PT90265B - Metodo rapido para analise de mutacoes - Google Patents
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Description
Método rápido para a análise de mutações Âmbito do invento 0 presente invento pertence ao domínio da bioloqia molecular e da imunologia. Refere—se a um novo método para seleccionar e analisar mutantes. O presente invento refere-se também á utilização do referido método para identificar domínios antigénicos ou epítopos de proteínas ou polipeptídeos.
Antecedentes do invento
As células T humanas ligam eritrócitos de carneiro através de uma proteína de superfície celular 50 KD específica das células T, denominada CD2 (Bach, J.F., et.al.,Transplanta-tion ,8:265-280 (1969); Howard, F.D., et .al . . J. Immunol.·, 126:2117-2122 (1981)). Este fenómeno tem, desde há muito, utilidade prática, mas, até há pouco tempo, o seu significado fisiológico era pouco conhecido. No entanto, estudos paralelos sobre a interacção entre as células T e os eritrócitos de carneiro (Hunig, T., J Ekd .Med . 162:690-901 (9185); Hunig, T.R., J.Immunol. 136:2103-2103 (1986)), e as células T e os seus alvos fisiológicos (Shaw, S. , et^al. , Nature, 323:262-204 (1986)), conduziram à identificação de um ligando molecular específica para a CD2, que é uma proteína de superfície largamente distribuída, que no caso dos seres humanas é a, LFA-3. As interacçSes CD2/LFA-3 vão mediar a conjugação do alvo citolitico (Shaw, S., = t -1 hUtur·- ^0^.062-264 (9136)), a adesão timócito-epitelial (Vollger, et.al.,(1987?> e * reacção mista de linfócitos (Martin, P.J., et.al., JImmun sugerido um papel mai Q\. 131: Γ3Θ-185 (1983)). Além disso, foi 6 vasto a ser desempenhado pelo antigénio
ta de que certas combinações de anticorpos CD2 mediante a descabei M \ 4 monoclonais anti-CD2 podem activar directamente células T maduras através de uma via independente do antigénio.
Presentemente α método mais comum para o mapeamento de epitopos de proteínas requere a síntese de um arranjo de pequenos peptídeos sintéticos abrangendo a sequência proteica e a utilização destes peptídeos em múltiplos ensaios de liqação (Geysen, H.M., et.al.,Science 235:1184-1190 (1987)). Para identificar os resíduos específicos importantes para a ligação a anticorpos, sintetizam-se variantes do peptídeo com substituições em cada uma das posições. A estratégia do peptídeo sintético tem várias limitações. Se a afinidade do anticorpo deriva da interacção com diferentes porções do esqueleto polipeptídico ou com uma nova conformação do esqueleto, o peptídeo será incapaz de imitar a proteína na sua totalidade no que respeita á ligação ao anticor— po. Para identificar resíduos individuais que contactam com o anticorpo tem de ser sintetizado um número extremamente largc* de variantes peptídeos. 0 mais exaustivo de tais estudos até à data envolveu o ensaio de cerca de 15€>€> peptídeos individuais (Getzoff, E.D., et a1..Science 235:1191—1196(1987)).
Os anticorpos monoclonais têm sido usados para selec-cionar determinantes dos envólucros virais (Yewdell, J.W., e Gerhard, W., Ann .Rev .Hicrobiol . 35:1B3·—2fc'6( 1981 ) ) . Tais selecções são menos convenientes e menos sensíveis do que o desejável pois as alterações mutacionais devem ser extraídas do genoma virai e as mutações conducentes à inviabilidade virai não podem ser detec tadas»
Sumário do Invento 0 presente inv-ento relaciona-se com um método rápido e simples para o mapeamento de epítopos de proteínas. A técnica
rápida de análise mutacional do presente invento envolve a selecção de mutações de cDNA do antigénio que conduzam a uma perda de reactividade antigénio-anticorpo. 0 método emprega mutant.es de cDNA que perderam epitopos e permite a amostragem de um número muito grande de substituições de aminoácidos na molécula nativa. A frequência de mutação é suficientemente alta com o método de mutagénese usado que raros variantes podem ser eficazmente isolados. A técnica do presente invento é rápida e tão simples que permite o isolamento de um grande número de mutantes e pode ser aplicada a qualquer proteína de superfície para a qual se disponha de um cDNA e de anticorpos monaclanais. A capacidade de obtenção fácil de um grande número de variantes com perda de epítopos permite o mapeamento detalhada das superfícies acessíveis das proteínas, a identificação de sítios de ligação de ligandos e o projecto de proteínas menos antigénicas mas tendo maior efeito biológico.
Ainda usando os métodos do presente invento é possível utilizar ligandos adequadamente talhados como reagentes de selecção negativa diretamente e assim, aumentar a abordagem para permitir a identificação de resíduos importantes para a interac-ç3o ligando ou substrato/proteína que pode ocorrer nas bolsas inacessíveis a.os anticorpos. A identificação de sítios de ligação de ligandos facilitará estudos estruturais conducentes ao projecto de novos ligandos e drogas. 0 método do presente inventa foi usado para definir as regiões através das quais o antigénio CD2 se liga aos anticorpos monoclonais anti—CD2 e para. definir os sítios de ligação no antigénio CD4 para o vírus da imunodeficiência humana ÍHIV).
As mutações no cDNA de CD2 foram seleccionadas relativamente á perda de reactividade com anticorpos anti-CD2. D padrão das substituições de aminoácidos nos mutantes define três regiões distintas da molécula de C'D2: uma região epítópica reconhecida por anticorpos dos grupos I e II; uma segunda região epitópica reconhecida por anticorpos do grupo III; e uma terceira região epitópica reconhecida por anticorpos do grupo IV. A comparação de resíduos de aminoácidos importantes para a ligação do anticorpo e de resíduos de aminoácidos importantes para a ligação de LFA-3 indica que os anticorpos do grupo I e dD grupo II interactuam com uma fracção do sítio de ligação de LFA-3; que os anticorpos do grupo III interactuam com uma outra fracção do sítio de ligação de LFA-3; e que os anticorpos do grupo IV interactuam ainda com uma outra fracção que não está envolvida na ligação de LFA-3. Em adição, a estreita correspondência entre os efeitos de substituição individuais no anticorpo do grupo I e ligação de LFA—3 sugere que os anticorpos do grupo I medeiam o seu efeito na activação das células T mascarando os efeitos da ligação de LFA-3.
Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 é uma representação esquemática do vector de isolamento do mutante e do processo para o isolamento do mutante. A figura IA é uma representação do vector piH3MCD2 usado para o isolamento de mutantes. A figura 1B é uma representação esquemática da estratégia para o isolamento de mutantes. No passo (i> as células COS aiipressandD moléculas mutantes e tipo selvagem são tratadas com um anticorpo monoclonal que reconhece o epítopo cuja perda se pretende. As células que ainda expressam o epítopo ligam o anticorpo, o que conduz à subsequente fixação do complemento
(passo ii) e lise celular. No passo iii as restantes células foram tratadas. com anticorpo que reconhece um segundo epítopo (iii) de CD2 e deixadas aderir a placas revestidas com anti-soro que reconhece monoclonais de murganho. Apenas as células que expressam o segunda epitopo se ligam ás placas (iv). G DNA de plasmideo foi recuperado a partir das células aderentes. 0 primeiro passo remove as moléculas que ainda expressam o ep.itopo cuja perda se pretende; o segundo passo aumenta a eficácia do processo e assegura que não se obtenham mutantes nulos. A figura 2 indica a localização dos epítopos na sequência primária de C,D2. A fiqura 2A representa a sequência prevista da proteína CD2 madura. A região transmembranar está sublinhada com uma barra a cheio. Os anticorpos usados estão apresentados ao lonqo da margem esquerda. Os símbolos sob a sequência primária indicam a sensibilidade de cada anticorpo a alterações naquela posição. Um "0" indica que se obteve um mutante com uma substituição naquela posição ou que imunofluorescência indirecta dos mutantes obtida com um outro anticorpo mostrou uma sensibilidade á substituição naquela posição. Um "+" indica que uma substituição naquela posição foi testada e que não se observou afectar a reactividade com anticorpos. 0 símbolo "=" significa que apenas prolina naquela posição afectou. a reactivida.de. A figura 3 apresenta a CDlecção de mutantes que definem a região ep.itópica de CD2. Estão mostradas as sequências de pequenos segmentos do polipeptídeo CD2 que incluem cada uma das duas principais regiões epitópicas. As variantes de substituição de aminoácidos conseguidas por selecção de mutantes estão apresentadas por baixo de cada sequência tipo selvagem. A figura 3A apresenta a sequência da região epi.tópica 1 do polipeptídeo CD2.
Β A figura 3B apresenta a sequência da região epitópica 2 do polipeptídeo CD2. As colunas à direita indicam (da esquerda para a direita) α anticorpo usado para a selecção negativa e o (s) anticorpo (s) usados para a selecção positiva. "Todos 16" significa que todos os 16 monoclonais na figura 2 foram combinadas para o passo de selecção positiva. "7 outros" significa que sete anticorpos que não o 35.1 reconhecendo a primeira região epi-tópica foram combinados para o passo de selecção positiva. As variantes directamente sob a sequência CD2 foram obtidas por selecção de mutantes de um conjunto de plasmídeos mutaqenizados através da fracção de cDNA codificadora do domínio e>:tracelular da proteína. As variantes sob as barras indicam mutantes adquiridos por selecção usando o plasmídeo mutagenizado apenas por oligonucleotídeo cobrindo a dimensão das barras. A figura 4 apresenta a localização de epítopos na sequência primária de CD4. A sequência prevista da proteína CD4 está apresentada, juntamente com o sítio proposto de ligação do HIV (sublinhado em cima), a região transmembranar (sublinhado por baixo) e as posiçoes de aminoácidos onde a substituição do mutante ocorrem (#).
Descrição do Invento 0 método do presente invento para o mapeamento de epítopos de antigénios da superfície celular torna possível mapear epítopos de qualquer proteína de superfície para as quais existam cDNA e anticorpos monoclonais. 0 método que é efectuado através da utilização de mutantes que perderam cDNA de epítopos, permite a amostragem de um número muito largo de substituições de aminoác ido-s na molécula nativa (natural) e portanto torna possível mapear as superfícies acessíveis das proteínas, identificar os sítios de ligação de ligandos e projectar proteínas menos 9
antigénicas do que as suas contrapartes naturais mas possuindo um maior efeito biológico»
Por "antigénio da superfície celular" pretende-se significar uma proteína que está presente na superfície celular; em geral , um a.ntigénio de superfície celular é transportado através do sistema de membranas intracelulares até à superfície celular. Tais antigénios estão geralmente ancorados à membrana da superfície celular através de um domínio carbaxilo terminal contendo aminoácidos hidrofóbicos que ficam na bicamada lípidica da membrana. Conforme descrito abaixo, o método do presente invento foi usado para identificar os sítios de ligação do receptor das células T humanas (antigénio CD2) e para identificar o sitio de ligação de HIV no antigénio CD4. Estes estão representados, respectivamente, nas Figuras 2 e 4.
Esquema geral do isolamento de mutantes C-D2. □ isolamento de mutantes foi efectuado conforme representado na Figura 1. 0 método representado na Figura 1 está discutido em termos da sua utilização no isolamento de mutantes que perderam epítopos de CD2. No entanto deve-se entender que ele foi igualmente usado para identificar mutantes que perderam epítopos de CD4 e é de um modo geral aplicável a outros antigénios da superfície celular.
Conforme representado na Figura 1, os mutantes que perderam epítopos de CD2 foram isolados como se segue: células COS foram transfectadas com um conjunto de plasmídeos mutaqeni-zados, cultivadas durante 43 horas, colhidas e tratadas sequen-ciadamente com um anticorpo monoclonal anti-CD2 (i.e., com um anticorpo monoclonal que reconhece α epítopo cuja perda se pretende) , anticorpo de coelho anti-imunoglobul ina. de murganho e
complemento. Este passo é referido como passo de selecção negativa e está representado como passo (i.) na Figura 1B.
Devido aos mutantes de deleção espontâneos surgirem frequentemente em células COS (Calos, M.P,, Proc. Natl- Acad.
Sci, USA, 80:3015-3019 (1983); efectuou-se um passo de selecção positiva como se- segue; as células poupadas no tratamento com complemento foram tratadas com anticorpos (s) que reconhecem um (s) epítopo (s) de CD2 distinto (s) e deixadas aderir a placas revestidas com anticorpo de cabra anti — imunoqlobu.l ina de murganho. Wysocki, L.J. e Sato, V.L., Froc. Natl . Acad. Sei. USA., 75:2344—2348 (1978). Ma Tabela 1 estão apresentados anticorpos usados no isolamento de mutantes que perderam epítopos. Q DMA de plasmídeo recuperado a partir de células aderentes (Hirt, B., J. Mo 1 . Bio 1 . 2jb:365-369 (1967) foi usado em en tão seguida para transformar células de E. co1i, amplificado e reintroduzido em células CDS para novos ciclos conforme adequados. No final do processo de selecção, o DNA de colónias bacte-rianas individuais foi transfectado para células COS que foram testadas quanto á ligação de anticorpos. TABELA 1
Anticorpos asados para o isolamento de mutantes que perderam e pítopos
Isotipo
Anticorpo
9,6 IgG^ 7E1Ô IgG2b MT910 IgG1 MT11© igGj 95-5-49 35,1 igG- aL ca T11/3PT2H9 igGj Τ11/3Τ4-8Β5 ^G2a 9-2 IgM Nu-Ter IgG1 CLB-T11/1 IgGj 39B21 IgG_ jia 0 TS1/8,1,1 igGj F92-3A11 IgG1 9,1 ^G2b 0CH217 IgM * Q anticorpo 39B21 é um monoclonal de rato e todos os outros são anticorpos de ratinho de Fevereiro de 1988 e
Na aplicação do método do presente invento para mapear epítopos do antigériio CD2, usou-se o vector piH3M no isolamento dos mutantes. Um segmento de cDNA codificador do antigénio de superfície celular foi inserido no vector piH3M, conforme descrito no pedido de patente dos Estados IJnidos copendente dos Requerentes N2. de Série 160.416 entregue em 25 12 aqui incluído como referência. piH3M contém uma origem de repli-cação de plasmídeo e um gene de tRNA supressor permitindo a replicação e selecção em E. coli. Contém também origens de replicação do bacter.iofago M13 e do vírus SV40 (Figura la). Estas permitem a produção de uma versão de cadeia simples do plasmídeo e a amplificação do plasmídeo após introdução em células que expressem as proteínas necessárias à replicação do SV40, i.e. células COS de macaco. A expressão de cDNA celular do antigéniD de superfície em células COS é dirigida pelo promotor da precoce imediata do citomeqalovírus humano. Sinais de "splicing" e de processamento 3' encontram-se ajusante do cDNA e derivam do vírus SV40. regiões através das quais CD2 se ligam anticorpos de cDNA pelos métodos
Mo isolamento e definição das os epítopos da superfície celular de monoclonais, seieccionarem-se mutações descritos atrás. O isolamento inicial de mutantes tira partido da elevada taxa de mutação que os DNAs transfectadas sofrem nas células em cultura de tecidos (Calos, M.P. et al., supra; Rassa-que, A. et al . , supra; e hlillsr, J.H. et al , EMEtQ J. 3:-_· 117-ul21 (1984). Uma população de plasmídeos, mutagenizados por passagem em células COS foi. recuperada em E. coli.. 0 conjunto mutagenizado fo.i. sujeito a três ciclos subsequentes de selecção usando o anticorpo monoclonal (Mab) 9.ó para a selecção negativa e o Mab 35.1 para a selecção positiva e isolou-se um único mutante (Figura 2). 0 mutante isolado tinha substituições de dois núcleo— tídeos, tendo I_is43 passando a Asn e Aspl86 passando a Glu. (Daqui em diante, os vários mutantes serão referidos por uma convenção resíduo tipo seivagem/resíduo mutante, de modo que.
e - g . , Li=48Aen indius que a lisina na μυ^ί'τ3ο 48 foi substituída por uma asparagina). A separação das duas alterações por mutaqé-nese de oligonucleotídeos mostrou que Lis48Asn foi apenas responsável pela parda de ligação do anticorpo 8.6. No entanto, foi sem sucesso que se fizeram outras tentativas usando outros anticorpos piara isolar mais mutantes a partir deste conjunto. 0 padrão de substituições de aminoácidos nos mutantes define três regiões distintas da molécula de CD2 compreendendo mui tas variantes da sequancia; anticorpos que participam na activação e bloqueio da adesão de eritrócitos ligam-se a uma primeira região; anticorpos que apenas bloqueiam a adesão ligam-se a uma segunda região; e anticorpos que participam na activação mas não bloqueiam a adesão ligam—se a uma terceira região. 0 método do presente invento também tem sidD usado para isolar e definir as regiões através das quais os epítopos de superfície celular de CD4 se ligam aos anticorpos monoclonais anti—CD4. Usando o presente método foram isoladas variantes de CD4 com substituições de aminoácidcs. As mutações que afectam a ligação de HIV encontram—se num agregado de epítopos que inclui o epítopo Leu3a.
Ma descrição detalhada que se segue, será feita referência a várias metodologias conhecidas dos faroiliariíados com genética de recombinantes. As publicações e outros materiais que descrevem tais metodologias conhecidas a que se faz referência estão aqui incluídas por referência.
Trabalhos de referência tradicionais que descrevem as princípios gerais da tecnologia de BNft recombinante incluem Da me 1 1 , J . E . , et a 1 . , Molecular Ce 11 Bioloqy, Sc ien t i. f ic 14
American Books, Inc., New York, New York <1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Bons, New York (1985); Old, R.W., et al, Principies of Gene Hanioulation: An Introduction to Genetic.
Enqineerinq, sequnda edição, University of Califórnia Press, Berkeley, Califórnia (1981); e Man iatis, T. , et al, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold •Spring Harbor, New York (1982). CB2
Mutagénese ao acaso e seleccão dg mutantes de epitopos de CD2.
Para aumentar a probabilidade de isolamento de mutantes foi pensadD um método geral para a mutagénese ao acaso de qualquer DNA com uma elevada eficácia. Ver, e.q., Botstein, D. e D. ShDrtle, Science 229, 1193-1201 (1985). Criou-se uma substi tuição homogénia e inespecífica de todos os possíveis pares de bases cDdificadores do domíniD extracelular de CD2 a partir de uma colecção de 22 o 1 iqonuc 1 eotídeos sobreponíveis de 33 unidades (33-mero) sintetizados com uma mistura de 957. de bases tipo selvagem para cada posição e 1.77 de cada uma das outras três bases. Os oligonuc leotídeos são sobrepon.íveis porque o resíduo ligado è matr.ix durante a síntese não pode ser convenientemente adulterado e porque a eficácia de incorporação de mutações que caem no extremo do ol.igonucleotídeo não é conhecida.
Para maximizar a eficácia das substituições de pares de bases, usou-se o processo de Kunkel para incorporar os oligonu-cleotídeos degenerados no vector de expressão piH3MCD2 (Figura la). Kunkel, T.A., Proc. Natl. ftcad. Sei. USA 82:488—492 (1985). Com base no grau de degenerescência dos oliqonucleotídeos e na eficácia da sua incorporação, calculou-se que apraximadamente 407. dos plasmídeos resultantes da transformação de E. coli continha 15 \ \ pelo menos a substituição de uma base. Efectuaram—se vinte reacções de mutagénese separadas e usaram—se para transformar E. coli e uma fracção de cada uma das culturas resultantes foi reunida para formar um "stock” de mutantes.
Quando uma amostra do "stock" de mutantes foi sujeita ao regime selectivo usando Mab 9.6 para a selecção negativa e o ilab 35.1 para a selecção positiva, encontrou-se que 1Ô-157. dos plasmideos recuperados possuíam o fenótipo pretendido. Após dois ciclos, os mutantes pretendidas constituíam 5ú—757 da população de plasmideos. Q mesmo “stock" de mutantes foi usado para todas as selecçoes de mutantes subsequentes.
Loca 1 i,zacão de mutações
Cento e quatorze (114) mutantes primários foram isolados, resultando numa colecção de 50 variantes diferentes da sequência de aminoácidos. Os resultados das selecçoes de mutantes estão resumidos nas Figuras 2 e 3. Toda a variação cai em três regiões discretas. A região está centrada à volta da Lis48 e contém 47 mutações para todos os anticorpos do grupo 1 (9.6, 7E10, HT11D e MT91D), todos os anticorpos do grupo 11 com e;:ce-pção de um e um anticorpo do grupo 111 (Figura 3a). A região 2 está. centrada à volta da Gli95. Mesta segunda região de epitopos, obtiveram—se 27 mutantes usando cinco anticorpos diferentes para a selecção neqativa (Figura 3b). 0 único anticorpo estimu. 1 ador contacta uma região mais vasta do que qualquer um dos outras anticorpos, mas não se pode fazer outra distinção clara; cada um dos anticorpos dá um padrão único de mutação. A maior parte dos anticorpos que reconhecem a regiãD 2 têm pouco efeito na activa— ção de células T. A região 3 está representada pot uma única mutação que provoca perda de reactividade com ambos os anticorpo^ do cjru.po IV (9.1 e 0CH217). 16 16
A figura 3a em particular mostra a colecção de mutantes que definem a região epitópica .1 - Os resíduas 42—56 de CD2 estãD apresentados por cima da substituição de aminoácidos codificada por cada um dos mutantes. A primeira coluna na direita mostra o anticorpo usado para a selecç^o negativa. A segunda coluna mostra o (s) anticorpo (s) da selecção positiva. "Todos os 16" indica que todos os 16 monoclonais na Tabela 1 foram combinados e u.sados no passo de selecção positiva. "7 outros" significa que os sete anticorpos que não o 35.1 reconhecendo a primeira região epitópica foram combinados para d passo de selecção positiva. As variantes directamente sob a sequência de CD2 foram obtidos por selec™ ção de mutantes a partir de um conjunto de plasmídeos mutageni-zados no domínio extracelular da proteína. As variantes sob as barras indicam os mutantes adquiridos pelo método deste invento usando plasmídeos mutaqenizados apenas pelos oligonucleotídeos que cobrem o comprimento das barras. A colecção de mutantes que definem a região epitópica 2 está. apresentada na. figura 3b. Os resíduos de CD2 86 a 1ΦΘ estão mostrados por cima das substituições dos mutantes. As outras notações são como na Figura 3a.
Rosetas de eritrócitos A capacidade das proteínas mutantes de CD2 para promoverem a adesão de eritrócitos humanos mediada por LFA-3 a célu.las COS transfectadas foi medida por um ensaio qualitativo de rosetas de eritrócitos. Foram avaliados três fenótipos; tipo selvagem, parcial e não formadores de rosetas. Muitas das mutações conducentes a alterações na região 1 e 2 (reactivo com anticorpos dos grupos 1, 11 e 111) reduziram dramaticamente a formação de rosetas. Para. examinar isto melhor, criaram-se alguns mutantes por mutagénese específica com oligonucleotídeos. A substituição de esperagina ou alamina por lisina em cada uma das posições 46, 47 e 48 da região epitó.pica 1 demonstrou uma correlação estreita 17 entre a ligação do anticorpo monoclonal do grupo 1 9.6 e a adesão de eritrócitos. L±s4óAsn/Ala mostrou um efeito fracD sobre Mab 9.6 e a ligação de eritrócitos; Lis47Asn/Ala não teve qualquer efeito em ambos; e Lis4SAsn/Ala aboliu completamente ambas as interacçSes. De um modo semelhante demonstrou-se que o resíduo 51 é importante para a ligação de eritrócitos e do Mab 9.6. 0 resíduo 52 teve apenas um efeito fraco em qualquer uma das interacçSes.
Experiências subsequentes com outros anticorpos e outros mutantes mostrou que Lis48 desempenha um papel importante na interacção de CD2 com anticorpo do grupo 1 e LFA-3 (Figura 2 e 4). Por exemplo o mutante Lis48Gli não reage com todos os anticorpos do grupo 1 e nenhuma das moléculas substituídas na Lis48 tem qualquer actividade formadora de rosetas detectável. 0 comportamento das substituições na Lis48 constitui uma das evidências mais fortes do que os anticorpos do grupo limitam a efeito da ligação de LFA-3 ao provocarem a proliferação de células T.
Apenas um anticorpo que participa na activação de células T reconhece determinantes na segunda região epitópica. As substituições nesta área caracteristicamente diminuem a formação de rosetas sem a eliminarem completamente, de acordo com a noção de que mutações seleccionadas com anticorpos que promovam a activação são geralmente mutações que afectam a formação de rosetas.
Efeitos de substituições de aminoácidos individuais
Apesar de alguns resíduos poderem determinar directa-mente a reactividade com anticorpos, parece que Dutros, de 18 importância secundária para a afinidade de anticorpos, podem ser identificados devido a estarem frequentemente alterados em associação com outras alterações. Por exemplo, uma substituição Lis46Asn encontra—se frequentemente em mutantes que não se ligam ao I1ab 9.6, mas por si sós provocam apenas perda parcial da ligação. Um fenómeno semelhante poderá estar presente no isolamento repetido de mutantes duplos nas posições 51 e 52.
Em principio, as substituições de aminoácidos podem conduzir â perda de ligação de anticorpos ou de LFA-3 através da eliminação de uma interacção especifica ou por causarem uma desnaturação local. Alguns padrões de ligação de anticorpos ou de LFA-3 são contra esta última possibilidade. Por exemplo, todas as moléculas substituídas na Lis48 ainda ligam o Mab -35.1, o qual é sensível a alterações na Ile49. De um modo semelhante, o Mab 9.6 e LFA-3 não se podem ligar á variante GlnSlLeu, a qual no entanto é reconhecida pelos anticorpos 7E10 e 9-2. CD2 tendo uma substituição Gln51Arg não reage com 7Ε1Θ e 9-2 mas liga-se a LFA-3 indistintamente do tipo selvagem. Na segunda reqião epitópica a mutação Tir91Asp provoca perda da formação de rosetas mas a ligação ao anticorpo NU-TER não é afectada mesmo que muitas substituições na posição 92 eliminem a actividade NU-TER.
Num caso, a. desnaturação local pode desempenhar um papel importante na perda de ligação de anticorpos. Sabe-se que os resíduos de prolina possuem uma. liberdade conformacional limitada que não fornece a formação cia hélice alfa (Chou, P.Y. e Fasman, G.D., An n . Rev. Bi oc hem. 47:251-276 (1978)). As variantes de Gln51F‘ro não são reconhecidas por qualquer um dos anticorpos que reagem com a primeira região epitópica e Gln51Prc« é frequentemente isolado por selecção negativa com anticorpos da região 1 se se usar selecção positiva com todos os 16 anticorpos. No caso mais extremo, a selecção negativa com o Mab 35.1 conduz 19 exclusivamente a GlnSlPro quando todos os 16 anticorpos s3q combinados pa.ra. selecção positiva. Para evitar o isolamento repetitiva de Gln51Pra, muitos dos mutantes na primeira região epitópica (Figuras 2 e 3) foram isolados usando o Mab 35.1 como o único anticorpo de selecção positiva.
Para isolar um mutante 35.1 que não seja o GlnSlPro, apenas os anticorpos que não se ligam a esta variante foram usados na selecção positiva. Após três ciclos de enriquecimento, obteve-se um único mutante 35.1 Ile49Gln que foi alterado nas três bases do codão original. A natureza invulgar desta mutação sugere que o anticorpo 35.1 derive a sua afinidade de caracteris-ticas múltiplas da conformação de CD2, de modo que a substituição de uma única característica apenas raramente conduz a uma afinidade muito mais baixa. A mutação GlnSlPro pode eliminar várias destas interacçSes por alteração profunda, da estrutura secundária local. Devido á afinidade do anticorpo 35.1 ser comparável à da anticorpo 9.6 (Martin, P.J. et al.. J Immunol. 131;180-185 (1983)), parece que o espectro mutacional invulgar deste anticorpo deriva de um modo qual i. tativamen te diferente de ligação e não simplesmente de uma interacção mais forte. Um outro anticorpo do grupo 11, T11/3PT2H9, também deu mutaç3es G1n51Pro exc1usivamente quando todos os 16 monoclonais foram reunidos para o passo de selecção positiva.
Epítopos de anticorpos do grupo IV
Obteve—se apenas um mutante para os anticorpos do grupo IV, uma dupla substituição Tir 14€>Asn/Gln 141His No entanto, os anticorpos do grupo IV reagem apenas fracamente com a molécula CD2 expressa em células CDB, uma situação reminiscente da reacti-viclade fraca dos anticorpos do grupo IV com CD2 em células
T não activadas, (Meuer, 3.C. et ai.. Cel1 36:897-906 (1984))» A activação prévia das células T ou incubação com um anticorpo do grupo 1 é necessário para tornar disponível o epítopa dos anticorpos do grupo IV (Meuer, S.C. et al., supra). A aquisição rápida da reactividade de anticorpos do grupo IV sugere que seja provocada por uma mudança conformacional na molécula e não por síntese de novo de uma espécie diferente (Meuer, 3.C., et al., supra; Yang, S»Y., et al., J. Immunol 137:1097-1100 (1986)).
Cada um dos anticorpos monoclanais neste estuda deu. um padrão linear contíguo de variação mutacional. As três regiões epi.tópicas são hidrofílicas como seria de esperar para uma fracção exposta da molécula disponível para ligação de anticorpos (Figura 2). Podem ser colocadas várias alternativas para explicar qual a razão de apenas algumas fracçoes restritas da molécula darem origem a múltiplos anticorpos independentes. Por exemplo, prevê—se qu.e uma fracção do primeiro epi topo forme uma hélice alfa com resíduos hidrofílicos num dos dados da hélice e com resíduos hidrofóbicos no outro (Chou, Ρ.Υ. e Fasman, B.D., Ann. Rev. Biochem. 47:251-276 (1978)). Pensa-se que tal hélice forme um antigénic· particularmente favorecido para reconhecimento pelas células T (De Lisi, C., e Berzofsky, J.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 62:7048 (1985)), e reconhecimento desta região por células T "helper" de ratinhos pode focar a resposta de anticorpos. Na região correspondente á região epitópica 2 (Figura 3b), encontram-se três potenciais sítios de g1icosilação ligado em N na sequência CD2 de rato (Williams, A.F., et al.. J. Exp. Med. 165:368-380 (1937)) que não estão presentes na sequência humana» Isto pode servir para aumentar a reactividade com a sequência humana através da redução do número de células T supressoras de ratinho que possam Como alternativa o dar reacção cruzada. com a sequência humana, espectro restrito dos sítios de ligação de
anticorpos podo surgir da selecção prévia de anticorpos quanta è. reactivida.de com receptores de eritrócitos. CD4 0 método do presente invento foi usado para isolar variantes de substituição de aminoâcidos de CD4. As mutações que afectam a ligação de H'ÍV foram encontradas num aglomerado de epítopos que inclui o epítopo Leu3a (Figura 4). As experiências de mapea.mento de epítopos mostram que a. maior parte dos anticorpos anti-CD4, incluindo os que são mais eficazes no bloqueamento dí? interacçSes CD4-gpl20, reconhecem o domínio amino— terminal de CD4. As localizações dos epítopos juntamente com a semelhança, entre o domínio amino-termina 1 de CD4 e os domínios V de imuno— globuli.nas permite a modelação da superfície de CD4 que inter-ac tu a c om g h12Φ„ CD2 pode mediar a adesão célu.la-célula e as reacçSes de activação independentes de antigénio. A proteína ghl20 do envólu- —9 cro do HIV liga-se a CD4 com elevada afinidade (Kd 10 fí) permitindo a entrada do vírus na célula hospedeira. A expressão de CD4 na, superfície celular é necessária à penetração virai e parece, nas células humanas, ser suficiente para a susceptibi1i-dade à infecção. A interacção entre CD4 e gpl20 também medeia a formação de síncicios, entre células infectadas portadoras de CD4, o que é pelo menos parcialmente responsável pelos efeitos citopáticos observados após infecção virai in vibro. incluindo os
Os sítios de ligação funcionalmente definidos identificados pelo método deste invento e em particular os dirigidos á molécula C-D2 ou à. molécula CD4 podem ser preparados na forma solúvel e podem portanto ser usados em métodos de ensaios de imunodiaqnóstico bem conhecidos, incluindo os radioimunoensaios,
imunoensaios com enzina e ensaios imunosorventes ligados a enzinas. Ainda, os antigénios de superfície celular isolados pelo método do presente invento podem ser preparados na forma solúvel e administrados sozinhos ou em combinação com outros antigénios da superfície celular deste invento para o tratamento de perturbações relacionadas com o sistema imune em animais, incluindo seres humanos. São exemplos de tais estados as doenças de ímuno-deficiências, AIDS, asma, artrite reumatóide doenças renais imunopatogénicas, endocrinopatias imunes e rejeição de teci-dos/orgãos transplantados.
Ao formar solúveis de CD4, sem o terceiro domínio extracelular ligado por pontes dissulfureto assim como as reqiSes transmembranares e citoplasmá.ticas, são capazes de se ligar a gp!20. Deen, K.C. et al., Nature. 331:82-84 (1988); Dalgleish, et al., The Lancet, 7 de Novembro, 1987, pâg. 1047—1049. Isto limita a actividade de ligação a HIV de CD4 aos dois domínios mais perto do extremo amino tem maior homologia com os domínios da região V das imunog1obu1inas, sugerindo que gpl20 pode interactuar com um domínio de CD4 tipo imunog1obu1ina, 0 sítio de ligação a HIV em CD4 foi indirectamente localizado usando anticorpos monoclonais que interferem com as interacçSes CD4-phl20. Dois epítopos de C'D4 parecem estar perto do sítio de ligação a HIV, um definido pelos anticorpos Leu.3a e C1KT4A e o outro definido pelos anticorpos ΜΤ1Ξ1 e VIT4. Os dois epítopos são especialmente distintos, os anticarpjos que reconhecem um epí topo não interferem c.om a ligação de anticorpos que reconhecem o outro. Anticorpos anti-id.iot.ipo induzidos contra o anticorpo Leu3a também reconhecem uma fracção conservada de gpl20 indicando que o epítopo Leu3a pode de facto compreender parte do sítio de ligação a HIV.
Assim, como resultado da identificação da sitio de ligação a H1V em CB4, é possível produzir peptídeos que interferem com a capacidade de HIV para infectar células humanas evitando que o vírus interactue com o receptor da superfície celular CD4. Isto pode ser feito, por exemplo, produzindo peptídeos que se ligam ao HIV, evitando assim que ele se ligue ao receptor da superfície celular. Assim é particularmente útil para este fim, por exemplo, peptídeo tendo a mesma sequência de aminoécidos ou muito parecida ao epítopo Leu3a ou à sublinhada por cima na Figura 4. Tal peptídeo pode ser sintetizado, usando técnicas conhecidas, e introduzido (e.g. por via intravenosa) num indivíduo na forma solúvel (e.g., como parte de uma outra proteína, como seja uma imunoglobulina) em quantidades suficientes para se ligar ao HIV e interferir com a sua capacidade para infectar células.
Quando usado em imunoterapia, os antigénios do presente inventa podem ser marcados ou não marcados com um agente terapêutico. Exemplos de tais agentes incluem drogas, radioisótopos, lectinas e toxinas celulares. Os métodos e composições deste invento serão ainda exemplificados pelos exemplos que se sequem não limitant.es.
EXEMPLO I
Mutaqénese com oliqonucleotídeos 01iqonucleotídeos degenerados foram sintetizados num sintetizador de DMA Applied Biosystems usando uma mistura de fosforamidetos, 957 da sequência tipo selvagem e 1,77 de cada. um dos outros três fosforamidetos, em cada uma das posiçSes. Os 60Θ nucleotídeos da. sequência CD2 a seguir à posição 63 tal como aparecem em Seed, B. e Aruffo, A., Proc. Natl . Acad. Sei.,__USA, 84i:3365—3369 (1987) foram sintetizados numa colecçã.c· de vinte 24 o 1 igonuc1eotídeos de -meros .
A sequência também aparece no pedidD de patente copendente dos Estados Unidos N.Q de série 160 416 do Requerente, entregue em 25 de Fevereiro de 1938. Cada um dos o 1igonuc1eotídeos sobrepSe-se à sequência de oligonucleo-tídeos precedente em três bases. A base mais perto de 3' é inutável ( a síntese prossegue 3'-5' a partir de fosforamideto ligado, fixado a uma resina); no entanto, podem ser obtidos mutantes que estejam alterados na base mais perto de 5' determinada por um o1igonuc1eotídeo. Isto implicaria que uma sobreposição de 1 base é suficiente para tornar todas as posiçSes mutáveis. Os oligonucleotídeos não foram purificados após des~ protecção e remoção do sal, mas antes foram imediatamente fos-forilados usando cinase de po1inuc1eotídeos (Pharmacia) nas condiçSes descritas por Maniatis, Tet al . , Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratary, Cold Spring Harbor, New York (1932). Dez manogramas de cada um dos oligD-nucleotídeos fosforilados foram separadamente adicionados a 500 ng de molde de cadeia simples. Cada uma das misturas foi aquecida rápidamente a 7Ã9C, arrefecida até à temperatura ambiente e adicionou-se trifosfatos de deo:·: inuc 1 eot í deos , 10 unidades de transcripta.se reversa (Life Sciences) e tampão de transcripta.se reversa para fazer um volume final de reacção de 10 ul. Após uma hora de incubação a 379C, adicionou-se ditiotreitol, ATP e albumina do soro bovina para se obter as condiçSes de reacção recomendadas para a DNA-ligase de T4 (New England Biolabs) que foi adicionada (400 unidades) para mais uma incubação de 15 minutos a 372C. Um quinto de cada reacção de ligação foi usado para transformar E. coli resultante em aproximadamente 1000 colónias bacterianas de cada oligonucleotídeo. As colónias de cada uma das placas foram raspadas-; para L.B e feitos 20 "stocks" em glicerol, cada um representando uma população de piH3MCD2 mutagenizado dentro de uma sequência diferente de bases. pares de 'ner DNA molde de cadeia simples foi preparado na estirpe BW313/p3, derivada de BW313 (Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82.:483-492 (19S5>) por transformação com o plasmídeo p3 relacionado com RP1 (Seed, B., Nuc. Acid Res. 11:2427-2445 (1933)). BW313/p3 permite a selecção de plasmideos contendo um gene de tRNA supressor por crescimento em meio contendo ampicili-na e tetracic1ina. 0 plasmídeo piH3MCD2 foi introduzido em BW313/p3 e o DNA da cadeia simples foi preparado injectando a estirpe portadora do plasmídeo com o vírus M13 tipo selvagem como descrito (Levinson, A, et al, J.Mol Αρρί. Genetics 2:507—517 (1984)). 0 DNA de cadeia simples produzido em BW313/p3 tinha 20-30 resíduos uracilo por molde. IstD permite uma selecção eficaz da cadeia de DNA feita irt vitro e da incorporação do oligonucleotídeo (Kunkel, T.A., supra). A frequência de incorporação foi de apro;·; imadamence 75%.
As alterações específicas de aminoácidos nas posições 46, 47 e 48 foram feitas de modo semelhante, excepto terem sido usados ds c1igonuc1eotídeos com potencial codificador especificada em vez dos o 1igonuc1eotídeos degenerados.
EXEMPLO II
Selecção de mutarites de CD2
Prepararam-se esferoplastos a partir de bactérias portadoras de piH3(MCD2 mutagenizado e fundiram-se com células CQS coma descrito no pedido de patente copendente dos Estados Unidos N2.de Série 16Θ.416 do Requerente, entregue em 5 de Fevereiro, 1988,. Quarenta e oito horas após a fusão, as células COS expressando CD2 foram descoladas da placa com PBS/EDTAlmM. As células COS de seis placas de óDmm foram então incubadas em F‘BS, 10% de soro de vitela, C,02% de azida de sódio (PBS-FBS) contendo uma diluição de 1/10Θ0 de fluido ascítico do anticorpo de selecção
neqativa. Todas as incubações com anticorpos foram efectuadas em lml de PBS-FBS durante 30 minutos em gelo e foram seguidas de centrifugação através de uma almofada de 27. de Ficoll em PBS. As células foram então incubadas com 5 p.g/ml de anticorpo de coelho anti-IG de ratinho <Rockland). Dois mis de complementa de coelho a 507. (Pel-Freeze) em DME (GIBCO) foram então adicionados e incubadas a 372C durante 30 minutos com agitação para evitar a formação de agregados. O complemento foi removido por diluição para 10 mis com PBS/EDTA 5mM e centrifugação das células de uma almofada de 5ml de ficoll. As células foram então incubadas com uma diluição a 1/1000 do anticorpo de selecção positiva e adicionadas a placas revestidas com soro de carneiro anti imunog1obu1i-na de ratinha (Cooper Biomedical) (Wysocki, L.J., e Sato, V.L. Proc .Na.t 1 Acad . 5c i , USA 75:2844-2848 (197B) preparado como descrita no pedido de patente copendente dos Estados Unidas NQ.Série 160.416 do Requerente, entregue em 25 de Fevereiro de 1988. Depois de decorrida uma hora durante a qual as células aderiram, as células não aderentes foram suavemente removidas por lavagem e o DMA foi preparada a partir de um sobrenadante de l-lirt das células aderentes. D E)NA recuperado foi usado para transfor— mar E - c o 1 i IÍC1061/p3 e as colónias resultantes foram sujeitas a posteriores- ciclos de selecção ou. analisadas directamente. Para a análise directa o DNA de plasmídeo preparado a partir de colónias individuais foi usado para transfectar células COS por um processo com DEAE-dextrana como descrito no pedido de patente copenden··· te dos Estados Unidos N2. de Série 160.416 do Requerente, entregue em 29 de Fevereiro de 1988. Os fenótipos mutantes foram testados por imunofluorescência indirecta sequenciada usando primeira a anticorpo de selecção negativa seguido do anticorpo de selecção positivo.
Quando se teve de mutagenizar todo o domínio extracelu-lar de CD2, as bactérias dos 20 conjuntos foram combinadas para 27 dar uma preparação substituída ao acaso. Para a mutação directa usou-se apenas as bactérias de um ou dois conjuntos.
Um painel parcial de anticorpos monoclonais foi obtido através do "Third International Workshop on Leukocyte Typing".
EXEMPLO III
Análise da sequência do DMA e formação de rosetas dos mutantes de CD2 A sequência de DNA dos mutantes foi determinada em moldes de cadeia simples ou DNA de plasmídeo desnaturado com bases pelo método dos dideso:<inucleotídeos (Sanger, F. et. al . , Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74:5463-5467 (1977)). Para os mutantes obtidos usando piH3MCD2 mutagenizado ao acaso, todo d domínio extracelular do CD2 foi sequenciado. Para os mutantes obtidos por mutagénese directa sequenciou-se uma fracção de 2Φ0 pb do cDNA contendo a região mutagenizado. Em todos os casos as mutações caíram dentro de um único d1igonucleotídeo como era de esperar.
Quarenta e oito horas após a transfecção deixou-se sedimentar sobre as células COS aderentes, uma suspensão a 27. de eritrócitos Peterson durante me .ia hora à temperatura ambiente. 0 excesso de eritrócitos foi suavemente removido e o fenótipo avaliado ao microscópio. Todos os fenótipos de roseta testados em pelo menos três ocasiões separadas com tipo selvagem e testemunhas negativas. Nalguns casos a expressão do CD2 de superfície foi confirmada por imunofluorescência indirecta após exposição a eritrócitos.
As rosetas tipo selvagem são caracterizadas por uma ligação forte dos eritrócitos às células COS. A formação parcial de rosetas surge como menos eritrócitos ligados mais froucamente do que nas rosetas tipo selvagem. A ausência de rosetas significa que o mutante não se distingue de um controlo negativo (i.e., células COS e:·:pressando CS3) . A Tabela. 2 resume as várias substituições dos mu.tantes que deram origem a padrões de rosetas. As substituições de aminoâcidos separadas par vírgulas estão presentes na mesma molécula. TABELA 2
Sem rosetas Lys4SA1a/Met/Glu 61n51Leu GlnSlPro Thr93Ser,Gly95,Vai Asn971le
Rosetas tipo selvagem Rosetas parciais
Lys47Ala/Asn Lys46Ala/Asn
GlrtSlArg GlnPhe51-2ArqSer
Phe52Val,Glu55Gly TyrGln140—lAsnHis Tyr91Asp
Asp92His EXEMPLO IV Selecção de mutantes de CD4 0 método geral aqui descrito através do qual os mutantes de antigénios de superfície que perderam epítopos são isolados foi aplicado ao antigénio CD4 com a modificação dos esfero-plastos serem preparados a partir de bactérias portadoras do plasmídeo mutagenizado piH3MCD4. 0 antigénio CB4 é de particular interesse por servir como sítio de ligação do HIV ás células T. foi introduzida 0 isolamento de mutantes que perderam epítopos foi efectuado como se segue: Um cDNA de CD4 isolado a partir da linha celular HPB-ALL foi mutagenizado através de empare1hamento de oligonucleotídeos degenerados, preparados como descrito no E;<emplo I, com um molde de cadeia simples substituído com desoxi-Liridina. A população mutagenizada de plasmídeos
em células COS por fusão de esferoplastos. Dois dias após a fusão, as células foram colhidas e sequencialmente incubadas com um anticorpo monoclonal anti.-CD4, anti-soro de coelho anti-Ig da ratinho e complemento de coelho. Isto resultou na selecção de células portadoras de determinamtes reconhecidos pelo anticorpo monoclonal. Para evitar o isolamento de rearranjos que eliminam completamente a expressão de CD4, as células que restaram após lise completa pelo complemento foram incubadas com um conjunto de monoclonais anti-CD4 e deixou-se as células aderirem a placas de petri revestidas com soro de cabra anti-Ig de ratinho. 0 DNA de plasmídeo recuperado das células que aderiram ãs placas revestidas com anticorpo foi usado para transformar E. coli, amplificado e reintraduzido em células COS. Após três ciclos de selecção em células COS, as preparações de plasmídeo de colónias bacterianas individuais foram usadas para transfectar células COS e testadas dois dias mais tarde por imunof1uorescência indirecta. Os pla.smí-deos que codificam moléculas de CD4 que não reagiram com α monoclonal usado para a fixação do complemento mas que mantiveram outros determinantes CD4 foram então sequenciados. A Figura 4 mostra na sequ.lncia primária a localização dos aminoãcidos cuja substituição conduz à perda de ligação dos anticorpos indicados. A Tabela 3 indica o aminoãcido que foi substituído em cada um dos casos. As variantes de aminoãcidos são referidas pela convenção resíduo tipo sei vagem—posição—novo resíduo na Tabela. 3 e ao longo do texto, e.g. uma variante portadora de uma substituição de serina normalmente encontrada na posição 18 por tirosina é referido como Ser 18 Tir. A maior parte das mutações que foram isoladas foram substituições de nucleotideos. Foram também isoladas uma inserção e uma deleção. Estes dois rearranjos não estão aparentemente relacionadas com a. mutagénese com ol igonuc leatídeos mas em vez disso resultaram da passagem através de células COS. Sabe—se que
a. transfecção de células C-OS resulta numa taxa de mutação de cerca de 17.. A maioria das lesões são inserções e deleções.
Localizações de epitopos A maior parte dos mutantes, incluindo vários seleccio— nados usando anticorpos que podem potencialmente bloquear a interacção gpl20-CD4 codificam substituições de aminoácidos no domínio amino-termina1 de CD4 relacionado com Ig V. Este domínio tem várias das características principais de um domínio de Iq, duas cisteínas, uma arginina e um ácido glutãnico, que numa imunog1obu1ina formam uma ligação dissulfureto e uma ponte salina respectivamente e um resíduo triptofano conservado, tornando altamente provável que o extremo aminD de CD4 se enrole do mesmo modo que um domínio V de Ig. Com base na hipótese de este domínio de CD4 enrolar de modo semelhante a um domínio V de Ig, pode-se fazer um modelo das localizações das substituições; de aminoácidos numa estrutura enrolada. A criação de um modelo permite fazer previsões acerca da interacção de gpl20 com este domínio de CD4. 0 anticorpo óó.l selecciona mutações que provocam variações de aminoácidos do extremo amino de CD4 (Fiqura 4 e Tabela 3). As substituições estão separadas com até cerca de 23 resíduos, sugerindo que óô.1 reconhece um epítopo que é formado pelo padrão tridimensional de enrolamento da proteína e não pela sequência primária de aminoácidos. As mutações caem dentro de duas regiões que poderiam corresponder à primeira e segunda regiões hipervar.iáveis de um segmento V. de Ig. Estas duas regiões estão perto uma da outra numa molécula de imunoglobulina enrolada se bem que estejam muito afastadas na sequência primária. Este resultado apoia fortemente a ideia de que o domínio amir;otermina 1 de CD4 se enrola de modo --Ofnelhante aos domínios V d e I g .
A capacidade dos anticorpos anti.-CD4 para bloquear a ligação de outros anticorpos anti-CD4 também apoia o padrão de enrolamento Ig. Por exemplo os mutantes seleccionados usando os anticorpos VIT4 e 13B.8.2 codificam substituiçSes de aminoácidos ssparados por 7Θ resíduos dos codificados pelos mutantes selec··· cionados com G19-2 (Figura 4 e Tabela o·). Tanto loB.B.2 como VIT4 podem substancia 1mente bloquear a ligação de G19—2; isto seria previsto a partir do padrão de enrolamento de Ig.
Os anticorpos 66.1 e G19—2 são incapazes de bloquear a interacção CD4-gpl2{? mesmo, muitas vezes, na concentração de saturação. Isto significa que gpl20 interactua com CD4 de um modo que não envolve a face· da molécula que seria formada pelos homólogos das cadeias B e C de CD4. A ligação de Leu3a ou de 0KT4A pode bloquear a ligação do outro anticorpo. A ligação dos anticorpos não é capaz de eliminar eficazmente a ligação dos anticorpos de óó.l e G19-2. D mutante seleccionado usando 0KT4A codifica uma substituição de um resíduo na cadeia D de uma dobra de Ig; os mutantes seleccionados com Leu3a codificam variantes das cadeias C' e C''. A configuração das cadeias B, CC', C'' e D numa Ig enrolada leva à previsão de que Leu3a e T4A interactuam com a face do domínio formado pelos homólogos das cadeias D, E e 0'' de CD4. Tanto T4A como Leu3a bloqueiam a interacção CD4-gpl20 com concentrações de anticorpo muito baixas. Se 0KT4A e Leu3a bloquearem o acesso de gpl20 a um sítio no domínio amino—terminal de CD4, o sítio deve estar nas regiões homólogas das cadeias D, E e C'' de CD4. o A ligação do anticorpo VIT4 a CD4 não interfere com a ligação de Leu3a ou de T4A. Isto não é surpreendente dada a localização do epítopo de VIT4 (Figura 4), no entanto VIT4 é tão potente quanta Leu3a e T4A no bloqueio da formação de sincícios dependentes cie CD4-gpl20. VIT4 deve bloquear indirectamente ou deve •acesso de gpl2« a um sítio de ligação na cadeia D, E, C'' interferir com um sítio de ligação espacialmente distinto, pelo bloqueio do acesso indirectamente ou pela ocupação do sítio de ligação. D facto de BI9-2 competir com VIT-4 na ligação a CD4 mas-não bloquear a interacção CD4-gpl20 sugere que a capacidade de VIT4 para bloquear gpl20 é indirecta. A conservação filogenética da susceptibi. 1 idade ao HIV sem conservação do epítopo de VIT4 apoia a noção de que este epítopo não está directamente envolvido na ligação do HIV. D anticorpo MT151 bloqueia a interacção com CD4 de modo semelhante a VIT4; ele bloqueia a interacção de gpl2« mas não QKT4A ou a ligação a Leu3a. As substituições codificadas pelos mutant.es que perderam o epítopo MT151 encontram-se 5 resíduos e 77 resíduos afastadas no sentido carboxi-terminal relativamente à substituição associada á perda do epítopo VIT4. 0 anticorpo Γ1Τ151 reconhece claramente um epítopo formado pela conformação da proteína enrolada. Este epítopo sobrepSe-se à região dos epítopos dc? VJ.T4 e de 13B-8.2 mas também inclui a parte carboxi-termina.l do segundo domínio. 0 epítopo MT151 coloca o extrema carboxila da segundo domínio ligado por ligações dissulfureto de CD4 muito perto da extremo carboxila do domínio amino—terminal tipo Ig e reforça a possibilidade de VIT4 e MT151 bloquearem a interacção CD4-gpl20 bloqueando o acesso a um sítio no segundo domínio, não no primeiro domínio.
Efeito de mutações na formação de sincícios..
Os mutantes permitem que sejam testadas algumas das previsões feitas a partir da localização dos epítopos. Uma manifestação da interacção de CD4—gpl2© é a formação de células gigantes muitinucleadas. Estes sincícios são pelo menos em parte, responsáveis pelos efeitos citopatogénicos da infecção virai. Os
sincícios podem ser formados por células que expressam apenas o produto gplòO do gene env de HIV e que interactuam com células que expressam CD4. Não conseguimos induzir sincícios em células COS transfectadas no entanto as células HeLa mostraram-se muito eficazes na fusão célula-célula. Cada um dos mutarites foi testado quanto à capacidade para colaborar na formação de sincícios, através da transfecção de células HeLa, seguido de infecção com um vírus da vacina recombinante que expressa gplóO de HIV. Linhas de células HeLa que expressam estávelmente alguns dos mutantes de CD4 foram criadas usando como vector um retrovírus portador da resistência a G—418. Células resistentes a G—418 em clones isolados ou em misturas foram expandidas e testadas quanto á formação de sincícios após infecção com um vírus da vacina expressando gplóO. Os mesmos resultados foram obtidos com o ensaio transitório, clones de expressão estáveis ou mistura de linhas celulares resistentes a G-418. A maior parte dos variantes de aminoácidos foi tão eficaz quanto CD4 tipo selvagem na formação de sincícios. Pelo contrário, as substituições dos aminoácidos 39, 44, 45 e 4ó teve um efeito drástico na capacidade de CD4 para induzir sincícios tal como uma mutação de inserção que foi isolada u.sando a selec-ção com ΙΊΤ151. Algumas das substituições provávelmente provocaram uma desnaturação localizada da proteína. Por exemplo, a variante seleccionada usando o anticorpo T4/13T3A9 tinha uma prolina a substituir a glutamina normalmente encontrada na posição 39. A prolina tem uma estrutura muito menos flexível do que a glutamina e deve-se esperar que altere a estrutura do enrolamento local. De modo semelhante as variantes seieccionadas usando 0KT4D, Sli46Arg e Gli46Glu, substituem glicina com resíduos volumosos carregados e devem desnaturar o homólogo da cadeia C* de CD4.
Se bem que as substituições que afectam a formação da sincicios possam destruir o enrolamento da proteína, várias observações sugerem que os efeitos sobre a formação de sincicios sejam devidos a pequenas variações na estrutura da proteína. As substituições, semelhantes ás que eliminam a formação de sincicios mediada por CB4, quando noutros locais, não t'è'm o mesmo efeito; a varainte Gln39Pro tem apenas uma capacidade moderadamente reduzida para suportar a formação de sincicios, as variantes 61i37Glu e Glnl64Pro são tão eficazes quanto CD4 tipo selvagem na participação de formação de sincicios. A variante de dupla substituição Lis45Asn, Gli4óVal seleccionado usando Leu3a não é óbviamente destrutivo mas elimina a formação de sincicios. 0 efeito da mutação de inserção, isolada usando MT151, na estrutura de CD4 é difícil de testar. Ele resulta numa grande inserção, 13 aminoácidos, perto do extrema da segundo domínio. As mutações pontuais seleccionadas usando MT151 demonstraram que CD4 enrola-se de modo a que esta fracçSa do segundo domínio esteja muito próxima do extremo carboxilo do primeiro domínio, é possível que a inserção tenha efeitos muito indirectos sobre o enrolamento de CD4 e altere o primeiro domínio.
As mutações que destroem a formação de sincicios poderão ser de pelo menos duas classes. Parece certo que mutações que eliminaram a capacidade de CD4 para ligar gpl20 eliminariam a capacidade para induzir a formação de sincicios. Uma outra classe de mutações é também possível; mutações que eliminaram a formação de sincicios mas não a ligação.
Efeito de mutações sobre a ligarão a HIV 0 efeito das ligar HIV foi testada mutações sobre a capacidade de CD4 para usando um ensaia de imunof 1 u.orescencia
indirecta. As partículas de vírus concentrada foram incubadas com células COS expressando os diferentes mutantes e as partículas ligadas foram detectadas usando soro humano com um título alto anti-gpl2Ô. A ligação foi quantificada por análise das células num citofluorímetro. Em cada um dos casos, a expressão de CD4 na superfície celular foi quantificada em paralelo usando monoclo— nais anti-CD4 e imunofluorescência indirecta. A capacidade das moléculas das variantes de CD4 ligarem o vírus foi consistente com a sua eficácia relativa na indução de síncicios. As mutações que eliminaram a formação de síncicios também eliminaram a ligação de partículas virais. As mutações que reduziram profundamente a capacidade de CD4 para suportar a fusão celular também reduziu a sua capacidade para ligar gpl2£. Isto mostra que o efeito primário das mutações reside na capacidade de CD4 para ligar gpl20 e não na sua capacidade para induzir síncicios.
Discussão □s efeitos das várias mutações sobre a capacidade de CD4 para ligar gp)12D são largamente consistentes com as previsões feitas a partir das 1 oca.1 izaçÕes dos epítopos. As mutações que provávelmente destroem a cadeia C' tem um comportamento alterado nos ensaios de ligação e de formação de síncicios. As mutações que alteram a cadeia C' ' eliminam a capacidade de? CD4 para ligar vírus. D mutante seleccionado usando o anticorpo 0KT4A é pressuposto comportar-se de modo diferente de CD4 tipo selvaqem no ensaio da formação de síncicios. Este mutante codifica uma substituição de aminoá.cidos na região homóloga da cadeia D do cDIMA de CD4. A substituição CDdif içada pelo mutante altera um padrão de sequência, que é conservado entre CD4 de? ratinho, rato e humano (ratinho-SKKG, rato-SRKN, humano-SRRS, QKT4A~-SRRR>. Parece provável que esta alteração de aminoácido altere a cadeia prevista D de CD4, no entanto ela não altera a ligação cie HIV. Em adição, o epítopo 0KT4A está fracamente conservado nas espécies de primatas que são infectáveis por H.TV, sugerindo novamente que a capacidade de QKT4A para bloquear a ligação de HIV seja indi-recta presumivelmente pelo bloqueio do acesso á região do epítopo Leu3A. 0 epítopo VIT4 também não está tão bem conservado quanto a susceptibi1 idade à infecção pelo HIV nas espécies de primatas e a mutação seleccionada usando este anticorpo não afecta a ligação de HIV. VIT4 provávelmente também bloqueia a ligação de HIV evitando indirectamente que gpl2ô interactue com sequências distintas do sítio de reconhecimento do anticorpo. As mutações seleccionada:-; usando este anticorpo caem no que corresponderia à quarta região hipervariável de um domínio V de Ig. é. possível que VIT4 bloqueie o acesso à fracção do sítiD de ligação ao HIV que identificámos como o epítopo Leu.3a. Tal explicação não á óbvia a partir da relação proposta entre as duas regiões epítopicas e do facto de VIT4 não interferir com a ligação de Leu3a e de QKT4A. 0 epítopo MT151, que se sobrepõe ao epítopo VIT4 no primeiro domínio, também atinge o extrema carboxilo do segundo domínio. Este epítopo traz a reqião epitópica VIT4 para mais perto do segundo domínio do que da face D, E, C'' do primeiro domínio. A capacidade de VIT4 e MT151 para bloquear a interac-ção qpl2õ~CD4 levanta portanto a possibilidade de um sítio de interacção com HIV no segundo domínio.
Os anti-soros anti-idiotipo que reconhecem o anticorpo Leu3a são capazes de neutralizar diversos isolados de HIV. Isto levou à sugestão de que este anticorpo deve reconhecer um determinante importante do sítio de ligação ao HIV. A concordância entre a expressão do epítopo Leu3a e a susceptibi1 idade ao HIV em espécies de primatas apoia· a importância do epítopo Leu3a para a ligação ao HIV. é fornecida ainda evidência directa da identidade
\ entre ο sitio de reconhecimento para Leu3a e um sítio que é importante para a ligação ao HIV. As variantes de CD4 que estão alteradas no reconhecimento por Leu3a também estão alteradas na sua capacidade para se ligarem ao HIV. 0 epítopo Leu3a fica no segmento de CD4 que corresponderia às cadeias C' e C'' de um domínio V de Ig. έ possível projectar reagentes que imitem a estrutura desta porção da molécula de CD4. Peptídeos pequenos que compreendem a cadeia C' e as suas regiões delimitantes devem ligar-se a gpl2© com suficiente avidez para evitar a interacção de gpl20 com CD4A substituição das cadeias C' e C'' de uma região V autêntica de Ig com os cognatos de CD4 deve de modo semelhante resultar numa estrutura que poderá interferir com a replicação de HIV e ou patologia. Tais reagentes serão importantes como agentes terapêuticos no tratamento de AIDS. A sequência primária de aminoácidos da proteína CD4 humana está apresentada na Figura 4. A sequência mostrada abaixo representa a sequência de ratinho onde difere da sequência humana. 0 sublinhado indica a extensão do domínio transmembranar de CD4. A barra por cima da sequência representa, o sítio de ligação ao HIV proposto para a proteína CD4. Os 16 anticorpos diferentes usados neste passo de selecção positiva estão apresentados ao longo da margem esquerda» 0 símbolo % acima da sequência primária indica que um mutante isolado usando um anticorpo particular tem uma posição naquela posição. As substituições nas posições de aminoácidos 39 e 46 afectarão a liqaç:ão ao HIV. Estas posições também estão indicadas na Figura 4. A Tabela 3 apresenta um resumo dos anticorpos usados no pxasso de selecção negativa e da colecçâo de mutantes de CD4 isolados usando os métodos deste invento.
TABELA 3
Anticorpo usado na. selecção negativa
Substituição de aminoácidos (indicado por posiçSo do resíduo norma1-reslduo novo)
Leu3a K34E* Lys34tólu Leu3a N38K e G46D Asn38Lys e Gly46Asp Leu3a Q39P e T44S Gln39Pro e Thr44Ser Leu3a K45N e G46V L.ys45Asn e Gly46Val T 4 F‘47S F'ro47Ser 94bl T44P Thr44F'ro OKTD G46D Gly46Asp 0KT4D G46R G1y46Arq T4/1BT3A9 Q39P Bln39Pro F101-5 G37E Gly37Glu G19-2 S18Y SerlBTyr G19-2 G19K Gin19Lys 66,1 Q19H e H26R Gin 19His e His26Arg 66, 1 S22G e I23V e Ser22Gly e Ile23Val H26L e His26Leu 136,8,2 E76K G1u76Lys * VI T 4 Q78L Gln7BLeu QKT4A S59R Ser59Arg 39 -
BL/10T4 G110 A GlyUOAla BL/10T4 P121H F'roí21His 0RT4E P121H Prol21His 0KT4B Q1Ó4P Gin 1ó4Pro NUTH—l A216G Ala216Gly MT321 V325I Vai 32511e * Nesta coluna usaram-se códigos de aminoácidos de uma letra único.
Equivalentes
Os que estão familiarizados com a matéria reconhecerão, ou poderão verificar, que usando apenas experimentação de rotina, muitos equivalentes da realização do invento aqui descrito.. Pretende—se que tais equivalentes estejam incluídos nas reivindicações que se sequem»
Claims (5)
- 46 REIVINDICACSES
- 15. - Método para isolamento de genes mutantes, carac-terizado para compreender os passos de: a. transfecção de células de mamífero com um vector ao qual está ligado um gene estrutural de interesse; b. tratamento das células de mamífero transfectadas com um primeira anticorpo monoclonal dirigida contra um epítopo da proteína codificada pelo gene estrutural e com complemento, em condições adequadas para que as células expressando o epítopo se liguem ao primeiro anticorpo monoclonal e se dê fixação do complemento e 1ise das células que expressam o epítopo; c. tratamento das restantes células de mamífero não lisadas com um segunda anticorpo monoclonal contra um segundo epítopo do gene estrutura1; d. indução da aderencia das células de mamíferos tratadas a um substrato res-estido com anti-soro que reconhece o segundo anticorpo monoclonal; e e. recuperação do DNA de plasmídeo das células aderentes.
- 25. - Método de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por a célula de mamífero ser uma célula CQ3. 3â. - Método de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por o qene estrutural de .interesse ser um ant.igenio da superfície celular.
- 45. - Método de acordo com a Reivindicação 3, caracte-rizado por o antigénio da superfície celular ser o antigénio CD2 de linfócitos T ou o antigénio CD4 de linfócitos T. 41
- 51. - Método para identificação de epítopos de proteínas de superfície celular caracterizado por compreender os passos de: a· transfecçSo de células de mamífero com um vector ao qual está ligado um gene estrutural de interesse; b. tratamento de células de mamífero com um primeiro anticorpo monoclonal dirigida contra um epitopo da proteína codificada pelo gene estrutural e· com complemento em condições adequadas para que células expressando o epitopo se liguem ao primeiro anticorpo monoclonal e se de fixação do complemento e lise das células que expressam o epitopo; c- tratamento das restantes células de mamífero não lisadas com um segundo anticorpo monoclonal dirigido contra um segundo epitopo do gene estrutural; d. provocar a aderencia das células de mamífero tratadas a um substrato revestido com anti-soro que reconhece o sequndo anticorpo monoclonal; e. recuperação dD DNA de plasmideo a partir das células aderentes ; f- amplificação do DNA de plasmideo recuperado numa célula hospedeira adequada; g- transfecçSo de células de mamífero com um vector do passo ía> em que o gene estrutural é o DNA de plasmideo recuperado e ampl if icacio; h. repetição dos passos (b) -(g) conforme adequado; i. transfecçSo de células de mamífera com DNA de plasmideo resultante do processo dos passos (a)-(h); e manutenção das células transfectadas em condições adequadas ã ocorrência da expressão do DNA do plasmideo; e plasmi™ j. detecção da ligação do produto de expressão do DNA de deo ao primeiro anticorpo monoclonal.6é. — Método para identificação de epítopos de proteínas da superfície celular, caracterizado por compreender os passos de: a„ transfecção de células COS de macaco com o vector piH3MCD2 ao qual está ligado um gene codificador de pelo menos uma fracção da proteína da superfície celular; b. cultura das células CQS transfectadas durante cerca de 48 horas; c. colheita das células transfectadas e tratamento das mesmas sequencialmente com um anticorpo de selecção negativa, anticorpo de coelho anti-imunog lobul ina. de murganho e complemento, em condiçSes adequadas para que as células expressando a proteína de superfície celular se liguem ao anticorpo de selecção negativa e se dê' fixação do complementa e lise das referidas células; d. colheita das células não lisadas e tratamento das células não lisadas com um anticorpo de selecção positiva; e. indução da aderencia das células não lisadas a um substrato revestido com soro de carneira ant.i-imunaglabu.lina de murganho; f. remoção das células não aderentes; g. preparação e recuperação de um extracto de DNA das células aderen tes; h„ transformação de Ε_^ co 11 !Ί01θθ1/ρ3 com o extracto de DNA recuperado; e i, sujeição das colónias bacterianas resultantes a outros ciclos de selecção, como nos passos (a)-(h) ou a análise directa da capacidade de ligação a anticorpos de selecção negativa. 7§, - Método de acordo com a Reivindicação 6, caracte-rizado por o gene estrutural ser um antigénio da superfície celular de linfócitos T e células B. Bé. - Método de acordo com a Reivindicação 6, caracte-rizado por o anticorpo de selecção negativa e o anticorpo de selecção positiva serem se 1 eccionados a partir do gru.po constituído pelos anticorpos da Tabela 1 seguinte: TABELA 1 Anticorpos usados para o isolamento de mutantes que perderam epitopos Isotipo Anticorpo 9,6 IgG2a 7E10 IgG2b MT 910 IgGj MT11Θ IgG1 95-5-49 35,1 IgG2a ΤΙ1/3PT2H9 igGj Τ11/3Τ4-8Β5 IqG,-, y 2a 9-2 IgM Nu-Ter IqGi CLB-T11/1 IgGj 39B21 IgG2a TS1/3,1,1 IgGj F92-3A11 IgG1 9,1 IgG2b QCH217 IgM 0 anticorpo 39E-'.21 é um monoclonal de rato e todo outros são anticorpos de ratinho 9§.~ Método aperfeiçoado para epitópicas de antigénios de superfície revestidos com anticorpos dirigidos o isolamento de celular usando contra o antigéniD variantes materiais de 44 superfície celular, caracterizada par a referido aperfeiçoamento compreender: a,, tratamento das células que expressam o antigénio de modo a que sejam lisadas as células que expressam um epítopo seleccionado; e b„ tratamento das restantes células não lisadas com um anticorpo monoclonal que reconhece um segundo epítopo distinto do antigénio de superfície celular, 10§, - Método para a preparação de um peptídeo solubi-lizado, que interfere com a infecção de células humanas pelo vírus da imunodeficiene ia humano evitando a ligação do vírus ao antigénio CD4, caracterizada por compreender os passos de; (a) identificação de um epítopo de antigénio CD4 ao qual o vírus se liga; e <b) síntese do epítopo sob a forma de um peptídeo solúvel ou como parte de uma proteína de fusão. 11§. - Método de acordo com a Reivindicação 1Θ, carácter izado por a sequência de aminoácidos do epítopo ser essencial-mente homóloga da sequência de aminoácidos do epítopo Leu3a do antigénio CD4. 12é. - Método de acordo com a Reivindicação 10, caracterizada por o epítopo ter uma sequência, de aminaâcidos essencialmente homóloga da sequência de aminoácidos do epítopo Leu.3a conforme representada pela sequência sublinhada da Figura 4 seguinte; Figura 4 Leu3a T4 94bl 0KT4D T4/18T3A9 F101-5 G19-266.1 * * ** * * * ** * * *** * * * 13B.8.2 VIT4 0KT4A KWLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNWNQIKILG. . NQGSFLTKQPS 48 TL E ESA P ES ITV T FSD R QHGK VLIRG SP * ★ _ * KLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFG 98 SQF F KKGA EK S NK M Q L NR E W F BL4/10T4 0KT4E * * * LTANSDTHLLQGQSLTLTLES. PPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQ 14 7 K TFSP T . D NSKV H LTE KHKK WS S V MN 0KT4B * LELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIWLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSF 197 RV DF N TLD NW GMTLS G STAITA S SA NUTH-1 MT321 PLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQ 247 N AE . .N W Μ K KD FFQP S SI QKS K L MGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLT1ALEAKTGKLHQEVNLWMRATQLQ 297 LKET T Kl VSL F T ..DK T KVA N * KNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKPVWVLNPEAGMWQCLLS 347 NT M MR T Q Q R EEQ V Q VA TL DSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCR 397 EGDK KMD R Q SRGVNOTVFL .C SF F G L C LC HRRRQ AERMS QIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCS PI 442 QQ A PM SHNL 46 13é. - Método de acordo com a Reivindicação 1Θ, carac-terizado por d epítopo ser expresso sob a forma de uma proteína de f LiSdO com uma imunog 1 obu.l ina, em que as cadeias C' e C" de uma região de imunog .1 obul ina V são substituídas pelo epítopo. Lisboa, 13 de Abril de 1989.J. PEREIRA DA CRUZ Ascnts Oíiciu ladustrial «UA v.CTLri CCaDCH. 10-A, 1/ 1200 LISBOA
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