JPH07313187A - 抗体作製法 - Google Patents
抗体作製法Info
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- JPH07313187A JPH07313187A JP10932994A JP10932994A JPH07313187A JP H07313187 A JPH07313187 A JP H07313187A JP 10932994 A JP10932994 A JP 10932994A JP 10932994 A JP10932994 A JP 10932994A JP H07313187 A JPH07313187 A JP H07313187A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
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- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗原蛋白質の精製を必要としない抗体作製法
を提供する。 【構成】 蛋白質に対して抗体を作製するにあたって、
該蛋白質をコードするＤＮＡを、動物細胞由来のプロモ
ーターを含む発現ベクターに組換え、次いで得られた発
現ベクターを動物に注射することを特徴とする、該蛋白
質に対する抗体の作製方法。 【効果】 上記の方法により、蛋白質をコードするＤＮ
Ａを用いて容易に抗体を作製することが可能であり、得
られる抗体は医薬、診断薬、研究試薬等として有用であ
る。
を提供する。 【構成】 蛋白質に対して抗体を作製するにあたって、
該蛋白質をコードするＤＮＡを、動物細胞由来のプロモ
ーターを含む発現ベクターに組換え、次いで得られた発
現ベクターを動物に注射することを特徴とする、該蛋白
質に対する抗体の作製方法。 【効果】 上記の方法により、蛋白質をコードするＤＮ
Ａを用いて容易に抗体を作製することが可能であり、得
られる抗体は医薬、診断薬、研究試薬等として有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原蛋白質の精製を必
要としない抗体作製法に関する。この方法により、医
薬、診断薬、研究試薬として有用な抗体を容易に作製す
ることができる。
要としない抗体作製法に関する。この方法により、医
薬、診断薬、研究試薬として有用な抗体を容易に作製す
ることができる。
【０００２】
【従来技術】抗体は、特定の蛋白質を認識して結合する
性質を有するため、蛋白質の検出、精製、除去、活性阻
害等の目的で、研究試薬として広く利用されている。最
近では、研究用試薬としてのみならず、医薬・診断薬と
しての用途も広がっている。抗体を作製するには、抗原
となる蛋白質を大量に精製した後、ウサギやマウスなど
の動物に注射し、血清中に産生される抗体を得るという
方法が取られてきた。しかし、精製抗原蛋白質を大量に
得るには、多くの時間と労力を要した。そこで、より簡
便な抗体作製法が望まれている。
性質を有するため、蛋白質の検出、精製、除去、活性阻
害等の目的で、研究試薬として広く利用されている。最
近では、研究用試薬としてのみならず、医薬・診断薬と
しての用途も広がっている。抗体を作製するには、抗原
となる蛋白質を大量に精製した後、ウサギやマウスなど
の動物に注射し、血清中に産生される抗体を得るという
方法が取られてきた。しかし、精製抗原蛋白質を大量に
得るには、多くの時間と労力を要した。そこで、より簡
便な抗体作製法が望まれている。
【０００３】最近、インフルエンザウイルス核蛋白質を
コードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを
ＤＮＡのままマウスの筋肉に注射すると、マウス体内で
ウイルス核蛋白質が生産され、しかも血清中にこの蛋白
質に対する抗体が産生されることが報告された（Ｕｌｍ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４
５−１７４９、１９９３；Ｇｉｎｓｂｅｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．、”Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９３”）。その結果、マウ
スがウイルスに対する免疫能を獲得することから、この
発現ベクターは新型のワクチン、すなわちＤＮＡワクチ
ンとして注目を集めている。
コードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを
ＤＮＡのままマウスの筋肉に注射すると、マウス体内で
ウイルス核蛋白質が生産され、しかも血清中にこの蛋白
質に対する抗体が産生されることが報告された（Ｕｌｍ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４
５−１７４９、１９９３；Ｇｉｎｓｂｅｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．、”Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９３”）。その結果、マウ
スがウイルスに対する免疫能を獲得することから、この
発現ベクターは新型のワクチン、すなわちＤＮＡワクチ
ンとして注目を集めている。
【０００４】これらの例で使用されている発現ベクター
のプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスやサイトメガロ
ウイルスなどのウイルス由来のプロモーターであり、ま
た発現させた遺伝子も細胞外に放出されてくるウイルス
の外被蛋白質をコードする遺伝子である。ウイルス以外
のプロモーターを用いた場合、あるいは細胞内で発現す
るウイルス蛋白質を発現させた場合、あるいはウイルス
以外の遺伝子を発現させた場合、同様の抗体産生が認め
られるかどうかは不明である。また、一般に抗体産生
は、血液やリンパ液などの細胞外液に存在する抗原をマ
クロファージが貪食作用によって取り込み、抗原提示を
行なった後、行なわれることが知られていることから、
非分泌蛋白質を発現させた場合には、抗体産生は困難で
あると考えられている。
のプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスやサイトメガロ
ウイルスなどのウイルス由来のプロモーターであり、ま
た発現させた遺伝子も細胞外に放出されてくるウイルス
の外被蛋白質をコードする遺伝子である。ウイルス以外
のプロモーターを用いた場合、あるいは細胞内で発現す
るウイルス蛋白質を発現させた場合、あるいはウイルス
以外の遺伝子を発現させた場合、同様の抗体産生が認め
られるかどうかは不明である。また、一般に抗体産生
は、血液やリンパ液などの細胞外液に存在する抗原をマ
クロファージが貪食作用によって取り込み、抗原提示を
行なった後、行なわれることが知られていることから、
非分泌蛋白質を発現させた場合には、抗体産生は困難で
あると考えられている。
【０００５】また、分泌蛋白質であるヒト成長ホルモン
やヒトα１−アンチトリプシンの遺伝子をヒトβ−アク
チンプロモーターやサイトメガロウイルスプロモーター
の下流に連結した発現ベクターを作製し、このプラスミ
ドでコートした金粒子をマウスの皮膚にパーティクルガ
ンで打ち込むことによって細胞内にプラスミドを導入し
たところ、マウスの血液中にこれらの蛋白質に対する抗
体が生産されたという報告がある（Ｔａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４、１９９
２）。しかし、この報文には、該プラスミドを注射して
も、抗体の産生は認められなかったと記載されている。
また、この場合も非分泌蛋白質については検討されてい
ない。
やヒトα１−アンチトリプシンの遺伝子をヒトβ−アク
チンプロモーターやサイトメガロウイルスプロモーター
の下流に連結した発現ベクターを作製し、このプラスミ
ドでコートした金粒子をマウスの皮膚にパーティクルガ
ンで打ち込むことによって細胞内にプラスミドを導入し
たところ、マウスの血液中にこれらの蛋白質に対する抗
体が生産されたという報告がある（Ｔａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４、１９９
２）。しかし、この報文には、該プラスミドを注射して
も、抗体の産生は認められなかったと記載されている。
また、この場合も非分泌蛋白質については検討されてい
ない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗原
蛋白質の精製を必要としない簡便な抗体作製法を提供す
ることである。
蛋白質の精製を必要としない簡便な抗体作製法を提供す
ることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、動物細胞内で働くプロモーターを有する発現ベク
ターに、細胞内で発現するウイルス蛋白質、あるいはヒ
ト蛋白質をコードするＤＮＡ等を組換えて動物体内に注
射すると、血清中に該蛋白質に対する抗体を産生するこ
とを見いだし、本発明を完成した。
結果、動物細胞内で働くプロモーターを有する発現ベク
ターに、細胞内で発現するウイルス蛋白質、あるいはヒ
ト蛋白質をコードするＤＮＡ等を組換えて動物体内に注
射すると、血清中に該蛋白質に対する抗体を産生するこ
とを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、蛋白質に対して抗体
を作製するにあたって、該蛋白質をコードするＤＮＡ
を、動物細胞由来のプロモーターを含む発現ベクターに
組換え、次いで得られた発現ベクターを動物に注射する
ことを特徴とする、該蛋白質に対する抗体の作製方法を
提供する。
を作製するにあたって、該蛋白質をコードするＤＮＡ
を、動物細胞由来のプロモーターを含む発現ベクターに
組換え、次いで得られた発現ベクターを動物に注射する
ことを特徴とする、該蛋白質に対する抗体の作製方法を
提供する。
【０００９】さらに本発明は、ウイルス以外の蛋白質に
対して抗体を作製するにあたって、該蛋白質をコードす
るＤＮＡを、動物細胞内で働くプロモーターを含む発現
ベクターに組換え、次いで得られた発現ベクターを動物
に注射することを特徴とする、該蛋白質に対する抗体の
作製方法を提供する。
対して抗体を作製するにあたって、該蛋白質をコードす
るＤＮＡを、動物細胞内で働くプロモーターを含む発現
ベクターに組換え、次いで得られた発現ベクターを動物
に注射することを特徴とする、該蛋白質に対する抗体の
作製方法を提供する。
【００１０】本発明において蛋白質とは、ウイルス、細
菌、植物、動物等の生物の遺伝子によってコードされて
いる蛋白質すべてを含む。これらの蛋白質は、大きく分
泌蛋白質と非分泌蛋白質に分類できる。さらに非分泌蛋
白質は細胞内の存在部位によって、膜蛋白質、細胞質蛋
白質、核蛋白質、オルガネラ蛋白質等に分類される。分
泌蛋白質としては、血液やリンパ液などの細胞外液の構
成成分、サイトカイン、細胞外マトリックスなどが例示
できる。膜蛋白質としては、レセプター、トランスポー
ター、イオンチャンエルなどが例示できる。細胞質蛋白
質としては、細胞骨格、代謝酵素、シグナル伝達因子、
蛋白質合成関連蛋白質（リボソームなど）、蛋白質分解
関連蛋白質（プロテアソームなど）、例示できる。核蛋
白質としては、核骨格、転写因子、複製因子等が例示で
きる。オルガネラ蛋白質としては、ミトコンドリア、リ
ソソーム、ペルオキシソーム、ミクロソームなどを構成
する各種蛋白質（電子伝達系、分解酵素など）が例示で
きる。さらに人工的にデザインされた合成遺伝子によっ
てコードされる人工蛋白質も本発明の蛋白質の範疇に含
まれる。
菌、植物、動物等の生物の遺伝子によってコードされて
いる蛋白質すべてを含む。これらの蛋白質は、大きく分
泌蛋白質と非分泌蛋白質に分類できる。さらに非分泌蛋
白質は細胞内の存在部位によって、膜蛋白質、細胞質蛋
白質、核蛋白質、オルガネラ蛋白質等に分類される。分
泌蛋白質としては、血液やリンパ液などの細胞外液の構
成成分、サイトカイン、細胞外マトリックスなどが例示
できる。膜蛋白質としては、レセプター、トランスポー
ター、イオンチャンエルなどが例示できる。細胞質蛋白
質としては、細胞骨格、代謝酵素、シグナル伝達因子、
蛋白質合成関連蛋白質（リボソームなど）、蛋白質分解
関連蛋白質（プロテアソームなど）、例示できる。核蛋
白質としては、核骨格、転写因子、複製因子等が例示で
きる。オルガネラ蛋白質としては、ミトコンドリア、リ
ソソーム、ペルオキシソーム、ミクロソームなどを構成
する各種蛋白質（電子伝達系、分解酵素など）が例示で
きる。さらに人工的にデザインされた合成遺伝子によっ
てコードされる人工蛋白質も本発明の蛋白質の範疇に含
まれる。
【００１１】目的蛋白質をコードするＤＮＡとしては、
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどいかなるＤＮ
Ａでもよい。ただし、いずれも開始コドンから終止コド
ンまでのオープンリーディングフレームを含んでいる必
要がある。
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどいかなるＤＮ
Ａでもよい。ただし、いずれも開始コドンから終止コド
ンまでのオープンリーディングフレームを含んでいる必
要がある。
【００１２】動物細胞内で働くプロモーターとしては、
例えば、ウイルス由来のもの、動物細胞由来のものな
ど、いかなるものでもよい。ウイルス由来のプロモータ
ーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターや後期プロモ
ーター、アデノウイルスの後期プロモーター、レトロウ
イルスのＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター、
サイトメガロウイルスのプロモーターなどが例示でき
る。動物細胞由来のプロモーターとしては、チミジンキ
ナーゼのプロモーター、メタロチオネインのプロモータ
ー、β−アクチンのプロモーター、延長因子−１αのプ
ロモーター、リボソーム蛋白質のプロモーター等が例示
できる。
例えば、ウイルス由来のもの、動物細胞由来のものな
ど、いかなるものでもよい。ウイルス由来のプロモータ
ーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターや後期プロモ
ーター、アデノウイルスの後期プロモーター、レトロウ
イルスのＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター、
サイトメガロウイルスのプロモーターなどが例示でき
る。動物細胞由来のプロモーターとしては、チミジンキ
ナーゼのプロモーター、メタロチオネインのプロモータ
ー、β−アクチンのプロモーター、延長因子−１αのプ
ロモーター、リボソーム蛋白質のプロモーター等が例示
できる。
【００１３】目的蛋白質をコードするＤＮＡの上記プロ
モーターを含む発現ベクターへの組換えは、公知の遺伝
子工学技術を用いて行なうことができる。
モーターを含む発現ベクターへの組換えは、公知の遺伝
子工学技術を用いて行なうことができる。
【００１４】目的遺伝子を含む発現ベクターとしては、
環状二本鎖ＤＮＡ、環状一本鎖ＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮ
Ａ、およびこれらのＤＮＡを含むファージ粒子等いかな
る態樣をとってもよい。これらの発現ベクターＤＮＡの
注射にあたっては、ＤＮＡをそのまま生理食塩水や緩衝
液に溶解あるいは懸濁したもの、あるいはリポソームに
封入したものなど、いかなる形態の試料でもよい。
環状二本鎖ＤＮＡ、環状一本鎖ＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮ
Ａ、およびこれらのＤＮＡを含むファージ粒子等いかな
る態樣をとってもよい。これらの発現ベクターＤＮＡの
注射にあたっては、ＤＮＡをそのまま生理食塩水や緩衝
液に溶解あるいは懸濁したもの、あるいはリポソームに
封入したものなど、いかなる形態の試料でもよい。
【００１５】動物としては、マウス、ラット、ウサギな
どの哺乳動物類、ニワトリなどの鳥類など、一般に抗体
作製に使用される動物が適している。動物体内へのＤＮ
Ａの注射は、通常、ＤＮＡ試料を注射器を用いて、筋肉
中、腹腔中、静脈中等に注射することによって行なわれ
る。ＤＮＡの注射量は動物によって異なるが、通常、一
匹当たり０．１ｎｇ〜１ｇの範囲内が用いられる。ＤＮ
Ａ試料の注射は、一回でもよいが、抗体生産を確実にす
るために一定間隔を置いて二回以上行なうことが望まし
い。
どの哺乳動物類、ニワトリなどの鳥類など、一般に抗体
作製に使用される動物が適している。動物体内へのＤＮ
Ａの注射は、通常、ＤＮＡ試料を注射器を用いて、筋肉
中、腹腔中、静脈中等に注射することによって行なわれ
る。ＤＮＡの注射量は動物によって異なるが、通常、一
匹当たり０．１ｎｇ〜１ｇの範囲内が用いられる。ＤＮ
Ａ試料の注射は、一回でもよいが、抗体生産を確実にす
るために一定間隔を置いて二回以上行なうことが望まし
い。
【００１６】抗体産生の有無は、血液を採取後血清を分
離し、抗原蛋白質との結合反応を調べることによって行
なう。例えば、免疫沈降、酵素免疫アッセイ、抗体染色
など公知の方法を用いることができる。これらの方法で
血清中での抗体産生を確認したのち、血清をそのままポ
リクローナル抗体試料として用いることもできるし、ア
フィニティカラムクロマトグラフィーなどにより精製し
た後、用いることもできる。また免疫能を獲得した動物
から脾臓を摘出し、常法によりモノクローナル抗体を作
製することもできる。
離し、抗原蛋白質との結合反応を調べることによって行
なう。例えば、免疫沈降、酵素免疫アッセイ、抗体染色
など公知の方法を用いることができる。これらの方法で
血清中での抗体産生を確認したのち、血清をそのままポ
リクローナル抗体試料として用いることもできるし、ア
フィニティカラムクロマトグラフィーなどにより精製し
た後、用いることもできる。また免疫能を獲得した動物
から脾臓を摘出し、常法によりモノクローナル抗体を作
製することもできる。
【００１７】
【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００１８】実施例１ ＳＶ４０Ｔ抗原に対する抗体の
作製 ヒト延長因子−１αのプロモーターの下流にＳＶ４０Ｔ
抗原の翻訳領域を組換えた発現ベクターｐＥＦ２０４−
Ｔ（図１、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ９１：２１
７ー２２３、１９９０に記載）を用いた。発現ベクター
ｐＥＦ２０４−Ｔを大腸菌内で増幅し大量に調製した
後、ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心分離法により精製した。
得られたプラスミドを２μｇ／μｌになるようリン酸緩
衝液（ＰＢＳ：１４５ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣ
ｌ、８．０９ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、２ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐ
Ｈ７．２）に溶解した。
作製 ヒト延長因子−１αのプロモーターの下流にＳＶ４０Ｔ
抗原の翻訳領域を組換えた発現ベクターｐＥＦ２０４−
Ｔ（図１、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ９１：２１
７ー２２３、１９９０に記載）を用いた。発現ベクター
ｐＥＦ２０４−Ｔを大腸菌内で増幅し大量に調製した
後、ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心分離法により精製した。
得られたプラスミドを２μｇ／μｌになるようリン酸緩
衝液（ＰＢＳ：１４５ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣ
ｌ、８．０９ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、２ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐ
Ｈ７．２）に溶解した。
【００１９】６〜８週令のマウスＢＡＬＢ／Ｃのメス、
６匹を用意した。各個体の目からガラス管で対照血液と
して約２００μｌの採血を行なった。ついでマウス３匹
の左右の大腿四頭筋に、先に調製したプラスミドのＰＢ
Ｓ溶液２５μｌづつ計５０μｌを２６ゲージの注射針を
用いて注射した。残りのマウス３匹の腹腔内に、プラス
ミドのＰＢＳ溶液５０μｌを同様に注射した。なお、本
実験はＰ２レベルの動物実験施設を用いて行なわれた。
６匹を用意した。各個体の目からガラス管で対照血液と
して約２００μｌの採血を行なった。ついでマウス３匹
の左右の大腿四頭筋に、先に調製したプラスミドのＰＢ
Ｓ溶液２５μｌづつ計５０μｌを２６ゲージの注射針を
用いて注射した。残りのマウス３匹の腹腔内に、プラス
ミドのＰＢＳ溶液５０μｌを同様に注射した。なお、本
実験はＰ２レベルの動物実験施設を用いて行なわれた。
【００２０】３週間後、目から約２００μｌの採血を行
なった後、前回と同じようにプラスミドのＰＢＳ溶液の
注射を行なった。さらに３週間後、最後の採血を行なっ
た。採血した血液は４℃で一晩保存し、血液を凝固させ
た後、８，０００ｇで５分間遠心し、上澄をとった。こ
の上澄にＮａＮ3を０．０１％になるように添加し、４
℃で保存した。
なった後、前回と同じようにプラスミドのＰＢＳ溶液の
注射を行なった。さらに３週間後、最後の採血を行なっ
た。採血した血液は４℃で一晩保存し、血液を凝固させ
た後、８，０００ｇで５分間遠心し、上澄をとった。こ
の上澄にＮａＮ3を０．０１％になるように添加し、４
℃で保存した。
【００２１】ＳＶ４０Ｔ抗原を発現しているサル腎臓細
胞株ＣＯＳ７細胞をカバーグラス上で培養した。ほぼ集
密状態になったところで、−２０℃に冷却したエタノー
ル−アセトン（１：１）中にカバーグラスごと入れ、１
５分間放置して細胞を固定した後、室温で乾燥し、つい
でこれをＰＢＳにつけた。マウスから採血した血清を
０．５％牛血清アルブミンを含むＰＢＳで希釈した液
を、ＰＢＳから取り出したカバーグラスの細胞上に乗せ
た。乾燥しないようにタッパー中で一時間放置した後、
血清をＰＢＳで充分洗浄した。ついで、０．５％牛血清
アルブミンを含むＰＢＳで２００倍に希釈したＦＩＴＳ
標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ製）を細胞上に乗
せ、室温で一時間放置した。充分ＰＢＳで洗浄後、蛍光
顕微鏡で観察し、ＳＶ４０Ｔ抗原が特異的に発現してい
る核が蛍光を発しているかどうかを調べた。その結果、
表１に示すように、筋肉内に注射した場合にはすべての
個体で、一回の注射でＳＶ４０Ｔ抗原に対する抗体の産
生が認められた。二回注射によって抗体価は約１０倍上
昇した。一方、腹腔内に注射したものは、一匹のみに抗
体の産生が認められた。
胞株ＣＯＳ７細胞をカバーグラス上で培養した。ほぼ集
密状態になったところで、−２０℃に冷却したエタノー
ル−アセトン（１：１）中にカバーグラスごと入れ、１
５分間放置して細胞を固定した後、室温で乾燥し、つい
でこれをＰＢＳにつけた。マウスから採血した血清を
０．５％牛血清アルブミンを含むＰＢＳで希釈した液
を、ＰＢＳから取り出したカバーグラスの細胞上に乗せ
た。乾燥しないようにタッパー中で一時間放置した後、
血清をＰＢＳで充分洗浄した。ついで、０．５％牛血清
アルブミンを含むＰＢＳで２００倍に希釈したＦＩＴＳ
標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ製）を細胞上に乗
せ、室温で一時間放置した。充分ＰＢＳで洗浄後、蛍光
顕微鏡で観察し、ＳＶ４０Ｔ抗原が特異的に発現してい
る核が蛍光を発しているかどうかを調べた。その結果、
表１に示すように、筋肉内に注射した場合にはすべての
個体で、一回の注射でＳＶ４０Ｔ抗原に対する抗体の産
生が認められた。二回注射によって抗体価は約１０倍上
昇した。一方、腹腔内に注射したものは、一匹のみに抗
体の産生が認められた。
【００２２】
【表１】 表１． 抗体産生試験結果 ─────────────────────────── マウス 前採血 ３週間後 ６週間後 ─────────────────────────── 筋肉注射 Ａ − ＋＋ ＋＋＋＋ Ｂ − ＋ ＋＋＋ Ｃ − ＋＋ ＋＋＋＋ ─────────────────────────── 腹腔内注射 Ａ − − − Ｂ − − − Ｃ − ＋ ＋＋ ─────────────────────────── ＋： １０倍希釈で核の特異的染色 ＋＋： ３０倍希釈で核の特異的染色 ＋＋＋： ９０倍希釈で核の特異的染色 ＋＋＋＋： ２７０倍希釈で核の特異的染色
【００２３】実施例２ ヒトＣＤ４４抗原に対する抗体
の作製 ヒトリンホーマ細胞株Ｕ９３７ｃＤＮＡライブラリー
（特開平４ー１１７２９２に記載）から任意に選択した
クローンの塩基配列決定の結果、ヒトＣＤ４４抗原の完
全長ｃＤＮＡを含むクローンｐＫＡ１−ＣＤ４４が得ら
れた。約１．４ｋｂｐからなるｃＤＮＡインサートの全
塩基配列を決定したところ、得られた塩基配列は文献記
載の配列（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１２
１６０ー１２１６４、１９９２）と一致していた。ＣＤ
４４は、選択スプライシングによって多くの分子種を形
成することが知られているが、ここで得られたものは、
造血細胞型のＣＤ４４であった。
の作製 ヒトリンホーマ細胞株Ｕ９３７ｃＤＮＡライブラリー
（特開平４ー１１７２９２に記載）から任意に選択した
クローンの塩基配列決定の結果、ヒトＣＤ４４抗原の完
全長ｃＤＮＡを含むクローンｐＫＡ１−ＣＤ４４が得ら
れた。約１．４ｋｂｐからなるｃＤＮＡインサートの全
塩基配列を決定したところ、得られた塩基配列は文献記
載の配列（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１２
１６０ー１２１６４、１９９２）と一致していた。ＣＤ
４４は、選択スプライシングによって多くの分子種を形
成することが知られているが、ここで得られたものは、
造血細胞型のＣＤ４４であった。
【００２４】ｐＥＦ３２１−Ｔ（Ｋｉｍ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｇｅｎｅ ９１：２１７ー２２３、１９９０に記
載）をＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで消化した後、ヒト延長因
子−１αのプロモーター約１．２ｋｂｐの断片をアガロ
ースゲル電気泳動後、ゲルから切り出した。ｐＫＡ１−
ＣＤ４４をＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで消化した後、ｃＤＮ
Ａを含む長い断片を同様にゲルから切り出した。両断片
をライゲーション後、ヒトＣＤ４４抗原の動物細胞内発
現ベクターｐＥＦ３２１−ＣＤ４４（図２）を構築し
た。
ｌ．、Ｇｅｎｅ ９１：２１７ー２２３、１９９０に記
載）をＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで消化した後、ヒト延長因
子−１αのプロモーター約１．２ｋｂｐの断片をアガロ
ースゲル電気泳動後、ゲルから切り出した。ｐＫＡ１−
ＣＤ４４をＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで消化した後、ｃＤＮ
Ａを含む長い断片を同様にゲルから切り出した。両断片
をライゲーション後、ヒトＣＤ４４抗原の動物細胞内発
現ベクターｐＥＦ３２１−ＣＤ４４（図２）を構築し
た。
【００２５】上記のヒトＣＤ４４抗原ｃＤＮＡ発現ベク
ターｐＥＦ３２１−ＣＤ４４の１００μｇをＰＢＳ溶液
として実施例１と同様の条件でマウスに筋肉内注射を行
なった。３週間隔で二回注射後、採血を行ない、血清を
調製した。
ターｐＥＦ３２１−ＣＤ４４の１００μｇをＰＢＳ溶液
として実施例１と同様の条件でマウスに筋肉内注射を行
なった。３週間隔で二回注射後、採血を行ない、血清を
調製した。
【００２６】ｐＫＡ１−ＣＤ４４を鋳型として用いて、
ウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ社製ＴＮＴインビト
ロ転写／翻訳キット）によるインビトロ翻訳を行なっ
た。この際、[35S]メチオニン（アマーシャム社製）を
添加し、発現産物をラジオアイソトープで標識した。反
応条件はキットに付属のプロトコールに従った。インビ
トロ翻訳産物を含む反応溶液４μｌを上記血清２０μ
ｌ、ＮＥＴゲル緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．
５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．２５％ゲラチン、０．０２％ＮａＮ3）
２００μｌと混合し、氷上で一時間静置した。これにプ
ロテインＡセファロースＣＬー４Ｂ（ファルマシア社
製）１０ｍｇを加え、４℃で１時間放置した。遠心後ゲ
ルをＮＥＴゲル緩衝液１ｍｌで２回洗浄後、さらに１０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌで２回洗浄し
た。ゲルにサンプリング緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、
ｐＨ６．８、１００ｍＭＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％
ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）２０μ
ｌを添加して１００℃、５分間加熱した。遠心後、上澄
をＳＤＳーポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた
後、オートラジオグラフィーを行ない、免疫沈降産物の
有無を確認した。その結果、プラスミドを注射したマウ
スの血清と反応させたもののみから、分子量約４６ｋＤ
ａの位置にＣＤ４４のバンドが認められ、抗体の産生が
確認できた。
ウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ社製ＴＮＴインビト
ロ転写／翻訳キット）によるインビトロ翻訳を行なっ
た。この際、[35S]メチオニン（アマーシャム社製）を
添加し、発現産物をラジオアイソトープで標識した。反
応条件はキットに付属のプロトコールに従った。インビ
トロ翻訳産物を含む反応溶液４μｌを上記血清２０μ
ｌ、ＮＥＴゲル緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．
５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．２５％ゲラチン、０．０２％ＮａＮ3）
２００μｌと混合し、氷上で一時間静置した。これにプ
ロテインＡセファロースＣＬー４Ｂ（ファルマシア社
製）１０ｍｇを加え、４℃で１時間放置した。遠心後ゲ
ルをＮＥＴゲル緩衝液１ｍｌで２回洗浄後、さらに１０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌで２回洗浄し
た。ゲルにサンプリング緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、
ｐＨ６．８、１００ｍＭＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％
ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）２０μ
ｌを添加して１００℃、５分間加熱した。遠心後、上澄
をＳＤＳーポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた
後、オートラジオグラフィーを行ない、免疫沈降産物の
有無を確認した。その結果、プラスミドを注射したマウ
スの血清と反応させたもののみから、分子量約４６ｋＤ
ａの位置にＣＤ４４のバンドが認められ、抗体の産生が
確認できた。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、煩雑な操作と長時間を要
する抗原蛋白質の精製を必要としない、簡便な抗体作製
法が提供される。本発明の方法を用いることにより、蛋
白質をコードするＤＮＡさえあれば、容易に該蛋白質に
対する抗体を作製することができる。得られた抗体は、
医薬、診断薬、研究試薬等として有用である。
する抗原蛋白質の精製を必要としない、簡便な抗体作製
法が提供される。本発明の方法を用いることにより、蛋
白質をコードするＤＮＡさえあれば、容易に該蛋白質に
対する抗体を作製することができる。得られた抗体は、
医薬、診断薬、研究試薬等として有用である。
【図１】 ヒト延長因子−１αのプロモーターを含むＳ
Ｖ４０Ｔ抗原発現ベクターｐＥＦ２０４ーＴの構造を表
す。
Ｖ４０Ｔ抗原発現ベクターｐＥＦ２０４ーＴの構造を表
す。
【図２】 ヒト延長因子−１αのプロモーターを含むヒ
トＣＤ４４抗原発現ベクターｐＥＦ３２１ーＣＤ４４の
構造を表す。
トＣＤ４４抗原発現ベクターｐＥＦ３２１ーＣＤ４４の
構造を表す。
Claims (6)
- 【請求項１】 蛋白質に対して抗体を作製するにあたっ
て、該蛋白質をコードするＤＮＡを、動物細胞由来のプ
ロモーターを含む発現ベクターに組換え、次いで得られ
た発現ベクターを動物に注射することを特徴とする、該
蛋白質に対する抗体の作製方法。 - 【請求項２】 ウイルス以外の蛋白質に対して抗体を作
製するにあたって、該蛋白質をコードするＤＮＡを、動
物細胞内で働くプロモーターを含む発現ベクターに組換
え、次いで得られた発現ベクターを動物に注射すること
を特徴とする、該蛋白質に対する抗体の作製方法。 - 【請求項３】 動物細胞内で働くプロモーターが動物細
胞由来のプロモーターである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 蛋白質が非分泌蛋白質である、請求項１
から請求項３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 プロモーターがヒト延長因子−１αのプ
ロモーターである、請求項１から請求項４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 該蛋白質をコードするＤＮＡがヒトｃＤ
ＮＡである、請求項１から請求項５のいずれかに記載の
方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10932994A JPH07313187A (ja) | 1994-05-24 | 1994-05-24 | 抗体作製法 |
| EP95918759A EP0761687A4 (en) | 1994-05-24 | 1995-05-22 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF AN ANTIBODY |
| PCT/JP1995/000973 WO1995032224A1 (fr) | 1994-05-24 | 1995-05-22 | Procede de preparation d'un anticorps |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10932994A JPH07313187A (ja) | 1994-05-24 | 1994-05-24 | 抗体作製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07313187A true JPH07313187A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=14507470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10932994A Pending JPH07313187A (ja) | 1994-05-24 | 1994-05-24 | 抗体作製法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0761687A4 (ja) |
| JP (1) | JPH07313187A (ja) |
| WO (1) | WO1995032224A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010098471A1 (ja) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | 株式会社バイオマトリックス研究所 | がん細胞を用いた免疫方法 |
| WO2012026615A1 (ja) | 2010-08-25 | 2012-03-01 | 株式会社バイオマトリックス研究所 | がん細胞を用いた抗体の製造方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000046969A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| CN100562570C (zh) | 2003-06-18 | 2009-11-25 | 吉恩勒克斯公司 | 修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用 |
| US20090098529A1 (en) | 2006-10-16 | 2009-04-16 | Nanhai Chen | Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses |
| RU2646111C2 (ru) * | 2015-12-29 | 2018-03-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор для гетерологической экспрессии рекомбинантного человеческого белка cd44 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0702516A4 (en) * | 1993-06-01 | 1998-04-22 | Life Technologies Inc | GENETIC IMMUNIZATION WITH CATIONIC LIPIDS |
-
1994
- 1994-05-24 JP JP10932994A patent/JPH07313187A/ja active Pending
-
1995
- 1995-05-22 WO PCT/JP1995/000973 patent/WO1995032224A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1995-05-22 EP EP95918759A patent/EP0761687A4/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010098471A1 (ja) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | 株式会社バイオマトリックス研究所 | がん細胞を用いた免疫方法 |
| WO2012026615A1 (ja) | 2010-08-25 | 2012-03-01 | 株式会社バイオマトリックス研究所 | がん細胞を用いた抗体の製造方法 |
| US8598408B2 (en) | 2010-08-25 | 2013-12-03 | Ordermade Medical Research Inc. | Method of producing an antibody using a cancer cell |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0761687A1 (en) | 1997-03-12 |
| EP0761687A4 (en) | 2000-04-19 |
| WO1995032224A1 (fr) | 1995-11-30 |
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