JPS58502132A - モノクロ−ナル抗体及びリンホカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト・モノクローナル抗体およびリンホカインこれは１９８１年１２月８日に出 願した米国特許出願筒３２８．７３８号の一部継続出願である。

技術分野 本発明は、酵素欠乏性悪性パートナ−細胞の使用を必要としない、ヒト−ヒトハ イブリドーマ法を用いた、診断および治療に役立つ高見）特異性を有するリンホ カインおよびモノクローナル抗体の新規製造方法に関するものである。

発明の開示 更に詳細には、本発明は、特異抗体を生産することが知られているヒト細胞を、 酵素欠乏性である必要がないところの悪性ヒト・パートナ−細胞と融合させて生 成する融合細胞を、上記パートナ−細胞から分離し、次いで融合細胞を培養する 新規な方法に関するものである。この分離法は、融合細胞を抗血清と反応させ、 抗血清との融合生成物を２４時間以内に間接ロゼツト形成により分離するもので ある。

新しい継代培養法は、ウェルあたりの細胞数を約１０．０００に制限して、推定 クローンを複数回分画する方法を提供するものである。

特異抗体を生産する細胞の代りに、白血球阻止因子、インターフェロン等のよう な特異的リンホカイン（免疫モジュレータ−）を生産するヒト細胞を用いること もできる。

本発明を実施するための最良の形態 本発明の実施にあたって、患者を特殊なリンホカイン又は成る種の抗体の生産能 によって選択する。抗体の中には、ヒトの疾患の診断および治療に役立つ特異性 を有するものがある。これらのヒト・モノクローナル抗体が診断に役立つ疾患の 中には、抗原が末梢系へ流入する（　ｓｈｅｄｄｉｎｇ　）ような病気がある。

有用な特異性の例を挙げれば、癌腫、特に臨床タイプの乳癌、並びにヘルペスの ようなウィールス性状態（例えば、タイプ１および■）、および破傷風である。

本発明により生産された抗−Ｔ細胞抗体が有効である病態群の中には、例えば、 自己免疫病および免疫不全症状のような免疫調節障害、そして特に成人および若 者のリウマチ様関節炎、全身性狼槍、ひどい合併症を伴った免疫不全、並びに高 度−および低度−ガンマグロブリン血症がある。

診断並びに治療に利用できるもう一つの分野は、臓器移植の分野である。抗−Ｔ 細胞抗体の使用により、組織移植拒絶に関係する細胞をモニターし、細胞数を調 節することができ、それによって多くの症例において組織移植拒絶の危機の発生 および悪化を防止することができる。

また、本発明の方法は、種々の免疫モジュレータ−１例えば白血球阻害因子（Ｌ ＩＦ　）等のリンホカインおよびインターロイキン■を分泌するハイブリッドク ローンを生産するためにも用いられる。今までは、そのようなリンホカインを純 化することは困難だった。異ったリンホカインを生産する本発明のハイブリッド クローンを用いれば、リンホカインの生産および特徴づけに新たな道を開（こと ができる。

上述のような特異性を有する抗体又はリンホカインを生産する患者から、王とし てその末梢血からリンパ球をとり、それを悪性ヒト・パートナ−細胞と融合する 。このパートナ−細胞は、例えばＲＰＭｒ　（ローズウェル・パーク台メモリア ル・インスティチュート。

Ｂａｆｆａｌｏ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋンから入手できるような培養細胞から選 択することができる。速かな増殖、良好な安定性そして高い融合効率といった特 徴をもった細胞がより好ましい。

抗体生産細胞と、上記パートナ−との融合の結果、次のものの混合物ができる。

ｌ）融合細胞 ２ノ　非融合抗体生産細胞 ３）非融合悪性パートナ−細胞 融合細胞をこの混合物から分離するためには、先行技術は、酵素欠乏性融合パー トナ−１特にＨＡＴ（ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）感作細胞の 使用が必要であるとしている。しかし、このようなパートナ−使用には次のよう な欠点がある。

■）ハイブリッドクローン生産のための融合効率の減少 ２）速い増殖特性の喪失 ３）遺伝的不安定性の増加 ４）酵素欠乏性突然変異体悪性融合パートナ−細胞の選択および維持に、時間と お金がかがるという論理的困難。

本発明は、このような酵素欠乏性融合パートナ−使用の必要性を排除するもので ある。その代りに、そのクローンに特徴的な抗原特異性をもつことが同定され、 かつ非融合パートナ−細胞とは反応しないところの特殊な抗血清を加えることに よって、クローンを非融合パートナ−から正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５ｅｌ ｅｃｔｉｏｎ　）をする−という方法を用いるのである。これらの抗血清は、Ｈ ＬＡ　（ヒト白血球抗原）型判定試薬として入手できる。

パートナ−細胞を選択する場合、非融合抗体又はリンホカイン生産細胞以外の異 ったＨＬＡタイプの一つを用いなければならないことは、当業者には明らかであ ろう。抗体又はリンホカイン生産細胞と、パートナ−細胞との間に少くとも一つ 又はそれ以上のＨＬＡ対立遺伝子の相違があれば、普通融合クローンな非融合パ ートナ−細胞から効率よ（分離するために十分である。言いかえるなら、抗体又 はリンホカイン生産細胞と、パートナ−細胞との間に、多少交叉反応性があって もよいのである。１０個の対立遺伝子の中に１個でも違いがあれば、十分に分離 が可能である。融合細胞の抗血清との反応は、通常６０分以内に完了する。

抗血清と反応しなかった非融合パートナ−細胞からの、融合クローン細胞の正の 選択は、密度勾配遠心法を用いて、通常の間接ロゼツト形成法によって、２４時 間以内に行われる。

こうして、融合クローン細胞及び非融合抗体又はリンホカイン生産細胞との混合 物が分離される。これらの非融合細胞は生存期間が比較的短か（、通常１ｏ日以 下であるのに対し、融合クローン細胞は生き残って培地中で増殖する。

個々のクローンを継代培養するには、マウス（ｍｕローｎｅ）培養で用いられる ものとは異る方法が用いられる。

マウス培養では、個々の細胞を継代培養に付し、増殖させるのだが、この方法は ヒト・クローンにおいては有効でなかった。推定クローンの複数回分画によって 行なうのがよ（、この場合、継代培養中の、ウェルあたりの最大細胞数が約１０ ．０００であることが見出された０ 異的抗体を選択的に生産するクローン培養物が得られるＯ 特異的抗体は、バッチ培養基からアフィニティーカラムクロマトグラフィー又は 予備的等電点電気泳動法のような一般的方法を用いることにより得られる。単離 した抗体はそのままで用いられるか、又は既知の方法と組合され、溶液、テスト キｆット又はラジオイムノアツセー材料のような薬物組成物とされる。

本発明の他の面では、種々の悪性腫瘍の確認に役立つヒト・モノクローナル抗体 が提供されると共に、ヒト乳癌抗原の存在を証明する生体内−特異試験法が提供 される。従来の間接的螢光法を用いる顕微鏡下でヒト乳癌の存在を「確認する」 ように組立てられたヒト・モノクローナル抗体を用いて試験を行った結果、ヒト 乳癌と反応するという点で有用であることがわかった。乳癌を確認する一般的具 体例としては、上記被験者の孔領域から得られる血清又は腺（ｄｕｃｔｉｌｅ　 ）分泌物を、ヒト・モノクローナル抗体−乳癌に特異性を有する抗体を生産する 正常人血リンパ球と、悪性パートナ−細胞との融合によって誘導されたもの−と 接触させる方法が挙げられる。上記ヒト・モノクローナル抗体と上記血清又は腺 分泌物との間の反応が陽性であることは、上記被験者に腫瘍抗原が存在すること を示し、乳癌細胞の存在を示唆する。

好ましい具体例における、悪性パートナ−細胞は、Ｂ−タイプの急性リンパ球性 白血病細胞である。ヒト乳癌の存在を示唆するこの陽性反応は、例えば、血清又 は腺分泌物によるヒト・モノクローナル抗体の沈澱、又は間接的螢光によって確 認される。

Ｔ−リンパ球はそれ自身では免疫グロブリンを生産しないが、本発明の目的のた めには非常に有効な融合パートナ−であることを見出した。このように、悪性融 合パートナ−としてのＢ細胞の使用は、抗体分ａクローンの生成のための必要条 件ではない。特殊な悪性細胞系列の選択は、もしそれが活発で生存期間が長いな らば特に制限されるものではない。Ｔ−細胞の使用が特に好都合なのは、比較的 遺伝的変化に対し抵抗性があり、生存期間が長（、より安定なハイブリッドが得 られるからである。

本発明は、昂進期には成る抗体が存在し緩和期にはそれが消失するという、若年 性リウマチ様関節炎の分野においても特殊な有用性を有する。この場合ヒトノ・ イブリドーマ細胞系列は、昂進期の患者からの白血球と、融合パートナ−として 特に有効であることが見出されたリンパ芽球様Ｔ細胞を用いることによって得ら れる；できたクローンは抗体を分泌し、その抗体はその種の患者の血清中に見出 される自己免疫抗体によって同定されるのと同様な正常人末梢血液Ｔ　ＩＪンバ 球のサブセットを同定する。これらの抗体はＴ−細胞集団の試験のため、そして 潜在的には、生体内における特異的免疫反応を調節するための特異的プローブと して応用の可能性をもっている。

次の実施例は、本発明を更に詳細に説明する目的で用意されたものである。これ らは、本発明を本質的にも範囲的にも制限するものと解釈されるべきではない。

当業者は、均等な抗原、試薬、被験者、細胞および操作法が本発明の範囲を超え ることな（採用できることを納得するであろう。

実施例　■ 患者群を乳癌組織に由来する長期細胞系列に対する反応性によってふるいにかけ る。選択した特殊な系列に対して血清反応性を示す患者から採血し、ＨＬＡ型を 判定する。　７　イ：７　／ｌ／　、、イバク（Ｆｉｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕ ｅ　）のように、多糖類密度勾配を用いてリンパ球を分離する。

２０．０００．０００個の単離したリンパ球を、１０．０００．０００個の悪性 融合粒子、例えば、Ｂ−細胞異常の急性リンパ性白血病患者から得た細胞系列で あるＢａｌ！−１と、ポリエチレングリコールの存在下で混合する。この混合物 を、４００ｆで遠心分離し、８分間インキュベートし、その時点で細胞を洗い、 約２０時間培地中に放置する。

同時に細胞を洗い、型判定の結果に従って適切な抗−ＨＬＡ試薬と共にインキュ ベートする。６０分後細胞を洗い、アフィニティーカラム精製抗−１ｇＧでコー ティングしたヒト赤血球でロゼツト形成を行う。間接ロゼツト混合物をフィコル ーハイバク密度勾配上に注意深（層状に重ね、１４００Ｓ’で１５分間遠沈する 。ロゼツト形成しない非融合悪性パートナ−細胞は界面に集まり、除去される。

ロゼツト形成融合−および非融合−抗体産生細胞はペレット中に集まる。これら を塩化アンモニウム緩衝液で処理し、赤血球を除去する。細胞を洗い、２４ウエ ルプレート中ウエルあたり２，０００．’０００細胞の濃度で培養する。その培 養基を、最大増殖が認められるまで一通常５〜７日間−３７℃で５％二酸化炭素 空気下に保つ。次いで各々の新しい継代培養ウェルＩＣ１００−５００細胞が存 在す・るよう各々のウェルについて継代培養をおこなう。これら継代培養された 細胞を約１００．０００の濃度になるまで増殖させ、その後継代培養を繰返す。

生産される抗体の特異性を各継代培養段階後に確かめるのが好都合である。

適切な特異性をもった継代培養細胞は、その後大規模に増殖させ、上澄液を常法 により集める。従来の免疫化学的手法によりこの上澄液から抗体を分離する。

成る型の乳癌に対する抗体を生産する典型的継代培養細胞は、乳癌細胞系列Ｓ、 Ｗ、５２７に対する反応性によって証明されるのだがＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ 　８１４３である。

実施例　■ 自己免疫病があると診断された患者群からリンパ球を得る。これら患者を、胸腺 由来のリンパ球（Ｔ細胞）に対する抗体があるかないかによってあらかじめふる いにかける。これらの患者についてＨＬＡ型も判定する。

リンパ球は実施例■と同様に処理した。

こうして、Ｔ　１７７７球集団に特異性をもつ抗体を生産する培養細胞が得られ る。ある患者の血液の場合には、ハイブリドーマ抗体の特異性は、機能的並びに 抗原的に区別されるＴ−細胞サブセットに向けられている０ ヘルパーＴ細胞に特異性をもった抗体を生産する細胞系列標本は、Ａ、Ｔ、Ｃ， Ｃ，ＨＢ　８１４５として寄託された。

実施例　■ 白血球阻止因子、ＬＩＦ、の生産力ためには、ヒトＴ−リンパ球サブセットの、 羊赤血球に対する異なる親和性に基づいた既知の特殊な同定方法を用いて、白血 球阻止因子の生産に関係する細胞を単離することが好ましい。こうしてヒト末梢 血液の単核細胞はフィコルーハイバク勾配で単離され、洗浄され、羊赤血球でロ ゼツト形成が行なわれる。Ｅ＋細胞はフィコルーハイバク勾配によりロゼツト形 成され、赤血球をとり除くために塩化アンモニウム緩衝液で処理され十分洗浄さ れる。次いで、Ｅ　細胞をモノクローナル抗体Ｌ’ｅｕ　３ａ　［ベクトンーデ ィ７　キ７　ソ７　（Ｂｅｃｔｏｎ　−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　）　〕で感作し、 洗浄し、アフィニティーカラム精製家兎抗−マウスＩｇと結合させたヒト赤血球 でロゼツト形成する（８００ｒｌＯ分間）。ロゼツト形成混合物をフィコルーハ イバク勾配に層状に重ね、１００ｆで１５分間遠心する。Ｌｅｕ陰性のＴ細胞は 界面にとどまり、Ｌｅｕ十 ３３　ロゼツト形成細胞はベレット状の形となる。

Ｌｅｕ３ａ陰性細胞を、ｌ−アリコートに５　Ｘ　１０６／ゴの濃度で、コンカ ナバリンＡとして知られるレクチン（０，０１ｗ／ｍｌ）と共に、３７℃で４８ 時間、５チＣＯ２を含む湿った大気中で培養する。次いで、コンカナバリンＡで 刺激されたＬｅｔ１３ａ陰性細胞の上澄液について、ＬＩＦ’生産を保証する阻 止活性をテストする。そのようなＬＩＦ生産サブセットを最初に単離することに より、ヒト・クローンの発育は、Ｔ細胞のＬＩＦ生産を刺激する一般的方法を用 いる場合に比べて著しく改善される。強く陽性を示すウェルから得た細胞を果め 融合に用いる。細胞を、ｌＯ％ウシ胎仔血清を含む市販のＲＰＭＩ　１６４０で 十分に洗い、ヒト悪性細胞との融合パートナ−として用いる。

この場合、ＬＩＦは抗体分子ではないから、Ｔ細胞タイプの悪性融合パートナ− を用いる。これはＬＩＦを生産することはできない。ポリエチレングリコール中 のコンカナバリンＡにより刺激された細胞２０．０００．０００とリンパ芽球性 Ｔ細胞、例えば〔ローズウェル・パーク（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　）　〕 がＪ、　Ｍ、と名づけだ系列の細胞１０．０００．０００の混合物を遠心し、更 に実施例■のように処理して融合、分離、培養および継代培養を行った。

次の表はヒ）Ｔ細胞ハイプリドーマ（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ８１４４）によ って生産されたＬＩＦの力価試験の結果を示す。この場合１：１からｌ：１ｏｏ ｏまでの稀釈塵で３回試験を行い、次のものと比較した。

ａ）不活性であることを確認するためあらかじめ試験したＪ、　Ｍ、上澄液 ｂ）ヒト抗−Ｔ細胞ハイブリドーマ上澄液Ｃ）　コンカナバリンＡで４８時間刺 激し、１：１０に稀釈された、新たに単離されたＴ細胞の、陽性対照上澄液 最初の測定ａ）およびｂ〕は、細胞融合が非特異的阻止因子を生産する可能性を 最小にするために行われた。

ヒトＴ細胞・・イブリドーマにより生産されたＬＩＦの力価８１　：　ｌ　Ｏ， ５３０，５１０，４５１：　２　０．４３　０，６７　０．６３１　：　ｌ　Ｏ Ｏ，５５０，３８０，５２１：１００　０．４０　０，４２　０．５０１　：　 ２００　０．４３　０，７８　０．６１１　：　４００　０．４０　０，５５　 ０．５３Ｊ、Ｍ、上澄液　１，１５　１，０８　０．９６ヒト抗−Ｔ細胞ハイ ブリドーマ上澄液　０８９　０°９８　１°０３陽　性　対　照　０．６５　０ ，５７　０．６６＊　指示細胞〔多形核白血球（ｐＭＮ））はデキストラン沈降 により単離した（分子量５００．０００　）。正常食塩水で調製した６％デキス トラン溶液の容量で２０％を、５０−一注射器中のヘパリン加血液に加えた。そ の注射器を上向きにして３０分間室温でインキュベートし、軟層の細胞を注意深 （押し出した。その細胞をＨＢ　Ｓ　Ｓで１＝２にうすめ、フイコルージアトリ ンゾエート勾配により遠心した。ペレット状のＰＭＮをＨＢＳＳ中で３回洗い、 必要ならば、混入赤血球を低張性（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ）ショックにより溶解し た。ＰＭＮを１０％馬血清および０、１％アガロースを含むアガロース培地に懸 濁させた。

１０８／−４７）割で細胞を含む液数滴（０−００２ｍ／りを、・・ミルトン注 射器で、平底ミクロタイタープレートのウェルに分配し、０．１艷の）・イブリ ドーマ上澄液又は比較上澄液を三つの（ぼみの各々に添加した。４−６時間、３ ７℃でインキュベート後、その小滴の外側へ移動した面積を目盛りつき１０×接 眼レンズをつげた倒立顕微鏡を用いて計算した。小滴の端から移動細胞の境界ま での移動ゾーンを、４垂直方向で測った；小滴の半径範囲を移動ゾーンの面積か らさし引いた。結果は、マイトジェン存在下の移動面積を、マイトジェン不存在 下の移動面積で割って計算した移動指数としてあられした。

実施例　■ 実施例Ｉで作られた抗体を乳癌の疑いがもたれる婦人から得た血清又は腺分泌物 と混ぜる。放射能標識しである、ヤギ抗−ヒト抗体のような沈澱剤を加える。

混合物を高速度で遠沈し、沈澱物を下に集めろ。沈澱物を洗って過剰の放射能を 除去し、得られた沈澱物をガンマ計数管で計数する。

実施例　■ 若年生りウマチ様関節炎（ＪＲＡ　）活性期の患者の血液からリンパ球を得る。

これら血清（５ｅａｒ　）は、正常供血者のＴ細胞との結合性によってあらかじ めふるいにかけ、彼等のリンパ球のＨＬＡ型を調べた。次いでリンパ球を分離し 、実施例Ｉと同様、悪性融合パートナ−としてリンパ芽球様Ｔ細胞、例えばＪ、 Ｍ、ＲＰＭＩからの細胞系列（他のＴ又はＢ細胞系列も用いることができろ）を 用いて融合処理を行った。

融合後、クローンの分離、培養および継代培養を実施例Ｉのように行う。好まし い培地は、９０係市販ＲＰＭＩ培地＋１０％ウシ胎仔血清から成るものである。

継代培養細胞と、供血患者の血清とから得られた上澄液について、正常供血者か ら単離されたＴ細胞に対する反応性を比較する試験を行った結果、クローンは、 患者血清と同じタイプのＪＲＡに対する抗体を作ることがわかった。融合過程に 由来する生産物によってひきおこされる非特異的結合の可能性を排除するために 、白血球阻止因子を生産するヒトクローン上澄液についても、これら正常供血者 からのＴ−細胞に対する反応性を試験し、陰性の結果が得られた。

実施例　■ 生後２４時間以内のニオナタル（ｎ１ｏｎａｔａｌ　）マウス腹腔内に、９０％ 市販ＲＰＭＩ培養培地および１０％ウシ胎仔血清との混合物（実施例■で継代培 養のために用いた培養培地）　０．０３−を注射する。３０日後、それらのマウ スにつき、この混合物に対する反応を試験し、反応しない耐性マウスのみを使用 する。これらの耐性マウスに、実施例■のＪＲＡクローン継代培養基からの上澄 混合物０．５　ｒｎｌを注射する。１４日後、そのマウスに同じ上澄液の０５− を補強的に与えろ。

１４日後、それらのマウスの眼静脈洞（ｏｃｕｌａｒ　５ｉｎｕｓ　）から採血 し、その血清につき、抗イデイオタイプ抗体（ＪＲＡ抗体に対する抗体）を試験 した。最初の試験では、陽性マウス血清は、クローン上澄液と反応して沈澱を生 じる；陰性である筈のクローン−フリー培地を用いて対照試験を行うよう配慮す るべきである。

もう一つの実施可能の試験では、抗イデイオタイプ血清を、ＪＲＡ活性期の患者 からの活性血清で試験すると、沈澱が得られ、一方、病気の活動性を示さない患 者からは、陰性の結果が得られる。その後、抗イデイオタイプ抗原に対し陽性の 試験結果を与えるマウスから得た膵臓を用いて融合を行う。

形質細胞腫〔例えば、ゾーン（５ａｌｋ　）研究所からのＮ５−１）を３７℃で Ｃｏ２下で連続培養し、ハイブリッド形成のために用いた。増殖培地は１０％ウ シ胎仔血ｍ　（Ｆｅ２　）　並ヒｉｃペニシリン、ストレプトマイシンオよびア ムフオテリシンＢよりなる抗生物質混合物２％を含む高ぶどう糖イーグル培地（ ＤＭＥＭ　）　（ｇｉｂｃｏ−ｇｒａ−ｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｉｎｃ、　、Ｎ、Ｙ、　）から構成される。

細胞をフラスコ、又はマルｆ−’）エル（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ　）培養プレー トおよびスプリットで培養し、１日おきに新しい培地を加えた。この細胞系列は 免疫グロブリンを分泌しないから、免疫グロブリンの非特異的分泌の問題は軽減 される。腹腔に０．３４　Ｍ蔗糖５−を流すことによって、マクロファージの供 給細胞層が得られる。

細胞を１０％ＦＣ８を含む培地で洗い、ＨＡＴ培地２〜３ＸＩＯ’ゴに再懸濁し 、次いでその１−を２４−ウェル培養プレートの各ウェルに加える。３７℃、１ ０％ＣＯ２中で１時間インキュベーションを行い、供給細胞を付着せしめる。

免疫寛容又は対照マウスからの無菌膵臓細胞は、１゜ゴハンク（Ｈａｎｋ　）液 の均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で４にき裂くことにより得られる。細胞を１５− 遠心管に移し、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ　）により分散し、１０分 間放置し、５〇−遠ノし・管に移し、ＨＢＳＳで２回洗い、再懸濁させ、そして 計数する。約ｌｏ８のリンパ球様牌細胞が１０７の洗浄した骨髄腫細胞と結合す る。それから４００２で５分間遠心する。上澄液除去後、細胞ペレツトをおだや かに再懸濁させ、５％ＤＭＳＯを含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　４０ ００　）　ＨＢＳＳ溶液３００ｔｎｔを加え、３０秒間混合し、次いで室温下、 ’６００　ｒｐｍで６〜７分間遠心分離する。ＰＥＧ中で８分装置いた後、Ｈｙ 培地（以下に示すハイブリドーマ培地）５ｔｎｔを注意深く加え、次に２０チＦ Ｃ８を含む培地５ｍｌを加える。室温で１分間インキュベーション後、管をゆっ くりと渦巻き状にまわし、次いで１０００　ｒｐｍで５分間遠沈した。上澄液を 除去し、５−のＨＡＴ培地を加える。室温で５分間インキュベーション後、管ヲ ユつ（つと再懸濁させ、細胞をＨＡＴ培地で４８ｍ１にし、マクロファージ供給 細胞層を含む２４−ウェル−クラスタープレートの各ウェルにｌｄずつ分配した 。細胞を３７℃、ｌＯ％ｃｏ□、中でインキュベートする。ｌ、　７．１０日目 抜、３週間まで１日おきに培地の１−をウェルからとり、１４日目抜では新鮮な ＨＡＴ培地をその代りに入れ、それ以後はＨＡＴのないハイブリドーマ培地を入 れた。

ハイブリドーマ培地（Ｗ！ｉ合のために用いられる）は次のものを含むニ ー４．５ｔ／ｌブドウ糖を含むダルベツコＭＥＭ　（変形イーグル培地ン 一２０チＦＣ８（ウシ給仕血清〕 ８ １ｏ％ＮｃＴｃ（ナショナル・コレクション・オフ゛・タイプ・カルチュアーズ ）１０９培地−５８４１Ｎｉ／ｌＬ−グルタミン −５０７ｑ／を蕉性ブドウ酸ナトリウムー１３２巧／ｌオキサル酢酸 一２０単位／ｌウシインシュリン 一１チペンーストレフ（ペニシリンージヒドロース２週間後、生きている細胞集 団にすし・て、抗イデオバシック（１ｄｅｏｐａｔｈｉｃ　）抗体の存在を、上 述のように試験した。

以下余白 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／　ＵＳ　８２／　０１７１２ ２、　発明の名称 ヒトモノクローナル抗体及びリンホカイン３、補正をする者 事件との関係　出願人 名　称　メテイカル　ユニノく−シティー　オフ　サウス　カロライナ代弄者　 ウッドバリー、マリオン ４、代理人 住　所　東京都中央区日本橋人形町１丁目３番６号（〒１０３）６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「発明の名称」及び「発明者」 の欄、願書の翻訳文の「出願人」及び［その他の出願人、発明者（いる場合りの 欄、明細書の翻訳文の「発明の名称」の欄、並びに委任状の翻訳文及び法人証明 簀 ７、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面（以下「所定の書面」と称 する）中、発明の名称及び発明者の住所を別紙所定の書面の通シ訂正する。

（２）　願書の翻訳文中、「出願人」の欄中すべての指定国の項及び［その他の 出願人、発明者（いる場合）」の欄中、発明者の住所を別紙願書の翻訳文の通シ 訂正する。

（３１Ｆ！Ａ細書の翻訳文中、第１頁第２行［ヒト・モノクローナル抗体および リンホカイン」とあるを別紙明細書の翻訳文の通シ「 ヒトモノクローナル抗体及びリンホヵインコと訂正する。

（４）　委任状の翻訳文を別紙の通シ訂正する。

（５）別紙の通り法人証明書及びその翻訳文を提出する。

明　細　誉 ヒトモノクローナル抗体及びリンホカインこれは１９８１年１２月８日に出願し た米国特許出願第３２８，７３８号の一部継続出願である。

技術分野 本発明は、酵素欠乏性悪性パートナ−細胞の使用を必敬としない、ヒト−ヒトハ イブリドーマ法を用いた、診断および治療に役立つ高い特異性を有するリンホカ インおよびモノクローナル抗体の新規製造方法に関するものである。

発明の開示 更に詳細には、本発明は、％異抗体を生産することが知られているヒト細胞を、 酵素欠乏性である磨製がないところの悪性ヒト・パートナ−細胞と融合させて生 成する融合細胞を、上記パートナ−細胞から分離し、次いで融合細胞を培養する 新規な方法に関するものである。この分離法は、融合細胞を抗血清と反応させ、 抗血清との融合生ａｖＩＪを２４時間以内に間接ロセット形成により分離するも のである。

新しい継代培養法は、ウェルあたりの細胞数を約１０．０００に制限して、推定 クローンを複数回分画する補正誉の翻訳文提出誉 （％許法第１８４条の７第１項） 昭和５８年７月２８日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、　特許出願の懺示 ＰＣＴ／ＵＳ８２１０１７１２ ２、発明の名称 ヒトモノクローナル抗体及びリンホカイン３、％許出願人 住　所　アメリカ合衆国　２９４２５　サウス　カロライナ、チャールストンア シュレイ　プヴエニュ−１７１ 名　称　メテイカル　ユニバージティー　オプ　サウス　カロライナ代弄者　ウ ッドバリー、マリオン 国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　東京都中央区日本機人形町１丁目３番６号（〒１０３）昭和５８年５月 １９日 ６、　添隋誉類の目録 （１）補正書の翻訳文　１　通 ６・　添附書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１通 補正後の請求の範囲 １．　特異的抗体又は特異的リンホカインを生産することが知られているヒト細 胞を悪性ヒトパートナ−細胞と融合させることによって得られる融合細胞を、そ のパートナ−細胞から分離する方法において、融合細胞とパートナ−細胞の混合 物に、融合細胞に特徴的な抗原特異性と反応し、非融合パートナ−細胞とは反応 しない特異的抗原型判定試薬を添加して融合細胞と試薬との反応生成物を形成し 、非融合パートナ−から反応生成物を分離することを特徴とする方法。

２、　抗血清の添加およびこれと融合細胞との反応後、抗血清との反応生成物の 分離を２４時間以内に間接ロゼツト形成によって行うことを特徴とする請求の範 囲第１項記載の方法。

３、上記悪性パートナ−細胞が、Ｔ−細胞タイプのものである請求の範囲帳１項 記載の方法。

４、上記悪性パートナ−細胞がＢ細胞タイプのものである請求の範囲第１項記載 の方法。

５、　％異的抗体が乳癌患者の腫瘍に由来する標的細胞に結合する能力を有する ものである請求の範囲第１および第２項記載の方法。

６、％異的抗体がヒト胸腺由来性リンパ球又はそのサブセットに結合する能力を 有するものである請求の範囲第１および第２項記載の方法。

７、％異的リンホカインが白血球阻止因子である請求の範囲第１および第２項記 載の方法。

８、女性被験者の乳儂域からの血清又は腺分泌物と、ヒトモノクローナル抗体と 全接触させることよりなり、上記ヒトモノクローナル抗体が、乳癌に対して％異 性を有する抗体を生産する正常人血液リンパ球と、悪性パートナ−細胞との融合 によって得られるものであり、上記ヒトモノクローナル抗体と上記血清又は腺分 泌物との間の陽性反応が、上記被験者に腫瘍抗原の存在することを示しひいては 乳癌細胞の存在を示唆するものである女性被験者における乳癌の存在を確認する 方法。

９、上記悪性ハードナー細胞がＢ−細胞タイプの急性リンパ球性白血病細胞であ る請求の範囲第８項記載の方法。

１０、上記陽性反応が血清又は腺分泌物と結合したヒトモノクローナル抗体の沈 澱生成である請求の範囲第８項記載の方法。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 とが知られているヒト細胞を悪性ヒトパートナ−細胞と融合させることによって 得られる融合細胞を、そのハードナー細胞から分離する方法において、クローン に特徴的な抗原特異性を確認することができ、非融合パートナ−細胞とは反応し ない特異的抗血清を添加することな特徴とする方法。 ２、抗血清の添加およびこれと融合細胞との反応後、抗血清との反応生成物の分 離を２４時間以内に間接ロゼツト形成によって行うことを特徴とする請求の範囲 第１項記載の方法。 ３　上記悪性パート六−細胞が、Ｔ−細胞タイプのものである請求の範囲第１項 記載の方法。 ４、　上記悪性パートナ−細胞がＢ細胞タイプのものである請求の範囲第１項記 載の方法。 ５、特異的抗体が乳癌患者の腫瘍に由来する標的細胞に結合する能力を有するも のである請求の範囲第１および第２項記載の方法。 ６、特異的抗体がヒ）ＩＩＩ腺由来性リンパ球又はそのサブセットに結合する能 力を有するものである請求の範囲第１および第２項記載の方法。 ７　特異的リンホカインが白血球阻止因子である請求の範囲第１および第２項記 載の方法。 ８、女性被験者の孔領域からの血清又は腺分泌物と、ヒトモノクローナル抗体と を接触させることよりなり、上記ヒトモノクローナル抗体が、乳癌に対して特異 性を有する抗体を生産する正常人血液リンパ球と、悪性パートナ−ｉ胞との融合 によって得られるものであり、上記ヒトモノクローナル抗体と上記血清又は腺分 泌物との間の陽性反応が、上記被験者に腫瘍抗原の存在することを示し、ひいて は乳癌細胞の存在な示唆するものである女性被験者における乳癌の存在を確認す る方法。 ９、上記悪性パートナ−細胞が、Ｂ−細胞タイプの急性リンパ球性白血病細胞で ある請求の範囲第８項記載の方法。 １０、上記陽性反応が、血清又は腺分泌物と結合したヒト・モノクローナル抗体 の沈澱生成である請求の範囲第８項記載の方法。 以上