JPH04504358A

JPH04504358A - 複製コンピテントヒト免疫不全２型プロウイルスクローンの特徴化

Info

Publication number: JPH04504358A
Application number: JP2505498A
Authority: JP
Inventors: フランシーニ，ジェノウブファ; ウォン―スタール，フロッシ; ガロ，ロバート
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 1992-08-06
Also published as: CA2047181A1; AU5353690A; WO1990012021A1; US5223423A; IL93927A0; EP0478556A4; AU648983B2; EP0478556A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】複製コンピテントヒト免疫不全２型プロウイルスクローンの特徴化発明の分野本発明はヒトにおける後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　ＤＳ）に関与するヒト免疫不全ウィルス２型（ＨＩ　Ｖ　−２）に関する。本発明は更にプロウィルスＨＩＶ−２配列のクローニング及び特徴化における組換えＤＮＡ技術及びその使用にも関する。

発明の背景ヒト免疫不全ウィルス１及び２型（ＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ　−２）はヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関与するレトロウィルスである。ＨＩＶ−２と密接に関係するウィルス５ＩＶＩＩｌａ０はＡＩＤＳの捕獲マカクザルから単離された。同族群の他のウィルスは捕獲及び野生双方の旧世界ザルから単離された。

ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の遺伝子構造は他の動物レトロウィルスの構造よりも複雑であり；コア及びエンベロープタンパク質をコードする構造遺伝子に加えて、ウィルスＬＴＲからウィルス遺伝子の発現を増加させるようにイン・トランスで作用する１４Ｋｄタンパク質のるｒｅｖ遺伝子（１９Ｋｄ）；ウィルス発現を減少させる関連サルウィルスＳＩＶ　に存在するが、ＨＩＶ−１１ａｅには存在しない。ムλ玉タンパク質（ＨＩＶ−２に関するｐ１６及びＳＩＶに関するｐ１４）は成熟ピリオンと関連しているが、その機能は未知のままである。

ＨＩＶ−１のウィルス発現及び複製を調節する遺伝子産物のほとんどはＨＩＶ− ２にも存在する。事実、調節タンパク質の推定機能性ドメインは進化的に保存されている。しかしながら、ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲよりも大きなＨＩＶ−２ＬＴＲの全体構造における差異は、ウイルストランスアクチベーター遺伝子（ｔ　ａ　ｔ）の応答領域におけるバリエーションの原因になっている。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２間における主な構造的差異は、１型ウスのみに存在することである。これら遺伝子のアミノ酸配列は相同的でなく、それらの機能的相当物はまだ未知である。

ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２アクセサリ−遺伝子の機能はインビトロにおけるＴ細胞の感染により研究されたが、本発明の目的として、生物活性ＨＩＶ−２クローンがめられた。このような複製コンピテントＨＩＶ−２プロウィルスクローンの利用可能性は、ｖｐｘ遺伝子の研究を含めたヒトにおけるＨｆＶ及びＨＩＶ感染の更なる研究、ウィルス複製における“非必須”ＨＩＶアクセサリ−遺伝子の役割、およびインビボにおけるＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２間の構造的差異の関連性の研究を可能にするであろう。加えて、ウィルスＬＴＲの調節要素並びに完全感染性ゲノムの関係における調節タンパク質とのそれらの相互作用についても評価を可能にする。ＨＩＶワクチン及び治療研究用の動物モデルを開発する上での感染性ＨＩＶ−２クローンの砺値も強調されるべきである。ＨＩＶに対する保護ワクチンの開発の迅速な進展は、適切かつコスト上有効な動物モデルの欠如によって阻まれてきた。非ヒト霊長類の感染はチノパンツー及びテナガザルのみでうまく達成されたが、それはまれであるためコスト高であり、一方感染は達成されるものの、病原性は観察されなかった。このため天然ＨＩＶと密接に関連するヒトウィルスを用いた動物モデルの開発は非常に有益となるであろう。

最後に、ＨＩＶ−１の個別的単離物は、明確な生物学的性質及び所定中和血清と感受性がある微変異体からなるという事実からみて、更にこの集団の組成は利用可能な標的細胞及び宿主免疫での変化に対する応答から生じる変異及び選択圧力のせいでおそらく流動することから、感染分子クローンの利用可能性はＨＩＶゲノムの遺伝的進化及び感染宿主におけるこの進化の免疫学的成果を測定可能にするであろう。

発明の要旨ＨＩ　Ｖ　−２ノ完全ケノムクローンハ、ＨＩＶ−２ＳＢＬ８８６９ウイルス単離物で感染されたばかりの新生物ヒト細胞系ＨＵＴ７８のＤＮＡを用いて構築された。この組換えファージＤＮＡクローンは、プロウィルスＤＮＡの複製受容能を試験するためＣＤ４陽性ＨＵＴ７８細胞系のリンパ球にトランスフェクトされた。ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹと命名されたゲノムクローンは数週間の培養後にレトロウィルス粒子を産生じた。ＨＩＶ−２ＳＢＬ／　ＩＳＹは細胞フランキング配列を含めた完全プロウィルスを含有している。このプロウィルスＤＮＡ配列が決定され、２種の他のＨＩＶ−２単離物、即ちＨＩＶ−２［Ｚａｇｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ・８５：Ｎ　Ｉ　Ｈ−Ｚ５９４１−５９４５（１，９８８）　］及びＨＩ　Ｖ　−Ｚ　Ｉ：Ｇｕｙａｄｅｒ　ｅｔ０Ｄａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２６：６Ｂ２−６６９（１９８７）　）並びにＳ　Ｉ　Ｖ　ＭＡＣ（Ｐｒａｎｃｈｉｎｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：５３９−５４３（１９８７）　）の公表配列と比較された。これらＨＩＶ−２単離物の間における変異度は、現在までに配列決定されたＨＩＶ−１単離物の間で通常観察された場合と同等であった。

免疫学上、ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹクローンは親ウィルスＨＩ　Ｖ　−２ｓＢＬ８６６９［ＡＩｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、＾ＩＤＳ　Ｒｅｓ、Ｈｕ＋ｇ。

Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、３：ｌ−１０（１９８７）　ｌ］　と類似しているが、しか１、ＨＩ　ｖ　−２はプロウィルスクローン（ｇｐ４ＳＢＬ／ｌ５Ｙ１）ではなく親ウィルスで端部切除された（ｇｐ３２−３４）エンベロープ−経膜タンパク質において異なる。

親及びクローン化双方のウィルスは、一部のヒトＴ細胞系に感染性かつ細胞変性的であり、融合細胞（ｓｙｎｃｙｔｉａ）を誘導し、インビトロでヒトマクロファージ細胞系Ｕ９３７に感染する。しかしながら、感染力はヒト細胞に限定されない。ＨＩ　Ｖ　−２及ヒＨＩ　Ｖ　−８ＢＬＢ６６９２ＳＢＬ／　ＩＳＹは双方ともインビトロにおいてアカゲザルからの新鮮末梢血Ｔ細胞に感染してそれを殺すことができる。それらはインビボでも同様にアカゲザルに産生的に感染しうる見掛は能力も有している。

ここで示された研究は、生物活性クローンＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹがインビボにおけるＨＩＶ遺伝子の機能性研究及びヒトでレトロウィルス感染を防止する実験的アプローチの開発に関する動物モデルを作製するために使用可能であることを示唆している。

図の上部はウィルス単離物から得られたプロウィルスＨＩＶ−２り０−ン、ＨＩＶ−２及びＩ（ＩＶ−３ＢＬ６８８９２Ｎｒｌ（Ｚのエンドヌクレアーゼ制限地図を表す。第１図の下部はＨＩｖ−２ＳＢＬ６６６９　’　ＨＩＶ−２ＮＩＨ２及ヒＳ　Ｉ　ＶＫａｗ感染細胞系のゲノムＤＮＡのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　５Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＩ開裂結果を表す。各パネルの第二列はプロウィルスクローンの”　Ｉｖ−２ＳＢＬ／ＩＳＹでトランスフェクトされたＨＵ７７ｇ細胞系からのＤＮＡの分析を表す。

密な円柱形又は丸形コア（断面に応じて）を有するいくつかの成熟ピリオンがこの図に示されている。加えて、挿入図はＨＵＴ７ｇ細胞から出芽するウィルス粒子がみられる図を示している。

第３図　ウィルスタンパク質の分析圧及び中央パネルは、破壊されたＨＩＶ−”ＳＢＬ／ＩＳＹ及びＳＩＶピリオンから各々得られた全ウィルスタンパク質のウェスターンプロットを示す。右パネルは代謝標識されたＨＩＶ”　２ＳＢＬ／ＩＳＹピリオンの免疫沈降の結果を示す。タンパク質の分子量はタンパク質マーカー（レインボー（Ｒａｉｎｂｏｗ）、ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）の相対的移動度と比較して計算された。

第４図　細胞培養物中に存在する融合細胞の分析図の左部分４−！ＨＩＶ−２及ＵＨＩＶ−Ｎ　Ｉ　Ｈ−Ｚ２ＳＯＬ／ＩＳＹ単離物での感染後における培養中の生存細胞数の減少について図示する。プラスは３．５．８及び１２２日目細胞培養物でみられる融合細胞数の相対的スケールを表す。双方のウィルス単離物に関して８日目における融合細胞血漿のサイズの一例が図の右側に示されこの図はヌクレオチド及びアミノ酸によるＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹのＤＮＡ配列の翻訳について示す。

発明の詳細な説明下記すべての参考文献は特に参考のため本明細書に組み込まれる。

Ａ、プロウィルスＨＩＶ−２ＤＮＡの単離ファージライブラリーは、ＨＩｖ”　２８ＢＬ６６６９（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２４：５０Ｂ−５０８（１９Ｂ４）　）で感染されたヒトＴ細胞系ＨＵＴ７８　（エイズ・リサーチやアンド・レファレンスφリエージェンツ・プログラム（ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｐｒｏｇｒａｍ）（“ＡＲＲＲＰ”）、ＥＲＣＩファシリティーズやサービス社（ＥＲＣＩ　Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ　５ｅｒｖ１ｃｅ　Ｃｏｒｐ、）、ｏ　ツクビル、ＭＤ−カタログ＃８９〕のゲノムＤＮＡから構築された。

ＤＮＡは５ａｕ３Ａで部分的に切断され、しかる後直線１０〜４０％スクロース勾配で分別され、２０Ｋｂ画分がＥＭＢＬ　−３アーム（Ｍａｎｊａｔｌｓ　ａｔ　ａｌ、、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｌｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、２８２−２８５（１９８２）　）に結合された。結合されたＤＮＡは製造業者の指示に従いストラタジーン・ギガバック（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ｇｉｇａｐａｃｋ）　（ストラタジーン。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてインビトロでパッケージ化された。組換えラムダファージクローンはＦｒａｎｔｌｎｉ　ｅｔａｌ、、ＡＩＤｓ　Ｒｅｓ、　Ｈｕｍ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、３：１ｌ−１７（１９８７）に記載されたＳｒＶｇａｇ　（Ｂ１６）及びエンベロープ（ＳＳ３５）プローブを用いて得られるライブラリーから得られた。完全プロウィルスを含む陽性クローンが単離され、このクローンはＨＩＶ−２ＳＢＬ／ｌｓＹと命名された。ＨＩＶ　−２ＳＢＬ／ＩＳＹ　’）　Ｏ／ハ受託番号４０５０５としてＡ　Ｔ　ＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　ＭＤ）に寄託された。

ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩｓＹ及びＨＩＶ−２クローンのＮ　Ｉ　Ｈ−Ｚ制限酵素地図は第１図の上部に示されている。明らかに示されるように、ＨＩｖ −２ｓＢＬ／ＩｓＹの制限パターンはウィルス単離物ＨＩｖ−２ＮＩＨ７から得られ６ＨＩＶ−２プロウィルスクローンＨＩＶ−２の場合と著しくＮ　Ｉ　Ｈ− Ｚ異なる。加えて、データは示さなかったが、ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩｓＹの制限パターンも旧ｖ−２ＲＯＤ及びＳＩＶ　の場合と著しく異なる。

ＩａＣＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩｓＹクローンは精製され、インサートＤＮＡは前掲のＭａｎｉａｔｉｓらの方法に従いブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター（ストラタジーン）テサフクローンを得るために用いられた。次いでこれらのサブクローンはＴａｂｏｒ　＆　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ、８４　：４７６７−４７７１（１９８７）及びＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ　、　７４　：　５４Ｈ−５４６７（１９７７）　の方法に従いシークアナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　（υＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　。

ＯＨ）を用いたジデオキシ鎖終結配列決定に用いられた。。

プロウィルス配列のＭａＸａｌｌ及びＧ１１ｂｅｒｔ配列決定もＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５６０−５８１（１９７７）で記載されたように行われた。ＨＩｖ−２ＳＢＬ／ＩＳＹプロウィルス配列は受託番号ＪＯ４４５ｇとしてＥＭＢＬ／ＧＥＮバンクに寄託された。その配列（ヌクレオチド及びアミノ酸）は第５図に示されている。

■■ｖ−２ＳＢＬ／ＩＳＹの完全ＤＮＡ配列は、ＨＩＶ−２及びＨＩＶ−２Ｒｏ、のものと比較された。

ＴＨ−ＺＨＩＶ−２配列は著しいバリエーション度を示し、結果はＨＩＶ−１配列間でもみられた。

Ｂ、ＨＩＶ−２感染細胞のサザーンプロット分析ＨＩｖ−２ＳＢＬ６ＢＢ９　’ 　ＨＩｖ−２ＮＩＨ２及びＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹで感染された細胞系からの全細胞ＤＮＡがＢａｍＨｌ、Ｘｂａ　１及びＥｃｏＲＩで切断され、０．８％アガロースゲルで電気泳動された。コントロールとして、ＳＩＶ　感染細胞のＤＮＡがまたこれらのａＣ同酵素で切断され、電気泳動された。

電気泳動後、ゲルは５ｏｕｔｈｅｒｎ　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、、９８：５（Ｉｔ　−５１７（１９７５）　）で記載されたように変性、中和され、ニトロセルロースフィルターでプロットされ、前掲のＭａｎｉａｔｉｓらに記載されたように標識プローブＢ１６又は５Ｓ３５とハイブリッド形成された。

サザーンプロット分析では第１図の下部で示されるようにウィルス配列の存在を示した。ＳＩＶｇａｇ遺伝子から誘導されたプローブのＢ１６ブローブに対するＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡのハイブリッド形成では、非りローン化親ＨＩＶ−２及びＨＩＶ−ＳＢＬ８８８９２ＳＢＬ／　ＩＳＹプロウィルスＤＮＡに関して同様の内部バンドを示したが、これはＨ”　−２ＳＢＬ／ＩＳＹが親ウィルスで感染された細胞系で存在する大多数の遺伝子型の代表であることを示している。

異なる制限パターンがＳＩＶ及びＨＩＶ−２感ＩＨ−Ｚ染細胞系のゲノムＤＮＡで観察された。ＢａｍＨＩで切断されかつ５Ｓ３５、ＳＩＶエンベローププローブとハイブリッド形成されたＤＮＡサンプルは、双方のＨＩＶ−２クローンにおいて同様の内部５Ｋｂバンド及びＳＩＶにおいて予想される８、５Ｋｂバンドを生じた。

Ｃ１新生Ｔ細胞におけるＤＮＡ　トランスフェクション約４千万個のヒト新生ＨＵ７７８細胞が１０％牛脂児血清（Ｇｆｂｃｏ）含有完全培地ＣＲＰＭＩ　−１６４０（Ｇｉｂｅｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）　）　４０ｍｌに懸濁され、３７℃で５時間インキュベートされた。インキュベート後、細胞はＲＰＭＩ　−１６４０（無牛脂児血清）で洗浄側細胞／チューブ）に分割された。次いで４ｍｌのＲＰＭｌ　−１６４Ｑ、５０ｉＭ）リス（ｐＨ７，４）及び完全プロウィルスＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹを含有した組換えファージＤＮＡ１０μｇが各チューブに加えられた。次いで１１のＲＰＭＩ−１６４０，１Ｍトリス（ｐＨ７，４）中５ＸＤＥＡＥＤｅｘｔｒａｎ（２５ｍｇ／ｍｌ　１００Ｘ）が各チューブに加えられた。チューブは穏やかに振盪しながら３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベート後、細胞は１５００　ｒｐｌｌで沈殿物化され、室温下完全培地で２回洗浄された。翌日新鮮完全培地１０１が加えられた。

処理細胞中におけるウィルス産生は、トランスフェクション後１週開目にマグネシウム依存性逆転写酵素（ＲＴ）に関して細胞培養物を試験することによりモニターされた。そのために、上澄中に細胞から発現されたタンパク質は３０％ＰＥＧ、０．４Ｍ　ＮａＣ１で沈降され、得られた沈殿物はＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　＆　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

、１４７：１１２Ｂ（１４１（１９７ｇ））で記載されたようにＶＳＢに再懸濁された。逆転写酵素は取込みトリチウムの沈降性カウントの形成に基づき見い出された。

Ｄ、感染細胞に関する免疫ケイ光ＨＩＶ感染細胞はペレット化され、５０％メタノール：５０％アセトンで１０分間かけてスライド上に固定され、ＨＩＶ−２で感染された個体から得られＰＢＳで１：４０に希釈されたヒト血清１５μＬと共に、室温で３０分間インキュベートされた。次いでスライドはＰＢＳで洗浄され、ケイ光抗ヒト抗体と共に３０分間インキュベートされた。陽性細胞はＵＶ光学顕微鏡下で計数された。

ＨＩｖ−２ＳＢＬ／ＩＳＹ　トランスフェクト細胞についての電子顕微鏡分析は、Ｂｌｂｅｒｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎ。

Ｉｎ５ｔ、、　７９：９３３−９４１（１９８７）　）で記載されかつ第２図で示されるように行われた。分析ではレンチウィルスに典型的な予想円柱形コアのある成熟ピリオン及び細胞膜から出芽する粒子の存在を示したが（第２図の挿入図参照）、これはＨＩ　Ｖ　−２ＳＢＬ／ＩｓＹ　Ｄ　Ｎ　ＡのトランスフェクトがＨＵＴ７８細胞系で産生的感染を誘導したことを示している。

ウィルス発現は、ＨＩＶ−２担持個体からの血清を用いた感染細胞の免疫ケイ光染色により確認された。

Ｅ、標的細胞系の感染ＨＵＴ７８細胞系が拡大され、ＨＩ”　−”ＳＢＬ／ＩＳＹ　ウィルスがＰｏ１ｅｓｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｆ、ＵＳＡ、７７：７４１５−７４１９（１９８０）で記載されるように、上澄約１ＯＬから濃縮された。ＨＩＶ−２単離物は並行実験で比Ｎ１）Ｉ−Ｚ較のために用いられた。１０００個のＴＣＩＤ５０感染ウィルスの相当物は、ヒト細胞系Ｈ９、ＭＯＬＴ−３、Ｕ９３７、ＨＵＴ７ｇ、ＯＥＭ、ＭＴ−２及びＴ細胞クローン５５を感染させるために用いられた。細胞系Ｈ９、ＭＯＬＴ−３、ＨＵＴ７ｇ及びＣＥＭはＡＲＲＲＰから入手できる。Ｔ細胞クローン５５はドクター・ロバート０ガロ研究所（Ｄｒ、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇａ１ｌｏ’ｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ｂｅｔｈｅｓｄｅ、　Ｍ　Ｄ　）から入手できる。Ｕ９３７及びＭＴ−２細胞系は研究目的のため我々に入手できる寄贈品であった。

各細胞系から約５Ｘ１０６個の細胞がポリブレン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）　５　μｇ／ｉ＋１で１時間処理された。

細胞はＰＢＳで洗浄され、しかる後ウィルスと共に１時間インキュベートされた。インキュベート終了時に、細胞は再び洗浄され、完全培地に再懸濁された。ウィルスの複製及び増殖は、培養上澄中における逆転写酵素活性及び前記のような固定細胞における免疫ケイ光によりモニターされた。ＨＩＶ−２単離物による感染細胞で示される生物学的効果は、異なる時間間隔で生存細胞及び融合細胞の数を計算することにより調べられた。各培養物に関する免疫ケイ光及びＲＴ活性は３日毎に調べられた。

細胞生存数はトリパンブルー染色を取込んだ細胞数を取込まない細胞数から差し引くことで計算された。融合細胞の数は光学顕微鏡下で計測された。

これら実験の詳細な結果は、ＨＩＶ−２単離ＳＢＬ／　ＩＳＹ物に関して以下の表１で報告されている。

表１ＭＴ−２１ＦＡ陽性％　ＮＤ　２０　Ｂ２ＲＴ　１８　１８　２９融合細胞　＋＋＋＋生存細胞％　８０　６１　４７ＣＬ５５　１ＦＡ陽性％　ＮＤ　’ＩＩ）　２５ＲＴ　６　２８　１４融合細胞　＋＋＋十＋生存細胞％　７０　４０　３８ＣＥＭ　ＩＦＡ陽性％　ＮＤ　４　ｌ１ｌＲＴ　７　９　１２融合細胞　十生存細胞％　９８　７６　７１ＨＵＴ７８　ＩＦＡ陽性％　２４１８ＲＴ　１３　１０　３Ｂ融合細胞　＋　＋＋生存細胞％　９０　７１　５０Ｕ９３７　１ＦＡ陽性％　３　ＮＤ　１２ＲＴ　８　７Ｂ　４１融合細胞　ＮＤ　ＮＤ生存細胞％　８５　７ｇ　７１Ｈ９ＩＦＡ陽性％　ＮＤ　１０　２０ＲＴ　１８　ＮＤ　９０融合細胞　＋　十＋＋＋÷ 生存細胞％　ｌｉ８　Ｈ４１Ｍ０ＬＴ３　１ＦＡ陽性％　ＮＤ　８　１５ＲＴ　９　１８　４９融合細胞　◆　＋＋　＋＋÷ 生存細胞％　７７　５８　４８ＩＦＡ−免疫ケイ光アッセイＲＴ　−ｃｐａＸ　１０３融合細胞−十生存細胞％−トリバンブルーを取込まない細胞率上記結果に加えて、ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹ及びＨＩＶ−２Ｎ！□−Ｚは、双方ともＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ細胞系ＭＴ−２、Ｔ細胞りｏ−ン５５　（ＨＴＬＶ−１（７）単一欠陥コピーで不死化されている）並びにＣＥＭ、ＨＵＴ７８、ＭＯＬＴ３、Ｈ９及びＵ９３９新生物細胞系に感染シタ。ｍｆｙ４ルｘＨＩＶ−２はＨＵＴ７８、ＵＢＬ６６６９３７クローン１６、ＣＥＭ及びジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞に感染する。

ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹ及びＨＩＶ−２の双方で示Ｎ　］　Ｈ−Ｚされる最大細胞変性効果はＨＴＬＶ−１感染細胞及びＨ９細胞で観察されたが、その結果は細胞培養物中に存在する最大数の融合細胞とも一致する（第４図）。

親ウィルスＨＩＶ−２は下記表２で示されるようにジＢＬ８８Ｂヤーカット及びＵ９３７−１６細胞系で最大細胞変性効果を示した。

ジャーカット　ＲＴ　１３　１２　７０　２１３融合細胞　今　＋＋　＋＋＋　＋＋＋ＨＵＴ７８　ＲＴ　３　２０　１７８　１５５融合細胞　＋　＋Ｕ９３７−１８　ＲＴ　１７　８　８０　２７９融合細胞　＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋ＲＴ　−ｃｐＩＩＸ１０３融合細胞−十Ｆ、ウェスターンプロット分析複製コンピテントＨＩ■−２ＳＢＬ／ＩＳＹプロウイルスＤＮＡ及びＳＩＶ　で感染されたＨＵＴ７８Ｔ細胞はｌａＣペレット化され、上澄が除去され、ウィルスをペレット化するため２０００　Ｏｒｐｍで１時間遠心された。次いでこれらのベレットは１０％ＳＤＳ　ＰＡＧＥゲル上での担持及び電気泳動用に未標識ピリオンを溶解させるため１　ｘＲＩ　ＰＡ緩衝液（５ｍＭＰＭＳ　Ｆ、　７５＋ＭＮ　ａ　Ｃ１。

２５■Ｈトリス−ｐＨ７，５，０，５％ＳＤ、５％トリトンＸ−１００，５％デオキシコール酸）に再懸濁された。

ゲルは電気泳動され、タンパク質はニトロセルロースフ　。

イルターに移され、フィルターはＴｏｖｂｌｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ１　、υＳＡ、７８：４１５０−４３５３（１９７９）で記載されるようにＰＢＳ中５％ドライミルクと１時間反応せしめられた。

上記処理後、フィルターは正常ヒト血清（ＮＳ）；ＳＩＶ　で感染されたマカクザルからの血清（１）；謡ａＣＨＩＶ−２で感染されたヒトからの血清（２及び３）；コントロールマウス腹水（Ｃ）；ＳＩＶのＨＩＶ−２／ＳＩＶ　主要ｇａｇタンパク質（ｐ２４−２６）に対ＳａＣ− するマウスモノクローナル抗体（Ｆ５）とハイブリッド形成された。ヨウ素化スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｅｅｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａが免疫複合体を検出するために用いられた。結果は第３図で示されている。

ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹ及びＳＩｖ　ピリオンで検出さａＣれた最も反応性でかつ見掛上鏝も豊富なウィルスタンパク質はｇａｇｐ２４−２６及びｐ１５タンパク質であった（第３図の最初の２パネル）。同様の結果は放射性同位元素標識Ｈ■■−２ＳＢＬ／ＩＳＹピリオンタンパク質が放射線免疫沈降（ＲＩ　Ｐ）アッセイで用いられた場合にも得られた（第３図の左パネル）。

エンベロープ糖タンバり質ｇｐ１２０は免疫沈降でほとんど検出されず、ウェスターンプロットでは全く検出されなかった。

複製コンピテントプロウィルスクローンのＤＮＡ配列は、エンベロープ遺伝子の軽層部分における終結コドンを欠き、約４０Ｋｄの軽層エンベロープ糖タンパク質を生じるであろう。実際に、４０Ｋｄ周辺の非常に弱いバンドは陽性ヒト血清を用いてＨ”　−２ＳＢＬ／ＩｓＹのＲＩＰ又はウェスターンプロット分析で検出できた。異なる相対的移動速度のスミア（ｓｍｅａｒ）　、おそらく代表的なタンパク質はＳＩＶ　において３０Ｋｄ周辺で検出された。こｌａＣのスミアは軽層タンパク質の端部切除形であると考えられるが、終結コドン後のアミノ酸配列は感染動物で発現ＳｌｖのＨＩｖ−２ｓＢＬ１１８Ｙで感染された細胞は３５Ｓ−メチオニン及び３５ｓ−システィン（１００μＣｉ／ｉｆ）が補充されたＲＰＭＩ培地中で４時間インキュベートされ、ペレット化され、標識ウィルスをペレット化するため上澄が２０００　Ｏｒｐｍ＋で１時間遠心された。

標識溶解物は正常ヒト血清及びセファロース結合タンパク質Ａで一夜にわたり前清澄化された。前清澄化溶解物の一部はＨＩＶ−２感染ヒト又はＳＩＶ感染サルからの血清と共にインキュベートされ、免疫複合体がセファロースに結で単離された。サンプルは１０％ＳＤＳ　ＰＡＧＥで電気泳動され、ゲルはエンハンサ− （Ｄｕｐｏｎｔ　Ｂｏｓｔｏｎ、ボストン、ＭＡ）で３０分間処理され、乾燥され、オートラジオグラフィーに付された。結果は第３図で示されている。

ＨＩＶ−２，８Ｙ　’：’ソＴンＦＩＧ、　２伍存＃３Ｒ２圭（刈　！存徊θ神（ス）ＤＮＡ西１１Ｕ５δＬＩＳγめ１１フ賦５＝ｔｃ−ｙｌｂｉｔｔ＞ＦｄＦＦｊＦＩＧ、　５−１ＦＩＧ、５−２ＦＩＧ、５−５ＦＩＧ、　５−６ＦＩＧ、　５−９ＦＩＧ、　５−１０ＦＩＧ、　５−１１ＦＩＧ、　５−１２ＦＩＧ、　５−１３ＦＩＧ、　５−１４ＦＩＧ、５−１５ＦＩＧ、　５−１６ＦＩＧ、５−１７ＦＩＧ、　５−１８ＦＩＧ、　５−１９ＦＩＧ、　５−２０ＦＩＧ、　５−２１ＦＩＧ、　５−２２ＧＬｕＰｒｏＬｅｕＧＬｎＨＩｔｌ　ＬｅＳｅｒＨ１ｓＨ１ａＡｒｇＶａｔＭε Ｔ−−−ＧＬｎＡＬａＬｅｕＬｅｕＧＬｙＣｙｓＴｙｒＦＩＧ、　５−２３ＦＩＧ、　５−２４ＦＩＧ、　５−２５ＦＩＧ、　５−２６ＦＩＧ、　５−２７ＦＩＧ、　５−２８ＦＩＧ、　５−２９ＦＩＧ、　５−３０ＦＩＧ、　５−３１ＦＩＧ、　５−３２ＦＩＧ、　５−３３補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の劇←−釦平成　３　年　９　月　３０日特許庁長官　深　沢　亘　殿　圃１゜　特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０１４４６２、発明の名称複製コンピテントヒト免疫不全２型プロウイルスクローンの特徴化３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国バージニア用、スプリングフィールド、ポート、ロイヤル、ロード、５２８５名　称　アメリカ合衆国４、代　理　人（郵便番号１００）東京都千代田区丸の内三丁目２番３号国際出願時における請求の範囲１−６項を夫々対応する１−６項として補正した。

請求の範囲１．　（補正）　非切形エンベロープ膜内外タンパク質をコードする、ＨＩＶ− ２と命名された複製ＳＢＬ／ＩｓＹコンピテントＨＩＶ−２プロウィルスクローンおよびその複製コンピテント変異体。

２、（補正）下記制限酵素地図を有する、請求項１に記載のプロウィルスクローン。

３゜　（補正）下記のアミノ酸配列の１又はそれ以上をコードするヌクレオチドを含むか、又は下記のヌクレオチド配列を含むか、又は前記アミノ酸配列の変異体のいずれか若しくは非切形エンベロープ膜内外タンパク質を構成するアミノ酸配列を含んだ前記アミノ酸配列の変異体をコードする前記ヌクレオチド配列を含んでなる、ＤＮＡフラグメント。

特表千４−５０４３５８　（２２）４、（補正）ＨＩＶ感染用の動物モデルであって、ＨＩＶ感染をうけやすい宿主からなり、その宿主が押切形エンベロープ膜内外タンパク質をコードするＨ１■ −２ＳＢＬ／ＩｓＹ又はその複製コンピテント変異体で感染されるでいることを特徴とする、モデル。

５、（補正）宿主が霊長類又は霊長類に由来する細胞もしくは細胞培養物である、請求項４に記載の動物モデル。

６、（補正）霊長類がアカゲザルである、請求項５に記載の動物モデル。

ＰＣＴ／ＬＩＳ６９１０１４４６Ａｔｔａｃｆｉｒｈｅｎｔ　ｔｏ　ｃＯＲＭ　ＰＣＴ／ｌｓＡ、’２１０　５ｅｃｔｉｏｎ　Ｉｌｌ。

ｏｏｃｕｍｅｎｔｓ　Ｃ０ｎ５Ｉｄｅｒｅ（ｌ　ｔｏ　ｂｅ　ｒｅｌｅｖａｎｔ　Ｃｌａｊｍｓ窮１頁の続き［相］Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１５１５１　ＺＮＡ［相］発　明　者　ウオンースタール、フロッシ　アメリカ合衆国メト、ナンバー　３多発　明　者　ガロ、ロバート　アメリカ合衆国メ特表千４−５０４３５８　（２９）【リーラノド類、ロックビル、リン、マノア、コー；【リーラノド類、ベセズダ、ソーンデン、テラス、

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹと命名された複製コンピテントＨＩＶ−２プロウイルスクローン又はその複製コンピテント変異体。
２．クローンが下記制限プロフィールを有する、請求項１に記載のクローン。 ▲数式、化学式、表等があります▼
３．下記ヌクレオチド配列又は下記アミノ酸配列の１以上をコードするヌクレオチド配列を有したＤＮＡセグメント又はその変異体。【配列があります】【配列があります】【配列があります】【配列があります】【配列があります】【配列があります】【配列があります】
４．ＨＩＶ感染用の動物モデルであって、上記モデルがＨＩＶ感染をうけやすい宿主からなり、その宿主がＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹ又はその複製コンピテント変異体で感染されることを特徴とする、モデル。
５．宿主が霊長類又は霊長類に由来する細胞もしくは細胞培養物である、請求項４に記載の動物モデル。
６．霊長類がアカゲザルである、請求項５に記載の動物モデル。