DK172814B1 - Antigener kodet af den gag-åbne aflæsningsramme (gag open reading frame) for LAV virus, anvendelse heraf ved fremstillingen - Google Patents

Description

i DK 172814 B1

Den foreliggende opfindelse angår polypeptider, hvad enten de er glycosylerede eller ikke, kodet af LAV-DNA. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til diagnosticering af antistoffer rettet mod LAV virus, et kit til 5 brug ved fremgangsmåden og en immunogenisk sammensætning indeholdende sådant polypeptid. DNA-sekvenser, der koder for sådanne polypeptider, en transformeret mikroorganisme, hvori sådanne DNA-sekvenser kan udtrykkes samt antistof rettet mod sådanne peptider er ligeledes oiufat-10 tet af den foreliggende opfindelse. 1 et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af antigener, der er kodet af gag open-reading frame'en for sådanne vira.

15 Det kausative agens for LAV (Virus of Lymphadenopathies Syndrome) eller AIDS (Aquired Immunodeficiency Syndrome) (A, et retrovirus er blevet identificeret af F. BARRE-SINOUSSI et al., Science, 220, 868 (1983), Det har følgende egenskaber. Det er T-lymphotropt; dets foretrukne 20 mål udgøres af Leu 3 celler (eller T4 lymphocytter); det har omvendt transcriptase-aktivitet, hvilket nødvendiggør tilstedeværelsen af Mg+ og udviser stærk affinitet over for poly(adenylat-oligodeoxy-thymidylat) (poly(A)- ~ oligo(dT) 12-18). Det har en densitet på 1,16-1,17 i en 25 sucrosegradient, en gennemsnitsdiameter på 139 nanometer; og en kerne, der har en gennemsnitsdiameter på 41 nanometer. Antigener af dette virus, specielt et protein p25, genkendes immunologisk af antistoffer, der findes i sera udvundet fra patienter, der er inficeret med LAV 30 eller AIDS. p25-proteinet, der er et kerneprotein, genkendes ikke immunologisk af p24-protein af HTLVI og II vira. Viruset er også uden et pl9-protein, der er immunologisk krydsreaktivt med p!9-proteiner fra HTLVI og HTLVII.

ψ 35 2 DK 172814 B1 r

Retrovira af denne type (somme tider betegnet med den generiske forkortelse LAV) er deponeret i National Collection of Microorganism Cultures of the INSTITUT PASTEUR of Paris, under numrene 1-232, 1-240 og 1-241. Virusstammer 5 lig med LAV i alle henseender set ud fra morfologisk og immunologisk synspunkt er isoleret i andre laboratorier.

Der henvises herved til f.eks. retrovirusstammer betegnet HTLV-III isoleret henholdsvis af R.C. GALLO et al.,

Science, 224, 500 (1984) og af M.G. SARNGADHARAN et al., 10 Science 224, 506 (1984) og retrovirus isoleret af M. JAY LEVY et al., Science, 25, 840-842 (1984), hvilket virus er blevet betegnet ARV. For at lette sprogbrugen vil de sidstnævnte vira, såvel som andre, der har ækvivalente morfologiske og immunologiske 15 egenskaber, i det efterfølgende blive betegnet under den generiske betegnelse "LAV". Der henvises også til europæisk patentansøgning indleveret 14. september 1984 med prioritet fra engelsk patentansøgning nr. 83 24800 indleveret 15. september 1983 med hensyn til en mere detalje-20 ret beskrivelse af LAV retrovira eller lignende og i anvendelser, som ekstrakterne af disse vira giver anledning til.

Til at begynde med var kerne-antigenerne hovedantigenerne 25 af de viruslysater eller ekstrakter, der blev genkendt af serum fra patienter inficeret med AIDS eller LAV i de forsøgssystemer, der på det tidspunkt blev anvendt. Et p42-protein, som viste sig at bestå af et kappeprotein, var også blevet påvist. På samme måde har GALLO et al på-30 vist et p41-protein, der også anses for at være en mulig komponent af viruskappen.

Fremgangsmåder til at opnå et LAV-virus er også blevet beskrevet. Der henvises specielt til den allerede nævnte 35 artikel af F. BARRE-SINOUSSI et al., med hensyn til præparationen af viruset i T-lymphocytkulturer stammende en- 3 DK 172814 B1 ten fra blod eller fra navlestrengen eller også fra knoglemarvsceller fra voksne raske donorer. Denne metode omfatter specielt følgende essentielle trin: 5 frembringelse af en viral infektion af disse T-lymphocyt-ter efter aktivering af et lectin mitogen med en viral suspension stammende fra en urenset supernatant væske af lymphocytter, der frembringer viruset (til at begynde med opnået fra en patient inficeret med LAV eller AIDS), 10 dyrkning af celler inficeret med TCGF i nærvær af anti-a-interferonfåreserum, rensning af det frembragte virus (produktionen starter 15 sædvanligvis mellem den 9. og 15. dag efter infektion og varer fra 10 til 15 dage), idet rensningen omfatter udfældningen af virus i polyethylenglycol for at frembringe en første koncentration af viruset, herefter centrifugering af det opnåede præparat i en 20-60¾ saccharosegradi-20 ent eller i en isotonisk gradient af metrizanid (forhandlet under handelsnavnet NYCODENS af NYEGåRD, Oslo) og udvinding af viruset med det bånd, der har en densitet på 1,16-1,17 i saccharosegradienten olier på 1,10-1,11 i Ny-codensgradienten.

25 LAV-viruset kan også frembringes ud fra permanente cellelinier af type T som f.eks. CEM-linien eller ud fra B-lymphoblastoide cellelinier f.eks. opnået ved transformation af lymphocytterne stammende fra en rask donor med 30 Epstein-Barr-viruset, f.eks. som beskrevet i fransk patentansøgning nr. 84 07151 indleveret 9. maj 1984. De frembragte permanente cellelinier frembringer kontinuert et virus (betegnet LAV-B, når det drejer sig om B-lym-phoblastoid-cellelinierne), der er i besiddelse af de es-; 35 sentielle antigene og morfologiske træk fra LAV-vira (bortset fra, at det er indsamlet i et densitetsbånd, der 4 DK 172814 B1 er lidt højere end i det forudgående tilfælde (specielt 1,18) i saccharose). Den endelige oprensning af viruset kan også udføres i en Nycodenzgradient.

5 En metode til at klone DNA-sekvenser, der kan hybridisere med det genome RNA fra LAV, er allerede blevet omtalt i engelsk patentansøgning nr. 84 23659 indleveret 19. september 1984. Der henvises herved til denne ansøgning, hvad angår materiale, der er fælles for nævnte ansøgning 10 og nærværende ansøgnings yderligere forbedringer.

Den foreliggende opfindelse har til hensigt at tilvejebringe yderligere hidtil ukendte midler, som ikke alene er værdifulde til afsløring af LAV eller beslægtede vira 15 (i det efterfølgende meré generelt omtalt som "LAV-vira", men som også har større anvendelighed, specielt til afsløring af specifikke dele af det genome DNA af disse vira, hvis ekspressionsprodukter ikke altid direkte kan afsløres ved immunologiske metoder. Herudover tilveje-20 bringer opfindelsen metoder til at tilvejebringe polypep-tider indeholdende sekvenser fælles med polypeptider omfattende antigene determinanter indbefattet i proteinerne kodet og udtrykt af LAV-genomet, der forekommer i naturen. Desuden tilvejebringer opfindelsen metoder til af-25 sløring AIDS eller præ-AIDS eller i modsætning hertil metoder til afsløring af antistoffer over for LAV-viruset eller proteiner beslægtet hermed, specielt hos patienter, der er ramt af AIDS eller præ-AIDS eller mere generelt hos asymptomatiske bærere og i blodprodukter. Endelig har 30 opfindelsen også til hensigt at tilvejebringe immunogene polypeptider og mere specielt beskyttende polypeptider, der anvendes ved fremstillingen af vaccinepræparater mod AIDS eller beslægtede syndromer.

35 De nævnte vira kan fremstilles ved den følgende fremgangsmåde. Denne fremgangsmåde skelner sig væsentlig fra 5 DK 172814 B1 det ovenfor nævnte med hensyn til den endelige oprensning. Specielt omfatter denne fremgangsmåde udførselen af differentielle centrifugeringer udført direkte på den su-pernatante del af dyrkniiigssubstratet fra de producerende 5 celler. Disse centrifugeringer omfatter specielt en første centrifugering ved en vinkelcentrifugeringshastighed specielt ved 10000 omdr. pr. min., der muliggør fjernelse af ikke-virale bestanddele, mere specielt af cellebe-standdele, herefter en anden centrifugering ved højere 10 vinkelhastighed specielt ved 55000 omdr. pr. min., hvorved der opnås udfældningen af selve viruset. I en fore-trukken udførelsesform holdes den første centrifugering ved 10000 omdr. pr. min. i 10 minutter og den anden ved 45000 omdr. pr. min. i 20 minutter. Disse er naturligvis 15 kun vejledende værdier, idet det er naturligt for fagmanden at være i stand til at modificere centrifugeringsbetingelserne til opnåelse af adskillelse af de cellulære bestanddele fra de virale bestanddele.

20 Denne modifikation af oprensningen bevirker frembringelsen af virale præparater, ud fra hvilke det nævnte antigen lettere kan isoleres end fra viruspræparater, der er frembragt ved de tidligere nævnte metoder. Under alle omstændigheder er de vira, der opnås til slut ved den om-25 handlede fremgangsmåde, lettere genkendt af sera fra patienter eller fra personer, der har været udsat for LAV-viruset eller for morfologisk og antigent lignende stammer.

30 De omhandlede antigener kan selv fås fra ovennævnte omhandlede vira ved lyse (eller anden passende bearbejdning) af sidstnævnte i nærværelse af en hvilket som helst passende detergent eller ved udvindelse og fraskillelse af de frigjorte antigener. Med fordel udføres lysen af 35 virus i nærværelse af aprotinin eller et hvilket som helst andet middel, der er i stand til at hæmme indvirk- 6 DK 172814 B1 ningen af proteaser. Fraskillelsen af de omhandlede antigener kan udføres ved i og for sig kendte metoder; f.eks. er det muligt at gå videre med adskillelsen af proteinerne ved at anvende deres respektive forskellige vand-5 ringer i en forudbestemt gel, idet det ønskede protein herefter isoleres fra den zone af gelen, hvor den normalt ville findes ved en elektroforesebehandling under veldefinerede betingelser, idet man tager hensyn til dets mo-: lekylvægt.

10

Yderligere detaljer ved opfindelsen vil blive klarlagt i løbet af den efterfølgende beskrivelse, der beskriver isolering af et omhandlet virus og af antigener, idet der henvises til tegningen, hvor 15 fig. 1 er en fotografisk gengivelse af gelstrimler, der er anvendt til at udføre elektroforese af lysatekstrakter af T-lymphocytter, henholdsvis inficeret og uinficeret (kontroller) med en LAV-suspension, 20 fig. 2 er et restriktionskort af et komplet LAV-genom (clon kJ19), fig. 3a til 3e er den fuldstændige sekvens af et LAV-vi-25 ralt genom, fig. 4 og 5 viser skematisk dele af de tre mulige aflæsningsfaser af LAV-genomt RNA, herunder de åbne aflæsningsrammer (open reading frame, ORF) der forekommer i 30 hver af aflæsningsfaserne, og fig. 6 er en skematisk afbildning af den LAV lange endestillede gentagelse (LTR).

35 T-lymphocytter stammende fra en rask donor og inficeret med LAV 1 under betingelserne beskrevet af F. Barré-Si- 11 7 DK 172814 B1 noussi et Coll., på CEM-celler stammende fra en patient, der er ramt af leukæmi, og også inficeret in vitro med LAV 1, dyrkedes i et substrat indeholdende 200 mikrocurie 3*S-cystein og uden umærket cystein. De inficerede lym-5 phocytter dyrkedes i et ikke-denaturerende substrat for at forhindre nedbrydning af det ønskede antigen. Den su-pernatante væske fra dyrkningssubstratet underkastedes herefter en første centrifugering ved 10000 omdr. pr. min. i 10 minutter for at fjerne ikke-virale komponenter, 10 herefter en anden centrifugering med 45000 omdr. pr. min. i 20 minutter for at bundfælde viruset. Viruspelleten lyseredes herefter med detergent i nærværelse af aprotinin (5%) specielt under de betingelser, der er beskrevet i artiklen af F. Barré-Sinoussi et Coll.

15

Den samme behandling blev gentaget på lymphocytter, der var opnået fra en rask donor som kontrol.

De forskellige lysater imlnunopræcipiteredes herefter med 20 serum fra patienter inficeret mod AIDS eller LAV. Sera, der stammede fra raske donorer eller fra donorer inficeret med andre sygdomme, immunopræcipiteredes også. Herefter underkastedes substratet elektroforese i en SDS-poly-acrylamidgel.

25

Resultaterne er angivet i fig. 1. Gelstrimlerne nummereret fra 1 til 6 opnåedes fra præparater mærket med 3*S-cystein. Strimlerne nummereret 7 til 10 viser resultater opnået på inficerede eller uinficerede lymphocyt-præpara-30 ter mærket med ?r‘S-methionin. Endelig svarer strimlen M til vandringsafstanden for de ovennævnte identificerede standardproteiner, hvis molekylvægt er angivet i den højere del af figuren.

35 Henvisning til de mærkede virale proteiner angives i figurens venstre side.

8 DK 172814 B1

Det skal bemærkes, at kolonne 7 til 10 viser det specifikke protein p25 af LAV mærket med ^S-methionin. Det samme protein mangler på strimmel S til 10 svarende til 5 resultater opnået med et præparat, der stammer fra raske lymphocytter.

Kolonne 3 og 5 svarer til resultaterne, der er observeret på præparater opnået fra lymphocytter inficeret og mærket 10 med 3'S-cystein. Proteinerne p25 og pl8, de karakteristiske kerneproteiner af LAV, og glycoprotein gpllO, også specifikt for LAV, fandtes også. Afbildninger svarende til et protein p41 (molekylvægt af størrelsesordenen 41000) forekom i de forskellige præparater, skønt mindre 15 distinkt.

Viruset kan enten udfældes med lectiner, specielt conca-navalin A, eller bindes til en Sepharose-concanavalin Λ søjle.

20

Beliggenheden af de efter hinanden anbragte pladser på-hele LAV-genomet (se også restriktionskortet over XJ19 i fig. 1) er angivet i det efterfølgende i forhold til Hindlll-pladsen (valgt som beliggenhed 1), der er belig-25 gende i R-regionen. Beliggenhederne er bestemt med en nøjagtighed på _+200 bp:

Hind III 0

Sac I 50 30 Hind III 520

Pst I 800

Hind III 1100

Bgl II 1500 Κηρ I 3500 35 Κηρ I 3900

Eco RI 4100 i :* ri 9 DK 172814 B1

Eco Rt 5300

Sal I 5500 Κηρ I 6100

Bgl II 6500 5 Bgl II 7600

Hind III 7850

Baro HI 8150

Xho I 8600 Κηρ I 8700 *0 Bgl II 8750

Bgl II 9150

Sac I 9200

Hind III 9250 15 En anden DNA-variant af dette virus indholder evt. en yderligere Hindlll omtrent ved den 5550's beliggenhed.

Der henvises yderligere til fig. 1, der viser et mere detaljeret restriktionskort over hele denne DNA (XJ19).

20 En yderligere detaljeret nucleotidsekvens af en foretruk-kent DNA er angivet i figurerne 4a-4e.

Opfindelsen angår yderligere andre foretrukne DNA-frag-menter og polypeptidsekvenser (glycosyleret eller ikke-25 glycosyleret), der vil blive omtalt i det efterfølgende.

Sekvensbedømroelse og bestemmelse af pladserne af særlig interesse udførtes på en fag-rekombinant svarende til XJ19 omhandlet i nævnte britiske patentansøgning nr.

30 84 23659. En metode til fremstilling heraf er omtalt i denne ansøgning.

Hele rekombinant-fag DNA fra klon \J19 (oiuhandlet i den tidligere ansøgning) lydbehandledes som beskrevet i for-35 søgsrapporten af DEININGER (1983), Analytical Biochero.

129, 216. DNA blev repareret ved hjælp af en Klenow-reak- DK 172814 B1 ΙΟ tion i 12 timer ved 16°C. DNA' et blev elektroforese-be-handlet gennem en 0,8% agarosegel, og DNA i størrelsesom-: rådet 300-600 bp blev udskåret og elektroelueret og ud fældet. Genopslæmmet DNA (i 10 mM Tris, pH 8; 0,1 mM 5 EDTA) ligeledes ind i M13mp8 RF DNA (afskåret med restriktionsenzymet Smal cg herefter alkalisk phosphate-ret), idet der anvendtes T4 DNA- og RNA-ligaser (Maniatis i T et al. (1982) - Molecular cloning - Cold Spring Harbor Laboratory). En E. coli-stamme betegnet TGI anvendtes til : 10 yderligere undersøgelse. Denne stamme havde følgende ge notype: Alac pro, supE, thi. F'traD36, proAB, lacl1, ; ΖΔΜ15, r*.

Denne E. coli TGl-stamme havde den særhed, at den mulig-15 gjorde, at rekombinanter let kunne genkendes. Den blå farve af cellerne overført med plasmider, der ikke rekom-binerer med et fragment af LAV DNA er ikke modificeret. I modsætning hertil giver celler behandlet med et rekombi-nantplasmid indeholdende et LAV DNA-fragment hvide kolo-20 nier. Metoden, der anvendtes, er omhandlet i (Gene (1983), 26, 101.

Denne stamme transformeredes med ligationsblandingen under anvendelse af Hanahanmetodon (Hanahan D (1983) J.

25 Mol. Biol. 166, 557). Celler blev udpladet på en tryp- tose-agaroseplade med IPTG og X-gal i blød agarose. Hvide plaque blev enten udtaget og undersøgt eller undersøgt direkte in situ under anvendelse af nitrocellulosefiltre.

Deres DNA blev hybridiseret med nick-translateret DNA-30 indskud af pUC18 Hindlll subkloner af kJ19. Dette muliggjorde isoleringen af plasmider eller subkloner af λ, der er identificeret i den efterfølgende tabel. Med hensyn til denne tabel skal det bemærkes, at betegnelsen for hver plasmid er efterfulgt af deponeringsnummeret for en 35 cellekultur af E. coli TGI indeholdende det tilsvarende plasmid i "Collection Nationale des Cultures de Microor-

II

DK 172814 B1 ganismes" (C.N.C.M.) i Pasteur InstituLet i Peris, Frankrig. En ikke-tran'sformeret TGI cellelinie blev også deponeret i C.N.C.M. under nr. 1-364. Alle disse deponeringer blev foretaget den 15. november 1984. Storreisen af de 5 tilsvarende indskud stammende fra LAV-genomet er også angivet.

TABEL

10 Hovedtræk ved de rekombinante plasmider - pJl9 - 1 plasmid (1-365) 0,5 kb

Hind III - Sac I Hind III 15 - pJ19 - 17 plasmid (1-367) 0,6 kb

Hind III - Pst 1 - Hind III

20 - pJ19 - 6 plasmid (1-366) 1,5 kb

Hind III (5')

Barn HI Xho I

2 5 Κρη I

Bgl II Sac I (3')

Hind III

30 - pJ19-13 plasmid (1-368) 6,7 kb

Hind III Bgl II Κρη I

35 Κρη I

Eco RI

I2 DK 172814 B1

Eco RI Sal I Κρη I Bgl II

5 Bgl II

Hind III (3' )

Positivt hybridiserende M13 fagplader dyrkedes indtil 5 timer, og det enkeltstrengede DNA blev ekstraheret.

10 M13mp8 subkloner af \J19 DNA blev sekvensbedømt efter di-deoxymetoden og teknologien udviklet af Sanger et al (Sanger et al (1977), Proo. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 og M13-kloning og sekvensbedømmelseshåndbogen, 15 AMERSHAM (1983). Den 17-mer oligonucleotide primer a-3i‘SdATP (400ci/mmol, AMERSHAM) og 0,5X-5X puffer gradientgeler (Biggen M.D. et al. (1983), Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 50^ 3963) anvendtes. Gelerne blev aflæst og anbragt i computeren under programmerne udviklet af Staden 20 (Staden R. (1982), Nuel. Acids Res. 10, 4731). Alle velegnede referencer og metoder kan findes i AMERSHAM's M13-klonings- og sekvensbedømmelseshåndbog.

Den fuldstændige DNA-sekvens af kJ19 (også betegnet som 25 LAV-Ia) er vist i fig. 4a-4e.

Sekvensen blev genopbygget fra sekvensen af fag XJ19 indskuddet. Nummereringen starter ved hovedpladsen, der blev lokaliseret eksperimentelt (se det efterfølgende). Vig-30 tige genetiske elementer, de vigtigste åbne aflæsningsrammer og deres forudbestemte slutprodukter er angivet sammen med Hindlll-kloningspladserne. De potentielle gly-cosyleringspladser i env-genet er angivet med en streg ovenover. Den NH^-endestillede sekvens af p253*7 bestemt 35 ved protein-mikrosekvensbedømmelse er rammet ind i kasse.

I3 DK 172814 B1

Hvert nucleotid blev sekvensbedømt gennemsnitlig 5,3 gange: 85% af sekvensen bestemtes på begge strenge og resten sekvensbedømtes mindst to gange fra uafhængige kloner. Basesammensætningen er T 22,2"; C 17,8*; A 35,8%; 5 G 244,2%; G + C 42%. Nucleotidet GC ér" for en stor del underrepræsenteret (0,9%) som almindeligt blandt euka-ryotiske sekvenser (Bird 1980).

Figurerne 5 og 6 giver en skematisk afbildning af længden 10 af de successive åbne aflæsningsrammer svarende til de successive aflæsningsfaser (også betegnet med numrene "1", "2” og "3". der forekommer på den venstre side af fig. 5). De relative beliggenheder af disse åbne aflæsningsrammer (ORF) i forhold til den nucleotide opbygning 15 af LAV-genomet er refereret ved hjælp af rækken af tal repræsentative for de respektive stillinger af de tilsvarende nucleotider i DNA-sekvensen. De lodrette streger svarer til positionerne for de tilsvarende stopcodoner.

20

Opfindelsen angår mere specifikt de følgende gener og DNA-fragmenter hidrørende fra "gag-genet" og til proteiner eller glycoproteiner kodet ved hjælp af disse gener og fragmenter.

25 1) "gag-genet" (eller ORF-gag) "gag-genet" koder for kerneproteiner.

30 gag: nær den 5. ydre ende af gag orf er en "typisk" ini-tiationscodon (Kozak 1984) (position 336), der ikke alene er den første i gag orf, men den første fra cap-pladsen. Precursorproteinet er 500 aminosyre langt. Beregnet molekylvægt = 55841 er i overensstemmelse med 55 kd gag pre-35 cursorpolypeptidet. Den N-terminale aminosyresekvens af hovenkerneprotein p25 er kodet af nucleotidsekvensen, der DK 172814 B1

M

starter fra position 732 (fig. 5a). Dette udgør formelt sammenbindingen mellem det klonede LAV-genom og det immunologisk karakteriserede LAVp25-protein. Proteinet kodende 5' af p25 kodefrekvensen er temmelig hydrofil. Dets 5 beregnede molekylvægt på 14 866 er i overensstemmelse ined molekylvægten af gag-protein pl8. 3'-delen af gag-regionen koder sandsynligvis for det retrovirale nucleinsyre-bindende protein (NBP). Faktisk ligesom i HTLV-1 (Seiki et al., 1983) og RSV (Schwartz et al., 1983), findes gen-10 tagelsen Cys-X;-Cys-X3-3-Cys fælles for alt NBP (Oroxlan et al., 1984) duplikeret (nucleotider 1509 og 1572 i LAV-sekvens). I overensstemmelse med dens funktion er det formodede NBP ekstremt basisk (17?. Arg + Lys) .

15 Specielt fremgår det, at et genomfragment (ORF-gag), der antages at kode for kerneantigenerne herunder p25, pi8 og pl3-proteinerne er anbragt mellem nucleotidposition 312 (der starter med 5' CTA GCG GAG 3r) og nucleotidposition 1835, (der afsluttes med CTCG TCA CAA 3')· Opbygningen af 20 peptiderne eller proteinerne med dele af ORF antages at være den, der svarer til fase 2.

Methioninaminosyre "M" kodet ved hjælp af ATG ved position 336-338 er sandsynligvis iniLiationsmethionin af 25 gag-proteinprecursoren. Afslutningen af ORF-gag og som følge heraf gag-protein viser sig at være anbragt ved position 1835.

Begyndelsen af p25-protein, der antages at starte med en 30 Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His-.... ami-nosyresekvens, antages at være kodet ved hjælp af nucleo-tidsekvensen CCTATA..., der begynder ved position 732.

Opfindelsen angår således 35 I5 DK 172814 B1 DNA-sekvensen, der strækker sig fra nucleotid 336 ind til ca. nucleotid 1650, der er fastlagt til at kode et p55-protein, der indeholder en aminosyresekvens svarende til den der findes i kerneproteinerne pl8 og p25 5 af LAV-viruset eller til et fragment af sådan DNA-se-kvens, der koder for et epitop-bærende fragment af sådanne kerneproteiner; - DNA-sekvensen, der strækker sig fra nucleotid 10 732 ind til ca. nucleotid 1300, der er fastlagt til at kode for p25-proteinet; DNA-sekvensen, der strækker sig fra ca. nucleotid 1371 til ca. nucleotid 1650, der er fastlagt til at 15 kode pl3-proteinet; DNA-sekvensen, der strækker sig fra nucleotid 336 indtil ca. nucleotid .611, der er fastlagt til at kode pi8-proteinet.

20

Opfindelsen angår også de rensede polypeptider, der indeholder aminosyreopbygningerne kodet af nævnte fragmenter, specielt pl3, pl8, p25 og p55-proteiner eller polypeptider, der har opbygninger svarende til de, der stammer fra 25 direkte translation af DNA-sekvenserne, eller fragmenterne, der er defineret nærmere ovenfor, hvilke peptidsekvenser er angivet direkte i fig. 4a. Mere specielt angår opfindelsen rensede polypeptider, der indeholder peptidsekvenser identisk eller ækvivalent med de, der er kodet 30 af DNA-sekvenserne, der udgår fra følgende nucleotidposi-tioner: 336 til 1650 (p55) 336 til 611 (P18) 35 1371 til 1650 (pl3) 732 til 1300 (p25).

16 DK 172814 B1

Det skal bemærkes, at pl3, pl8 og p25 alle synes at stamme fra den samme precursor dvs. p55.

5 Opfindelsen angår yderligere epitop-bærende polypeptid-fragmenter kodet af tilsvarende DNA-fragmenter af den gag-åbne aflæsningsramme. Specielle hydrofile peptider i den gag-åbne aflæsningsramme er identificeret nedenfor.

De er defineret, idet der gås ud fra aminosyre 1 = Met 10 kodet af ATG, der starter for 336-338 i LAV DNA-sekvensen (fig. 4a) og herefter yderligere nummereret i overensstemmelse med deres rækkefølge i gag-sekvensen. Det første og andet tal i relation til hvert peptid henfører henholdsvis til den respektive N-terminale og C-terminale 15 aminosyre.

Disse hydrofile peptider omfatter: aminosyrer 12-32 inklusive, dvs.

20

Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-

Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys aminosyrer 37-46 inklusive, dvs.

25

Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val- aminosyre 49-79 inklusive, dvs.

30 Gly-Leu-Leu-Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Gln-

Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr- aminosyre 88-153 inklusive, dvs.

Val-His-Gln-Arg-Ile-Glu-Ile-Lys-Asp-Thr-Lys- 35 17 DK 172814 B1

Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-^ Val-His-Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn- aminosyre 158-165 inklusive, dvs.

Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser- 10 aminosyre 178-188 inklusive, dvs.

Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu-Asn-Thr-Met-Leu- 15 aminosyre 200-220 inklusive, dvs.

Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-

Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala- 20 aminosyre 226-334 inklusive, dvs.

Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser- aminosyre 239-264 inklusive, dvs.

25

Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-

Trp-Met-Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-

Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg- 30 aminosyre 288-331 inklusive, dvs.

Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg-Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu-Val-Lys-Asn-Trp-Met-35 Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-

Pro-Asp-Cys-Lys- · I8 DK 172814 B1 aminosyre 352-361 inklusive, dvs.

Gly-Val-Gly-Gly-Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg- 5 aminosyre 377-390 inklusive, dvs.

Met-Met-Gln-Arg-Gly-Asn-Phe-Arg-Asn-Gln-

Arg-Lys-Ile-Val- 10 aminosyre 399-432 inklusive, dvs.

Gly-His-Ile-Ala-Arg-Asn-Cys-Arg-Ala-Pro-Arg-Lys-Lys-Gly-Cys-Trp-Lys-Cys-Gly-I.ys-15 Glu-Gly-His-Gln-Met-Lys-Asp-Cys-Thr-Glu-

Arg-Gln-Ala-Asn- aminosyre 437-484 inklusive, dvs.

20 Ile-Trp-Pro-Ser-Tyr-Lys-Gly-Arg-Pro-Gly-

Asn-Phe-Leu-Gln-Ser-Arg-Pro-Glu-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Glu-Glu-Ser-Phe-Arg-Ser-Gly-Val-Glu-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Gln-Lys-Gln-Glu-Pro-Ile-Asp-Lys-Glu-Leu-Tyr-25 aminosyre 492-498 inklusive, dvs.

Leu-Phe-Gly-Asn-Asp-Pro-Ser- 30 Opfindelsen angår også en hvilken som helst kombination af disse peptider.

Tabel 1 opsummerer beliggenheder og størrelser af virale åbne aflæsningsraromer. Nucleotidkoordinaterne henfører 35 til den første fase af den første triplet (1. triplet) af den første methionin initiationscodon (Met) og af stop- 19 DK 172814 B1 codonen (stop). Antallet af aminosyrer og beregnede mol-vægte er beregnet for umcdificerede precursorprodukter, der starter ved et første methioni’n indtil enden bortset fra pol, hvor størrelsen cg molekylvægten henfører til 5 hele orf.

Antal Beregnet 1. tri- amino- molekyl- 10 orf plet Met stop syrer vægt gag 312 336 1836 500 55841 15 pol 1631 1934 4640. (1003) (113629) orf Q 4554 4587 5163 192 . 22487 env 5746 5767 8350 861 973676 20 orf F 8324 8354 8972 206 23316

Tabel 1: Beliggenhed og størrelse af virale åbne aflæs-25 ningsraimner.

Opfindelsen angår mere specielt alle DNA-fragmenter, der nærmere er omtalt ovenfor, og som svarer til åbne aflæsningsrammer. Det er naturligt, at fagmanden vil være i 30 stand til at opnå dem alle, f.eks. ved at spalte DNA'et, der strækker sig fra ca. nucleotid 336 til ca. nucleotid 1835 på fig. 4a-4e, f.eks. ved spaltning ved hjælp af partielt eller fuldstændig nedbrydning heraf med et passende restriktionsenzym og ved efterfølgende udvindelse 35 af de relevante fragmenter. De forskellige DNA omhandlet ovenfor kan også anvendes som en kilde for passende frag- 20 DK 172814 B1 menter. Metoden omhandlet nedenfor til isolering af fragmenterne, som herefter inkluderes i de ovenfor nævnte i plasmider, og som anvendtes herefter til DNA-sekvensbe- dømmelse, kan anvendes.

5

Naturligvis kan andre metoder anvendes. Visse af disse er angivet i britisk patentansøgning nr. 84 23659 indleveret 19. september 1984. Der skal f.eks. omtales følgende me-! toder.

10 a) DNA kan indføres i pattedyrceller med passende selektionmarkører ved hjælp af en hel række metoder, calcium-phosphatudfældning, polyethylenglycol, protoplaster-fusioner osv.

15 b) DNA-fragmenter svarende til gener kan klones i ekspressionsvektorer for E. coli, gær- eller pattedyrceller, og de fremkomne proteiner renses.

20 c) Det pro-virale DNA kan blive "shot-gunned" (fragmenteret) i prokaryotiske ekspressionsvektorer til opnåelse af fusionspolypeptider. Rekombinant producerende antigenisk kompetente fusionsproteiner kan identificeres ved simpel undersøgelse af rekombinanterne med antistof-25 fer over for LAV-antigener.

Opfindelsen angår yderligere mere specielt DNA-rekombi-nanter, specielt modificeret vektorer, herunder en vilkårlig af de foregående DNA-sekvenser og tilpasset til at 30 transformere tilsvarende mikroorganismer eller celler, specielt eukaryotiske celler som f.eks. gær som Saccharo-myces cerevisiae, eller højere eukaryotiske celler, specielt celler fra pattedyr, eller højere eukaryotiske celler, specielt celler fra pattedyr, for at muliggøre eks-35 pression af DNA-sekvenserne i de tilsvarende mikroorganismer eller celler. Almene metoder af denne typer er DK 172814 Bl 21 nævnt i ovennævnte britiske patentansøgning nr. 84 29099 indleveret 16. november 1984.

Mere specielt angår opfindelsen sådanne modificerede DNA 5 rekombinantvektorer modificeret med nævnte DNA-sekvenser, og som er i stand til at transformere højere eukaryotiske celler, specielt pattedyrceller. Fortrinsvis er en vilkårlig af nævnte sekvenser anbragt under den direkte kontrol af en promotor indeholdt i vektoren, og som er gen-10 kendt ved hjælp af polymeraserne i cellerne, således af de første udtrykte nucleotidcodoner svarer til de første tripletter af ovennævnte definerede DNA-sekvenser.

Opfindelsen angår derfor tilsvarende DNA-fragmenter, der kan fås fra DNA, der strækker sig fra ca. nucleotid 336 15 til ca. nucleotid 1835 på fig. 4a-4e ved hvilken som helst passende metode. Er. sådan metode kan f. eks. omfatte spaltning af LAV-genomerne eller cDNA ved hjælp af restriktionsenzymer, fortrinsvis ved restriktionssteder omgivende fragmenterne og nær de modsatte ydre ender 20 heraf, udvinding og identificering af de ønskede fragmenter efter størrelse, om nødvendig undersøgelse af deres restriktionskort eller nucleotidsekvens (eller ved omsætning med monoklonale antistoffer specielt rettet over for epitoper båret af polypeptiderne kodet af DNA-25 fragmenterne) og yderligere, dersom der er behov, tilpasning af fragmenternes ydre ender f.eks. med et exonucleo-lytisk enzym som f.eks. Bal31 for at kontrollere de ønskede nucleotidsekvenser af de ydre dele af DNA-fragment-erne eller omvendt reparation de ydre dele med Klenow-en-30 zym og om muligt legering af sidstnævnte til syntetiske polynucleotidfragmenter, der er udformet til at muliggøre rekonstituering af de ydre nucleotiddele af fragmenterne.

Disse fragmenter kan herefter indføres i en hvilken som helst af de nævnte vektorer for at bevirke ekspression af 35 det tilsvarende polypeptid af cellen transformeret hermed. Det tilsvarende polypeptid kan herefter udvindes fra 22 DK 172814 B1 de transformerede celler, evt. efter lysering heraf, og renses ved hjælp af metoder som f.eks. elektroforese. Det er ikke nødvendigt at nævne, at alle almindelige metoder til at udføre disse operationer kan anvendes.

5

Opfindelsen angår også mere specielt klonede prober, der t er fremstillet gående ud fra et hvilket som helt omhandlet DNA-fragment, således rekombinant DNA indeholdende disse fragmenter, specielt hvilke som helst plasmider, 10 der er opformeret i prokaryotiske eller eukaryotiske celler og indeholdende disse fragmenter.

Idet der anvendes de klonede DN7\-fragmenter som en molekylær hybridiseringsprobe - enten ved mærkning med radio-15 nucleotider eller med fluorescerende reagenser - kan LAV virion RNA afsløres direkte i blod, legemsvæsker og blodprodukter (f.eks. af den antihæmophyle faktor som f.eks. faktor VIII koncentrater) cg til vacciner, dvs. Hepatitis B vaccine. Det er allerede vist, at hele virus kan afslø-20 res i de kultursupernatante dele af LAV-producerende celler. En passende metode til at opnå afsløring omfatter immobilisering af virus på en understøttelse f.eks. nitrocellulosefiltre osv., itubrydning af virion og hybri-disering med mærket (radiomærket eller "kold" fluore-25 scens- eller enzymmmærkede) probér. En sådan metodik er allerede udviklet for Hepatitis B virus i perifert blod (jfr. SCOTTO J. et al. Hepatology (1983), 3, 379-384).

De omhandlede prober kan også anvendes til hurtig afsøg-30 ning af genomt RNA eller DNA stammende fra væv fra patienter med LAV-relaterede symptomer for at se, om det provirale DNA eller RNA findes i værtsvævet og i andre væv.

35 En metode, der kan anvendes til sådan screening omfatter følgende trin: Ekstraktion af DNA fra væv, restriktions- .i 23 DK 172814 B1 enzymspaltning af DNA, elektrophorese af fragmenterne og Southern blotting af ger.cmt DNA fra vævene, efterfølgende hybridisering med mærket klonet LAV proviral DNA. Hybri-disering in situ kan også anvendes.

5

Lymfevæske og væv og andet ikke-lymfatisk væv fra mennesker, primater og andre pattedyr kan også undersøges for at se om andre udviklingsmæssigt relaterede retrovirus eksisterer. De ovenfor nævnte metoder kan anvendes, skønt 10 hybridisering og vask bør gøres under strengt kontrollerede betingelser.

De omhandlede DNA eller DNA-fragmenter kan anvendes til at opnå ekspression af de ovenfor definerede peptider til 15 diagnostiske formål.

Opfindelsen angår generelt selve polypeptiderne, hvad enten de er syntetiseret kemisk, isoleret fra virale præparater eller udtrykt med forskellige omhandlede DNA, spe-20 cielt med ORF eller fragmenter heraf i passende værter, specielt prokaryotiske eller eukaryotiske værter, efter transformation af disse med en passende vektor, der forud er modificeret med det tilsvarende DNA.

25 Mere generelt angår opfindelsen også en vilkårlig af po-lypeptidfragmenterne (eller molekyler, specielt glycopro-teiner med samme polypeptid-skelet som de nævnte polypep-tider) indeholdende en epitop karakteristisk for et LAV-protein eller glycoprotein, hvilket polypeptid eller mo-30 lekyle herefter har N-terminale og C-terminale dele henholdsvis enten fri eller uafhængigt af hinanden kovalent bundet til aminosyrer, der er forskellig fra de, der er normal associeret med dem i de større polypeptider eller glycoproteiner af LAV-virus, hvilket sidstnævnte amino-35 syrer herefter er fri eller hører til anden polypeptidse-kvens. Specielt angår opfindelsen hybrid polypeptider in- DK 172814 Bl 24 deholdende en vilkårlig af de epitopbærende polypeptider, der nærmere er beskrevet ovenfor, rekombineret med andre polypeptidfragmenter normalt fremmede for LAV-protei-nerne, der har en tilstrækkelig størrelse til at tilveje-5 bringe en forøget immugenicitet af det epitop-bærende po-lypeptid, idet disse fremmede polypeptidfragmenter enten er immunogent inerte eller ikke griber ind i de immunogene egenskaber af det epitopbærende polypeptid.

10 Sådanne hybridpolypeptider, der kan indeholde indtil 150, endog 250 aminosyrer består sædvanligvis af ekspressionsprodukter af en vektor, der fra begyndelsen indeholdt en nucleinsyresekvens som defineret ovenfor, der kunne udtrykkes under kontrol af en passende promotor eller re-15 plikon i en passende vært, hvilken nucleinsyresekvens imidlertid forud var modificeret ved indførsel i denne af en DNA-sekvens, der koder det epitopbærende polypeptid.

De epitopbærende polypeptider, specielt sådanne, hvis N-20 terminale og C-terminale aminosyrer er frie, kan også opnås ved kemisk syntese ved metoder, der er velkendte inden for proteinkemien.

Syntese af peptider i homogen opløsning og i fast fase er 25 velkendt.

Med hensyn til dette skal henvises til syntesemetoden i homogen opløsning beskrevet af Houben-Weyl i et arbejde med titlen "Methoden der Organischen Chemie" (methods of 30 Organic Chemistry) udgivet af E. Wunsch., vol 15-1 og II, THIEME, Stuttgart 1974.

Denne syntesemetode består af efter hinanden følgende kondensering af enten de successive aminosyrer to og to, 35 i passende orden eller de successive peptidfragmenter, der er forud fremstillet eller dannet og allerede inde- 25 DK 172814 B1 holdende adskillige aminoacylrester i den passende orden.

Bortset fra carboxyl- og aminogrupper, der vil blive engageret i dannelsen af peptidbindingerne, må man passe på forud at beskytte alle andre reaktive grupper, der bæres 5 af disse aminoacylgrupper eller fragmenter. Imidlertid aktiveres med fordel carboxylgrupperne inden dannelsen af peptidbindingerne ved velkendte metoder inden for peptid-syntesekemien. Alternativt kan man anvende koblingsreaktioner, der omfatter almindelige koblin’gsreagenser f.eks.

10 af carbodiimidtypen som f.eks. l-ethy.l-3-(3-dimethyl- aminopropyl)-carbodiimid. Dersom den anvendte aminosyre og gruppe bærer en yderligere amingruppe (f.eks. lysin) eller en anden syrefunktion (f.eks. glutaminsyre), kan disse grupper beskyttes med carbobenzoxy eller t-butyl-15 oxycarbonylgrupper, når det drejer sig om amingrupper, eller med t-butylestergrupper, når det drejer sig om car-boxy.lgrupper. Lignende metoder er mulige til beskyttelse af andre reaktive grupper. F.eks. kan SH-gruppen (f.eks. i cystein) beskyttes med en acetamidomethyl- eller para-20 methoxybenzylgruppe.

Når det drejer sig om fremadskridende syntese, aminosyre for aminosyre, starter syntesen fortrinsvis med kondensationen af den C-terminale aminosyre med den aminosyre, 25 der svarer til den nabostillede aminoacylgruppe i den ønskede sekvens osv. trin fer trin indtil den N-terminale aminosyre. En anden foretrukken metode, der kan anvendes, er den der er beskrevet af R.D. Merrifield i "Solid phase peptide synthesis" (j. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154).

30

Ved Herrifield-metoden bindes den første C-terminale aminosyre i kæden til en passende porøs polymerharpiks ved hjælp af aminosyrens carboxylgruppe, hvorefter aminogrup-pen i aminosyren beskyttes f.eks. ved hjælp af en t-35 butyloxyearbonylgruppe.

26 DK 172814 B1 Når den første C-terminale aminosyre således er fastgjort til harpiksen, fjernes den beskyttende gruppe ved amino-gruppen ved vask af harpiksen med en syre f.eks. trifluoreddikesyre, når den beskyttende gruppe for amino-5 gruppen er en t-butyloxycarbonylgruppe.

Herefter kobles carboxylgruppen af den anden aminosyre, der skal give den anden aminoacylgruppe i den ønskede peptidsekvens, til den afbeskyttede aminogruppe i den C-10 terminale aminosyre fastgjort til harpiksen. Fortrinsvis er carboxylgruppen i denne anden aminosyre aktiveret for f.eks. med dicyclohexylcarbodiimid, medens aminosyrens amingruppe er beskyttet f.eks. med en t-butyloxycarbonylgruppe. Den første del af den ønskede peptidkæde, der om-15 fatter de to første aminosyrer, er således opnået. Som forud fjernes beskyttelsen herefter fra amingruppen, og man kan gå yderligere frem med at binde den næste aminoacylgruppe osv., indtil hele det ønskede peptid er opnået.

20

De beskyttende grupper i de forskellige sidekædegrupper, dersom der er nogen i den dannede peptidkæde, kan herefter fjernes. Det ønskede peptid kan herefter frigøres fra harpiksen f.eks. ved hjælp af hydrogenfluoridsyre, og til 25 slut kan den fås i ren form fra den sure opløsning ved almindelige metoder.

Med hensyn til peptidsekvenser af mindre størrelse og indeholdende en epitop eller immunogen determinant og mere 30 specielt sådanne, der let fås ved kemisk syntese, kan det være nødvendigt for at forøge deres in vivo immunogene karakter at koble eller "konjugere" dem kovalent til et fysiologisk acceptabelt og ikke-toxisk bæremolekyle.

35 Eksempler på bæremolekyler eller makromolekylære understøttelser, der kan anvendes til at fremstille de omhand- 27 DK 172814 B1 lede konjugater, er naturlige proteiner som teta'ntoxoid, ovalbumin, serumalbuminer, hemocyaniner osv.. Syntetiske makromolekylære bærere som f.eks. polysiner eller poly(D-L-alanin)-poly(L-lysin)er kan også anvendes.

5

Andre typer makromolekylære bærere, der kan anvendes, og som sædvanligvis har en molekylvægt på mere end 20000 er velkendte fra litteraturen.

10 Konjugaterne kan fremstilles ved velkendte metoder som f.eks. beskrevet af Frantz og Robertson i "Infect, and Immunity", 33, 193-198 (1981), eller af P.E. Kauffman in Applied and Environmental Microbiology, October 1981,

Vol. 42, nr. 4, 611-614.

15 F.eks. kan følgende koblingsmidler anvendes: Glutaralde-hyd, ethylchlorformiat, vandopløselige carbodiimider (N-ethyl-N'(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, IIC1), diiso-cyanater, bis-diazobenzidin, di- og trichlor-s-triaziner, 20 cyanbromider, benzaquincn såvel som koblingsmidler nævnt i Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p. 7-23 (Avrameas,

Ternynck, Guesdon).

En hvilken som helst koblingsmetode kan anvendes til at 25 binde én eller flere reaktive grupper af peptidet på den ene side og én eller flere reaktive grupper af bærestoffet på den anden side. Atter opnås kobling med fordel mellem carboxyl og amingrupperne i peptidet og bærestoffet eller omvendt i nærværelse af koblingsmiddel af den 30 type, der anvendes ved proteinsyntese, dvs. l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, N-hydroxybenzotriazol osv.. Kobling mellem amingrupper henholdsvis båret af peptidet og bærestoffet kan også foretages med glutaral-dehyd f.eks. som beskrevet af BOQUET, P. et al. (1982) 35 Molec. Immunol., jL9, 1441-1549, hvor bærestoffet er hemo-cyanin.

28 DK 172814 B1

Imininunogeniciteten af epitopbærende peptider kan også forstærkes ved oligomerisering heraf f.eks. i nærværelse af glutaraldehyd eller et andet passende koblingsmiddel.

5 Specielt angår opfindelsen vandopløselige immunogene ori-gamerer opnået på denne måde, der specielt omfatter fra 2 til 10 monomere enheder.

De omhandlede proteiner og polypeptider i det efterfølg-10 ende betegnes som "antigener", mere specielt peptider, fremstillet ved kemisk syntese, er anvendelige ved metoder til afsløring af tilstedeværelsen af anti-LAV-anti-stoffer i biologiske substrater, specielt biologiske væsker som sera fra mennesker eller dyr, specielt med hen-15 blik på mulig diagnostisering af LAV eller AIDS.

Opfindelsen angår specielt en in vitro metode til diagnostisering, der anvender et polypeptid som defineret ovenfor (eller et polypeptid indeholdende en epitop af dette 20 polypeptid) til afsløring af anti-LAV-antistoffer i sera fra personer, der indeholder disse.

En foretrukket udførelsesform for opfindelsen omfatter: 25 - Anbringelse af en forudbestemt mængde af én el ler flere af antigenerne i kopperne på en titreringsmi-kroplade; indførsel af stigende fortyndinger af biologiske 30 væsker f.eks. serum der skal diagnosticeres, i disse kopper; inkubering af mikropladen; 35 ~ forsigtig vask af mikropladen med en passende puffer; 29 DK 172814 B1 tilsætning til kopperne af specielt mærkede antistoffer rettet mod blodimmunoglobuliner og 5 - afsløring af det dannede antigen-antistofkom pleks, der herefter er en indikation på tilstedeværelsen af LAV-antistoffer i den biologiske væske.

Med fordel foretages mærkningen af anti-iromunoglobulin-10 antistofferne ved hjælp af et enzym valgt blandt de, der er i stand til at hydrolysere et substrat, idet substratet undergår en forandring med hensyn til bestrålingsabsorption i det mindste inden for et forud bestemt bånd af bølgelængder. Undersøgelse af substratet, foretrukkent i 15 forhold til en kontrol, giver herefter et mål for den potentielle risiko eller for den egentlige tilstedeværelse af sygdommen.

Foretrukne metoder er således immunoenzymatiske eller 20 også immunofluorescensafsløringer specielt i overensstemmelse med ELISA-metoden. Titreringer kan bestemmes ved immunofluorescens eller direkte eller indirekte immunoenzymatiske bestemmelser. Kvantitative titreringer af antistoffer kan foretages.

25

Opfindelsen angår også selve det diagnostiske udstyr til in vitro afsløring af antistoffer over for LAV-virus, idet udstyret omfatter en vilkårlig af de heri beskrevne polypeptider og alle biologiske og kemiske reagenser samt 30 udstyr, der er nødvendigt for at udføre den diagnostiske undersøgelse. Foretrukkent udstyr omfatter alle nødvendige reagenser til udførelse af ELISA-forsøgene. Foretrukne udstyr vil således udover en vilkårlig af de nævnte polypeptider yderligere indeholdende passende 35 pufre og anti-humane immutioglobuliner, idet anti-humane immunoglobuliner er mærket enten med et immunofluore- 30 DK 172814 B1 scensmolekyle eller med et; enzym. I det sidste tilfælde omfatter foretrukkent udstyr også et substrat, der kan hydrolyseres med enzymet og som giver et signal, specielt en modificeret absorption af en stråling, i det mindste 5 ved en forudbestemt bølgelængde, idet signalet herefter er en indikation på tilstedeværelsen af antistof i den biologiske væske, der skal undersøges med udstyret.

Opfindelsen angår også vaccinepræparater, hvis aktive 10 princip udgøres af en vilkårlig af antigenerne dvs. de heri beskrevne polypeptider eller immunogene fragmenter heraf, fusionspolypeptider eller oligopeptider sammen med et passende farmaceutisk eller fysiologisk acceptabelt bærestof.

15

Foretrukne aktive principper, der falder inden for området, består af peptiderne indeholdende mindre end 250 ami-nosyreenheder, fortrinsvis mindre end 150, der kan deduceres ud fra DNA'et, der strækker sig fra ca. nucleotid 20 336 til ca. nucleotid 1835 på fig. 4a-4e. Som eksempel, uden dog at virke begrænsende, kan nævnes, at passende doser af vaccinepræparaterne er sådanne, der er i stand til at frembringe antistoffer in vivo hos værten, specielt i en menneskelig vært. Passende doser ligger fra 10 25 til 500 pg polypeptid, protein eller glycoprotein pr. kg f.eks. 50 til 100 ug pr. kg.

De omhandlede forskellige peptider kan også anvendes som sådan til fremstilling af antistoffer, fortrinsvis mo-30 noklonale antistoffer specifikke over for de respektive forskellige peptider. Til fremstillingen af hybridomer, der udskiller disse monoklonale antistoffer, anvendes almindelige fremstillings- og undersøgelsesmetoder. De monoklonale stoffer, der i sig selv er en del af den fore-35 liggende opfindelse, udgør.herefter værdifuld værktøj til identifikation og endog hestemmelse af de relative for- DK 172814 Bl 31 hold mellem de forskellige polypeptider eller proteiner i biologiske prøver, specielt prøver for mennesker .indeholdende LAV eller relaterede vira.

5 Opfindelsen angår yderligere værter (prokaryotiske eller eukaryotiske celler), der er transformet ved hjælp af ovennævnte rekombinanter, og som er i stand til at udtrykke DNA-fragmenterne.

10 Endelig omhandler opfindelsen også vektorer til transformation af eukaryotiske celler af human oprindelse, specielt lymfocytter, hvis polymeraser er i stand til at genkende LTR af LAV. Foretrukne vektorer er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et LAV LTR heri, idet LTR 15 herefter er aktiv som promotor, der i stand til effektiv transkription og tranlaticn i en passende vært af et DNA-indskud, der koder for det ovenfor definerede polypeptid eller epitop-bærende fragment.

20 Det er ikke nødvendigt at nævne at opfindelsen også angår alle varianter af de ovenfor definerede DNA-fragmenter (ORF), der har i det væsentlige ækvivalente egenskaber, idet alle genomerne hører til retrovirus, der kan betragtes som ækvivalenter af LAV.

25

Det er klart, at de efterfølgende krav også dækker alle ækvivalenter af produkterne ifølge opfindelsen (polypeptider, DNA osv.), hvor et ækvivalent er et produkt dvs. polypeptid, der kan skelnes fra et bestemt ét defineret i 30 et af kravene, f.eks. ved hjælp af én eller flere aminosyrer, medens det stadig har i det væsentlige samme immunologiske eller immunogene egenskaber. En lignende regel for ækvivalens skal anvendes med hensyn til DNA, idet skal forstås, at ækvivalensreglen herefter vil være bund-35 et til reglen for ækvivalens, der hører til de polypeptider, som de koder for.

32 DK 172814 B1

LITTERATURLISTE

Alizon, M., Sonigo, P., Barré-Sinoussi, F., Chermann, 5 J.C., Tiollais, P., Montagnier, L. and Wain-Hobson, S.

(1984) . Molecular cloning of lymphadenopathy-associated virus. Nature, in press.

Arya, S.K., Gallo, R.C., Hahn, B.H., Shaw, G.M., Popvic, 10 M., Salahuddin, S.Z., and Wong-Staal, F. (1984). Homology of genome of AIDS-associated virus with genomes of human T-cell leukemia lymphoma viruses. Sicence 225, 927-930.

Barré-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeybe, 15 M.T., Charmaret, S., Gruest, J., Dauguet, C., Axler-Blin, C., Vézinet-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbaum, W., and Montagnier, L. (1983). Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Science 220, 868-870.

20

Biggen, M.D., Gibson, T.J., and Hong, G.F. (1983). Buffer gradient gels and 3:’S label as an aid to rapid DNA sequence determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963-3965.

25

Bird, A. P. (1980). DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucl. Acids Res. 8, 1499-1504.

Brun-Vézinet, F., Rouzioux, C., Barré-Sinoussi, F., 30 Klatzmann, D., Saimot, A.G., Rozeinbaum, W., Montagnier,

Jj. and Chermann, -J.C. (1984) . Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immuno-deficiency syndrome of lymphadenopathy syndrome. Lancet I, 1253-1256.

35 33 DK 172814 B1

Chen, H.R. and Barker, W.C. (1984). Nucleotide sequences of the retroviral long terminal repeats and their adjacent regions. Nucl. Acids Res. 12, 1767-1773.

5 Chen, I.S.Y., Me Laughlin, J., Gasson, J.C., Clark, S.C. and Golde, D.W. (1983). Molecular characterization of genome of a novel human T-cell leukaemia virus. Nature 305, 502-505.

10 Chiu, I.M., Callahan, R., Tronick, S.R., Scholm, J. and Aaronson, S.A. (1984). Major pol gene progenitors in the evolution of oncornaviruses. Science 223, 364-370.

Cianciolo, G.J., Kipnis, R.J., and Snyderman, R. (1984).

15 Similarity between pl5E of murine and feline viruses and p21 of HTLV. Nature 311, 515.

Daly, II.M. and Scott, G.L. (1983) . Fatal AIDS in a haemo-philiae in the U.K. Lancet II, 1190.

20

Dittmar, K.J. and Moelling, K. (1978). Biochemical properties of pi5-associated protease in an avion RNA tumor virus. J. Virol. 28-106-113.

25 Donehower, L. A., Huang, A.L. and Hager G.L. (1981).

Regulatory and coding potential of the mouse mammary tumor virus long terminal redundancy. J. Virol. 37, 226-238.

30 Gottlieb, M.S., Schroff, R., Schanler, II.M., Weisman, J.D., Fan P.T., Wolf, R.A., Saxon, A. (1981). Pneumocytis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: Evidence of a new acquired cellular immuno-deficiency. N. Engl. J. Med. 305, 1426-1431.

35 34 DK 172814 B1

Hahn, B.H., Shaw, G.M., Arya, S.U., Popovic, M., Gallo, R.C. and Wong-Stall, F. (1984). Molecular cloning and characterization of the HTLV-III virus associated with AIDS. Nature 312, 166-169.

5

Harris, J.D., Scott, J.V., Taylor, B., Brahic, M., Stow-ring, L., Ventura, P., Haase, A.T. and Peluso, R. (1981).

Visna virus DNA: Discovery of a novel gapped structure.

Virology 113, 573-583.

10

Kiyokawa, T., Yoshikura, H., Hattori, S., Secki, M., and Yoshida, M. (1984). Envelope proteins of human T-cell leukemia virus: Expression in Escherischia coli and its application to studies of env gene functions. Proc. Natl.

15 Acad. Sci. USA 81, 6202-6206.

Klatzmann, D., Barré-Sincussi, F., Nugeyre, M.T.,

Dauguet, C., Vilmer, E., Griscelli, C., Brun-Vézinet, F.,

Rouzioux, C., Gluckman, J.C., Chermann, J.C., and Montag-20 nier L. (1984). Selective tropism of lymphadenopathy associated virus (LAV) for helper-inducer T-lymphocytes.

Sciences 225, 59-63.

Kozak, M. (1984). Compilation and analysis of sequences 25 upstream from the transcriptional start site in eucary-otic mRNAs. Nucl. Acids Res. 12, 857-872.

Levy, J.A., Hoffman, A.D., Kramer, 5.M., Lanois, J.A.,

Shimabukuro, J.M., and Oskiro, L.S. (1984). Isolation of 30 lymphocytopathic retroviruses from San Fransisco patients with AIDS. Science 225, 840-842.

Masur, H., Michelis, M.A., Greene, J.B., Onovato, I., Van de Stowe, R.A., Holzman, R.S., Wormser, G., Brettman, I.., 35 Lange, M., Murray, H.W., Cunninghan-Rudles, S. (1981). An outbreak of community-acquired pneumocystic carinii pneu- 35 DK 172814 B1 monia: Initial manifestation of cellular immune dysfunction. N. Engl. J. Med. 305, 1431-1438.

Misra, T.K., Gradgenett, D.P. and Parsons, J.T. (1982).

5 Avian retrovirus pp32 DN7\-binding protein. I. Recognition of specific sequences on retrovirus DNA terminal repeats.

J. Virol. 44, 330-343.

Montagnier, L. et al., (1984), A new human T-lymphotropic 10 retrovirus: Characterization and possible role in lympha-denopathy and acquired immune deficiency symdromes. In human t-cell leukemia/lymphoma viruses. R.C. Gallo, M.

Essex and L. Gross, eds. (Cold Spring Laboratory, New York), 363-370.

15

Croszlan, S., Copeland, T.D., Kalyanaraman, V.S., Sarn-gadharan, M.G., Schultz, A.M. and Gallo, R.C. (1984).

Chemical analysis of human T-cell leukemia virus structural proteins. In HTLVS (R.C. Gallo, M.E. Essex and L.

20 Gross, eds. (Cold Spring Laboratory, New York),101-110.

Piot, P., Quinn, T.C., Taelmann, H., Feinsod, F.M. et al.

(1984). Acquired immunodeficiency syndrome in a heterosexual population in Zaire. Lancet II, 65-69.

25

Popvic, M. Sarngadharan, M.G., Read, E. and Gallo, R.C.

(1984). Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Sceince 224, 497-500.

30

Querat, G. Barban, N., Sauze, N., Filippi, P. Vigne, R.,

Russo, P. and Vitu, C. (1984). Highly lytic and persistent lentiviruses naturally present in sheep with progressive pneumonia are genetically distinct. J. Virol.

35 52, 672-679.

36 DK 172814 B1

Raba, M., Limburg, K. Burghagen, M., Katze, J.R., Simsek, M., Heckman, J.E., Rajbhandary, U.L., and Gross, H.J.

(1979). Nucleotide sequence of three isoaccepting lysine tRNAs from rabbit liver and SV40-transformed mouse fibro-5 blasts. Eur. J. Biochem. 97, 305-318.

Rice, N.R., Stephens, R.M., Couez, D., Deschamps, J.,

Kettmann, R., Burny, A. and Gilden, R.V. (1984). The nucleotide sequence of the env gene and post-env region of 10 bovine leukemia virus. Virology 138, 82-93.

Sagata, N., Yasunaga, T., Ogawa, Y., Tsuzuku-Kawamura, J. and Ikawa, Y. (1984). Bovine leukemia virus: Unique structural features of its long terminal repeats and its 15 evolutionary relationship to human T-cell leukemia virus.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4741-4745.

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulsen, A.R. (1977). BNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl.

20 Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.

Schwartz, D.E., Tizard, R. and Gilbert, W (1983). Nucleotide sequence of Rous sarcoma virus. Cell 32, 853-869.

25 SchUpbach, J., Popovic, M., Gilden, R.V., Gonda, Μ.Λ., Sarngadharan, M.G. and Gallo, R.C. (1984). Serological analysis of a subgroup of human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS. Science 224, 503-505.

30

Seiki, M., Hattori, S., Hirayama, Y. and Yoshida, M.

(1983). Human adult T-cell leukemia virus: Complete nucleotide sequence of the'provirus genome integrated in leukemia cell DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3618-35 3622.

I _ 37 DK 172814 B1

Shaw, G.M., Hahn, B.H., Arya, S.K., Groopman, J.F..,

Gallo, R.C. and Wong-Staal, F. (1984). Molecular characterization of human T-cell leukemia (lymphotropic) virus type in the Acquired Immune Deficiency Syndrome. Science 5 226, 1165-1171.

Shimotohno, K. and Temin, Η.Μ. (1982). Spontaneous variation and synthesis in the U3 region of the long terminal repeat of avion retroviruses. J. Virol. 41, 1636171.

10

Shimotohno, K., Golde, D.M., Miwa, M., Sugimura, T. and Chen, I.S.Y. (1984). Nucleotide sequence analysis of the long terminal repeat of human T-cell leukemia virus type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1079-1083.

15

Shinnick, T.M., Lerner, R.A. and Sutcliffe, J.G. (1981). Nucleotide sequence of Moloney murine leukemia virus. Nature 293, 543-548.

20 Scinivasan, A., Reddy, E.P., Dunn, c.Y. and Aaronson, S.A. (1984). Molecular dissection of transcriptional control elements with the long terminal repeat of retrovirus. Science 223, 286-289.

25 Staden, R. (1982). Automation of the computer handling of gel reading date produced by the shotgun method of DNA sequencing. Nucl. Acids. Res. 10, 4731-4751.

Temin, H. (1981). Structure, variation and synthesis of 30 retrovirus long terminal repeat. Cell 27, 1-3.

Weinberg, R.A. (1982). Fewer and fewer oncogenes. Cell 30, 3-9.

Claims (18)

1. Polypeptid, der har aminosyresekvensen kodet af den 5 DNA-sekvens, der strækker sig fra ca. nucleotid 336 til ca. nucleotid 1835 på fig. 4a-4e, eller af et epitopbær-ende fragment heraf.

2. Polypeptid ifølge krav 1, der indeholder mindre end 10 250 aminosyrerester.

3. Polypeptid ifølge krav 1, der indeholder mindre end 150 aminosyrerester.

4. Polypeptid ifølge krav 1, der har aminosyresekvensen kodet af DNA-sekvensen, der strækker sig fra ca. nucleotid 732 til ca. nucleotid 1300 på fig. 4a-4e.

5. Polypeptid ifølge krav 1, der har aminosyresekvensen 20 kodet af DNA-sekvensen, der strækker sig fra ca. nucleotid 1371 til ca. nucleotid 1650 på fig. 4a-4e.

6. Polypeptid ifølge krav 1, der har aminosyresekvensen kodet af DNA-sekvensen, der strækker sig fra ca. nucleo- 25 tid 336 til ca. nucleotid 611 på fig. 4a-4e.

7. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er valgt blandt polypeptiderne defineret i det efterfølgende, idet tallene i forbindelse med hvert peptid 30 svarer til de relative positioner af dets N-terminale og C-terminale aminosyrer startende med methionin (aminosyre 1) kodet af ATG sekvensen ved nucleotid-positionerne 336-338 af LAV-DNA’et vist påLegningens fig. 4a-4e 35 aminosyrer 12-32 inklusive, dvs. Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys- DK 172814 B1 Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys aminosyrer 37-46 inklusive, dvs. Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-5 aminosyrer 49-79 inklusive, dvs. Gly-Leu-Leu-Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Glr.-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr- 10 aminosyrer 88-153 inklusive, dvs. Val-His-Gln-Arg-Ile-Glu-Ile-Lys-Asp-Thr-Lys-Giu-Ala-Leu-Asp-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-15 Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn- Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His-Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn- 20 aminosyrer 158-165 inklusive, dvs. Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-5er- aminosyrer 178-188 inklusive, dvs. Gly-Ala-Thr-Fro-Gln-Asp-Leu-Asn-Thr-Met-Leu-25 aminosyrer 200-220 inklusive, dvs. Meli-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala- 30 aminosyrer 226-234 inklusive, dvs. Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser- aminosyrer 239-264 inklusive, dvs. Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met-Thr-Asn-Asn-Pro-35 Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg- DK 172814 B1 aminosyrer 288-331 inklusive, dvs. Gly-Pro-Lys-Glu-Pro- Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg-Phe-Tyr-Lys-; Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-GluThr-Leu-5 Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys- aminosyrer 352-361 inklusive, dvs. Gly-Val-Gly-Gly-Pro- Gly-His-Lys-Ala-Arg- 10 aminosyrer 377-390 inklusive, dvs. Met-Met-Gln-Arg-Gly- Asn-Phe-Arg-Asn-Gln-Arg-Lys-Ile-Val- aminosyrer 399-432 inklusive, dvs. Gly-His-Ile-Ala-Arg- Asn-Cys-Arg-Ala-Pro-Arg-Lys-Lys-Gly-15 Cys-Trp-Lys-Cys-Gly-Lys-Glu-Gly-His-Gln-Met- Lys-Asp-Cys-Thr-Glu-Arg-Gln-Ala-Asn- aminosyrer 437-484 inklusive, dvs. Ile-Trp-Pro-Ser-Tyr- Lys-Gly-Arg-Pro-Gly-Asn-Phe-Leu-Gln-Ser-Arg-20 Pro-Glu-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Glu-Glu-Ser-Phe- Arg-Ser-Gly-Val-Glu-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Gln-Lys-Gln-Glu-Pro-Ile-Asp-Lys-Gl.u-Leu-Tyr- aminosyrer 492-498 inklusive, dvs. Leu-Phe-Gly-Asn-Asp-

25 Pro-Ser- og kombination af disse peptider.

8. Fremgangsmåde til diagnosticering af antistoffer ret-30 tet imod LAV virus i en biologisk væske kendetegnet ved, at den omfatter, at nævnte biologiske væske in vitro bringes i kontakt med polypep-tidet ifølge krav 1-7 under betingelser, hvorved der kan dannes et kompleks mellem nævnte antistoffer og nævnte 35 polypeptid, og at dette kompleks detekteres som et udtryk DK 172814 B1 for tilstedeværelsen af nævnte antistoffer i nævnte biologiske væske.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvori nævnte biologiske 5 væske er humant serum.

10. Kit til in vitro påvisning af antistoffer rettet mod LAV virus i væsker kendetegnet ved, at det omfatter 10 et polypeptid ifølge krav 1-7, biologiske og kemiske reagenser, der er nødvendige for at udføre et diagnostisk assay såsom velegnede bufre, anti-humane immunglobuliner mærket med et immunfluorescerende 15 molekyle eller enzym, og, når det anti-humane immunglobu-lin er mærket med et enzym, et substrat, der kan hydroly-ceres af enzymet og give et signal, der er indikativt for tilstedeværelsen af antistof i den biologiske væske.

11. Immunogenisk sammensætning kendetegnet ved, at den indeholder et polypeptid ifølge krav 1-7 i kombination med et farmaceutisk bærermedie.

12. Immunogenisk sammensætning ifølge krav 11 25 kendetegnet ved, at polypeptdet er i en oligomer form, især en vandopløselig immunogen oligomer.

13. Immunogenisk sammensætning ifølge krav 11 kendetegnet ved, at polypeptidet er konjugeret 30 til et fysiologisk acceptablet og ikke-toksisk bærermolekyle.

14. DNA-sekvens kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid ifølge krav i-7. 35 DK 172814 B1

15. Hybridiseringsprobe til screening af genomt RNA eller DNA fra en patient med LAV-relaterede symptomer.

16. DNA-sekvens ifølge krav 14 kendetegnet 5 ved, at den er indsat i en vektor.

17. Mikroorganisme transformeret ved vektoren i krav 16 under betingelser, der muliggør ekspression af DNA-sekvensen indsat i vektoren i nævnte mikroorganisme. 10

18. Antistof kendetegne t ved, at det specifikt er rettet mod peptidet eller antigenet ifølge krav 1 eller 2.