JPS62500450A - モノクロ−ナル抗体及びこれによる免疫化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体及びこれによる免疫化方法本発明は、モノクローナル抗体に 関するものである。

ハイブリドーマ技術における最近の開発が示すところでは、ヒＩ−Ｔ細胞は２種 以上の機能的に異なるサブ群に分割することができる。たとえば、ラインヘルツ 等、セル第１９巻、第８２１頁（１９８０）及びラインヘルツ等、イミュノロジ ー・ツブ−、第４巻、第６９頁（、１９８１）は、成る種のＴ細胞リフ群がイン デユー１ノ゛機能を有するのに対し、他のザブ群がサプレッサー機能を有するこ とを示す研究を記載している。他の研究が示すところでは、特異的イフェクタ機 能の発生に際し上下細胞ザブ群の間及びそれらの内部で伝達相互作用が生ずる［ エバンス等、ジＶ−ナル・イミュノロジー、第１２０巻、第１４２３頁（１９７ ８）　：モリモト等、シレーナル・イミュノロジー、第１２８巻、第１６４５頁 （１９８２）　ニド−マス等、ジャーナル争イミュノロジー、第１２５巻、第２ ４０２頁（１９８０）　ニガテンビー等、ジューナル◆エキスペリメンダル・メ ソッド、第１５６巻、第５５頁（１９８２）　：及びヤッチ等、ジャーナル・イ ミュノロジー、第１２９巻、第１０３頁（１９８２）　］。免疫ホメオスタシス を維持するには調整メカニズムが必須であるため、サブ群間における相互作用の 理解が極めて重要である。

主Ｔ細胞群（すなわちＴ４及びＴ８）の内部には機能上及び表現型の両者に異質 性が存在することが示されている［トーマス等、ジャーナル・イミュノロジー、 第１２５巻、第２４０２頁（１９８０）　：モリモト等、ジャーナル・イミュノ ロジー、第１２８巻、第１６４５頁（１９８２）　ニガテンビー等、ジューナル ・エキスペリメンタル・メソッド、第１５６巻、第５５頁（１９８２）　：及び ラインヘルツ等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２６巻、第６７頁（１９８ １）　］。たとえば抗原、ヤマゴボウミトゲン又は自己白血球反応作用系におけ るＩＣＪＧ生成の抑制を誘発するには、Ｔ４細胞とＴ８細胞とのサブ群間の相互 作用が必要とされる。同様に、混合白血球反応における予備細胞毒性Ｔ８リンパ 球からのＴ８細胞毒性イフエクタの区別にもＴ４細胞の存在を必要とすることが 示されている。

これら細胞の主たる群内において異質性の初期表現型の規スチゲーション、第６ ７巻、第７５３頁（１９８１）は、活発な若年性関節リュウマチ症（ＪＲＡ）を 有する患者に見出される天然の抗−丁細胞抗体を用いて、Ｔ４細胞をヘルパ一群 （Ｔ４ＪＲＡ−）とヤマゴボウミトゲン及び抗原作用の免疫グロブリン産生に対 するサプレッサーサブ群のインジューザ（Ｔ４ＪＲＡ＋）とに分割することを記 載している。同様に、ラインヘルツ等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２８ 巻、第４６３頁（１９８２）は、Ｉａに対する抗体を用いてＴ４細胞をＴ４１ａ ＋とＴｌａ−とのサブ群に分割することを記載している。これら両ザブ群は、Ｂ 細胞による最適なＩＣ！分泌を誘発させるのに必要とされた。

発明の要点 一般に、本発明は複数のヒト細胞、好ましくはたとえばＴ４細胞のようなＴ細胞 におけるナブ群を区別するモノクローナル抗体及び方法を特徴とし、この方法は たとえばキヌザル若しくはチンパンジーＴ細胞のような非ヒト霊長動物細胞に対 するモノクローナル抗体を産生させ、このモノクローナル抗体をヒ１〜細胞と接 触させ、かつモノクローナル抗体に対する異なる反応性の程度に阜づいてサブ群 を区別することを特徴とする。

この抗体は、免疫化９１群により引起こされ或いは悪化するたとえば若年性関節 ツユマチ症（ＪＲＡ）、ショーグレン病又は全身紅斑性狼１（ＳＬＥ）などの病 気の診断及び（又は）治療に有用である。診断は、蛍光染料と結合する抗体によ り細胞の反応性を測定する流動血球計算法を用いて行なうことができる。病気を 処置するには、抗体を細胞毒製剤に化学結合させかつ病気に罹患している患者に 投与することができる。抗体は病源細胞に特異的に結合してこれを破壊するが、 正常細胞は破壊しない。

本発明の方法は、ヒト細胞の明らかに均質な群（ポピユレーション又はセット） を独特なザブｕ（＃ｊブボピュレーション又はサブセット）に分割することを可 能にし、したがってＴ細胞が関与するたとえば若年性関節１ノユウマチ症（ＪＲ Ａ）、ショーグレン病及び全身紅斑性狼癒（ＳＬＥ）のような自家免疫病の診断 を可能にする。

非ヒト霊長動物細胞による吐乳動物の免疫化は、かくして１群のヒ１〜細胞にお ける第１ザブ群に対し第２サブ群よりも大ぎい程度に反応するモノクローナル抗 体を、たとえ前記両ザブ群が前記１群を規定する異なるモノクローナル抗体に対 しほぼ同じ程度の反応性を示すとしても生成することができ、たとえばこの抗体 はＴ４細胞に対し高度に反応性であるがＴ８細胞に対しては小さい反応性を示す 。好ましくは、ヒト細胞はリンパ球、たとえばＴ４若しくはＴ８細胞のようなり 細胞又はＴ細胞である。

非ヒト霊長動物細胞での吐乳動物の免疫化により、さらに利点が実現されること が判明した：まだ明らかでない理由により、ヒト及び非ヒトの霊長動物細胞に共 通な抗原決定子は、しばしばヒト細胞に比較して非ヒト細胞に対して示されるた とえばネズミのようなゲッシ動物においてより大きい免疫性を示すことができる 。この理由は、恐らく比較的高度の抗原配列における非ヒト細胞での決定子の発 現により、非ヒト霊長動物細胞に対し決定子が比較的より大きい免疫性を示すた めと思われる。この知見は、ヒト細胞に対し重要であるが抗原性の弱い決定子に 対するモノクローナル抗体の産生を、同大させることを可能にする。

１群のヒト細胞をサブ群に分割しうるモノクローナル抗体を産生させるための非 ヒト霊長動物細胞の使用方法は、サブ群の１種に対し特異性であるモノクローナ ル抗体を産生させるための追加工程により次のように行なうことができる。非ヒ ト霊長動物細胞由来のモノクローナル抗体を使用して、いわゆるヒトＴ４細胞の ２種の異なるサブ群（一方のサブ群は抗体に対し反応性が大きく、他方は抗体に 対し反応性が低い）を同定した後、同定したサブ群の一方（すなわち反応性の大 ぎいサブ群）を使用してネズミを免疫化しかつ複数のハイブリドーマを生成させ る。これらのハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体を次いで免疫 化サブ群及び他方の蕾ナブ群に対してスクリーニングすることができる。免疫化 サブ群に対し他方のサブ群よりも反応性の大ぎい抗体は、２種のザブ群を区別す る多形質表面構造を規定する。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の好適具体例の説明から明らかとなるであろ う。

好適具体例の説明 先ず最初に、図面につき説明する。

回画 第１図は上記した抗体生成方法の流れ図であり、第２図はヒトＴ細胞に対する本 発明による抗体の反応性を示す１群のグラフであり、 第３図は各種の細胞及び細胞組合せによるヘルパ誘発を示す棒グラフであり、 第４図は本発明の抗原決定子を有する細胞と他の抗原を有する細胞との間の関係 を示す１対のグラフであり、第５図は本発明の抗原決定子を生化学的に特性化す る放射能写真図である。

非ヒト霊長動物細胞による免疫化 本方法の第１工程は、免疫化用に使用すべき細胞を有する非ヒト霊長動物細胞を 選択することである。霊長動物の選択は、その霊長動物がヒトからどの程度系統 発生学的に異なっているかに部分的に依存する。この系統発生学的隔たりは、一 般にヒト起源のモノクローナル抗体に対する霊長動物細胞の反応性に反映される 。

下記第１表は、各種のヒトＴ細胞サブ群でＢａＩｂ／Ｃ若しくはＣＡＦ１ネズミ を免疫化して生成されたモノクローナル抗体に対する各種のＴ細胞の反応性を示 している。系統発生学士ヒトに近いチンパンジーの細胞はヒｌ〜細胞に由来する 抗体の全てと反応するのに対し、差の大きいキツネザルの細胞はこれら抗体と反 応しない。一般的なキヌザルのＴ細胞はＴ４Ａ及びＴ８Ａに対し反応性であるが 、その他の抗体には反応性でない。

非ヒト霊長動物細胞Ｔ細胞は次のように免疫化用として使用することができる。

先ず最初に、細胞をヘパリン処理した血液からフィコール−ハイパツク及び比重 差遠心分離を用いて分離する。次いで、これらの細胞を０．１５ＭのＮＨ２Ｏで 処理して赤血球を溶解さ往、洗浄し、燐酸塩緩衝塩水に再懸濁させかつ免疫化用 に使用すると共に、次のスクリーニング用に凍結する。

次いで、３ａ　ｌ　ｂ／Ｃ若しくはＣＡＦ１ネズミを標準法によってこれら細胞 で免疫化する。得られた牌細胞をＰＥＧにおいてＰ３／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１ 青髄腫細胞と融合させる。次いで、免疫化細胞に対し反応性であるがヒトＴ細胞 若しくはＴ細胞ラインに対し部分的に反応性であるハイブリドーマ培養上澄液を 選択し、これらのラインを標準技術によりクローン化しかつ供与体細胞の存在下 での制限希釈率により再クローン化する。

最初のスクリーニングは、霊長動物−［細胞に対し反応性でありかつ全部ではな く成る程度のヒトＴリンパ球に対し反応性である抗体を同定することを意味する 。次のスクリーニングは、新たに分離されたＴ４細胞、Ｔ４ＪＲＡ−ＴＱ１＋、 Ｔ４ＪＲＡ−ＴＱｌ−１Ｔ４ＪＲＡ十、Ｔ８細胞、Ｔ４１１！胞毒性ライン、Ｔ ８細胞毒性ライン、Ｔ４抗原特異性インデューサＴ細胞ライン、サプレッサＴ細 胞ラインのＴ４抗原特異性インデューサ、Ｔ８サプレッサライン及び新たに分離 された活性化Ｔ細胞を包含する大パネルのヒトＴリンパ球に対するこれら抗体の 特性化を含んでいる。インデューサ若しくはサプレッサ群のフラクションに対し 反応性であるがヒトＢライン、Ｂ−リンパ球、マイクロイド細胞及びマイクロイ ドラインに対し反応性であってもなくてもよい抗体を分離する。

次いで、この種の抗体を使用してＴ４若しくは１８群を、各サブ群からの細胞が 抗体と反応する程度に基づいてサブ群に分割することができる。この種の異なる 反応性は、いわゆるＴ４若しくはＴ８を規定する単一表面抗原の構造に多形質エ ビ１−−プか存在するか、或いは抗原群が異質性を示すＴ４及び１８群を規定す る１群のこの種の表面抗原が存在することを示す。いずれの場合にも、多形質性 若しくは異質性は、できる。免疫調整サブ群に多くの自己免疫病に存在する各種 の異常が生ずると、Ｍ　ＨＣ複合体の構造変化が病気の感受性を予測するのに重 要であるため、多形質決定子又は独特なすブ群の規定が極めて重要となることが 判る。

細胞のＴ４群及び１８群におけるサブフラクションと反応する抗体は、間接的° 免疫蛍光性によって次のように特性化される。約１０６個の細胞をハイブリドー マ上澄液若しくは腹水のいずれかと一緒に培養し、４℃にて激しく洗浄し、次い でＦＩＴＣ抗−ネズミ■ｇＧで染色する。次いで、蛍光性抗体で被覆した細胞を ＦＡＣｓ　１．ＥＰＩＣ３Ｖなどの装置で分析し、これらの装置は反応性細胞の 個数を正確に定量評価することができる。

抗−４８４ 抗−４８４と称する特定の抗−霊長動物細胞モノクローナル抗体を標準技術によ り次のように生成させた。

ＢＡＬＢ／ＣＪネズミ（ジャクソン・ラボラドリース、バー・ハーバ−１ＭＥ） をコットントップシンザル（ｓａｇｕ−ｉｎｕｓ　０ｅｄｉｐｕｓ）　、すなわ ち草食性の新大陸霊長動物に由来するＴリンパ球ラインの細胞で免疫化した。こ の動物からの末梢血液リンパ球をインビトロにてＰＨＡで刺戟し、次いでＴ細胞 成長因子と共に連続培養し続けた。ヒト（Ｅ＋）細胞に対し反応性の抗体を含有 するハイブリドーマ培養物を選択し、クローン化させかつ供与体細胞の存在下で の制限希釈法によって再クローン化した。Ｅ＋細胞は、Ｔ細胞に対し反応性でな い抗体か６−Ｔ細胞特異性の゛抗体を規定しうろことが知られている。次いで、 悪性の腹水を発生させ、これを分析用に使用した。モノクローナル抗体である抗 −４８４は、フルオレシン標識したヤギ抗−ネズミＩｑＧ（メロイ・ラボラドリ ース社、スプリングフィールド、ＶＡ）での染色の特異性により及びネズミ免疫 グロブリンの他のサブ群に対するフルオレシン標識抗体で染色されないことによ り、Ｉｑ０１同型であることが示された。

Ｔ４＋及びＴ８＋細胞群の作成 ヒトＴリンパ球を抗−Ｔ４若しくは抗−Ｔ８モノクローナル抗体及びウサギの補 体（Ｃ）　（ペルーフリーズ・バイオロジカルス社）で処理した。２Ｘ１０７個 の細胞を１：２５０の希釈による抗体１ｒｄと共に室温で１時間培養し、次いで ０、３ｍｌのウザギＣをこの混合物へ添加した。混合物を３７℃の振とう水浴中 でさらに１時間培養し、洗浄しかつ残余の細胞を３７°Ｃで１晩培益した。抗− Ｔ４及びＣで細胞を溶解させた後、残留細胞の〉９０％がＴ８＋細胞であり、か つく５％がＴ４＋細胞であった。抗−Ｔ８及びＣで溶解ざぜた後には、残留細胞 の＞９０％がＴ４＋細胞であり、かつく５％が−［８＋細胞であった。これら２ 種の群を本明細書においてそれぞれＴ８＋及びＴ４＋群と呼ぶ。

蛍光性賦活した細胞ソータによるリンパ球群の分析及び分離細胞群の細胞蛍光分 析を、エピツクスｖ、ｍ胞ソータ（クールター・エレクトロエックス社）にてフ ルオレシン結合したＦ（ａｂ’＞２ヤギ抗−ネズミＦ（ａｂ’）２での間接的免 疫蛍光性によって行なった。バックグランドとしての蛍光反応性は、非分泌性ハ イブリドーマクローンで免疫化したネズミから得られた比較腹水によって測定し た。分析のため、全モノクローナル抗体は１／　２５０〜１　／　１０００の希 釈率にて抗体過剰で使用した。

Ｔ　４　＋　Ｔ細胞を４８４＋及び４Ｂ４−に分離するため、１晩培養した８０ ｘ１０Ｂ個のＴ４＋細胞を１／　２５０希釈の抗−４８４の４ばて標識し、かつ フルオレシン結合したＦ（ａｂｌｚヤギ抗−ネズミＦ（ａｂ’＞２で発生させた 。

エピツクスジ細胞ソータを使用することにより、Ｔ４＋細胞を４８４＋及び４Ｂ ４−サブ群に分離した。

この手順によりＴ４＋細胞の２種のナブ群を生成させ、一方のザブ群は抗−４８ ４に対し高い反応性を示しく　ｒ４Ｂ４＋」と呼ぶ〉かつ他方のザブ群は抗−４ ８４に対し低い反応性を示した（　ｒ４Ｂ４−Ｊ　）。

全ての場合、選別後の生存率はトリパンブルー分析により９５％より犬であった 。分離したＴ細胞サブ群の純度は９５％以第２図は抗−４８４モノクローナル抗 体による末分画工、Ｔ４＋及びＴ８＋細胞の細胞蛍光分析を示し、対数尺度で示 したものである。第２図に示したように、抗−４８４は４１±２％（平均±ＳＥ 、ｎ＝１３）の末梢血液ヒトＴリンパ球に対し反応性でありかつ４１±３％（平 均±ＳＥ、ｎ＝１４＞のＴ４十Ｔリンパ球及び４３±４％（平均±ＳＥ、ｎ＝１ ０）のＴ８十丁リンパ球に対し反応性であることが判明した。したがって、４Ｂ ４＋Ｔ細胞は、Ｔ４＋及びＴ８＋ザブ群の両者に見出された。

抗−４８４抗体と他のヒトリンパ球様細胞及び細胞ラインとの反応性を下記第２ 表に示す。抗−４Ｂ４は末梢血液ゼロ細胞、大食細胞及び胸腺リンパ球の３０％ 以上に対し反応性であり、極く僅かに末梢血液Ｂ細胞に対し反応性であることが 判明した。抗−４８４は、試験した全部で４種のヒトＴ細胞ラインに対し反応性 であった。ざらに、第２表のデータは抗−４８４と４種のリンパ芽Ｂ細胞ライン 及び２種のバーキットリンパ腫ラインとの反応性を示している。ざらに、試験し た３種の造血細胞ライン、すなわちに５６２、Ｕ−９３７及びＫＧ−１は抗−４ ８４に対し反応性であった。これらの結果は、抗−４８４の反応性がＴラインの 培養細胞ラインに限定されず、寧ろ非Ｔ細胞も抗−４８４反応性であることを示 唆している。

里ｌ茎 抗−４８４抗体とヒトリンパ球様細胞 及び細胞ラインとの反応性８ ■、リンパ球様細胞 Ｂ細胞　士 ゼロ細胞　士 Ｍφ十 ■、胸腺細胞　十 ＩＩ１．　Ｔ細胞ライン モルト４　十 １２人（続き） ＩＶ、Ｂ細胞 Ｄａｕｄ　ｉ　＋ ａ：抗−４８４抗体の反応性は、細胞蛍光分析での間接的免疫蛍光性によって測 定した。（−）はバックグランド比較よりも５％高い反応性を示し、（±）は５ 〜３０％の反応性を示し、（＋）は３０％の反応性を示す。

増ｔａ活性がＴ細胞の一方の１ノ゛ブ群又は他方のサブ群、たとえばＴ４＋細胞 の４８４＋若しくは４Ｂ４−サブ群に限定されるかどうかを決定するため、次の 手順を行なった。

Ｔ細胞を１０％ヒ１〜ＡＢ血清と２００ｍＨのし一グルタミンと２５ｍＨのＨＥ ＰＥＳ緩Ｏ１液（マイクロバイオロジカル・アソシエーツ社）と０．５％の重炭 酸す］・リウムと１％のペニシリン−ストレプトマイシンとを含有するＲ　ＰＭ 　Ｉ　１６４０培地で培養した。１マイクロ培養穴１個当り１０５個の細胞をフ イ１〜へマグルチニン（ＰＨＡ）（バラーーウエルカム・カンパニー社、リサー チ・トライアングル・パーク、ＮＣ＞及びコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ　Ａ）（カ ルビオケム社、サンジエゴ、ＣＡ）の最適投与量に対する増殖反応につき試験し た。アロ抗原作用による増殖反応を、ミドマイシンＣｆｆ１理したＬａＺ１５６ 、すなわちエプスタイン−バール・ウィルス形質転換したヒトＢリンパ球様ライ ンでの刺戟によって同時に測定した。破傷風毒素（ＴＴ）（マサチューセッツ・ デパートメント・オブ・パブリック・ヘルス・バイオロジカル・ラボラドリース 社、ジャマイカ・プレイン、ＭＡ）及び耳下腺炎抗原（マイクロバイオロジカル ・アソシエーツ社）に対する増殖を、それぞれ１０μ９／ｄの最終濃度及び１： ２０の希釈率を用いて試験した。

大食細胞を、インビトロ培養の開始時点で最終濃度５％にて全リンパ球群に添加 した。ミトゲン刺戟した培養物を、細胞穴部１個当り０．１５　μＣｉのトリチ ウム化したチミジン（Ｈ３−ＴｄＲ）　（１，９Ｃｉ／ｍＨｓｐ、ａｃｔ　＞　 （シュワルツ−マン、オレンジブルグ、ＮＹ）で４日後にパルス処理した。１６ 時間の培養後、マツシュ■型装置（マイクロパイロロジカル・アソシエーツ社） で細胞を収穫し、かつＨ３−ＴｄＲ組込みをパラカード・シンチレーション・カ ウンタ（パラカード・インスツルメン１へ・カンパニー社、ダウナース・グロー ブ、ＩＬ）で測定した。バックグランドのト１３−ＴｄＲ組込みは、ミトゲンの 代りに培地を用いて得た。可溶性かつ細胞表面アロ抗原作用の培養物を、５日後 にｌ−１３−ＴｄＲで１６■１間パルス処理し、収穫しかつ上記と同様にカウン トした。

第３表に示したように、Ｃｏｎ　Ａと可溶性抗原と自己抗原とに対する反応の差 がＴ４＋４８４＋及びＴ４＋４８４−細胞群に見られた。ＣＯｎ　Ａ及び自己細 胞抗原（ＡＭＬＲ＞に対する反応において、Ｔ４＋４８４−細胞はＴ４＋４８４ 十群よりも顕著に多いＨ３−ＴｄＲを組込んだ。これに対し、たとえばＴＴ及び 耳下腺炎のような可溶性抗原に対する反応において、Ｔ４＋４Ｂ７！Ｉ＋細胞は Ｔ４＋４８４−細胞群よりも顕著に多いＨ３−ＴｄＲを組込んだ。Ｔ４＋４８４ ＋群及びＴ４＋４８４一群の増殖反応の間におけるこれらの差は有意であった（ Ｐ　Ｏ，０５＞。これらのことは、可溶性抗原に反応する主たる増殖活性がＴ４ ＋４８４＋細胞群に見られ、かつＣＯｎ　Ａ及び自己細胞抗原に反応する主たる 増殖活性がＴ４＋４８４−細胞群に見られることを示している。

Ｔ４＋４８４＋及びＴ　４−＋−４Ｂ　４−リンパ球と共に培養したＢ細胞によ るＰＷＭ−刺戟のＩｑＧ合成り細胞免疫グロブリンの産生に対するＴ細胞ヘルパ がＴ４＋４Ｂ４＋若しくはＴ４＋４８４−のＴ細胞サブ群に制限されるかどうか を決定するため、未分画のＴ　４　＋Ｔ細胞若しくはＴ　４　＋４８４＋及びＴ 　４　＋４８４−細胞を自己Ｂリンパ球と混合し、インビトロでＰＷＭにより刺 戟し、かつ全ＩＣＩＧ産生を７日間培養して測定した。

リンパ球の未分画かつ分離群を丸底のマイクロタイター培養プレート（ファルコ ン社）で３７℃にて５％のＣＯ２を有する）♀潤雰囲気内で、２０％の加熱失活 させた胎児牛血清（マイクロバイオロジカル・アソシエーツ社）と０．５％の重 炭酸ナトリウムと２００ｍＨのＬ−グルタミンと２５ｍＨのＨＥＰＥＳと１する Ｔ細胞の各サブ群の作用を決定ターるため、種々の個数の未分画Ｔ　４　＋Ｔ細 胞又は精製Ｔ４＋４８４＋及びＴ４＋４Ｂ４、−Ｔ細胞ナブ群を、容積１ｄの５ ｘ１０４個のＢ細胞へ添加した。これへｏ、　ｉ７！のヤマゴボウミトゲン（（ ＰＷＭ）（ギブコ・ラボラドリース社、グランド・アイランド・バイオロジカル ・カンパニー社、グランド・アイランド、ＮＹ）を１：５０の希釈率で添加した 。インビトロ培養の開始時点に大食細胞を最終濃度５％にて全群に加えた。７日 目に培養を停止させ、上澄液を収穫し、かつ上澄液中へのＩＣ１０分泌を同相放 射線免疫分析（Ｒ■Ａ）によって決定し、その際ヒトγ重鎖（抗−Ｆｃ）（Ｖ、 ラソ傅士、ダナー、ハーバ−・カン１）−一・インスティチュートにより寄贈） のＦｃ部分に関するモノクローナル抗体を用いた。

第３図に示したように、Ｂ細胞も未分画のＴ　４　＋Ｔ細胞も選別したＴ４＋サ ブ群も単独で培養するとＩｇＧを分泌しなかった。これに対し、未分画のＴ４＋ Ｔ細胞及びＢ細胞は、これらを混合してＰＷＭと共に培養すれば、培養上澄液１ ｄ当り１８４００±８１０ｎｇのＩｇＧを分泌した。Ｔ４＋Ｔ細胞を抗−４８４ と共に培養しても、Ｂ細胞に対して与えるこれら細胞の作用に何らの効果もなか った。

同数のＴ４＋４８４＋及びＴ４＋４８４−細胞を自己Ｂ細胞の別の培養物に添加 した場合、Ｔ４＋４８４＋Ｔ細胞サブ群により誘発されるＩＣ１０分泌はＴ４＋ ４８４−とＢ細胞との組合せにより得られる分泌よりも約１５倍大であった（　 ３３０００±２１００ｎｇ対１７００±１１００ｎ　）。　さらに、Ｂ細胞のＩ ｇＧ産生に関しＴ４＋４８４＋及びＴ４＋４８４−のＴ細胞によりｊｑられるヘ ルパー機能の定量比較（下記第４表）は、Ｔ４＋４８４＋Ｔ細胞のヘルパー効果 が任意の個数の試験Ｔ細胞及びＢ細胞においてＴ４＋４８４−Ｔ細胞より漁顕著 に大であることを示した。したがって、Ｂ細胞によりＰＷＭに反応する抗体産生 のヘルパー活性の大部分は細胞のＴ４＋４８４＋サブ群に見られ、Ｔ４＋４Ｂ’ ４−はこの相互作用にお。

いて最小のヘルパー効果を有する。

細胞のこれらＴ４＋４８４＋及びＴ４＋４８４−サブ群がザプレッザ機能の発生 に対し何らかの作用を有するかどうかを決定するため次の手順を行なった。

加した。これらの細胞へ、分画したＴ４＋４８４＋若しくはＴ４＋４Ｂ４−細胞 （２ｘ１０４　）を加えた。第５表（部分Ａ及びＢ）に示したように、Ｔ４＋４ ８４−細胞及びＢ細胞に対し添加するＴ８＋細胞の個数を増加させると、ＩｑＧ 産生における顕著な抑制が観察された。これに対し、Ｔ４＋４８４＋細胞及びＢ 細胞に添加するＴ８＋細胞の個数を中庸若しくは少なくすると、ＩＱＧ産生にお ける減少が全く又は極く僅かしか見られなかった。過剰数のＴ８＋細胞（４ｘ１ ０４　）をＴ４＋４８４＋細胞及びＢ細胞に添加すると、ＩｇＧ産生における中 庸な程度の抑制が見られることに注目すべきである。これらの結果は、Ｔ４＋４ ８４−細胞がＴ８＋細胞の存在下でＢ細胞によりＩｑＧ産生を抑制するのに極め て効果的であることを示している。

Ｔ４＋４８４−細胞が抑制の誘発に必要であることを直接示すため、種々異なる 個数のＴ　４　＋４８４＋若しくはＴ４＋４Ｂ４−細胞を一定数のＢ細胞（５ｘ １０４　）及びＴ４＋２Ｈ４−若しくはＴ　４　＋　２１−１４＋細胞（２Ｘ１ ０４　）及びＴ８＋細胞（１ｘ１０４　）へＰＷＭの存在下で添加した。第５表 （部分Ｃ及びＤ）に示したように一定数の８細胞、Ｔ４＋４８４＋細胞及びＴ８ 細胞に添加するＴ４＋４８４−細胞の個数を増大させると、ＩＣＩＧ産生の抑制 増大が観察された（　１００００ｎｃ＋対６８０ｎｃ＋　、　６８００ｎｇ対３ ２００ｎｇ、６０００ｎｇ対８１０ｎｏ　＞。これに対し、Ｔ４＋４８４＋細胞 の添加数を増大させると、ＩｇＧ産生を増大させた。これらの結果は、Ｔ　４− ）−４Ｂ　４−細胞がサプレッサ・イフエクタ細胞となるようＴ８＋細胞を活性 化し又は誘発することを示唆している。

Ｔ４＋２Ｈ４＋細胞ザブ群とＴ４＋４８４＋細胞サブ群との間の関係 Ｔ４＋２Ｈ４＋リンパ球はＣｏｎ　Ａ刺戟に対し充分に増殖したが可溶性抗原刺 戟に対しては貧弱にしか増殖せず、用しか与えない。Ｔ　４　＋　２　Ｈ４−細 胞はＣＯｎ　Ａでの刺戟に際し貧弱にしか増殖しないが可溶性抗原に露出すると 良好に増殖し、ＰＷＭ誘発にＪ：る１０合成に関し良好なヘルパ信号を与える。

ざらに、この抗体はＴ８＋サプレッサ細胞のインデューサとなるＴ４＋細胞のサ ブ群を規定する。これに対し、Ｔ４＋４８４＋リンパ球はＣｏｎ　Ａでの刺戟に 際し貧弱にしか増殖しないが可溶性抗原に露出すると良好に増殖し、ＰＷＭ誘発 によるＩｃＡ合成に関し良好な麺ヘルパ信号を与える。Ｔ４＋４Ｂ４−細胞はＣ Ｏｎ　Ａ刺戟に対し良好に繁殖しかつＰＷＭ誘発によるＩＱ合成に関しＢ細胞に 対して貧弱な作用を示す。さらに、Ｔ　４−１−４８４−リンパ球群はサプレッ サ・インデューザ活性を有する。したがって機能上、抗−４８４抗体はＴ細胞サ ブ群と反応し、これは抗−２８４により示されるものと逆である。

第４図に示したように、抗−４８４はほぼ全部のＴ４十２Ｈ４−細胞と反応し、 かつ抗−２Ｈ４はほぼ全部のＴ４＋４８４−細胞と反応する。さらに、４８４− ＦＩＴＣ結合体及び２　Ｈ４−フィコエリトリン結合体による二重蛍光染色技術 を用いて、４Ｂ４＋２ｔ−１４＋細胞は細胞の全Ｔ４＋群の１０％未満を構成す ることが判明した。すなわち、機能上かつ表現型において抗−４８４により規定 されるＴ４＋細胞ザブ群は抗−２Ｈ４により規定されるサブ群と逆である。

抗−４８４により検出される抗原の特性化抗−４８４により検出される細胞表面 抗原を標識しがつ特性化するため次の手順を行なった。

Ｉｌ！４Ｉ臓Ｔ細胞を、Ｅ−ロセッティングに続ぎ抗−８１抗体、抗−Ｍｏｌ抗 体及び補体での溶解によって作成した。死滅細胞の除去又ははフィコール−ハイ パツク濃度勾配の後、これらの細胞をラフ１〜ベルオキシダービ技術の変法によ って標識した。標識細胞を、０．０５１Ｖｌのトリスト１α１０．４ＭＮａα／ ２ｍ）ｌ　ＰＭＳＦ／２ｍＨＥＤＴＡ１５０ｍＨ−ｉ’オドアセタミドにおける ０、５％トリｌ〜ンＸ−１００で４５分間溶解させた。細胞核及びその他の不溶 性物質を１０００（ｌにて１０分間遠心分離して除去した。

細胞溶解物の免疫沈澱を、１００．０００（］で１０分間遠心分離して行ない、 上澄液をパンソルビン（カルビオケム社、１−ａ・ジヨウ、ＣＡ）で２回予備清 澄化させた。次いで、上澄液をセファロース４Ｂに結合させた無関係な抗体で清 澄化させた。

予備清澄化した上澄液を４８４−セファ０一ス４Ｂ結合体と混合し、かつ４°Ｃ で４時間培養した。この後、ビーズを細胞溶解緩衝液で４回洗浄した。複合体を ＳＤＳ試おｌ緩衝液中で煮沸することによりビーズから溶出させ、かつ１０％Ｓ ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ８−ＰＡＧＥ）によって分析した。

第５図のレーン２に示したように、非還元性条件下で試験すると４８４抗原は１ ２５−１３５ＫＤ間に２つのバンドを有した。これに対し、還元性条件下では抗 原（レーン４）は１３０−１４０ＫＤの単一の幅広バンドとして移動する。非還 元性条件下にお（プる明確な２つのバンド構造及び僅かに早−い移動性は、グリ コジル化の差及び連鎖間のジスルフィド結合の作用を反映する。

亙肛 抗−４８４抗体を生成するハイブリドーマ細胞のほぼ純粋な培養物をメリーラン ド州、ロックビル在、アメリカン・タイプ・カルチＶ−・コレクションに１９８ ５年１月２２日付けでＡＴＣＣ寄託番号１−１３８７０３として寄託した。

駆逐 本発明のモノクローナル抗体は、検出可能な標識、たとえば常法による放射線標 識で標識し、生物学的試料又はインビボにおける４Ｈ４＋細胞の定量測定を行な うことができる。

４　Ｈ４＋Ｔ細胞に対する特異性のため、本発明のモノクローナル抗体は生物学 的試料におけるこれら細胞型の存在を検出するために使用することができる。本 発明のモノクローナル抗体は、Ｔ細胞が関与するＪＲＡ、ＳＬＥ、ショーグレン 病及びその他の自己免疫障害に含まれる細胞型を特性化する際、或いはＴ細胞か ら生ずる各種のリンパ腫及び白血症に対する診断助剤として使用することができ る。さらに、本発明による放射線標識したモノクローナル抗体を用いるインビボ の影像化は、これらの細胞型、たとえばＴ細胞起源の腫瘍を検出しかつ位置決定 するための無害な手段を提供することができる。

４Ｂ４抗体は免疫調整活性によりＴ４細胞の主たるサブ群を検出する。Ｔ４群に おける作用のこのインデューサを検出する能力は、各種の免疫調整障害の診断及 び処置の両者に重要である。ヘルパのインデューサの除去はたとえば腎臓、心臓 、骨髄を含め各種の組織を移植する際の主たる助けとなる。

抑制の残余のインデューサ、すなわち４Ｂ４一群はグラフトの確立を可能にする 。ざらに、この抗体を単独で或いはラジオアイソトープ、薬物若しくは毒素と組 合せて治療投与すれば、自己免疫病或いは器官移植を受ける患者に対し治療上の 利点を与える。何故なら、移植物を拒否するメカニズムは免疫反応の活性化を含 むからである。

他の実施態様については以下の請求の範囲に示す。

ＵＮＳＥＰＡＲＡＴＥＤＴＣＥＬＬＳ Ｔ４　ＣＥＬＬＳ ７８　ＣＥＬＬＳ ＣＥＬＬＮＵＭＢＥＲ）＋ 手続補正書 昭和６１年１１月　２５日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ダナー７アーバー　キャンサー　インステイテユート。

インコーホレイテッド

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．１群のヒト細胞における第１サブ群の表面の抗原決定子に対し前記群のヒト 細胞における第２サブ群の抗原決定子に対するよりも大きい程度に反応し、前記 第１及び第２サブ群の細胞は第１モノクローナル抗体とは異なる第２のモノクロ ーナル抗体に対し相対的にほぼ同定度の反応性を示すことを特徴とする非ヒト霊 長動物細胞に対する第１モノクローナル抗体。
2. ２．抗原決定子が還元性条件下で約１３０，０００〜１４０，０００ダルトンの 分子量を有し、かつ非還元性条件下で約１２５，０００〜１３５，０００ダルト ンの範囲の２つの分子量を有する請求の範囲第１項記載の第１モノクローナル抗 体。
3. ３．ヒト細胞がリンパ球である請求の範囲第１項記載の第１モノクローナル抗体 。
4. ４．リンパ球が丁細胞である請求の範囲第３項記載の第１モノクローナル抗体。
5. ５．１群のヒト細胞がＴ４＋細胞である請求の範囲第４項記載の第１モノクロー ナル抗体。
6. ６．１群のヒト細胞がＴ８＋細胞である請求の範囲第４項記載の第モノクローナ ル抗体。
7. ７．抗体が第１及び第２サブ群のヒトＴ８＋細胞に対し異なる程度の反応性を示 す請求の範囲第５項記載の第１モノクローナル抗体。
8. ８．抗体が第１及び第２サブ群のヒト丁４＋細胞に対し異なる程度の反応性を示 す請求の範囲第６項記載の第１モノクローナル抗体。
9. ９．抗体がＩｇＧ１同型である請求の範囲第５項又は第６項記載の第１モノクロ ーナル抗体。
10. １０．第２サブ群のＴ４＋細胞の増殖が、第１サブ群のＴ４＋細胞よりもコンカ ナバリンＡによる誘発に対し感受性が大である請求の範囲第８項記載の第１モノ クローナル抗体。
11. １１．第１サブ群のＴ４＋細胞の増殖が、第２サブ群のＴ４＋細胞よりも可溶性 抗原による誘発に対し感受性が大である請求の範囲第８項記載の第１モノクロー ナル抗体。
12. １２．第１サブ群のＴ４＋細胞が、ヤマゴボウミトゲンの存在下で第２サブ群よ りもヒトＢ細胞における１９Ｇ分泌より大きい程度に誘発しうる請求の範囲第８ 項記載の第１モノクローナル抗体。
13. １３．第２サブ群のＴ４＋細胞が、ヤマゴボウミトゲンの存在下で第１サブ群よ りもヒトＢ細胞における１９Ｇ分泌を大きい程度に抑制するヒトＴ８＋細胞を誘 発しうる請求の範囲第８項記載の第１モノクローナル抗体。
14. １４．モノクローナル抗体が検出可能な標識で標識される請求の範囲第７項記載 の第１モノクローナル抗体。
15. １５．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８７０３として同定される ハイブリドーマ細胞ラインにより産生されるモノクローナル抗体に相当する請求 の範囲第１項記載の第１モノクローナル抗体。
16. １６．非ヒト霊長動物細胞に対するモノクローナル抗体を生成させ、 このモノクローナル抗体をヒト細胞と接触させ、′かつこれらサブ群を前記モノ クローナル抗体に対する反応性の異なる程度に基づいて区別する ことを特徴とする複数のヒト細胞におけるサブ群の分別方法。
17. １７．ヒト細胞が丁細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．丁細胞がＴ４＋細胞若しくはＴ８＋細胞である請求の範囲第１７項記載の 方法。
19. １９．非ヒト霊長動物細胞がＴ細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。
20. ２０．非ヒト霊長動物細胞が、サグイヌス・エディプスからの丁細胞である請求 の範囲第１６項記載の方法。
21. ２１．複数の動物を第１サブ群の細胞で免疫化しかつ異なるモノクローナル抗体 を生成する複数の異なるハイブリドーマを生成させ、 前記免疫化に使用しなかつた第２サブ群の細胞に対する抗体の反応性を試験し、 かつ 前記第１サブ群に対するよりも前記第２サブ群に対する反応性が小さい抗体を選 択する ことをさらに含む請求の範囲第１６項記載の方法。
22. ２２．ヒト細胞及び非ヒト霊長動物細胞に存在する抗原決定子に対する動物の免 疫反応を増大させるに際し、前記動物を前記非ヒト霊長動物細胞で免疫化するこ とを特徴とする免疫反応の増大方法。
23. ２３．ヒト細胞及び非ヒト霊長動物細胞がＴ細胞である請求の範囲第２１項記載 の方法。
24. ２４．非ヒト霊長動物細胞がサグイヌス・エディプスからの丁細胞である請求の 範囲第２１項記載の方法。
25. ２５．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８７０３として同定された細胞ラインに相当するハ イブリドーマ細胞。