KR20020007281A - 조류종에 있어서 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용한항체의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용하여 조류종에서 항원에 대한 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이오-샘플로부터 분리된 일련의 미리 선택된 DNA 서열의 프로테오믹스 프로필을 결정하는 방법, 바람직하게는 인간 cDNA 라이브러리의 프로테오믹스 프로필을 결정하는 방법에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 또한 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련한 생리학적으로 식별가능한 마커를 동정하는 방법에도 관한다.

Description

조류종에 있어서 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용한 항체의 생산방법{GENERATION OF ANTIBODIES USING POLYNUCLEOTIDE VACCINATION IN AVIAN SPECIES}
1. 닭에서의 폴리뉴클레오타이드 백신접종
유전학적 백신접종 (genetic vaccination)는 백신 면역 치료법 개발의 새로운 접근방식이다. 종래의 백신접종에 비교해서, 유전학적 면역화는 비교적 개발 시간이 짧고, 대규모 생산이 용이하며, 개발, 제조 및 유통 비용이 저렴하며, 백신 제조자, 관리자 및 수용자에게 보다 안전하다는 장점을 갖는다.
유전학적 백신접종은 DNA 백신접종과 mRNA 백신접종으로 나눌 수 있다. 최근의 연구결과 다음과 같이 중요한 플라스미드 DNA 면역화의 특성이 밝혀졌다 (Chattergoon 외, FASEB, 1997, 11: 753-763). 첫째, 전달방법에 기초한 여러가지 조직들 (특히 근육 및 피부)이 플라스미드 DNA에 의해 in vivo 트랜스펙션될 수 있을 뿐만 아니라, 생산적인 항원 공장역할을 한다. 둘째, 어떤 모델 시스템에서는 여러가지 다양한 전달 방법을 통해 보호적인 세포성 및 체액성 응답을 유도할 수 있다. 셋째, 항원을 자극하는데 단지 소량의 플라스미드 DNA만이 필요할 뿐이다. 몇가지 표적 항원에 대한 면역 응답을 유도하는데 있어서, 몇몇 면역화 부위를 통한, 그리고 몇몇 독특한 전달 기술에 의한 플라스미드 DNA 면역화의 성공은 DNA 백신의 개념을 공고하게 다져주었다. 이 기술은 그 이후 B형 인플루엔자, B형 간염 바이러스, 말라리아, 결핵, SIV 및 HIV 타잎 1 및 여러가지 암을 비롯한 여러가지 질병 모델에 적용되어 왔다 (상기 문헌).
폴리클로날 항체는 마우스, 토끼, 양, 염소 및 돼지와 같은 포유동물에서 전통적으로 제조되어 왔다. 이 항체들은 면역화 기간 후에 혈청으로부터 얻어진다. 이 기술은 동물로부터 혈액 샘플을 채취하는 것과 관련하여, 침입적이고, 시간이 많이 걸리며, 경비가 많이 들고, 삼가하게 되는 경향이 있다. 이와 대조적으로, 항체 소스로서 닭, 특히 난황을 사용하여 폴리클로날 항체를 생산하는 것은 비-침입적인 기술이다. 난황에 면역글로불린을 축적시키는 것을 혈청의 경우와 유사하다고 할 수 있다 (Altchul외, Nature Genetics, 1994, 6:119-129). 이에 더해, 가금류는 포유류에 비해 계통발생적으로 하등하고 (European Community Directive 86/609 Article 7), 따라서, 포유류 대신에 새를 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
잘 보존된 포유류의 단백질에 대해서 고도의 특이성을 갖는 항체를 만드는 것은 어려울 수 있다. 닭은 포유류와 진화적인 관점에서 동떨어져 있기 때문에, 닭이 종종 항체 생산자로서 이용될 수 있다 (Burke외, Science, 1987, 236: 806-812). 항체 생산자로서 닭이 갖는 또 다른 장점은 닭의 항체가 다른 종에 존재하는 항원에 대한 동족체 분석에 종종 이용된다는 것이다 (Bonaldo외, Genome Research, 1996, 6:791-806; Buckler외, Proc. Natl. Acad. Sci, 1991, 88:4005-4009).
대규모로 항체를 생산하는데 닭을 이용하면 분명 많은 장점이 있다. 닭의 사육비용은, 폴리클로날 항체 생산에 전통적으로 가장 널리 이용되어온 토끼의 사육비용과 비슷하거나 더 저렴하다. 따라서, 토끼를 닭으로 대체하면 필요한 동물의 수도 더 적을 뿐만 아니라, 경제적인 장점도 누릴 수 있다. 항체 소스로서 달걀을 사용할 경우, 포유류의 경우보다 생산성이 훨씬 높다. 닭은 근친교배 혈통으로 얻을 수 있기 때문에, 토끼 항체 생산의 경우 흔히 문제가 되는, 항체 응답에 있어서의 유전적 다양성을 최소화할 수 있다 (Bussey, Yeast, 1997, 13(16):1501-1503). 또 달걀을 수집 및 표시하는데는 아무런 기술적인 보조도 필요하지 않다.
Fynan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 1993, 90:11478-11482은 인플루엔자 헤마글루티닌 당단백질을 발현하는 정제된 DNA를 이용해서 마우스와 닭을 DNA 백신접종하는것에 대해 설명하였다. Fynan 등은 테스트된 마우스의 67-95%와 테스트된 닭의 25-63%가 치명적인 인플루엔자 챌린지로부터 보호되었음을 발견하였다. 챌린지 전에는 검색가능한 수준으로 항-인플루엔자 항체를 갖지 않았던 마우스와 닭 모두에서 보호가 일어났다. 챌린지 전, DNA 백신 접종 및 부스터 (booster) 접종에 의해 검색불가능하거나 매우 낮은 수준의 항-인플루엔자 항체가 마우스에서 발생되었다. DNA 백신접종 후 닭에서의 항체 응답에 대한 데이타에 대한 설명은 없었다.
Kodihalli 등, J. Virol., 1997, 71(5):3391-3396은 H5 HA 단백질을 코딩하는 DNA의 유전자 총 (gene gun) 전달법이 치명적인 H5 바이러스로 챌린지된 닭에 완벽한 면역 보호를 제공한다는 것을 보여주고 있다. 그러나, 면역화 후 최초 3주일 이내에는, 어떠한 백신 그룹에서도 검색가능한 항체는 발견되지 않았다. 이에 더해, 챌린지 전 DNA 백신 그룹의 부스터 면역화 후에는 세가지 H5 바이러스 항원 중 어느 것에 대한 항체도 발견되지 않았다.
2. 게놈 및 단백질 조사
발현된 서열 택 (EST: expressed sequence tags)에 기초한 데이타베이스에 따르면, 인간의 게놈은 염색체-기초한 DNA 코드의 30억 내지 40억개의 뉴클레오타이드에 분산된, 약 60,000 ~ 100,000개의 유전자로 이루어져 있고, 그 서열은 2005년경까지는 완전 해독될 것으로 예상된다 (James, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 231:1-6). 그러나, DNA 서열 정보는 단지 세포가 그의 유전자를 이용할 수 있는 가능한 모든 방식 중 단지 정적인 스냅만을 제공할 뿐이다. 따라서, 기초적인생물학적 프로세스에 대한 의미있는 통찰과 여러가지 분야로 이러한 통찰을 적용하기 위해서는, 이 방대한 양의 정적인 DNA 서열 정보를 유전자 산물 및 그의 상호작용에 관한 동적인 정보와 연관시킬 필요가 있다.
프로테옴 (proteome)이라는 단어는 "게놈의 총 단백질 보체 (total protein complement of a genome)"의 의미를 갖는 것으로 정의되며 1995년 7월 처음 소개되었다 (Wasinger 외, Electrophoresis, 1995, 16:1090-1094). 프로테오믹스 (proteomics)는 어떤 단백질이 어디에서, 얼마만한 양으로, 어떤 조건 하에서 만들어지는지에 대한 정보를 이용해서 유전자 서열 데이타를 보충하는데 그 목적이 있다 (Persidis, Nature Biotechnology, 1998, 16:393-394. 이것은 세포 내부에서 단백질 캐스케이드가 특정한 질병의 결과로 어떻게 변화하는지를 보여주며, 그에 따라 신규한 잠재적인 약물 표적을 동정하는 것이다. 이어서, 이것은 선도 약물이 프로테옴 캐스케이드에 어떻게 영향을 미치는가에 대한 정보를 제공함으로써, 그러한 표적에 대해 특정 선도 약물을 비준하는 것을 목적으로 한다 (Persidis, Nature Biotechnology, 1998, 16:100-101). 따라서, 프로테오믹스는, 여하한 시점에서의 세포 상태의 분자적 기초에 관한 기본적인 물음에 대한 응답에 더해, 임상적으로 관련있는 분자 현상의 자동화 분석을 통한 신규한 약물 발견을 가속화시켜줄 것이다.
게놈 연구의 급속한 발달에 비추어 볼 때, 프로테옴 연구는 뒤쳐져 있다. 예컨대, 현재 알려져 있는 인간 DNA 서열에 의해 코딩된 것으로 추정되는, 대부분의 단백질의 존재여부, 양, 세포 위치 및 조직 또는 발달적 발현 특이성과 같은 프로테옴의 특성들이 아직까지 특징화되지 않고 있다. 현재 이용가능한 대형-포맷 2-DE는 10,000개 까지의 서로 다른 단백질과 펩타이드 스팟 (spots)을 함유하는 젤을 생산할 수 있지만, 이러한 2-DE 젤에 의해 분리된 스팟의 95% 이상은 현재의 고감도 Edman시퀀싱 기술의 한계를 넘어서기 때문에, 서열분석이 불가능하다 (Persidis, Nature Biotechnology, 1998, 16:393-394).
특이 항체는 입수가능하기만 하다면, 프로테옴 연구에 강력한 도구가 된다. 항체들은 마우스, 토끼, 래트 또는 양과 같은 포유류의 단백질 또는 펩타이드 백신접종에 의해 쉽게 생산된다. 따라서, 특성화시킨 공지의 DNA 서열의 수가 매우 많으므로, 대규모 프로테옴 연구에 필요한 항체를 생산하기 위해 기존의 단백질 또는 펩타이드 백신접종 기술을 이용하는 것은 현실적으로 불가능하다.
프로테옴 연구에 대한 지대한 관심과 프로테옴 연구에서의 항체의 유용성에 비추어 볼 때, 대규모 프로테옴 연구에 이용하기 위한 항체를 생산하기 위한 보다 신속하고 경제적으로 가능성 있는 방법을 개발할 필요가 절실하다.
본 명세서에서 인용된 문헌들이 본 발명에 대한 종래기술로서 인정되도록 추론되어서는 안된다.
발명의 요약
본 발명은 조류종에서 항원에 대한 항체를 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 상기 조류종에게, 상기 조류 종에서 상기 항원의 발현을 지향시킬 수 있는 프로모터에 작동적으로 링크된 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열, 또는 상기 항원을 코딩하는 mRNA 서열을, 상기 항원에 대한 상기 항체의 검출가능할 정도의 생산을 유도시키는데 충분한 양으로 전달하고; 2) 상기 조류종으로부터 상기 항체를 회수한다. 바람직하게는, 백신접종되는 조류종이 닭이고 항체는 그 닭의 난황으로부터 회수되는 것이 좋다.
본 발명은 또한 닭에서 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 방법도 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 상기 닭에게, 상기 조류 종에서 상기 항원의 발현을 지향시킬 수 있는 프로모터에 작동적으로 링크된 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열, 또는 상기 항원을 코딩하는 mRNA 서열을, 상기 항원에 대한 상기 항체의 검출가능할 정도의 생산을 유도시키는데 충분한 양으로 전달하고; 2) 상기 닭으로부터 항체-생산 세포의 적어도 일부를 제거하며; 3) 상기 제거된 항체-생산 세포를 불멸화시키고; 4) 상기 불멸화된 항체-생산 세포를 증식시켜; 5) 상기 불멸화된 항체-생산 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체를 수확한다. 바람직하게는, 닭 항체-생산 세포가 닭의 B 림포블라스토이드 (lymphoblastoid) 세포주의 세포들과의 융합에 의해 또는 온코진 형질전환에 의해 불멸화되는 것이 좋다.
본 발명은 또한 도 3A 및 3C에 도시된 플라스미드를 포함하는, 조류 및 박테리아 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터; 및 도 12에 도시된 플라스미드를 포함하는, 닭의 항체-생산 세포를 불멸화시키기 위한 벡터도 포함한다.
본 발명은 또한 바이오-샘플로부터 분리된, 미리-선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하기 위한 방법도 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함하여 이루어진다: 1) 조류 및 박테리아 세포에서 상기 DNA 서열을 발현할 수 있는 이중-발현 벡터 내로 상기 각각의 DNA 서열을 클로닝시키고; 2) 상기 1) 단계에서 형성된 상기 이중-발현 벡터 중의 상기 DNA 서열을, 상기 NA 서열에 의해 코딩된 항원에 대한 항체를 검출가능한 양으로 생산 유도할 수 있는데 충분한 양으로 조류종에게 전달한 후, 상기 조류종으로부터 상기 항체를 회수한 다음; 3) 상기 2) 단계에서 상기 조류종에게 전달된 상기 DNA 서열을 박테리아 세포에 전달한 후, 상기 박테리아 세포로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 회수하고; 4) 상기 2) 단계에서 회수된 상기 항체들과 상기 3) 단계에서 회수된 단백질 또는 펩타이드들 간에 면역반응을 수행하여 상기 항체들의 면역특이성을 검증한 후; 5) 상기 2) 단계에서 회수된 상기 항체들과 상기 바이오-샘플간의 면역반응을 수행해서 상기 미리-선별된 DNA 서열 세트들의 프로테오믹스 프로파일을 결정한다.
마지막으로, 본 발명은 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련한 생리학적으로 식별가능한 마커들을 동정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음 단계로 이루어진다: 1) 상기 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플의 프로테오믹스 프로파일을 상기 설명된 방법을 통해 결정하고; 2) 상기 설명된 방법을 통해 필적할만한 생리학적으로 정상적인 바이오-샘플의 프로테오믹스 프로파일을 결정한 다음; 3) 상기 1) 단계에서 얻어진 프로테오믹스 프로파일을 상기 2) 단계에서 얻어진 프로테오믹스 프로파일과 비교해서 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련된 생리학적으로 식별가능한 마커를 동정한다.
출원은 1998년 11월 16일자로 출원된 "조류종에서 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용하여 항체를 생산하기 위한 방법 및 벡터 (METHODS AND VECTORS FOR GENERATING ANTIBODIES USING POLYNUCLEOTIDE VACCINATION IN AVIAN SPECIES)"라는 제목의 Linxun Duan의 35 U.S.C. 119(e) 조에 따른 미국잠정 특허출원제 60/108,487의 우선권주장 출원이다.
본 발명은 조류종, 특히 닭에서 폴리뉴클레오타이드 백신접종 (vaccination)을 이용하여 항원에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이오-샘플로부터 분리된 일련의 미리-선별된 DNA 서열의 프로테오믹스 프로필 (proteomics profile), 특히, 인간의 cDNA 라이브러리의 프로테오믹스 프로필을 결정하는 방법에 관한 것이기도 하다. 나아가 본 발명은 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련된 생리학적으로 식별가능한 마커를 동정하기 위한 방법에 관한 것이다.
도 1은 목적하는 DNA 클론의 선별 방법을 도시한 도면.
도 2는 항체를 이용한 유전자 및 단백질의 동정방법 (AMIGAP)의 다이아그램.
도 3A는 pS&DV의 제한효소 지도; 도 3B는 pS&DV의 제작도; 도 3C는 pS&DV-S의 제한효소 지도; 도 3D는 pS&DV-S의 제작도를 나타낸 도면.
도 4는 DNA 백신접종에 의해 도출된 잠재적인 면역 응답을 도시한 도면.
도 5는 pCMV-HBx, pCl-HBV-pol 및 pZeoSV2-hCD34에 의해 코딩된 3가지 항원에 의해 DNA 백신접종시킨 닭에서 생산된 항체의 ELISA 역가측정을 나타낸 도면.
도 6은 HbxAg 항원 특이적인 발현 벡터 pCMV-HBx의 제한효소 지도를 나타낸 도면.
도 7은 B형 간염 바이러스 Polymorantz 항원 특이적인 발현 벡터 pCl-HBV-pol의 제한효소 지도를 나타낸 도면.
도 8은 인간 CD 34 항원 특이적인 발현 벡터 pZeoSV2-hCD34의 제한효소 지도를 나타낸 도면.
도 9는 HBxAg의 DNA 백신 접종에 의해 생산된 IgY의 결합 친화도를 나타낸 도면.
도 10은 난황으로부터 정제된 IgY의 SDS-PAGE 분석도.
도 11은 DNA 백신 접종에 의해 생산된 항-HBxAg IgY의 웨스턴 블롯을 나타낸 도면.
도 12는 닭의 B 세포를 불멸화시키는데 이용될 수 있는 plmmmmo 벡터의 제한효소 지도를 나타낸 도면.
도 13은 항체-칩 (antibody-chip)의 프로토타잎과 그의 작동과정을 도시한 도면.
닭에서 DNA 백신접종에 의한 항체 생산이 이제까지 실패하여 왔음에도 불구하구, 본 출원인은 놀랍게도 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용함으로써 조류종에서 소망되는 항체를 생산할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용하여 조류종에서 소망되는 항체를 생산하기 위한 방법, 바이오-샘플로부터 분리된 미리-선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하는 방법 및 조류종의 폴리뉴클레오타이드 백신접종에 의해 생산된 항체를 이용하여 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 연관된 생리학적으로 식별가능한 마커를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명을 더욱 명확히 설명하기 위해 이하에 목차를 두어 본 발명을 세분하여 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
1. 폴리뉴클레오타이드 백신접종에 의해, 조류종에서 항체를 생산하는 방법
본 발명은 1) 조류종에게, 상기 조류 종에서 항원의 발현을 지향시킬 수 있는 프로모터에 작동적으로 링크된 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열, 또는 상기 항원을 코딩하는 mRNA 서열을, 상기 항원에 대한 상기 항체의 검출가능할 정도의 생산을 유도시키는데 충분한 양으로 전달하고; 2) 상기 조류종으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하여 이루어지는, 조류종에서 항원에 대한 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 백신접종될 조류종은 닭 (Gallus), 칠면조 (Meleagris gallopavo), 오리, 거위 및 일본산 메추라기 (Coturnix japonica) 중에서 선택되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 백신접종될 조류종이 닭인 것이 더 좋다.
닭 (chicken)의 또 다른 이름의 예로는 Gallus (G. domesticus), 병아리, 및 암탉을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 동의어도 본 발명에 포함된다. 그러나, 내용의 일관성을 위해, 본 명세서에는 "닭(chicken)"만을 사용하지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않음은 물론이다.
DNA 또는 mRNA 서열을 동물 신체 조직의 간질성 (interstitial) 공간, 예컨대 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 쓸개, 위장, 소장, 고환, 난소, 자궁, 결장, 신경계, 눈, 글랜드, 및 연결조직에 전달시킬 수 있다. 조직의 간질성 공간은 망상 섬유 또는 기관 조직, 혈관 또는 챔버벽 중의 탄성 섬유, 섬유 조직의 콜라겐 섬유 중의 세포내, 체액, 뮤코다당류를 포함하며, 또는 골소공 (lacunae of bone) 또는 근육 세포를 감싸는 연결 조직 중의 동일한 매트릭스를 포함한다. 이것은 림프액 채널의 림프액의 순환의 플라즈마가 차지하는 공간과 유사하다.
DNA 또는 mRNA 서열은 이러한 세포들을 포함하는 조직 내로 주사에 의해 간편하게 전달될 수 있다. 이들은 연속적이고 비-분화성인 세포에서 전달 및 발현되는 것이 바람직하지만, 예컨대, 혈액이나 피부 섬유아세포와 같은 분화되지 않거나, 완전하게 분화되지 않은 세포들에서도 전달 및 발현될 수 있다.
특벌한 구체예에서, DNA 또는 mRNA 서열은 조류종의 조직에 직접 전달된다. 바람직하게는, DNA 또는 mRNA 서열을 근육, 피부 또는 점막에 전달하는 것이 좋다. 근육 세포들은 폴리뉴클레오타이드를 테이크업 하여 발현하는 능력이 특히 뛰어나기 때문에, 근육 조직의 간질성 공간으로 전달하는 것이 바람직하다.
DNA 또는 mRNA 서열은 주사, 유전자총 (gene gun) 기술 또는 지질 매개된 전달 기술에 의해 조류종의 조직에 직접 전달시킬 수 있다. 주사는 바늘 또는 다른 주사도구에 의해 수행할 수 있다. 유전자총 기술은 미국특허 5,302,509호에 기재되어 있으며, 지질 매개 전달 기술은 미국특허 제 5,703,055호에 기재되어 있고, 이들 내용은 본 발명에 참고된다.
또 다른 구체예에서, DNA 또는 mRNA 서열을 조류종의 세포에 전달하여, DNA 또는 mRNA 서열을 함유하는 상기 세포들을 조류종의 적절한 조직에 전달한다. 바람직하게는, DNA 또는 mRNA 서열을 조류종의 혈액 세포에 전달하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, DNA 또는 mRNA 서열을 조류종의 비장 B 세포내로 전달하는 것이 좋다.
DNA 또는 mRNA 서열은 Ca3(PO4)2-DNA 트랜섹션 (Sambrook 외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor Press, 1989), DEAE 덱스트란-DNA 트랜스펙션 (Sambrook 외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor Press, 1989), 전기영동 (예컨대, Bio-Rad사의 프로토콜), "LIPOFECTIN"TM시약을 이용한 트랜스펙션 (예컨대 BRL-Life Science사의 프로토콜), 유전자총 기술 (미국특허 5,302,509호), 바이러스 유전자 전달 시스템 (Kaplitt외, Viral Vectors, Academic Press, Inc., 1995)를 비롯한 여러가지 방법 (일반적으로 Koprowski & Weiner, DNA vaccination/genetic vaccination, 1998. Springer-verlag Berlin Heidelberg)에 의해 조류종의 세포로 전달될 수 있다.
금-입자에 기초한 유전자총 전달법은 DNA 또는 mRNA 서열을 전달하는데 바람직한 방법이다 (미국특허 5,302,509호). 특정 구체예에서, Bio-Rad 헬리오스 유전자총 시스템을 DNA 백신접종 절차에 이용한다 (BIO-RAD Inc. New England). 헬리오스 유전자총은 in vivo로 신속하고 직접적인 유전자 전달을 가능케 해주는 간편한 손잡이식 장치이다. 이 장치는 DNA 코팅된 황금 마이크로캐리어를 소형 플라스틱 카트리지의 내벽으로부터 표적 세포에 스위핑 (sweep) 시키기 위한 조정가능한 헬륨 펄스를 이용한다. 튜빙 프렙스테이션 (tubing prepstation) 및 튜빙 절단기를 이용하므로 50개의 카트리지 "탄알 (bullets)"을 간단히 한번에 준비할 수 있다.
또 다른 특별한 구체예에서, 조류종에서 직접 항원을 발현시킬 수 있게 해주는, 프로모터에 작동적으로 연결된 항원을 코딩하는 DNA 서열을 전달한다. 바람직하게는, 전달되는 DNA 서열이 플라스미드인 것이 좋다.
사용되는 프로모터는 조류종의 내인성 프로모터일 수 있다. 다른 한편, 프로모터는 조류종에서 항원 발현을 지향할 수 있는, 바이러스 프로모터와 같은 외인성 프로모터일수도 있다. 바람직하게는, 바이러스 프로모터가 RSV LTR, MPSV LTR, SV40 IEP, CMV IEP 메탈로티오네인 프로모터 (미국특허 5,703,055호), 또는 비장 괴사 바이러스 LTR (SNV LTR) (미국특허 5,703,055호)인 것이 좋다.
또 다른 특정 구체예에서, 조류종을 백신접종시키는데 이용되는 DNA 서열은 코딩된 항원의 조류종에서의 분비를 지향시키는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 분비-지향 서열이 리더 서열인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 리더 서열이 닭의 IgY의 리더 서열 (Kabat외, Sequences of Proteins of Immunological Interests,1983, U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.), 닭의 SPARC (GenBank 수탁번호. L24906; Bassuk 외, Eur. J. Biochem., 1993, 218(1):117-127), 닭의 혈청 알부민 (GenBank 수탁번호 V00381 및 J00806; Hache 외, J. Biol. Chem., 1983, 258(7): 4556-4564) 및 닭의 조직-타잎 플라스미노겐 활성화제 (tPA) (GenBank 수탁번호 U31988)과 같은, 조류종의 내인성 리더 서열인 것이 좋다. 비록 내인성 조류 리더 서열이 바람직하기는 하지만, 본 발명에는 다른 종류의 리더 서열도 이용될 수 있다. 리더 서열에 더해, 여하항 공지의 막 단백질의 세포막-지향서열도 사용될 수 있다. 이러한 세포막-지향 서열의 예로는 IL-1, CD4 및 MHC의 세포막 지향 서열을 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 특정 구체예에서는 항원을 코딩하는 mRNA 서열이 전달된다.
본 발명에 따라 전달되는 폴리뉴클레오타이드 물질은 어떠한 형태를 취해도 무방하며, 본 발명은 어떤 특정 폴리펩타이드를 코딩하는 특정 폴리뉴클레오타이드에 국한되지 않는다.
자동화 핵산 합성장치를 이용할 수 있다면, PCR 클로닝과 발효기술의 조합에 의해 뉴클레오타이드 서열이 알려지기만 하면, DNA와 RNA를 모두 직접 합성하는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 소망되는 폴리펩타이드 서열이 알려져 있으면, 그 폴리뉴클레오타이드에 대한 적절한 코딩 서열도 추론할 수 있다.
미국특허 5,703,055호에 개시된 바와 같이, 사용하고자 하는 폴리뉴클레오타이드가 mRNA이면, 상응하는 DNA로부터 쉽게 in vitro 합성가능하다. 예컨대, 종래 기술은 개별적인 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 mRNA를 제조하기 위해 파지 RNA 폴리머라제 SP6, T3, 또는 T7을 이용한다. 복제 부위의 T7 오리진과 같은 적절한 파지 프로모터를 전사될 유전자의 바로 상류의 주형 DNA에 위치시킬 수 있다. 이러한 방식으로 T7을 이용하는 시스템은 익히 알려져 있으며, 예컨대 Current Protocols in Molecular Biology, §3.8 (vol.1 1988)에 설명되어 있다.
본 발명에서 사용되는 mRNA를 얻기 위한 한가지 특히 바람직한 방법은 pXGB 플라스미드 또는 그와 유사한 플라스미드로서 당업자가 쉽게 제작할 수 있고, 본 발명을 실시하는데 있어서 실제로 무제한수의 cDNA에 대해 이용가능한 플라스미드를 이용하는 방법이다 (미국특허 5,703,055호). 이러한 플라스미드는 5'-미번역 대역, 3'-미번역 대역, 폴리 A 트랙트에 대한 주형을 수반하는, 소망되는 RNA 폴리머라제를 위한 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에는 소망되는 cDNA를 플라스미드내로 삽입시키는 것을 용이하게 해 줄 수 있도록, 이 5' 및 3' 대역 사이에 독특한 제한효소 부위가 있어야 한다. 또한, 소망되는 유전자를 함유하는 플라스미드를 클로닝한 후, 폴리아데닐화 대역에서 절단함으로써 플라스미드를 선형화하고, 생체외에서 전사되어 mRNA 전사체를 형성하게 된다. 이들 전사체들에는 5' 캡이 제공되는 것이 바람직하다. 다른 한편, EMC와 같은 5' 미번역 서열들을 사용할 수도 있는데 이들은 5' 캡을 필요로 하지 않는다.
전술한 설명들은 mRNA를 제조하기 위한 대표적인 바람직한 방법들로서, 당업자라면 이들의 변형방법이 여러가지 있을 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예컨대, mRNA는 시판되는 뉴클레오타이드 합성 장치를 이용해서 제조할 수 있다. 다른한편, 원형 형태의 mRNA도 제조할 수 있다. 원형 mRNA, 화학적으로 블로킹된 mRNA 및 5' 캡을 갖는 mRNA와 같은 엑소뉴클리아제-내성 RNA가 바람직한데, 이는 이들의 생체내 반감기가 길기 때문이다.
특히, 바람직한 mRNA는 소아마비 바이러스의 5' 미번역 대역이 앞에 붙어있는 목적 유전자를 갖는 자가-고리화 mRNA이다 (미국특허 5,703,055호). 원형 mRNA는 매우 긴 반감기를 갖는 것으로 입증된 바 있다 (Harland & Misher, Development, 1988, 102:837-852; Pelletier & Sonnenberg, Nature, 1988, 334:320-325). 이 물질은 Been & Cech, Cell, 1986, 47:206-216에 설명된 방법에 따라, 자가-분할성이고 원형 "밧줄 (lariat)" mRNA를 생산하는 DNA 주형으로부터 제조될 수 있다. 이 논문의 내용은 본문에 참고되었다.
또한 미국특허 5,703,055호에 기재된 바와 같이, 본 발명은 RNAse (이 효소는 엑소뉴클리아제이므로 사슬의 중간에서는 RNA를 절단하지 않는다)의 접근을 방지하기 위해 5' 및/또는 3' 말단이 화학적으로 블로킹된 mRNA를 사용하는 것도 포함한다. 이러한 화학적 차단은 생체내에서의 RNA의 반감기를 실질적으노 연장시킬 수 있다. RNA를 변형시키는데 이용가능한 2가지 제제가 Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, Calof.로부터 구입가능하다: C2 AminoModifier (Catalog #5204-1) 및 Amino 7-dUTP (Catalog #K1022-1). 이 물질들은 RNA에 반응성 기를 부가시킨다. 목적하는 RNA 분자상에 이들 한가지의 제제를 도입한 후에, 제조사의 지침에 따라 RNA에 적절한 반응성 치환기를 링크시킬 수 있다. 충분한 벌크성을 갖는 기를 부가함으로써, 화학적으로 변형된 이 RNA에 RNAse가 접근하는 것을 방지할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 닭에게 백신접종하여 그 닭의 난황으로부터 항체를 회수한다. 바람직하게는, 암모늄 설페이트 침전법, 폴리에틸렌 글리콜 6000 침전법 또는 카프릴산 침전법에 의해 난황으로부터 항체를 정제하는 것이 좋다.
닭의 난황으로부터 항체르 회수하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 한가지 예가 Svendsen외, Laboratory Animal Science, 1995, 45(1):89-93에 기재되어 있으며, 그 내용은 본 발명에 참고되었다. Svendsen에 따라, 달걀을 매일 모은다. 가정용 달걀 분리기에 의해 난백과 난황을 분리하고, 난백 단백질에 의한 오염을 피하기 위해 물러 깨끗이 씻는다. 난황막을 터뜨려서 난황을 수집한다. 난황을 증류수로 수차례 희석한 다음 면역글로불린을 추가 정제할 때까지 -20℃에서 보관한다. 난황 지질을 제거하기 위해, 냉동된 희석 난황을 실온에서 해동시킨 다음 원심분리 한 후 여과시켜 침전된 지질 분획을 제거한다. 난황 용액을 투석 튜브에 넣고 고형 폴리에틸렌 글리콜 20000을 이용해서 물을 제거함으로써, 이 난황 용액을 본래의 난황 부피로 농축시킨다.
암모늄 설페이트 침전을 위해서는, 난황 용액에 고형 AmS를 교반하면서 첨가함으로써 침전을 수행한다. 최적의 침전 조건을 찾아내기 위해서, AmS 농도를 50%로 단계적으로 증가시킬 수 있다 (예컨대 0에서 10%, 10에서 205, 20에서 25%, 25에서 30%, 35에서 40%, 40에서 50%). 실온에서 일정기간 인큐베이션시킨 후, 용액을 원심분리한다. 미생물의 성장을 방지하기 위해, 펠렛을 소듐 아자이드 (NaN3)를함유하는 포스페이트-완충염수 (PBS)에 용해시키고, 상등액을 다음 침전 단계에 이용한다.
폴리에틸렌 글리콜 침전의 경우, 고형 폴리에틸렌 글리콜 6000 (PEG)를 난황용액 내로 교반하여 침전을 수행한다. 최적 침전 조건을 찾아내기 위해, 폴리에틸렌 글리콜 농도를 12%까지 단계적으로 증가시킬 수 있다 (예컨대 0에서 2%, 2에서 %, 4에서 6%, 6에서 8%, 8 에서 10%, 10에서 12%). 실온에서 일정기간 인큐베이션시킨 다음 용액을 원심분리한다. NaN3를 함유하는 PBS에 펠렛을 용해시킨다. 상등액을 수집해서 다음 침전 단계에 사용한다.
카프릴산 침전의 경우, 난황용액을 아세테이트 완충액으로 희석한다. 카프릴산 (CA)를 최종 농도 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 또는 1%가 되도록 용액 내로 교반혼합한다. 실온에서 일정기간 인큐베이션시킨 후, 용액을 원심분리한다. 펠렛을 NaN3를 함유하는 PBS에 용해시킨다.
또 다른 특정 구체예에서는, 닭을 백신접종시켜 항체를 닭의 항체-생산 B 세포, 바람직하게는 비장의 B세포로부터 회수한다.
현재 청구된 방법은 어떠한 단백질 또는 펩타이드 항원에 대한 항체를 생산하는데 이용될 수 있지만, 청구된 방ㅂ버들은 분비된 단백질 또는 펩타이드 항원에 대한 항체를 생산하는데 바람직하게 이용가능하다.
도 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 각각 도 3A 및 3C에 도시된 플라스미드를 함유하는, 조류 세포와 박테리아 세포에서 유전자를 발현하기 위한 벡터; 및,도 12에 도시된 플라스미드를 포함하는, 닭 항체-생산 세포를 불멸화시키기 위한 벡터를 제공한다.
2. 폴리뉴클레오타이드 백신접종을 이용하여 닭에서 모노클로날 항체를 생산하는 방법.
본 발명은 1) 닭에게, 상기 조류 종에서 상기 항원의 발현을 지향시킬 수 있는 프로모터에 작동적으로 링크된 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열, 또는 상기 항원을 코딩하는 mRNA 서열을, 상기 항원에 대한 상기 항체의 검출가능할 정도의 생산을 유도시키는데 충분한 양으로 전달하고; 2) 상기 닭으로부터 항체-생산 세포의 적어도 일부를 제거하며; 3) 상기 제거된 항체-생산 세포를 불멸화시키고; 4) 상기 불멸화된 항체-생산 세포를 증식시켜; 5) 상기 불멸화된 항체-생산 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체를 수확하는 단계를 포함하여 이루어지는, 닭에서 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 2) 단계에서 어떠한 항체-생산 세포도 제거될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체-생산 세포를 2) 단계에서 비장으로부터 제거한다.
닭의 비장 B 세포는 여하한 공지 방법으로든 불멸화시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 닭의 비장 B 세포를 닭의 B 림포블라스토이드 세포주의 세포와 융합시킴으로써 불멸화시킨다. 닭의 B 림포블라스토이드 세포주의 예로는 HU3R27, HU3427N 및 R27N4를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. HU3R27, NU3427N 및 R27H4가 Nishinaka 외, J. Immunological Methods, 1991, 139:217-222에 개시되어 있으며, 이 내용은 본 발명에 참고되었다.
닭의 항체-생산 세포를 불멸화시키는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고, Current Protocols in Immunology (Ed. Coligan외) John Wiley & Sons, Inc., 1997에 설명된 방법이면 어느 것이든 본 발명에 이용될 수 있다. 이러한 방법의 한가지 예가 Nishinaka외, Journal of Immunological methods, 1991, 139:217-222에 설명되어 있으며, 그 내용이 본문에 참고되었다. Nishinaka에 따라, HU3R27, HU3R27N, 및 R27H4와 같은 닭의 B 림포블라스토이드 세포 클론들을 면역된 닭의 비장 세포와 특정 어버이 세포/임파구 비율, 예컨대 1:5의 비율로 실온 (RT)에서 PBS 중 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 폴리-L-아르기닌과 함께 융합시킨다. 융합된 세포들을 가볍게 씻어주고 FBS가 보강된 IMDM에 현탁시켜 96-웰 배양 플레이트에 융합 전 세포 수에 기초해서 웰 당 3 x 105개의 밀도로 플레이팅시킨다. 38℃에서 24시간 인큐베이션시킨 후, HAT 배지를 각 웰에 첨가하고, 2-3일 간격으로 동일한 배지를 갈아주면서 10-14일간 배양한다. 10-14일 후, 이들 웰로부터의 배양 상등액을 이용해서 항체-분비 하이브리도마를 동정한다.
클로닝은 연한천 (soft agar) 배양법에 의해 수행할 수 있다. 생육중인 하이브리도마 세포들을 IMDM, Noble 한천 (Difco), EBS를 함유하는 연한천 배지 및 어버이 세포 배양으로부터 조건화된 배지에서 60 mm 플레이트레 분포시킨다. 연한천 플레이트를 실온으로 냉각시킨 다음 CO2인큐베이터 중 약 38℃에서 인큐베이션시킨다. 눈에 보이는 콜로니들을 연한천으로부터 개별적으로 제거하고 액체 배지에서 키웠다.
또 다른 특정 구체예에서, 닭의 비장 B 세포를 온코진 형질전환에 의해 불멸화시킨다. 바람직하게는, 형질전환에 사용되는 온코진이 돌연변이 닭 p53 온코진 또는 Ras 온코진인 것이 좋다.
3. 바이오-샘플로부터 분리된 미리 선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하는 방법
특정 구체예에서, 본 발명은 또한 바이오-샘플로부터 분리된, 미리-선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하기 위한 방법도 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함하여 이루어진다: 1) 상기 DNA 서열 각각을 조류 및 박테리아 세포에서 상기 DNA 서열을 발현할 수 있는 이중-발현 벡터 내로 클로닝시키고; 2) 상기 1) 단계에서 형성된 상기 이중-발현 벡터 중의 상기 DNA 서열을, 상기 NA 서열에 의해 코딩된 항원에 대한 항체를 검출가능한 양으로 생산 유도할 수 있는데 충분한 양으로 조류종에게 전달한 후, 상기 조류종으로부터 상기 항체를 회수한 다음; 3) 상기 2) 단계에서 상기 조류종에게 전달된 상기 DNA 서열을 박테리아 세포에 전달한 후, 상기 박테리아 세포로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 회수하고; 4) 상기 2) 단계에서 회수된 상기 항체들과 상기 3) 단계에서 회수된 단백질 또는 펩타이드들 간에 면역반응을 수행하여 상기 항체들의 면역특이성을 검증한 후 5) 상기 2) 단계에서 회수된 상기 항체들과 상기 바이오-샘플간의 면역반응을 수행해서 상기 미리-선별된 DNA 서열 세트들의 프로테오믹스 프로파일을 결정한다.
백신접종에 사용될 DNA 서열 세트는 이러한 백신접종을 수행하는 목적 또는관심분야에 따라 특정 기준 또는 절차에 기초해서 선별할 수 있다. 바람직하게는, 미리-선별된 DNA 서열 세트가 cDNA 라이브러리인 것이 좋다.
cDNA 라이브러리는 인간, 동물, 식물 또는 미생물 샘플과 같은 여하한 바이오-샘플로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 바이오-샘플이 인간 기원의 것인 것이 좋다. 또한, cDNA 라이브러리는 이러한 백신접종을 수행하는 목적 또는 관심분야에 따라 여하한 생리학적 상태에 있는 바이오-샘플로부터 유래한 것일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 어떤 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체를 생산하기 위한 일련의 DNA 서열 세트를 선별 및 제작하는 방법을 제공하며, 이 방법은: (1) 목적하는 특정 조직 샘플을 선별하고; (2) 선별된 샘플로부터 mRNA를 추출한 다음; (3) 바람직하게는 변형된 RNA 정상화 방법을 이용해서 cDNA 합성을 수행한 후; (4) 바람직하게는 젤 전기영동에 의해, 합성된 cDNA를 분획화한 다음; (5) 도 3A에 도시된 바와 같은 pS&DV 및 도 3C에 도시된 바와 같은 pS&DV-S와 같이, 조류 세포와 박테리아 세포 두가지 모두에서 cDNA를 발현시킬 수 있는 벡터에서 cDNA를 제작하여; (6) 분획화된 마스터 cDNA 라이브러리를 확립하고; (7) 마스터 cDNA 라이브러리의 품질 보증 분석을 수행한 후; (8) 클로닝된 cDNA를 정제하고; (9) 클로닝된 cDNA의 서열을 결정해서; (10) 추가의 DNA 백신접종을 위한 DNA 서열 세트를 선별하기 위해 DNA 서열 데이타에 대한 바이오정보 분석을 수행하는 단계를 포함하여 이루어진다. 목적하는 DNA 서열 세트를 선별 및 제작하기 위한 다른 기준 및 방법이 기술분야에 널리 알려져 있으며 이러한 다른 방법도 본 발명의 범위에 포함된다.
프레쉬 소스 또는 냉동 소스로부터 조직 샘플을 얻을 수 있다. 조직 샘플은 인간, 동물, 식물 또는 미생물로부터 얻을 수 있다. 특정 조직의 선별은 각각의 특정 연구에 따라 결정될 것이다. 예컨대, 인간의 간에 특이적인 유전자를 얻고자 할 때는, mRNA 추출을 위한 소스로서 성인의 간이나 태아의 간 조직을 이용할 수 있을 것이다. 바람직한 구체예에서, 조직은 가능한 한 신선한 것을 사용하는 것이 좋다.
mRNA으 제조기술은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, Ausubel외, Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons, 1995; Dracopoli외, Current Protocols in Human Genetics, New York: John Wiley and Sons, 1995; 및 Sambrook외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor Press, 1989를 참조할 수 있다. 또한, Life Science BRL (Gaithersburg, MD) 및 Promega Inc. (Madison, WI)사가 시판하는 키트와 같이, 시판되는 mRNA 추출 키트도 이용가능하다. 특정 메시지 RNA를 추출하기 위한 바람직한 방법에서, 조직 샘플을 액체 질소중에서 급속 냉동시켜, 분쇄한 다음 4M 구아니딘 용액과 같은 RNA 추출 완충액 중에 재현탁시킬 수 있다. 다른 한편, 용해 (lysis) 완충액을 이용해서 조직으로부터 mRNA를 직접 추출할 수 있으며, 추출된 mRNA는 Qiagen (Chatsworth, CA)사의 컬럼과 같은 이온 교환 컬럼 상에서 추가정제될 수도 있다.
다음 설명은 변형된 RNA 표준화 방법을 이용함으로써, 하우스키핑 유전자를 저농도로 함유하는, cDNA 라이브러리를 얻기 위한 방법을 설명한다. 라이브러리로부터 무작위적으로 골라잡은 cDNA 클론의 대규모 싱글-패스 시퀀싱은 유전자를 발견하는 강력한 접근방식인 것으로 입증된 바 있다 (Adams 외, Science, 1991, 252:1651-1656; Okubo외, Nature Genet., 1992, 2:173-179). 그러나, 보통의 cDNA 라이브러리는 이 접근방법의 전체적인 효율성을 크게 손상시킬 뿐만 아니라, 생성된 데이타의 인테그리티를 크게 감소시키는, 바람직하지 못한 "쓰레기" 클론을 높은 빈도로 함유한다. 이러한 쓰레기 클론들 중에는, (a) 폴리(A) 테일만으로 구성되는 클론; (b) 매우 짧은 cDNA 삽입물을 함유하는 클론; (c) 어댑터에 연결된 첫번째 가닥 cDNA의 합성에 이용된 NotI-올리고 (dT) 18 프라이머의 3' 반쪽 (half)만을 함유하는 클론; 및 (d) 키메릭 클론이 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, cDNA에 대한 RNA의 표준화 및 공제를 위한 전통적인 절차가 이용될 수 있다 (Bonaldo외, Genome Research, 1996, 6: 791-806; Neto외, Gene, 1997, 186:135-142). 이 방법의 단점은 mRNA의 조작에 다단계가 요구된다는 것으로, 이로 인해, 최종 cDNA 산물에 짧은 RNA가 발생되게된다. 그러나, 이 방법 대신 사용할 수 있는 대체방법이 있다. 모든 인간 유전자의 큰 분획은 이미 동정되었기 때문에, 상이한 조직으로부터 특성화된 여분의 유전자들은 cDNA 합성을 위해 올리고 dT 프라이머와 혼합된 바이오틴-표지된 특정의 여분 유전자 옹리고를 이용함으로써 쉽게 피할 수 있게 되었다. 역전사 반응을 완료한 후, 여분의 유전자 cDNA를 아비딘-자석 비드를 이용해서 cDNA 혼합물로부터 제거할 수 있다. 이 방법에 의해 하우스키핑 유전자 cDNA의 배경농도를 매우 낮추면서 cDNA를 생산할 수 있다 (Diatchenko 외, Proc. Natl. Acad. Sci, 1996, 93: 6025-6030). mRNA를 cDNA로 역전사 반응시키는 것을 향상시키기 위해 또 다른 방법을 이용할 수 있다 (Gastel & Sutter, BioTechniques, 1996, 20: 870-875).
다음에 젤 전기영동에 의해 cDNA를 분획하하는 방법을 설명한다. 대규모 DNA 시퀀싱은 동일한 클론의 시퀀싱을 여러번 반복시켜야 한다는 부담이 있다. 증폭되지 않은 cDNA 라이브러리를 이용하면 DNA 시퀀싱을 향상시키고 첫번째 가닥 cDNA 합성 효율을 검사할 수 있으며, 역전사 반응의 질을 결정하기 위한 지표로서도 이용가능하다 (Bodescot & Brison, Bio Techniques, 1997, 22(6): 1119-1125). 바람직한 구체예에서 0.8 내지 1% 아가로스 젤과 같은, 젤 전기영동에 의해 총 cDNA 산물을 분획화시킬 수 있다. 이어서 소망되는 크기를 갖는 cDNA를 수집해서 Qiagen (Chatsworth, CA)사의 벡터와 같은, 클로닝 벡터 내로 라이게이션시키기 전에 추출할 수 있다. 수집된 cDNAs의 길이는 수집된 샘플에 대한 대역처럼 매 0.5kb단위로 변할 수 있다. 이어서, 수집된 cDNAs를 여러가지 형질전환 실험에 할당된 각각의 라이게이션 튜브중의 벡터내로 삽입할 수 있다. 혼합된 cDNA 라이브러리에서, 완전한 길이의 cDNA는 종종 작은 cDNA 혼합물의 복잡한 배경 중에 종종 남아있다. cDNA 제조를 위한 이 분획화 방법에 의해 cDNA 라이브러리의 서브-집단이 생성될 수 있다. 일단 3'EST 서열이 알려지고, 표준 RNA 노던 블롯 실험 (Chenchick 외, Bio/Techniques, 1996, 21: 526-534)로부터 유전자 전사체의 크기가 얻어지면, 지정된 길이의 cDNA 클론 역시 cDNA의 서브집단으로부터 완전한 길이의 클론을 동정하는 것을 도와줄 것이다. 이 방법은 여러가지 조직 샘플로부터 다양한 cDNA 라이브러리를 구축하는데 응용될 수 있다.
다음에 각각 도 3A 및 도 3C에 도시된 pS&DV 및 pS&DV-S와 같은, 이중-발현벡터를 이용해서 cDNA 라이브러리를 구축하는 방법을 설명한다. 이중 발현 벡터 내로 cDNA 삽입물을 직접 클로닝하는 목적은 DNA 백신접종을 조류종에서 수행할 하여, 코딩된 단백질 또는 펩타이드 항원을, 동일한 DNA를 가지고 박테리아 내에서 발현시키기 위한 것이다. 이 이중 기능 벡터는 내인성 조류 프로모터와 같은 조류 세포 유전자 발현을 위한 단편, 또는 CMV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터, SV40 인트론 및 SV40 폴리아데닐화 부위등을 지닌다. 이 벡터는 또한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 발현 시스템을 지니는데 여기서, 클로닝된 유전자는 BL23 (DE3)과 같은 T7 RNA 폴리머라제를 지니는 E. coli 균주에서 발현할 것이다 (Studier외, Methods in Enzymol., 1990, 1985: 60-89). cDNA 단편은 예컨대 5' 말단에서는 PacI, 3' 말단에서는 NotI과 같이, 상이한 제한효소를 이용해서 양쪽 말단에서 cDNA를 절단함으로써 벡터 내로 방향에 맞춰서 삽입될 수 있다. cDNA를 정확한 방향에 맞춰서 클로닝시킴으로써 유전자 발현을 확실하게 할 수 있다. 대부분의 cDNA 단편이 그 단편 중에 5' 대역이나 번역 개시 코드 (ATG)를 갖지 않은 점을 고려하여, 인공 ATG를 벡터 내에 만들어서, ATG 사이의 Shine-Dalgarno/Kozak 컨센서스 서열의 거리를 조정함으로써, 박테리아에서의 단백질 발현 수준을 증진시켰다. ATG의 바로 하류에는 복수개의 클로닝 부위가 위치한다. 그리고 3 세트의 상이한 오픈 리드 프레임 (ORF)를 벡터 내에 제조하였다. 벡터 중 cDNA가 소망되거나 정확한 ORF가 아닐 경우, 제한효소 절단을 이용함으로써 이를 정확한 ORF 벡터로 쉽게 옮길 수 있다. pS&DV-S는 pS&DV의 모든 구성요소에 더해, 닭의 IgY 리더 서열을 추가로 함유하며, 이것은 닭 세포에서 cDNA 삽입물에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 분비하는 것을 지향시킬 수 있다.
다음에 분획화된 cDNA 클론들의 서브집단으로 이루어진 마스터 cDNA 라이브러리의 제작방법을 설명한다. 표준공정, 바람직하게는, 전기영동을 이용해서 Life Science BRL (Gaithersburg, MD)와 같은 다양한 제조회사로부터 얻어질 수 있는, HB101과 같은 박테리아 세포내로 벡터 및 cDNA 라이게이션 혼합물을 효과적으로 형질전환시킬 수 있다. 배양 플레이트 상에 형질전환된 박테리아 세포를 플레이팅시킨 다음 세포들을 밤새 인큐베이션시키고, 클론을 픽업한 다음, 15% 글리세롤와 같은 냉동 보관 용액을 함유하는 320 웰 플레이트 내로 옮겼다 (Ausubel외, Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons, 1995; 및 Sambrook 외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor Press). 각각의 분획화된 cDNA 프레퍼레이션이 서브-집단 라이브러리로서 수집되므로, 총 라이브러리에 대한 분리된 클론들은 잠재적인 인간 유전자의 수보다 적어도 10배는 되는 것이 바람직하다. 공개된 데이타 베이스로부터 얻어진 예비 데이타는 인간 게놈에 약 100,000개의 기능적인 유전자가 있을 수 있음을 가리킨다. 따라서 각각의 조직-특이적인 cDNA 라이브러리에 대해, 추가적인 DNA 시퀀싱 분석을 위해서는 약 100만개의 클론을 픽업해야만 한다. Stanford University, DNA sequence Center, CA 등과 같은 여러가지 상업적인 회사로부터 자동화된 클론 픽-업 시스템을 구입할 수 있다.
다음에 마스터 cDNA 라이브러리의 품질 보증 분석을 수행하기 위한 방법을 설명한다. 대규모 DNA 시퀀싱에 앞선 이러한 품질 보증 분석은 소망되는 결과를 경비절감적인 방식으로 확인시켜줄 것이다. cDNA 라이브러리의 일부를 분석한 다음 얻어진 데이타를 총 cDNA의 품질을 측정하는데 이용하는데는 여러가지 방법이 있다. 한 방법에서는, 약 1,000개의 클론을 라이브러리로부터 무작위적으로 픽업해서, cDNA 5' 서열에 대한 특이적인 프라이머를 이용하여 DNA 시퀀싱을 수행하는 것이다. 이러한 한정된 시퀀싱 데이타의 분석은 유전자 분포 패턴, 삽입된 유전자의 길이 및 벡터의 자가-라이게이션 백분율과 같은 유용한 정보를 줄 것이다. 다른 한편, 약 2,000개의 클론을 플레이트(들) 상에서 배양하여 니트로셀룰로스 막에 복제한 다음 프로브로서 하우스키핑 유전자 서열을 이용하여 DNA 하이브리다이제이션에 의해 스크리닝할 수 있다. 예컨대, cDNA 라이브러리가 간 조직으로부터 유래된 경우, β-액팅 및/또는 알부민 뉴클레오타이드 서열을 프로브로서 이용할 수 있다. 프로브는 공지의 여하한 기술로 표지시켜도 무방하다. 바람직한 방법에서는, 무작위 프라이머법을 이용해서 프로브를 표지시킨다 (Feinberg & Vogelstein, Analyt. Biochem., 1983, 132:6-13; Dracopoli외, Current Protocols in Human Genetics, New York, John Wiley and Sons, 1995). 바람직하게는 DECprime II DNA 표지 키트 (Ambion, Austin, TX)와 같은 키트를 이용해서32P-dNTP를 무작위 프라이머 표지 반응에 인코포레이션시키는 것이 좋다.35S 또는33P와 같은 다른 동우원소도 표지 반응에 사용할 수 있다. 다른 한편, 비동위원소 표지 제제도 이용가능하다 (Kricka, ed., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, 2판, San Diego, CA, Academic Press, 1995). 하이브리다이제이션 결과는 표준화된 cDNA 라이브러리에서하우스키핑 유전자의 배경 오염을 검토하는데 이용될 수 있다. 대부분의 하우스키핑 유전자는 일반적으로 cDNA 라이브러리에서 동일한 비율로 발생하므로, 하우스키핑 유전자에 대한 하이브리다이제이션 비율은 cDNA 라이브러리의 품질을 결정하는데 이용될 수 있다. cDNA 라이브러리의 품질은 PCR-기초 공정에 의해 측정될 수도 있다 (Pacchioni외, Bio Techniques, 1996, 21:644-649). 바람직한 방법에서는 무작위적으로 골라잡힌 cDNA 라이브러리 클론에서 3' DNA 특이적인 올리고로서, β-액틴 유전자를, 5' 프라이머로서 T7 프로모터 올리고와 같은 하우스키핑 유전자를 이용해서 PCR 증폭을 수행한다. PCR 산물 (+/- 점수)의 존재여부에 대한 후속적인 검색을 젤 전기영동이나 내부 올리고뉴클레오타이드 하이브리다이제이션에 의해 수행한다. PCR 증폭 결과는 cDNA 라이브러리에서 하우스키핑 유전자의 존재 백분율을 밝혀줄 뿐만 아니라, cDNA 삽입물의 평균 길이를 측정하는데도 이용될 수 있다. cDNA 라이브러리의 무작위적인 클론의 PCR 증폭 반응은 Origene Technologies, Inc. (Rockville, MD)가 판매하는 것과 같은 시판되는 시약이나 키트를 이용해서 수행할 수 있다.
클로닝된 플라스미드 DNA는 공지의 여하한 방법으로 정제할 수 있다. 바람직하게는, 후속적인 DNA 시퀀싱 분석을 위한 고순도 DNA 주형을 제공하기 위해 Quiagen Inc.의 자동화 시스템 9600 (Valencia, CA)와 같은 자동 플라스미드 정제 장치를 이용하는 것이 좋다. 다른 한편, PCR 증폭 및 네스트-PCR을 하기 위해 cDNA 클론을 이용함으로써 DNA 시퀀싱 주형을 제공할 수 있다. 서열이 공지되므로, PCR을 위한 2쌍의 프라이머들을 라이브러리에서 모든 클론들에 대해 쉽게 표준화시킬수 있다.
DNA 서열은 여하한 공지 방법에 의해 결정할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 무작위적으로 선별된 클론을 cDNA 라이브러리로부터 정제하여, cDNA 시퀀싱 주형을 제조하는 것이 좋다. 이 주형을 디데옥시법, 바람직하게는 A.L.F. (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 또는 ABI/373 또는 ABI/377 (Applied Biosystems, Foster City, Calif)와 같은 자동화된 DNA 시퀀서를 이용해서 시퀀싱하는 것이 좋다. 보편적인 프라이머를 이용함으로써 각각의 클론으로부터 초기 리딩이 취해지는 이러한 "샷건 (shotgun)" 페이즈에 더해, "워킹 (walking)" 페이즈는 맞춤 (custom) 프라이머를 사용함으로써 선택된 클론으로부터 부가적인 리딩을 취한다. 이들 및 관련된 시퀀싱 방법에 대한 완전한 프로토콜은 Ausubel 등, Current protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons, 1995; 및 Sambrook 외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor Press에 기재되어 있다. 효율적인 디자인은 DNA 시퀀싱을 위한 "워킹" 프라이머로서 이용될 수 있는 작은 (바람직하게는 18 내지 22 bp) 올리고뉴클레오타이드를 생산한다. 올리고뉴클레오타이드 서열은 일반적으로, 이전의 DNA 서열 데이타베이스에서 유전자의 말단과 관련된 서열들을 우선적으로 검출하도록 고안된다. 이러한 선택적인 편향은 서열을 수작업으로 판독하거나 또는 비교하고자 하는 서열들을 시험함으로써 달성할 수 있다. 일단 고안되면, 이들 올리고뉴클레오타이드들은 Research Genetics (Huntsville, AL)과 같은 DNA 합성회사로부터 주문할 수 있다. 다른 한편, 올리고뉴클레오타이드들을 예컨대 Applied Biosystems (Foster City, CA)와 같은 DNA 합성기로 합성할 수 있다.
DNA 시퀀싱 반응 산물들은 바람직하게는 형광 검색을 이용하는 폴리아크릴아미드 젤상에서 전기영동에 의해 분리할 수 있다. 예컨대 초박형 젤 슬랩 (Kostichka외, Bio/Technology, 1992, 10:78-81), 모세관 어레이 (Mathies & Huang, Nature, 1992, 359:167-169), 및 질량 스펙트럼분석 (Wu외, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1993, 7:142-146)과 같은 다른 DNA 크기 분리 기술도 이용가능하다. 젤 전기영동을 이용하지 않는 DNA 시퀀싱 분석도 하이브리다이제이션 방법학에서 수행되어 왔다 (Drmanac외, Science, 1993, 260:1649-1652; Southern외, Genomics, 1991, 13:1008-10017). 또 다른 접근방법은 염기 부가 시퀀싱 전략 (BASS)으로서, 이 방법은 미지의 DNA 주형의 서열을 결정하기 위해 동시화된 (synchronized) DNA 폴리머 구축방식을 이용한다 (미국특허 5,302,509; WO 93/21340; 및 WO91/06678).
"워킹" 방법에 의해 선별된 클론들의 서열은 매칭 중복에 의해 삽입된 DNA의 완전한 cDNA 서열내로 조립될 수 있다. 이러한 작업에 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다 (예컨대 Rodger Staden 프로그램, Cambridge, UK; DNAStar, Madison, Wis.). 서열 어셈블리에 이어, 유전자 및 반복 요소를 동정하고, 기능을 추정하며, 게놈 및 세포의 다른 부분과의 서열의 관련성을 결정하기 위해, 연관된 서열 데이타베이스 (예컨대 Genbank, Bethesda, MD; EMBL, Cambridge, UK; Phil Green's GENEFINDER, Seattle, Wash)에서 유사성 및 상동성 조사를 수행할 수 있다 (Gonzelez & Sylvester, Genome Research, 1997, 7:65-70).
상기한 절차들은 E. coli (Plunkerr 외, Nucl. Acids Res., 1993, 21:3391-3398)과 같은 몇몇 박테리아 (Human Genome Sciences, Gaithersburg, Md), 및 효모 (Oliver 외, Nature, 1992, 357:38-46), 인간 (Martin-Gallardo외, Nature Genet., 1992, 1:34-39), 마우스 (Wilson 외, Genomics, 1992, 13:1198-1208) 및 C. elegans (Wilson외, Nature, 1994, 368:32-38; Sulston 외, Nature, 1992, 356:37-41)과 같은 고등생물체의 게놈을 시퀀싱하는데 성공적으로 적용된 바 있다. 지도 작성된 코스미드 (또는 기타) 클론으로부터의 모다 큰 게놈 대역의 자동화 시퀀싱이 염기당 평균 비용 $ 0.38-0.50 저렴한 경비로 매우 낮은 오차범위 하에, 몇군데의 센터 (Sanger Center, Cambridge, UK; Washington University, St. Louis, Mo.)에서 이제 통상적으로 이루어지고 있다.
다음에 cDNA 서열 데이타의 컴퓨터에 기초한 생체정보 분석을 위한 절차를 설명한다. 바람직한 방법에서, 삽입된 DNA의 5' 말단으로부터의 보편적인 프라이머에 의해 선별된 클론의 서열들을 특정 컴퓨터 프로그램에 의해 먼저 분석할 수 있다. 예컨대, 기능이 알려져 있는 유전자와 미동정 cDNA 단편을 동정하기 위해, 유사성 및 상동성 조사를 수행할 수 있다 (Genbank, Bethesda, MD; EMBL, Cambridge, UK; Phil Green's GENEFINDER, Seattle, Wash). 벡터와 삽입된 DNA간의 정션 DNA 서열과 잠재적인 ORFs를 분석할 수 있으며, 이는, 유전자 기능을 추정하고, 게놈 및 세포의 다른 부분들에 대한 서열의 관련성을 결정하는데 도움이 될 것이다 (Altchul외, Nature Genetics, 1994, 6:119-129). 새로 동정된 몇몇 서열의 경우, "워킹" 단계 후에, 이들 새로운 서열을 조립해서 중복물을 맞춰봄으로써 삽입된DNA의 완전한 cDNA 서열을 얻을 수 있다. 이러한 작업을 위해 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다 (예컨대 Rodger Staden 프로그램, Cambridge, UK; DNAStar, Madison, Wis). 서열 조립에 이어, 완전한 길이의 cDNA 코딩된 추정적인 단백질을 기능 도메인 조사등을 위해 추가로 분석할 수 있다. 이러한 분석 데치타는 컴퓨터 데이타베이스로 카테고리화시킬 수 있다. cDNA의 기능을 매핑한 후 DNA 전사 조절 서열을 찾는 것과 같은 다른 시험도 수행할 수 있다 (Fickett & Hatzigeorgious, Genome Research, 1997, 7:861-878).
일단 DNA 서열이 선택되면, 상기 1절과 2절에 설명된 방법들을 이용해서, 이러한 선별된 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드에 대해 폴리클로날 항체이건, 모노클로날 항체이건간에 소망되는 항체를 생산할 수 있다.
특정 구체예에서, DNA 백신접종에 이용되는 DNA 서열 역시 경쟁적인 박테리아 세포내로 전달하여 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있으며, 이를 이용해서 DNA 백신접종에 의해 생산된 항체들을 특징화시킬 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 세포가 반응력 있는 E. coli 세포인 것이 좋다. 또한, 도 3A 또는 3C에 도시된 이중 발현 벡터를 이용해서 박테리아 세포에 DNA 서열을 이용하는 것도 바람직하다. 도 3A 또는 3C에 도시된 벡터에 함유된 DNA 서열들을 RNA 7 폴리머라제를 지니는 BL21 (DE3) 세포와 같은 박테리아 세포내로 형질전환시킬 경우, 전달된 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질들을 예컨대 IPTG와 같은 인듀서 존재 하에서 고농도로 발현시킬 수 있다. DNA 서열은 기술분야에 알려진 여하한 방법에 의해서도 박테리아 세포 내로 전달하는 것이 가능하다 (예컨대, Ausubel외, Current Protocolsin Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons, 1995; 및 Sambrook외, Molecular Cloning 2판, Plainview, N.Y. Cld Spring Harbor Press). 바람직하게는, Life Science BRL (Geitesburg, MD)와 같은, 시판되는 DNA 형질전환 시스템을 이용하는 것이 좋다.
박테리아에 의해 발현된 단백질 또는 펩타이드는 공지의 여하한 방법으로든 회수가능하다 (예컨대 Ausubel외, Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons, 1995; 및 Sambrook외, Molecular Cloning 2판, Plainview, N.Y. Cld Spring Harbor Press). 예컨대, 형질전환된 박테리아 클론들을 픽업해서 LB 배양 배지에서 키울 수 있다. 이 박테리아 세포들을 수확하기 전에, IPTG와 같은 인듀서를 첨가해서 단백질 발현을 유도할 수 있다. 박테리아 세포들을 원심분리에 의해 수확하여 SDS-PAGE 용해 완충액에 직접 재현탁시킨 다음 Bio-RAD Inc. (Hercules, CA)사 제품과 같은 시판되는 시스템을 이용해서 SDS-PAGE 분석할 수 있다.
DNA 백신접종에 의해 생산되니 항체들과 박테리아가 발현시킨 단백질 또는 펩타이드들간의 면역반응을 기술분야에 알려진 여하한 방법에 의해 분석할 수 ㅇㅆ다 (예컨대 Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons, 1995; 및 Sambrook외, Molecular Cloning 2판, Plainview, N.Y. Cld Spring Harbor Press). 바람직하게는, 이러한 면역반응을 면역블로팅에 의해 분석하는 것이 좋다. 예컨대, SDS-PAGE 분리 후, 분석하고자 하는 단백질 또는 펩타이드들을 Schielen외, Journal of Immunological Methods, 1995, 188:33-41에 설명된 방법에 따라, 예컨대 PVDF 막과 같은 적절한 막 위에 옮길 수 있다. 면역블로팅 반응은 공지의 여하한 방법에 의해서도 분석할 수 있다. 바람직하게는, 면역블로팅 반응을 BIO-RAD (Hercules, CA)사의 Chemiluminscence 검색 시스템과 같은 시판되는 시스템에 의해 검색하는 것이 좋다.
항체와 박테리아가 발현시킨 단백질 또는 펩타이드들 사이의 면역반응으로부터 발생된 양성 결과가 얻어지는 경우는 바이오-샘플로부터 분리된 DNA 서열에 의해 단백질과 펩타이드가 코딩됨을 확인시켜줄 뿐이다. 상기한 바와 같이 항체를 박테리아에 의해 발현된 단백질과 펩타이드 간의 면역 반응에 의해 특징화시킨 후, 항체들과 DNA 서열을 분리한 바이오-샘플간의 추가적인 면역반응을 수행하여 선별된 DNA 서열들의 프로테오믹스 프로파일을 결정할 수 있다.
리딩 프레임에 불확실한 것이 있는 경우, 그리고 공지 서열과의 상동성 또는 유사성의 결여에 대해 어떠한 특이적인 ORF도 결정되지 못한 경우에는, DNA 단편을 세가지 ORFs내로 삽입해서 세가지 상이한 항체들을 이용한 웨스턴 블롯 분석을 수행할 수 있다.
항체돠 바이오-샘플 사이의 면역반응을 분석하는데는 여하한 공지의 방법이 모두 이용가능하다. 바람직하게는, 면역블로팅, 면역침전 및 in situ 면역염색을 이용하는 것이 좋다. 또한, 프로테옴 연구에, 2차원 전기영동 (2-DE), 울트라-센시티브 질량 분광계 (MS), 및 기타의 하이-쓰루아웃 (high-throughout) 기능성 스크리닝 분석법과 같은 다른 기술들과 항체기초 방법을 병용할 수도 있다. 이러한 2-DE 및 MS 분석법의 예로는, 질량-기초 분리를 수반하는 등전점 전기영동 (ISO-DALT), 비-평형 기초 전기영동 (NEPHAGE), 고정된 1차 pH 구배 (IPG-DALT) (Humphery-Smith 외, Electrophoresis, 1997 18:1217-1242)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
항체와 바이오-샘플들간의 면역반응을 분석하기 위한 한가지 기술은 기술분야에 잘 알려진 조직 면역염색법이다 (Feitelson & Zern, Clinics In Laboratory Medicine, W.B. Saunders Com., 1996). 바람직하게는, 저온절단된 (cryosecte) 조직 샘플을 이용해서 면역염색 분석을 수행하는 것이 좋은데, 이는, 이 방법에 의해 고정되니 조직 샘플이 세포 항원 구조를 잘 보존할 수 있기 때문이다. 이 분석법으로부터 얻는 데이타는 테스트된 조직에서의 세포 단백질 발현 패턴도 나타낼 수 있다. 다른 한편, 항체 면역염색을 위해 파라핀 고정된 조직 샘플을 이용할 수 있는데, 이는 이러한 조직 고정법에 의해 조직을 장기간 보존할 수 있고 또한 여러가지 의료적인 연구 소스로부터 쉽게 수집될 수 있기 때문이다. 파라핀 고정된 조직 샘플을 이용할 경우 면역염색 감도를 증진시키기 위해 몇가지 기술이 이용될 수 있다 (Lantis 외, Surgical Endoscopy, 1998, 12(2): 170-176).
본 발명에 의해 제조된 항체들과 이러한 항체와 바이오-샘플 사이의 면역반응을 분석함으로써 얻어진 정보들은 여러가지 방식으로 이용될 수 있다. 이러한 한가지 용례는 항체 인덱스를 만드는 것과 이러한 항체 인덱스를 공지의 뉴클레오타이드 서열 데이타베이스내로 통합시키는 것이다.
대규모 게놈 시퀀싱 분야의 최근의 진전은 입수가능한 DNA 서열을 분석 및 해독하기 위해 보다 강력한 툴을 필요로 한다. GLAST와 같은 상동성 및 유사성 조사 프로그램은 매우 효과적이면서 믿을 수 있는 컴퓨터화된 툴이다. 이러한 유형의 컴퓨터 분석 프로그램의 기능을 증진시키기 위해 새로운 powerBLAST가 개발되었다 (Zhang & Madden, Genome Research, 1997, 7:649-656). 이 새로운 powerBLAST 프로그램에서는, 조사결과를 상호작용성 브라우저 Chromoscope에 송출시키거나 또는 ASCII 파일로 포맷시키거나, 또는 전세계 웹 (Wordl Wide Web)을 통해 브라우징할 수 있도록 GenBank, MEDLINE, 및 기타 Enterez의 다른 요소들에 HTML 페이지로 링크시킬 수 있다. cDNA 서열의 다중 얼라인먼트를 텍스트 화면과 그래픽 화면 두가지 모두로 볼 수 있다. 매칭 서열에 대한 특성 설명이 얼라인먼트와 포개지는데, 이는 분석된 서열에서 기능적인 도메인을 동정하는 것을 극히 쉽게 해준다. 본 발명에 의해 생산된 항체 인덱스는 상응하는 cDNA 서열 각각에 자동적으로 링크될 수 있으며 웨스턴 블롯 데이타와 조직 면역염색 데이타를 이 데이타베이스에 교차인용시킬 수 있다. cDNA 유도된 항체를 이용한 면역염색에 의해 생산된 서브세포 이미지를 저장할 수 있으며, 웨스턴 블롯 분석 데이타를 데이타베이스에서 추적하여 특정 cDNA 코딩-단백질의 크기를 평가할 수 있다.
본 발명에 의해 생산된 항체들은 새로운 cDNA 서열에 의해 코딩된 단백질이나 펩타이드를 기능적으로 분석하는데도 이용될 수 있다. cDNA 유도된 항체로부터 얻어진 정보를 기능적 인덱스별로 그룹화시킬 수 있다 (Poustka외, Cold Spring Harbor Sympl Quant. Biol., 1986, 51:131-139). 항체-기초 분석을 통해, 몇몇 종류의 정보를 표적 유전자에 대해 얻을 수 있다. 먼저, 클로닝된 cDNA 단편이 실제로 단백질을 코딩하는지의 여부이다. 둘째, 조직 면역염색법을 통해서, 이 유전자에 대애 어떤 것이 정확한 ORF인지 알아낼 수 있아. 세번째로, 단백질을 코딩하는 유전자가 발현된 곳에서, 조직 분포 패턴과 서브 세포 위치를 결정할 수 있다. 특정 유전자의 발현 수준은 내부 콘트롤로서 β-액틴 또는 GAPDH와 같은 매우 널리 문서화된 단백질을 이용해서 결정할 수 있다. 특정 유전자에 대한 이러한 선도적인 정보에 기초해서, 유전자의 세포수준의 기능을 더욱, 조명하고, 만일 그 유전자가 어떤 질병이나 장애와 관련되어 있을 경우에는, 특정 질병과 그 유전자와의 연관성을 이해하기 위해 다중-유전자 기능 분석을 고안할 수 있는 것이다.
DNA 서열은 핵에 저장된 장기간 유전된 DNA에 대한 정보와 그 유전자의 물질적인 연관에 관한 정보를 게놈적인 상황으로 알려준다. 그러나, 이러한 유전자가 어떻게 발현되며 그들의 세포에서의 위치는 어떤것인지를 알아내는 것도 유용하다. 이 목적을 위해, 상기한 바와 같이, 특정 조직에서의 유전자 발현을 평가하기 위해 cDNA 라이브러리를 구축하고, 직접 선별과 같은 방법을 개발해서 게놈에 대해 이러한 cDNA 맵을 작성하기 위한 방법이 개발되어 왓다 (Lovett외, Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88:9628-9632). 유전자 발현 측정 및 엑손 맵 작성을 위해 엑손 트래핑과 같은 다른 방법도 마찬가지로 이용된다 (Buckler 외, Proc. Natl. Acad, Sci., 1991, 88:4005-4009). 유전자의 기능적인 분석을 위해, 훌륭하게 개발된 많은 기술과 시스템을 이용할 수 있다 (Christoffersen, nature BIotechnology, 1997, 15:484-484l Nemotoy, Japanese Journal of Clinical Medicind, 1998, 5691):224-232; Bussey, yeast, 197, 13(16):1501-1503). 본 발명은 또한 이렇게 선별된 DNA 서열의 프로테오믹스를 연구하는데도 이용될 수 있다.
돌연변이 생산은 유전자 기능을 연구하기 위한 강력한 수단이다. 선별된 유전자를 돌연변이시켜 마우스와 같은 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 만들기 위한 특정 벡터내로 클로닝시키고, 트랜스제닉 동물의 표현형을 이용해서 생체내에서 표적 유전자의 기능을 밝혀낼 수 있다 (Stewart, Molecular Medicine Today, 1997, 3(3):93; Hicks 외, Nature Genetics, 1997, 16(4)"338-344). 다른 한편, 특정 cDNA 코딩된 단백질의 활성을 예컨대 변형된 올리고 안티센스 억제법 (Milner & Southern, Nature Biotecnology, 1997, 15:537-541), 표적 서열-특이적 리보자임 억제법 (Duan외, Gene Therapy, 1997, 4:533-543) 또는 단일사슬 항체 (sFv) 기초한 세포내 면역화 접근법 (Duan외, Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91:5075-5079)과 같은 여러가지 기술에 의해 억제시킬 수 있다. 본 발명은 이러한 녹-아웃 (knock-out) 생명체의 선별된 cDNA 서열의 프로테오믹스를 연구하는데 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 생리학적으로 정상적인 바이오-샘플로부터 분리된 미리0선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플로부터 분리된 미리-선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 바이오0샘플의 비정상성은 영구적이거나 일시적인 것일 수 있으며, 유전적 변화나 그 외의 요인에 기인하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플을 특정 질병 또는 장해를 가질 위험성이 높거나 또는 갖는 걱으로 알려진 대상으로부터 얻는 것이 좋다.
특정 구체예에서, 본 발명은 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련한생리학적으로 식별가능한 마커들을 동정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음 단계로 이루어진다: 1) 상기 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플의 프로테오믹스 프로파일을 상기 설명된 방법을 통해 결정하고; 2) 상기 설명된 방법을 통해 필적할만한 생리학적으로 정상적인 바이오-샘플의 프로테오믹스 프로파일을 결정한 다음; 3) 상기 1) 단계에서 얻어진 프로테오믹스 프로파일을 상기 2) 단계에서 얻어진 프로테오믹스 프로파일과 비교해서 생리학적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련된 생리학적으로 식별가능한 마커를 동정한다.
본 발명을 다음에 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하나, 이들 실시예는 어디까지나 설명 목적을 위해 제공된 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
1. 이중 기능 발현 벡터의 제작
pS&DV 벡터를 만들기 위해, STRATAGENE Inc. (La Jolla, CA)로부터 구입한 pDual 벡터를 두가지 CMV/T 프로모터 발현 카세트의 증폭을 위한 주형 벡터로서 사용하였다. 100ul PCR 반응 튜브에서, 10ng pDual 플라스미드 DNA를 95℃로 5분간 가열한 다음 표준 PCR 반응을 이용해서 10 pM의 두가지 모두의 CMV-1 (5'CACCCTGAATTGACTCTCTTTC3') (SEQ ID NO:1) 및 PacII-1(5'ATATGAATTCTTAATTAAGATCTCCATGGTGGCCTCTCCTTC3') (SEQ ID NO:2) 올리고와 혼합하였다 (Promega PCR Kit). PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 1.45분간, 55℃에서 1.30분 동안, 72℃에서 2분 동안 40 사이클. 마지막으로, PCR 산물을 72℃에서 10분간 더 인큐베이션시켰다. 이 산물을 Fragment-I (0.75kb)라 이름붙였다. 두번째 튜브에서는, 올리고 PacI (5'CGCGGAATTCGCGGCCGCTACCAGGTAAGTGTACC3') (SEQ ID NO:3) 및 올리고 ter-2 (5'CGAGTAGTTTAAACAAAAAACCCCTCAAGTCCCG3') (SEQ ID NO:4)를 이용해서 10ng pDual 플라스미드 DNA를 상기한 조건을 이용해서 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 산물은 Fragment-II (0.6kb)라 명명하였다. 두가지 Fragmant I 및 II 모두 (각각 1 ug) EcoRI으로 절단한 다음 1% 아가로스에서 젤 정제시켰다. 이들 ㄷ개의 분획들을 T4 DNA 라이게이즈로 16℃에서 밤새 50 ul 부피중에서 라이게이션시킨 다음 5 ul 라이게이션 혼합물을 새로운 PCR 튜브에 옮겨넣고 상기한 바와 같은 동일 조건을 이용해서 PCR 증폭을 하기 위해 올리고 CMV-1 및 Ter-2와 혼합하였다. 1.36 kb PCR 산물을 PmeI으로 절단한 후, 이 1.36kb 단편을 PmeI 절단된 클로닝 벡터인 pT7*에 삽입하였다. 이 최종 벡터를 pS&DV라 명명하였다.
클로닝 벡터 pT7*을 만들기 위해, PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서, Novagen Inc.에서 구입한 정제된 pT7Blu(R) 플라스미드를 이용하였다. 100 ul PCR 반응 혼합물 중, 10 ng pT7Blu(R) 플라스미드를 이용해서, 2개의 올리고 T7A와 T7B를 반응물에 첨가하고 상기한 바와 동일한 조건을 이용해서 PCR을 수행하였다 (T7A: 5'AGATCTGTTTAAACCAGGTGGCACTTTTCGG3' (SEQ ID NO:5) 및 T7B:5'AGATCTGTTTAAACAGCTGTTTCCTGTGTGA3' (SEQ ID NO:6)). 이어서 2.1 kb PCR 산물을 BglII로 절단하고 자가-라이게이션을 위해 젤-정제시켰다. 얻어진 벡터를 pT7*으로 명명하였으며 이것은 2개의 독특한 PmeI 자리를 지니고 있다.
닭의 IgY Vh1 시그날 도메인 (MSPLVSSLLLLAALPGLMAA) (SEQ ID NO:7)을 갖는 pS&DV-S를 제작하기 위해, 2개의 올리고들을 다음과 같이 합성하였다: 링커-1: (5'AACCCTCTTCCATGAGCCCACTCGTCTCCTCCCTCCTGCTCCTGGCCGCCCTGCCAGGGCTGATGGCGGCC3') (SEQ ID NO:8), 링커-2 (5'CAGATCCTCTTCGAAGCTAGCGGCCGCGAATTCTTAATTAAGGCCGCCATCAGCCCTGGCAG3') (SEQ ID NO:9). 링커-1과 링커-2 올리고 각각 1ug씩을 Taq DNA 폴리머라제 없이 50 ul PCR 반응 조건하에 혼합하고 94℃에서 5분간 가열한 다음 서서히 실온으로 냉각시켰다. Taq DNA 폴리머라제 2.5 유닛을 첨가한 후, 상기한 것과 동일한 조건 하에서 PCR 반응을 수행하였으나, 단 10사이클만 수행하였다. 105 bp PCR 산물을 Eam1104-I로 절단하고 pDual 벡터의 Eam1140-1 자리에 삽입하였다. 얻어진 벡터를 pDual-S로 명명하였다. pDual-S를 DNA 주형으로 사용하여, CMV-1과 Ter-2 올리고를 이용해서 추가로 PCR 증폭시킴으로써 유전자 발현 카셋을 갖는 1.5kb DNA 단편을 만들었다. PmeI 절단 후, 1.5 kb DNA 단편을 pT7*벡터의 PmeI 자리에 삽입하여 이중 기능 벡터 pS&DV-S 벡터를 만들었다.
2. DNA 백신접종에 의해 유도된 생체내 면역 응답 메카니즘 설명
DNA 발현 카세트의 직접적인 세포내 접종은 숙주세포의 생체내 트랜스펙션을유도한다. 플라스미드-코딩된 단백질의 발현은 면역 응답을 이끌어낼 수 있다. 분비된 면역원은 식세포작용에 의해 소화되어 프로페셔널한 항원-제시 세포에 의해 펩타이드-MHC II 복합체로서 제시된다. 이들 세포들은 나이브 (naive) T 세포를 자극하는데 필요한 시토카인, 공동자극 리간드, 및 주요 활성화 시그날을 제공할 수 있다. ThO T 세포를 IL-4로 자극하면 Th2 CD4 헬퍼 T 세포가 발달되고, 이것은 시토카인을 분비시켜 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-10을 비롯하여, B 세포 발달을 촉진한다. ThO 세포를 예비염증성 시토카인 IL-12 및 IFN-로 자극하면 Th1 CD4+헬퍼 T 세포가 발달된다. 이 세포들은 CD8+세포독성 T 임파구의 개발을 촉진할 시토카인을 분비한다 (Koprowski외 DNA vaccination/genetic vaccination. 1998 Springer-Verlag Berlin Heidelberg).
3. 입자-매개된 DNA 전달 실험에 의해 면역화된 닭의 ELISA 적정 (titering)
도 5에 도시된 바와 같이, CMV 또는 SV40 프로모터에 의해 추진된 3가지 항원 cDNAs를 각각 이용하여 닭을 백신접종하였다. 이 실험에 사용된 닭의 종류는 Hy-line SC 종으로서, Hy-Line Inc. (Dallas Center, Iowa)로부터 얻었다.
매번 트랜스펙션을 위해, 0.5 mg의 황금 마이크로플레이트 상에 코팅된 1 ug의 벡터 DNA를 상술한 바와 같이 Kapton 마이크로 발사장치에 장착시켰다 (Williams 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88 2726-2730). 손잡이식 헬륨-추진 충격 유전자총을 이용해서 200 ng의 플라스미드에 상당하는 DNA를 표적 부위 (닭의 등 피부) 내로 전달하였다 (Sanford 외, Technique, 1991, 3:3-16). 유전자 총의내부 합력을 1200 psi로 조정하였다. DNA 주사 후, 여러가지 여러날 동안, 면역화된 닭으로부터 달걀을 채집해서 -4℃에 저장한 다음 8절에 설명된 프로토콜에 따라 IgY를 정제하였다. 이 실험에서, 동일한 양의 플라스미드 DNA를 반복 주사해서 항원에 대한 숙주의 면역응답을 관찰하였다.
면역화된 닭으로부터 유도된 항체의 결합 친화도 및 특이성을 분석을 위해, E. coli로부터 상응하는 각각의 항원, 즉, HbxAg, HBV-pol 및 CD34를 정제하기 위해서, HbxAg 유전자를 pET31내로 클로닝시켰다 (Wu 외, Cell, 1990, 63:687-695). HBV 폴림라제 단백질의 RNase H 도메인을 Pol-1 및 Pol-2 올리고를 이용해서 PCR 증폭시키고, pET28a NdeI-HindIII 자리로 삽입하였다. 다음 절에 설명되는 바와 같이, 인간의 CD34 cDNA를 얻어서 PET 28a 벡터에 삽입하였다. 모든 pET 벡터들은 Novagen Inc.로부터 구입하였다. 각 제작물을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 재조합 단백질 발현을 Novagen Kit Instruction에 따라 분석하였다 (Studier 외, Methods Enzymol. 1990, 185:60-89도 참조). 요약하면, 제작된 플라스미드를 Bl21 (DE3) 컴피턴트 세포로 형질전환시키고, 클론들을 카르베니실린 (Sigma Inc. cat# C1389) 또는 카나마이신을 함유하는 3ml LB 배지내로 옮긴 다음 37℃에서 밤새 배양하였다. 이틀째 되는 날, 배양물을 선별용 500 ml LB 배지에 옮기고 37℃에서 OD600이 0.45가 될 때까지 진탕시켰다. 이어서 0.2mM IPTG를 박테리아 배양체에 첨가하고 박테리아 세포들을 2시간 더 배양하였다. 세포들을 얼음으로 5분간 냉각한 다음 4℃에서 5000 x g에서 5분간 원심분리시켜 세포를 수확하였다. 세포 펠렛을 차가운 PBS 완충액으로 1회 세척하였다. 세포들을 50ml Tris-완충액 (50mM Tris-HCl, 2mM EDTA, pH 8.0) 중에 재현탁시키고 소니케이션에 의해 파열시켰다. 소니케이션된 샘플을 4℃에서 5000 x g에서 5분간 원심분리시킴으로써 가용성 분획과 불용성 (펠렛) 분획으로 분리시켰다. 펠렛을 100ug/ml 리소자임과 5ml 1% 트리톤 X-100을 함유하는 45 ml Tris-완충액에 재현탁시키고, 가용성 샘플과 불용성 샘플 10ul를 12.5% SDS-PAGE (BioRad 미니-젤 시스템)상에 로딩시켰다. 대조군으로는 형질전환되지 않은 박테리아 샘플을 사용하였다. 젤 염색결과 세균 발현된 세가지 모든 단백질, 즉, HbxAg, HBV-pol 및 CD34는 주로 불용성 분획에서 발견된 것으로 나타났다.
4℃에서 교반하면서 8M의 최종 농도로 우레아를 50 ml 불용성 분획에 서서히 첨가하였다. 펠렛이 완전히 용해된 후, 샘플을 4℃, 5000 x g에서 5분간 더 원심분리시켜 펠렛을 제거하고, Novagen Inc.사의 키트에 제시된 프로토콜을 이용해서 재조합 단백질의 정제를 위해 3 ml His-Bind Resin 컬럼 상에 상등액을 로딩시켰다. 세척 단계 후, 정제된 단백질을 6M 우레아를 함유하는, 10ml 1 X 스트립 완충액으로 컬럼으로부터 용출시켰다. 정제된 단백질 샘플을 투석 튜브에 옮기고 4L 부피에서, 4℃에서 PBS에 대해 밤새 투석시켰다. 마지막으로, 투석 튜브 중의 단백질 샘플을 Amicon 스핀 농축 컬럼 (Amicon Inc., MW 컷: 10,000 달톤)에 의해 1 ml 부피로 더 농축시켰다. 단백질 농도를 검사한 후, 3ul의 정제된 단백질을 12.5% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 분자 농도계 (Molecular Dynamic Inc.)를 이용한 단백질 밴드의 밀도로 측정된 재조합 단백질의 순도는, 93%가 넘었다.
200 ul PBS 완충액 중, 박테리아에 의해 생산된 정제된 항원 단백질 5 ug을 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트상에 코팅시켰다. 코팅된 웰을 PBS로 1회 세척한 후, 5% BSA 용액 200 ul 용액을 추가로 첨가해서 분석 중 비-특이적인 결합을 차단하는데 이용하였다. DNA 면역화 후 PEG 방법에 의해 정제된 닭의 IgY (1 mg/ml)(8절 참조)를 계대희석하고, 각각의 코팅된 웰내로 첨가한 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS 완충액으로 5회 세척한 후, HRP-표지된 염소의 항-닭 항체 (Sigma Inc., 1:10000배 희석)을 웰에 첨가하고 1시간동안 인큐베이션하였다. PBS로 5회 세척후, 기질 완충액을 첨가하고 15분간 인큐베이션하면서 매 5분마다 ELISA 판독하였다.
도 5에서, 각각의 막대는 각각의 닭들을 나타낸다. 도 5A에서,닭을 pCMV-HBx 벡터로 면역시키고; 도 5B에서는 닭을 pCMV-HBV-pol 벡터로 면역시켰으며; 도 5C에서는, 닭을 pZeoSV2-hCD34로 면역시켰다. 분석 시점은 다음과 같다: 면역전 (Pre); 또는 부스트 1 (B1), 부스트 2 (B2) 및 부스트 3 (B3)후 12일. 복수의 DNA 백신 숙주 면역-반응 데이타의 분석결과, DNA를 1회 주사한지 12일 후, 닭에 특이적인 항체 생산수준은 이미 검색가능한 정도에 도달한 것으로 나타났다.
4. pCMV-HBx 발현 벡터의 제작
간염 B X 유전자 발현 벡터의 제작은 다음과 같이 수행하였다. pTKHH2 DNA (HBV 완전한 길이의 바이러스 게놈 다이머 플라스미드) 10 ng을 100 ul PCR 반응튜브 중에서 MF18 (MF18: 5'GGAAGCTTGCCGCCATGGCTGCTAGGCTGTGC3') (SEQ ID NO:10) 및 MF19 (MF19: 5'GTGGAGACGGATTAGTACCATGGCC3') (SEQ ID NO:11)와 혼합하였다. 다음조건 하에서 HBV 폴리머라제 유전자를 PCR 증폭시켰다: 95℃에서 1.30분, 55℃에서 1.30분 및 72℃에서 2분; 총 40 사이클. 최종적으로, PCR 산물을 72℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 488 bp PCR 산물을 젤 정제한 다음 HindIII와 KpnI으로 절단하였다. 절단된 HBx 단편을 포유류의 발현 벡터 pTTW-1 벡터 (Condreay 외, J. Virology, 1990, 64:3249-3258)에 삽입하고, 이를 동일 효소로 절단하여 pCMV-HBx 플라스미드를 얻었다.
pCMV-HBx를 인간의 간세포성 (hepatocellular) 육종 세포주인 HepG2 세포에 형질전환시킴으로써 HBx 단백질의 발현을 테스트하였다. 1 x 106HepG2 세포를 10% 소의 태아 혈청이 보강된 10ml DMEM 배지 중 10 cm 배양 접시에서 37℃, CO2인큐베이터에서 밤새 접종하였다. 트랜스펙션하기 4시간 전, 10% 소의 태아 혈청이 보강된, 10 ml의 갓 제조하여 예열시킨 DMEM 배지를 갈아주었다. 5 ug의 정제된 pCMV-HBx 플라스미드를 제조업자의 프로토콜 (Promega Inc/ 칼슘 트랜스펙션 키트)에 따라 칼슘 침전 혼합물중에 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 30분간 침전시킨 후, 혼합물을 HepG2 세포내로 서서히 적가하여 12시간 배양하였다. 다음날, 10ml 예열시킨 갓 만든 배지를 갈아주고 세포를 하루 더 배양하였다.
트랜스펙션된 세포들을 10 ml 차가운 PBS 완충액으로 세척하고 1.5 ml PBS 중 러버 폴리스맨을 이용해서 세포를 수집하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 100 ul H2O에 재현탁시키고, 20 ul 세포 샘플을 동 부피의 SDS-PAGE 로딩 완충액과 혼합한 다음 3분간 끓였다. 끓인 샘플을 2분간 최대-속도 Eppendorf 원심분리시키고SDS-PAGE 분리를 위해 5 ul의 상등액을 12.5% 젤 상에 로딩시켰다. 특이적인 토끼의 항-HBx 항체 (1:800 희석)를 이용한 웨스턴 블롯 분석결과추출된 세포 단백질은 HBxAg 발현에 대해 양성인 것으로 입증되었다 (Wu외, Cell, 1990, 63:687-695).
5. B형 간염 폴리머라제 항원 특이적인 발현 벡터의 제작
B형 간염 폴리머라제 (HBV pol) 유전자 발현 벡터는 다음과 같이 제작하였다. 제 4절에 설명된 바와 같이, 100 ul PCR 반응물에서, pTKHH2 플라스미드 DNA 주형을 올리고 MF26 (5'AAGAGCTCGCCACCATGGCCCTATCCTATCAAC3') (SEQ ID NO;12) 및 HBVpol-2 (5'TCACCTTAAGGTGTTGGAAGGTGGTTTGA3') (SEQ ID NO: 13)와 혼합하였다. 868 bp의 HBV pol 5' 말달 DNA 단편을 젤 정제한 다음 SalI과 EcoRI으로 절단한 후, 동일 효소에 의해 절단된 pGEM3Z 벡터 (Promega Inc.)에 삽입하여, 플라스미드 pGEM3Zpol-5'를 제조하였다. 다음의 올리고, 즉, Pol-3 (5'GGCCATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCC3') (SEQ ID NO:14) 및 Pol-4 (5'AACCAAGCTTCACGGTGGTCTGGATGCAAC3') (SEQ ID NO:15)와 혼합된 pTKHH2 플라스미드를 이용해서, pTKHH2 벡터로부터, HBV 폴리머라제 DNA 단편의 또 다른 1638 bp 3' 말단을 PCR 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 EcoRI 및 HindIII로 절단하였다. 절단된 단편을 pGEM3Zpol-5'EcoRI-HindIII 자리에 삽입하여 총 2874bp 길이의 HBV 폴리머라제 유전자를 만들었다. 얻어진 플라스미드를 p3Zpol이라 명명하였다. HBV 폴리머라제 유전자를 SacI으로 먼저 절단한 다음, klenow 반응으로 충전시켜 (Sambrook외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor Press, 1989) 블런트 엔드를 형성하였다. SalI으로 다시 절단한 후, 완전한 길이의 폴리머라제유전자를 pCl 벡터 (Promega Inc.)내로 삽입하고, 이것을 MuII으로 절단하여, 블런트화시킨 다음 SalI으로 절단하여 pCl-HBV-pol 발현 벡터를 만들었다.
HBV 폴리머라제 단백질의 발현 역시 4절에 설명된 바와 같이 인간의 간암 세포주 HepG2에 pCl-HBV-pol을 트랜스펙션시킴으로써 시험하였다. 특이적인 토끼의 항-HBV 폴리머라제 펩타이드 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석결과, 추출된 세포 단백질은 양성인 것으로 입증되었다 (Feitelson 외, Clinics In Laboratory Medicine, 1996, W. B. Saunders Com).
6. pZeoSV2-hCD34 발현 벡터의 제작
DNA 백신접종을 위한 인간의 CD34-완전한 길이의 cDNA를 얻기 위해, CD34 양성 세포주 KG-1a을 RNA 추출에 이용하였다 (Simmons 외, J. Immunol. 1992, 148:267-271). Puissant 등의 Bio Technoniques, 1990, 8:148-149 에 설명된 기술을 약간 변형시켜, 1x106개의 배양된 KG-1a 세포로부터 총 RNA를 정제해냈다. 요약하면, 2 x 106개의 배양된 KG-1a 세포를 5 ml 완충액 (4M 구아니딘 티오시아네이트, 25mM 소듐 시트레이트, 0.5% 사르코실, 0.1M 2-머캅토에탄올, pH 7.0)에 현탁시켰다. 다음의 시약을 첨가하고, 튜브를 와동시켜 천공하였다: 2M 소듐 아세테이트 pH 4.0 (0.5 ml), 페놀 (5ml), 및 클로로포름 (1ml). 15분간 얼음에서 인큐베이션한 후, 튜브를 10,000g (7,000rpm)으로 10분간 원심분리하였다. 이소프로판올 (5ml)을 상층에 첨가하고 얼음상에서 10분간 인큐베이션한 다음 상기와 같이 원심분리하였다. RNA 펠렛을 1 ml 4M LiCl에 용해시키고 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 원래의 튜브를 0.5ml LiCl로 헹군다음 펠렛을 5분간 결합 액체 중에서 와동시켰다. RNA를 원심분리 (10분)에 의해 펠렛화시키고, 1ml 4M LiCl에 재현탁한 후 다시 펠렛화시켰다. 펠렛을 TE/0.5% SDS에 완전히 재현탁하고 동 부피의 클로로포름/이소아밀알코올 (24:1)로 추출하였다. 2M 소듐 아세테이트 (0.1ml)과 이소프로판올 (600ul)을 첨가함으로써 RNA에 의해 침전시키기 전에 수층을 2번 추출하였다. RNA를 펠렛화시키고 물에 재현탁시켰다.
제조업자의 프로토콜 (BRL Life Science Inc., RT kit)에 따라, 올리고 dT18프라이머를 이용해서 역전사 (RT) 반응을 위해 1 ug의 정제된 총 RNA를 이용하였다. 완전한 길이의 인간 CD34 cDNA를 올리고 hCD34-1 (5'GAAGGATGCTGGTCCGCAGGGG3') (SEQ ID NO:16) 및 hCD34-2 (5'CACCTAGCCGAGTCACAATTCG3') (SEQ ID NO:17) 프라이머를 이용해서 PCR 증폭시켰다. PCR 반응은 다음 조건 하에서 수행하였다: 95℃에서 1.30분, 53℃에서 1.30분, 72℃에서 2분; 및 총 40 사이클. 마지막으로, PCR 산물을 72℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 1.2kb PCR 산물을 HincII 절단된 pUC18 벡터 (Pharmacia Inc)에 직접 삽입하였다. ABI 373 DNA 시퀀서 및 M13 프라이머를 이용하여 DNA 시퀀싱 분석하자 얻어진 플라스미드 pUC18-hCD34는 완전한 길이의 hCD34서열을 함유하는 것으로 확인되었다.
HindIII 및 EcoRI으로 pUC18-hCD34를 절단한 후, 1.2 kb hCD34 단편을 젤 정제하고 HindIII 및 EcoRI 자리를 통해 포유류의 발현 벡터 pZeoSV2+ (InvitrogenInc.)내로 삽입하여 벡터 pZeoSV2-hCD34를 만들었다. pZeoSV2-hCD34의 발현은 HeLa 세포내로 이것을 트랜스펙션시켜 마우스의 항-인간 CD34 모노클로날 항체 (Pharmacia Inc., CA)로 면역염색함으로써 확인하였다.
7. HbxAg에 대한 닭 항체의 효소-결합 면역분석
3절에 설명된 바와 같이 DNA 백신접종으로부터 생산된 닭의 항-HBx 항체를 분석하기 위해 이 실험에서는, 정제된 E. coli 유래 HBxAg 항원을 이용하였다. 200 ul PBS 완충액 중 정제된 HbxAg 항원 5 ug을 ELISA 플레이트 웰 (Nalge Nunc Internation., Rockester, NY) 상에서 밤새 코팅하였다. PBS 완충액으로 세척한 후, 5% BSA 200ul를 첨가하여 분석 중 비-특이적인 결합을 차단하기 위해 웰을 코팅하였다. 닭의 항체를 0.1% 소의 혈청 알부민을 함유하는 PBS 완충액 중에 계대 희석하고 2시간 동안 HbxAg 항원 으로 코팅시킨 마이크로타이터 플레이트 중에서 인큐베이션시켰다. PBS 완충액으로 5회 세척한 후, HRP-표지된 염소의 항-닭 항체 (Sigma Inc., 1:10000 희석)을 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS로 다시 5회 세척한 후, 기질 완충액을 첨가하고 15분간 인큐베이션시키면서 매 5분마다 ELISA 판독하였다. 이 값들은 중복 샘플의 평균치이다. 도 9는 DNA 백신접종에 의해 HBxAg 항원에 대해 매우 높은 결합 친화도를 갖는 닭의 항체가 생산되었음을 나타낸다.
8. DNA 면역화된 닭의 난황으로부터 닭의 IgY의 정제
Hyline Inc. (Dallas Center, Iowa)의 알 낳는 암탉을 보통의 명주기 (light cycles)로 유지시켰다. 3절에 설명된 바와 같이 pCMV-HBx 벡터를 1회 주사함으로써닭을 면역화시킨지 20일 후부터, 10번째 알이 얻어질 때까지 알을 수집하였다. Polson등, Immunol. Commun., 1980, 9:475-493에 설명된 방법에 따라 IgY를 추출하였다. 요약하면, 난백으로부터 난황을 분리하고 구배 실린더 내로 깔때기를 통해 드로핑시킴으로써 파괴시켰다. 동 부피의 완충액 (0.01M 포스페이트, 0.1M NaCl, 및 0.01% NaN3, pH 7.5)를 첨가하여 교반하였다. 분쇄된 PEG 6000 (Sigma Inc.)을 3.5% 농도로 첨가하고 용해될 때까지 교반하였다. 형성된 단백질 침전물을 13,000 g에서 10분간 원심분리하여 펠렛화시켰다. 상등액을 따라내고 무명천을 통해 걸러낸 다음 PEG 6000을 첨가해서 최종 농도가 12%가 되도록 하였다. 이 혼합물을 완전히 교반하고 13,000g에서 10분간 다시 원심분리하였다. 0.01M-포스페이트-0.1M NaCl (pH 7.5) 중에서 본래의 난황 부피로 펠렛을 재용해시키고 PEG 6000을 2번째 침전을 위해 12%까지 첨가하였다. 상등액을 따라내고 펠렛을 2회 원심분리하여 PEG 6000을 삼출시켰다. 이 마지막 IgY 펠렛을 50mM Tris-0.1 mM EDTA-25% 글리세롤-0.02% NaN3(pH 7.9)에 용해시켰다.
추가 정제를 위해, 0.015 M KPO4(pH 8.0)에서 흡착시킴으로써 IgY를 DEAE-셀룰로스상에서 정제시키고 0.015-0.3 M KPO4(pH 8.0) 구배를 이용해서 용출시켰다. 4 ug의 정제된 샘플을 4-20% 폴리아크릴아미드 구배 젤 (BIO-RAD 시판 미니-젤)상에서 분리한 다음 은 염색으로 가시화시켰다 (Sambrook 외, Molecular Cloning, 2판, Plainview, N.Y., Cold Spring Harbor Press, 1989). 정제 결과를 도 10에 나타내었다. 레인 1은 PEG 침전을 통해 정제된 IgY이고 레인 2는 DEAE-셀룰로스에 의해 정제된 IgY이다. H 및 L은 면역글로불린의 헤비 체인과 라이트 체인의 위치를 각각 나타낸다.
9. 면역블롯 분석에 의해 측정된 암탉에서의 항-HBx 생산의 시간적 경과
도 10은 DNA 백신접종에 대한 숙주 면역응답의 시간경과를 도시한 것이다. 항-HBx 항체 수준을 정제된 E. coli-유도된 재조합 HbxAg 항원을 이용하여 분석하였다. 정제된 E. coli-유도된 재조합 HBxAg 항원 1웰 당 8 ug을 (3절에 설명된 바와 같이) 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 분리시킨 다음 제조업자의 프로토콜 (Bio-Rad 미니-젤 키트)에 따라, 분리된 단백질을 PVDA 막에 옮겼다. 8절에 설명된 바와 같이 PEG 6000 침전에 의해 정제된 난황 항체를 Tris-완충액 염수 중에 1:1200으로 희석하고 PVDA막에 10ml 정제된 IgY용액을 적용한 다음 37℃에서 2시간 인큐베이션시켰다. PBS 완충액으로 5분간 세척한 후, HRP 표지된 염소의 항-닭 항체 (1:8000 희석, Sigma Inc.) 용액 20ml에 옮긴 다음 37℃에서 1시간 동안 막을 인큐베이션시켰다. PBS 완충액으로 다시 5회 세척한 후, Enhanced Chemiluminescence 시스템 (PIERCE Inc. ECL 키트)를 이용해서 면역블롯 분석을 수행하였다. 도 11은 DNA 백신접종 12일 경과 후, 닭의 항-HBx 항체가 검색가능한 수준에 달하였음을 보여준다.
10. 닭의 B 세포를 불멸화시키는데 이용된 (plmmo)의 지도
인간의 B 세포는 EBV 감염에 의해 불멸화시킬 수 있고 마우스 B세포는 p53 및 Ras 온코진 (oncogene)과 같은 온코진의 트랜스펙션에 의해 직접 불멸화시킬 수 있다. 레트로바이러스 벡터 형질도입 시스템, 특히, 휴지기 세포를 감염시킬 능력이 있는 랜티바이러스 (lantiviral) 벡터 시스템을 이용하여 닭의 특이적인 온코진(들)을 불멸화시키기 위해 닭의 B 세포를 선별한다. 닭의 세포를 형질전환시키는데는 ASV (Avian Sarcoma Virus: 조류 육종 바이러스)에 기초한 벡터가 널리 사용되어왔다 (Kaplitt 외, Viral Vectors, Academic Press, 1995). 이 절에서는 닭의 B 세포 불멸화에 이용될 수 있는, 닭의 돌연변이체 p53 또는 Ras 유전자 단편을 함유하는 HIV-기초 벡터의 제작과정을 설명한다.
새로운 랜티바이러스 벡터에 기초한 닭의 B 세포 불멸화 벡터의 제조방법의 상세한 과정을 다음에 설명한다. HIV-1에 기초한 랜티바이러스 벡터 (Naldini외, Science, 1996, 272:262-268)를 새로운 벡터 제작을 위한 출발 물질로서 사용한다. 다음의 2가지 올리고: 즉 Cp53-1 (5'ATGGCGGAGGAGATGGAACCA3') (SEQ ID NO:18) 및 Cp53-2 (5'TCAGTCCGAGCCTTTTTGCAGCAG3') (SEQ ID NO:19)를 이용해서 닭의 돌연변이 p53 온코진을 PCR 증폭시킨다 (Soussi 외, Nucleic Acids Research, 1988, 16:11383). 완전한 길이의 닭의 돌연변이체 053 온코진을 젤 정제하고 pT7 Bleu(R)벡터 (Novagen Inc.)에 삽입하여 pT7-p53을 만든다. 400 bp Cap-독립적인 번역 증진 (CITE) DNA 단편을 pCITE-5b(+) 플라스미드 (Novagen Inc.; Parks외, J. Virol., 1986, 60:376-384)로부터 PCR 증폭시켜서 p53 온코진의 하류에서 pT7-p53 벡터내로 삽입하여 pT7-p53-CITE 벡터를 제조한다. 2개의 올리고, 즉, C-Ras-1 (5'ATGACCGAGTACAAGCTG3') (SEQ ID NO:20) 및 C-Ras-2 (5'TCACGATATCACGCATTTACAG3') (SEQ ID NO:21)을 사용해서, 닭의 Ras 온코진을 PCR에 의해 증폭시키고 Ras 온코진 DNA 단편을 pT7-p53-CITE 내로 삽입하여 이중 온코진 발현 벡터: pT7-p53-CITE-Ras를 제조하였다.
HindIII-XhoI으로 절단함으로써, HIV-1 벡터 중 LacZ 유전자 DNA 단편을 닭의 돌연변이 p53-CIE-Ras 온코진 DNA 단편으로 대체시킴으로써 발현 벡터 pHIV-1-Ch-p53-Ras를 만들었다. 두개의 온코진을 CITE DNA 단편과 링크시켜, 온코진의 발현을 단일 CMV 프로모터 하에서 추진한다.
HIV-1 바이러스 숙주 세포 특이성 문제는 소포성 구내염 바이러스의 G 단백질 (VSV-G)을 이용해서 슈도타이핑시킴으로써 극복하였다. 이 랜티바이러스 벡터의 형질도입 효율을 테스트하기 위해, HIV-1기초 랜티바이러스 벡터 트랜스펙션 스톡을 생산하는 실험을 다음과 같이 실시하였다. 5 ug의 pCMV-VSV-G 플라스미드, 5 ug의 HIV-1 헬프 플라스미드 pCMV*R9 및 10 발현벡터 pHIV-lacZ을 혼합하고 칼슘 침전공정을 이용하여 1 x 106293 세포내로 트랜스펙션시켰다 (Promega Inc.) 100mm 세포 배양 디시에, ATCC로부터 얻은 1 x106293 세포를 접종하고 37℃, 10% FCS 보강된 DMEM 배지와 함께 표준 세포배양 환경 하에서 5% CO2인큐베이터에서 배양시켰다. 트랜스펙션하기 4시간 전에 10% FCS 배지를 교환하였다. 트랜스펙션 12시간 후, 10ml의 신선한 예열된 배지를 갈아주고 48시간 후, 상등액을 수집해서 동 부피의 FCS와 혼합시켜 바이러스 원액 샘플을 -80℃에서 보관하였다. 다른 한편, 바이러스 원액을 Chen 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93:10057-10062에 설명된 프로토콜에 따라 생산하였다.
닭 세포를 위한 랜티바이러스 벡터의 형질도입은 다음과 같이 테스트하였다. 5 x 105SL-29 세포 (ATCC로부터 얻은 닭의 배 섬유아세포)를 5% FCS가 보강된 MEM 배지와 함께 10 ml 배양 디시에 접종하였다. 다음날, 100 ul의 계대희석된 HIV-1-LacZ 바이러스 원액을 SL-29 배양체에 첨가하고 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 변이체 제어를 위해 모든 샘플을 중복적으로 작동시켰다. 세포들을 PBS 완충액으로 한번 세척한 후, 형질도입된 세포를 0.25% (PBS 중 v/v) 글루타르알데히드 용액으로 15분간 교정한 후, X-Gal 용액 (1mg/ml X-Gal, 2mM MgCl2, 5mM K4Fe(CN)6-3X H2O, 5mM K3Fe(CN)6)으로 37℃에서 2시간 동안 염색하였다. 청색-염색 세포를 계수함으로써, 이 실험에서 슈도타잎 랜티바이러스 원액 역가는 1.32 x 105/ml인 것으로 측정되었다.
DNA 백신접종된 닭의 비장의 B 세포를 다음과 같이 불멸화시켰다. 닭의 비장 세포를 수집하고 Hypaque-Density Ficoll 구배법 (Sigma Inc)를 이용해서 정제하였다. PBS 완충액으로 3회 세척한 후, 1 x 105혼합된 B 세포를 1ml MEM-10% FCS 배지 중 6 웰 플레이트에 접종하고 2ml 바이러스 원액과 밤새 직접 혼합하였다. 바람직학는 바이러스 원액 상등액을 5 mM dNTP 및 2mM 스퍼미딘으로 37℃에서 2시간 동안 처리하여 바이러스 감염성을 높이는 것이 좋다 (Zhang 외, J. Virology, 1995, 69:3929-3932). B 세포 배양체 내로 4 ug/ml 폴리브렌 (Sigma Inc)을 첨가하여 바이러스/세포 인큐베이션 동안 바이러스 형질도입 효율을 개선시켰다. B 세포를 37℃에서 밤새 바이러스 용액과 함께 인큐베이션시킨 다음, B 세포를 96 웰 플레이트 (400-500 닭의 B 세포/웰 20 Gays로 조사됨) 중 피딩 (feeding)를 함유하는 단일 웰 배양체 (10세포/웰) 내로 희석하였다. 형질전환된 세포들을 2 내지 3주일간 인큐베이션시키고, 상기한 바와 같이, 다 자란 세포 상등액을 먼저 IgY 항체 (Davis Ed., Methods in Molecular Biology, Monoclonal Antibody Protocols, 1995, Human Press) 생산을 위해 테스트하거나, 또는 ELISA를 이용해서 특이적인 항원 결합 IgY를 스크리닝하였다.
11. 비-표준화된 인간의 간-유래된 cDNA 라이브러리에서의 하우스키핑 유전자의 발생비율 측정
이 실험에서는, 단일 라운드 DNA 시퀀싱에서 하우스키핑 유전자의 발생비율을 측정하였다. 2개의 간에 특이적인 cDNA 라이브러리를 각각 Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA), 카탈로그 #:A550-39 및 Clontech Inc. (Palo Algo, CA), 카탈로그 #:HL400 2A2로부터 구입하였다. 라이브러리 원액 1 ul를 500 ul LB 배지에 옮긴 후, 10 ul를 이용하여 선택용 항생제를 함유하는 LB 플레이트에 분무하였다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 각각의 cDNA 라이브러리로부터, 300개의 개별적인 클론을 픽업해서 3 ml LB중에서 밤새 진탕배양하였다. Quigen Tip20 키트 를 이용해서 각각의 플라스미드를 제조하고 라이브러리 제조업체가 추천한 프라이머를 이용해서 AB1377 자동화 DNA 시퀀싱 시스템에 의해 1 ug 플라스미드 DNA를 시퀀싱하였다. GenBank 데이타베이스에 대해 서열 데이타를 분석함으로써 이 시퀀싱 데이타를 분석하였다. 이 데이타를 다음 표 1에 요약하였다.
인간의 간 cDNA 라이브러리에서의 여분의 전사체
유전자 이름 빈도
NADH-데히드로게나제 체인 7.2
알부민 4.8
액틴 4.0
ATPase 4.0
α-튜불린 3.2
시토크롬 옥시다제 체인 2.1
연장 팩터 1α 1.0
미오신 라이트 체인 1.0
알돌레이즈 0.8
12. 항체-칩의 프로토타입 구조
특이적인 항원에 의해 자극된 후, 각각의 숙주 B 세포는 항원 특이적인 순차적인(sequential) 도메인, 또는 배좌구조 (conformational structure) 도메인에 결합된다. 폴리클로날 항체는 다중 결합 부위를 통해 특이적인 항원과 결합한다. 고체 매트릭스 지지체 상에 특이적인 항체 그룹으로 구성되어 있는 항체-칩을 이용해서 단백질 샘플 용액 중에서 유리 표적 단백질 (항원)을 포획할 수 있다. 세척단계 후,폴리클로날 항체의 다중 결합 도메인때문에, 그리고 ECL 시스템 또는 레이저 방출 시스템 (플로우사이토미터)과 같이 효소의 기질과의 결합 시그날 밀도를 측정하기 위해 HRP와 같은 효소, 또는 형광염료 (FITC 또는 C3)와 같은 검색가능한 마커와 컨쥬게이트된 동일한 항체 그룹을 위의 포획 항체들가 추가 결합하는데 이용할 수 있다. 이와 대조적으로, 만일 상기 포획 및 표지-결합 단계가 모노클로날 항체를 이용하여 수행되는 경우에는, 특이적인 항원에 대한 모노클로날 항체의 단일결합 도메인으로 인해, 결합 효율이 매우 낮다. 비록 이러한 문제점은 모든 단일 항원에 대해 2개의 모노클로날 항체를 사용함으로써 이론적으로 해소가능하지만, 각각의 상이한 모노클로날 항체를 특징화하는데는 극히 시간이 많이 걸리므로 거의실용화될 수 없다.
본 발명의 AMIAP을 이용하여, 미지의 단백질 또는 기능적으로 정의되지 않은 단백질에 대한 복수개의 항체를 생산할 수 있다. 각각의 IgY 항체으 정제 후에, 각각의 항체를 2개의 분획으로 나누어서 분획중 하나를 바이오틴으로 표지할 수 있다 (PIERCE Inc. IL. EZ-Link Biotinylating Reagensts). 2개의 동일한 고체 지지체 매트릭스 상에 수백 또는 수천개의 특이적인 비표지 항체를 개별적이로 무작위적으로 스포팅한다 (예컨대, PVDF 막 또는 마크된 각각의 유리 구슬 상의 1 스팟 당 각각의 항체 1 ug; 및 각각의 스팟 또는 구술은 공지의 항체를 나타냄). 스포팅딘 매트릭스를 5% BSA-PBS 완충액으로 블로킹시켜서 비-특이적인 결합 백그라운드를 감소시킨다. 세포-사이클 특이적인 조절 단백질을 표적화하는 항체 또는 G-커플링된 수용체 그룹 단백질과 같은 특정 항체군을 사용할 수 있다. 항체-칩은 밀봉된 플라스틱 백 안에서 4℃에서 공기-건조시켜 수개월간 보관할 수 있다. 실험을 수행하기 전에, 항체-칩을 PBS 완충액 중에 칩을 30분간 적셔서 활성화시킬 수 있다.
본 발명에 설명된 시스템은 두개의 샘플에서 표적 단백질의 발현을 비교하는데, (예컨대 간 종양 세포 대 정상적인 간 세포 또는 항암제로 치료된 인간의 폐암 세포 대 치료되지 않은 대조군 세포) 이용될 수 있다. 단백질 샘플 제조를 위해, 2개의 표적 세포 샘플 또는 조직을 PBS 용액 중에서 순한 세정제로 용해시키거나 또는 냉동 및 해동법을 이용해서 용해시킬 수 있다 (Sambrook외, Molecular Clonng, 2판, Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor press, 1988). 단백질 발현 대조를 위해 동일한 수의 세포를 이용할 수 있다. 다른 한편, 세포 용해물 (lysate) 샘플을 먼저 그으 단백질 농도에 대해 측정한 다음 동량의 단백질 샘플을 항체-칩상에 로딩시킨다. 대개, 각각의 분석 당, 용해물 샘플 하나 당 1 x 106세포 또는 50-100 ug 단백질이 이용된다.
각각의 단백질 샘플을 동일한 항체-칩에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 서서히 와동시키면서 인큐베이션시킨다. 도킹 (docking) 항체가 그의 표적 항원에 특이적으로 결합된 후, 간단한 세척 단계를 이용해서 미-포획 세포 단백질을 제거한다. 항체-칩을 PBS 용액으로 4시간 동안 세척하며, 1회 세척당 걸리는 시간은 15-30분이다.
세포의 표적 단백질이 막-결합 도킹 항체에 의해 포획되어, 샌드위치 패션으로서 기능하므로, 포획된 표적 단백질은 각각 본래 스포팅된 항체에 상응하는 바이오틴 표지된 항체의 혼합 용액에 의해 검색되며, 이를 37℃에서 2시간 인큐베이션시킨다. 포획된 바이오틴-표지된 항체의 시그날 밀도는 도킹 세포 단백질 수준 (항원) 수준과 연관되어 있다. 포획된 바이오틴-표지된 항체의 추가적인 정량화는 이 분석에서 항원 발현 수준을 나타낸다. PBS 완충액에서 5회 세척한 후, 항체-칩 상의 포획되지 않은 바이오틴-표지된 항체를 제거한다. 마지막으로, 아비딘 컨쥬게이트된 HRP (Sigma Inc. 2% BSA와 함께 PBS 중에 1:8000배 희석)를 첨가하여 15분간 인큐베이션시킨다. 항체-칩을 PBS 용액을 이용해서 6회 세척한 후 항체-칩을 ECL 기질 용액 (PIERCE Inc. IL)과 함께 침지시키고, 이 칩을 X-선 필름에 노출시킨다.
본 발명은 상기 설명된 특정 구체예에 한정되지 않는다. 실제로, 본문에 설명된 것 이외에 본 발명이 여러가지 다양한 방식으로 변형될 수 있다는 것은 전술한 설명으로부터 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 변형 역시 첨부된본 발명의 청구범위 내에 포함되는 것이다.
본 명세서에 인용된 여러가지 참고문헌과 그 내용은 본 발명에 참고되었다.

Claims (63)

1) 조류종에게, 상기 조류종에서 항원의 발현을 지향시킬 수 있는 프로모터에 작동적으로 링크된 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열, 또는 상기 항원을 코딩하는 mRNA 서열을, 상기 항원에 대한 상기 항체의 검출가능할 정도의 생산을 유도시키는데 충분한 양으로 전달하고;
2) 상기 조류종으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하여 이루어지는, 조류종에서 항원에 대한 항체를 생산하기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 조류종이 닭, 칠면조, 오리 및 거위 중에서 선택되는 방법.
제 2항에 있어서, 조류종이 닭인 방법.
제 1항에 있어서, DNA 또는 mRNA 서열을 조류종의 조직에 직접 전달하는 방법.
제 4항에 있어서, 조직이 근육인 방법.
제 4항에 있어서, 조직이 피부인 방법.
제 4항에 있어서, 조직이 점막인 방법.
제 4항에 있어서, DNA 또는 mRNA 서열을 주사, 유전자총 기술 또는 지질 매개 전달 기술에 의해 전달하는 방법.
제 1항에 있어서, DNA 또는 mRNA 서열을 조류종의 세포에 전달하여 DNA 또는 mRNA 서열을 함유하는 상기 세포를 조류종의 적절한 조직에 전달하는 방법.
제 9항에 있어서, 세포를 혈액 세포 및 비장 B 세포 중에서 선택하는 방법.
제 9항에 있어서, DNA 또는 mRNA 서열이 Ca3(PO4)2-DNA 트랜스펙션, DEAE 덱스트란-DNA 트랜스펙션, 전기영동, "LIPOFECTIN"TM시약을 이용한 트랜스펙션, 유전자총 기술 및 바이러스 유전자 전달 시스템 중에서 선택된 방법에 의해 세포에 전달되는 방법.
제 1항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 링크된 항원을 코딩하는 DNA 서열을 전달하는 방법.
제 12항에 있어서, DNA 서열이 플라스미드 형태인 방법.
제 12항에 있어서, 프로모터가 조류종의 내인성 프로모터인 방법.
제 12항에 있어서, 프로모터가 조류종에서 항원의 발현을 지향할 수 있는 바이러스 프로모터인 방법.
제 15항에 있어서, 바이러스 프로모터가 RSV LTR, MPSV LTR, SV40 IEP, CMV IEP, 비장 괴사 바이러스 LTR (SNV LTR) 및 메탈로티오네인 프로모터 중에서 선택되는 방법.
제 12항에 있어서, DNA 서열이 조류종에서 코딩된 항원의 분비를 지향하는 서열을 추가로 포함하는 방법.
제 17항에 있어서, 분비-지향 서열이 리더 서열인 방법.
제 18항에 있어서, 리더 서열이 조류종의 내인성 리더 서열인 방법.
제 18항에 있어서, 리더 서열이 닭의 IgY, 닭의 SPARC, 닭의 혈청 알부민 및 닭의 조직형 플라스미노겐 활성화제 (tPA) 중에서 선택되는 방법.
제 18항에 있어서, 리더 서열이 IL-1, CD4 및 MHC 중에서 선택된 방법.
제 1항에 있어서, 항원을 코딩하는 mRNA 서열을 전달하는 방법.
제 1항에 있어서, 조류종이 닭이고 항체를 닭의 난황으로부터 회수하는 방법.
제 23항에 있어서, 암모늄 설페이트 침전, 폴리에틸렌 글리콜 6000 침전, 또는 카프릴산 침전에 의해 난황으로부터 항체를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 조류종이 닭이고 닭의 항체-생산 B 세포로부터 항체를 회수하는 방법.
제 1항에 있어서, 항원이 분비된 단백질 또는 펩타이드인 방법.
1) 닭에게, 상기 닭에서 항원의 발현을 지향시킬 수 있는 프로모터에 작동적으로 링크된 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열, 또는 상기 항원을 코딩하는 mRNA 서열을, 상기 항원에 대한 상기 항체의 검출가능할 정도의 생산을 유도시키는데 충분한 양으로 전달하고;
2) 상기 닭으로부터 항체-생산 세포의 적어도 일부를 제거하며;
3) 상기 제거된 항체-생산 세포를 불멸화시키고;
4) 상기 불멸화된 항체-생산 세포를 증식시켜;
5) 상기 불멸화된 항체-생산 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체를 수확하는 단계를 포함하여 이루어지는, 닭에서 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 방법.
제 27항에 있어서, 2) 단계에서 제거된 항체-생산 세포가 닭의 비장 B 세포인 방법.
제 28항에 있어서, 닭의 비장 B 세포가 닭의 B 림포블라스토이드 세포주의 세포와 융합됨으로써 불멸화되는 방법.
제 29항에 있어서, 닭의 B 림포블라스토이드 세포주가 HU3R27, HU3R27N 및 R27H4 중에서 선택되는 방법.
제 28항에 있어서, 닭의 비장 B 세포가 온코진 형질전환에 의해 불멸화되는 방법.
제 31항에 있어서, 형질전환에 사용된 온코진이 돌연변이 닭 p53 온코진 또는Ras온코진인 방법.
도 3A 또는 도 3C에 제시된 플라스미드를 포함하는, 조류 및 박테리아 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터.
1) 조류 및 박테리아 세포에서 DNA 서열을 발현할 수 있는 이중-발현 벡터 내로 상기 각각의 DNA 서열을 클로닝시키고;
2) 상기 1) 단계에서 형성된 상기 이중-발현 벡터 중의 상기 DNA 서열을, 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 항원에 대한 항체를 검출가능한 양으로 생산 유도할 수 있는데 충분한 양으로 조류종에게 전달한 후, 상기 조류종으로부터 상기 항체를 회수한 다음;
3) 상기 2) 단계에서 상기 조류종에게 전달된 상기 DNA 서열을 박테리아 세포에 전달한 후, 상기 박테리아 세포로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 회수하고;
4) 상기 2) 단계에서 회수된 상기 항체들과 상기 3) 단계에서 회수된 단백질 또는 펩타이드들 간에 면역반응을 수행하여 상기 항체들의 면역특이성을 검증한 후;
5) 상기 2) 단계에서 회수된 상기 항체들과 상기 바이오-샘플간의 면역반응을 수행해서 상기 미리-선별된 DNA 서열 세트들의 프로테오믹스 프로파일을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는, 바이오-샘플로부터 분리된, 미리-선별된 DNA 서열세트의 프로테오믹스 프로파일을 결정하기 위한 방법.
제 34항에 있어서, 미리 선별된 DNA 서열 세트가 cDNA 라이브러리인 방법.
제 34항에 있어서, 바이오-샘플이 인간 기원의 것인 방법.
제 34항에 있어서, 이중-발현 벡터가 도 3A 또는 도 3C에 제시된 플라스미드인 방법.
제 34항에 있어서, 조류종이 닭, 칠면조, 오리 및 거위 중에서 선택된 방법.
제 38항에 있어서, 조류종이 닭인 방법.
제 34항에 있어서, DNA 서열을 조류종의 조직에 직접 전달하는 방법.
제 40항에 있어서, 조직이 근육인 방법.
제 40항에 있어서, 조직이 피부인 방법.
제 40항에 있어서, 조직이 점막인 방법.
제 40항에 있어서, DNA 서열이 주사, 유전자총 기술 또는 지질 매개 전달 기술에 의해 전달되는 방법.
제 34항에 있어서, DNA 서열을 조류종의 세포에 전달하여 DNA 또는 mRNA 서열을 함유하는 상기 세포를 조류종의 적절한 조직에 전달하는 방법.
제 45항에 있어서, 세포를 혈액 세포 및 비장 B 세포 중에서 선택하는 방법.
제 44항에 있어서, DNA 서열이 Ca3(PO4)2-DNA 트랜스펙션, DEAE 덱스트란-DNA 트랜스펙션, 전기영동, "LIPOFECTIN"TM시약을 이용한 트랜스펙션, 유전자총 기술 및 바이러스 유전자 전달 시스템 중에서 선택된 방법에 의해 세포에 전달되는 방법.
제 34항에 있어서, 조류종이 닭이고 2) 단계에서 항체를 닭의 난황으로부터 회수하는 방법.
제 48항에 있어서, 암모늄 설페이트 침전, 폴리에틸렌 글리콜 6000 침전, 또는 카프릴산 침전에 의해 난황으로부터 항체를 정제하는 방법.
제 34항에 있어서, 조류종이 닭이고 2) 단계에서 항체를 닭의 항체-생산 B 세포로부터 회수하는 방법.
제 34항에 있어서, 박테리아 세포가E. coli세포인 방법.
제 34항에 있어서, 면역블로팅, 면역침전 또는in situ면역염색에 의해 면역반응을 분석하는 방법.
제 34항에 있어서, 5) 단계에서, 바이오-샘플 중 미리-선별된 DNA 서열 세트의 프로테오믹스 프로파일을 평가하는데 있어서, 미리-선별된 DNA 서열 세트에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드의 존재여부, 양, 서브세포 위치 또는 조직 발현 특이성을 결정하기 위해 면역반응을 수행하는 방법.
제 34항에 있어서, 미리-선별된 DNA 서열이 생리적으로 정상적인 바이오-샘플로부터 분리된 방법.
제 34항에 있어서, 미리-선별된 DNA 서열이 생리적으로 비정상적인 바이오-샘플로부터 분리된 방법.
제 34항에 있어서, CNA 서열이 코딩된 항원의 조류종에서의 분비를 지향하는 서열을 추가로 포함하는 방법.
제 56항에 있어서, 분비-지향 서열이 리더 서열인 방법.
제 57항에 있어서, 리더 서열이 조류종의 내인성 리더 서열인 방법.
제 57항에 있어서, 리더 서열이 닭의 IgY, 닭의 SPARC, 닭의 헐청 알부민 및 닭의 조직-타잎 플라스미노겐 활성화제 (tPA) 중에서 선택되는 방법.
제 58항에 있어서, 리더 서열이 IL-1, CD4 및 MHC 중에서 선택된 방법.
제 35항에 있어서, cDNA 라이브러리가 바이오-샘플 중에 분비된 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 방법.
1) 제 34항의 방법을 통해서, 생리적으로 비정상적인 바이오-샘플의 프로테오믹스 프로파일을 결정하고;
2) 제 34항의 방법을 통해서, 필적할만한 생리적으로 정상적인 바이오-샘플의 프로테오믹스 프로파일을 결정한 다음;
3) 1) 단계에서 얻어진 프로테오믹스 프로파일을 2) 단게에서 얻어진 프로테오믹스 프로파일과 비교해서 생리적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련된 생리적으로 식별가능한 마커를 동정해내는 단계를 포함하여 이루어지는, 생리적으로 비정상적인 바이오-샘플과 관련된 생리적으로 식별가능한 마커를 동정하는 방법.
도 12에 도시된 플라스미드를 포함하는, 닭의 항체-생산 세포를 불멸화시키기 위한 벡터.
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