DE68919524T2

DE68919524T2 - Schnelles Verfahren zur Analyse von Mutationen.

Info

Publication number: DE68919524T2
Application number: DE68919524T
Authority: DE
Inventors: Andrew 1L Somerville Ma 02143 Peterson; Brian Dr. Boston Ma 02114 Seed
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1989-04-13
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2009-04-14
Also published as: ATE114821T1; PT90265B; EP0341444B1; PT90265A; US5411861A; DK172589D0; ES2065933T3; DK172589A; US6579676B1; US5955264A; DE68919524D1; DK172110B1; EP0341444A2; EP0341444A3; JPH02203787A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und Immunologie. Sie bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Selektion und Analyse von Mutanten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung dieses Verfahrens zur Identifizierung von antigenen Domänen oder Epitopen von Proteinen oder Polypeptiden.

Stand der Technik

Ruhende menschliche T-Zellen binden Schaferythrozyten über ein T-Zell-spezifisches 50 kD Zelloberflächenprotein, das CD2 genannt wird (Bach, J.F., et al., Transplantation 8:265-280 (1969); Howard, F.D., et al., J. Immunol. 126:2117-2122 (1981)). Diese Eigenschaft ist seit langem von praktischem Nutzen, ihre physiologische Bedeutung war jedoch bis vor kurzem kaum bekannt. Parallele Studien der Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und Schaf-Erythrozyten (Hunig, T., J. Exp. Med. 162:890-901 (1985); Hunig, T.R., J. Immunol. 136:2103-2108 (1986)) und von T-Zellen und ihren physiologischen Targets (Shaw, S., et al., Nature 323:262-264 (1986)) führten zur Identifizierung eines spezifischen molekularen Liganden für CD2, bei dem es sich um ein weit verbreitetes Oberflächenprotein handelt, das beim Menschen LFA-3 genannt wird. Die Wechselwirkungen zwischen CD2 und LFA-3 vermitteln zytolytische Targetkonjugation (Shaw, S., et al., Nature 323:262-264 (1986), Thymozyten-Epitheladhäsion (Vollger, et al., (1987)) und die gemischte Lymphozytenreaktion (Martin, P.J., et al., J. Immunol. 131:180-185 (1983)). Darüber hinaus ließ die Entdeckung, daß bestimmte Kombinationen von monoklonalen Antikörpern gegen CD2 reife T-Zellen über einen Antigen-unabhängigen Weg direkt aktivieren können, vermuten, daß das CD2-Antigen eine umfassendere Rolle spielt.
Die derzeit am häufigsten eingesetzte Methode zur Kartierung von Proteinepitopen erfordert die Synthese einer Reihe von kurzen, synthetischen Peptiden, die die Proteinsequenz abdecken, sowie den Einsatz dieser Peptide in zahlreichen Bindungstests (Geysen, H.M., et al., Science 235:1184-1190 (1987)). Zur Identifizierung spezifischer Reste, die für die Antikörperbindung wichtig sind, werden Varianten der Peptide mit Substitutionen in jeder Position synthetisiert. Der Strategie der synthetischen Peptide sind in mehrfacher Hinsicht Grenzen gesetzt. Wenn der Antikörper seine Affinität aus den Wechselwirkungen mit ungleichen Teilen des Polypeptid-Rückgrats oder mit einer neuen Konformation des Rückgrats ableitet, werden die Peptide nicht in der Lage sein, hinsichtlich der Bindung an den Antikörper das gesamte Protein zu imitieren. Zur Identifizierung einzelner Reste, an die der Antikörper bindet, muß eine extrem hohe Anzahl von Peptidvarianten synthetisiert werden. Die bislang umfassendste derartige Studie führte Tests an über 1500 einzelnen Peptiden durch (Getzoff, E.D., et al., Science 235:1191-1196 (1987)).
Monoklonale Antikörper wurden zur Selektion auf Determinanten von Virushüllen eingesetzt (Yewdell, J.W., und Gerhard, W., Ann. Rev. Microbiol. 35:185-206 (1981)). Derartige Selektionen sind sowohl weniger praktisch als auch weniger empfindlich als erwünscht, da die mutationsbedingten Änderungen aus dem Virusgenom entfernt werden müssen und Mutationen, die zur Lebensunfähigkeit der Viren führen, nicht nachgewiesen werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein schnelles und einfaches Verfahren zur Kartierung von Proteinepitopen. Die erfindungsgemäße schnelle Technik zur Analyse von Mutationen beinhaltet die Selektion von Mutationen der Antigen-cDNA, die den Verlust der Antigen-Antikörper-Reaktivität bedingen. Das Verfahren setzt cDNA-Epitop-Deletionsmutanten ein und ermöglicht die Untersuchung einer sehr großen Anzahl von Aminosäurensubstitutionen in dem nativen Molekül. Die Mutationsrate ist bei dem eingesetzten Mutagenese-Verfahren hoch genug, um seltene Varianten effizient isolieren zu können. Die Technik der vorliegenden Erfindung ist schnell und einfach genug, um eine sehr große Anzahl von Mutanten isolieren zu können, und sie kann auf jedes Oberflächenprotein angewendet werden, für das eine cDNA und monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen.
Die Fähigkeit, auf einfachem Wege eine große Anzahl von Epitop-Deletionsmutanten zu erhalten, ermöglicht die detaillierte Kartierung von zugänglichen Oberflächenbereichen von Proteinen, die Identifizierung von Liganden-Bindungsstellen und das Design von Proteinen, die weniger stark antigen sind, aber eine größere biologische Wirkung haben.
Darüber hinaus kann man unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend zugeschnitte Liganden direkt als Reagenzien für die negative Selektion einsetzen und so den Ansatz dahingehend erweitern, daß wichtige Reste für die Wechselwirkungen zwischen Ligand oder Substrat und Protein identifiziert werden können, die in für Antikörper unzugänglichen Taschen stattfinden können. Die Identifizierung der Liganden-Bindungsstellen wird Strukturstudien erleichtern, die zum Design neuer Liganden und Arzneimittel führen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde zur Definition der Regionen, durch die das CD2-Antigen an monoklonale Antikörper gegen CD2 bindet, und zur Definition der Bindungsstellen für das humane Immundefizienzvirus (HIV) auf dem CD4-Antigen eingesetzt.
CD2-CD4-Mutationen wurden selektiert, die zum Verlust der CD2-Antikörper-Reaktivität führen. Das Muster der Aminosäurensubstitutionen in den Mutanten definiert drei getrennte Regionen des CD2-Moleküls: eine Epitopregion, die von Gruppe I- und Gruppe II-Antikörpern erkannt wird; eine zweite Epitopregion, die von Gruppe III-Antikörpern erkannt wird; und eine dritte Epitopregion, die von Gruppe IV-Antikörpern erkannt wird. Ein Vergleich der für die Antikörperbindung wichtigen Aminosäurereste und der für die LFA-3-Bindung wichtigen Aminosäurereste weist darauf hin, daß Gruppe I- und Gruppe II- Antikörper mit einem Abschnitt der LFA-3- Bindungsstelle in Wechselwirkung treten, daß Gruppe III-Antikörper mit einem anderen Abschnitt der LFA-3-Bindungsstelle in Wechselwirkung treten, und daß Gruppe IV-Antikörper mit einem dritten Abschnitt in Wechselwirkung treten, der an der LFA-3-Bindung nicht beteiligt ist. Außerdem weist die enge Entsprechung der Auswirkungen der einzelnen Substitutionen auf die Bindung von Gruppe I-Antikörpern und auf die LFA-3-Bindung darauf hin, daß Gruppe I-Antikörper ihre Auswirkungen auf die T-Zell-Aktivierung durch Imitation der Auswirkungen der LFA-3-Bindung vermitteln.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine schematische Darstellung des Mutanten- Isolierungsvektors und des Verfahrens zur Isolierung von Mutanten.
Figur 1A ist eine Darstellung des zur Isolierung von Mutanten eingesetzten Vektors piH3MCD2.
Figur 1B ist eine schematische Darstellung der Strategie zur Isolierung von Mutanten. In Schritt (i) werden COS-Zellen, die mutierte und Wildtyp-Moleküle exprimieren, mit einem monoklonalen Antikörper behandelt, der das Epitop erkennt, dessen Deletion gewünscht wird. Diese Zellen, die das Epitop noch exprimieren, binden den Antikörper, was Komplementfixierung (Schritt ii) und Zellyse zur Folge hat. In Schritt (iii) werden die restlichen Zellen mit einem Antikörper behandelt, der ein zweites Epitop (iii) von CD2 erkennt, und in Schalen gegeben, die mit Antisera beschichtet sind, die monoklonale Mäuse-Antikörper erkennen. Nur diejenigen Zellen, die das zweite Epitop exprimieren, binden an die Schalen (iv). Plasmid-DNA wird aus den anhaftenden Zellen zurückgewonnen. Der erste Schritt entfernt diejenigen Moleküle, die noch immer das Epitop exprimieren, dessen Deletion gewünscht wird; der zweite Schritt steigert die Effizienz des Verfahrens und stellt sicher, daß keine Nullmutanten erhalten werden.
Figur 2 zeigt die Lokalisation der Epitope auf der Primärsequenz von CD2.
Figur 2A stellt die vorhergesagte Sequenz des reifen CD2-Proteins dar. Die Transmembranregion ist mit einem dunklen Balken unterstrichen. Die eingesetzten Antikörper sind am linken Rand angegeben. Die Symbole unter der Primärsequenz kennzeichnen die Empfindlichkeit der einzelnen Antikörper gegenüber Veränderungen in dieser Position. Ein "O" gibt an, daß eine Mutante mit einer Substitution in dieser Position erhalten wurde, oder daß indirekte Immunofluoreszenztests von Mutanten, die mit einem anderen Antikörper erhalten wurden, Empfindlichkeit gegenüber einer Substitution in dieser Position aufzeigten. Ein "+" gibt an, daß eine Substitution in dieser Position getestet wurde und sich nicht auf die Antikörperreaktivität auswirkte. Das Symbol "=" bedeutet, daß sich in dieser Position nur Prolin auf die Reaktivität auswirkte.
Figur 3 zeigt die Sammlung von Mutanten, die Epitopregionen von CD2 definieren. Die Sequenz kurzer Abschnitte des CD2-Polypeptids, die beide der zwei wichtigsten Epitopregionen umfassen, wird gezeigt. Die durch Mutantenselektion erhaltenen Aminosäurensubstitutions-Varianten sind unter den jeweiligen Wildtyp-Sequenzen dargestellt. Figur 3A zeigt die Sequenz der Epitopregion 1 des CD2-Polypeptids. Figur 3B zeigt die Sequenz der Epitopregion 2 des CD2-Polypeptids. Die Spalten auf der rechten Seite zeigen (von links nach rechts) den für die negative Selektion eingesetzten Antikörper und den/die für die positive Selektion verwendeten Antikörper. "Alle 16" bedeutet, daß alle 16 monoklonalen Antikörper von Figur 2 für den Schritt der positiven Selektion kombiniert wurden. "7 andere" bedeutet, daß sieben Antikörper außer 35.1, die die erste Epitopregion erkennen, für den Schritt der positiven Selektion kombiniert wurden. Die Varianten direkt unter der CD2- Sequenz wurden durch die Selektion von Mutanten aus einem Pool von Plasmiden erhalten, die in dem Abschnitt der cDNA mutagenisiert wurden, der für die extrazelluläre Domäne des Proteins codiert. Die Varianten unter den Strichen zeigen Mutanten, die durch Selektion mit plasmid erhalten wurden, das nur von Oligonucleotiden aus den Bereichen der Striche mutagenisiert wurde.
Figur 4 stellt die Lokalisation der Epitope auf der Primärsequenz von CD4 dar. Gezeigt wird die vorhergesagte Sequenz des CD4-Proteins sowie die vorgeschlagene HIV-Bindungsstelle (mit Oberstrich), die Transmembranregion (unterstrichen) und die Aminosäurenpositionen, in denen es zur mutationsbedingten Substitution kommt (*).

Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Kartierung von Epitopen von Oberflächenantigenen ermöglicht die Kartierung von Epitopen jeglicher Oberflächenproteine, für die eine cDNA und monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen. Das Verfahren wird unter Verwendung von c-DNA-Epitop-Deletionsmutanten durchgeführt, ermöglicht die Überprüfung einer sehr hohen Anzahl von Aminosäurensubstitutionen in dem nativen (natürlich auftretenden) Molekül und ermöglicht so die Kartierung der zugänglichen Oberflächenbereiche von Proteinen, die Identifizierung von Liganden-Bindungsstellen und das Design von Proteinen, die weniger stark antigen sind als ihre natürlich vorkommenden Entsprechungen und gleichzeitig eine größere biologische Wirkung haben.
Der Begriff "Oberflächenantigen" bezeichnet ein auf der Zelloberfläche vorhandenes Protein; im allgemeinen wird ein Oberflächenantigen durch das intrazelluläre Membransystem zur Zelloberfläche transportiert. Solche Antigene sind normalerweise mit einer carboxylterminalen Domäne in der Zelloberflächenmembran verankert, die hydrophobe Aminosäuren enthält, die in der Lipid-Doppelschicht der Membran liegen. Wie nachstehend beschrieben wird, wird das erfindungsgemäße Verfahren dazu eingesetzt, die Bindungsstellen des humanen T-Zell-Rezeptors (CD2-Antigen) sowie die HIV-Bindungsstelle auf dem CD4-Antigen zu identifizieren. Diese sind in Figuren 2 bzw. 4 dargestellt.

Allgemeines Schema der Isolierung von CD2-Mutanten

Die Mutantenisolierung erfolgt wie in Figur 1 dargestellt. Das in Figur 1 dargestellte Verfahren wird im Hinblick auf seine Anwendung zur Isolierung von CD2-Epitop-Deletionsmutanten diskutiert. Es versteht sich jedoch, daß es ebenfalls zur Identifizierung von CD4-Epitop-Deletionsmutanten Anwendung findet und allgemein für andere Oberflächenantigene eingesetzt werden kann.
Wie in Figur 1 dargestellt ist, wurden CD2-Epitop-Deletionsmutanten wie folgt isoliert: COS-Zellen wurden mit einem Pool mutagenisierter Plasmide transfiziert, 48 Stunden kultiviert, geerntet und nacheinander mit einem monoklonalen Antikörper gegen CD2 (d.h. mit einem monoklonalen Antikörper, der das Epitop erkennt, dessen Deletion gewünscht wird), Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper und Komplement behandelt. Dieser Schritt wird als negative Selektion bezeichnet und ist in Figur 1B als Schritt (i) dargestellt.
Da in COS-Zellen häufig spontane Deletionsmutanten auftreten (Calos, M.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3015-30l9 (1983); Razzaque, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3010-3014 (1983), wurde ein positiver Selektionsschritt wie folgt durchgeführt: Die von der Komplementbehandlung nicht betroffenen Zellen wurden mit einem oder mehreren Antikörpern behandelt, die ein oder mehrere bestimmte CD2-Epitope erkennen, und man gab sie in Schalen, die zur Bindung der Zellen mit Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin beschichtet waren. Wysocki, L.J. und Sato, V.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:2844-2848 (1978). Tabelle 1 zeigt zur Isolierung von Epitop-Deletionsmutanten eingesetzte Antikörper.
Von den an den Schalen anhaftenden Zellen zurückgewonnene Plasmid-DNA (Hirt, B., J. Mol. Biol., 26:365-369 (1967) wurde dann in E. coli transformiert, amplifiziert und nach Bedarf für weitere Runden erneut in COS-Zellen eingeführt. Am Ende des Selektionsprozesses wird DNA von einzelnen Bakterienkolonien in COS- Zellen transfiziert, die dann hinsichtlich der Antikörperbindung ausgewertet werden. TABELLE 1 Zur Isolierung von Epitop-Deletionsmutanten eingesetzte Antikörper Antikörper Isotop *Antikörper 39B21 ist ein monoklonaler Ratten-Antikörper, alle anderen sind Mäuse-Antikörper
Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kartierung von Epitopen des CD2-Antigens wurde der Vektor piH3M zur Isolierung von Mutanten verwendet. Ein für das Oberflächenantigen codierendes cDNA-Segment wird in den Vektor piH3M eingeführt, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 330191 des Anmelders beschrieben wurde, was durch den Verweis auf die genannte Patentanmeldung in diese Patentanmeldung aufgenommen wird. piH3M enthält einen plasmidspezifischen Replikationsursprung und ein Suppressor- tRNA-Gen, was die Replikation und Selektion in E. coli ermöglicht. Zusätzlich enthält er Replikationsursprünge des M13-Bakteriophagen und des SV40-Virus (Figur 1a). Diese ermöglichen die Bildung einer einzelsträngigen Version des Plasmids und die Amplifikation des Plasmids nach der Einführung in Zellen, die die für die Replikation von SV40 erforderlichen Proteine exprimieren, d.h. in COS- Affenzellen. Die Expression von cDNA-Oberflächenantigen in COS- Zellen wird von dem Promotor der sehr frühen (immediate early) Region des humanen Cytomegalovirus gesteuert. Signale für das RNA- Spleißen und die Prozessierung des 3'-Endes befinden sich flußabwärts von der cDNA und sind vom SV40-Virus abgeleitet.
Bei der Isolierung und Definition der Regionen, durch die die CD2-Zelloberflächenepitope an monoklonale Antikörper gegen CD2 binden, wurden die cDNA-Mutationen mit den hier beschriebenen Verfahren selektiert.
Die erste Isolierung von Mutanten macht sich die hohe Mutationsrate von DNA zunutze, die in Zellkulturzellen transfiziert wurde (Calos, M.P. et al., supra; Rassaque, A. et al., supra; und Miller J.H. et al., EMBO J. 3:3117-3121 (1984)). Eine Population von Plasmiden, die mittels Passage durch COS-Zellen mutagenisiert wurden, wurde in E. coli zurückgewonnen. Der mutagenisierte Pool wurde drei weiteren Selektionsrunden unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers (MAk) 9.6 für die negative Selektion und MAk 35.1 für die positive Selektion unterzogen, und eine einzige Mutante wurde isoliert (Figur 2).
Die isolierte Mutante hatte zwei Nucleotid-Substitutionen, wobei Lys48 zu Asn und Asp186 zu Glu verändert wurde. (Nachstehend werden die verschiedenen Mutanten durch Angabe von Wildtyp- Rest/Mutanten-Rest beschrieben, so daß beispielsweise Lys48Asn bedeutet, daß Lysin in der Position 48 durch ein Asparagin ersetzt wurde.) Die Trennung der beiden Veränderungen durch Oligonucleotid-Mutagenese zeigte, daß Lys48Asn allein für den Verlust der Bindung des Antikörpers 9.6 verantwortlich war. Weitere Versuche, mit anderen Antikörpern weitere Mutanten aus diesem Pool zu isolieren, blieben erfolglos.
Das Muster der Aminosäurensubstitutionen in den Mutanten definiert drei getrennte Regionen des CD2-Moleküls, die viele Sequenzvarianten umfassen: Antikörper, die an der Aktivierung beteiligt sind und die Erythrozytenadhäsion blockieren, binden an eine erste Region; Antikörper, die nur die Adhäsion blockieren, binden an eine zweite Region; und Antikörper, die an der Aktivierung beteiligt sind, aber die Adhäsion nicht blockieren, binden an eine dritte Region.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde ebenfalls zur Isolierung und Definition der Regionen eingesetzt, durch die die CD4-Zelloberflächenepitope an monoklonale Antikörper gegen CD4 binden. Mit dem vorliegenden Verfahren wurden Aminosäurensubstitutions-Varianten von CD4 isoliert. Mutationen, die sich auf die HIV-Bindung auswirken, wurden in einem Epitop-Cluster gefunden, der das Leu3a- Epitop umfaßt.
In der folgenden ausführlichen Beschreibung wird auf verschiedene Verfahrensweisen verwiesen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der rekombinanten Genetik bekannt sind. Veröffentlichungen und andere Unterlagen, in denen diese bekannten Vorgehensweisen beschrieben werden, und auf die hier verwiesen wird, sind durch diesen Verweis in diese Patentanmeldung einbezogen.
Zu den Standardwerken, die die allgemeinen Grundsätze der Gentechnik darlegen, gehören Darnell, J.E., et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Publisher, New York, New York (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, New York (1985); Old, R.W., et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Auflage, University of California Press, Berkeley, California (1981); und Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

CD2

Zufallsmutagenese und Selektion auf Mutanten des CD2-Epitops

Zur Steigerung der Wahrscheinlichkeit der Mutantenisolierung wurde ein allgemeines Verfahren für die hocheffiziente Zufallsmutagenese jeglicher DNA entwickelt. Siehe z.B. Botstein, D und D. Shortle, Science 229:1193-1201 (1985). Eine homogene und unspezifische Substitution aller möglichen Basenpaare, die für die extrazelluläre Domäne von CD2 codieren, wird aus einer Sammlung von 20 überlappenden Oligonucleotiden mit 33 Einheiten (33-mer) entwickelt, die aus einem Gemisch von 95% der Wildtyp-Base in jeder Position und 1,7% von jeder der drei anderen Basen synthetisiert wurden. Die Oligonucleotide überlappen, da der während der Synthese an der Matrix verankerte Rest nicht nach Belieben manipuliert werden kann, und da die Effizienz des Einbaus von Mutationen, die sich am äußersten Ende des Oligonucleotids befinden, nicht bekannt ist.
Zur Maximierung der Wirksamkeit der Basenpaar-Substitutionen wurde das Verfahren von Kunkel eingesetzt, um die degenerierten Oligonucleotide in den Expressionsvektor piH3MCD2 einzubauen (Figur 1a). Kunkel T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985). Auf der Grundlage des Degenerationsgrads der Oligonucleotide und der Wirksamkeit ihres Einbaus wurde berechnet, daß etwa 40% der aus der Transformation in E. coli resultierenden Plasmide mindestens eine Basensubstitution enthielten. Zwanzig getrennte Mutangenesereaktionen wurden durchgeführt und in E. coli transformiert, und ein Teil von jeder der resultierenden Kulturen wurde gepoolt, um einen Mutantenvorrat zu erhalten.
Die Anwendung des Selektionsverfahrens auf einen aliquoten Teil des Mutantenvorrats unter Verwendung von MAk 9.6 für die negative Selektion und MAk 35.1 für die positive Selektion ergab, daß 10-15% der zurückgewonnenen Plasmide den gewünschten Phänotyp trugen. Nach zwei Runden entsprachen die gewünschten Mutanten 50- 75% der Plasmidpopulation. Für alle nachfolgenden Mutantenselektionen wurde derselbe Mutantenvorrat eingesetzt.

Lokalisation der Mutationen

Einhundertundvierzehn (114) primäre Mutanten wurden isoliert, was zu einer Sammlung von 50 verschiedenen Varianten von Aminosäuresequenzen führte. Die Ergebnisse dieser Mutantenselektionen sind in Figuren 2 und 3 zusammengefaßt. Alle Veränderungen entfallen auf drei separate Regionen. Region 1 konzentriert sich um Lys48 und enthält 47 Mutationen für alle Gruppe I-Antikörper (9.6, 7E10, MT11D und MT91D), alle Gruppe II Antikörper bis auf einen, und einen Gruppe III-Antikörper (Figur 3a). Region 2 konzentriert sich um Gly95. In dieser zweiten Epitopregion erhielt man unter Verwendung fünf verschiedener Antikörper für die negative Selektion 27 Mutanten (Figur 3b). Der einzige stimulierende Antikörper bindet an eine wesentlich breitere Region als alle anderen Antikörper, aber es kann keine andere klare Unterscheidung getroffen werden; jeder Antikörper ergibt ein unverwechselbares Mutationsmuster. Die meisten der Antikörper, die die Region 2 erkennen, haben wenig Einfluß auf die T-Zell-Aktivierung. Region 3 wird von einer einzigen Mutation repräsentiert, die den Verlust der Reaktivität auf beide Gruppe IV-Antikörper (9.1 und OCH127) bewirkt.
Figur 3a zeigt die Mutantensammlung, die die Epitopregion 1 definiert. Die CD2-Reste 42-50 werden über den Aminosäurensubstitutionen gezeigt, die auf den jeweiligen Mutanten codiert sind. Die erste Spalte von rechts führt die zur negativen Selektion eingesetzten Antikörper auf. Die zweite Spalte enthält den/die Antikörper für die positive Selektion. "Alle 16" bedeutet, daß alle 16 monoklonalen Antikörper von Tabelle 1 zusammengegeben und für die positive Selektion verwendet wurden. "7 andere" bedeutet, daß 7 andere Antikörper als 35.1, die die erste Epitopregion erkennen, für den Schritt der positiven Selektion zusammengegeben wurden. Man erhielt die direkt unter der CD2-Sequenz gezeigten Varianten durch Selektion von Mutanten aus einem Pool von Plasmiden, die im gesamten Bereich der extrazellulären Domäne des Proteins mutagenisiert wurden. Die Varianten unter den Strichen sind Mutanten, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz von Plasmiden erhalten wurden, die nur von Oligonucleotiden aus dem Bereich der Striche mutagenisiert wurden. Die Mutantensammlung, die die Epitopregion 2 definiert, ist in Figur 3b dargestellt. Die CD2-Reste 86 bis 100 sind über den mutationsbedingten Substitutionen angegeben. Die anderen Angaben sind wie in Figur 3a.

Erythrozyten-Rosetten-Test

Die Fähigkeit der mutanten CD2-Proteine, die LFA-3-vermittelte Adhäsion humaner Erythrozyten an transfizierte COS-Zellen zu fördern, wurde mit einem qualitativen Erythrozyten-Rosetten-Test gemessen. Drei Phänotypen wurden ausgewertet: Wildtyp-Rosettenbildung, partielle Rosettenbildung und keine Rosettenbildung. Viele der Mutationen, die Veränderungen in den Regionen 1 und 2 (Reaktivität mit Gruppe I-, Gruppe-II und Gruppe-III-Antikörpern) bewirkten, reduzierten die Rosettenbildung erheblich. Um dies weiter zu untersuchen, wurden einige Mutanten durch spezifische Oligonucleotid-Mutagenese hergestellt. Die Substitution von Lysin durch Asparagin oder Alanin in den Positionen 46, 47 und 48 der Epitopregion 1 zeigte einen auffallenden Zusammenhang zwischen der Bindung des Gruppe I-Antikörpers MAk 9.6 und der Erythrozytenadhäsion. Lys46Asn/Ala zeigt nur mäßige Auswirkungen auf die Bindung von MAk 9.6 und von Erythrozyten; Lys47Asn/Ala wirkte sich auf beide nicht aus und Lys48Asn/Ala schaltete beide Wechselwirkungen gänzlich aus. Entsprechend konnte gezeigt werden, daß der Rest 51 sowohl für die Erythrozyten- als auch für die MAk 9.6-Bindung wichtig ist. Rest 52 hatte nur geringe Auswirkungen auf beide Wechselwirkungen.
Nachfolgende Versuche mit anderen Antikörpern und anderen Mutanten zeigten, daß Lys48 eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung von CD2 mit Gruppe I-Antikörpern und LFA-3 spielt (Figuren 2 und 4). So reagiert beispielsweise die Mutante Lys48Gly mit keinem der Gruppe 1-Antikörper, und keines der bei Lys48 substituierten Moleküle hat eine nachweisbare Rosettenbildungsaktivität. Das Verhalten der Substitutionen bei Lys48 ist einer der stärksten Belege dafür, daß Gruppe I-Antikörper den Effekt der LFA-Bindung bei der Anregung der T-Zell-Proliferation nachahmen.
Nur einer der an der T-Zell-Aktivierung beteiligten Antikörper erkennt Determinanten in der zweiten Epitopregion. Es ist kennzeichnend für Substitutionen in diesem Bereich, daß sie die Rosettenbildung verringern, ohne sie gänzlich auszuschalten, was die Annahme bestätigt, daß mit Antikörpern, die die Aktivierung fördern, selektierte Mutationen normalerweise Mutationen sind, die sich auf die Rosettenbildung auswirken.

Auswirkungen einzelner Aminosäurensubstitutionen

Während einige Reste die Antikörperreaktivität direkt beeinflussen können, zeigt es sich, daß andere, die von sekundärer Bedeutung für die Antikörperaffinität sind, identifiziert werden können, weil sie häufig im Zusammenhang mit anderen Veränderungen geändert werden. So tritt beispielsweise eine Lys46Asn-Substitution häufig in Mutanten auf, die nicht an MAk 9.6 binden, doch alleine bewirkt sie nur einen teilweisen Verlust der Bindung. Ein ähnliches Phänomen kann der wiederholten Isolierung von Doppelmutanten in den Positionen 51 und 52 zugrundeliegen.
Im Prinzip könnten Aminosäurensubstitutionen entweder durch Ausschaltung einer spezifischen Wechselwirkung oder durch Auslösung einer lokalen Denaturierung zum Verlust der Antikörper- oder LFA-3-Bindung führen. Einige Muster der Antikörper- oder LFA-3- Bindung sprechen gegen die letztere Möglichkeit. So binden beispielsweise alle bei Lys48 substituierten Moleküle immer noch an MAk 35.1, der empfindlich gegenüber Veränderungen bei Ile49 ist. Ähnlich können weder MAk 9.6 noch LFA-3 an die Gln51Leu-Variante binden, die aber dennoch von den Antikörpern 7E10 und 9-2 erkannt wird. CD2 mit einer Gln51Arg-Substitution reagiert nicht mit 7E10 und 9-2, bindet jedoch LFA-3 ohne Unterschied zum Wildtyp. In der zweiten Epitopregion bewirkt die Tyr91Asp-Mutation den Verlust der Rosettenbildung, die Bindung des Antikörpers NU-TER wird jedoch nicht beeinträchtigt, während zahlreiche Substitutionen in der Position 92 die NU-TER-Reaktivität ausschalten.
In einem Fall kann die lokale Denaturierung eine wichtige Rolle beim Verlust der Antikörperbindung spielen. Es ist bekannt, daß Prolin-Reste nur eine geringe Konformationsfreiheit haben, die die Bildung einer Alpha-Helix nicht begünstigt (Chou, P.Y. und Fasman, G.D., Ann. Rev. Biochem. 47:251-276 (1987)). Keiner der Antikörper, die mit der ersten Epitopregion reagieren, erkennt Gln51Pro-Varianten, und Gln51Pro wird häufig durch negative Selektion mit Antikörpern der Region 1 identifiziert, wenn die positive Selektion mit allen 16 Antikörpern durchgeführt wird. Im extremsten Fall führt die negative Selektion mit MAk 35.1 ausschließlich zu Gln51Pro, wenn alle 16 Antikörper für die positive Selektion zusammengegeben werden. Um die wiederholte Isolierung von Gln51Pro zu vermeiden, wurden viele der Mutanten in der ersten Epitopregion (Figuren 2 und 3) unter Verwendung von MAk 35.1 als einzigem positiven Selektionsantikörper isoliert.
Zur Isolierung anderer 35.1-Mutanten als Gln51Pro wurden nur diejenigen Antikörper für die positive Selektion eingesetzt, die nicht an diese Variante binden. Nach drei Anreicherungszyklen wurde eine einzige 35.1 Ile49Gln-Mutante erhalten, die in allen drei Basen des ursprünglichen Codons verändert war. Die ungewöhnliche Art dieser Mutation weist darauf hin, daß der Antikörper 35.1 seine Affinität von verschiedenen Merkmalen der CD2-Konformation ableitet, so daß die Substitution eines einzigen Merkmals nur selten zu einer stark verringerten Affinität führt. Die Mutation Gln51Pro kann einige dieser Wechselwirkungen durch starke Veränderungen der lokalen Sekundärstruktur ausschalten. Da die Affinität des Antikörpers 35.1 mit der des Antikörpers 9.6 vergleichbar ist (Martin, P.J. et al., J. Immunol. 131: 180-185 (1983)), hat es den Anschein, daß das ungewöhnliche Mutationsspektrum dieses Antikörpers nicht einfach auf eine stärkere Wechselwirkung sondern auf einen qualitativ unterschiedlichen Bindungsmodus zurückzuführen ist. Bei einem anderen Gruppe II-Antikörper, T11/3PT2H9, wurden ebenfalls ausschließlich Gln51Pro-Mutationen festgestellt, wenn alle 16 monoklonalen Antikörper für den Schritt der positiven Selektion gepoolt wurden.

Gruppe IV-Antikörper-Epitop

Für die Gruppe IV-Antikörper wurde nur eine einzige Mutante erhalten; eine Tyr140Asn/Gln141His-Doppelsubstitution. Gruppe IV- Antikörper reagieren jedoch nur schwach mit dem auf COS-Zellen exprimierten CD2-Molekül. Diese Situation erinnert an die schwache Reaktivität der Gruppe IV-Antikörper gegenüber CD2 auf unaktivierten T-Zellen (Meuer, S.C. et al., Cell 36:897-906 (1984)). Die vorherige Aktivierung von T-Zellen oder die Inkubation mit einem Gruppe I-Antikörper ist erforderlich, um das Gruppe IV-Antikörper- Epitop zugänglich zu machen (Meuer, S.C. et al., supra). Der rasche Erwerb der Reaktivität von Gruppe IV-Antikörpern weist darauf hin, daß diese durch eine Konformationveränderung in dem Molekül bedingt ist, und nicht durch eine de novo-Synthese einer anderen Spezies (Meuer, S.C. et al., supra; Yang, S.Y., et al., J. Immunol. 137:1097-1100 (1986)).
Die einzelnen monoklonalen Antikörper in dieser Studie ergaben ein aneinandergrenzendes lineares Muster der mutationsbedingten Variation. Alle drei Epitopregionen sind hydrophil, wie man es bei einem exponierten Abschnitt des Moleküls erwarten würde, der zur Antikörperbindung zur Verfügung steht (Figur 2). Man kann mehrere Alternativen als Erklärung dafür anbieten, warum nur wenige, eingeschränkte Abschnitte des Moleküls die Bildung zahlreicher unabhängiger Antikörper bewirken. So wird beispielsweise vorhergesagt, daß ein Abschnitt des ersten Epitops eine Alpha-Helix mit hydophilen Resten auf der einen Seite der Helix und hydrophoben Resten auf der anderen Seite bildet (Chou, P.Y. und Fasman, G.D., Ann. Rev. Biochem. 47:251-276 (1978)). Weiterhin wird angenommen, daß eine solche Helix ein besonders günstiges Antigen für die T-Zell-Erkennung bildet (De Lisi, C. und Berzofsky, J.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7048 (1985)), und die Erkennung dieser Region durch Mäuse-T-Helferzellen kann die Antikörperantwort fokussieren. In der der Epitopregion 2 entsprechenden Region (Figur 3b) wurden in der CD2-Sequenz von Ratten drei potentielle N-gekoppelte Glykosilierungsstellen gefunden (Williams, A.F. et al., J. Exp. Med. 165:368-380 (1987)), die in der humanen Sequenz nicht vorhanden sind. Dies kann zur Verbesserung der Reaktivität mit der humanen Sequenz dienen, indem man die Anzahl der Mäuse-T-Suppressorzellen reduziert, die mit der humanen Sequenz kreuzreagieren könnten. Alternativ könnte das eingeschränkte Spektrum von Antikörper-Bindungsstellen auf die vorherige Selektion von Antikörpern für die Erythrozyten-Rezeptor- Reaktivität zurückzuführen sein.

CD4

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde zur Isolierung von Aminosäurensubstitutions-Varianten von CD4 eingesetzt. Mutationen, die die HIV-Bindung beeinflussen, wurden in einem Epitopcluster festgestellt, der das Leu3a-Epitop umfaßt (Figur 4). Die Versuche zur Epitopkartierung zeigen, daß die meisten Anti-CD4-Antikörper, einschließlich derjenigen, die die Wechselwirkungen zwischen CD4 und gp120 am wirkungsvollsten blockieren, die aminoterminale Domäne von CD4 erkennen. Die Lokalisationen der Epitope zusammen mit der Ähnlichkeit zwischen der aminoterminalen Domäne von CD4 und den V-Domänen von Immunglobulin ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Oberfläche von CD4, die mit gp120 in Wechselwirkung tritt.
CD2 kann sowohl die Zell-Zell-Adhäsion als auch antigenunabhängige Aktivierungsreaktionen vermitteln. Das HIV-Hüllprotein gp120 bindet mit hoher Affinität (Kd 10&supmin;&sup9;M) an CD4, so daß das Virus in die Wirtszelle eindringen kann. Die Expression von CD4 an der Zelloberfläche ist für die Penetration des Virus erforderlich und scheint bei menschlichen Zellen als Voraussetzung für die Empfindlichkeit gegenüber Infektionen zu genügen. Die Wechselwirkung zwischen CD4 und gp120 vermittelt auch die Syncytienbildung zwischen infizierten Zellen und nicht infizierten Zellen, die CD4 tragen, was zumindest zum Teil für die nach Virusinfektionen in vitro beobachteten zytopathischen Effekte verantwortlich ist.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten, funktionell definierten Bindungsstellen, und insbesondere die auf das CD2-Molekül oder das CD4-Molekül ausgerichteten, können in löslicher Form hergestellt werden und können daher in dem Fachmann bekannten immundiagnostischen Testmethoden eingesetzt werden, einschließlich Radio-Immunoassays, Enzym-Immunoassays und ELISA. Darüber hinaus können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Oberflächenantigene in löslicher Form hergestellt werden und zur Behandlung immunologisch bedingter Störungen bei Tieren, einschließlich Menschen, für sich oder in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Oberflächenantigenen eingesetzt werden. Beispiele für solche Störungen sind Immundefekterkrankungen, AIDS, Asthma, rheumatoide Arthritis, immunpathogene Nierenschädigungen, Immunendokrinopathien und Gewebe-/Organtransplantat-Abstoßungen.
Lösliche Formen von CD4, denen die dritte Disulfid-gebundene extrazelluläre Domäne sowie die Transmembran- und Cytoplasma- Regionen fehlen, können an gp120 binden. Deen, K.C. et al., Nature 331:82-84 (1988); Dalgleish, et al., The Lancet, 7. November 1987, S. 1047-1049. Dies beschränkt die HIV-bindende Aktivität auf die beiden den Aminotermini am nächsten gelegenen Domänen. Die den Aminotermini am nächsten gelegene Domäne weist eine starke Homologie mit den Domänen der V-Regionen von Immunglobulin auf, was vermuten läßt, daß gp120 mit einer immunglobulinartigen Domäne von CD4 in Wechselwirkung treten kann.
Die Bindungsstelle für HIV auf CD4 wurde indirekt lokalisiert, indem monoklonale Antikörper eingesetzt wurden, die die Wechselwirkungen zwischen CD4 und gp120 beeinträchtigen. Zwei Epitope von CD4 scheinen sich in der Nähe der HIV-Bindungsstelle zu befinden, von denen eines durch die Antikörper Leu3a und OKT4A und das andere durch die Antikörper MT151 und VIT4 definiert wurde. Die beiden Epitope sind räumlich voneinander getrennt, und Antikörper, die eines der Epitope erkennen, beeinträchtigen nicht die Bindung von Antikörpern, die das andere erkennen. Gegen den Antikörper Leu3a induzierte antiiodiotypische Antikörper erkennen auch einen konservierten Abschnitt von gp120, was darauf hinweist, daß das Leu3a-Epitop in der Tat einen Teil der HIV-Bindungsstelle umfassen kann.
Daher ist es als Ergebnis der Identifizierung der HIV-Bindungsstelle auf CD4 möglich, Peptide herzustellen, die die Fähigkeit des HIV beeinträchtigen, menschliche Zellen zu infizieren, indem das Virus daran gehindert wird, an den CD4-Zelloberflächenrezeptor zu binden. Besonders geeignet für diesen Zweck ist zum Beispiel ein Peptid mit derselben, oder im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie das Leu3a-Epitop oder das in Figur 4 unter dem Oberstrich dargestellte. Ein solches Peptid kann mit bekannten Techniken synthetisiert werden und (beispielsweise intravenös) einer Person in löslicher Form (beispielsweise als Teil eines anderen Proteins wie etwa eines Immunglobulins) in ausreichenden Mengen verabfolgt werden, um an das HIV zu binden und seine Fähigkeit zu beeinträchtigen, Zellen zu infizieren.
Beim Einsatz in der Immuntherapie können die erfindungsgemäßen Antigene unmarkiert oder mit einer therapeutischen Substanz markiert sein. Beispiele für eine solche Substanz umfassen Arzneimittel, Radioisotope, Lektine und Zelltoxine. Erfindungsgemäße Verfahren und Zusammensetzungen werden in den folgenden Beispielen, die keine Einschränkung darstellen, näher erläutert.

BEISPIEL I Oligonucleotid-Mutagenese

Degenerierte Oligonucleotide wurden mit einem DNA-Syntheseautomaten von Applied Biosystems unter Verwendung eines Gemischs aus Phosphoramiditen, 95% der Wildtyp-Sequenz und 1,7% von jedem der drei anderen Phosphoramidite in jeder Position synthetisiert. Die 600 Nukleotide der CD2-Sequenz nach der Position 63, wie sie bei Seed B. und Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3365-3369 (1987) dargestellt ist, wurden in einer Sammlung von zwanzig 33- meren Oligonucleotiden synthetisiert. Die Sequenz erscheint auch in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 330191 des Anmelders. Jedes Oligonucleotid überlappt die vorhergehende Oligokukleotidsequenz um 3 Basen. Die Base am 3'-Ende ist nicht mutierbar (die Synthese erfolgt 3'-5' aus einem matrixfixierten Phosphoramidit); man kann jedoch Mutanten erhalten, die an der Base am 5'-Ende, wie durch das Oligonucleotid festgelegt, verändert sind. Dies würde darauf hinweisen, daß eine Überlappung von einer Base ausreicht, um alle Positionen mutierbar zu machen. Die Oligonucleotide wurden nach der Schutzgruppenabspaltung und Entsalzung nicht weiter gereinigt, sondern unverzüglich unter Verwendung von Polynucleotidkinase (Pharmacia) unter den bei Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Publisher, Cold Spring Harbor, New York (1982) beschriebenen Bedingungen phosphoryliert. Zehn Nanogramm von jedem phosphorylierten Oligonucleotid wurden unabhängig voneinander zu 500 ng einzelsträngiger Template zugegeben. Jedes Gemisch wurde kurz auf 70ºC erhitzt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt, und Desoxynucleotidtriphosphate, 10 Einheiten reverse Transkriptase (Life Sciences) und reverse Transkriptase-Puffer wurden zugegeben, um ein abschließendes Reaktionsvolumen von 10 ul zu erhalten. Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC wurden ATP, Dithiothreitol und Rinderserumalbumin zugegeben, um die empfohlenen Reaktionsbedingungen für T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) zu erreichen, wovon 400 Einheiten zugegeben wurden; anschließend wurde erneut 15 min bei 37ºC inkubiert. Ein Fünftel von jeder Ligationsreaktion wurde zur Transformation von E. coli eingesetzt, und man erhielt etwa 1.000 Bakterienkolonien von jedem Oligonucleotid. Die Kolonien von jeder Platte wurden in LB-Medium gekratzt und 20 Glycerin-Stammkulturen wurden angelegt, von denen jede einer Population von piH3MCD2 entsprach, die innerhalb einer anderen Sequenz von 33 Basenpaaren mutagenisiert wurde.
Einzelsträngige Template-DNA wurde in Stamm BW313/p3 hergestellt, der von BW313 (Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)) durch Transformation mit dem RP1-verwandten Plasmid p3 (Seed, B., Nuc. Acid Res. 11:2427-2445 (1983)) abgeleitet wurde. BW313/p3 ermöglicht die Selektion von Plasmiden, die ein Suppressor-tRNA-Gen enthalten, durch Züchtung in ampicillin- und tetracyclinhaltigen Medien. Das Plasmid piH3MCD2 wurde in BW313/p3 eingeführt, und einzelsträngige DNA wurde durch Infektion des Plasmid-tragenden Stammes mit dem Wildtyp des Virus M13 hergestellt, wie bei Levinson, A., et al., J. Mol. Appl. Genetics 2:507-517 (1984) beschrieben wurde. Die in BW313/p3 erzeugte einzelsträngige DNA hat 20 bis 30 Uracil-Reste pro Template. Dies ermöglicht die wirkungsvolle Selektion auf den in vitro hergestellten DNA-Strang und dadurch auf den Einbau des Oligonucleotids (Kunkel, T.A., supra). Die Einbaurate betrug etwa 75%.
Spezifische Aminosäure-Veränderungen in den Positionen 46, 47 und 48 wurden auf vergleichbare Weise bewirkt, mit der Ausnahme, daß anstelle von degenerierten Oligonucleotiden Oligonucleotide mit einem spezifizierten Codierungspotential verwendet wurden.

BEISPIEL II Die Selektion von CD2-Mutanten

Sphäroplasten wurden aus Bakterien gewonnen, die den mutagenisierten Vektor piH3MCD2 enthielten, und mit COS-Zellen verschmolzen, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 330191 des Anmelders beschrieben wurde. Achtundvierzig Stunden nach der Verschmelzung wurden die CD2-exprimierenden COS-Zellen in PBS/1mM EDTA von der Schale gelöst. Die CCS-Zellen von sechs 60-mm-Schalen wurden dann in PBS, 10% Kälberserum, 0,02% Natriumazid (PBS-FBS) mit einer 1/1000 Verdünnung von Ascitesflüssigkeit des negativen Selektionsantikörpers inkubiert. Alle Antikörperinkubationen erfolgten in 1 ml PBS-FBS für 30 min auf Eis. Anschließend wurde durch ein Kissen von 2% Ficoll in PBS zentrifugiert. Die Zellen wurden dann mit 5ug/ml Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Antikörper (Rockland) inkubiert. Zwei ml 50%iges Kaninchenkomplement (Pel- Freeze) in DME (GIBCO) wurden dann zugegeben und 30 min bei 37ºC unter Rühren inkubiert, um ein Verklumpen zu verhindern. Das Komplement wurde durch Verdünnung auf 10 ml mit PBS/5mM EDTA und Zentrifugieren durch ein 5 ml Ficoll-Kissen entfernt. Die Zellen wurden dann mit einer 1/1000-Verdünnung des positiven Selektionsantikörpers inkubiert und in mit Schaf-Anti-Maus- Immunglobulin (Cooper Biomedical) beschichtete Schalen gegeben (Wysocki, L.J. und Sato, V.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2844- 2848 (1978)), die wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 330191 des Anmelders beschrieben hergestellt wurden. Nach einer Wartezeit von einer Stunde, damit die Zellen sich anheften können, wurden die nicht anhaftenden Zellen vorsichtig abgewaschen, und die DNA wurde aus einem Hirt-Überstand der anhaftenden Zellen präpariert. Die zurückgewonnene DNA wurde in E. coli Mc1061/p3 transformiert und die resultierenden Kolonien wurden entweder für weitere Selektionsrunden eingesetzt oder direkt analysiert. Für die direkte Analyse wurde die aus den einzelnen Kolonien gewonnene Plasmid-DNA verwendet, um COS-Zellen mit einem DEAE-Dextran-Verfahren zu transfizieren, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 330191 des Anmelders beschrieben wurde. Die mutierten Phänotypen wurden mit aufeinanderfolgenden indirekten Immunofluoreszenztests untersucht, wobei zunächst der negative Selektionsantikörper und dann der positive Selektionsantikörper verwendet wurde.
Wenn die gesamte extrazelluläre Domäne von CD2 mutagenisiert werden sollte, wurden Bakterien aus allen 20 Pools zusammengegeben, um eine zufällig substituierte Zubereitung zu erhalten. Für die gerichtete Mutation wurden nur die Bakterien aus einem oder zwei Pools eingesetzt.
Eine Auswahl von monoklonalen Antikörpern wurde über den Third International Workshop on Leukocyte Typing erhalten.

BEISPIEL III DNA-Sequenzanalyse und Rosettenbildung bei CD2-Mutanten

Die DNA-Sequenz von Mutanten wurde anhand von einzelsträngigen Templates oder alkalisch denaturierter Plasmid-DNA nach der Didesoxynucleotid-Methode bestimmt (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)). Bei Mutanten, die unter Verwendung von zufällig mutiertem piH3MCD2 erhalten wurden, wurde die gesamte extrazelluläre Domäne von CD2 sequenziert. Bei Mutanten, die durch gerichtete Mutagenese erhalten wurden, wurde ein cDNA- Abschnitt von 200 Basenpaaren, der die mutierte Region enthielt, sequenziert. In allen Fällen erfolgten die Mutationen wie erwartet im Bereich eines einzigen Oligonucleotids.
Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion läßt man eine 2%ige Suspension von Peterson-Erythrozyten auf anhaftenden COS- Zellen 30 min bei Umgebungstemperatur absetzen. Überschüssige Erythrozyten wurden vorsichtig entfernt und der Phänotyp wurde mittels mikroskopischer Untersuchung ausgewertet. Mit allen rosettenbildenden Erythrozyten wurden mindestens drei separate Tests mit dem Wildtyp und mit negativen Kontrollen durchgeführt. In einigen Fällen wurde die Expression von Oberflächen-CD2 nach der Exposition gegenüber Erythrozyten durch indirekte Immunofluoreszenztests bestätigt.
Wildtyp-Rosetten sind durch enge Bindung der Erythrozyten an die COS-Zellen gekennzeichnet. Bei der partiellen Rosettenbildung werden weniger Erytrozyten weniger stark gebunden als bei den Rosetten des Wildtyps. Fehlende Rosettenbildung bedeutet, daß die Mutante von einer negativen Kontrolle nicht unterschieden werden kann (d.h. CS8-exprimierende COS-Zellen). Tabelle 2 faßt die verschiedenen mutationsbedingten Substitutionen zusammen, bei denen Rosettenbildung entsteht. Mit Kommata getrennte Aminosäurensubstitutionen sind auf demselben Molekül vorhanden. TABELLE 2 Wildtyp-Rosette Partielle Rosettenbildung Keine Rosettenbildung

BEISPIEL IV Selektion von CD4-Mutanten

Das hier beschriebene allgemeine Verfahren, mit dem die Oberflächenantigen-Epitop-Deletionsmutanten isoliert werden, wurde für den Einsatz mit dem CD4-Antigen dahingehend verändert, daß Sphäroplasten aus Bakterien gewonnen wurden, die das mutagenisierte Plasmid piH3MCD4 enthielten. Das CD4-Antigen ist von besonderem Interesse, da es als T-Zell-Bindungsstelle für HIV dient.
Die Isolierung der Epitop-Deletionsmutanten wurde wie folgt durchgeführt: Eine aus der HPB-ALL-Zellinie isolierte CD4-cDNA wurde durch Anelierung degenerierter Oligonucleotide, die wie in Beispiel I beschrieben hergestellt wurden, an eine Desoxyuridinsubstituierte einzelsträngige Template mutagenisiert. Die mutagenisierte Plasmid-Population wurde mittels Sphäroplastenverschmelzung in COS-Zellen eingeführt. Zwei Tage nach der Verschmelzung wurden die Zellen geerntet und nacheinander mit monoklonalen Antikörpern gegen CD4, Kaninchen-Anti-Maus-Ig- Antisera und Kaninchenkomplement inkubiert. Dies führte zur Selektion gegen die Zellen, die von dem monoklonalen Antikörper erkannte Determinanten tragen. Zur Vermeidung der Isolierung von Neukombinationen, die die CD4-Expression völlig ausschließen, wurden die nach der Komplementlyse verbleibenden Zellen mit gepoolten monoklonalen Antikörpern gegen CD4 inkubiert, und man gab die Zellen in Petrischalen, die mit Ziegen-Anti-Maus-Ig beschichtet sind. Aus den an den antikörperbeschichteten Schalen anhaftetenden Zellen zurückgewonnene Plasmid-DNA wurde zur Transformation von E. coli verwendet, amplifiziert, und erneut in COS-Zellen eingeführt. Nach drei Selektionsrunden in COS-Zellen wurden Plasmidzubereitungen aus einzelnen Bakterienkolonien in COS-Zellen transfiziert und zwei Tage später mittels indirekter Immunofluoreszenztests untersucht. Plasmide, die für CD4-Moleküle codieren, die nicht mit den für die Komplementfixierung eingesetzten Antikörpern in Wechselwirkung traten, andere CD4-Determinanten jedoch beibehielten, wurden dann sequenziert. Figur 4 zeigt die Positionen in der Aminosäure-Primärsequenz, in denen Substitution zum Verlust der Bindung der angegebenen Antikörper führt. Tabelle 3 zeigt die jeweils substituierten Aminosäuren an. In Tabelle 3 sowie in der gesamten Beschreibung werden die Aminosäure-Varianten durch Angabe von Wildtyp-Rest, Position und neuem Rest bezeichnet, z.B. wird eine Variante, bei der das normalerweise in der Position 18 befindliche Serin durch Tyrosin ersetzt wurde, als Ser18Tyr bezeichnet.
Die meisten Mutationen, die isoliert wurden, waren Nucleotidsubstitutionen. Eine Insertion und eine Deletion wurden ebenfalls isoliert. Diese beiden Neukombinationen stehen anscheinend in keinem Zusammenhang mit der Oligonucleotid-Mutagenese, sondern resultieren aus der Passage durch COS-Zellen. Es ist bekannt, daß die Transfektion von COS-Zellen zu einer Mutationrate von etwa 1% führt. Die Mehrzahl der Läsionen sind Insertionen und Deletionen.

Epitop-Lokalisationen

Die meisten Mutanten, einschließlich einiger, die unter Verwendung von Antikörpern selektiert wurden, die die Wechselwirkungen zwischen gp120 und CD4 wirkungsvoll blockieren können, codieren für Aminosäurensubstitutionen in der aminoterminalen, den V-Domänen von Immunglobulin entsprechenden Domäne von CD4. Diese Domäne enthält mehrere der Hauptmerkmale einer Ig-Domäne sowie zwei Cysteine, ein Arginin und eine Glutaminsäure, die in einem Immunglobulin eine Disulfidbindung bzw. eine Salzbrücke sowie einen konservierten Tryptophanrest bilden, so daß es äußerst wahrscheinlich ist, daß der Aminoterminus von CD4 auf dieselbe Weise gefaltet ist wie eine V-Domäne eines Immunglobulins. Ausgehend von der Hypothese, daß diese Domäne von CD4 auf eine ähnliche Weise wie eine Ig V-Domäne gefaltet ist, kann ein Modell für die Lokalisationen der Aminosäurensubstitutionen in einer gefalteten Struktur entwickelt werden. Anhand des Modells kann man Vorhersagen zu den Wechselwirkungen von gp120 mit dieser Domäne von CD4 anstellen. Figur 4 zeigt ein Stereobild der Faltung eben dieser Ig V-Domäne, sowie die Lokalisation einiger wichtiger Reste.
Der Antikörper 66.1 selektiert Mutationen, die eine Aminosäurenvariation des Aminoterminus von CD4 bewirken (Figur 4 und Tabelle 3). Die Substitutionen sind durch bis zu 23 Reste getrennt, was annehmen läßt, daß 66.1 ein Epitop erkennt, das von dem dreidimensionalen Faltungsmuster des Proteins und nicht von der Aminosäure-Primärsequenz gebildet wird. Die Mutationen entfallen auf zwei Regionen, die der ersten und der zweiten hypervariablen Region eines Ig V-Segments entsprechen würden. Diese beiden Regionen sind bei einem gefalteten Immunglobulin in der Nähe von einander, während sie in der Primärsequenz recht weit von einander entfernt sind (Figuren 2 und 3). Diese Erkenntnis spricht sehr für die Vorstellung, daß die aminoterminale Domäne von CD4 auf eine ähnliche Weise gefaltet ist wie V-Domänen von Immunglobulinen.
Die Fähigkeit von Anti-CD4-Antikörpern, die Bindung anderer Anti-CD4-Antikörper zu blockieren, spricht ebenfalls für das in Figur 3 dargestellte Faltungsmuster. So codieren beispielsweise die mit den Antikörpern VIT4 und 13.B.8.2 selektierten Mutanten für Aminosäurensubstitutionen, die etwa 70 Reste von denjenigen Substitutionen entfernt sind, für die mit G19-2 selektierte Mutanten codieren (Figur 1 und Tabelle 1). Sowohl 13B.8.2 als auch VIT4 können die Bindung von G19-2 wesentlich blockieren; dies wäre aufgrund des Ig-Faltungsmuster zu erwarten.
Die Antikörper 66.1 und G19-2 sind selbst bei einem Vielfachen der Sättigungskonzentration nicht in der Lage, die Wechselwirkungen zwischen CD4 und gp120 zu blockieren. Dies bedeutet, daß gp120 so mit CD4 in Wechselwirkung tritt, daß die Oberfläche des Moleküls, die von den B- und C-Ketten-Homologen von CD4 gebildet würde, nicht betroffen ist (Figur 3). Die Bindung von entweder Leu3a oder OKT4A kann die Bindung des anderen Antikörpers völlig blockieren. Die Bindung eines dieser Antikörper kann die Bindung der Antikörper 66.1 und G19-2 in keinem Fall wirkungsvoll eliminieren. Die unter Verwendung von OKT4A selektierte Mutante codiert für eine Substitution eines Restes in der D-Kette einer Ig-Faltung; die mit Leu3a selektierten Mutanten codieren für Varianten der C'- und C"-Ketten. Die Konfiguration der B-, C-, C'-, C"- und D-Ketten in einer Ig-Faltung läßt annehmen, daß Leu3a und T4A mit derjenigen Oberfläche der Domäne in Wechselwirkung treten, die von den D-, E- und C"-Ketten-Homologen von CD4 gebildet werden. Sowohl T4A als auch Leu3a blockieren die Wechselwirkungen zwischen CD4 und gp 120 bei sehr geringen Antikörperkonzentrationen. Wenn OKT4A und Leu3a den Zugang von gp120 zu einer Bindungsstelle auf der aminoterminalen Domäne von CD4 blockieren, muß diese Bindungsstelle auf den zu den D-, E- und C"-Ketten homologen Regionen von CD4 sein.
Die Bindung des Antikörpers VIT4 an CD4 beeinträchtigt nicht die Bindung von Leu3a oder T4A. Dies ist nicht überraschend, wenn man die Lokalisation des VIT4-Epitops bedenkt (Figur 4), doch VIT4 ist ebenso wirkungsvoll wie Leu3a und T4A, wenn es um die Blockierung der CD4-gp120-abhängigen Syncytienbildung geht. VIT4 könnte den Zugang von gp120 zu einer Bindungsstelle auf den D-, E-, C"- Ketten indirekt blockieren, oder eine räumlich getrennte Bindungsstelle beeinflussen, indem entweder der Zugang indirekt blockiert oder die Bindungsstelle besetzt wird. Die Tatsache, daß G19-2 mit VIT4 bezüglich der Bindung an CD4 konkurriert, die Wechselwirkungen zwischen CD4 und gp120 aber nicht blockiert, weist darauf hin, daß die Fähigkeit von VIT4, gp120 zu blockieren, indirekt ist. Phylogenetische Konservierung der HIV-Empfindlichkeit ohne Konservierung des VIT4-Epitops spricht dafür, daß dieses Epitop nicht direkt an der HIV-Bindung beteiligt ist.
Der Antikörper MT151 blockiert die Wechselwirkungen mit CD4 auf ähnliche Weise wie VIT4; er blockiert die Wechselwirkung von gp120, nicht jedoch die Bindung von OKT4A oder Leu3a. Die auf MT151-Epitop-Deletionsmutanten codierten Substitutionen werden 5 Reste und 77 Reste carboxyterminal zu der mit der VIT4-Epitop-Deletion assoziierten Substitution gefunden. Der Antikörper MT151 erkennt klar ein durch die Konformation des gefalteten Proteins gebildetes Epitop. Dieses Epitop überschneidet sich mit der VIT4- und der 13B.8.2-Epitopregion, umfaßt aber auch den carboxyterminalen Teil der zweiten Domäne. Das MT151-Epitop plaziert den Carboxyterminus der zweiten Disulfid-gebundenen Domäne von CD4 in nächste Nähe zu dem Carboxyterminus der aminoterminalen Ig-artigen Domäne und stärkt die Möglichkeit, daß VIT4 und MT151 die Wechselwirkung zwischen CD4 und gp120 blockieren, indem sie den Zugang zu einer Stelle auf der zweiten Domäne, und nicht auf der ersten Domäne, blockieren.

Auswirkungen der Mutationen auf die Syncytienbildung

Anhand der Mutanten können einige der aufgrund der Epitoplokalisationen angestellten Vorhersagen überprüft werden. Eine Manifestation der Wechselwirkungen zwischen CD4 und gp120 ist die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen. Diese Syncytien sind zumindest teilweise für die zytopathischen Auswirkungen von Virusinfektionen verantwortlich. Syncytien können von Zellen gebildet werden, die nur das HIV-spezifische Genprodukt gp160 der Hülle exprimieren, das mit CD4-exprimierenden Zellen reagiert. Es gelang uns nicht, die Syncytienbildung in transfizierten COS-Zellen zu induzieren, doch HeLa-Zellen erwiesen sich als äußerst wirksam bei der Zell- Zell-Verschmelzung. Die Mutanten wurden jeweils auf ihre Fähigkeit geprüft, bei der Syncytienbildung durch Transfektion von HeLa-Zellen, gefolgt von der Infektion mit einer Vaccinia-Virus-Rekombinante, die HIV gp160 exprimiert, zusammenzuarbeiten. HeLa-Zell- Linien, die einige der CD4-Mutanten stabil exprimieren, wurden unter Einsatz eines retroviralen Vektors hergestellt, der für G-418- Resistenz codiert. Die G-418-resistenten Zellen wurden als einzelne Klone oder gepoolt expandiert und auf Syncytienbildung untersucht, nachdem sie mit einem gp160 exprimierenden Vaccinia-Virus infiziert worden waren. Dieselben Ergebnisse wurden bei der Prüfung auf eine transiente Expression erhalten, wobei Klone oder gepoolte G-418-Zellinien stabil exprimiert wurden.
Die meisten der Aminosäurevarianten waren, was die Syncytienbildung betrifft, ebenso wirkungsvoll wie CD4 des Wildtyps. Im Gegensatz dazu hatten die Substitutionen der Aminosäuren 39, 44, 45 und 46 ebenso wie die Insertionsmutation, die durch Selektion mit MT151 erhalten wurde, erhebliche Auswirkungen auf die Fähigkeit von CD4, Syncytien zu induzieren. Einige der Substitutionen schienen eine lokale Denaturierung des Proteins bewirken zu können. So hatte beispielsweise die mit dem Antikörper T4/18T3A9 selektierte Variante in der Position 39 ein Prolin anstelle des normalerweise dort vorhandenen Glutamins. Prolin hat ein wesentlich eingeschränkteres Rückgrat als Glutamin, und man könnte erwarten, daß es die lokale Faltungsstruktur ändert. Auf ähnliche Weise ersetzen die mit OKT4D selektierten Varianten Gly46Arg und Gly46Glu Glycin mit sperrigen, geladenen Resten und könnten das C"-Ketten- Homolog von CD4 denaturieren.
Obwohl die Substitutionen, die sich auf die Syncytienbildung auswirken, die Proteinfaltung unterbrechen können, weisen mehrere Beobachtungen darauf hin, daß die Auswirkungen auf die Syncytienbildung auf Veränderungen der Proteinstruktur innerhalb eines kurzes Bereichs zurückzuführen sind. Substitutionen ähnlich zu denen, die an anderen Positionen die CD4-vermittelte Syncytienbildung eliminieren, haben nicht dieselbe Wirkung; die Fähigkeit der Variante Gln39Pro, Syncytien zu induzieren, ist nur geringfügig verringert, die Varianten Gly37Glu und Gln164Pro beteiligen sich ebenso wirksam wie der CD4-Wildtyp an der Syncytienbildung. Die mit Leu3a selektierte Doppelsubstitutions-Variante Lys45Asn, Gly46Val bewirkt keine offensichtlichen Unterbrechungen der Proteinfaltung, eliminiert aber die Syncytienbildung.
Die Auswirkungen der mit MT151 isolierten Insertionsmutation auf die Struktur von CD4 ist schwer zu beurteilen. Sie führt zu einer großen, 13 Aminosäuren umfassenden Insertion nahe dem Ende der zweiten Domäne. Die mit MT151 selektierten Punktmutationen zeigen, daß CD4 so gefaltet ist, daß dieser Abschnitt der zweiten Domäne sehr nahe bei dem Carboxyterminus der ersten Domäne liegt. Möglicherweise hat die Insertion sehr indirekte Auswirkungen auf die CD4-Faltung und ändert die erste Domäne.
Mutationen, die die Syncytienbildung unterbrechen, könnten zu mindestens zwei Klassen gehören. Es erscheint gesichert, daß Mutationen, die die Fähigkeit von CD4, an gp120 zu binden, eliminierten, auch die Fähigkeit beseitigen würden, die Syncytienbildung zu induzieren. Eine andere Klasse von Mutationen ist ebenfalls möglich; Mutationen, die die Syncytienbildung ausschalten, nicht aber die Bindung.

Auswirkungen von Mutationen auf die HIV-Bindung

Die Auswirkungen der Mutationen auf die Fähigkeit von CD4, an HIV zu binden, wurde mit einem indirekten Immunofluoreszenzassay untersucht. Konzentrierte Viruspartikel wurden mit COS-Zellen inkubiert, die die verschiedenen Mutanten exprimieren, und gebundene Partikel wurden unter Verwendung von Humansera mit einem hohen Anti-gp120-Titer nachgewiesen. Die Bindung wurde durch Analyse von Zellen auf einem Cytofluorometer quantifiziert. In jedem Fall wurde die Expression von CD4 auf der Zelloberfläche unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen CD4 und mit einem indirekten Immunofluoreszenzassay parallel quantifiziert. Die Fähigkeit der veränderten CD4-Moleküle, an das Virus zu binden, entsprach ihrer relativen Fähigkeit, Syncytien zu induzieren. Die Mutationen, die die Syncytienbildung ausschalteten, eliminierten ebenfalls die Bindung von Viruspartikeln. Mutationen, die die Fähigkeit von CD4, die Zellverschmelzung zu unterstützen, deutlich reduzierten, reduzierten entsprechend die Fähigkeit von CD4, an gp120 zu binden. Dies zeigt, daß die Mutationen sich primär auf die Fähigkeit von CD4 auswirken, an gp120 zu binden, und nicht auf ihre Fähigkeit, Syncytien zu induzieren.

Diskussion

Die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen auf die Fähigkeit von CD4, an gp120 zu binden, entsprechen weitgehend den Vorhersagen, die aufgrund der Epitoplokalisationen angestellt wurden. Mutationen, die wahrscheinlich die C'-Kette unterbrechen, weisen ein verändertes Verhalten in Bindungs- und Syncytienbildungs-Tests auf. Mutationen, die die C"-Kette verändern, eliminieren die Fähigkeit von CD4, Viren zu binden. Man hätte erwarten können, daß sich die unter Verwendung des Antikörpers OKT4A selektierte Mutante in dem Versuch zur Syncytienbildung anders als der CD4-Wildtyp verhalten würde. Diese Mutante codiert für eine Aminosäurensubstitution in der D-Ketten-homologen Region der CD4-cDNA. Die auf der Mutanten codierte Substitution ändert ein Sequenzmuster, das in der Mäuse-, Ratten- und humanen CD4 konserviert ist (Mäuse- SKKG, Ratten-SRKN, Human-SRRS, OKT4A&supmin;-SRRR). Es scheint wahrscheinlich, daß diese Aminosäurensubstitution die vorhergesagte D- Kette von CD4 ändern würde, sie ändert jedoch nicht die HIV-Bindung. Darüber hinaus ist das OKT4A-Epitop in den Primatenspezies, die von HIV infiziert werden können, schlecht konserviert, was auch darauf hinweist, daß die Blockierung der HIV-Bindung durch OKT4A indirekt ist und wahrscheinlich über die Blockierung des Zugangs zur Leu3a-Epitopregion erfolgt.
Das VIT4-Epitop ist ebenfalls nicht so gut konserviert wie die HIV-Infizierbarkeit von Primatenspezies, und die unter Verwendung dieses Antikörpers selektierte Mutante beeinträchtigt die HIV-Bindung nicht. VIT4 blockiert wahrscheinlich ebenfalls die HIV-Bindung, indem er gp120 indirekt daran hindert, mit anderen Sequenzen als der Antikörper-Erkennungsstelle in Wechselwirkung zu treten. Die unter Verwendung dieses Antikörpers selektierten Mutationen entfallen auf den Bereich, der bei einer Ig V-Domäne der vierten hypervariablen Region entsprechen würde. Möglicherweise blockiert VIT4 den Zugang zu dem Abschnitt der HIV-Bindungsstelle, den wir als das Leu3a-Epitop identifiziert haben. Eine solche Erklärung ist aus der vorgeschlagenen Beziehung zwischen den beiden Epitopregionen und aus der Tatsache, daß VIT4 die Bindung von Leu3a und OKT4A nicht beeinflußt, nicht offensichtlich. Das M151- Epitop, das das VIT4-Epitop in der ersten Domäne überlappt, erreicht auch den Carboxyterminus der zweiten Domäne. Dieses Epitop verbindet die VIT4-Epitopregion enger mit der zweiten Domäne als mit der D, E, C"-Oberfläche der ersten Domäne. Die Fähigkeit von VIT4 und MT151, die Wechselwirkungen zwischen gp120 und CD4 zu blockieren, eröffnet daher die Möglichkeit einer HIV-Bindungsstelle in der zweiten Domäne.
Antiidiotypische Antisera, die den Antikörper Leu3a erkennen, können ebenfalls diverse HIV-Isolate neutralisieren. Daraus leitete sich die Vermutung ab, daß dieser Antikörper eine wichtige Determinante der HIV-Bindungsstelle erkennen muß. Die Entsprechung zwischen der Expression des Leu3a-Epitops und der Empfindlichkeit gegenüber HIV bei Primatenspezies unterstreicht die Bedeutung des Leu3a-Epitops für die HIV-Bindung. Direkte Belege für die Übereinstimmung zwischen der Leu3a-Erkennungsstelle und einer Stelle, die für die Bindung von HIV wichtig ist, werden aufgeführt. Bei Varianten von CD4, deren Erkennung durch Leu3a verändert ist, ist auch die Fähigkeit zur Bindung von HIV verändert. Das Leu3a-Epitop ist auf dem CD4-Segment lokalisiert, das den C'- und C"-Ketten einer Ig V-Domäne entsprechen würde. Es kann möglich sein, Reagentien zu entwickeln, die die Struktur dieses Abschnitts des CD4-Moleküls imitieren. Kurze Peptide, die die C"-Kette und deren Flanking-Regionen umfassen, könnten mit genügend Avidität an gp120 binden, um Wechselwirkungen von gp120 mit CD4 zu verhindern. Der Austausch der C'- und C"-Ketten einer authentischen Ig V-Region gegen die CD4-Cognate könnte ebenfalls zu einer Struktur führen, die sich auf die HIV-Replikation und/oder -Pathologie auswirken könnte. Solche Reagentien wären wichtige therapeutische Mittel zur Behandlung von AIDS.
Die Aminosäuren-Primärsequenz des humanen CD4-Proteins ist in Figur 4 dargestellt. Die darunter aufgeführte Sequenz zeigt die Sequenz der Maus, dort wo sie sich von der humanen Sequenz unterscheidet. Die Unterstreichung zeigt den Umfang der Transmembrandomäne von CD4 an. Der Strich über der Sequenz entspricht der vorgeschlagenen HIV-Bindungsstelle des CD4-Proteins. Die 16 unterschiedlichen Antikörper, die für den Schritt der positiven Selektion eingesetzt wurden, sind am linken Rand angegeben. Das Symbol * über der Primärsequenz zeigt an, daß eine mit einem bestimmten Antikörper isolierte Mutante in dieser Position eine Substitution hat. Substitutionen in den Aminosäurepositionen 39 und 46 wirken sich auf die HIV-Bindung aus. Diese Positionen sind ebenfalls in Figur 4 angegeben. Tabelle 3 gibt eine Zusammenfassung der für den negativen Selektionsschritt eingesetzten Antikörper und der Sammlung von CD4-Mutanten, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren isoliert wurden. TABELLE 3 Für die negative Selektion eingesetzte Antikörper Aminosäurensubstitution (Angegeben als normaler Rest/Position/neuer Rest) SeLektion eingesetzte < Angegeben aLs * Die Aminosäuren werden in dieser Spalte mit den Einbuchstaben-Codes bezeichnet.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Genmutanten, das folgende Schritte umfaßt:

a) Transfektion von Säugerzellen mit einem Vektor, in den ein in diesem Fall interessierendes Strukturgen ligiert ist;

b) Behandlung transfizierter Säugerzellen mit einem ersten, gegen ein Epitop des von dem Strukturgen codierten Proteins gerichteten, monoklonalen Antikörper und mit Komplement, unter geeigneten Bedingungen, so daß die Zellen, die das Epitop exprimieren, an den ersten monoklonalen Antikörper binden und eine Komplementfixierung und Lyse der das Epitop exprimierenden Zellen eintritt;

c) Behandlung der verbleibenden, nicht lysierten Säugerzellen mit einem zweiten monoklonalen Antikörper, der gegen ein zweites Epitop des Strukturgens gerichtet ist;

d) Veranlassung der behandelten Säugerzellen, sich an ein mit Antisera, die den zweiten monoklonalen Antikörper erkennen, beschichtetes Substrat anzuheften; und

e) Rückgewinnung der Plasmid-DNA aus den anhaftenden Zeilen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Säugerzelle eine COS-Zelle ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in diesem Fall interessierende Strukturgen ein Oberflächenantigen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oberflächenantigen das CD2-Antigen von T-Lymphozyten oder das CD4-Antigen von T-Lymphozyten ist.

5. Einsatz des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Identifizierung von Epitopen von Oberflächenproteinen, zusätzlich folgende Schritte umfassend:

f) Amplifikation zurückgewonnener Plasmid-DNA in einer geeigneten Wirtszelle;

g) Transfektion von Saugerzellen mit einem Vektor gemäß Schritt (a), wobei das Strukturgen die amplifizierte zurückgewonnene Plasmid-DNA ist;

h) Gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) - (g);

i) Transfektion von Säugerzellen mit der aus dem Verfahren der Schritte (a)-(h) hervorgehenden Plasmid-DNA; und Aufbewahrung der transfizierten Zellen unter geeigneten Bedingungen, so daß die Expression der Plasmid-DNA stattfindet; und

j) Nachweis der Bindung des Expressionsproduktes der Plasmid-DNA an den ersten monoklonalen Antikörper.

6. Einsatz des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Identifizierung von Epitopen von Oberflächenproteinen, wobei die transfizierten Säugerzellen COS-Affenzellen sind und der Vektor piH3MCD2 ist, in den ein Gen ligiert ist, das mindestens für einen Teil des Oberflächenproteins codiert, folgende Schritte umfassend:

a) Kultivierung transfizierter COS-Zellen für etwa 48 Stunden;

b) Ernte transfizierter Zellen und Behandlung dieser Zellen nacheinander mit einem negativen Selektionsantikörper, mit Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper und mit Komplement unter geeigneten Bedingungen, so daß die das Oberflächenprotein exprimierenden Zellen an den negativen Selektionsantikörper binden und die Komplementfixierung und die Lyse der genannten Zellen stattfinden;

c) Ernte der nicht lysierten Zellen und Behandlung der nicht lysierten Zellen mit einem positiven Selektionsantikörper;

d) Veranlassung der nicht lysierten Zellen, sich an ein mit Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin beschichtetes Substrat anzuheften;

e) Entfernung nicht anhaftender Zellen;

f) Herstellung und Rückgewinnung eines DNA-Extrakts der anhaftenden Zellen;

g) Transformation des zurückgewonnenen DNA-Extrakts in E.coli MC 1001/p3; und

h) Durchführung weiterer Selektionsdurchgänge nach den Schritten (a)-(h) mit den resultierenden Bakterienkolonien oder direkte Analyse ihrer Fähigkeit, an den negativen Selektionsantikörper zu binden.

7. Einsatz nach Anspruch 6, wobei das Oberflächenprotein ein Oberflächenantigen von T-Lymphozyten und B-Zellen ist.

8. Einsatz eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 zur Isolierung epitopischer Varianten von Oberflächenantigenen.

9. Einsatz eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung der Bindungsstellen des menschlichen T-Zellen-Rezeptors (CD2-Antigen), der HIV-Bindungsstelle auf dem CD4- Antigen und der CD4-Epitopdeletionsmutanten.

10. Einsatz eines Verfahrens nach Anspruch 1 zur Identifizierung des Leu3a-Epitops des CD4-Antigens.

11. Einsatz nach Anspruch 10, wobei das Leu3a-Epitop eine Aminosäuresequenz aufweist, die essentiell homolog ist mit der Aminosäuresequenz KILG..NQGSFLTKQPSKLND.