DE3588254T2

DE3588254T2 - GAG-Antigen und dessen Verwendung zum Nachweis von LAV-Infektion, sowie in immunogenen Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3588254T2
Application number: DE3588254T
Authority: DE
Inventors: Luc Montagnier; Bernard Krust; Solange Chamaret; Francois Clavel; Jean-Claude Chermann; Francoise Barre-Sinoussi; Marc Alizon; Pierre Sonigo; Cole Stewart; Olivier Danos; Simon Wain-Hobson
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1984-10-18
Filing date: 1985-10-18
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2005-10-19
Also published as: EP0387915A1; JPH09132594A; DE3587181D1; NZ230372A; DE3587181T2; EP0201540B2; DE3588251D1; ES557357A0; JPH09118689A; ES8801319A1; JP2761376B2; JPH07309779A; EP0387914B1; EP0201540A1; EP0387915B1; DE3583293D1; DE3588251T2; DK174910B1; HK1050215A1; ATE92502T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antigene des Lymphadenopathie-Virus (nachstehend abkürzend als LAS bezeichnet) und des das erworbene Immunschwäche-Syndrom (nachstehend abkürzend als AIDS bezeichnet) verursachenden Virus, insbesondere in gereinigter Form und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antigene, insbesondere rekombinantes oder synthetisches GAG-Antigen dieser Viren, das aus der in 4a und 4b dargestellten Aminosäuresequenz besteht, die mit dem Rest Met an Position 336 beginnt und mit Rest Gln oder an Position 1836 endet, oder Polypeptidfragmente davon. Die Erfindung betrifft auch glycosylierte und nicht-glycosylierte Polypeptide, die durch diese DNA-Sequenzen codiert sind.
Der Erreger von LAS oder AIDS, ein Retrovirus, ist von BARRE-SINOUSSI, F. et al., Science 220 (1983), 868, identifiziert worden. Es weist die nachstehend beschriebenen Eigenschaften auf. Es ist T-lymphotrop, und es befällt bevorzugt Leu 3-Zellen (oder T4-Lymphocyten). Es weist eine reverse Transkriptase-Aktivität, für die die Gegenwart von Mg+ erforderlich ist, und eine starke Affinität für Poly(Adenylat-oligodesoxy-Thymidylat)(poly(A)-oligo(dT)12–18) auf. Es weist eine Dichte von 1,16 bis 1,17 in einem Saccharose-Gradienten, einen durchschnittlichen Durchmesser von 139 Nanometer und einen Kern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 41 Nanometern auf. Antigene des Virus, besonders ein p25-Protein, werden immunologisch von Antikörpern erkannt, die in Seren enthalten sind, die von an LAS oder AIDS leidenden Patienten stammen. Das p25-Protein, das ein Kern-Protein ist, wird vom p24-Protein der HTLVI- und -II-Viren immunologisch nicht erkannt. Ferner fehlt dem Virus ein p19-Protein, das mit den HTLVI- und HTLVII-p19-Proteinen eine immunologische Kreuzreaktion zeigt.
Retroviren diesen Typs (gelegentlich wird abkürzend die übergeordnete Bezeichnung LAV verwendet) sind bei der National Collection of Micro-organism Cultures des INSTITUT PASTEUR in Paris unter den Nummern I-232, I- 240 und I-241 hinterlegt worden. Virusstämme, die unter dem morphologischen und immunologischen Gesichtspunkt dem LAV in jeder Hinsicht gleichen, sind in anderen Laboratorien isoliert worden. Es wird auf die Retrovirusstämme, die als HTLV-III bezeichnet werden und von GALLO, R. C. et al., Science 224 (1984), 500, bzw. SARNGADHARAN, M. G. et al., Science 224 (1984), 506, isoliert wurden, und auf das als ARV bezeichnete Retrovirus, das von M. Jay LEVY et al., Science 225 (1984), 840–842, isoliert wurde, beispielhaft Bezug genommen. Zur sprachlichen Vereinfachung erhalten die zuletzt erwähnten Viren neben anderen mit entsprechenden morphologischen und immunologischen Eigenschaften hier nach-stehend die übergeordnete Bezeichnung "LAV". Es wird hinsichtlich der genaueren Beschreibung der LAV- oder ähnlicher Retroviren und der Verwendungen der Extrakte dieser Viren auf die am 14. September 1984 eingereichte europäische Patentanmeldung hingewiesen, die die Priorität der am 15. September 1983 eingereichten britischen Patentanmeldung mit der Nummer 83 24800 in Anspruch nimmt.
Anfänglich waren die Kern-Antigene in den damals verwendeten Testsystemen die Haupt-Antigene der Virus-Lysate oder Extrakte, die durch Seren von mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erkannt wurden. Ein p42-Protein, das als aus einem Hüll-Protein bestehend dargestellt wurde, ist ebenfalls nachgewiesen worden. In derselben Weise beschrieben GALLO et al. ein p41-Protein, von dem auch angenommen wurde, eventuell ein Bestandteil der Virus-Hülle zu sein.
Es sind auch Verfahren zum Erhalt eines LAV-Virus beschrieben worden. Es kann im Hinblick auf die Herstellung des Virus in T-Lymphocyten-Kulturen, die entweder von Blut, der Nabelschnur oder auch den Knochenmarkszellen von erwachsenen Spendern in gutem Gesundheitszustand abstammen, besonders auf den schon erwähnten Artikel von F. BARRE-SINOUSSI et al. Bezug genommen werden. Dieses Verfahren umfasst besonders die nachstehend beschriebenen wesentlichen Schritte:

– Herstellung einer viralen Infektion dieser T-Lymphocyten nach der Aktivierung durch ein Lectin-Mitogen mit einer Virus-Suspension, die von einer unbehandelten Überstandsflüssigkeit von Lymphocyten stammt, die das Virus produzieren (ursprünglich von einem mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erhalten)
– Züchtung von mit TCGF infizierten Zellen in Gegenwart von anti-a- Interferon-Schafserum,
– Durchführung einer Reinigung des erzeugten Virus (die Produktion beginnt üblicherweise zwischen dem 9. und dem 15. Tag nach der Infektion und dauert zwischen 10 und 15 Tage), wobei die Reinigung zum Erhalt einer ersten Konzentrierung des Virus die Ausfällung des Virus in Polyethylenglycol umfasst, im Anschluss daran eine Zentrifugation des erhaltenen Präparats in einem 20–60% Sucrose-Gradienten oder einem isotonischen Metrizanid-Gradienten (unter dem Warenzeichen NYCODENZ von NYEGAARD, Oslo, im Handel erhältlich) und die Gewinnung des Virus mit der Bande, die eine Dichte von 1,16 bis 1,17 im Sucrose-Gradienten oder von 1,10 bis 1,11 im NYCODENZ^®-Gradienten aufweist.

Das LAV-Virus kann auch von permanenten Zelllinien des Typs T, zum Beispiel der CEM-Zelllinie, oder von B-Lymphoblastoid-Zelllinien produziert werden, die zum Beispiel durch Transformation der von einem gesunden Spender stammenden Lymphocyten mit dem Epstein-Barr-Virus erhalten werden, wie dies beispielsweise in der am 9. Mai 1984 eingereichten französischen Patentanmeldung Nr. 84 07151 offengelegt ist. Die erhaltenen permanenten Zelllinien produzieren kontinuierlich ein Virus (bei B-Lymphoblastoid-Zelllinien als LAV-B bezeichnet), das die wichtigsten antigenen und morphologischen Merkmale der LAV-Viren besitzt (abgesehen davon, dass es gelegentlich in einer Bande mit etwas höherer Dichte als im vorstehenden Fall (genauer 1,18) in Saccharose erhalten wird). Die abschließende Reinigung des Virus kann auch in einem Nycodenz^®-Gradienten durchgeführt werden.
Es wird auf den Artikel von SCHÜPBACH et al., Science 224 (4. Mai 1984), 503–505, hingewiesen. Dieser Artikel beschreibt eine Untersuchung im Hinblick auf verschiedene Antigene des HTLV-III-Retrovirus.
Es werden Ergebnisse vorgestellt, die einen Hinweis auf ein Antigen enthalten, das auf einem Elektrophoresegel eine Laufstrecke zurücklegte, die einem Molekulargewicht von etwa 110.000 entsprach.
SCHÜPBACH et al. erwähnten, dass dieses Antigen in einer Virus-Präparation nachgewiesen wurde, in den Zellen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze lag.
Ein Verfahren zur Clonierung von DNA-Sequenzen, die mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbar sind, ist bereits in der am 19. September 1984 eingereichten britischen Patentanmeldung 84 23659 offengelegt worden. Nachstehend wird hinsichtlich des gemeinsamen Gegenstands mit den weiteren Verbesserungen in der hier beschriebenen Erfindung auf diese Anmeldung Bezug genommen.
Die Anmeldung beschreibt die Bereitstellung gereinigter, unveränderter Virusformen (oder Viren, die durch die verwendeten Reinigungsverfahren weniger verändert wurden) und Verfahren zum Erhalt der unveränderten, gereinigten Viren.
Die vorliegende Erfindung zielt darüber hinaus auf die Bereitstellung weiterer neuer Verfahren, die neben ihrer Nützlichkeit zum Nachweis von LAV oder verwandten Viren (hier nachstehend allgemeiner als "LAV-Viren" bezeichnet) auch eine größere Vielseitigkeit insbesondere beim Nachweis bestimmter Teile der genomischen DNA der Viren aufweisen sollten, deren Expressionsprodukte durch immunologische Verfahren nicht immer direkt nachweisbar sind. Die vorliegende Erfindung zielt darüber hinaus auf die Bereitstellung von Polypeptiden, die Sequenzen enthalten, die mit antigene Determinanten umfassenden Polypeptiden, übereinstimmen, die in den durch das natürlich vorkommende LAV-Genom codierten und exprimierten Proteinen enthalten sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Verfahren zum Nachweis von mit LAV-Viren verwandten Proteinen, besonders zur Diagnose von AIDS oder Prä-AIDS oder, im Gegensatz dazu, zum Nachweis von Antikörpern gegen das LAV-Virus oder mit ihm verwandten Proteinen, besonders in Patienten, die an AIDS oder Prä-AIDS leiden, oder allgemeiner in asymptomatischen Trägern und in blutverwandten Produkten. Schließlich betrifft die Erfindung auch die Bereitstellung immunogener Polypeptide, und insbesondere schützender Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung von Impfstoff-Zusammensetzungen gegen AIDS oder verwandte Syndrome.
Die vorliegende Erfindung betrifft weitere, mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbare DNA-Fragmente, wie hier nachstehend beschrieben, ebenso wie weitere cDNA-Varianten, die den gesamten LAV-Virus-Genomen entsprechen. Sie betrifft weiter rekombinante DNAs, die die DNAs oder cDNAFragmente enthalten.
Ein unverändertes, gereinigtes LAV-Retrovirus unterscheidet sich von den vorstehend definierten durch einen Gehalt an einem oder mehreren Hüll-Antigenen, der zur Sichtbarmachung ausreicht, wenn das Virus mit ³⁵S-Cystein, ohne nicht-markiertes Cystein, in einem Verhältnis von 200 Microcurie pro ml Medium markiert wird. Von diesen Antigenen werden in vitro durch Seren von Patienten, die an AIDS oder SLAs leiden, oder durch Seren von asymptomatischen Trägern des Virus besonders Glycoproteine selektiv erkannt.
Die Anmeldung offenbart ein Antigen gemäß der vorstehenden Definition, das aus einem Lysat dieses Virus erhältlich ist (oder durch vorsichtiges Reinigen der Virus-Hüllen), das ein Glycoprotein ist, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 110.000 Dalton aufweist, wie durch einen Vergleich seiner Laufstrecke mit den Laufstrecken von Standardproteinen, die bekannte Molekulargewichte aufwiesen, im selben Laufsystem festgestellt wurde. Insbesondere wurden vergleichende Messungen 18 Stunden bei einer Spannung von 18V auf einem 12,5% Polyacrylamidgel durchgeführt, wobei die nachstehend aufgeführten Standardproteine (Vertrieb durch AMERSHAM) verwendet wurden:

– Lysozym-(¹⁴C)-Methyl (MG: 14.300),
– Kohlendioxid-(¹⁴C)-Methyl (MG: 30.000),
– Ovalbumin-(¹⁴C)-Methyl (MG: 46.000),
– Rinderserumalbumin-(¹⁴C)-Methyl (MG: 69.000),
– Phosphorylase b-(¹⁴C)-Methyl (MG: 92.500),
– Myosin-(¹⁴C)-Methyl (MG: 200.000).

Die Anmeldung offenbart auch die Antigene selbst, besonders das mit einem Molekulargewicht von etwa 110.000–120.000, das auch die Eigenschaft aufweist, durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS leiden, oder durch Seren von Personen erkannt zu werden, die den LAV-Viren oder ihren Analoga ausgesetzt worden waren. Diese Antigene weisen weiter die Eigenschaft auf, mit Concanavalin A Komplexe zu bilden, wobei der Komplex in Gegenwart von O-Methyl-a-D-mannopyranosid dissoziierbar ist. Die erfindungsgemäßen Antigene können auch andere, zum Beispiel unter dem Namen "Linsen-Lectin" bekannte Lectine binden. Das bevorzugte erfindungsgemäße Antigen mit einem Molekulargewicht von 110000 ist auch empfindlich gegen die Wirkung von Endoglycosidasen. Diese Wirkung wird durch das aus dem Antigen mit einem Molekulargewicht von 110.000 hergestellte Protein deutlich, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 90.000 aufweist, wobei letzteres beispielsweise durch Immunpräzipitation oder Trennung unter Verwendung der Unterschiede in den Molekulargewichten (unterschiedliche Laufstrecken auf einem Gel) abtrennbar ist.
Die Anmeldung offenbart auch das Verfahren zur Herstellung der hierin beschriebenen Viren. Dieses Verfahren unterscheidet sich wesentlich von den vorstehend beschriebenen auf der Stufe des abschließenden Reinigungsschrittes. Der Reinigungsschritt des anmeldungsgemäßen Verfahrens wird insbesondere nicht weiter in Gradienten durchgeführt, sondern schließt die Durchführung von Differential-Zentrifugationen ein, die direkt mit den Überständen der Kulturmedien der produzierenden Zellen durchgeführt werden. Diese Zentrifugations-Verfahren umfassen besonders eine erste Zentrifugation bei einer Winkelgeschwindigkeit der Zentrifugation, besonders bei 10.000 UpM, die die Entfernung von nicht-viralen Bestandteilen, insbesondere von zellulären Bestandteilen ermöglicht, und anschließend eine zweite Zentrifugation bei einer höheren Winkelgeschwindigkeit, besonders bei 45.000 UpM, um den eigentlichen Virus-Niederschlag zu erhalten. In bevorzugten Ausführungsformen wird in der ersten Zentrifugation 10 Minuten mit 10.000 UpM und in der zweiten 20 Minuten mit 45.000 UpM zentrifugiert. Dies sind natürlich nur Orientierungswerte, wobei es sich versteht, dass es der Fähigkeit des Spezialisten überlassen bleibt, zur Trennung der zellulären und der viralen Bestandteile die Zentrifugations-Bedingungen zu modifizieren.
Diese Modifikation des Reinigungsverfahrens hat die Herstellung von viralen Präparationen zur Folge, aus denen das erwähnte Antigen leichter als aus Virus-Präparationen gewonnen werden kann, die durch die früher verwendeten Verfahren gereinigt wurden. Auf jeden Fall werden die schließlich durch das anwendungsgemäße Verfahren erhaltenen Viren durch Seren von Patienten oder Personen, die dem LAV-Virus oder morphologisch und hinsichtlich der Antigenität ähnlichen Stämmen ausgesetzt worden sind, leichter erkannt.
Die beschriebenen Antigene selber können aus den vorstehend beschriebenen Viren durch deren Lyse (oder andere geeignete Verfahren) in Gegenwart eines geeigneten Detergens und durch Gewinnung und Trennung der freigesetzten Antigene erhalten werden. Die Lyse des Virus wird vorzugsweise in Gegenwart von Aprotinin oder einem anderen zur Hemmung der Protease-Wirkung geeigneten Wirkstoff durchgeführt. Die Trennung der Antigene kann anschließend durch ein beliebiges bekanntes Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise ist es möglich, eine Trennung der Proteine aufgrund ihrer jeweiligen unterschiedlichen Laufstrecken in einem vorgegebenen Gel durchzuführen, worauf das gesuchte Protein aus der Zone des Gels isoliert wird, in der es bei streng festgelegten Bedingungen unter Berücksichtigung seines Molekulargewichts nach der Durchführung einer Elektrophorese üblicherweise gefunden wird. Die Anmeldung offenbart Antigene, die aufgrund ihrer Affinität für Lectine, insbesondere Concanavalin A oder Linsen-Lectin, vom Lysat der vorstehend beschriebenen Viren abgetrennt sind. Das verwendete Lectin wird vorzugsweise auf einem festen Träger, zum Beispiel dem quervernetzten, aus Agarose stammenden und unter dem Warenzeichen Sepharose vertriebenen Polymer immobilisiert. Nach dem Waschen der gebundenen Antigene mit einem geeigneten Puffer können die Antigene in einer geeigneten Weise, besonders' durch Verwendung von gelöstem O-Methyl-u-D-mannopyranosid eluiert werden.
Eine sorgfältigere Reinigung dieser Antigene wird anhand der Immunpräzipitation mit Seren von Patienten, von denen bekannt ist, dass sie gegen dieses Protein wirksame Antikörper aufweisen, mit konzentrierten Antikörper-Präparationen (polyclonalen Antikörpern) oder erneut mit insbesondere gegen das erfindungsgemäße Antigen gerichteten monoclonalen Antikörpern beschrieben, insbesondere gegen das mit dem Molekulargewicht von 110.000, das nachstehend durch die Abkürzung gp110 bezeichnet wird.
Weitere Eigenschaften der Erfindung werden auch bei der nachstehenden Beschreibung der Isolierung eines erfindungsgemäßen Virus und von Antigenen des Virus beschrieben. Es wird auf die Figuren Bezug genommen, wobei:
1 eine Kopie einer photographischen Reproduktion von Gelspuren darstellt, die zur Durchführung von Elektrophoresen von Lysatextrakten von T-Lymphocyten verwendet wurden, die durch eine LAV-Suspension infiziert bzw. nicht-infiziert (Kontrollen) worden waren;
2 und 3 die Restriktionskarten eines vollständigen LAV-Genoms (Clon XJ19) darstellen;
4a bis 4g die vollständige Sequenz eines viralen LAV-Genoms darstellen;
5 und 6 Teile der drei möglichen Lesephasen der genomischen LAV-RNA als Diagramm darstellen, einschließlich der offenen, in jedem der Lesephasen erscheinenden Leseraster (ORF).
I-Herstellung des Virus und der Antigene
T-Lymphocyten, die von einem gesunden Spender stammten und mit LAV1 unter den von F. BARRE-SINOUSSI et al. beschriebenen Bedingungen auf CEM-Zellen infiziert worden waren, die von einem an Leukämie leidenden Patienten stammten und auch in vitro mit LAV1 infiziert worden waren, wurden in einem Medium gezüchtet, das 200 Microcurie ³⁵S-Cystein enthielt und dem nicht-markiertes Cystein fehlte. Die infizierten Lymphocyten wurden in einem nicht-denaturierenden Medium gezüchtet, um den Abbau des gesuchten Antigens zu verhindern. Im Anschluss daran wurde mit der Überstandsflüssigkeit des Kulturmediums zur Entfernung der nicht viralen Bestandteile eine erste Zentrifugation von 10 Minuten bei 10.000 UpM und danach zur Sedimentierung des Virus eine zweite Zentrifugation von 20 Minuten bei 45.000 UpM durchgeführt. Das Virus-Pellet wurde anschließend in Gegenwart von Aprotinin (5%), insbesondere unter den im Artikel von F. BARRE-SINOUSSI et al. beschriebenen Bedingungen durch Detergens lysiert.
Dasselbe Verfahren wurde an Lymphocyten wiederholt, die als Kontrolle aus einem gesunden Spender gewonnen worden waren.
Die verschiedenen Lysate wurden anschließend durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS litten, immunpräzipitiert. Seren, die von gesunden Spendern oder von mit anderen Krankheiten infizierten Spendern stammten, wurden ebenfalls immunopräzipitiert. Mit den Medien wurde anschließend in einem SDS-Polyacrylamidgel eine Elektrophorese durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die von 1 bis 6 numerierten Gelspuren wurden von Präparationen erhalten, die mit ³⁵S-Cystein markiert worden waren. Die Spuren mit den Nummern 7 bis 10 zeigen Ergebnisse, die an infizierten und nicht-infizierten, mit ³⁵S-markierten Lymphocyten-Präparationen beobachtet wurden. Die Spur M entspricht schließlich den Laufstrecken der vorstehend identifizierten Standardproteine, deren Molekulargewichte im rechten Teil der Figur angegeben sind.
Die Bezeichnung der markierten viralen Proteine erscheint im linken Teil der Figur.
Es ist zu beobachten, dass die Spuren 7 und 9 das spezifische, mit ³⁵S-Methionin markierte LAV-Protein p25 zeigen. Die Abwesenheit des gleichen Proteins auf den Spuren 8 und 1,0 entspricht den Ergebnissen, die an einer von gesunden Lymphocyten stammenden Präparation erhalten wurden.
Die Spuren 3 und 5 entsprechen den Ergebnissen, die an Präparationen von infizierten und mit ³⁵S-Cystein markierten Lymphocyten erhalten wurden. Die Proteine p25 und p18, die charakteristischen Kernproteine von LAV, und das auch für LAV spezifische Glycoprotein gp110 waren ebenfalls vorhanden.
Abbildungen, die einem Protein p41 entsprechen (Molekulargewicht der Größenordnung 41.000) erschienen, obgleich weniger deutlich, in den verschiedenen Präparationen.
Das offenbarte Virus und Antigen können entweder durch Lectine, besonders Concanavalin A, ausgefällt oder an eine Sepharose-Concanavalin A-Säule gebunden werden. Insbesondere die Reinigung der Hüll-Glycoproteine kann wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden. Diese Bindung kann insbesondere durch Inkontaktbringen eines in einem geeigneten Puffer gelösten Lysats des LAV-Virus mit an Sepharose^® gebundenem Concanavalin A durchgeführt werden. Ein geeigneter Puffer weist die nach-stehend beschriebene Zusammensetzung auf:

Tris 10 mM

NaC1 0,15 M

CaC1₂ 1 mM

MgC1₂ 1 mM

Triton 1%

(Warenzeichen des Dertergens im Handel)

pH-Wert 7,4
Nach der Durchführung der Bindung wird das Sepharose^®-Concanavalin A, abgesehen von der auf 0,1%-verminderten Triton^®-Konzentration, mit einem Puffer der gleichen Zusammensetzung gewaschen. Die Elution wird anschließend mit einer 0,2 M 0-Methyl-α-D-mannopyranosidlösung im Waschpuffer durchgeführt.
Das Protein kann durch Immunpräzipitation mit Antikörpern, die in Seren von mit dem AIDS-Virus infizierten Patienten enthalten sind, oder mit polyclonalen Antikörpern weiter konzentriert werden, die aus einem Serum erhalten werden, das von einem zuvor gegen das "unveränderte" erfindungsgemäße Virus oder das vorstehend beschriebene Glycoprotein immunisierten Tier stammt. Das Protein kann anschließend durch Dissoziation des Komplexes mittels einer Lösung, die einen geeigneten ionischen Salzgehalt aufweist, gewonnen werden. Vorzugsweise wird die Antikörper-Präparation selbst in einer an sich bekannten Weise auf einem unlöslichen Träger, beispielsweise vom Sepharose^®-B-Typ immobilisiert.
Es ist auch möglich, monoclonale Antikörper zu verwenden, die von zuvor gegen gp110 hergestellten Hybridomen sekretiert werden. Diese monoclonalen Antikörper bilden neben den sie produzierenden Hybridomen auch einen Teil der Erfindung.
Ein Verfahren zur Herstellung und Selektion von monoclonalen Antikörpern, die gegen das gp110 Glycoprotein gerichtet sind, ist nachstehend beschrieben.
Immunisierung der Mäuse
Es wurden Gruppen von 6 bis 8 Wochen alten BALB/c-Mäusen verwendet. Eine Gruppe erhält das Virus, das das vorstehend beschriebene Glycoprotein trägt, und eine andere ein gereinigtes Glycoprotein gp110. Das bei allen Mäusen identische Immunisierungsverfahren umfasst die Injektion von 10 mg der antigenen Präparation in Gegenwart von komplettem Freunds Adjuvans am Tag 0, anschließend erneut, jedoch in Gegenwart von inkomplettem Freunds Adjuvans am Tag 14 und ohne Adjuvans an den Tagen 28 und 42. Die ersten drei Injektionen werden intraperitoneal, die vierte intravenös verabreicht.
Fusion und Züchtung der Hybride
Die nicht-sekretierende Myelom-Variante 5.53 P3 × 63 Ag8, die Azaguanin-resistent ist und von der MOPC-21-Zellinie stammt, wird verwendet. In Gegenwart von Polyethylenglycol 4000 wird am 45. Tag mithilfe des Verfahrens von FAZEKAS de ST-GROTH und SCHEIDEGGER die Fusion mit immunisierten Maus-Splenocyten durchgeführt. Die Selektion der Hybride in RPMI-1640-"HAT"-Medium wird unter Verwendung derselben Züchtungstechniken auf Platten durchgeführt, die 24 Vertiefungen aufweisen (bekannt unter der Bezeichnung Costar).
Die Hybridome, die Antikörper von geeigneter Spezifität produzieren, werden anschließend in Gegenwart einer "ernährenden" Schicht von syngenen Thymocyten in Platten, die 96 Vertiefungen aufweisen, cloniert. Die so selektierten, produzierenden Clone werden anschließend immer noch in Gegenwart von Thymocyten in Platten mit 24 Vertiefungen vermehrt. Sobald in einer der Vertiefungen Konfluenz auftritt, wird der Clon intraperitoneal in eine BALG/c-Maus injiziert, die 8 Tage zuvor eine Pristan-Injektion erhalten hatte, und/oder in Flüssigkultur gehalten.
Darstellung der anti-LAV-Antikörper
Fünf verschiedene Verfahren ermöglichen die Charakterisierung der Clane, die Antikörper von geeigneter Spezifität produzieren. In einer ersten Stufe werden die Hybride, die Antikörper produzieren, durch einen ELISA-Test ermittelt, der Maus-Immunglobuline in den Überstandsflüssigkeiten zeigt. In dieser ersten Selektion werden durch Verwendung eines ELISA-Tests, der anti-LAV-Antikörper zeigt, oder durch Immunfluoreszenz an Virus produzierenden menschlichen Zellen Überstände gesucht, die gegen virale Bestandteile gerichtete Antikörper aufweisen. Schließlich werden die Überstandsflüssigkeiten durch Radio-Immunpräzipitation des mit Cystein markierten Virus und durch das Western-Blot-Verfahren an einer viralen Präparation, die die Bestimmung der Spezifitäten dieser anti-LAV-Antikörper ermöglichen, analysiert.
Ergebnisse
Die von den verschiedenen Fusionen erhaltenen Zellen werden in 648 Vertiefungen gezüchtet. Ihre mikroskopische Untersuchung zeigt, dass die Mehrzahl dieser Vertiefungen einen einzelnen Hybridclon enthält, der fähig ist, in einem selektiven "HAT"-Medium zu wachsen. Mehr als 50% von ihnen produzieren Antikörper, die bei einer ELISA-anti-Virus-Untersuchung eine positive Antwort bewirken. Die repräsentativsten Fusionen werden mithilfe des Western-Blot-Verfahrens getestet und einige von ihnen subcloniert, wobei ihre jeweiligen Spezifitäten und Reaktivitäten im anti-Virus-ELISA und ihre Verhaltensweisen unter den Züchtungsbedingungen berücksichtigt werden. Es werden insbesondere die Hybride selektiert, die Antikörper produzieren, die selektiv das virale Glycoprotein gp110 erkennen, das ein Molekulargewicht von etwa 110 kD aufweist. Sämtliche Subclonierungen ergeben Antikörper produzierende Clone, die nach der Expression syngenen Mäusen injiziert werden. Eine Analyse der Spezifitäten der in den unterschiedlichen Ascites-Flüssigkeiten vorhandenden Antikörper bestätigt die Spezifität der Ascites-Antikörper hinsichtlich des gp110.
Die erhaltenen monoclonalen Antikörper können selbst zur Reinigung von Proteinen verwendet werden, die eine auch in gp110 vorhandene antigene Stelle enthalten. Die Anmeldung beschreibt auch diese Reinigungsverfahren als solche. Dieses Verfahren wird vorteilhaft bei Virus-Lysaten, Lysaten von T-Lymphocyten oder weiteren LAV produzierenden Zellen oder ähnlichen angewandt, wenn die unkontrollierte Abtrennung von gp110 während des Reinigungsverfahrens des Virus vor seiner Lyse sorgfältig vermieden worden ist. Es ist unnötig zu sagen, dass das Verfahren auch bei jeder Lösung angewendet werden kann, die gp110 oder ein Protein, Polypeptid oder Glycoprotein enthält, das eine antigene Stelle umfasst, die üblicherweise vom Hüll-Protein getragen und durch den monoclonalen Antikörper erkannt wird. Zur Durchführung dieses Verfahrens ist es vorteilhaft, die monoclonalen Antikörper auf einem festen Träger zu immobilisieren, der bevorzugt für Affinitätschromatographie-Verfahren verwendbar ist. Diese monoclonalen Antikörper werden beispielsweise an ein dreidimensional vernetztes Agarosegitter, unter dem Warenzeichen Sepharose von der schwedischen Firma Pharmacia A. G. vertrieben, beispielsweise durch das Bromcyan-Verfahren gebunden.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Trennung der betroffenen Antigene, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines die Antigene von Interesse einschließenden Antigen-Gemisches (zum Beispiel ein Virus-Lysat oder -Extrakt) mit einer Affinitätssäule, die die vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper trägt, um die durch die monoclonalen Antikörper selektiv erkannten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine selektiv zu binden, die Gewinnung der letzteren durch Dissoziation des Antigen-Antikörper-Komplexes unter Verwendung eines geeigneten Puffers, insbesondere einer Lösung von geeigneter Ionenstärke, beispielsweise eines Salzes, vorzugsweise Ammoniumacetat (das bei der Gefriertrocknung der Präparation keinen Rückstand bildet), einer auf einen pH-Wert von 2 bis 4 angesäuerten Lösung oder eines Glycin-Puffers bei einem gleichen pH-Wert, und die Gewinnung der eluierten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine umfasst.
Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung auch Polypeptid-Fragmente betrifft, die niedrigere Molekulargewichte aufweisen und antigene Stellen tragen, die durch die gleichen monoclonalen Antikörper erkannt werden. Es ist für den Fachmann klar, dass die Verfügbarkeit von monoclonalen Antikörpern, die das gp110-Glycoprotein erkennen, auch den Zugriff auf kleinere Peptidsequenzen oder Fragmente ermöglicht, die eine gemeinsame antigene Stelle oder ein gemeinsames Epitop enthalten. Fragmente von kleinerer Größe können unter Verwendung von bekannten Verfahren erhalten werden. Ein derartiges Verfahren umfasst beispielsweise die Spaltung des ursprünglich größeren Polypeptids durch Enzyme, die zur Spaltung an spezifischen Stellen fähig sind. Zur beispielhaften Darstellung solcher Proteine kann das Enzym von Staphylococcus aureus V8, α-Chymotrypsin, Maus-Unterkiefer-Drüsen-Protease, die von der Firma Boehringer vertrieben wird, Vibrio alginolyticus chemovar iophagus-Collagenase, die unter anderem die Peptide Gly-Pro und Gly-Ala spezifisch erkennt, erwähnt werden.
Es ist auch möglich, durch Clonierung von Fragmenten, die einer aus Genomen von LAV-Varianten konstruierten cDNA entnommen worden sind, Polypeptide oder Fragmente von Hüll-Antigenen des Virus zu erhalten.
Die 2 und 3 sind Restriktionskarten einer solchen cDNA, die insgesamt 9,1 bis 9,2 kB umfasst. Die von cDNA-Fragmenten codierten Polypeptide befinden sich in der Region, die sich von der KpnI-Stelle (Position 6100) bis zur BgIII-Stelle (Position 9150) der Restriktionskarte von 2 erstreckt. Das Vorhandensein einer charakteristischen Stelle eines Hüll-Antigens des LAV-Virus oder eines ähnlichen Virus in einem exprimierten Polypeptid (in einer geeigneten Wirtszelle, die zuvor durch ein entsprechendes Fragment oder durch einen das Fragment enthaltenden Vektor transformiert worden ist) kann durch jedes geeignete immunologische Verfahren nachgewiesen werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere Polypeptide, die von hier nachstehend definierten cDNA-Fragmenten codiert werden. Sie betrifft auch die Nucleinsäure-Fragmente selbst, die eine cDNA-Variante einschließen, die einem vollständigen retroviralen LAV-Genom entspricht, das durch eine Reihe von Restriktionsstellen in der hier nachstehend beschriebenen Reihenfolge (vom 5'-Ende zum 3'-Ende) charakterisiert ist.

Die Koordinaten der aufeinanderfolgenden Stellen des gesamten LAV-Genoms (vgl. auch die Restriktionskarte von λJ19 in 1) werden hier nachstehend unter Bezug auf die HindIII-Stelle (gewählt als Koordinate 1), die in der R-Region liegt, auch angegeben. Die Koordinaten werden mit einer Genauigkeit von ± 200 Bp geschätzt:

HindIII	0
SacI	50
HindIII	520
PstI	800
HindIII	1100
BglII	1500
KpnI	3500
KpnI	3900
EcoRI	4100
EcoRI	5300
SalI	5500
KpnI	6100
BglII	6500
BglII	7600
HindIII	7850
BamHI	8150
XhoI	8600
KpnI	8700
BglII	8750
BglII	9150
SacI	9200
HindIII	9250

Eine weitere hierin offenbarte DNA-Variante enthält gegebenenfalls eine weitere HindIII-Stelle etwa an der Koordinate 5550.
Es wird auch auf 2 Bezug genommen, die eine genauere Restriktionskarte der Gesamt-DNA (λJI9) darstellt.
Eine noch detailliertere Nucleotidsequenz einer bevorzugten erfindungsgemäßen DNA ist hier nachstehend in den 4a–4e dargestellt.
Die Erfindung betrifft ferner weitere bevorzugte DNA-Fragmente und Polypeptidsequenzen (glycosyliert oder nicht glycosyliert), auf die hier nachstehend Bezug genommen wird.
Sequenzierung von LAV
Die Sequenzierung und Bestimmung der Stellen von besonderem Interesse wurden an einem rekombinanten Phagen durchgeführt, der dem in der vorstehend genannten britischen Patentanmeldung Nr. 84 23659 beschriebenen λJ19 entspricht. Ein Verfahren zu seiner Herstellung wird in der Anmeldung beschrieben.
Die gesamte rekombinante Phagen-DNA vom Clon λJ19 (in der früheren Anmeldung beschrieben) wurde gemäß der Vorschrift von DEININGER, Analytical Biochem. 129 (1983), 216, mit Ultraschall behandelt. An der DNA wurde 12 Stunden bei 16°C durch eine Klenow-Reaktion eine Reparatur durchgeführt. Mit der DNA wurde in einem 0,8% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt, und die DNA im Größenbereich von 300–600 Bp wurde ausgeschnitten, elektroeluiert und aus-gefällt. Die resuspendierte DNA (in 10 mM Tris, pH-Wert 8; 0,1 mM EDTA) wurde in M13mp8-RF-DNA (durch das Restriktionsenzym SmaI gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt) unter Verwendung von T4-DNA-und RNA-Ligasen ligiert (Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning – Cold Spring Harbor Laboratory). Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung TG1 wurde für die weitere Untersuchung verwendet. Dieser Stamm weist den nachstehend beschriebenen Genotyp auf:
Δlac pro, supE, thi.F'traD36, proAB, lacI^q, ZΔM15, r^–
Dieser E. coli TGI-Stamm weist die Besonderheit auf, dass Rekombinante leicht erkannt werden können. Die blaue Farbe der Zellen, die mit Plasmiden transfiziert sind, die nicht mit einem LAV-DNA-Fragment rekombiniert haben, wird nicht modifiziert. Die Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert sind, das ein LAV-DNA-Fragment enthält, ergeben dagegen weiße Kolonien. Das verwendete Verfahren ist in Gene 26 (1983), 101, beschrieben.

Dieser Stamm wurde unter Verwendung des Hanahan-Verfahrens (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557) mit dem Ligierungsgemisch transformiert. Die Zellen wurden auf einer Trypton-Agarose-Platte mit IPTG und X-Gal in weicher Agarose ausplattiert. Weiße Plaques wurden entweder entnommen und abgesucht oder unter Verwendung eines Nitrocellulose-Filters direkt in situ abgesucht. Ihre DNA-Moleküle wurden mit nick-translatierten DNA-Insertionen von pUC18-HindIII-Subclonen von λJ19 hybridisiert. Dies ermöglichte die Isolierung der Plasmide oder Subclone von λ, die in der nachstehenden Tabelle identifiziert sind. In Bezug auf diese Tabelle sollte auch darauf hingewiesen werden, dass auf die Bezeichnung eines jeden Plasmids die Hinterlegungsnummer einer Zellkultur von E. coli TGI, die das entsprechende Plasmid enthält, bei der "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes" (C.N.C.M.) des Pasteur-Instituts in Paris, Frankreich, folgt. Auch eine nicht transformierte TGI-Zellinie wurde bei der C.N.C.M. unter der Nr. I-364 hinterlegt. Sämtliche Hinterlegungen fanden am 15. November 1984 statt. Die Größen der entsprechenden vom LAV-Genom stammenden Insertionen wurden ebenfalls angegeben. Tabelle Haupt-Merkmale der rekombinanten Plasmide

- pJI9 – 1-Plasmid	(I-365)	0,5 kB

HindIII-SacI-HindIII

- pJ19 – 17-Plasmid	(I-367)	0,6 kB

HindIII-PstI- HindIII

– pJI9 – 6-Plasmid	(I-366)	1,5 kB

HindIII (5')
BamHI
XhoI
KpnI
BglII
SacI (3')
HindIII

- pJI9 – 13-Plasmid	(1-368)	6,7 kB

HindIII (5')
BglII
KpnI
KpnI
EcoRI
EcoRI
SalI
KpnI
BglII
BglII
HindIII (3')

Positiv hybridisierende M13-Phagen-Platten wurden 5 Stunden gezüchtet, und die einzelsträngigen DNAs extrahiert.
Die M13mp8-Subclone von λJ19-DNAs wurden nach dem Didesoxy-Verfahren und der Technologie, die von Sanger et al. entwickelt wurden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463 und M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch (Amersham (1983)), sequenziert. Es wurden der 17-mer-Oligonucleotid-Primer α-³⁵SdATP (400Ci/mMol, Amersham) und die 0,5x-5x Puffer-Gradienten-Gele (Biggen, M. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50 (1983), 3963) verwendet. Die Gele wurden gelesen und über die Programme von Staden (Staden, R., Nucl. Acids Res. 10 (1982), 4731) in den Computer eingegeben. Sämtliche einschlägige Literaturhinweise und geeignete Verfahren können dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch von Amersham entnommen werden.
Die vollständige DNA-Sequenz von λJ19 (auch als LAV-Ia bezeichnet) ist in den 4 bis 4e dargestellt.
Die Sequenz wurde aus der Sequenz der Insertion des Phagen λJ19 rekonstruiert. Die Nummerierung beginnt an der Cap-Stelle, die experimentell lokalisiert wurde (s. u.). Wichtige genetische Elemente, größere offene Leserahmen und ihre erwarteten Produkte sind zusammen mit den HindIII-Clonierungsstellen angegeben. Die potentiellen Glycosylierungs-Stellen im env-Gen sind oben mit einem Strich versehen. Die NH₂-terminale Sequenz von p25^gag, die durch Protein-Micro-Sequenzierung bestimmt wurde, ist eingerahmt.
Jedes Nucleotid wurde im Durchschnitt 5,3-mal sequenziert: 85% der Sequenz wurden an beiden Strängen bestimmt und der Rest mindestens zweimal in unabhängigen Clonen sequenziert. Die Basenzusammensetzung ist T, 22,2%; C, 17,8%; A, 35,8%; G, 244,2%; G + C, 42%. Das Dinucleotid GC ist stark unterrepräsentiert (0,9%), wie dies bei eukaryontischen Sequenzen üblich ist (Bird 1980).
Die 5 und 6 liefern eine Diagramm-Darstellung der Längen der aufeinanderfolgenden offenen Leserahmen, die den aufeinanderfolgenden Lesephasen entsprechen (auch mit den Zahlen "1" "2" und "3" bezeichnet, die auf der linken Seite von 5 erscheinen). Die relativen Positionen dieser offenen Leserahmen (ORF) in bezug auf die Nucleotid-Struktur des LAV-Genoms werden durch die Reihe von Zahlen angegeben, die die jeweiligen Positionen der entsprechenden Nucleotide in der DNA-Sequenz wiedergeben. Die vertikalen Striche entsprechen den Positionen der jeweiligen Stoppcodons.
Die nachstehend beschriebenen Gene und DNA-Fragmente können hinsichtlich der verschiedenen dargestellten Leserahmen unterschieden werden. Es wird anschließend auch auf die von diesen Genen und Fragmenten codierten Proteine oder Glycoproteine Bezug genommen, insbesondere auf ORF-Sequenzen, beispielsweise ORF-Q und ORF-F.
Die Anmeldung offenbart offene Leserahmen liefernde DNA-Sequenzen, die als ORF-Q, ORF-F und als "1", "2", "3", "4" und "5" definiert werden, deren relative Positionen genauer in den 2 und 3 erscheinen.

Diese ORFs weisen die nachstehend aufgeführten Positionen auf:

ORF-Q	Phase 1	Start 4554	Stop 5162
ORF-F	Phase 2	Start 8324	Stop 8972
ORF-1	Phase 1	Start 5105	Stop 5392
ORF-2	Phase 2	Start 5349	Stop 5591
ORF-3	Phase 1	Start 5459	Stop 5692
ORF-4	Phase 2	Start 5595	Stop 5849
ORF-5	Phase 1	Start 8042	Stop 8355

ORF-Q und -F
Man stellte am viralen (+)-Strang des LAV-Genoms fest, dass er obligatorische retrovirale Gene enthielt, die die Kernstrukturproteine (gag), die reverse Transkriptase (pol) und das Hüll-Protein (env) codieren, und zwei weitere offene Leserahmen (ORF), die als Q und F bezeichnet werden (Tabelle 1). Die genetische Organisation von LAV, 5'-LTR-gag-pol-Q-env-F-3'-LTR, ist einmalig.
Während in sämtlichen replikationskompetenten Retroviren die pol- und env-Gene überlappen, sind sie in LAV durch den ORF-Q (192 Aminosäuren), worauf vier kleine (< 100 Triplets) ORFs folgen, getrennt. Der ORF-F (206 Aminosäuren) überlappt leicht das 3'-Ende von env und ist deswegen bemerkenswert, dass er zur Hälfte durch die U3-Region des LTR codiert wird.
Eine derartige Struktur unterscheidet LAV klar von zuvor sequenzierten Retroviren (2). Der (–)-Strang ist anscheinend nicht-codierend. Die weitere HindIII-Stelle des LAV-Clons λJ81 (bezüglich λJ19) lässt sich der anscheinend nicht-codierenden Region zwischen Q und env (Positionen 5166–5745) kartieren. In der Position 5501 beginnt eine Sequenz (AAGCCT), die sich durch eine einzelne Base (unterstrichen) von der HindIII-Erkennungssequenz unterscheidet. Es muss erwartet werden, dass viele der Restriktionsstellen-Polymorphismen zwischen verschiedenen Isolaten in dieser Region kartiert werden können. Der Clon λJ81 ist auch in der am 15. September 1984 eingereichten britischen Anmeldung mit der Nr. 84 23659 beschrieben worden.
Q und F
Die Nucleotid-Positionen ihrer jeweiligen Enden sind hier nachstehend in Tabelle 1 dargestellt.
Die Lage von ORF-Q ist in der Struktur von Retroviren ohne Vorbild. ORF-F ist dadurch einmalig, dass es zur Hälfte durch das U3-Element des LTR codiert wird. Beide ORFs weisen in der Nähe ihrer 5'-Enden "starke" Initiator-Codons auf (Kozak 1984) und können Proteine von 192 Aminosäuren (berechnetes MG = 22.487) bzw. 206 Aminosäuren (berechnetes MG = 23.316) codieren. Beide mutmaßlichen Proteine sind hydrophil (pQ 49% polar, 15, 1% Arg + Lys; pF 46% polar, 11% Arg + Lys), und daher ist es unwahrscheinlich, dass sie direkt mit der Membran verbunden sind. Die Funktion der mutmaßlichen Proteine pQ und pF kann nicht vorhergesagt werden, da durch Absuchen von Proteinsequenz-Datenbanken keine Homologie festgestellt wurde. Zwischen ORF- F und dem pX-Protein von HTLV-1 besteht keine nachweisbare Homologie. Ferner weichen ihre Hydrophobie/Hydrophobie-Profile stark voneinander ab. Es ist bekannt, dass Retroviren zelluläre Gene, besonders Proto-Oncogene (Weinberg 1982) transduzieren können. Es wird angenommen, dass ORF-Q und -F exogenes genetisches Material und nicht Überbleibsel von zellulärer DNA darstellen, da (I) LAV-DNA unter stringenten Bedingungen nicht an das menschliche Genom hybridisiert (Alizon et al., 1984), (II) ihre Codon-Verwendung mit der von gag-, pol- und env-Genen vergleichbar ist (Daten nicht dargestellt).
Die Organisation eines rekonstruierten LTR und flankierender viraler Elemente ist in 6 schematisch dargestellt. Die LTR ist 638 Bp lang und zeigt die üblichen Merkmale (Chen und Barker 1984): (I) Sie wird durch eine invertierten Wiederholung (5'ACTG) gebunden, die die konservierten TG-Dinucleotide (Temin 1981) enthält, (II) zum 5'-LTR benachbart ist die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS), die zu tRNAlys3 komplementär ist (Raba et al., 1979), (III) ein perfekter 15-Bp-Polypurin-Bereich ist zu der 3'-LTR benachbart. Den übrigen drei zwischen den Nucleotiden 8200–8800 beobachteten Polypurin-Bereichen schließt sich keine Sequenz an, die zu der genau der PBS vorangehenden Sequenz komplementär ist. Die Grenzen der U5-, R- und U3-Elemente wurden, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. U5 liegt zwischen PBS und der Polyadenylierungsstelle, was durch die Sequenz des 3'-Endes der Oligo(dT)-geprimten LAV-cDNA (Alizon et al., 1984) nachgewiesen wurde. Daher ist U5 84 Bp lang. Die Länge von R + U5 wurde durch Synthese der tRNA-geprimten LAV-cDNA bestimmt. Nach der alkalischen Hydrolyse des Primers wurde festgestellt, dass R + U5 eine Länge von 181 ± 1 Bp aufweisen. Daher ist R 97 Bp lang, und die Cap-Stelle an seinem 5'-Ende kann lokalisiert werden. U3 ist schließlich 456 Bp lang. Die LAV-LTR enthält auch charakteristische regulatorische Elemente: eine Polyadenylierungs-Signalsequenz AATAAA 19 Bp von der R-U5-Verbindung entfernt und die Sequenz ATATAAG, die sehr wahrscheinlich die TATA-Box ist, 22 Bp 5' von der Cap-Stelle entfernt. Es gibt keine weiteren direkten Wiederholungen innerhalb der LTR. Interessanterweise zeigt die LAV-LTR einige Ähnlichkeiten zu dem des Maus-Brusttumor-Virus ((MMTV) Donehower et al., 1981). Sie verwenden beide tRNAlys3 als Primer zur (–)-Strangsynthese, während alle übrigen zur Zeit bekannten exogenen Säuger-Retroviren tRNA^pro verwenden (Chen und Barker, 1984). Sie weisen sehr ähnliche Polypurin-Bereiche auf (der von LAV ist AAAAGAAAAGGGGGG, während der von MMTV AAAAAAGAAAAAGGGGG ist). Es ist wahrscheinlich, dass die virale (+)-Strangsynthese diskontinuierlich ist, da der das U3-Element der 3'-LTR flankierende Polypurin-Bereich als exaktes Duplikat am 3'-Ende vom ORF-pol bei 4331–4336 vorliegt. Ferner sind MMTV und LAV darin ungewöhnlich, dass das U3-Element einen ORF codieren kann. Bei MMTV enthält U3 den gesamten ORF, während in LAV U3 110 Codons der 3'-Hälfte von ORF-F enthält.
Die lange terminale Wiederholung (LTR) von LAV ist in 6 diagrammatisch dargestellt. Wie erwähnt, wurde die LTR aus der λJ19-Sequenz durch Nebeneinanderstellen der zu den HindIII-Clonierungsstellen benachbarten Sequenzen rekonstruiert.
Die Sequenzierung des Oligo(dT)-geprimten LAV-DNA-Clons pLAV75 (Alizon et al., 1984) schließt die Möglichkeit von gehäuft auftretenden HindIII-Stellen in der R-Region von LAV aus. Die LTR werden durch eine invertierte Wiederholungs-Sequenz (IR) begrenzt. Beide viralen Elemente, die die LTR flankieren, sind dargestellt worden, d. i. die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PES) an der 5'-LTR und der Polypurin-Bereich (PU) an der 3'-LTR. Eine mutmaßliche TATA-Box, die Cap-Stelle, das Polyadenylierungs-Signal (AATAAA) und die Polyadenylierungs-Stelle (CAA) sind ebenso angegeben. Die Lage des offenen Leserahmens F (648 Nucleotide) ist oberhalb des LTR-Schemas dargestellt.
Die LTRs (lange Terminale Wiederholungen) können auch durch ihre Lage zwischen der Position 8560 und der Position 160 (das Ende erstreckt sich über die Position 9097/1 hinaus) definiert werden. Das Ende des Genoms ist in der Tat bei 9097, und aufgrund der LTR-Struktur des Retrovirus ist es mit dem Sequenz-Anfang:
verbunden.

Tabelle 1 fasst die Lagen und Größen der viralen offenen Leserahmen zusammen. Die Nucleotid-Koordinaten beziehen sich auf die erste Base des ersten Tripletts (1. Triplett), des ersten Methionin-Initiationscodons (Met) und des Stopp-Codons (Stopp). Die Anzahl der Aminosäuren und die berechneten Molekulargewichte sind diejenigen, abgesehen vom pol, die für unmodifizierte Vorläuferprodukte, vom ersten Methionin beginnend bis zum Ende, ermittelt worden sind, wobei sich die Größe und das MG auf die bzw. das des gesamten ORF beziehen.

ORF	1. Triplett	Met	Stopp	Keine Aminosäuren	^MGberechnet
gag	312	336	1836	500	55841
pol	1631	1934	4640	(1003)	(113629)
ORF-Q	4554	4587	5163	192	22487
env	5746	5767	8350	861	97376
ORF-F	8324	8354	8972	206	23316

Tabelle 1: Lage und Größen von viralen offenen Leserahmen.
Die Anmeldung offenbart insbesondere alle DNA-Fragmente, auf die hier vorstehend genauer Bezug genommen worden ist und die offenen Leserastern entsprechen. Es versteht sich von selbst, dass ein Fachmann fähig ist, diese alle zu erhalten, beispielsweise durch Spaltung einer vollständigen DNA, die dem gesamten Genom einer LAV-Art entspricht, zum Beispiel durch deren partielle oder vollständige Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym und durch anschließende Gewinnung der betreffenden Fragmente. Die unterschiedlichen, vorstehend beschriebenen DNAs können auch als eine Quelle von geeigneten Fragmenten verwendet werden. Es können die Verfahren verwendet werden, die hier nachstehend zur Isolierung der Fragmente beschrieben werden, die dann in den hier vorstehend beschriebenen Plasmiden eingeschlossen waren und nachfolgend zur DNA-Sequenzierung verwendet wurden.
Selbstverständlich können auch andere Verfahren verwendet werden. Einige davon sind in der am 19. September 1984 angemeldeten britischen Patentanmeldung Nr. 8423659 beispielhaft dargestellt worden. Es wird beispielsweise auf die nachstehend beschriebenen Verfahren Bezug genommen:

a) DNA kann mit geeigneten Selektionsmarkern durch mehrere Verfahren in Säugerzellen transfiziert werden: z. B. Calciumphosphat-Präzipitation, Polyethylenglycol oder Protoplastfusion.
b) DNA-Fragmente, die Genen entsprechen, können in Expressionsvektoren für E. coli, Hefe- oder Säugerzellen cloniert und die erhaltenen Proteine gereinigt werden.
c) Die provirale DNA kann zur Erzeugung von fusionierten Polypeptiden mit dem "shot-gun"-Verfahren (Fragmentierung) in prokaryontische Expressionsvektoren eingeführt werden. Rekombinant hergestellte, als Antigen kompetente Fusionsproteine können durch einfaches Absuchen der Rekombinanten mit anti-LAV-Antigen-Antikörpern identifiziert werden.

Die Anmeldung beschreibt ferner spezifischer DNA-Rekombinanten, insbesondere modifizierte Vektoren, die eine der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen einschließen und zur Transformation entsprechender Mikroorganismen oder Zellen, insbesondere eukaryontischer Zellen, beispielsweise Hefen, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, oder höherer eukaryontischer Zellen, insbesondere Säugerzellen, und zur Ermöglichung der Expression dieser DNA-Sequenzen in den entsprechenden Mikroorganismen oder Zellen angepasst sind.
Insbesondere offenbart die Anmeldung solche modifizierten rekombinanten DNA-Vektoren, die durch die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen modifiziert wurden und die fähig sind, höhere eukaryontische Zellen, insbesondere Säugerzellen, zu transformieren. Vorzugsweise wird eine der vorstehend beschriebenen Sequenzen unter die direkte Kontrolle eines Promotors gestellt, der in den Vektoren enthalten ist und der durch die Polymerasen der Zellen erkannt wird, so dass die ersten exprimierten Nucleotid-Codons den ersten Tripletts der vorstehend definierten DNA-Sequenzen entsprechen. Daher beschreibt diese Anmeldung auch die entsprechenden DNA-Fragmente, die durch ein geeignetes Verfahren aus LAV-Genomen oder entsprechenden cDNAs erhalten werden können. Ein derartiges Verfahren umfasst beispielsweise die Spaltung der LAV-Genome oder cDNAs durch Restriktionsenzyme, vorzugsweise auf der Höhe der Restriktionsstellen, die die Fragmente umgeben und nahe an ihren jeweiligen entgegengesetzten Enden liegen, die Gewinnung und Identifizierung der gesuchten Fragmente nach der Größe, falls erforderlich durch Überprüfung ihrer Restriktionskarten oder Nucleotidsequenzen (oder durch eine Reaktion mit monoclonalen Antikörpern, die spezifisch gegen Epitope gerichtet sind, die von den DNA-Fragmenten codierten Polypeptiden getragen werden), und ferner, falls erforderlich, die Verkürzung der Enden der Fragmente beispielsweise durch ein exonucleolytisches Enzym, zum Beispiel Bal31, zum Zweck der Kontrolle der gewünschten Nucleotidsequenzen der DNA-Fragment-Enden oder umgekehrt die Reparatur der Enden mit dem Klenow-Enzym und gegebenenfalls die Ligierung der letzteren an synthetische Polynucleotid-Fragmente, die so gestaltet sind, um die Rekonstitution der Nucleotid-Enden der Fragmente zu ermöglichen. Diese Fragmente können anschließend in einen der Vektoren inseriert werden, um die Expression des entsprechenden Polypeptids durch die damit transformierte Zelle zu bewirken. Das entsprechende Polypeptid kann anschließend aus den transformierten Zellen gewonnen werden, gegebenenfalls nach deren Lyse, und durch Verfahren, beispielsweise die Elektrophorese, gereinigt werden. Es ist unnötig zu erwähnen, dass alle üblichen Verfahren zur Durchführung dieser Arbeitsschritte verwendet werden können.
Die Anmeldung beschreibt spezifischer auch clonierte Sonden, die ausgehend von jedem hierin beschriebenen DNA-Fragment hergestellt werden können, und somit rekombinante DNA-Moleküle, die solche Fragmente enthalten, insbesondere alle Plasmide, die in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen amplifizierbar sind und die Fragmente tragen.
Unter Verwendung der clonierten DNA-Fragmente als eine molekulare Hybridisierungs-Sonde – entweder durch Markierung mit Radionucleotiden oder mit fluoreszierenden Reagenzien – kann LAV-Virion-RNA im Blut, in Körperflüssigkeiten und Blutprodukten (z. B. von anti-hämophilen Faktoren wie Faktor VIII-Konzentraten) und in Impfstoffen, z. B. im Hepatis B-Impfstoff, direkt nachgewiesen werden. Es wurde bereits gezeigt, dass das gesamte Virus in Kulturüberständen von LAV-produzierenden Zellen nachgewiesen werden kann. Ein geeignetes Verfahren, um diesen Nachweis durchzuführen, umfasst die Immobilisierung des Virus auf einem Träger, z. B. unter anderem auf Nitrocellulose-Filtern, das Aufbrechen des Virions und die Hybridisierung mit markierten (radioaktiv-markierten oder "kalten" Fluoreszenz- oder Enzymmarkierten) Sonden. Eine derartige Vorgehensweise ist bereits für das Hepatitis B-Virus im peripheren Blut entwickelt worden (gemäß Scotto, J. et al., Hepatology 3 (1983), 379–384).
In der Anmeldung offenbarte Sonden können auch zum schnellen Absuchen von genomischer DNA verwendet werden, die aus Gewebe von Patienten mit LAV-assoziierten Symptomen stammt, um festzustellen, ob die provirale DNA oder RNA in Wirtsgeweben und weiteren Geweben vorhanden ist.
Ein für derartiges Absuchen verwendbares Verfahren umfasst die nachstehend beschriebenen Schritte: Extraktion von DNA aus dem Gewebe, Restriktionsenzym-Spaltung der DNA, Elektrophorese der Fragmente und Southern-Blotting von genomischer DNA aus Geweben, und anschließende Hybridisierung mit markierter, clonierter proviraler LAV-DNA. Eine Hybridisierung in situ kann ebenfalls verwendet werden.
Lymphatische Flüssigkeiten und Gewebe und weitere nicht-lymphatische Gewebe von Menschen, Primaten und anderen Säugerarten können auch abgesucht werden, um festzustellen, ob weitere evolutionär verwandte Retroviren existieren. Die vorstehend beschriebenen Verfahren können verwendet werden, obwohl Hybridisierung und Waschen unter nicht-stringenten Bedingungen durchgeführt werden würden.
Die in der Anmeldung offenbarten DNAs oder DNA-Fragmente können auch zur Durchführung der Expression von viralen LAV-Antigenen zu diagnostischen Zwecken verwendet werden.
Die Erfindung betrifft allgemein die Polypeptide als solche, ohne zu unterscheiden, ob sie chemisch synthetisiert, aus viralen Präparationen isoliert oder durch die unterschiedlichen erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere durch die ORFs oder Fragmente davon, in geeigneten Wirten, insbesondere in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten, nach der Transformation mit einem geeigneten Vektor, der zuvor durch die entsprechenden DNA-Moleküle modifiziert worden ist, exprimiert werden.
Die Erfindung betrifft generell auch jedes der Polypeptid-Fragmente (oder Moleküle, besonders Glycoproteine, die dasselbe Polypeptid-Rückgrat wie die hier vorstehend beschriebenen Polypeptide aufweisen), die ein für ein LAV-Protein oder -Glycoprotein charakteristisches Epitop tragen, wobei das Polypeptid oder Molekül dann N-terminale bzw. C-terminale Enden aufweist, die frei oder unabhängig voneinander kovalent an Aminosäuren gebunden sind, die andere als diejenigen sind, die normalerweise in den größeren Polypeptiden oder Glycoproteinen der LAV-Viren mit ihnen verbunden sind, wobei die zuletzt beschriebenen Aminosäuren dann frei sind oder zu einer anderen Polypeptidsequenz gehören. Insbesondere betrifft die Erfindung Hybrid-Polypeptide, die jegliche der hier vorstehend spezifischer beschriebenen, Epitop-tragenden Polypeptide enthalten, rekombiniert mit anderen, normalerweise zu den LAV-Proteinen fremden Polypeptid-Fragmenten, die Größen aufweisen, welche ausreichen, um eine erhöhte Immunogenität der Epitop-tragenden Polypeptide zu liefern, wobei die fremden Polypeptid-Fragmente entweder als Immunogen inert sind oder die immunogenen Eigenschaften der Epitop-tragenden Polypeptide nicht stören.
Derartige Hybrid-Polypeptide, die bis zu 150 und sogar 250 Aminosäuren enthalten können, bestehen üblicherweise aus den Expressions-Produkten eines Vektors, der ab initio eine Nucleinsäure-Sequenz enthielt, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder Replikons in einem geeigneten Wirt exprimierbar ist, wobei die Nucleinsäure-Sequenz jedoch zuvor durch Insertion einer DNA-Sequenz modifiziert worden war, die das Epitop-tragende Polypeptid codiert.
Die Epitop-tragenden Polypeptide, insbesondere die, deren N-terminale und C-terminale Aminosäuren frei sind, sind auch durch chemische Synthese zugänglich, und zwar gemäß Verfahren, die in der Proteinchemie gut bekannt sind.
Die Synthese von Peptiden in homogener Lösung und in fester Phase ist gut bekannt.
Diesbezüglich kann auf das Syntheseverfahren in homogener Lösung zurückgegriffen werden, das von Houbenweyl in der Arbeit mit dem Titel "Methoden der Organischen Chemie" Hrsg. E. Wunsch, Bd. 15-I und II, Thieme, Stuttgart 1974, beschrieben wurde.
Dieses Syntheseverfahren besteht aus einer schrittweisen Kondensierung von jeweils zwei einzelnen aufeinanderfolgenden Aminosäuren in der geeigneten Reihenfolge oder von zuvor verfügbaren oder hergestellten, aufeinanderfolgenden Peptidfragmenten, die bereits mehrere Aminoacyl-Reste in der jeweils richtigen Reihenfolge enthalten. Abgesehen von den Carboxyl- und Aminogruppen, die an der Bildung der Peptidbindungen beteiligt sind, muss Sorge dafür getragen werden, dass alle anderen reaktionsfähigen Gruppen, die von diesen Aminoacyl-Gruppen oder Fragmenten getragen werden, zuvor geschützt werden. Vor der Bildung der Peptidbindungen ist es jedoch vorteilhaft, die Carboxylgruppen gemäß den in der Peptidsynthese vertrauten Verfahren zu aktivieren. In einer anderen Ausführungsform kann auf Kupplungsreaktionen zurückgegriffen werden, die übliche Kupplungsreagenzien ins Spiel bringen, beispielsweise vom Carbodiimid-Typ, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Wenn die verwendete Aminosäuregruppe eine weitere Aminogruppe (z. B. Lysin) oder eine weitere Säurefunktion (z. B. Glutaminsäure) trägt, können diese Gruppen durch Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, bezüglich der Aminogruppen, oder durch t-Butylester-Gruppen, hinsichtlich der Carboxyl-Gruppen, geschützt werden. Ähnliche Verfahren sind zum Schutz von weiteren reaktiven Gruppen verfügbar. Es können beispielsweise SH-Gruppen (z. B. im Cystein) durch eine Acetamidomethyl- oder Paramethoxybenzyl-Gruppe geschützt werden.
Bei fortschreitender Synthese, Aminosäure für Aminosäure, beginnt die Synthese vorzugsweise durch die Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die der benachbarten Aminoacyl-Gruppe in der gewünschten Sequenz entspricht usw, Schritt für Schritt, bis zur N-terminalen Aminosäure. Ein weiteres verlässliches, bevorzugtes Verfahren ist das von R. D. Merrifield in "Solid Phase Peptide Synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149–2154) beschriebene Verfahren.
Im Merrifield-Verfahren wird die erste C-terminale Aminosäure der Kette mit Hilfe ihrer Carboxylgruppe an ein geeignetes, poröses polymeres Harz fixiert, worauf die Aminogruppe der Aminosäure beispielsweise durch eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt wird.
Wenn die erste C-terminale Aminosäure so an das Harz gebunden worden ist, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe durch Waschen des Harzes mit einer Säure, d. h. Trifluoressigsäure, entfernt, falls die Schutzgruppe der Aminogruppe eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe ist.
Anschließend wird die Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure, die die zweite Aminoacyl-Gruppe der gewünschten Peptidsequenz liefern soll, an die Aminogruppe, von der die Schutzgruppe entfernt wurde, der an das Harz gebundenen, C-terminalen Aminosäure gekoppelt. Vorzugsweise ist die Carboxylgruppe dieser zweiten Aminosäure aktiviert worden, beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, während seine Aminogruppe geschützt worden ist, zum Beispiel durch eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe. Der erste Teil der gewünschten Peptidkette, der die ersten beiden Aminosäuren umfasst, wird so erhalten. Wie vorstehend beschrieben, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe anschließend entfernt, und es kann mit der Bindung der nächsten Aminoacyl-Gruppe und so weiter fortgefahren werden, bis das gesamte gewünschte Peptid erhalten wird.
Die Schutzgruppen der unterschiedlichen Seitengruppen (falls vorhanden) der so gebildeten Peptidkette können anschließend entfernt werden. Das gesuchte Peptid kann anschließend vom Harz gelöst werden, beispielsweise durch Fluorwasserstoffsäure, und schließlich nach üblichen Verfahren in reiner Form aus der Säurelösung gewonnen werden.
Hinsichtlich der Peptidsequenzen von kleinster Größe, die ein Epitop oder eine immunogene Determinante tragen, und insbesondere derjenigen, die durch chemische Synthese leicht zugänglich sind, kann es zur Erhöhung ihrer immunogenen in-vivo-Eigenschaften erforderlich sein, sie kovalent an ein physiologisch verträgliches und nicht-toxisches Träger-Molekül zu koppeln oder zu konjugieren.
Als Beispiele von Träger-Molekülen oder macromolekularen Trägern, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendet werden können, werden natürliche Proteine erwähnt, beispielsweise Tetanus-Toxoid, Ovalbumin, Serumalbumine und Hämocyanine. Synthetische macromolekulare Träger, beispielsweise Polylysine oder Poly(D-L-Alanin)-poly(L-Lysin)-Moleküle können ebenfalls verwendet werden.
Weitere Arten von verwendbaren macromolekularen Trägern, die üblicherweise Molekulargewichte von mehr als 20.000 aufweisen, sind aus der Literatur bekannt.
Die Konjugate können durch bekannte Verfahren synthetisiert werden, die beispielsweise von Frantz und Robertson in "Infect. and Immunity" 33 (1981), 193–198, oder von P. E. Kauffman in Applied and Environmental Microbiology, Oktober 1981, Bd. 42, Nr. 4, 611–614, beschrieben werden.
Es können beispielsweise die nachstehend genannten Kopplungs-Wirkstoffe verwendet werden: Glutaraldehyd, Ethylchlorkohlensäureester, wasserlösliche Carbodiimide (N-Ethyl-N'(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, HCl), Diisocyanate, bis-Diazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine, Bromcyane, Benzochinon ebenso wie Kopplungs-Wirkstoffe, die in "Scand. J. Immunol." 8 (1978), 7–23, (Avrameas, Ternynck, Guesdon) erwähnt werden.
Es kann jedes Kopplungsverfahren zur Bindung einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Peptids auf der einen Seite und einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Trägers auf der anderen Seite verwendet werden. Auch hier ist es vorteilhaft, die Kopplung in Gegenwart eines in der Proteinsynthese verwendeten Kopplungs-Wirkstoffs, d. h. z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder N-Hydroxybenzotriazol, zwischen den Carboxyl- und Aminogruppen durchzuführen, die im Peptid und im Träger oder umgekehrt enthalten sind. Die Kopplung zwischen Aminogruppen, die im Peptid bzw. im Träger enthalten sind, kann, wenn der Träger Hämocyanin ist, auch mit Glutaraldehyd beispielsweise gemäß dem von Boquet, P. et al. Molec. Immunol. 19 (1982), 1441–1549, beschriebenen Verfahren erreicht werden.
Die Immunogenität von Epitop-tragenden Peptiden kann auch durch ihre Oligomerisierung, beispielsweise in Gegenwart von Glutaraldehyd oder eines anderen geeigneten Kupplungs-Wirkstoffs verstärkt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung so erhaltene wasserlösliche immunogene Oligomere, die besonders 2 bis 10 monomere Einheiten umfassen.
Die Glycoproteine, Proteine und Polypeptide (üblicherweise hier nachstehend als erfindungsgemäße "Antigene" bezeichnet, die mithilfe der rekombinanten DNA-Technologie in gereinigtem Zustand erhalten werden) sind in Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von anti-LAVAntikörpern in biologischen Medien, insbesondere biologischen Flüssigkeiten, beispielsweise Seren vom Menschen oder von Tieren, insbesondere im Hinblick auf die mögliche Diagnose von LAS oder AIDS nützlich.
Insbesondere offenbart die Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose unter Verwendung eines Hüll-Glycoproteins (oder eines Polypeptids, das ein Epitop dieses Glycoproteins trägt) zum Nachweis von anti-LAV-Antikörpern in Seren von Personen, die sie tragen. Andere Polypeptide – insbesondere die, die ein Epitop eines Kernproteins tragen – können erfindungsgemäß auch verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst:

– Platzieren einer bekannten Menge eines oder mehrerer Antigene in den Vertiefungen einer Microtiterplatte;
– Einführung von ansteigenden Verdünnungen der biologischen Flüssigkeit, d. h. Serum zur Diagnose in diesen Vertiefungen;
– Inkubation der Microtiterplatte;
– Sorgfältiges Waschen der Microtiterplatte mit einem geeigneten Puffer;
– Zugabe von spezifischen, markierten Antikörpern gegen Immunglobuline des Blutes in die Vertiefungen; und
– Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes, der dann die Gegenwart von LAV-Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit anzeigt.

Es ist vorteilhaft, die anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym zu markieren, das aus denen ausgewählt wird, die zur Hydrolyse eines Substrat fähig sind, wobei das Substrat wenigstens innerhalb eines bekannten Wellenlängenbereichs eine Veränderung seiner Strahlungsabsorption erfährt. Der Nachweis des Substrats, vorzugsweise im Vergleich mit einer Kontrolle, liefert anschließend einen Messwert der potentiellen Risiken oder des tatsächlichen Vorhandenseins der Krankheit.
Derartige bevorzugte Verfahren sind immunenzymatische Nachweise oder auch Immunfluoreszenz-Nachweise, insbesondere gemäß dem ELISA-Verfahren. Titrationen können durch Immunfluoreszenz oder direkte oder indirekte immunenzymatische Bestimmungen nachgewiesen werden. Es ist möglich, quantitative Titrationen von Antikörpern in den untersuchten Seren durchzuführen.
Die Erfindung betrifft auch Diagnose-Kits als solche zum in-vitro-Nachweis von anti-LAV-Virus-Antikörper, wobei die Kits neben irgendeinem der hier genannten Polypeptide und sämtlichen biologischen und chemischen Reagenzien auch die notwendige Ausstattung zur Durchführung diagnostischer Tests umfassen. Bevorzugte Kits umfassen sämtliche Reagenzien, die zur Durchführung der ELISA-Tests erforderlich sind. Derart bevorzugte Kits werden neben einem der Polypeptide auch geeignete Puffer und anti-Mensch-Immunglobuline einschließen, wobei die anti-Mensch-Immunglobuline entweder mit einem immunfluoreszierenden Molekül oder einem Enzym markiert werden. Im letzten Fall umfassen bevorzugte Kits dann auch ein Substrat, das durch das Enzym hydrolysierbar ist und ein Signal liefert, insbesondere eine veränderte Absorption einer Strahlung, mindestens in einer bekannten Wellenlänge, wobei das Signal anschließend das Vorhandensein eines Antikörpers in der mit diesem Kit zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit anzeigt.
Die Anmeldung beschreibt auch Impfstoffzusammensetzungen, deren Wirkstoff aus einem beliebigen der Antigene besteht, d. h. aus den hier vorstehend offenbarten vollständigen Polypeptid-Antigenen, Fusionspeptiden oder Oligopeptiden in Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutisch oder physiologisch verträglichen Träger.
Ein erster Typ des bevorzugten Wirkstoffs ist das gp110-Immunogen.
Weitere bevorzugte Wirkstoffe, die in diesem Bereich in Betracht kommen, bestehen aus Peptiden, die weniger als 250, vorzugsweise weniger als 150 Aminosäuren enthalten, die aus den vollständigen Genomen der LAV-Viren ableitbar sind, und noch stärker bevorzugt aus Peptiden, die eine oder mehrere Gruppen enthalten, die aus Asn-X-Ser und Asn-X-Ser, wie vorstehend definiert, ausgewählt sind. Anhand eines Beispiels, das nicht begrenzend sein soll, kann erläutert werden, dass geeignete Dosierungen der Impfstoffzusammensetzungen im Wirt, insbesondere einem menschlichen Wirt, in vivo wirksam Antikörper erzeugen sollen. Geeignete Dosierungen reichen von 10 bis 500 Mikrogramm Polypeptid, Protein oder Glycoprotein pro Kilogramm, beispielsweise 50 bis 100 Mikrogramm pro Kilogramm.
Die unterschiedlichen erfindungsgemäßen Peptide können selbst auch zur Produktion von Antikörpern, vorzugsweise monoclonalen Antikörpern, die für die jeweils unterschiedlichen Peptide spezifisch sind, verwendet werden. Zur Herstellung von Hybridomen, die die monoclonalen Antikörper sekretieren, werden übliche Herstellungs- und Absuchverfahren verwendet. Diese monoclonalen Antikörper, die selbst Teil der Erfindung sind, liefern dann sehr nützliche Werkzeuge zur Identifizierung und selbst zur Bestimmung der relativen Verhältnisse der unterschiedlichen Polypeptide oder Proteine in biologischen Proben, insbesondere Proben vom Menschen, die LAV oder verwandte Viren enthalten.
Die Anmeldung beschreibt Wirte (prokaryontische oder eukaryontische Zellen), die durch die vorstehend beschriebenen Rekombinanten transformiert sind und die fähig sind, die DNA-Fragmente zu exprimieren.
Schließlich beschreibt die Anmeldung auch Vektoren zur Transformation von eukaryontischen Zellen menschlichen Ursprungs, insbesondere von Lymphocyten, deren Polymerasen fähig sind, die LTRs von LAV zu erkennen. Insbesondere sind die Vektoren durch die Gegenwart einer darin enthaltenden LAV-LTR gekennzeichnet, wobei die LTR dann als ein Promotor aktiv ist, der unter seiner Steuerung in einem geeigneten Wirt die wirksame Transkription und Translation einer ein bestimmtes Protein codierenden DNA-Insertion ermöglicht.
Es ist unnötig darauf hinzuweisen, dass die Anmeldung sich auf sämtliche Genom-Varianten und die entsprechenden DNA-Fragmente (ORFs) erstreckt, die im Wesentlichen äquivalente Eigenschaften aufweisen, wobei sämtliche Genome zu Retroviren gehören, die als LAV-Äquivalente angesehen werden können.
Literaturhinweise

Alizon, M., Sonigo, P., Barré-Sinoussi, F., Chermann, J. C., Tiollais, P., Montagnier, L. und Wain-Hobson, 5. (1984). Molecular cloning of lymphadenopathy-associated virus. Nature, im Druck.
Arya, S. K., Gallo, R. C., Hahn, B H., Shaw, G. M., Popovic, M., Salahuddin, S. Z. und Wong-Staal, F. (1984). Homology of genome of AIDS-associated virus with genomes of human T-cell leukemia lymphoma viruses. Science 225, 927–930.
Barré-Sinoussi, F., Chermann, J. C., Rey, F., Nugeybe, M. T., Chamaret, S, Gruest, J., Dauguet, C., Axler-Blin, C., Vézinet-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbaum, W. und Montagnier, L. (1983). Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Science, 868–870.
Biggen, M. B., Gibson, T. J. und Hong, G. F. (1983). Buffer gradient gels and ³⁵S as an aid to rapid DNA sequence determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963–3965.
Bird, A. P. (1980). DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucl. Acids Res. E, 1499–1504.
Brun-Vézinet, F., Rouzioux, C., Barré-Sinoussi, F., Klatzmann, D., Salmot, A. G., Rozembaum, W., Montagnier, L. und Chermann, J. C. (1984). Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immuno-deficiency syndrome of lymphadenopathy syndrome. Lancet I, 1253–1266.
Chef, H. R. und Barker, W. C. (1984). Nucleotide sequences of the retroviral long terminal repeats and their adjacent regions. Nucl. Acids Res. 12, 1767–1779.
Chef, I. S. Y., Mc Laughlin, J., Gasson, J. C., Clark, S. C. und Golde, D. W. (1983). Molecular characterization of genome of a novel human T-cell leukaemia virus. Nature 305, 502–305.
Chiu, I. M., Callahan, R., Tronick, S. R., Scholm, J. und Aaronson, S. A. (1984). Major pol gene progenitors in the evolution of oncornaviruses. Science 223, 364–370.
Cianciolo, G. J., Kipnis, R. J. und Snyderman, R. (1987). Similarity between p15E of murine and feline viruses and p21 of HTLV. Nature 311, 515.
Daly, H. M. und Scott, G. L. (1983). Fatal AIDS in a haemophiliae in the U. K. Lancet II, 1190.
Dittmar, K. J. und Moelling, K. (1979). Biochemical properties of p15-associated protease in an avian RNA tumor virus. J. Virol. 28, 108–119.
Donehower, L. A., Huang, A. I. und Hager, G. L. (1981). Regulatory and coding potential of the mouse mammary tumour virus long terminal redundancy. J. Virol. 37, 226–238.
Gottlieb, M. S., Schroff, R., Schanler, H. M., Weisman, J. D., Fan P. T., Wolf, R. A., Saxon, A. (1981). Pneumocytis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: Evidence of a new acquired cellular immuno-deficiency. N. Engl. J. Med. 305, 1426–1431.
Hahn, B. H., Shaw, G. M., Arya, S. U., Popovic, M., Gallo, R.C. und Wong-Stall, F. (1984). Molecular cloning and characterization of the HTLV-III virus associated with AIDS. Nature 312, 166–169.
Harris, J. D., Scott, J. V., Taylor, B., Brahic, M., Stowring, L., Ventura, P., Haase, A. T. und Peluso, R. (1981). Visna virus DNA: discovery of a novel gapped structure. Virology 113, 573–583.
Kiyokawa, T., Yoshikura, H., Hattori, S., Secki, M. und Yoshida, M. (1984). Envelope proteins of human T-cell leukemia virus: expression in Escherischia coli and its application to studies of env gene functions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6202–6206.
Klatzmann, D., Barré-Sinoussi, F., Nugeyre, M. T., Dauguet, C., Vilmer, E., Griscelli, C., Brun-Vézinet, F., Rouzioux, C., Gluckman, J. C., Chermann, J. C. und Montagnier, L. (1984). Selective tropism of lymphadenopathy associated virus (LAV) for helper-inducer T-lymphocytes. Sciences 225, 59–63.
Kozak, M. (1984). Compilation and analysis of sequences upstream from the transcriptional start site in eucaryotic mRNAs. Nucl. Acids Res. 12, 857–872.
Levy, J. A., Hoffman, A. D., Kramer, S. M. Lanois, J. A., Shimabukuro, J. M. und Oskiro, L. S. (1984). Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS. Science 225, 840–842.
Masur, H., Michelis, M. A., Greene, J. B., Onovato, I., Van de Stowe, R. A., Holzman, R. S., Wormser, G., Brettman, L., Lange, M., Murray, H. W., Cunningham-Rundles, S. (1981). An outbreak of community-acquired pneumocystis carinii pneumonia: Initial manifestation of cellular immune dysfunction. N. Engl. J. Med. 305, 1431–1438.
Misra, T. K., Grandgenett, D. P. und Parsons, J. T. (1982). Avian retrovirus pp32 DNA-binding protein. I. Recognition of specific sequences on retrovirus DNA terminal repeats. J. Virol. 44, 330–343.
Montagnier, L. et al, (1984). A new human T-lymphotropic retrovirus: characterization and possible role in lymphadenopathy and acquired immune deficiency syndromes. In human T-cell leukemia/lymphoma viruses. R. C. Gallo, M. Essex and L. Gross, Hrsg. (Cold Spring Laboratory, New-York), S. 363–370.
Oroszian, S., Copeland, T. D., Kalyanaraman, V. S., Sarngadharan, M. G., Schultz, A. M. und Gallo, R. C. (1984). Chemical analysis of human T-cell leukemia virus structural proteins. In HTLVS (R. C. Gallo, M. E. Essex and L. Gross, Hrsg.) Cold Spring Laboratory, New-York, S. 101–110.
Plot, P., Quinn, T. C., Taelmann, H., Feinsod, F. M. et al., (1984). Acquired immunodeficiency syndrome in a heterosexual population in Zaire. Lancet II; 65–69.
Popovic, M., Sarngadharan, M. G., Read, E. und Gallo, R. C. (1984). Detection, isolation, and continous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224, 497–500.
Querat, C., Barban, N., Sauze, N., Filippi, P., Vigne, R., Russo, P. und Vitu, C. (1984). Highly lytic and persistent lentiviruses naturally present in sheep with progressive pneumonia are genetically distinct. J. Virol. 52, 672–679.
Raba, M., Limburg, K., Burghagen, M., Katze, J. R., Simsek, M., Heckman, J. E., Rajbhandary, U. L. und Gross, H. J. (1979). Nucleotide sequence of three isoaccepting lysine tRNAs from rabbit liver and SV40-transformed mouse fibroblasts. Eur. J. Biochem. 97, 305–318.
Rice, N. R., Stephens, R. M., Couez, D., Deschamps, J., Kettmann, R., Burny, A. und Gilden, R. V. (1984). The nucleotide sequence of the env gene and post- env region of bovine leukemia virus. Virology 138, 82–93.
Sagata, N., Yasunaga, T., Ogawa, Y., Tsuzuku-Kawamura, J. und Ikawa, Y. (1984). Bovine leukemia virus: Unique structural features of its long terminal repeats and its evolutionary relationship to human T-cell leukemia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 47410–4745.
Sanger, F., Nicklen, S. und Coulsen, A. R. (1977). DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467.
Schwartz, D. E., Tizard, R. und Gilbert, W. (1983). Nucleotide sequence of Rous sarcoma virus. Cell 32, 853–869.
Schüpbach, J., Popovic, M., Gilden, R. V., Gonda, M. A., Sarngadharan M. G. und Gallo, R. C. (1984). Serological analysis of a subgroup of human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS. Science 224, 503–505.
Seiki, M., Hattori, S., Hirayama, Y. und Yoshida, M. (1983). Human adult T-cell leukemia virus: complete nucleotide sequence of the provirus genome integrated in leukemia cell DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3618–3622.
Shaw, G. M., Hahn, B. H., Arya, S. K., Groopman, J. E., Gallo, R. C. und Wong-Staal, F. (1984). Molecular characterization of human T-cell leukemia lymphotropic) virus type III in the Acquired Immune Deficiency Syndrome. Science 226, 1165–1171.
Shimotohno, K. und Temin, H. M. (1982). Spontaneous variation and synthesis in the U3 region of the long terminal repeat of avion retroviruses. J. Virol. 41, 1636171.
Shimotohno, K., Golde, D. M., Miwa, M., Sugimura, T. und Chef, I. S. Y. (1984). Nucleotide sequence analysis of the long terminal repeat of human T-cell leukemia virus type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1079–1083.
Shinnick, T. M., Lerner, R. A. und Sutcliffe, J. G. (1981). Nucleotide sequence of Moloney murine leukemia viruse. Nature 293, 543–548.
Srinivasan, A., Reddy, E. P., Dunn, C. Y. und Aaronson, S. A. (1934). Molecular dissection of transcriptional control elements with the long terminal repeat of retrovirus. Science 223, 286–289.

Claims

Rekombinantes oder synthetisches GAG-Antigen, das aus der in 4a und 4b dargestellten Aminosäuresequenz besteht, die mit dem Rest Met an Position 336 beginnt und mit dem Rest Gln an Position 1836 endet.
Rekombinantes oder synthetisches GAG-Antigen nach Anspruch 1, das von dem offenen Leserahmen codiert wird, der der Nucleotidsequenz entspricht, die zwischen Nucleotid 336 and 1836 der in 4 dargestellten Nucleotidsequenz umfasst wird.
Polypeptidfragment eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das ein Epitop des Antigens trägt.
Polypeptid, das sich durch ein oder mehrere Aminosäuren von einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 unterscheidet, wobei es im Wesentlichen die gleichen immunologischen Eigenschaften hat.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das von Antikörpern erkannt wird, die im Serum von mit LAV infizierten Patienten enthalten sind.
Polypeptidfragment nach Anspruch 4, das mit einem physiologisch verträglichen und nicht toxischen Trägermolekül verknüpft ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das aus einem LAV-Virus-Präparat gereinigt wird.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinaten oder synthetischen Kernantigens, das als p25 bezeichnet wird, umfassend die Expression einer ORF-Sequenz nach Anspruch 2 in einer Zelle und das Erhalten eines Kernantigens, das ein bei einer Elektrophorese in SDS-Polyacrylamidgel offensichtliches Molekulargewicht von 25000 Da und die folgende NH₂-terminale Aminosäuresequenz hat: Pro Ile Val Gin Asn Ile Gin Gly Gin Met Val His Gin Ala Ile.
Verfahren zur chemischen Synthese eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch: – schrittweises Kondensieren entweder der aufeinanderfolgenden Aminosäuren in Zweiergruppen, in der richtigen Reihenfolge, oder von bereits vorhandenen bzw. gebildeten aufeinanderfolgenden Peptidfragmenten, die bereits verschiedene Aminoacylreste in der jeweils richtigen Reihenfolge enthalten, wobei alle reaktiven Gruppen außer den an der Bildung der Peptidbindung beteiligten Carboxyl- und Aminogruppen geschützt sind, – möglicherweise Aktivieren der Carboxylgruppen vor der Bildung der Peptidbindung, – Gewinnen des gebildeten Peptids oder Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung des Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch: – Transformation eines prokaryontischen oder eukaryontischen Wirts mit einem geeigneten Vektor, der zuvor durch eine DNA, die ein GAG-Antigen oder ein Polypeptidfragment nach den Ansprüchen 1 bis 9 codiert, unter Bedingungen modifiziert wurde, welche die Herstellung des gewünschten Peptids erlauben, – Gewinnen und Reinigen des so erhaltenen Antigens, z. B. durch Elektrophorese.
Verwendung eines Antigens, eines Polypeptids oder eines Polypeptidfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder Verwendung eines durch das Verfahren nach Anspruch 8 erhaltenen Polypeptids für den in vitro-Nachweis von Anti-LAV-Antikörpern.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Nachweis durch ELISA-Verfahren erbracht wird.
Kit zum Nachweis von Anti-LAV-Antikörpern, das ein Polypeptid oder ein Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und biologische oder chemische Reagenzien und Mittel umfasst, die für die Durchführung diagnostischer Tests notwendig sind.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Anti-LAV-Antikörpern in einem biologischen Medium, umfassend das Inkontaktbringen des biologischen Mediums mit einem Antigen, einem Polypeptid oder einem Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder einem Polypeptid, das durch ein Verfahren nach Anspruch 8 erhalten wurde, unter Bedingungen, die für eine Komplexbildung zwischen den Antikörpern und dem herzustellenden Polypeptid geeignet sind, und Nachweisen des Komplexes als Hinweis auf die Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit.
Verwendung der Antikörper, die ein Antigen, ein Polypeptid oder ein Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein durch ein Verfahren nach Anspruch 8 erhaltenes Polypeptid spezifisch erkennen, für deren Identifizierung oder auch zur Bestimmung des relativen Anteils des Antigens in einer biologischen Probe, die LAV oder ein verwandtes Virus enthält.
Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass das schützende Prinzip durch ein Antigen, ein Polypeptid oder ein Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein durch ein Verfahren nach Anspruch 8 erhaltenes Polypeptid gewährleistet wird.
Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen, ein Polypeptid oder ein Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein durch ein Verfahren nach Anspruch 8 erhaltenes Polypeptid, umfassend die Schritte: – Fusionieren von Myelomzellen mit Splenocyten eines zuvor mit diesem Antigen immunisierten Tiers, um Hybridome zu erhalten, – Auswählen der Hybridome, welche Antikörper mit Spezifität für das bei der Immunisierung verwendete Antigen haben, – Gewinnen der Antikörper gegen das bestimmte Antigen.