を融解する。再
度温度を下げると、過剰のプライマーがまだ存在するため、さらに１ラウンドの
合成が起きる。合成と融解のサイクルの繰り返しは、目的の配列を増幅する。Ｐ
ＣＲのさらに詳細な説明は、アールリッヒ（Ehrlich）編、ＰＣＲ技術：原理とＤＮＡ増幅への応用（PCR Technology: Principles and Applications for DNA
Amplification）、ダブリュー・エィチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H
. Freeman and Co.）、１９９２、とアールリッヒ（Ehrlich）編、ポリメラーゼ
連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８９（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【０００９】スターターＤＮＡは、種々の供給源から得られる。これは、生物由来の総ゲノ
ムＤＮＡでもよく、例えば逆転写酵素を使用して細胞性ｍＲＮＡから合成された
ｃＤＮＡでもよい。適当なＲＮＡの供給源には、正常組織および疾患組織、細胞
抽出物などがある。

【００１０】本発明の実施において、所望の遺伝子配列は任意の供給源から得られる。下記
の例は、単一の生物、例えばサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces ce
revisiae）からのすべての読みとり枠（ＯＲＦ）の増幅を示す。「読みとり枠」
とは、開始コドンと終止コドンの間に存在し、遺伝子である可能性が高いＤＮＡ
のセグメントを意味する。下記の例はさらに、癌の進展に重要であると考えられ
るヒト遺伝子の群の増幅を示す。

【００１１】特定の生物、例えば酵母（サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces ce
revisiae））、原核生物（枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（E. coli）、
ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ヘリコバクター・ピロ
リ（Helicobacter pylori）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma geni
talium）など）、魚（フグ・ルブリペス（Fugu rubripes））、哺乳動物（ヒト、マウス）、植物（コメ、綿）などについて、ゲノム全体またはその一部を含む
公のデータベースが存在する。周知のデータベースには、例えばジーンバンク（
GenBank）、ユニジーン（Unigene）、イーエムビーエル（ＥＭＢＬ）、イメージ
（ＩＭＡＧＥ）およびティーアイジーアール（ＴＩＧＲ）がある。これらのよう
な公のデータベースは、本発明の方法で使用する遺伝子配列の供給源として使用
することができる。

【００１２】増幅工程で使用されるプライマーは、各所望の遺伝子配列に特異的であり、種
々のユニークな特徴を含む。例えば５’「センス」プライマーは、配列５’−Ｃ
ＡＣＣＡＴＧ．．．（下線は開始コドン）で始まる。ＣＡＣＣ配列は、翻訳効率
を助けるコザック（Kozak）コンセンサスとして加えられる。増幅される遺伝子配列が完全長遺伝子である時は、３’「アンチセンス」コドンは好ましくは、増
幅される遺伝子の最後のコドンの３番目の位置プラスアデニン残基で、増幅生成
物が終止するように、設計される。これは、フレーム内のコード領域と異種ペプ
チド配列（例えば、エピトープタグ、アフィニティ精製タグなど）との融合を促
進する（下記参照）。しかし、本発明の方法は、任意の遺伝子配列（発現配列タ
グ（ＥＳＴ）を含む）に対して平等に適しているため、この遺伝子配列は、完全
長配列をコードする必要はない。プライマーは、同定とさらなるプロセシングを
促進するマルチウェルフォーマット（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレ
ート）で合成、乾燥することができる。

【００１３】次に増幅された遺伝子産物は、増幅反応混合物の他の成分から単離される。こ
の精製は、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの種々の方法を使用し
て行うことができる。好適な精製法では、低融点アガロースゲル電気泳動を使用
する。反応混合物は分離され、適当な手段（例えば、臭化エチジウム染色）によ
り視覚化される。正しいサイズの増幅産物であるＤＮＡバンドは、残りのゲルか
ら切り取られ、９６ウェルマイクロタイタープレートの適当な対応するウェルに
入れられる。次にこれらの充填物を融解し、その中のＤＮＡはクローニング挿入
体として使用される。ゲル電気泳動の使用は、作業者は所望の増幅遺伝子配列を
精製することができ、さらに、配列が正しいサイズ（すなわち、完全な所望の遺
伝子配列）であることを証明することができるという利点を有する。

【００１４】精製され増幅された遺伝子配列は次に、発現ベクター中に挿入される。本発明
の方法での使用には（原核生物発現および真核生物発現の両方について）種々の
発現ベクターが適している。一般に発現ベクターは、１つまたはそれ以上の以下
の特徴を有する：プロモーター−エンハンサー配列、選択マーカー配列、複製開
始点、アフィニティ精製タグ配列、誘導性成分配列、エピトープ−タグ配列など
。

【００１５】プロモーター−エンハンサー配列は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始
するＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写される鎖を特定して、転写体の極
性を決定する。細菌性プロモーターは、特定のシグマ因子とＲＮＡポリメラーゼ
により拘束される、転写開始位置に対して−３５〜−１０ヌクレオチドであるコ
ンセンサス配列からなる。真核生物プロモーターは、さらに複雑である。発現ベ
クターで使用される多くのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼIIにより転写さ
れる。一般的な転写因子（ＧＴＦ）はまず、開始位置の近くの特定配列に結合し
、次にＲＮＡポリメラーゼIIの結合を求める。これらの最小のプロモーター成分
以外に、小配列成分は、あるプロモーターの活性を制御するモジュラーＤＮＡ結
合性／トランス活性化タンパク質（例えば、ＡＰ−１、ＳＰ−１）により特異的
に認識される。ウイルスプロモーターは、細菌または真核生物のプロトコールと
同じ機能を果たし、特異的ＲＮＡポリメラーゼをトランスで提供（バクテリオフ
ァージＴ７）するか、または細胞因子やＲＮＡポリメラーゼを集める（ＳＶ４０
、ＲＸＶ、ＣＭＶ）。ウイルスプロモーターは、特に強いプロモーターであるた
め、好適である。

【００１６】さらにプロモーターは、構成性でもよいが、好ましくは制御性（すなわち、誘
導性または抑制性）である。誘導性成分は、プロモーターとともに作用し、レプ
レッサー（例えば、大腸菌（E. coli）のｌａｃＯ／ＬＡＣＩｑレプレッサー系）またはインデューサー（例えば、酵母のｇａｌ１／ＧＡＬ４インデューサー系
）に結合するＤＮＡ配列成分である。いずれの場合も、転写はプロモーターが脱
抑制または誘導される時（この時、転写は「開始」される）まで事実的に「閉鎖
」される。

【００１７】構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのプロモーター、ｐＢＲ
３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、ｐＰＲ３２５のク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモータ
ーなどがある。誘導性原核生物プロモーターの例には、バクテリオファージの主
要右および左プロモーター（Ｐ_LとＰ_R）、大腸菌（E. coli）のｔｒｐ、ｒｅｃａ、ｌａｃＺ、ＬａｃＩ、ＡｒａＣおよびｇａｌプロモーター、枯草菌（B. sub
tilis）のα−アミラーゼ（ウルマネン（Ulmanen）ら、J. Bacteriol. 162: 176
-182, 1985）およびシグマ−２８−特異的プロモーター（ギルマン（Gilman）ら
、Gene sequence 32:11-20 (1984)）、バチルス（Bacillus）のバクテリオファージのプロモーター（グリクザン（Gryczan）、バチルスの分子生物学（The Mol
ecular Biology of the Bacilli）、アカデミックプレス・インク（Academic Pr
ess Inc.）、ニューヨーク（1982））、ストレプトミセス（Streptomyces）プロ
モーター（ワード（Ward）ら、Mol. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986）などがある。原核生物プロモーターの例は、グリック（Glick）（J. Ind. Microbiol.
1: 277-282, 1987）、セナチエンポ（Cenatiempo）（Biochimie 68: 505-516, 1
986）、およびゴッテスマン（Gottesman）（Ann. Rev. Genet. 18: 415-442, 19
84）の総説がある。

【００１８】好適な真核生物プロモーターには例えば、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配
列のプロモーター（ハマー（Hamer）ら、J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982
）、ヘルペス（Herpes）ウイルスのＴＫプロモーター（マックナイト（McKnight
）、Cell 31: 355-365, 1982）、ＳＶ４０初期プロモーター（ベノイスト（Beno
ist）ら、Nature (London) 290: 304-310, 1981）、酵母ｇａｌ１遺伝子配列プロモーター（ジョンストン（Johnston）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6
971-6975, 1982）、シルバー（Silver）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 59
51-5955, 1984）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクダイソン（Ecdysone）応答性プロモーターなどがある。

【００１９】選択マーカー配列は、ベクターを含有する細胞のみの増殖を選択する手段を提
供するため、発現ベクターの有用な成分である。このようなマーカーには２つの
型がある：薬剤耐性と栄養要求性。薬剤マーカーは、本来は細胞を死滅させる外
から添加した薬剤を、細胞が無毒化することを可能にする。栄養要求性マーカー
は、必須成分が欠如した培地中で増殖すると、必須成分（通常、アミノ酸）を、
細胞に合成させる。

【００２０】通常選択マーカー遺伝子配列には、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン
、カナマイシン、ストレプトマイシン、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、ネオ
マイシン、ゼオシン（Zeocin）（登録商標）などの抗生物質に対する耐性の選択
マーカーがある。選択可能な栄養要求性遺伝子配列には、例えばｈｉｓＤ（これ
は、ヒスイジノールの存在下でヒスチジンを含まない培地中での増殖を可能にす
る）がある。

【００２１】酵母発現系での使用のための好適な選択マーカーには、ＵＲＡ３がある。オロ
チジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ（ウラシル生合成に必須の酵素
）をコードする遺伝子に突然変異を有する実験室酵母株は、外因性ウラシルの非
存在下では増殖できない。野生型遺伝子のコピー（エス・ポンベ（S. pombe）の
ｕｒａ４＋とエス・セレビッシェ（S. cerevisiae）のＵＲＡ３）は、この欠陥をトランスで補足する。

【００２２】発現ベクターで有用なさらなる成分は、複製開始点配列である。複製開始点は
、マルチマー性開始点結合性タンパク質により認識され、開始部位でのＤＮＡ複
製酵素の集合に中心的な役割を果たす複数の短い繰り返し配列を含有するユニー
クなＤＮＡ配列である。本発明において発現ベクターで使用するのに適当な複製
開始点は、E. coli oriC、２μおよびＡＲＳ（いずれも酵母系中）、ｓｆ１、Ｓ
Ｖ４０（哺乳動物系で有用）などがある。

【００２３】本発明の方法で使用される発現ベクターに含有される追加の成分は、アフィニ
ティ精製タグまたはエピトープタグをコードする配列である。アフィニティ精製
タグは一般に、固相支持体上に固定化される結合パートナーと相互作用すること
ができるペプチド配列である。複数の連続の単一のアミノ酸（例えば、ヒスチジ
ン）をコードする合成ＤＮＡ配列は、発現されるタンパク質に融合している時、
樹脂カラム（例えば、ニッケルセファロース）への高アフィニティ結合により組
換えタンパク質の１工程精製に使用される。エンドペプチダーゼ認識配列はしば
しば、特異的プロテアーゼを用いた消化によりリーダーペプチドの以後の除去を
可能にするために、ポリアミノ酸タグと目的のタンパク質との間で作成される。
キチン結合性ドメイン（キチンに結合する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（グルタチオンに結合する）、ビオチン（アビジンまたはストレプトアビ
ジンに結合する）などのペプチドをコードする配列はまた、目的のタンパク質の
精製を促進するために使用することができる。アフィニティ精製タグは、インテ
イン（タンパク質自己スプライシング成分、チョング（Chong）ら、Gene 192: 2
71-281, 1997）の使用を含む、当該分野で公知の方法により、目的のタンパク質
から分離される。

【００２４】エピトープタグは、エピトープ特異的抗体により認識される短いペプチド配列
である。組換えタンパク質とエピトープタグを含む融合タンパク質は、クロマト
グラフィー樹脂に結合した抗体を使用して、簡便かつ容易に精製することができ
る。さらにエピトープタグの存在は、以後の測定法（例えば、ウェスタンブロッ
ト）で組換えタンパク質が、組換えタンパク質自身に特異的な抗体を産生する必
要なく、検出されることを可能にする。通常使用されるエピトープタグの例には
、Ｖ５、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、血球凝集素（ＨＡ
）、ペプチドＰｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、キチン結合性ドメイン
などがある。

【００２５】発現ベクターでさらに有用な成分には、複クローニング部位またはポリリンカ
ーがある。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする合成ＤＮＡは、
プロモーター成分の下流でプラスミドベクター中に挿入される。これらの部位は
、特定の部位でのベクターへのＤＮＡの便利なクローニングのために作成される
。

【００２６】前記成分を組合せて、本発明の実施に有用な発現ベクターが産生される。適当
な原核生物ベクターには、大腸菌（E. coli）中で複製可能なもの（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＰＡＣＹＣ１８４、ｉｔＶＸ、ｐＲＳ
ＥＴ、ｐＢＡＤ（インビトロゲン（Invitrogen）、カールスバッド（Carlsbad）
、カリホルニア州）など）がある。このようなプラスミドは、サムブルーク（Sa
mbrook）（モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）、第２版、サムブルーク（Sambrook）、フリシュ（Frit
sch）およびマニアティス（Maniatis）編、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８９）により開示されている。バチルス（Bacillus）プラスミドには、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７
などがあり、グリクザン（Gryczan）（バチルスの分子生物学（The Molecular B
iology of the Bacilli）、アカデミックプレス・インク（Academic Press Inc.
）、ニューヨーク（1982）、３０７−３２９頁）により開示されている。適当な
ストレプトミセス（Streptomyces）プラスミドには、ｐＩＪ１０１（ケンダル（
Kendall）ら、J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987）、およびストレプトミセス（streptomyces）バクテリオファージ、例えばψＣ３１（チャター（Chater）
ら、アクチノミセターレス（Actinomycetales）生物学に関する第６回国際シンポジウム、アカデミアイカイド（Akademiak Kaido）、ブダペスト、ハンガリー（1986）、４５−５４頁）がある。シュードモナス（Pseudomonas）プラスミドは、ジョン（John）ら（Rev. Infect. Dis. 8: 693-704, 1986）およびイザキ（
Izaki）（Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742, 1978）の総説がある。

【００２７】適当な真核生物プラスミドには、例えばＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−
ミクロンサークル、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ、ｐＹＥＳ２／
ＧＳ、ｐＭＴ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（Ｓｐ１）、ｐＶｇＲＸＲ（インビトロゲン
（Invitrogen））など、またはこれらの誘導体がある。このようなプラスミドは
当該分野で公知である（ボトステイン（Botstein）ら、Miami Wntr. Symp. 19:
265-274, 1982）；ブローチ（Broach）、「酵母サッカロミセス（Saccharomyces
）の分子生物学：生活環と遺伝（The Molecular Biology of the Yeast Sacchar
omyces: Life Cycle and Inheritance）」、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、４４５−４７０頁、１９８１；ブロー
チ（Broach）、Cell 28: 203-204, 1982；ディロン（Dilon）ら、J. Clin. Hema
tol. Oncol. 10: 39-48, 1980；マニアティス（Maniatis）、細胞生物学：総合論文（Cell Biology: A Comprehensive Treatise）、第３巻、遺伝子配列発現、
アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨーク、５６３−６０８頁、１
９８０）。

【００２８】インビトロでのキメラＤＮＡ分子の作製は従来から、別々のタンパク質成分に
より触媒される２つの酵素工程に依存している。ＤＮＡリガーゼの作用によりそ
の末端で共有結合される明確な末端を有する線状ＤＮＡを作成するのに、ＰＣＲ
増幅または部位特異的制限エンドヌクレアーゼが使用される。しかしＤＮＡリガ
ーゼは、作用が遅く温度感受性であるという欠点を有する。

【００２９】すなわち、精製され増幅された遺伝子配列を発現ベクターに挿入する時は、部
位特異的にＤＮＡを切断かつ再結合することができる酵素の使用が好ましい。任
意のタイプの任意の部位特異的酵素が適しており、例えばＩ型トポイソメラーゼ
または部位特異的リコンビナーゼがある。適当な部位特異的リコンビナーゼの例
には、ラムダインテグラーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｐ１−Ｃｒｅタンパク質
、Ｋｗリコンビナーゼなどがある（パン（Pan）ら、J. Biol. Chem. 268: 3683-
3689, 1993；ヌンズ−ダビイ（Nunes-Duby）ら、EMBO J. 13: 4421-4430, 1994 ；ハレット（Hallet）とシェラット（Sherratt）、FEMS Microbio. Revs 21: 15
7-178, 1997；リングローズ（Ringrose）ら、Eur J. Biochem 248: 903-912, 19
97）。

【００３０】本発明の方法での使用に特に適した酵素は、Ｉ型トポイソメラーゼ、特にワク
シニアＤＮＡトポイソメラーゼである。ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼは２
本鎖ＤＮＡに結合し、１つの鎖のホスホジエステル骨格を切断する。この酵素は
、制限エンドヌクレアーゼに似た高レベルの配列特異性を示す。切断は、切れや
すい鎖のコンセンサスペンタピリミジン成分５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴで起きる
。切断反応では、切り込みを入れた鎖の３’ホスフェートとタンパク質のチロシ
ン残基との間で共有結合付加物の形成を介して、結合エネルギーが保存される。
ワクシニアトポイソメラーゼは、元々の切断されたものと同じ結合を介して共有
結合鎖を再結合する（ＤＮＡ緩和の時に起きるように）か、異種アクセプターＤ
ＮＡに再結合し、こうして組換え分子を作成する。

【００３１】切れやすい結合がＤＮＡ２本鎖の３’末端の近く（１０塩基対以内）に位置す
るように基質が形成されると、切断は、切断される鎖の下流部分の自発的解離を
伴う。５’１本鎖テイルを含有する生じるトポイソメラーゼ−ＤＮＡ複合体は、
アクセプター分子が、活性化ドナー複合体のものと相補的な５’ＯＨテイルを有
するなら、アクセプターＤＮＡに再結合することができる。

【００３２】本発明において、この反応は、プラスミドベクターにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断
片を結合するために最適化されている（図１を参照）。ＰＣＲ断片は一般的に、
増幅反応に使用されるプライマーからの５’ヒドロキシル残基を有するため、Ｐ
ＣＲ断片は、トポイソメラーゼＩ再結合工程の天然の良好な代替基質である。５
’ヒドロキシル残基は、再結合反応の基質である。クローニングのためのワクシ
ニアトポイソメラーゼＩ型使用は、同時係属米国特許出願第０８／３５８，３４
４号（１９９４年１２月１９日出願）（参照によりこの全体が本明細書に組み込
まれる）に詳細に記載されている。

【００３３】発現ベクター中に挿入される遺伝子配列は、センスまたはアンチセンス方向の
どちらでも挿入することができる。従って本発明は、遺伝子配列が所望のタンパ
ク質を発現することを確実にするための、挿入体のサイズと配向の両方の証明を
提供する。好ましくは挿入体を有するベクターは、標準的細菌形質転換反応で使
用され、形質転換の内容物は選択増殖培地上に蒔かれる。細菌形質転換と増殖選
択法は、当該分野で公知であり、例えばアウスベル（Ausubel）ら、Short Proto
cols in Molecular Biology, 3rd ed. 1995に詳細に記載されている。

【００３４】個々の細菌コロニーを取り上げ、選択増殖培地を含有するマルチウェルマイク
ロタイタープレートの個々のウェル中で増殖させる。これらの細胞のアリコート
を、直接診断的ＰＣＲ反応で使用する。この反応のプライマーは、正しく配向さ
れた挿入体を有するプラスミドのみが増幅産物を与えるように設計される。増幅
されたＤＮＡは分離され、標準的プロトコールを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
電気泳動により視覚化される（アウスベル（Ausubel）ら、Short Protocols in
Molecular Biology, 3rd ed. 1995を参照）。

【００３５】細菌からまずＤＮＡを調製するのではなく、培養した細胞溶解物から直接ＰＣ
Ｒ反応を行うことは、必要なデータを作成するために必要な時間とコストを短縮
するため、これは本発明の方法の特殊な利点である。

【００３６】遺伝子配列を正しい配向で含有するプラスミドがいったん同定されると、発現
のために宿主細胞の形質転換で使用されるプラスミドＤＮＡが調製される。プラ
スミドＤＮＡの調製と細胞の形質転換法は、当業者に公知である。このような方
法は、例えばアウスベル（Ausubel）ら（前出）に記載されている。

【００３７】原核生物宿主は一般的に、組換えタンパク質の産生に非常に効率的で便利であ
り、従って１つの好適な発現系である。原核生物は最も頻繁には、大腸菌（E. c
oli）の種々の株で示される。しかし他の生物（他の細菌株を含む）も使用できる。

【００３８】認められた原核生物宿主には、大腸菌（E. coli）のような細菌、およびバチルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseu
domonas）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）属などの細菌がある。しかしこのような条件下では、ポリペプチドはグリコシル化されないであ
ろう。本明細書での使用に選択される原核生物宿主は、レプリコンおよび発現プ
ラスミド中の制御配列と適合性がなければならない。

【００３９】適当な宿主には、しばしば真核生物細胞が含まれる。好適な真核生物宿主には
、例えば、インビボまたは組織培養の酵母、真菌、昆虫細胞、および哺乳動物細
胞がある。宿主として有用な哺乳動物細胞には、HeLa細胞、ＶＥＲＯのような繊
維芽細胞起源の細胞、３Ｔ３またはＣＨＯＫ１、ＨＥＫ２９３細胞、またはリン
パ起源の細胞（例えば、３２Ｄ細胞）およびこれらの誘導体がある。好適な哺乳
動物宿主細胞には、ＣＨＯ、３２Ｄなどの非接着性の細胞がある。好適な酵母宿
主細胞には、エス・ポンベ（S. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastori
s）、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）（例えばＩＮＶＳｃ１）などがある
。

【００４０】さらに、植物細胞も宿主として利用でき、植物細胞と適合性の制御配列も利用
できる（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ、ノパリン
シンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列など）。別の好適な
宿主は、昆虫細胞（例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila）幼虫）であ
る。昆虫細胞を宿主として使用して、キイロショウジョウバエ（Drosophila）ア
ルコールデヒドロゲナーゼまたはＭＴプロモーターを使用することができる。ル
ービン（Rubin）、Science 240: 1453-1459, 1988）。あるいは、昆虫細胞中で所望の遺伝子配列によりコードされるペプチドを大量に発現するように、バキュ
ロウイルスベクターを操作することができる（ジャスニイ（Jasny）、Science 2
38: 1653, 1987）；ミラー（Miller）ら、Genetic Engineering (1986), セトロ
ー・ジェイ・ケー（Setlow, J.K.）ら編、Plenum, 第８巻、２７７−２９７頁）
。

【００４１】本発明のさらなる実施態様において、本発明の方法により産生される発現可能
な遺伝子配列のライブラリーが提供される。以下の例により詳細に記載するよう
に、このようなライブラリーは、種々の起源（例えば、酵母、哺乳動物（ヒトを
含む）など）からの遺伝子配列を含む。本発明はまた、上記方法により産生され
る発現可能な遺伝子産物の精製されたか、単離されたか、または濃縮されたもの
を特徴とする。

【００４２】本発明のライブラリーを使用するための成分を含有する１つまたはそれ以上の
容器またはバイアルを含むキットはまた、本発明の範囲に包含される。キットは
、以下の成分の１つまたはそれ以上を含んでよい：１つまたはそれ以上の発現可
能な遺伝子配列、該遺伝子配列でトランスフェクトされるかトランスフェクトさ
れることができる細胞、および発現された遺伝子産物を認識する抗体またはこれ
に関連するエピトープ。このようなキットに含めることに適した細胞には、細菌
細胞、酵母細胞（例えば、ＩＮＶＳｃ１）、昆虫細胞または哺乳動物細胞（例え
ば、ＣＨＯ）がある。

【００４３】ある実施態様において、このようなキットは、界面活性剤溶液、好ましくはト
ラックス（Trax）（登録商標）溶解試薬（１×ＰＢＳ中の６％ＮＰ−４０と９
％トリトンＸ−１００）を含むことができる。またキット中には、１つまたはそ
れ以上の結合パートナー（例えば、抗体、好ましくは同じ発現された遺伝子産物
に対する抗体（これは好ましくは、発現された遺伝子産物上の同じ結合部位には
競合しない））を含んでよい。

【００４４】別の実施態様において、キットは、２対以上のそのような抗体または他の結合
パートナー（各対は、異なる標的分子に対する）を含有してもよく、こうして試
料中のそのような複数の標的分子の検出または測定を可能にする。具体的な実施
態様において、キットの１つの結合パートナーは、固相マトリックスにあらかじ
め吸着されるか、あるいは結合パートナーとマトリックスは別々に供給されて、
測定操作の一部として結合が行われる。キットは好ましくは、当該分野で公知の
他の必要な洗浄試薬を含有する。ＥＩＡについては、キットは発色性基質と、発
色が起きた時に酵素反応を停止するための試薬を含有する。キットに含まれる基
質は、抗体調製物の１つに結合した酵素に適切なものである。これらは当該分野
で公知であり、いくつかは以下に例示される。キットは、随時標的分子標準物質
（すなわち、ある量の、検出されるかまたは測定される標的分子である精製され
た標的分子）を含む。

【００４５】具体的な実施態様では、本発明のキットは、１つまたはそれ以上の容器に以下
を含む：（１）固相担体、例えば第１の結合パートナーで被覆されたマイクロタ
イタープレート；（２）第１の結合パートナーと同じ発現された遺伝子産物に結
合する、検出可能に標識された第２の結合パートナー；（３）第１および第２の
結合パートナーに認識される発現された遺伝子産物の標準試料；（４）濃縮され
た界面活性剤溶液；および（５）随時、希釈剤。

【００４６】本発明を、以下の非限定例を参照して詳細に説明する。

【００４７】例１−酵母ＯＲＦの高処理能力発現以下の例は、発現可能な酵母遺伝子配列の作成を例示する。

【００４８】増幅− ６，０３２の酵母ＯＲＦと各３’末端の対応する遺伝子特異的プライマーを、
９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットで０．３ng/μlの濃度でリサ
ーチジェネティクス（Research Genetics）（ハンツビル（Huntsville）、アラバマ州）から得た。各遺伝子特異的プライマーは、遺伝子の終止コドンを排除す
るように設計した。鋳型はそれぞれ、開始ＡＴＧの５’のすぐ近くに共通の配列
（５’−ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＣＣ）（配列番
号１）を含むため、共通の５’プライマーで各鋳型を増幅することが可能であっ
た。

【００４９】５μlのＯＲＦ鋳型を、１２チャネルピペッターを使用して、新鮮な９６ウェルマイクロタイタープレート（ポリカーボネート、サーモウェルシンウォール（
Thermowell Thinwall）、モデルＭ．カタログ番号６５１１）に加えた。６μlの
特異的３’プライマー溶液（２μM）を加え、ウェルあたりの総容量をＰＣＲカクテルで３０μlにし、その直後、プレートを氷の上に置いた。（１２０反応用のＰＣＲカクテル−７２０μlの５×緩衝液Ｊ、４８μlのｄＮＴＰ（５０mMスト
ック）、１２μlの共通の５’プライマー（１μg/μlストック）、４８μlのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）またはプロメガ（Promega）、５単位/μl）、１．９２μlのＰｆｕＤＮＡポリメ
ラーゼ（ストラタジーン（Stratagene）、カタログ番号６００１５３−８１、２
．５単位/μl）および１４６４μlの蒸留水。５×緩衝液Ｊ：３００mMトリス（ｐＨ９．５）、７５mM硫酸アンモニウム、１０mM ＭｇＣｌ₂）。ゴムハイベイドミクロマット（Hybaid Micromat）を、０．１ＭＨＣｌに浸して洗浄し、蒸留水で２分リンスし、完全に乾燥してから、９６ウェルプレートに添加した。

【００５０】ハイベイド社（Hybaid, Ltd.）（ミドルセックス（Middlesex）、英国）サーマルサイクラーを製造業者の説明書に従って使用して、ＰＣＲ反応を行なった。
使用した条件は以下の通りである：前融解工程：９４℃×４分；融解工程：９４
℃×３０秒、アニール工程：５８℃×４５秒、伸長工程：７２℃×３分−２５サ
イクル繰り返す；最終伸長：７２℃×４分；最終ブロック温度を室温（約２２℃
）に設定。プレートを４℃で保存した。

【００５１】精製− プレートを１０００rpmで短時間遠心分離し、次に１０μlの６×ゲルローディ
ング色素を各ウェルに加えた（６×ゲルローディング色素：６mMトリス（ｐＨ８
）、６mM ＥＤＴＡ、０．０３％ブロモフェノールブルー、３０％グリセロール
）。各ウェルの全内容物を、１×ＴＡＥ（１リットル（水）当たり、５０×ＴＡ
Ｅ＝２４２ｇトリス塩基、５７．１mlの氷酢酸、１００mlの０．５ＭＥＤＴＡ
、ｐＨ８．０）中１％の低融点アガロース（インビトロゲン（Invitrogen）＃４
６−０１５０）ゲル（これに加えて、２０μlの１０mg/ml臭化エチジウム溶液を
、４００mlのアガロースに加えた）にのせ、１１０〜１２０ボルトで１．２５〜
１．５時間泳動した。紫外線箱を使用して、増幅産物を視覚化し、正しいサイズ
のＰＣＲ産物のみが挿入工程で使用されるようにした。

【００５２】発現ベクターへの挿入− 増幅した遺伝子配列を含有する各レーンの部分を、ゲルから切断し、９６ウェ
ルマイクロタイタープレートのウェルに移し、ヒートブロック（７５℃）で融解
し、融解物の一部をマルチチャネルピペットで、２つの発現ベクター（HIndIII であらかじめ消化したＴＯＰＯ適合させたｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳまたはｐＹＥ
Ｓ２／ＧＳ（インビトロゲン（Invitrogen）、カールスバッド（Carlsbad）、カ
リホルニア州））のうちの１つを含有する９６ウェルマイクロタイタープレート
（７μl／ウェル）に入れる。上の１０個の化学的にコンピタントな細胞（インビトロゲン（Invitrogen））を各ウェルに加え（４５μl／ウェル、Ｏ．Ｄ．＝４．７）、ここでプレートに再度カバーをして、氷上で５分インキュベートした
。次に細胞に４２℃で１分熱ショックを加え、氷に１分戻す。ＳＯＣ培地のアリ
コートを各ウェルに加え（１５０μl、２０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、０．５ｇＮａＣｌ、２５０mM ＫＣｌ、２０mlの１Ｍグルコース／リットル）、プ
レートを３７℃で９０〜１２０分でインキュベートした。

【００５３】各ウェルの内容物を、適当な選択マーカー（ｐＹＥＳ２／ＧＳのためのアンピ
シリン（５０μg/ml）、およびｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳのためのゼオシン（Zeoc
in）（登録商標）（２５μg/ml））を含有する、ＬＢ（１０ｇトリプトン、５ｇ
酵母エキス、１０ｇＮａＣｌ／リットル）／１．５％寒天ペトリプレートに入れ
た。ペトリプレートは、３７℃で一晩増殖させた。

【００５４】サイズと配向の証明− この工程では、汚染が重大になる可能性がある。空中の混入物質、非滅菌試薬
もしくは装置、またはウェルからウェルへの汚染を介するプロセスの汚染に対し
て、防御するように注意すべきである。

【００５５】各ペトリプレートから８つのコロニーを取り上げ、９６ウェルマイクロタイタ
ープレートの８つの個々のウェルに入れた。各ウェルは、１００μlの２×ＬＢと使用する発現ベクターに適した１００μg/mlアンピシリンまたは５０ng/mlゼオシン（Zeocin）（登録商標）を含有した。プレートを３７℃で一晩インキュベ
ートした。

【００５６】プレートを、１０００rpmで短時間遠心分離した。細胞をピペッターで上下に攪拌し、次に各ウェルから２μlを、２８μl／ウェルＰＣＲカクテル（８４０反
応分のＰＣＲカクテル−５０４０μlの５×緩衝液Ｊ、３３６μlのｄＮＴＰ（５
０mMストック）、８４μlの共通の５’プライマー（１μg/μlストック、ダルト
ンケミカルラボ・インク（Dalton Chemical Lab. Inc.）、オンタリオ、カナダ）、８４μlの３’Ｈ６ｓｔｏｐｐｒｅｖｕプライマー（１μg/μlストック、ダ
ルトンケミカルラボ・インク（Dalton Chemical Lab. Inc.）、オンタリオ、カナダ）、３３６μlのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boe
hringer-Mannheim）またはプロメガ（Promega）、５単位/μl）、および１７．６４mlの水）を含有するＰＣＲ反応プレートの対応するウェルに移した。Ｈ６ｓ
ｔｏｐｐｒｅｖｕプライマーは、配列５’ＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴ
ＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’）（配列番号２）を有する。

【００５７】ＰＣＲ反応を基本的に前記したように以下のサイクルで行なった：前融解工程
：９４℃×１０分；融解工程：９４℃×１分、アニール工程：６７℃×１分、伸
長工程：７２℃×３分−３５サイクル繰り返す；最終伸長：７２℃×４分；最終
ブロック温度を室温（約２２℃）に設定。プレートを１００rpmで短時間遠心分離し、６μlの６×ゲルローディング色素を各ウェルに加えた。正しく配向した挿入体を有するプラスミドのみが、この工程で増幅される。

【００５８】陽性クローンの位置を、データベースに入力し陽性クローンのスプレッドシー
トを作成した。スプレッドシートをキアゲン・バイオロゴット９６００（Qiagen
BioRobot 9600）（登録商標）にダウンロードし、ディープウェル培養ブロック
への陽性クローンのラックの入れ替えを指令した。基本的に、各クローンの単一
の陽性培養物を増殖させて、キアプレップターボ（Quia-Prep Turbo）プロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを調製した。

【００５９】Ｐｆｘ−６パーフェクトリピッド（PerFect Lipid）システム（インビトロゲン（Invitrogen）、カタログ番号Ｔ９３０−１６）を使用して、調製したプラス
ミドＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェトした。エス・シー・イージーコンプ・
トランスフォーメーション（S.C. EasyComp Transformation）キット（インビト
ロゲン（Invitrogen）、カタログ番号５０５０−０１）を使用して、酵母細胞（
ＩＮＶＳｃｌ）をトランスフェトした。発現は、抗Ｖ５抗体を使用してウェスタ
ンブロットによりエピトープタグを検出して証明した。シングルパス後に、正し
いタンパク質を発現する全部で５５８クローンを得た。

【００６０】例２−ヒトの遺伝子配列の高処理能力発現以下の例は、本発明の方法を使用する発現可能なヒトの遺伝子配列のライブラ
リーの作製を例示する。プライマーは、ジーンバンク（GenBank）から入手できるヒト遺伝子の配列に基づき作製した。

【００６１】医学進歩の国際研究所（International Institute for the Advancement of M
edicine）（IIAM）から、ヒト胎児の心臓組織を得た。ポリＡ＋ｍＲＮＡをフーストトラック（FastTrack）（登録商標）２．０キット（インビトロゲン（Invit
rogen）、カールスバッド（Carlsbad）、カリホルニア州））を使用して、製造業者の説明書に従って単離した。ｃＤＮＡサイクル（Cycle）（登録商標）キット（インビトロゲン（Invitrogen））を使用して、提供されたオリゴｄＴプライ
マーと推奨されたプロトコールを使用して、ｍＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡに変換し
た。単一のｃＤＮＡ合成反応物を、９６ウェルのＰＣＲ増幅プレートの１２の異
なるウェルに分け、基本的に前記したように特異的プライマーセットを使用して
ＰＣＲ増幅を行なったが、ただしＴａｑ対Ｐｆｕの比は、初期増幅では５０：１
であった（最終濃度、２ＵＴａｑ：０．０４Ｕ Pfu/ウェル）。

【００６２】プライマーステーション（Primerstation）９６０（インテリジェントオートメーションシステムズ・インク（Intelligent Automation Systems, Inc.））を
使用して、製造業者の説明書に従ってプライマーを合成し、ユニジーン（Unigen
e）からダウンロードした配列から設計し、直接シンセサイザーに送った。平均長さが２５塩基対である約１５ナノモルの各プライマーを、９６ウェルフォーマ
ットで合成した。合成後、プライマーを支持体から切断し、脱保護し、同じ９６
ウェルフォーマットで乾燥した（製造業者の説明書を参照）。

【００６３】増幅した遺伝子配列を精製し、基本的に前記したようにｐｃＤＮＡ３．１／Ｇ
Ｓ２発現ベクターに挿入した。正しい配向にあることが証明された配列を含有す
る発現ベクターを、Ｐｆｘ−６パーフェクトリピッド（PerFect Lipid）システム（インビトロゲン（Invitrogen）、カタログ番号Ｔ９３０−１６）を使用して
、９６ウェルのディープウェルブロック中のＣＨＯ細胞にトランスフェトした。
トランスフェクションの４８時間後、細胞溶解物を作成し、溶解物をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分離し、抗Ｖ５エピトープタグモノクローナル抗体／西洋ワサビペルオ
キシダーゼ結合体を使用して、標準的プロトコールに従ってウェスタンブロット
で分析した。表１は、この方法を使用してうまく発現されたヒトタンパク質のリ
ストである。シングルパス後に、１１８のうち正しいタンパク質を発現する全部
で６６のクローンが得られた。

【００６４】

【００６５】例３−発現プラスミドの作製以下の例は、上記例で使用した発現ベクターの作製を例示する。発現可能な遺
伝子配列のライブラリーを作成するのに使用される他のベクター中で、同様の修
飾をすることができる。

【００６６】ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓをインビトロゲン（Invitrogen）（
カタログ番号Ｖ８１０−２０）から得て、ゼオシン（Zeocin）（登録商標）耐性
の遺伝子配列を有し、複クローニング部位が欠如するように、若干修飾した。１
００μgのアリコートを２００μlの医用洗浄（ＭＩ）水に懸濁した。５μlのアリコートをゲル分析のためにとっておいた。残りを１．７mlエッペンドルフチュ
ーブに移した。ベクターを、プロメガ（Promega）緩衝液Ｅ（最終容量＝４００ μl）を使用してHIndIII（４００Ｕ）で消化した。反応は、３７℃で３時間行な
った。１×ＴＡＥ中の０．８％アガロースゲルでアリコートの消化が完全かどう
かチェックし、臭化エチジウムで視覚化した。

【００６７】消化したベクターを、標準的方法に従って２００μlフェノール／クロロホルム（ｐＨ７．５）で処理し、１／１０容量の３ＭＮａＯＡｃと２容量の１００
％ＥｔＯＨを使用して室温で水層からＤＮＡを沈殿させ、次に８０％ＥｔＯ
Ｈで洗浄した。ペレットを１００μlのＭＩ水に再懸濁した。

【００６８】２つのオリゴヌクレオチドを、再懸濁したＤＮＡ（Ｔｏｐｏ−Ｈ（４０μg）５’−（Ｐ）ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＡＧＴＧ（配列番号３）
、Ｔｏｐｏ−４（１２μg）５’−（Ｐ）ＡＧＧＧＣＧ（配列番号４））プラス１７μlの１０×プロメガ（Promega）Ｔ４リガーゼ緩衝液に加えた。チューブを
氷上に置き、容量をＭＩ水で１７０μlに増やした。２０Ｕのプロメガ（Promega
）Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、オリゴをベクターに連結し、１２℃で一晩インキュベートした。

【００６９】ベクターを１００μlのフェノール／クロロホルムで処理し、水層を前記したように沈殿させた。ペレットにしたＤＮＡを１５０μlの無菌水に再懸濁し、HIn
dIII（１７μlプロメガ（Promega）緩衝液Ｅ、２００Ｕ HIndIII−３７℃、１時間）で再消化した。再消化したＤＮＡをフェノール／クロロホルムで再抽出し
、１／１０容量の３ＭＮａＯＡｃと７／１０容量のイソプロパノールで沈殿さ
せ、次に８０％ＥｔＯＨで洗浄した。

【００７０】ペレットにしたＤＮＡを８２μlのＴＥ緩衝液（１０mMトリス、ｐＨ８．０、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。２μlのアリコートを使用して、前記のアガロースゲル電気泳動を使用して前記操作をチェックした。残りの８０
μlをファルコンチューブに移し、１６μgのＴｏｐｏ−オリゴヌクレオチド（５
’−（Ｐ）ＣＡＡＣＡＣＴＡＴＣＧＧＡＡＴＡ（配列番号５））と混合した。こ
の混合物に１９０μlのＮＥＢ制限緩衝液＃１（室温）を加えた。総反応混合物を、ＭＩ水で１．９mlに調整した。ワクシニアトポイソメラーゼＩ酵素を加え（
８０μl）、反応チューブを３７℃水浴に１５分入れた。

【００７１】１５分後、２００μlの室温Ｔｏｐｏ−１０Ｘ停止緩衝液を加えた（１００mM トリス７．４、１１０mM ＥＤＴＡ、ブロモフェノールブルー）。全容量をアガ
ロースゲル（１．２ｇアガロース／１３０mlの１×ＴＡＥ）にのせ、ブロモフェ
ノールブルー色素が約１／２インチ泳動するまで７０ボルトで泳動した（１×Ｔ
ＡＥを加えて、ローディングウェル中の容量を一定に維持した）。９０秒間電圧
を逆転させた。ローディングウェルの内容物を１５mlのファルコンチューブに移
し、氷の上に置いた。２mlの冷Ｔｏｐｏ−２Ｘ洗浄緩衝液（６０mMトリス７．４
、１mM ＥＤＴＡ、４mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２００μg/mlのウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ））を加え、次に容量を、冷Ｔｏｐｏ−１×酵素希釈緩衝
液（５０％グリセロール、５０mMトリス７．４、１mM ＥＤＴＡ、２mM ＤＴＴ
、０．１％トリトンＸ−１００、１００μg/ml ＢＳＡ）プラスＴｏｐｏ−グリ
セロール混合物（９０％グリセロール、１０％５０mM ＴＥｐＨ７．４、０
．１％トリトンＸ−１００）で４mlに調整し、必要になるまで保存した。

【００７２】同様の方法を使用して、Ｔｏｐｏ−適合ｐＹＥＳ２（インビトロゲン（Invitr
ogen）、カタログ番号Ｖ８２５−２０）を作成した。

【００７３】本発明の具体的な実施態様を参照して本発明を説明したが、本発明の原理と精
神（本発明の範囲は添付の請求の範囲により限定される）を逸脱することなく、
これらの実施態様に変更が可能であることを、当業者は理解できるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の実施で使用されるワクシニアトポイソメラーゼＩ型クローニ
ング法の略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホーフラー、ジェームズ、ポールアメリカ合衆国カリフォルニア、カールスバド、ジャスミンコート 957 (72)発明者マークス − ハル、ヒーザー、リンアメリカ合衆国カリフォルニア、オーシャンサイド、ハミルトンストリート 155 (72)発明者シンディシ、ミシェル、リンアメリカ合衆国カリフォルニア、サンディエゴ、シルバーゲートアベニュー 418

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】発現可能なコード領域のライブラリーの産生方法であって、（ａ）少なくとも１つのコード領域特異的プライマーを使用して、複数のコー
ド領域を増幅する工程、（ｂ）各コード領域を発現ベクターに挿入する工程、および（ｃ）挿入されたコード領域のサイズと配向を証明する工程、とを含んでなる上記方法。
【請求項２】証明されたコード領域を含有するベクターで細胞を形質転換
することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】発現ベクターに挿入する前に、増幅したコード領域を精製す
ることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】コード領域は完全長タンパク質をコードする、請求項１に記
載の方法。
【請求項５】増幅に使用される５’プライマーは、ヌクレオチドＣＡＣＣ
ＡＴＧで始まり、３’プライマーは、増幅されるコード領域の終止コドンの直前
にあるコドンの第３の位置に単一のアデニン残基を加えたもので増幅産物を停止
させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】精製はアガロースゲル電気泳動を使用して行われる、請求項
３に記載の方法。
【請求項７】アガロースは低融点アガロースである、請求項６に記載の方
法。
【請求項８】発現ベクターへの増幅コード領域の挿入は、ＤＮＡを切断し
かつ連結する酵素を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】精製は低融点アガロース電気泳動を使用して行われ、増幅し
たコード領域の発現ベクターへの挿入は、ＤＮＡを切断しかつ連結する酵素を使
用して行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】酵素は、Ｉ型トポイソメラーゼまたは部位特異的リコンビ
ナーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】酵素は、ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼ、ラムダイン
テグラーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼまたはＰ１−Ｃｒｅタンパク質である、請求
項１０に記載の方法。
【請求項１２】酵素は、ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼである、請求
項１１に記載の方法。
【請求項１３】発現ベクターは真核生物発現ベクターである、請求項１に
記載の方法。
【請求項１４】真核生物発現ベクターはｐＹＥＳ２／ＧＳまたはｐｃＤＮ
Ａ３．１／ＧＳである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】発現ベクターは原核生物発現ベクターである、請求項１に
記載の方法。
【請求項１６】原核生物発現ベクターはｐＢＡＤである、請求項１５に記
載の方法。
【請求項１７】発現ベクターは、プロモーター−エンハンサー配列、選択
マーカー配列、複製開始点、アフィニティ精製タグ配列、誘導性成分配列、およ
びエピトープ−タグ配列から選択される１つまたはそれ以上の成分を含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項１８】挿入体のサイズと配向は、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコ
ールを使用して証明される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】証明は、全細胞溶解物を使用した行われる、請求項１８に
記載の方法。
【請求項２０】増幅されるコード領域は、原核生物ＤＮＡまたは真核生物
ＤＮＡ中の読みとり枠配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】真核生物ＤＮＡは、酵母または哺乳動物細胞から得られる
、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】増幅されるコード領域は、タンパク質のファミリーのメン
バーをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】タンパク質はヒトタンパク質である、請求項２２に記載の
方法。
【請求項２４】タンパク質のファミリーは、キナーゼ、ホスファターゼ、
転写因子、癌遺伝子、または腫瘍サプレッサーである、請求項２３に記載の方法
。
【請求項２５】工程（ａ）と（ｂ）は、マルチウェルマイクロタイタープ
レート中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】正しいサイズで正しい配向のコード領域は、発現のための
細胞中への形質転換のために、ロボットを使用して選択される、請求項１に記載
の方法。
【請求項２７】形質転換された細胞がコード領域を発現することを証明す
る工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】形質転換された細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞
である、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】真核生物細胞は、ＣＨＯ細胞またはエス・セレビッシェ（
S. cerevisiae）細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】請求項１に記載の方法により産生されるコード領域の発現
ライブラリー。
【請求項３１】コード領域は酵母タンパク質をコードする、請求項３０に
記載のライブラリー。
【請求項３２】コード領域は哺乳動物タンパク質をコードする、請求項３
１に記載のライブラリー。
【請求項３３】哺乳動物タンパク質はヒトタンパク質である、請求項３２
に記載のライブラリー。
【請求項３４】ヒトタンパク質は、キナーゼ、ホスファターゼ、転写因子
、癌遺伝子、または腫瘍サプレッサーである、請求項３３に記載のライブラリー
。
【請求項３５】請求項１に記載の方法により得られる発現ライブラリー。
【請求項３６】発現ベクターｐＹＥＳ２／ＧＳ。
【請求項３７】発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＧＳ。
【請求項３８】発現可能なコード領域のライブラリーの産生方法であって
、（ａ）ＰＣＲを使用して複数のコード領域を増幅する工程（ここで、５’プラ
イマーは、配列ＣＡＣＣＡＴＧを含有し、３’プライマーは、終止コドンの直前
で増幅産物を停止させる）、（ｂ）低融点アガロース電気泳動を使用して増幅コード領域を精製する工程、（ｃ）ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼを使用して発現ベクター中に各精製
コード領域を挿入する工程（ここで、該発現ベクターは、プロモーター−エンハ
ンサー配列、選択マーカー配列、複製開始点、アフィニティ精製タグ配列、およ
びエピトープ−タグ配列を含有する）、（ｄ）発現ベクターを含有する挿入体で細菌細胞を形質転換する工程、（ｅ）形質転換された細胞を増殖させ、挿入されたコード領域のサイズと配向
を証明する工程、（ｆ）遺伝子産物の発現のために正しい配向で、挿入コード領域を含有する発
現ベクターを選択する工程、そして（ｇ）該発現ベクターで発現のための細胞を形質転換する工程、とを含んでなる上記方法。