DE69534100T2

DE69534100T2 - Diagnose und behandlung von zellproliferativen erkrankungen mit beteiligung von klonalen makrophagen

Info

Publication number: DE69534100T2
Application number: DE69534100T
Authority: DE
Inventors: Michael S. Mcgrath; Brian Herndier; Bruce Shiramizu
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-08-01
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2015-08-02
Also published as: ATE291614T1; AU3403795A; EP0772456B1; AU700490B2; CA2196776A1; EP0772456A4; DE69534100D1; JPH10503656A; WO1996004019A1; EP0772456A1; US5639600A

Description

Gebiet der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung betrifft einen rekombinanten Makrophagen; Verfahren zur Diagnose der Beteiligung von Makrophagen an einer Zellproliferationskrankheit; Kits zur Verwendung bei der Diagnose; und Verfahren zum Screenen nach einem therapeutischen Kandidaten-Mittel, welches die Lebensfähigkeit eines Makrophagen vermindert.
Hintergrund der Erfindung
Krankheiten, welche durch ein übermäßiges unkontrolliertes Zellwachstum verursacht werden, sind für tausende von lebensbedrohlichen Erkrankungen verantwortlich, welche jährlich diagnostiziert werden. Zellproliferationserkrankungen schließen die verschiedenen Krebsarten sowie Krankheiten ein, deren Ätiologie erst seit kurzem mit Zellproliferation in Zusammenhang gebracht worden ist. Besondere Beispiele schließen Astrocyten-Proliferation in den Gehirnen von AIDS-Demenz-Patienten, Arteriosklerose und Glomerulosklerose, resultierend aus von Retroviren induzierter Nierenerkrankung, ein.
Lymphome sind eine häufige Form von Krebs in HIV-infizierten Patienten. Von den ungefähr 36000 neuen Lymphom-Fällen, welche in den Vereinigten Staaten 1992 diagnostiziert wurden, sind schätzungsweise zwischen 8 und 27% in HIV-infizierten Individuen aufgetreten (Gail, M. H., et al., J. Natl. Can. Int. (1991) 83: 695–701). Somit stellt HIV-verwandtes Lymphom ein größeres klinisches Problem für Ärzte dar, welche mit der Pflege von HIV-infizierten Individuen betraut sind.
Die Biologie von AIDS-Lymphom ist umstritten und erscheint komplex. Früh in der AIDS-Epidemie begann das hochmaligne Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) in Individuen in Erscheinung zu treten, welche in Gefahr für die Entwicklung von AIDS standen (Ziegler, J., et al., N. Eng. J. Med. (1984) 311: 565–570). In den letzten Jahren ist es jedoch zu einer Erhöhung des Auftretens von NHL in HIV-infizierten Individuen gekommen (Harnly, M. E., et al., Am. J. Epi. (1988) 128(2): 261–267; Levine, A., et al., Ann. Intern. Med. (1984) 100: 7–13). Es ist klar, dass mit der Ausweitung der AIDS-Epidemie das Non-Hodgkin-Lymphom ein kontinuierlich bedeutsameres Gesundheitsproblem bei HIV-infizierten Individuen werden wird. In dem Maße, wie die Behandlung für die zugrundeliegende HIV-Erkrankung erfolgreicher wird und Patienten während längerer Zeiträume in Abwesenheit opportunistischer Infektionen überleben, werden wahrscheinlich mehr Fälle von Lymphom in dieser Patientenpopulation auftreten.
Die Non-Hodgkin-Lymphome, welche sich in HIV-1-infizierten Individuen entwickeln, lassen sich in zwei Haupt-Unterkategorien einteilen: die großzelligen Lymphome und die kleinzelligen nicht-geteilten bzw. SNCC-Burkitt-Lymphome (Ziegler, J., et al., 1984, siehe oben; Knowles, D. M., et al., Blood (1989) 73: 792–799; Bermudez, M., et al.; Am. J. Med. (1989) 86: 71–76; Gill, P., et al., J. Clin. Oncol. (1987) 5: 1322–1328; Kaplan, L. D., et al., JAMA (1989) 261: 719–724; Knowles, D. M., et al., Ann. Intern. Med. (1988) 108: 744–753; Lowenthal, D. A., et al., Cancer (1988) 61: 2325–2337). Beide Hauptklassen von Lymphomen sind hochmaligne Neoplasmen und sind vorwiegend von B-Zell-Ursprung (Ziegler, J., et al., 1984, siehe oben; Subar, M., et al., Blood (1988) 72: 667–671); allerdings kann auch die Häufigkeit von T-Zell-Lymphomen zunehmen (Presant, C. A., et al., Cancer (1987) 60: 1459–1461; Nasr, S., et al., Cancer (1988) 61: 947–951; Herndier, B., et al., VII. Intl. Conference of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), Florenz, Italien, 16.–21. Juni 1991). In der HIV-Krankheit neigen Lymphome dazu, verstreut aggressiv zu sein, wobei ungefähr 90% von B-Zellen abstammen, und 5–10% von T-Zellen abgeleitet sind. Ungefähr die Hälfte der großzelligen Lymphome werden hierin "gemischte Immunphänotyp"-Lymphome genannt, weil sie eine Mischung aus B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen enthalten. AIDS-assoziierte Non-Hodgkin-Lymphome sind üblicherweise durch ihre sehr hohen Raten des extranodalen (85–97%) (Kaplan, L. D., et al., JAMA (1989) 261: 719–724; Burkes, R. L., et al., Arch. Intern. Med. (1986) 146: 913–915; Balasubramanyam, A., et al., Chest (1986) 90: 243–246; Guarner, J., et al., Arch. Pathol. Lab. Med. (1987) 111: 254–256; Kaplan, L., et al., Ann. Intern. Med. (1989) 110: 162; Friedman, S. L., Gastroenterol. Clin. North Am. (1988) 17: 465–486) und Zentralnervensystem-Befalls (35%) (Baumgartner, J., et al., J. Neurosurg. (1990) 73: 206–211; Formenti, S. C., et al., Cancer (1989) 63: 1101–1107; Ciricillo, S., et al., J. Neurosurg. (1990) 73: 720–724) sowie ihre schlechte Antwort auf derzeitige Chemotherapie-Protokolle gekennzeichnet (Kaplan, L. D., et al., (1989) siehe oben; Bermudez, M., et al., Am. J. Med. (1989) 86: 71–76; Gill, P., et al., J. Clin. Oncol. (1987) 5: 1322–1328; Urba, W., et al., Journal of the National Cancer Institute (1990) 10: 29–37; Kaplan, L. D., et al., JCO (1991) 9(6) 929–940).
Lymphome sind im Allgemeinen eine heterogene Gruppe von Malignitäten. Ihr biologisches Verhalten reicht von indolenten, keine Therapie erfordernden, bis zu aggressiven Malignitäten mit wenigen Langzeit-Überlebenden. Das Verhalten eines Lymphoms wird von dem Immunzustand des Wirts beeinflusst. Das Risiko von B-Zell-Lymphom ist in Individuen mit Defekten der zellvermittelten Immunität drastisch erhöht. Die am besten charakterisierte dieser Gruppen sind die immunsupprimierten Fremdtransplantat-Empfänger, deren Risiko zur Entwicklung eines Lymphoms das 50- bis 60-Fache von jenem der allgemeinen Bevölkerung ist. Diese Individuen entwickeln ein Spektrum von lymphoproliferativen Krankheiten, welches von einem typischen monoklonalen immunoblastischen Lymphom bis zu einer aggressiven Form einer polyklonalen lymphoproliferativen Krankheit reicht (Frizzera, G., et al., Cancer Res. (1981) 41: 4262–4279; Hanto, D. W., et al., Cancer Res. (1981) 41: 4253–4261; Hanto, D. W., et al., Ann. Surg (1983) 198: 356–369), häufig assoziiert mit einer Infektion durch das Epstein-Barr-Virus (Hanto, D. W., et al., (1981) siehe oben; Penn, I., Transplant. Proc. (1983) 15 (Suppl. 1): S2790–S2797; Shearer, W. T., et al., N. Engl. J. Med. (1985) 312: 1151–1159). Klinisch stellen sich Lymphome in diesen Individuen aggressiv an extranodalen Stellen dar, was auf ein gemeinsames Merkmal zwischen HIV-assoziierten Lymphomen und den molekularen und klinischen Charakteristika der Fremdtransplantat-assoziierten Lymphome hinweist.
Das primäre Mittel zur HIV-Lymphom-Diagnose bleibt die mikroskopische Untersuchung von mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Schnitten aus Formalin-fixiertem Gewebe. Im Laufe der Zeit haben Pathologen klinische Präsentationen, Autopsie-Folgeuntersuchungen und die Versuch-und-Irrtum-Methode angewandt, um histologische Verfahren zum Diagnostizieren und Einstufen von Krebs zu entwickeln. Das Fehlen einer histologischen Diagnose von Krebs oder "Over-calling" eines Krebs und das Unterziehen eines Patienten unter eine Krebstherapie sind ausreichende Anreize zur Vorsehung einer genauen Diagnose. Herkömmliche histologische Verfahren können durch phänotypische und insbesondere genotypische Analysen von Lymphomen verbessert werden, wo die erkannten molekularen Änderungen des betroffenen Gewebes auf eine alternative Form der Behandlung hinweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft in vitro-Verfahren zum Diagnostizieren einer klonalen Makrophagen-Beteiligung an einer Zellproliferationskrankheit unter Anwendung von genotypischer Analyse. Das Verfahren der Erfindung ist auf eine Vielzahl von Zellproliferationskrankheiten anwendbar, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, HIV-assoziierten und nicht-HIV-assoziierten Lymphomen oder anderen Krebsarten, sowie nicht-krebsartigen Zellproliferationserkrankungen, wie AIDS-Demenz, Arteriosklerose und Nephropatie. Die Erfindung betrifft auch Kits für derartige diagnostische Verfahren und einen rekombinanten Makrophagen, nützlich in an vitro- und in vivo-Verfahren zum Screenen nach therapeutischen Mitteln, welche bei der Behandlung von Makrophagen-induziertem Krebs nützlich sind.
Die Erkenntnis, dass HIV-Lymphome häufig mit der Beteiligung klonaler Makrophagen assoziiert sind, und dass bei dem Makrophagen HIV-DNA stromaufwärts eines bekannten Onko gens, c-fes (c-fes/fps), integriert ist, wird offenbart. Wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, ist die Makrophagen-Klonalität mit vielen HIV-verwandten Lymphomen assoziiert. Die Makrophagen-Klonalität kann auch mit nicht-HIV-verwandten Lymphomen assoziiert sein. Die Expansion von Makrophagen kann das Wachstum von umgebendem Gewebe durch Sekretion von Cytokinen verstärken; von dem Cytokin Interleukin-6 wurde gezeigt, das Wachstum von Myelom- und Hybridom-Zellen zu verursachen (Woodruff, C., et al., DNA and Cell Biology 11: 587–592).
Die Diagnose der Makrophagen-Klonalität und eine Behandlung, welche auf klonale Makrophagen abzielt, bieten eine neue Richtung in der Therapie von Zellproliferationskrankheiten. Es werden diagnostische Verfahren und Kits offenbart, welche in dem Kampf zur Überwindung von durch klonale Makrophagen induzierten HIV-Lymphomen und durch klonale Makrophagen induzierten Zellproliferationskrankheiten im Allgemeinen nützlich sind.
Folglich betrifft die Erfindung, in einem Aspekt, ein in-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren der Gegenwart von klonal expandierten Makrophagen in einem erkrankten Gewebe eines Säugers und ein Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von klonal expandierten Makrophagen in einer Probe in vitro durch Bestimmung, mittels einer Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik, der Gegenwart einer retroviralen DNA-Transkriptions-Regulationssequenz in Makrophagen-DNA, integriert an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen eines Makrophagen, wobei die Stelle ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Integration zu einer klonalen Expansion des Makrophagen führt. Die Isolierung von DNA aus dem Gewebe kann durch Standardtechniken durchgeführt werden, welche dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind. Die Gegenwart von retroviraler DNA in der isolierten DNA wird durch Standardtechniken bestimmt, einschließlich, ohne darauf jedoch eingeschränkt zu sein, einer HIV-Integrationsstellen-Analyse mittels IPCR (Shiramizu, B., et al., Cancer Res (1994) 54: 2069–2072); RFLP (Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus)-Analyse von genomischen Sequenzen nahe üblichen Stellen der viralen (z. B. HIV) Integration; oder Immunglobulin(Ig)-Gen-Rearrangement-Analyse (Levy, R., et al., J. Exp. Med. (1977) 145: 1014–1028). Präferenziell schließt diese Analyse ein solches Vermischen von polyklonaler DNA ein, dass im Anschluss an eine Southern-Analyse die DNA-Banden-Intensität einer 5%igen monoklonalen Mischung bestimmt und als ein Standard verwendet wird, gegenüber dem die Klonalität der Test-DNA verglichen wird. Unter Anwendung der Technik sind monoklonale Makrophagen diejenigen, von welchen definiert wurde, mehr als eine 5%ige monoklonale DNA-Komponente innerhalb eines analysierten Gewebes aufzuweisen. Vorzugsweise ist die Technik der inversen Polymerasekettenreaktion (IPCR), verwendet zum Bestimmen der Klonalität einer Gewebeprobe, enthaltend integrierten HIV, ein wertvolles diagnostisches Werkzeug und wird nachstehend ausführlich definiert.
Die Erfindung beinhaltet des weiteren Kits zum Diagnostizieren des Vorhandenseins eines klonal expandierten Makrophagen in einem Gewebe oder einer Probe. Dies kann die Diagnose von durch Makrophagen induzierten prä-kanzerösem und kanzerösem Gewebe als Gewebe mit mehr als 5% monoklonaler DNA aus Mokrophagen beinhalten. In einem Aspekt umfasst das Kit der Erfindung ein Paar Nukleinsäureprimer für die Amplifikation einer DNA-Sequenz, isoliert aus einem Makrophagen des Gewebes oder der Probe, wobei das Primerpaar an eine retrovirale transkriptionsregulierende DNA-Sequenz hybridisiert, welche an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen in der DNA eines Makrophagen in dem Gewebe oder der Probe integriert ist, wobei die Stelle ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Integration zur klonalen Expansion des Makrophagen führt. Die Nukleinsäureprimer hybridisieren präferenziell an Regionen der 5' und/oder 3' gelegenen Long-Terminal-Repeats (lange terminale Repetitionen bzw. LTRs), so dass die DNA-Synthese in entgegengesetzten Richtungen für die IPCR-Analyse geprimed wird. In einem anderen Aspekt umfasst das Kit eine markierte (z. B. radioaktiv markierte; biotinylierte; oder anderweitig standardmäßig markierte) oder nachweisbare Sonde für die RFLP-Analyse von aus einer Probe oder einem Gewebe isolierter DNA, wobei die Integration einer retroviralen transkriptionsregulierenden Sequenz an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen in DNA eines Makrophagen mit Makrophagen-Proliferation assoziiert ist. Eine derartige Sonde hybridisiert spezifisch an einen genetischen Lokus, in welchem eine genetische Veränderung mit zellulärer Proliferation assoziiert ist, nämlich eine DNA-Sequenz nahe der Stelle der retroviralen Integration, welche mit zellulärer Proliferation assoziiert ist. Derartige Stellen schließen eine Stelle ein, in welche ein Virus integrieren kann und ein wachstumsförderndes Zellproliferationsgen steuern kann. Ein Kit der Erfindung kann auch Antikörper zum Nachweisen von makrophagenspezifischen Zelloberflächenproteinen einschließen, um Makrophagen in einer Gewebeprobe zu isolieren und zu identifizieren.
Das diagnostische Verfahren der Erfindung kann auch das Vergleichen der Klonalität von Test-DNA zur Kontrolle von HIV-enthaltender DNA umfassen, um die Beteiligung von HIV-enthaltenden klonalen Zellen (z. B. klonaler Makrophage) an der Gewebe-Morphologie anzuzeigen. Die Beteiligung von klonalen Makrophagen wird durch anfängliches Sortieren zu zellulären Subpopulationen (mittels einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungs(FACS)-Technik oder Makrophagen-Adhäsion an Glas oder Kunststoff; oder einer anderen im Fachgebiet gut bekannten Technik), gefolgt von DNA-Analyse, bestimmt. Alternativ dazu wird eine Analyse der DNA aus einer gemischten zellulären Population durchgeführt, gefolgt von Zweifach-Färbung oder in situ-Hybridisierung einer Gewebepräperation, um klonales HIV mit den Makrophagen zu korrelieren.
Das diagnostische Verfahren der Erfindung beinhaltet auch eine Analyse der Klonalität von nicht-HIV-assoziierten Makrophagen. Das Verfahren beinhaltet das Isolieren von Test-DNA aus einer Mischung von Zellen oder einer vorsortierten Subpopulation von Makrophagen aus prä-kanzerösem oder kanzerösem Gewebe, gefolgt von RFLP-Analyse der Test-DNA. Eine RFLP-Analyse der Erfindung verwendet eine Nukleinsäuresonde, welche an eine genomische Sequenz hybridisiert, codierend eine übliche virale (z. B. HIV) Integrationsstelle, die mit zellulärer Proliferation nach der viralen Integration assoziiert ist. Zum Beispiel hat man eine HIV-Integration in genomische DNA im z-Exon des fur-Gens sowohl in T-Zellen (Shiramizu, B., et al. (1994), siehe oben) als auch in Makrophagen, wie hierin beschrieben, beobachtet.
Unter Anwendung des diagnostischen Verfahrens der Erfindung kann die Abwesenheit von HIV-Klonalität eine nicht-HIV-assoziierte klonale Makrophagen-Beteiligung an der Gewebemorphologie anzeigen. Die Abwesenheit von sowohl HIV- als auch Makrophagen-Beteiligung ist unter Verwendung des Kits der Erfindung ebenfalls erkennbar. Die Diagnose der Makrophagen-Beteiligung versieht den Arzt mit wichtigen Informationen zum Aufstellen eines passenden Behandlungsschemas für den Patienten.
Die Erfindung beinhaltet einen isolierten Makrophagen eines Säugers, in dessen Genom eine retrovirale transkriptionsregulierende Sequenz integriert ist, welche derartig relativ zu einem Zellproliferationsgen des Makrophagen positioniert ist, dass die Gegenwart der transkriptionsregulierenden DNA-Sequenz und des Zellproliferationsgens zur Proliferation (Expansion) des Makrophagen führt.
Die Zellproliferation kann das Ergebnis einer substanziell erhöhten Expression eines Cytokingens oder eines anderen Zellproliferationsgens, wie eines Onkogens, sein. Ein Beispiel ist die in das z-Exon des Makrophagen-fur-Gen erfolgende Integration eines starken Promotor- und/oder Enhancer-Elements (z. B. ein HIV-Genom; ein defektes HIV-Genom, worin die Enhancer-Region eines HIV-3'-LTR funktional ist; die Enhancer-Region eines HIV-3'-LTR) oder eines anderen Promotor- oder Enhancer-Elements, fähig zur wesentlichen Erhöhung der Expression eines nahegelegenen Gens (wobei mit nahegelegen innerhalb von etwa 12 kb, vorzugsweise etwa 10 kb, oder weiter bevorzugt etwa 5 kb von der Transkriptions-Startstelle gemeint ist), so dass die Expression des stromabwärts gelegenen c-fes/fps-Gens substanziell erhöht ist im Verhältnis zur c-fes/fps-Expression in einem Makrophagen, innerhalb dem kein Promotor- oder Enhancer-Element integriert ist. Die HIV-Integration in oder nahe dem c-sis (PDGF-B-Gen) eines Makrophagen fördert die Makrophagen-Proliferation.
Die Integration einer DNA-Sequenz, codierend einen starken Promotor (und gegebenfalls ein Enhancer-Element), funktionstüchtig verknüpft an ein wachstumsförderndes Zellproliferationsgen, in das Makrophagengenom wird durch molekularbiologische Standardtechniken bewerkstelligt (z. B. Zuführung der transfizierenden DNA in Liposomen) (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Green Publishing Associates, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989). Rekombinante Makrophagen werden hinsichtlich einer erhöhten Expression von c-fes/fps durch hierin beschriebene Techniken gescreent. Alternativ dazu werden die transkriptionsregulierenden Regionen an ein Zellproliferationsgen auf einer DNA-Expressionskassette fusioniert, welche in das Makrophagengenom integriert wird. Die Expression des Zellproliferationsgens der Kassette führt ebenfalls zur Zellproliferation. Rekombinante Makrophagen werden auch hinsichtlich der Fähigkeit gescreent, Zellproliferation relativ zu nicht-rekombinanten Makrophagen zu erhöhen, wenn sie in eine Population von B- und/oder T-Zellen eingebracht werden.
Makrophagen, welche erhöhte Spiegel an Zellproliferations-Regulierungsgen exprimieren, wie das Onkogen c-fes/fps oder c-sis, sind nützlich zum Screening von therapeutischen Mitteln in vitro hinsichtlich des Vermögens, das Wachstum solcher Makrophagen zu inhibieren. Das Screeningverfahren der Erfindung sieht kultivierte rekombinante Makrophagen vor, welche einen wesentlich erhöhten Spiegel an c-fes/fps oder c-sis in einem angemessenen Kulturmedium exprimieren. Zu den kultivierten rekombinanten Makrophagen wird ein therapeutisches Mittel in einer geeigneten Formulierung zur Zuführung des therapeutischen Mittels an den rekombinanten Makrophagen zugesetzt. Der Effekt der Verabreichung des Mittels wird als reduziertes Zellwachstum, reduzierte Zelllebensfähigkeit, reduzierte c-fes/fps- oder c-sis-Expression und/oder reduzierte Cytokin-Expression verfolgt. Verfahren zur Überwachung von Zellwachstum und -lebensfähigkeit sind im Fachgebiet gut bekannt. Verfahren zur Überwachung der c-fes/fps- und Cytokin-Expression sind hierin beschrieben. Therapeutische Mittel, welche eine Reduktion in den überwachten Phänotypen verursachen, werden als Kandidatenverbindungen oder -formulierungen für die Behandlung von Makrophagen-induzierten Krebsarten, wie jenen, welche in der Tabelle II aufgelistet sind, ausgewählt.
Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Screenen nach einem therapeutischen Kandidatenmittel, welches die Lebensfähigkeit eines Makrophagen verringert, in vivo. Die Fähigkeit des Mittels, einen rekombinanten Makrophagen (z. B. einen klonal expandierten Makrophagen, bei welchem eine transkriptionsregulierende Sequenz für die erhöhte Expression eines Zellproliferationsgens integriert ist) aus dem Wirt substanziell zu eliminieren, kann bestimmt werden. Der rekombinante Makrophage wird in das entsprechende Gewebe des Wirts (z. B. die Milz, das periphere Blut, die Haut oder das Knochenmark) injiziert, und das Wachstum eines Tumors, welcher den rekombinanten Makrophagen enthält, wird überwacht. Dann wird dem Wirt ein therapeutisches Kandidatenmittel in einer Formulierung für die präferenzielle Aufnahme durch einen Makrophagen verabreicht, wobei die Verabreichung bei einer Dosis, einem Intervall und während einer Dauer durchgeführt wird, welche ausreichend ist, um den rekombinanten Makrophagen im Wesentlichen aus dem Wirt zu eliminieren.
Dieses Verfahren kann angewandt werden, um ein therapeutisches Kandidatenmittel für die Behandlung von Zellproliferationskrankheit, induziert durch die Gegenwart von klonal expandierten Makrophagen, zu identifizieren. Das Screeningverfahren beinhaltet die Transplantation von Säuger-Tumorgewebe, enthaltend klonal expandierte Makrophagen (wie einen rekombinanten Makrophagen, welcher ein wachstumsförderndes Zellproliferationsgen in funktionstüchtiger Verknüpfung an eine funktionelle transkriptionsregulierende Region, wie eine Promotor/Enhancer-Region, enthält), in einen Säuger (wie eine Maus mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID-Maus)). Ein Krebs oder eine andere Zellproliferationskrankheit wird sich in dem Säuger, der das implantierte Gewebe enthält, entwickeln gelassen. Ein therapeutisches Mittel wird an den Säuger verabreicht, um zu bestimmen, ob die Verabreichung des Mittels zu einer Reduktion in der Größe des Tumors, einer Reduktion in der Lebensfähigkeit des klonalen Makrophagen oder einer Reduktion der Proliferation des klonalen Makrophagen führt.
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls ein in-vitro-Verfahren zum Screenen nach einem therapeutischen Kandidatenmittel, welches die Lebensfähigkeit eines Makrophagen verringert, umfassend das Kontaktieren eines Makrophagen der Erfindung mit einem therapeutischen Kandidaten-Mittel in vitro und das Bestimmen des Effekts des Kandidaten-Mittels auf die Lebensfähigkeit des Makrophagen.
Eine Zellproliferationskrankheit, bei welcher klonaler Makrophage beteiligt ist, kann behandelt werden, indem zuerst die Gegenwart eines klonal expandierten Makrophagen in dem erkrankten Gewebe bestimmt wird. Als Zweites wird der Makrophage aus dem erkrankten Gewebe im Wesentlichen eliminiert durch Verabreichen eines therapeutischen Mittels, welches in einer Formulierung für die präferenzielle Aufnahme durch einen Makrophagen vorliegt, an den Säuger (vorzugsweise einen Menschen), welcher das erkrankte Gewebe enthält. Die Verabreichung wird bei einer Dosis, bei einem Intervall und während einer Dauer durchgeführt, welche ausreichend ist, um die Makrophagen (einschließlich der klonal expandierten Makrophagen) im Wesentlichen aus dem Säuger zu eliminieren, gefolgt von einer Unterbrechung der Verabreichung des therapeutischen Mittels, so dass die Makrophagenpopulation des Säugers regeneriert wird.
Bei dem therapeutischen Mittel kann es sich um DNA, welche Antisense-mRNA von einem Zellproliferationsgen codiert, handeln. Das Ziel-Zellproliferationsgen ist ein solches, positioniert nahe (d. h. innerhalb von 12 kb, vorzugsweise innerhalb 5 kb Abstand zu) einer üblichen bzw. gewöhnlichen Stelle der HIV-Integration, wobei von der üblichen Stelle der HIV-Integration durch das diagnostische Verfahren der Erfindung gezeigt wird, klonal mutiert zu sein. Die Einbringung der Antisense-codierenden DNA in das Makrophagengenom und die Expression der Antisense-mRNA verringert die Expression des Zellproliferationsgens.
Das therapeutische Mittel kann DNA umfassen, codierend eine Mutantenform eines Zellproliferationsgens, so dass die Rekombination in das endogene Zellproliferationsgen des Makrophagengenoms dazu führt, dass die Mutation in das Genom eingebaut wird. Die Mutation des Zellproliferationsgens ist so ausgelegt, dass die Genexpression im Wesentlichen eliminiert wird oder dass das exprimierte Gen ein im Wesentlichen nicht-funktionales Genprodukt erzeugt.
Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wird verstehen, dass jedes aus einer Vielzahl von herkömmlichen Gentransferverfahren für die Einbringung von Genen in Zellen angewandt werden kann. Beispielsweise schließen physikalische Verfahren für die Einbringung von DNA in Zellen Mikroinjektion (siehe z. B. Capecchi et al., Cell 22: 479, 1980), Elektroporation (siehe z. B. Reiss et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: 244, 1986) und andere Standardverfahren ein. Chemische Verfahren, wie Copräzipitation mit Calciumphosphat und Einbringung von DNA in Liposomen, sind ebenfalls angewandt worden, um DNA in Säugerzellen, insbesondere Makrophagen, wie hierin beschrieben, einzuführen. Schließlich kann die Zuführung von Nukleinsäuren in Säugerzellen durch die Verwendung von viralen Vektoren durchgeführt werden, insbesondere jenen, welche aus Maus- und Vogel-Retroviren abgeleitet sind (siehe, z. B., Gluzman et al., Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).
Im Handel erhältliche cytotoxische therapeutische Mittel, wie Trichosanthin (Lifson, J. D., et al., USPN 4 795 739; USPN 4 869 903; McGrath, M. S., et al., PNAS (1989) 86: 2844–2848), alpha- oder beta-Momorcharin (Lifson, J. D., et al., siehe oben), andere einzelkettige Ribosomen-inaktivierende Proteine oder andere cytotoxische Mittel, welche auf dem Gebiet der HIV-Inhibition oder Krebstherapie gut bekannt sind, können eingesetzt werden. Das Cytotoxin kann mehrere Mittel umfassen, so dass die kombinierten Wirkungen der Mittel zu einer Cytotoxizität führen.
Trichosanthin ist ein Pflanzenprotein, erhalten aus der Wurzelknolle von Trichosanthes kirilowii. Es besitzt Homologie zu der Aminosäuresequenz der Ricin-A-Kette und kann Ribosomen-inhibierende Eigenschaften besitzen, ähnlich zu Ricin und verschiedenen einzelkettigen Ribosomen-Inhibitor-Proteinen, wie Momorcharin, Kermesbeeren- bzw. Pokeweed-Antiviral-Protein (PAP), Weizenkeim-Inhibitor und Gelonin (Xuejun) (Lifson, J. D., et al., siehe oben). Trichosanthin und Momorcharin inhibieren die Expression von HIV-Antigenen in humanen Blutzellen, einschließlich Makrophagen (Lifson, J. D., et al., siehe oben).
Beispiele von anderen cytotoxischen oder proliferationsmodulierenden Mitteln schließen Daunomycin, Mitomycin C, Daunorubicin, Doxorubicin, 5-FU, Cytosinarabinosid, Colchicin, Cytochalasin B, Bleomycin, Vincristin, Vinblastin, Methotrexat oder dergleichen ein. Ebenfalls von Interesse sind toxische Mittel, welche aus Mikroorganismus- oder Pflanzen-Quellen abgeleitet werden können. Beispiele schließen die toxischen Untereinheiten von natürlich vorkommenden Toxinen, wie Ricin, Abrin, Diphterietoxin, Saporin und dergleichen, ein. Veranschaulichende toxische Untereinheiten schließen die A-Ketten von Diphtherietoxin, enzymatisch aktive proteolytische Fragmente von Exotoxin-A von Pseudomonas aeruginosa, die Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette und Proteine mit ähnlicher Aktivität, gefunden in verschiedenen Pflanzen, wie den Pflanzen Gelonium multiflorum, Phytolacca americana, Croton, Tiglium, Jatropha, Curcas, Momordic, Charantia, Reachan, das Toxin Saporin aus Saponaria officinalis (Thorpe et al., J. National Cancer Institute (1985) 75: 151), und das chinesische Gurken-Toxin Trichosanthin (Yeung et al., Intl. J. of Peptide Protein Res. (1985) 27: 325–333) ein. Mutante Arten der Toxine können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise CRM 45 (Boquet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1976) 73: 4449–4453).
Das Behandlungsverfahren für die Zellproliferationskrankheit kann eine Liposomen-Präparation beinhalten, welche innerhalb des Liposoms einen makrophagen-spezifisches Cytotoxin oder ein cytotoxisches Breitbandmittel enthält. Ein derartiges Cytotoxin-enthaltendes Liposom wird hergestellt, um eine angemessene Größe für die Aufnahme des Cytotoxin-enthaltenden Liposoms präferenziell durch eine phagocytische Zelle des mononukleären Phagocyten-Systems (z. B. einem Makrophagen) aufzuweisen. Ein bevorzugtes Cytotoxin zur Verwendung in einer Makrophagen-"Suizid"-Technik ist Dichlormethylen-Bisphosphonat (Cl₂MBP oder Clodronat), wie beschreiben von Van Rooijen und Sanders (Van Rooijen, N., und Sanders, A. (1994) J. Imm. Methods 174: 83–93).
Das Targeting bzw. Ziellenken des Cytotoxin-enthaltenden Liposoms zu einem Makrophagen sieht die Spezifität der Zuführung und eine erhöhte Aufnahme vor. Das Ziellenken wird durch Einbau oder Anheftung eines Makrophagen-spezifischen Antikörpers, wie Anti-CD14, an das Liposom bewerkstelligt. Passende Lipide und andere Mittel und Verfahren für die Herstellung von therapeutischen Liposomen sind im Fachgebiet gut bekannt (siehe z. B. Martin, F. J., und Papahadjopoulos, D., J. Biol. Chem. 257: 286–288, (1982); Szoka, F., und Papahadjopoulos, D., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467–508, (1980); und Ostro, M. J. (Hrsg.) Liposomes From Biophysics to Therapeutics, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
Die Krebsbehandlung kann zusätzlich einen Anti-Makrophagen-Zelloberflächen-Antikörper beinhalten, kovalent angeheftet an ein cytotoxisches Mittel, so dass das cytotoxische Mittel präferenziell von einem Makrophagen, im Anschluss an eine Anlagerung des Zelloberflächen-Antikörper-Cytotoxin-Komplexes an einen Makrophagen-Zelloberflächen-Marker, aufgenommen wird. Die Aufnahme des Komplexes erfolgt durch einen phagozytischen Prozess, welcher für den Makrophagen normal ist.
Das proliferationsmodulierende Mittel und das Targetingmittel, welches eine Bindung an die extrazelluläre Matrix vorsieht, können verknüpft werden, üblicherweise durch eine Bindung, welche entweder intra- oder extrazellulär durch Reduktionshydrolyse enzymatisch spaltbar ist, oder durch eine Bindung, welche säurelabil ist. Der Typ der verwendeten Bindung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, jedoch insbesondere der Natur des proliferationsmodulierenden Mittels. Wo das Mittel beispielsweise ein solches ist, welches von einer Zelle internalisiert werden muss, um einen Effekt zu zeigen, wie ein Toxinmolekül oder eine Toxin-A-Kette, ist es zu bevorzugen, dass die Bindung an die Targeting-Einheit gespalten werden kann. Die Targeting-Einheit kann an ein Arzneimittel entweder direkt oder indirekt durch Trägermoleküle, wie Serumalbumin (insbesondere humanes Serumalbumin), Polyaminosäuren, Dextran und dergleichen, durch Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, verknüpft werden. Die Verwendung eines Trägermoleküls erlaubt die Bindung von mehreren Molekülen des proliferationsmodulierenden Mittels an das Linker-Molekül, vorzugsweise 10 bis 30 Moleküle pro Molekül Trägermolekül für eine antiproliferative Verbindung, oder 1 bis 2 Moleküle pro Molekül Trägermolekül für ein Toxinmolekül.
Der verwendete Bindungstyp kann auch von dem Zelltyp vorgeschrieben werden, welcher das letztendliche Ziel der proliferationsmodulierenden Aktivität ist. Somit handelt es sich bei der Bindung vorzugsweise um eine pH-labile oder säure-labile Bindung zwischen der Targeting-Einheit und der proliferationsmodulierenden Einheit in Fällen, bei welchen die Zellen phagozytotische Eigenschaften besitzen, zum Beispiel Fibroblasten und Makrophagen. Ebenfalls von Interesse sind Peptidbindungen, welche für eine Hydrolyse durch Enzyme anfällig sein werden, die ebenfalls in der extrazellulären Matrix vorhanden sein können. Zweckmäßige Bindungen schließen somit Disulfide, Imide, Hydrazone, Amide und dergleichen ein.
Die Krebsbehandlung kann zusätzlich die ergänzende Behandlung der Nicht-Makrophagen-Zellen des Tumors durch herkömmliche Krebstherapieverfahren beinhalten, so dass sowohl der klonal expandierte Makrophage des Tumors als auch die Nicht-Makrophagen-Zellen des Tumors jeweils im Wesentlichen eliminiert werden.
Mit "klonaler Makrophage" oder "klonal expandierter Makrophage" werden identische Kopien eines Makrophagen bezeichnet, welche von einem einzelnen Vorläufer-Makrophagen abstammen.
Mit "Klonalität von DNA" wird der Grad gemeint, zu welchem aus einer Zellpopulation isolierte DNA gleich ist, wie bestimmt durch das Muster von erkennbaren DNA-Charakteristika, wie RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus), Gen-Rearrangements mittels Southern-Analyse, IPCR oder anderen Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Folglich wird eine Gewebeprobe als eine monoklonale Makrophagen-Komponente aufweisend bezeichnet, wenn die Ausführung des diagnostischen Verfahrens der Erfindung zu einem eindeutigen HIV-spezifischen und/oder Makrophagen-spezifischen DNA-Bandenmuster von gleicher oder größerer Intensität als eine 5-%-Kontrollprobe führt.
Mit "5%-Kontrollprobe" ist eine Probe von bekannter polyklonaler DNA gemeint, zu welcher eine Probe von bekannter monoklonaler DNA zugesetzt worden ist, um 5% der Gesamt-DNA auszumachen.
Mit "Promotor" ist eine Minimalsequenz gemeint, ausreichend, um die Transkription zu steuern. Ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen sind diejenigen Promotorelemente, welche ausreichend sind, um eine Promotor-abhängige Genexpression regulierbar hinsichtlich Zelltyp-Spezifität oder induzierbar durch externe Signale oder Mittel zu machen; derartige Elemente können in den 5'- oder 3'-Regionen des nativen Gens lokalisiert sein.
Mit "integriert in das Genom" wird exogene DNA (wie eine Expressionskassette oder virale Sequenz) gemeint, welche linear innerhalb der genomischen-DNA-Kette einer Zelle (wie einem Makrophagen) eingebaut und an jedem seiner Enden mit der genomischen DNA verbunden ist. Exogene DNA, codierend eine Expressionskassette, wird so integriert, dass funktionelle RNA oder Proteine durch die codierten Sequenzen hergestellt werden. Eine exogene virale Sequenz wird so integriert, dass die Expression von nahegelegenen endogenen [...].
Mit "Enhancer" wird eine minimale Sequenz gemeint, ausreichend zur Verstärkung der Transkription substanziell über Wildtyp-Spiegel. Ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen sind diejenigen Enhancer-Elemente, welche ausreichend sind, um die Promotor-abhängige Genexpression, welche hinsichtlich Zelltyp-Spezifität regulierbar oder durch externe Signale oder Mittel induzierbar ist, zu verstärken; solche Elemente können in den 5'- oder 3'-Regionen des nativen Gens lokalisiert sein.
Mit "pharmazeutisch wirksame Menge" ist eine Menge an einem Mittel (wie einem therapeutischen Mittel) gemeint, welche bei Verabreichung an eine Zelle oder einen Säuger zu einem gewünschten physiologischen Effekt führt (wie Cytotoxizität, verringerte Lebensfähigkeit oder wesentlich verringerte Proliferation).
Mit "wesentliche Erhöhung" oder "substanziell über" wird eine Erhöhung der Expression, Transkription oder eines anderen Prozesses über den Wildtyp-Spiegel dieses Prozesses hinaus gemeint, wobei die Erhöhung mindestens ungefähr 50% über dem Wildtyp liegt.
Mit "substanziell verringert" oder "wesentliche Verminderung" wird eine Verringerung oder Reduktion der Expression, Transkription oder eines messbaren phänotypischen Merkmals gemeint, welche ungefähr 80% des Wildtyp-Spiegels beträgt, vorzugsweise auf ungefähr 50% des Wildtyp-Spiegels reduziert ist, oder stärker bevorzugt auf ungefähr 10% oder weniger des Wildtyp-Spiegels reduziert ist.
Mit "im Wesentlichen eliminiert" oder "substantielle Beseitigung" wird eine Verringerung der Zellzahl gemeint, so dass weniger als ungefähr 50% der Zellen lebensfähig bleiben, vorzugsweise weniger als ungefähr 20% der Zellen lebensfähig bleiben, oder weiter bevorzugt weniger als 10% der Zellen lebensfähig bleiben.
Mit "wesentlich verringerte Lebensfähigkeit" wird eine Verringerung der Anzahl von lebenden Zellen in einer Population von Zellen relativ zu einer Kontrollpopulation gemeint, so dass weniger als ungefähr 50% der Zellen lebensfähig bleiben, vorzugsweise weniger als ungefähr 20% der Zellen lebensfähig bleiben oder weiter bevorzugt weniger als 10% der Zellen lebensfähig bleiben.
Mit "prä-kanzeröses Gewebe" wird Säugergewebe gemeint, welches bei histologischer Untersuchung und chirurgisch-pathologischer Auswertung, welche dem Fachmann auf dem Gebiet der Pathologie gut bekannt sind, hyperplastisch ist.
Mit "kanzeröses Gewebe" wird Säugergewebe gemeint, welches nicht länger unter der normalen Kontrolle von Wachstumsregulatoren steht. Die kanzeröse Natur von Säugergewebe wird durch chirurgisch-pathologische Auswertung bestimmt, welche dem Fachmann auf dem Gebiet der Pathologie gut bekannt ist.
Mit "Antisense" wird Nukleinsäure gemeint, wobei der nicht-codierende Strang eines Zielgens von Interesse für die Expression so in einem Konstrukt positioniert ist, dass, bei Expression als mRNA, die einzelsträngige Antisense-mRNA komplementär ist zur mRNA des Ziel-Gens und daran hybridisieren kann, wodurch ihre Nutzung moduliert wird. Die zu einer Sequenz der Botschafter-RNA komplementäre Sequenz wird üblicherweise eine Länge von mindestens etwa 15 Nukleotiden, noch üblicher mindestens etwa 20 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 30 Nukleotiden oder mehr, und noch üblicher weniger als 1000 Nukleotiden aufweisen.
Die jeweiligen Stelle(n), an welche die Antisense-Sequenz bindet, und die Länge der Antisense-Sequenz werden in Abhängigkeit von dem gewünschten Ausmaß der Inhibition, der Einzigartigkeit der Sequenz, der Stabilität der Antisense-Sequenz oder dergleichen variieren. Deshalb werden diese Faktoren empirisch basierend auf der Erfahrung bestimmt, welche mit einer besonderen Antisense-Sequenz erhalten wurde.
Mit "funktionstüchtig verknüpft" wird gemeint, dass eine zu exprimierende Nukleinsäuresequenz am 5'-Ende an ein funktionales Promotorelement fusioniert ist, einschließlich transkriptionaler und translationaler (falls zutreffend) Initiationsstellen, und am 3'-Ende an eine funktionale transkriptionelle und translationale (falls zutreffend) Terminationssequenz fusioniert ist.
Mit "Nukleinsäure-Primer" wird eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise DNA, gemeint, welche an eine Nukleinsäuresequenz von Interesse zum Primen einer DNA-Synthese durch DNA-Polymerase hybridisiert. Die Nukleinsäure-Primer der Erfindung sind zur Verwendung in dem Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren und dem inversen Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren (Shiramizu, B., et al. (1994), siehe oben) und wie hierin beschrieben entworfen.
Mit "markierte Nukleinsäuresonde" wird eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz gemeint, an welche eine Markierung angeheftet ist (wie eine radioaktive Markierung; eine Biotinylierungs-Einheit; oder eine andere Markierung, welche im Fachgebiet bekannt und in Southern- und Northern-Analysen nützlich ist). Die Nukleinsäuresequenz der in dem diagnostischen Verfahren der Erfindung verwendeten markierten Sonde hybridisiert an eine genomische Sequenz nahe (d. h. innerhalb von 5 kb, vorzugsweise innerhalb 1 kb) einer üblichen HIV-Integrationsstelle. Die HIV-Integration an der Stelle ist mit einer erhöhten Proliferation der infizierten Zelle assoziiert. Ein Beispiel einer derartigen üblichen Integrationsstelle ist das z-Exon des fur-Gens, wobei die HIV-Integration mit Makrophagen-Proliferation (wie hierin beschrieben) oder T-Zell-Proliferation (Shiramizu, B., et al., (1994), siehe oben) assoziiert ist.
Mit "Zellproliferation" ist ein erhöhtes Zellwachstum in einer Testpopulation über der Rate des Zellwachstums (z. B. Zellteilung) einer Kontrollpopulation gemeint, so dass das Zellwachstum 20% über, vorzugsweise 50% über oder weiter bevorzugt mehr als 100% über einer Kontrollpopulation liegt.
Mit "Zellproliferationskrankheit" ist ein Krankheitszustand gemeint, verursacht durch übermäßiges Zellwachstum im Verhältnis zum normalen Zellwachstum des Gewebes. Derartige Krankheiten schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Lymphom, nicht-lymphoiden Krebs, AIDS-Demenz, Arteriosklerose, Nephropatie und fokale segmentale Glomerulo-Sklerose ein.
Mit "Gen, assoziiert mit Zellproliferation" ist ein das Zellwachstum förderndes Gen (wie ein Onkogen) gemeint, welches bei Aktivierung aufgrund von viraler Integration oder einer anderen Mutation zu einer erhöhten Zellproliferation führt. Zellproliferationsgene schließen ohne Einschränkung Onkogene, wie c-fes/fps, ras, c-myc, c-sis und andere im Fachgebiet gut be kannte; und Gene, codierend für Cytokine wie IL-6 und IL-10, ein. Ein aktiviertes Onkogen bedeutet ein Onkogen, welches die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Neoplasmen (insbesondere malignen Tumoren) in einem Säuger (insbesondere einem Menschen) erhöht. Ein mit Zellproliferation assoziiertes Gen schließt des Weiteren ein Zellwachstum-unterdrückendes Gen ein, so dass die verringerte Genexpression eines Suppressor-Gens zur Zellproliferation führt.
Mit "im Wesentlichen nicht-funktionelle mutierte Form eines Gens" ist ein Gen oder dessen Genprodukt gemeint, welches bei 50%, vorzugsweise bei 20% oder weiter bevorzugt weniger als 10% des Wildtypspiegels exprimiert wird oder funktioniert.
Mit "präferenzielle Aufnahme durch einen Makrophagen" ist ein Makrophage gemeint, fähig zur Inkorporierung eines Mittels zu einem größeren Ausmaß (20% größerem, vorzugsweise 50% größerem oder weiter bevorzugt mehr als 100% größerem Ausmaß) als Zellen von anderen Zelltypen in der Zellkultur oder in dem Säuger.
Mit "Kit" ist eine Kombination von physikalischen Elementen gemeint, wie spezifische Primer, markierte Sonden oder andere Elemente, welche für die Ausführung der Erfindung nützlich sind. Das diagnostische Kit der Erfindung umfasst Elemente, nützlich für die Diagnose von klonalen Makrophagen in einer Säuger-Gewebeprobe.
Mit "Makrophage" ist eine Zelle der Monocyten/Makrophagen-Abstammungslinie gemeint, welche in der Milz zu finden ist oder sich zu einem Gewebe-Makrophagen differenziert hat. Diese Zellen schließen follikuläre dendritische Zellen (FDC), dendritische Zellen, Langerhans-Zellen sowie andere Gewebe-Makrophagen ein. Der hierin beschriebene Makrophage ist ein nicht-färbbarer Körpermakrophage, welcher nicht mit dem Abfangen von Zelltrümmern im Gewebe assoziiert ist. Mit "Gewebe" wird jegliches Material gemeint, isoliert aus einem Säuger, einschließlich Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Cerebrospinal-Fluid, oder jedwedes Material, welches Makrophagen für die Analyse durch das Verfahren der Erfindung enthalten kann.
Mit "HIV" wird ein humanes Immunschwäche-Virus der Stämme HIV-1, HIV-2 oder anderen Varianten gemeint.
Die Verfahren der Erfindung und das Kit der Erfindung sind vorzugsweise für die Diagnose von klonalem HIV- und nicht-HIV-assoziierten Makrophagen-induzierten Krebs in einem Menschen entworfen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Patentansprüchen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Zeichnung wird zuerst beschrieben werden.
Zeichnungen
Die 1 ist ein schematisches Diagramm des IPCR-Verfahrens zum Nachweisen von Integrationsstellen. Die Primer CW1B (SEQ ID Nr.: 1) und CW2H (SEQ ID Nr.: 2) flankieren die LTR-Region in der entgegengesetzten Richtung. Die Sequenz der Primer und Sonden ist gezeigt. Die Lokalisierung der Primer und Sonden wird als Pfeile oberhalb und unterhalb der genetischen Karte der fur-Gen-Integrationsstelle angegeben.
Die 2 zeigt ein schematisches Diagramm der HIV-Insertion in humanes c-sis.
Die 3 ist ein Abschnitt der humanen c-sis-Proto-Onkogen-Sequenz, in welche HIV am Intron 5 inseriert worden ist. Die sequenzierte-DNA bestand aus IPCR-Produkten aus Makrophagen, erhalten aus Cerebrospinal-Fluid eines AIDS-Demenz-Patienten. Die Insertion bei Nukleotid 343 wird als reduzierte Homologie des Testgens (CSF2C2.DNA SEQ ID Nr.: 7) zur bekannten c-sis-Sequenz (HUMSIS5DEL, SEQ ID Nr.: 6) beobachtet.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es folgt nun eine Beschreibung der Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von klonalem HIV in einer Gewebeprobe sowie Beschreibungen von Techniken, die bei der Ausführung der Erfindung nützlich sind. Die nachstehenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung der Erfindung angegeben und sollten nicht als einschränkend ausgelegt werden.
Experimenteller Abschnitt
HIV und die Pathogenese von Nicht-B-Zell-Malignitäten
Wie obenstehend beschrieben, enthalten einige AIDS-assoziierte Nicht-B-Zell-Lymphome klonale Formen von HIV. Es ist nützlich, den Zelltyp zu bestimmen, welcher klonal expandiert ist, um die notwendige Therapie zu ermitteln. Um die Gegenwart und klonale Natur von HIV in prä-kanzerösem und kanzerösem Gewebe zu bestimmen, wurden zwei Lymphome mit gemischtem Immunophänotyp und eine angioimmunoblastische Lymphadenopathie mit Dysproteinämie (AILD) mittels Proben analysiert. Eine Southern-Blot-Analyse, welche einen hohen Spiegel an HIV in drei von diesen Fällen identifizierte, wurde wie beschrieben in "Materialien und Methoden" durchgeführt. Es wurde herausgefunden, dass diese Lymphome eine einzelne vorherrschende Form von HIV, welche innerhalb des Tumors vorhanden ist, aufweisen. Alle drei der Gewebeproben besaßen eine gemischte Immunphänotyp-Morphologie; zwei von ihnen wiesen keine klonalen B- oder T-Lymphocyten auf, wohingegen eine eine klonale Population von T-Zellen aufwies.
Um die Integrationsstelle der HIV-Sequenzen innerhalb dieser Lymphome zu kartieren, wurde ein Verfahren durchgeführt, das als inverse PCR (IPCR) bezeichnet wird (Shiramizu, B., et al., (1994) siehe oben). Ein schematisches Diagramm der IPCR-Technik ist in der 1 angegeben. In dieser Technik wurden die Integrationsstellen von klonalen Formen von HIV durch Verwenden von PCR-Primern, komplementär zu Sequenzen innerhalb des HIV-LTR, welche voneinander weg nach außen wiesen, gefolgt von Restriktionsverdau, Ligation und DNA-Synthese amplifiziert.
Wie in der 1 gezeigt, wird, wenn eine klonale Form von HIV innerhalb eines Tumors vorhanden ist, im Allgemeinen ein einfaches Bandenmuster von einer oder zwei PCR-Banden erscheinen, wobei jede Bande ein LTR mit flankierender zellulärer genomischer Sequenz repräsentiert. Die Integrationsstelle aus diesen gemischten immunophänotypischen Proben wurde auf ein Segment des fur-Gens kartiert, das auf dem Chromosom 15 gerade 5' zum c-fes/fps-Onkogen vorhanden ist. Dies ist die gleiche Integrationsstelle, welche in einem klonalen HIV-assoziierten T-Zell-Lymphom beobachtet wurde (Shiramizu, B., et al., (1994), siehe oben), was nahelegt, dass die Integration von HIV stromaufwärts des c-fes/fps-Onkogens zu einer zellulären Expansion führt. Eine IPCR wurde an Tumor- und Nicht-Tumor-betroffenem Gewebe aus diesen drei Tumoren durchgeführt, wobei mit dem früher beschriebenen T-Zell-Lymphom verglichen wurde. Klonale IPCR-Produkte wurden aus diesen Tumoren amplifiziert, wohingegen nicht-beteiligte Lymphknoten und Milz aus zwei der Fälle keine amplifizierbaren Sequenzen zeigten. Die Southern-Analyse unter Verwendung einer internen LTR-Gen-Sonde (SEQ ID Nr.: 3) ergab eine Hybridisierung an beide amplifizierten IPCR-Produkte aus jedem Tumor, was zeigte, dass jedes Produkt eine LTR-Sequenz aufwies. Zwei fur-Sonden (SEQ ID Nr.: 4 und SEQ ID Nr.: 5), welche Oligonukleotide sowohl am 5'- als auch 3'-Ende des 3'-Exons von fur repräsentierten, wurden in einer Southern-Analyse dieser IPCR-Produkte verwendet. Ein LTR-enthaltendes IPCR-Produkt aus jedem Fall hybridisierte mit dieser fur-Sonde, was anzeigte, dass HIV in dem 3'-Exon des fur-Gens integriert hatte. Die Sequenzanalyse von einem dieser Tumoren bestätigte die Lokalisierung auf dieses Segment des fur-Gens. Die Integrationsstelle für eine Probe wurde auf die Basenpaar-Position 301 kar tiert, und für die andere Probe wurde sie auf Basenpaar 1652 des 2200 Basenpaare großen 3'-Exons von fur kartiert.
Um die Empfindlichkeit der IPCR-Analyse zu bestimmen, wurde eine Verdünnungsreihe von DNA aus dem ursprünglichen T-Zell-Lymphom (Shiramizu, B., et al., (1994), siehe oben in DNA vorgenommen, welche aus einem hyperplastischen Lymphknoten aus dem gleichen Patienten extrahiert worden war. Die IPCR-Technik besitzt eine Empfindlichkeit zwischen 2 und 5 Prozent dahingehend, dass klonale Formen von integriertem HIV lediglich amplifizierbar sein werden, wenn sie zwischen 2 und 5 Prozent der Probe repräsentieren (Shiramizu, B., et al., (1994), siehe oben). Es wurden keine Formen von IPCR-Produkt in hyperplastischen Knoten oder Milzgewebe aus HIV-infizierten Individuen beobachtet.
Klonale Formen von HIV werden in Nicht-B-Zell-Lymphomen gefunden
Um zu testen, ob die klonale HIV-Beteiligung in Nicht-B-Zell-Lymphomen üblich ist, wurde ein IPCR-Analyse an einem Spektrum von Nicht-B-Zell-Malignitäten durchgeführt. Das IPCR-Verfahren wird in "Materialien und Methoden" ausführlich dargelegt. Dieses Spektrum schloss Proben aus Patienten mit Mycosis Fungoides, kutanem T-Zell-Lymphom, AILD, Hodgkin-Krankheit und gemischten Immunphänotyp-Lymphomen ein. Die Tabelle I listet die Ergebnisse der IPCR-Analyse auf. Tabelle I Zusammenfassung von Fällen und IPCR-Ergebnissen

¹ N. D.: nicht durchgeführt

Die Ergebnisse sind mit der Zahl von IPCR-Banden aus jeder Probe tabellarisch aufgeführt, worin MF: Mycosis Fungoides; Lym: Lymphom; AILD: Angioimmunoblastische Lymphadenopathie; KS: Kaposi-Sarkom. Zusätzliches Gewebe war aus drei Fällen verfügbar (9: nicht-betroffener Knoten; 15: nicht-betroffenes Adrenalgewebe und KS aus Gehirn; 17: nicht-betroffene Niere), welche als interne Negativkontrollen verwendet wurden. Die Ergebnisse der Hybridisierung an die fur-Sonde (Spalte 5) sind als positiv oder negativ für Proben, welche IPCR-Banden aufwiesen, aufgelistet.
Die Daten in der Tabelle I zeigen, dass vierzehn von achtzehn analysierten Fällen klonale Formen von HIV, vorhanden innerhalb der Tumor-DNA, aufwiesen. In jedem Fall, in welchem klonale Formen von HIV nachgewiesen wurden, wurden ein oder zwei IPCR-Produkte amplifiziert. Die Größe der amplifizierten Banden variierte zwischen den Proben, was es unwahrscheinlich macht, dass die Banden ein PCR-Artefakt waren. In manchen Fällen bestätigten die immunphänotypischen Daten die Gegenwart von HIV in Zellen, welche innerhalb des Tumors vorhanden waren. Die Hodgkin-Krankheit-Probe UM war eine syncytiale Varianten-Hodgkin's-Krankheit, worin alle der Tumorzellen Reed-Sternberg-Zellen waren, welche mit Zellen der Makrophagen-Abstammungslinie verwandt sind. Diese Zellen zeigten eine Färbung mit Anti-HIV-p24-Antikörper, und eine klonale Form von HIV wurde mittels IPCR identifiziert. Alle der IPCR-Produkte hybridisierten ebenfalls mit einer HIV-LTR-Sonde in einer Southern-Analyse. Sechs von 13 IPCR-Produkten hybridisierten mit den früher beschriebenen fur-Sonden, was anzeigt, dass diese sechs Nicht-B-Zell-Lymphome eine klonale Form von HIV aufwiesen, welche direkt 5' zum c-fes/fps-Onkogen integriert war.
Die klonale HIV-Beteiligung wurde in vier Fällen von Kaposi-Sarkom untersucht. Eine von vier der Proben zeigte klonale HIV-IPCR-Produkte, und eine HIV-p24-Analyse lokalisierte die HIV-Expression auf zu Tumorzellen benachbarte Makrophagen.
c-fes/fps wird in Tumorgewebe exprimiert
Eine Northern-Blot-Analyse wurde an RNA durchgeführt, extrahiert aus den Fällen 9 und 10 der obenstehenden Tabelle I, um zu bestimmen, ob c-fes/fps in Tumorgewebe exprimiert wurde, bei welchem HIV stromaufwärts des c-fes/fps-Gens integriert war. Der Northern-Blot zeigt die Gegenwart einer 3-Kilobasenpaare (kb) großen c-fes/fps-Botschaft aus Tumor-mRNA, wohingegen die gleiche Botschaft nicht aus Nicht-Tumor-mRNA erhalten wurde. Die 3 kb-Botschaft ist eine passende Größe für die c-fes/fps-mRNA, welche eine 92 Kilodalton (Kd) große Tyrosinkinase (nicht gezeigt) codiert. Um zu bestimmen, ob die c-fes/fps-mRNA zur Entstehung von Fes-Protein führen wird, wurde ein monoklonaler Anti-Fes-Antikörper von der ATCC erhalten (HB8595) und in einer Reihe von immunhistochemischen Untersuchungen eingesetzt. Das Fes-Protein wurde häufig in Tumorzellen nachgewiesen, welche in einem der Makrophagen-reichen Lymphome mit gemischtem Immunphänotyp vorhanden waren, wohingegen es nicht häufig innerhalb eines follikulären hyperplastischen, HIV-infizierten Lymphknotens nachgewiesen wurde.
Eine klonale Form von HIV war auch innerhalb von AILD vorhanden, einem Krankheitsprozess, der angenommenermaßen einen prä-lymphomatösen Zustand repräsentiert. Histologisch zeigte die AILD-GH-Probe eine Lokalisierung des Anti-p24-Antikörpers auf das Zytoplasma von Makrophagen, wobei eine gewisse Färbung auch in einem follikulären dendritischen Muster vorhanden war. Eine immunhistochemische Zweifarben-Analyse von Gewebe mit Anti-p24 (braun) und Anti-fes (rot) zeigt die Gegenwart von zweifach gefärbten Zellen (orange), welche sowohl p24 (aus HIV) als auch c-fes/fps (dadurch aktiviert, dass es stromabwärts der HIV-Integrationsstelle positioniert ist) exprimierten. Makrophagen wurden aus der GH-AILD-Milz durch Adhäsion isoliert, und die Zellen wurden mit Anti-Fes und Anti-p24 zweifachgefärbt. Orange Makrophagen wurden beobachtet, was zeigt, dass Fes und p24 in Makrophagen co-lokalisiert sind. Obwohl keine klonale Form von T-Zelle oder B-Zelle in dem GH-AILD vorhanden war, legt deshalb die Feststellung einer klonalen Form von HIV und p24, intrazellulär exprimiert bei den AILD-assoziierten Makrophagen, nahe, dass die klonale Form von HIV in einer klonalen Makrophagen-artigen Zelle angesiedelt ist. In den in der Tabelle I gezeigten Fällen, war, wo gefrorene Proben verfügbar waren, eine intensive Fes-Färbung vorwiegend mit Makrophagen-ähnlichen Zellen assoziiert, wie es ebenfalls bei der p24-Färbung der Fall war. Ein Fall zeigte jedoch eine intensive Fes-Färbung ohne p24-Färbung, wies jedoch eine große Häufigkeit an klonalem HIV, integriert nahe (im 3'-z-Exon von fur) dem c-fes/fps-Gen (Fall 11) auf. Deshalb kann die c-fes/fps-Expression durch HIV in Abwesenheit von HIV-Gen-Expression beeinflusst werden.
Cytokine sind an Makrophagen-assoziierten Lymphomen beteiligt
Cytokine sind normalerweise an der Lymphocyten-Proliferation beteiligt. Interleukin-6 (IL-6) ist ein pleiotropes Cytokin, welches von verschiedenen Zelltypen hergestellt wird, welche Immunantworten, Reaktionen der akuten Phase und die Hämatopoiese regulieren (Akira, S., et al., Immunol. Review (1992) 127: 25–50). Viele Zelltypen, einschließlich Monocyten/Makrophagen, Fibroblasten, Endothel, B- und T-Lymphocyten, Chondrocyten, Astrocyten und Keatinacyten, sind in der Lage, IL-6 herzustellen. IL-6 kann wachstumsinduzierende, wachstumshemmende oder Differenzierungs-induzierende Aktivitäten ausüben, was von der Natur der Zielzellen abhängt. In Bezug auf die lymphocytische Stimulation, hat man von IL-6 gezeigt, beteiligt zu sein an 1) der Enddifferenzierung von B-Zellen zu antikörperherstellenden Plasmazellen; 2) der Induktion von IL-2 und IL-2-Rezeptoren und der Differenzierung von T-Zellen; und 3) hat man von IL-6 gezeigt, das Wachstum von Myelom- und Hybridomzellen zu verursachen (Woodruff, C., et al., DNA and Cell Biology (1992) 11: 587–592). IL-6 kann eine Transformation von IL-6-Rezeptor exprimierenden Zellen verursachen (Tohyama, N., et al., J. Exp. Med. (1990) 171: 389). Von IL-6 erzeugenden Makrophagen und Endothelzellen wurde gezeigt, in primären Kulturen von AIDS-assoziierten immunoblastischen großzelligen Lymphomen vorhanden zu sein (Emilie, D., et al., Blood (1992) 80: 498–504), jedoch wurde keine Assoziation mit der HIV-Integration oder der klonalen Makrophagen-Expansion beschrieben.
Die Inhibition von Cytokinen in vitro blockiert die Lymphocyten-Proliferation
Drei Patienten mit bösartigem großzelligen Lymphom-Aszites wurden hinsichtlich der in vitro-Effekte von IL-6 und IL-10 auf die Zellproliferation untersucht. Das Aszites-Fluid enthielt hohe Konzentrationen an IL-6 und IL-10, und neutralisierende Antikörper gegen diese Cytokine blockierten die Lymphomzell-Proliferation. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung damit, dass Cytokine, wie IL-6 und IL-10, eine Lymphom-Entstehung in vivo induzieren. Die Gegenwart einer klonal expandierten Population von Makrophagen, welche mit lymphoiden Tumoren assoziiert sind, legt nahe, dass die Makrophagen, durch Sezernieren von Cytokinen, auf sekundäre Weise umgebende untransformierte Zellen zu einem übermäßigem Wachstum bzw. Überwachsen induzieren, wodurch eine Tumorentstehung verursacht wird.
Identifizierung von Zellen, welche das integrierte HIV enthalten und Cytokin exprimieren
Weil viele der Lymphome, welche klonal integriertes HIV enthalten, Lymphome mit gemischtem Immunphänotyp repräsentieren, welche B-Zellen, T-Zellen und prominente Makrophagen enthalten, ist es wichtig, zu bestimmen, welcher Zelltyp die klonale Form von HIV enthält. Wie in der Tabelle I obenstehend beschrieben, wurden mehrere Krankheitskategorien beschrieben, in welchen festgestellt wurde, dass HIV klonal integriert ist. Diese schließen Mycosis Fungoides, kutanes T-Zell-Lymphom, systemisches T-Zell-Lymphom, gemischtes Immunphänotyp/polyklonales Lymphom, AILD und Hodgkin-Krankheit ein. Dieselbe Vorgehensweise ist nützlich bei der Analysierung verschiedener Lymphomkategorien, welche festgestelltermaßen integrierte Formen von HIV aufweisen, wobei Zell-Subpopulationen analysiert werden können (z. B. durch Zellsortierung oder Zweifachfärbung), um den Zelltyp zu identifizieren, welcher das klonale HIV enthält.
RFLP-Analyse von Nicht-HIV-Makrophagen hinsichtlich Klonalität
In dem Fall, dass festgestellt wird, dass Makrophagen-reichem zellproliferativem Krankheitsgewebe HIV fehlt, wird die Klonalität der Zellpopulation (z. B. der Makrophagen-Population) wie obenstehend bestimmt, indem zuerst die Zellen gemäß Zelloberflächenmarker-Reaktivität in Subpopulationen sortiert werden. Die Makrophagen- oder sonstige Zell-Subpopulation wird mittels RFLP-Analyse, welche dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt ist, hinsichtlich Klonalität getestet. Eine RFLP-Analyse gemäß der Erfindung beinhaltet die Sondierung der restriktionsverdauten und auf einem Gel aufgetrennten DNA mit Nukleinsäuresonden, welche an spezifische genomische DNA-Regionen von Säugern (vorzugsweise Menschen) hybridisieren.
Die genomischen Regionen von Interesse schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Regionen ein, welche übliche virale (z. B. HIV) Integrationsstellen flankieren, welche mit zellulärer Transformation assoziiert sind, wie Stellen nahe an Genen, die mit der Regulierung der Zellproliferation assoziiert sind (z. B. ein Onkogen). Das fur-Gen-Z-Exon, von welchem hierin gezeigt wurde, die Stelle von HIV-Integration zu sein, die mit einer klonalen Makrophagen-Expansion assoziiert ist, ist ein Beispiel einer genetischen Region, an welche Nukleinsäuresonden zur Bestimmung der Klonalität durch RFLP-Analyse unter Anwendung des diagnostischen Verfahrens der Erfindung hybridisiert werden können. Im Fachgebiet der Molekular- und Zellbiologie ist es gut bekannt, dass genetische Mutationen oder Rearrangements auftreten können, welche die abnormale Expression eines jeweiligen Gens, wie eines Onkogens, verursachen. Somit ist die Integration von HIV oder eines anderen Virus nicht für die abnormale Expression eines Gens erforderlich, welches benachbart zu einer häufig beobachteten Integrationsstelle liegt.
Behandlung von Lymphom, enthaltend Makrophagen mit integriertem HIV
SCID-Mäuse erhalten eine Injektion mit menschlichem Milzgewebe, welches klonale Makrophagen mit integriertem HIV enthält (z. B. Gewebe aus dem Fall 10). Kontroll-SCID-Mäuse erhalten eine Injektion mit normalem Milzgewebe (keine HIV-Assoziation, nicht-kanzerös). Das Wachstum von Tumoren in den Kontroll- und Testmäusen wird überwacht; die Wachstumsrate des HIV-assoziierten Tumors überschreitet jene der Kontrolle.
Um das Vermögen eines zu Makrophagen gelenkten cytotoxischen Mittels zu veranschaulichen, das Wachstum von Makrophagen-induziertem krebsartigen Gewebe zu inhibieren, wird das folgende Beispiel beschrieben. SCID-Mäuse, welche von Makrophagen mit integriertem HIV induziertes kanzeröses Gewebe (wie obenstehend beschrieben) beinhalten, werden in Kontroll- und Testgruppen unterteilt. An die Testgruppe 1 wird ein cytotoxisches Mittel in einer Formulierung verabreicht, welche das cytotoxische Mittel präferenziell an die Makrophagen z. B. durch in Liposomen eingekapseltes Cytotoxin zuführt. An die Kontrollgruppe 1 wird eine Formulierung verabreicht, identisch zu derjenigen, welche der Testgruppe gegeben wird, jedoch ohne das cytotoxische Mittel. Das Tumorwachstum in der Testgruppe 1 wird mit dem Tumorwachstum in der Kontrollgruppe 1 verglichen.
Eine ergänzende Behandlung des tumorartigen Nicht-Makrophagen-Gewebes inhibiert das Tumorwachstum weiter. An die Testgruppe 2 wird das auf Makrophagen gelenkte cytotoxische Mittel in einer Formulierung, wie obenstehend beschrieben, verabreicht. An die Testgruppe 2 wird ein zweites cytotoxisches Mittel verabreicht, welches präferenziell auf Gewebe einer Zellproliferationskrankheit (z. B. krebsartiges Gewebe) zielt. An die Kontrollgruppe 2 wird lediglich die Formulierung mit dem zweiten cytotoxischen Mittel, welche auf das krebs artige Gewebe abzielt, verabreicht. Das Tumorwachstum in der Testgruppe 2 wird mit der Testgruppe 1 sowie den Kontrollen verglichen, um die Effektivität der ergänzenden Behandlung des umgebenden Gewebes zu bestimmen, während ebenfalls die wachstumsinduzierenden Makrophagen behandelt werden. Die Wachstumsinhibition sowohl der klonal expandierten Makrophagen als auch des umgebenden Gewebes in ergänzenden Behandlungen verringert weiter die Größe des Tumors.
Pathogenes Modell der Lymphomentstehung
Die Feststellung der Erfindung besteht darin, dass HIV eine direkte Rolle in der schrittweisen Entwicklung von Lymphom in der HIV-Erkrankung spielen kann. Klonale HIV-infizierte Makrophagen waren mit einer großen Häufigkeit in polyklonalem Lymphom und polyklonalem AILD vorhanden, bei welchen keine klonale B- oder T-Zell-Marker beobachtet wurden. In einer separaten Messung der Klonalität (d. h. IPCR zur Kartierung klonaler Formen von HIV) haben wir festgestellt, dass HIV häufig in einer klonalen Form innerhalb dieser Typen von Tumoren vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass in den untersuchten Fällen dieses klonale HIV innerhalb von Tumor-assoziierten Makrophagen vorhanden war und somit zur polyklonalen Proliferation von Lymphom und Angioproliferation von AILD durch Sekretion von Cytokinen, welche typischerweise von Makrophagen sezerniert werden, beitragen kann. Die gemeinsame Integrationsstelle innerhalb von 6 von 13 separaten Tumoren wies auf eine Rolle für c-fes/fps im Prozess der Makrophagen-induzierten Tumorigenese hin. Mindestens 5% der Zellen innerhalb dieser Tumoren tragen eine klonale Form von HIV, und die einzigen Zellen, welche festgestellterweise HIV exprimieren, sind Zellen der Makrophagen-Abstammungslinie gewesen, mit Ausnahme des früher untersuchten Falles, worin HIV in den malignen T-Zellen vorhanden war. Deshalb schlagen wir ein Modell vor, dass eine langsame Expansion von klonal infizierten Makrophagen-ähnlichen Zellen ein frühe Stufe in der Lymphomentstehung repräsentiert und aufgrund der Überstimulierung des lymphoiden Elements mit von Makrophagen sezernierten Cytokinen (z. B. IL-6) zur Entwicklung von polyklonalen und anschließend monoklonalen Lymphomen führt.
Auf einen Gewebetyp (z. B. Makrophage) isolierte Klonalität ist kennzeichnend für eine durch Makrophagen induzierte Tumorentstehung in der frühen Stufe. Bei den späteren Stufen sind wahrscheinlich klonale Populationen anderer Zelltypen enthalten, da die Wachstums-Stimulierung zu einem Auswuchs einiger Klone führt.
Die Entwicklung von klonalem lymphoiden Lymphom kann auch in hyperproliferativem Gewebe durch Ereignisse, wie chromosomale Translokation, stattfinden, wobei die chromosomale Translokation innerhalb einer klonalen Population von Makrophagen die Expression eines Onkogens oder Überexpression von Cytokinen verursacht, was zur Tumorentstehung im umgebenden Gewebe führt.
Die Pathogenese der Hodgkin-Krankheit, bei welcher angenommen wird, dass die Reed-Sternberg-Zelle zum Großteil der Tumorentwicklung durch die Expression von Cytokinen, wie IL-6, beiträgt, zeigt Parallelen zu den obenstehend beschriebenen klonalen HIV-enthaltenden Makrophagen-induzierten Lymphomen dahingehend, dass c-fes/fps einheitlich in Reed-Sternberg-Zellen bei nicht-AIDS-assoziierter Hodgkin-Krankheit exprimiert wird (Tramper, L. H., et al., Blood (1993) 81: 3097–3115).
Experimentelle Daten: Materialien und Methoden
Nachweis von klonal integriertem HIV-1 durch IPCR
Unter Anwendung von IPCR (inverse Polymerase-Kettenreaktion) wurden Lymphome aus HIV-infizierten Individuen, welche klonal integriertes HIV-1 enthielten, identifiziert.
DNA wurde aus frischem oder gefrorenem Gewebe durch Standardtechniken extrahiert, wie früher beschrieben (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). DNA aus fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe kann beispielsweise durch Einbringen von Dünnschnitten des Gewebes in ein Eppendorf-Röhrchen und Entfernen des Paraffins mit Xylen hergestellt werden. Nach Spülen mit Ethanol wurde die Probe mit Proteinase K (0,5 mg/ml) und 1% SDS bei 50°C 24 Stunden lang in TEN-Puffer (100 mM Tris-Cl, 40 nM EDTA, 10 mM NaCl, pH 8) verdaut. Die Konzentration an Proteinase K und SDS wird dann auf 1 mg/ml bzw. 1% eingestellt, und das Inkubieren wird weitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Im Anschluss an eine Phenol- und Chloroform:Isoamylalkohol-Extraktion wird die DNA mit Natriumacetat und Ethanol gefällt und getrocknet.
Eine IPCR wurde an DNA, isoliert aus frischem, gefrorenem und fixiertem Gewebe, wie obenstehend beschrieben, oder durch äquivalente Techniken, welche dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt. Die Vorgehensweise wurde ausgeführt, wie beschrieben von Shiramizu et al., (Shiramizu, B., et al., (1994), siehe oben). DNA (0,1 μg) wurde mit Sau3A (oder einem anderen häufig schneidenden) verdaut und in einer 200-μl-Reaktion: 1X Ligasepuffer (NEB, Beverly, MA), 40 U T4-DNA-Ligase (NEB), 36 Stunden lang bei 15°C ligiert, und zwar bei einer DNA-Konzentration, welche die Selbst-Ligation der DNA-Fragmente unter Bildung von Kreisen bzw. Ringen begünstigt. Die Reaktion wurde durch Ethanolfällung gereinigt, und hierauf folgte eine IPCR (1): 100 pMol Primer (CW1B und CW2H, 1), 1 μl ligiertes Produkt, 1 × Tag1-DNA-Polymerasepuffer, 20 nM dNTP's, 2,5 U Tag1-DNA-Polymerase (Promega Biotech, Madison, WI) in einem Thermozykler von Cetus-Perkin-Elmer (Cetus-Chiron, Emeryville, CA). Bedingungen: Schmelzen bei 94°C während 1,5 Minuten, Annealing bei 50°C während 1,5 Minuten, Verlängerung bei 72°C während 3 Minuten, während insgesamt 60 Zyklen. Die amplifizierten Produkte wurden auf einem Ethidium-gefärbten Gel (1–2% Agarose/1–2% NuSieve-Gel, FMC BioProducts, Rockland, ME) getrennt. Um die amplifizierten Produkte zu bestätigen, wurde die DNA aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran überführt und für die Hybridisierung mittels Standardtechniken vorbereitet (Maniatis, T., et al., (1982) siehe oben). Die für die Hybridisierung verwendeten Nukleinsäuresonden waren LTRP, Fur1 und Fur2 (1). Die Sonden wurden mit Digoxigenin markiert und durch Chemolumineszenz nachgewiesen (Boehringer-Mannheim, Deutschland) oder durch andere Standardtechniken markiert (z. B. radioaktive Markierung, Biotinylierung, Fluoreszenz-Markierung).
Um Zellen zu identifizieren, welche das klonale HIV enthalten, wird die Zellpopulation, wie obenstehend beschrieben, sortiert, und die aus jedem Zelltyp isolierte DNA wird mittels IPCR analysiert. Alternativ dazu wird die aus der gemischten Zellpopulation isolierte DNA durch IPCR analysiert, gefolgt von Zweifachfärbung des Gewebes, um ein HIV-Produkt, wie p24, in einem jeweiligen Zelltyp zu lokalisieren. In-situ-Hybridisierungs-Techniken sind im Fachgebiet ebenfalls Standard für die Lokalisierung spezifischer Sequenzen (wie HIV) in dem Fall, dass die integrierten HIV-Sequenzen inaktiviert sind und keine identifizierbaren Proteine herstellen. Eine Zweifachfärbung unter Verwendung von Anti-CD14-Antikörper und Anti-p24-Antikörper würde die zweifach-gefärbte Zelle als einen Makrophagen, der HIV enthält, identifizieren. Die Antikörper-Färbung ist im Fachgebiet gut bekannt; für die Färbung verwendete Antikörper können im Voraus markiert werden (kovalent gebunden an einen nachweisbaren Marker) oder im Anschluss an die Anheftung an das Protein von Interesse markiert werden (wie ein, im Fachgebiet gut bekanntes, Biotin-IgG/Streptavidin-System). Die zuvor bestimmte Klonalität der HIV-Sequenzen zeigt, dass der Anti-p24-markierte Makrophage ein Mitglied einer klonal expandierten Population von Makrophagen ist, welche mit dem kanzerösem Gewebe assoziiert ist.
Zelltrennung durch Flusszytometrie
Die folgende Verfahrensweise kann auf Zellen von jeglichem Zellproliferationskrankheits-Gewebe angewandt werden, wie Niere, arteriosklerotisches Gewebe, Hirngewebe von ADC-Patienten oder Lymphome. Als Beispiel für ein Verfahren zur Trennung von Makrophagen von Nicht-Makrophagen-Krankheitsgewebe wird die folgende Vorgehensweise beschrieben.
Einzelzell-Suspensionen aus neu diagnostizierten oder kryo-konservierten Lymphomen werden durch Pressen von frischem Lymphomgewebe durch Stahlmaschen-Siebe hergestellt.
Wenn das Lymphom, bei der IPCR, ein monoklonales HIV enthält, werden die Einzelzellsuspensionen mit monoklonalen Antikörpern gefärbt werden, wie früher beschrieben (Mercolino, T. J., et al., CD5 B cells in development and disease (1992), L. Herzenberg, K. Rawjesky und G. Haughton, Hrsg. (New York Academy of Sciences) 409–421). Nützliche Antikörper beinhalten: Anti-CD14, der Makrophagen identifizieren wird; Anti-CD4, der CD4⁺-T-Zellen sowie Makrophagen identifizieren wird; Anti-CD8, Anti-CD20, welcher B-Zellen identifiziert, Anti-CD30 (Ki-1); und Anti-CD15, welcher Reed-Sternberg-Zellen identifiziert. Die Zellen werden unter Verwendung eines FACS-Vantage-Zellsortierers oder eines Äquivalents sortiert, welcher mit einer Biohazard-Eindämmungskammer ausgestattet worden ist, der fähig zur Sortierung von Suspensionen lebender Zellen aus HIV-infizierten Proben war. Die Makrophagen können einzeln von den anderen Zellen in einer gemischten Population aussortiert werden durch anfängliches Markieren mit einem Makrophagen-spezifischen Zelloberflächen-Antikörper, wie markiertem Anti-CD14, gefolgt von Zellsortierung und Auffangen der Anti-CD14-markierten Zellen, getrennt von allen anderen Zellen. Die sortierten Zellproben werden einer IPCR unterzogen, wie obenstehend beschrieben. Zytozentrifugen-Präparationen aus den sortierten Zellen werden mit Anti-HIV-p24-Antikörpern mittels Standardtechniken gefärbt, um zu bestimmen, ob die Zellen, welche klonal integriertes HIV enthalten, auch HIV-Strukturdeterminanten exprimieren. Sortierte Zellpopulationen sind ebenfalls nützlich zur Durchführung von RT-PCR (reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion), um das Spektrum an Cytokinen zu bestimmen, welches von jeder Population von Zellen exprimiert wird.
Alternativ dazu können Makrophagen von anderen Zelltypen in einer gemischten Population durch Adhäsion an Glas oder Kunststoff (wie Glas- oder Kunststoffkügelchen oder die Seiten eines Glas- oder Kunststoffbehälters) getrennt werden. Nicht-adhärierende Zellen werden entfernt und für eine getrennte Analyse zurückbehalten, wie notwendig.
Doppelfärbungs-Immuncytochemie
Ein im Fachgebiet gut bekanntes standardmäßiges Immunperoxidase-Protokoll wird mit geringfügigen Modifikationen für Doppel-Antikörper-Nachweis verwendet (Herndier, B. G., et al., AIDS (1994) 8: 575–581). Der p24-Antikörper (DAKO, Carpinteria, CA) wird für die HIV-Lokalisierung verwendet. c-fes-Antikörper wurde aus einer Hybridomkultur hergestellt, welche von der American Type Culture Collection (HB 8595) (Gaithersburg, MD) erhalten wurde. Wenn die c-sis-Expression getestet werden soll, wird Anti-c-sis-Antikörper oder ein Antikörper gegen PDGF-B über kommerziell verfügbare Quellen erhalten.
Die folgende Technik ist auf jedes Gewebe anwendbar, welches im Verdacht steht, klonale Makrophagen zu enthalten. Die Doppelfärbungs-Technik wird auf den Nachweis von HIV und der c-fes-Expression, als ein Beispiel, angewandt.
Scheibchen von fixiertem Gewebe wurden in abgestuftem Ethanol, mit einer Endwaschung in destilliertem Wasser, hydratisiert. Die Scheibchen wurden dann 30 Minuten lang mit 0,5% Casein in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) blockiert und gepuffert. Der p24-Antikörper wurde auf dem Scheibchen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Scheibchen wurde dann 5 Minuten lang in Casein-PBS gewaschen. Das Scheibchen wurde dann mit Biotin-konjugiertem Anti-Maus-IgG 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Scheibchen wurde 5 Minuten lang in Casein-PBS gewaschen, gefolgt von Diaminobenzidin-Inkubation während 7–10 Minuten. Nach Waschen in destilliertem Wasser wurde eine Inkubation mit 0,5% CuSO₄ 5 Minuten lang durchgeführt, und es wurde 2 Minuten lang mit Wasser gewaschen. Das Scheibchen wurde dann 10 Minuten lang in 1 N HCl inkubiert, worauf ein Waschen mit Wasser und eine Inkubation in Casein-PBS während 15 Minuten folgten. Das Scheibchen wurde dann mit Anti-fes- oder Anti-p24-Antikörper 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Casein-PBS-Waschung. Das Scheibchen wurde danach mit Biotin-konjugiertem IgG bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert (Anti-Maus-IgG, hergestellt im Pferd; BioGenex, San Ramon, CA). Nach 5 Minuten langem Waschen in Casein-PBS wurde das Scheibchen mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Streptavidin (BioGenex) bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Im Anschluss an eine Waschung in Casein-PBS während 5 Minuten wurde das Scheibchen dann mit dem "Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I" (Vector Lab) 10–15 Minuten lang inkubiert, 2 Minuten lang in Wasser gewaschen und 1 Minute lang mit Hämatoxylin gegen gefärbt. Das Scheibchen wurde 1 Minute lang in Wasser gewaschen, gefolgt von einer Waschung mit verdünntem Ammoniak in Wasser, worauf eine Waschung mit abgestuftem Ethanol und Xylen folgte. Dieses Verfahren war auch für die p24-Färbung nützlich. Methoden zum Nachweisen von Antikörpern sind im Fachgebiet gut bekannt; das obenstehende Vorgehen gibt ein Beispiel an.
Identifizierung von c-fes/fps-exprimierenden Zellen
Um Zellen, welche c-fes/fps exprimieren, innerhalb von Tumoren zu identifizieren, welche festgestellermaßen HIV klonal integriert stromaufwärts von c-fes/fps aufweisen, wurden Zweifarb-Immunfluoreszenz-Untersuchungen an fixierten und permeabilisierten Zellen durchgeführt, wie obenstehend beschrieben. Die obenstehend beschriebenen Antikörper zur Identifizierung des Zelltyps werden in einer ersten Immunfärbung verwendet, gefolgt von einer Fixierung und Permeabilisierung mit Ortho-Permafix (Ortho Pharmaceuticals, Raritan, N. J.) (oder äquivalent), was die Färbung von intrazellulärem Fes-Protein mit einem Anti-fes-Onkogen-Antikörper (ATCC HB8595) gestatten wird. Diese Zweifarb-Untersuchungen werden sowohl an Tumorgewebe als auch an Kontroll-Lymphknoten-Gewebe durchgeführt, weil dort eine kleine Menge an Fes in normalen Makrophagen exprimiert wird. Eine aktivierte Form eines Fes-spezifischen Kaninchen-Antiserums kann ebenfalls durch Standardtechniken als eine nützliche Färbung hergestellt werden, da normale Makrophagen die aktivierte Form von Fes nicht exprimieren. Die Erststufen-Antikörper werden direkt an FITC konjugiert, wohingegen die zweiten Anti-fes-Antikörper einen Phycoerythrin-markierten Zweitstufen-Antikörper aufweisen.
Die Expression von anderen Onkogenen, wie PDGF-B, wird durch dasselbe Vorgehen nachgewiesen. Ein Anti-PDGF-B-Antikörper ist über handelsüblich verfügbare Quellen erhältlich.
Cytokin- und Zellproliferationsgen-Expression
Cytokin- und Zellproliferations-Genexpression wird durch die folgende Standardtechnik überwacht. Zelluläre RNA wird aus sortierten Zellpopulationen extrahiert, wie früher beschrieben (Chomzynsky, P., und Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162: 145). Reverse Transkriptase aus Moloney-Leukämie-Virus wird verwendet, um zelluläre RNA revers in cDNA zu transkribieren. Eine RT-PCR unter Verwendung von Cytokin-Primern, entworfen, um mit der cDNA von bekannten Cytokinen zu hybridisieren, wird an der cDNA durchgeführt, wie früher beschrieben (Trumper, L. H., et al., (1993) siehe oben; Brenner, Ca et al., Biotechniques (1989) 7: 106). Nützliche Primer schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Primer für die Interleukine 1–13, c-fes/fps-Onkogen, c-sis(PDGF-B)-Onkogen, basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) und GMCSF (Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) ein. Die Primer werden vom Fachmann leicht entworfen und synthetisiert, da die Sequenzen der relevanten Gene bekannt sind und synthetische Techniken eine Routineangelegenheit sind.
Makrophagen-Beteiligung am AIDS-Demenz-Komplex (ADC)
Der AIDS-Demenz-Komplex ist eine ernste Komplikation bei der HIV-Krankheit, welche vorwiegend in Individuen mit einer fortgeschrittenen Immunsuppression auftritt. Klinisch gesehen, weisen Patienten mit ADC deutliche Gedächtnisänderungen auf und sind nicht in der Lage, alltägliche Aufgaben zu vollführen. Es liegt eine profunde Inhibition der Funktion des Zentralnervensystems vor, welche zur Verlangsamung des intellektuellen Prozesses und letztendlich zu Koma und Tod führt. Pathologisch gesehen, ist das Gehirn eines Individuums mit AIDS-Demenz zum Teil gekennzeichnet durch 1) Gliose (eine Überproliferation von Astrocyten), 2) einem Verlust von Neuronen, und 3) die Entwicklung von vielkernigen Riesenzellen und Mikroglia-Knötchen. Ein hervorstechendes Merkmal von Gehirngewebe eines AIDS-Demenz-Patienten ist das Vorhandensein von HIV-exprimierenden Makrophagen (Watkins, B. A., et al. (1990) Science, 249: 549–583). Die zunehmende Schwere der Demenz steht in Korrelation mit einer zunehmenden Häufigkeit von infizierten Makrophagen innerhalb des Gehirngewebes. Die zunehmende Schwere der Demenz steht in Korrelation mit einer zunehmenden Häufigkeit von infizierten Makrophagen innerhalb des Gehirns (Koenig, S., et al. (1986) Science, 233: 1089–1093).
Wachstumsfaktoren sind Polypeptidhormone, welche eine definierte Population von Zielzellen stimulieren. Beispiele von Wachstumsfaktoren schließen den aus Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), insulinartige Wachstumsfaktoren (IGF-1 und II), transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) ein. PDGF ist ein kationisches, wärmelösliches Protein, welches in den Granulae von zirkulierenden Blutplättchen gefunden wird, das bekanntermaßen die in vitro Proteinsynthese, Kollagenherstellung durch Fibroblasten und das Zellwachstum stimuliert.
Von ihm ist ebenfalls bekannt, dass es in vitro als ein Mitogen und chemotaktisches Mittel für Fibroblasten, glatte Muskelzellen, Gliazellen und Astrocyten wirkt.
Es wird hierin gezeigt, dass HIV-infizierte Makrophagen im Gehirn eines AIDS-Demenzpatienten klonal sind. Die klonale Makrophagenproliferation im Gehirn aufgrund einer HIV-Infektion ist vorgeschlagenerweise mit einer Astrocyten-Proliferation assoziiert, welche zu einer Gliose führt. Als ein Ergebnis ist die Behandlung der Makrophagen-Proliferation ein Ziel von Therapien zur ADC-Behandlung.
Inverse PCR unter Verwendung der HIV-LTR-Primern wurde an einer Reihe von DNA-Proben durchgeführt, isoliert aus den Gehirnen von mehreren Patienten mit AIDS-Demenz und aus einer Cerebrospinal-Fluid-Probe von einem Patienten mit AIDS-Demenz. HIV-LTR-Primer wurden durch Standard-Oligonukleotidsynthese hergestellt. Die Sequenz jedes Primers und dessen Länge wird aus der bekannten Sequenz von HIV-LTR (Shiramizu, B., et al., Cancer Res. (1994) 54: 2069–2072) ausgewählt. Die Sequenzen der IPCR-Primer (SEQ ID Nr.: 1 und SEQ ID Nr.: 2) wurden in diesem Beispiel verwendet. Monoklonale inverse PCR-Produkte wurden in vier Proben identifiziert, einschließlich der CSF-Probe. Die IPCR-Produkte aus der CSF-Probe wurden durch Standardtechniken sequenziert. Die HIV-Integrationsstelle wurde auf das Gen für Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor B (PDGF-B) kartiert, wie gezeigt in der 3. Eine virale LTR-Sequenz wird inseriert im humanem c-sis-Gen (PDGF-B-Gen) gezeigt.
Es wurde gezeigt, dass zwei Gehirnproben ein RFLP-identifiziertes PDGF-B-Gen-Arrangements in Gehirn aufweisen, und zwar durch Southern-Analyse unter Verwendung der v-sis-Sonde, erhalten von Oncor, Gaithersburg, MD. Die Ergebnisse implizieren eine PDGF- B-Beteiligung in Makrophagen aus mindestens drei Proben aus Gehirn und Cerebrospinalfluid, erhalten aus Individuen mit einer HIV-assoziierten neurologischen Krankheit.
Die HIV-Integration innerhalb des PDGF-B-Gens (c-sis) ist mit einer dauerhaften Astrocyten-Proliferation und Gliose assoziiert. Dies kann durch erhöhte Expression von Makrophagen-PDGF-B auftreten, welche von dem HIV-LTR-Enhancer-Element angetrieben wird. AIDS-Demenz kann daher ein primärer Prozess sein, an welchem klonale Makrophagen beteiligt sind, die konstitutiv Wachstumsfaktoren für Astrocyten herstellen, welche dann ihrerseits den sekundären Schaden im Gehirn verursachen, der für die Symptome von ADC verantwortlich ist. Anstatt dass ein HIV-assoziierter ADC durch einen primären Hirnschaden mit resultierender Gliose stattfindet, kann deswegen klonaler Makrophage eine Gliose, welche sekundären Hirnschaden verursacht, vorantreiben.
Diagnose der Beteiligung von klonalen Makrophagen an der AIDS-Demenz
Cerebrospinal-Fluid wird aus einem Patienten erhalten, der die Symptome von AIDS-Demenz aufzeigt. Makrophagen werden aus CSF isoliert, und mittels IPCR oder RFLP oder einem ähnlichen Verfahren wie beschrieben, siehe oben, hinsichtlich Klonalität getestet. Die Klonalität zeigt an, dass eine Proliferation von Makrophagen an der Krankheit beteiligt ist. Die Behandlung richtet sich auf die wesentliche Beseitigung von klonalen Makrophagen aus dem Gehirn. Als ein Verfahren zur Eliminierung der klonalen Makrophagen sind die obenstehend beschriebenen Behandlungen nützlich in der Behandlung von AIDS-Demenz. Allerdings werden Makrophagen-zytotoxische Mittel gewählt, welche die Blut-Hirn-Schranke durchqueren, um auf Makrophagen im Gehirn zu zielen, wo diese Gliose induzieren.
Diagnose der Beteiligung von Makrophagen an Proliferationskrankheiten
Makrophagen aus dem Blutkreislauf werden hinsichtlich der Gegenwart von klonalem HIV analysiert, um Patienten vorherzusagen, welche in der Gefahr zur Ausprägung von Zellproliferationskrankheiten stehen können. Makrophagen werden aus Blut isoliert. DNA wird durch IPCR, wie hierin beschrieben, analysiert. Beweise für HIV-Klonalität weisen darauf hin, dass der Patient eine HIV-Insertion in Makrophagen aufweist und dass diese Makrophagen klonal proliferieren. Der Patient wird als für eine Entwicklung einer Zellproliferationskrankheit in einem Gewebe, welches einer Invasion durch proliferierende Makrophagen unterliegt, gefährdet angesehen. Die Verabreichung von zytotoxischen Mitteln, um die Anzahl von proliferierenden Makrophagen wesentlich zu verringern, ist nützlich zur Verhinderung oder Reduzierung der Wahrscheinlichkeit einer Entwicklung einer Zellproliferationskrankheit.
Beteiligung von Makrophagen an Retrovirus-induzierter Nierenkrankheit
HIV-induzierte Nephropathie ist ein häufiges Leiden bei AIDS-Patienten, welches 10–33% der HIV-infizierten Individuen betrifft (Vaziri, N. D., et al. (1985) J. Nat. Med. Assoc. 77: 369–375; Rao, T. K. S., et al. (1984) N. Engl. J. Med. 310: 669–673; Pardo, V., et al. (1984) Ann. Int. Med. 101: 429–434; Bourgoignie, J. J. (1990) Kidney int. 37: 1571–1584). Das Modell einer sequenziellen Neoplasie ist auf Retrovirus-induzierte Nierenkrankheit anwendbar, wenn die folgenden Beobachtungen in Betracht gezogen werden.
Mesangiale Zellen sind spezialisierte Zellen, welche mit dem renalen Glomerulus assoziiert sind und Eigenschaften von Makrophagen und kontraktionsfähigen Zellen besitzen. Eine mesangiale Proliferation in den Glomeruli ist der häufigste Nierenschaden, der in AIDS-Patienten gefunden wird.
Der Schaden ist mit einer Nephropathie in Zusammenhang gebracht worden (Rao, T. K. S., et al. (1984) siehe oben) und wird häufig bei der Autopsie gefunden (Pardo, V., et al. (1984) siehe oben). Die mesangiale Proliferation wird herkömmlich als eine Antwort auf eine Endothel-Basalmembran-Epithel-Verletzung angesehen. Allerdings wird hierin von der mesangialen Proliferation vorgeschlagen, mit der Makrophagen-Proliferation im Bereich des Schadens assoziiert zu sein. Proliferierende Makrophagen stehen hypothetischermaßen in Kommunikation mit den mesangialen Zellen über Cytokine, wie IL-1, IL-6, TGF-β und PDGF. Von diesen Makrophagen wird hierin vorgeschlagen, dass sie klonal proliferieren als Ergebnis der viralen Integration an einer Stelle nahe oder innerhalb eines Gens, welches Zellproliferation steuert – Proliferation des virusinfizierten Makrophagen – was seinerseits die Proliferation der mesangialen Zellpopulation induziert, in welche die klonalen Makrophagen eingedrungen sind.
Die häufigste Ursache von Nierenversagen bei der HIV-Erkrankung ist ein nephrotisches Syndrom, assoziiert mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS; Rao, T. K. S., et al. (1984) siehe oben). Die Pathogenese von FSGS ist komplex, beinhaltet jedoch eine diffuse mesangiale Proliferation (Couser, W. G., und Johnson, R. J., (1994) Am. J. Kidney Dis. 23: 193–198). FSGS beinhaltet eine Sklerose eines Teils der glomerulären Struktur, welche durch Epithelproliferation, gefolgt von Matrix-Akkumulation, eingeleitet werden kann.
Eine sekundäre FSGS (nicht assoziiert mit HIV-Infektion) beinhaltet eine glomeruläre Verletzung aufgrund des erhöhten Kapillardrucks, welcher durch Hypertension verursacht wird. Die Schäden bei der sekundären FSGS sind sklerotisch und beinhalten eine mesenchymale Zellproliferation (Floege, J., et al. (1993) J. Clin. Investigation 92: 2952–2962). Es ist vorgeschlagen worden, dass die Expression von Cytokinen, wie PDGF und TGF-Beta, durch einen erhöhten glomerulären Kapillardruck verändert wird (Shankland, S. J., et al. (1994) Circ. Res. 75: 844–853). Infusionsuntersuchungen haben gezeigt, dass PDGF und b-FGF eine mesangiale Proliferation und Matrix-Akkumulation in Glomeruli induzieren können (Floege, J., et al. (1993) Am. J. Path. 142: 637–650). In vivo Transfektion von Genen für TGF-Beta und des PDGF-B-Gens erzeugte eine Matrix-Akkumulation und mesangiale Proliferation (Isaka, Y., et al. (1993) J. Clin. Investigation 92: 2597–2601).
Die hierin offenbarte Feststellung bezüglich der Assoziation von HIV-Insertion in dem PDGF-B-Gen von klonalen Makrophagen, welche ihrerseits mit einer Zellproliferationskrankheit assoziiert sind, stellt einen Mechanismus für die Beteiligung von HIV an FSGS bereit. Die sequenzielle Pathogenese kann eine anfänglich Proliferation (Neoplasie) von mesangialen Zellen beinhalten, welche, als potenzielle Quellen von PDGF, eine anschließende Proliferation von mesenchymalen Zellen, wie Endothelzellen und Fibroblasten, induzieren. Die Diagnose der Beteiligung von klonalen Makrophagen an einer Nierenkrankheit sieht einen frühen Nachweis der Krankheit sowie die Entwicklung von Behandlungsschemen vor, welche auf die Auslöschung der Quelle des Proliferationssignals gerichtet sind: Die veränderten Cytokin-herstellenden Makrophagen und Mesangial-Zellen.
Diagnose von durch klonale Makrophagen induzierter mesangialer Proliferation.
Patienten, welche im Verdacht stehen, eine Nierenkrankheit aufzuweisen, wie Nephrose (Protein im Urin) oder Nierenversagen (erhöhte BUN- und Kreatin-Spiegel), werden häufig einer Nieren-Biopsie für die pathologische Diagnose unterzogen. Das Gewebe wird durch die IPCR-Technik hinsichtlich HIV-Integration analysiert. Die zelluläre Lokalisierung der klonalen HIV-Integration wird durch eine Disassoziation des Gewebes (durch manuelle oder enzymatische Techniken) erreicht, wobei das Gewebe in zelluläre Komponenten aufgetrennt wird und die Makrophagen isoliert werden. DNA aus isolierten Makrophagen kann anschließend mittels IPCR wie obenstehend analysiert werden, um HIV-Klonalität in Makrophagen zu bestätigen. Die Feststellung einer konsistenten HIV-Integrationsstelle, welche mit Nierenkrankheit assoziiert ist, weist darauf hin, dass proliferierende Makrophagen mit der Krankheit assoziiert sind. Das Vorliegen von klonalen Makrophagen zeigt eine abnormale Makrophagenproliferation und eine Beteiligung an der Zellproliferationskrankheit des Patienten.
Wenn bekannt ist oder vermutet wird, dass der Patient mit HIV infiziert ist, wird die DNA ferner mittels IPCR unter Verwendung von HIV-LTR-Primern zur Amplifizierung flankierender genomischer Sequenzen analysiert. Die flankierenden Sequenzen werden in einen Vektor für die anschließende Sequenzanalyse oder Southern-Analyse kloniert, in der Absicht, die Region zu identifizieren, in welche das HIV integriert hat.
Beteiligung klonaler Makrophagen an Arteriosklerose
Es wird hierin offenbart, dass eine durch retrovirale Insertions-Mutagenese verstärkte Makrophagen-Proliferation eine Rolle im arteriosklerotischen Prozess spielt.
Die Bildung eines arteriosklerotischen Plaques ist ein komplexes Wechselspiel zwischen dem Gefäßendothel, glatten Muskelzellen der Intima, Intima-Makrophagen und Serumlipiden. Die Arteriosklerose-Forschung hat sich schwerpunktmäßig auf das Verständnis der Serumlipid-Kinetik gerichtet. Einige Forscher haben sich auf die zelluläre Proliferation und Rekrutierung in den arteriosklerotischen Plaque konzentriert. Eine Mutagenese, welche zu Arteriosklerose führt, kann die virale Insertion, Integration von Nicht-Retroviren oder jedwede andere Form von Mutagenese, welche die Expression eines Cytokins verändert, einschließen. Das Ergebnis ist eine klonale Makrophagen-Proliferation, welche zur Induktion der Proliferation von anderen Zelltypen und zu der beobachteten Proliferationskrankheit führt.
Makrophagen sind Komponenten von arteriosklerotischen Plaques. Die Anzahl von Makrophagen in Plaques ist von der Wanderung von im Kreislauf befindlichen Monocyten und von der Proliferation von Makrophagen in situ abhängig (Spagnoli, L. G., et al. (1991) Atherosclerosis 88: 87–92). Klonale Theorien der Arteriosklerose haben sich auf die Proliferation von klonalen glatten Muskelzellen in der Intima der Arterienwand konzentriert (Aikawa, M., et al. (1993) Circ. Res. 73: 1000–1012). In experimentellen Systemen mit fettgefütterten Kaninchen (Rosenfeld, M. E., und Ross, R. (1990) Arteriosclerosis 10: 680–687) und in der Zellzyklus-Analyse von humanen Plaques (Gordon, D., et al. (1990) P. N. A. S. USA 87: 4600–4604) ist es jedoch deutlich, dass eine in situ stattfindende Makrophagen-Proliferation vergleichbar, wenn nicht stärker häufig als die Proliferation von glattem Muskel vorkommt.
PDGF ist ein zentrales Cytokin in der Pathogenese von Arteriosklerose. Während der Bildung von arteriosklerotischen Plaques haften Blutplättchen an beschädigtem Subendothel, was zu einem bedeutenden Ereignis in der Krankhaftigkeit, welche mit Arteriosklerose assoziiert ist, führt, nämlich der Ausbildung einer Thromboembolie. Angeheftete Blutplättchen können eine exogene Quelle von PDGF sein, während mechanische Faktoren, wie Scherbelastung (Sterpetti, A. V., et al. (1994) Eur. J. Vascular Surgery 8: 138–142) und Koronarspasmus (Ogawa, H., et al. (1993) 4: 437–442) die Freisetzung von PDGF aus mit der Intima assoziierten Zellen verursachen können.
In humanen arteriosklerotischen Schäden werden PDGF-A- und PDGF-B-mRNA und -Protein in Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Makrophagen exprimiert (Barrett, T. B., und Benditt, E. P. (1988) P. N. A. S. USA 85: 2810–2814). Die PDGF-B-Expression wurde auf Makrophagen lokalisiert und die Expression von PDGF-A wurde auf glatte Muskelzellen, welche Actin exprimieren, lokalisiert (Barrett, T. B., und Benditt, E. P. (1988) siehe oben).
Eine Mutagenese, einschließlich zum Beispiel retroviraler Insertionsmutagenese in das PDGF-B-Gen, welche die Proliferation der mutagenisierten Makrophagen betrifft, kann als ein diagnostischer Indikator der Beteiligung von klonalen Makrophagen an der arteriosklerotischen Krankheit verwendet werden. Makrophagen werden an die Stelle eines arteriosklerotischen Schadens rekrutiert und durch PDGF aus derartigen Quellen wie Blutplättchen, in Assoziation mit Hypercholesterinämie, oder Scherbelastung, zur Proliferation veranlasst. Die hierin offenbarte Feststellung einer HIV-Insertion in oder nahe dem PDGF-B-Gen als einem Induktor der Makrophagen-Proliferation legt nahe, dass Makrophagen in einem klonalen (neoplastischen) Zustand durch Mutagenese (z. B. retrovirale Insertionsmutagenese), beispielsweise durch Mutagenese eines zellulären Wachstumsfaktorgens, wie PDGF-B, gehalten werden können.
Diagnose von Cytokin-Gen-Mutagenese und Makrophagen-Klonalität bei Arteriosklerose
Die Diagnose von genetischen Veränderungen, welche die Beteiligung klonaler Makrophagen an HIV- oder nicht-HIV-assoziierter Arteriosklerose anzeigen, wird mittels der folgenden Schritte durchgeführt. Makrophagen werden aus dem Blut von Arteriosklerosepatienten durch Standardtechniken, wie Flusszytometrie, oder durch Adhäsion an eine Oberfläche, wie eine Glas- oder Kunststoffoberfläche, isoliert. Man unterzieht die DNA der Makrophagen einer Southern-Analyse zur Bestimmung der Klonalität und einer RFLP-Analyse, um eine mögliche Insertionsmutagenese oder ein genetisches Rearrangement im Bereich des c-sis(PDGF-B)-Gens zu bestimmen. Die spezifische Beteiligung von HIV durch Insertionsmutagenese wird mittels IPCR unter Verwendung von HIV-LTR-Primern, wie zuvor beschrieben, bestimmt. Die Analyse kann ebenfalls auf jedwedes Cytokingen angewandt werden, dessen Produkt im Verdacht steht, Makrophagen-Proliferation zu induzieren.
Die Klonalität der HIV-Insertion in Makrophagen wurde durch Untersuchen des arteriosklerotischen Plaques eines AIDS-Patienten festgestellt, der Arteriosklerose hatte und an einer Herzattacke verstorben war. Das Gewebe aus dem arteriosklerotischen Plaque, der Milz und der Niere des Patienten wurde isoliert und dessen DNA hinsichtlich HIV-Insertion und Klonalität mittels IPCR unter Verwendung der IPCR-Primer CW1B (SEQ ID Nr.: 1) und CW2H (SEQ ID Nr.: 2) analysiert. Die HIV-Klonalität wird in Form von zwei DNA-Banden beobachtet, welche von den Primern amplifiziert wurden, welche in den HIV-LTRs hybridisieren (siehe 1). Die IPCR-Analyse zeigte zwei amplifizierte DNA-Banden nur für das arteriosklerotische Plaque-Gewebe, was darauf hinweist, dass klonales HIV in dem Gewebe vorhanden war. Es wurden keine Banden für die Proben aus Milz und Niere beobachtet. Die anschließende Isolierung von Makrophagen aus denselben Gewebeproben und die Analyse der DNA durch IPCR lieferte das gleiche Ergebnis – nur Makrophagen aus dem arteriosklerotischen Plaque enthalten klonales HIV.
Es gab keine Anzeichen von Zellproliferationskrankheit in der Milz oder Niere des Patienten, und die IPCR-Ergebnisse zeigen, dass keine klonale HIV-Insertion in diesen Geweben nachweisbar war. Somit wird durch IPCR-Analyse hierin gezeigt, dass eine Zellproliferationskrankheit, wie Arteriosklerose, mit HIV-Klonalität assoziiert ist.
Die Insertion von HIV in das PDGF-B-Gen wurde durch RFLP-Analyse von DNA aus Makrophagen des arteriosklerotischen Plaque-Gewebes bestimmt. Unter Verwendung der v-cis-Sonde (Oncor, Gathersberg, MD), welche an Sequenzen in dem humanen PDGF-B-Gen hybridisiert, wurde festgestellt, dass das PDGF-B-Gen rearrangiert war. Somit wird von der durch IPCR angezeigten HIV-Insertion gezeigt, mit einem Rearrangement des PDGF-B-Gens assoziiert zu sein. Die HIV-Klonalität ist das Ergebnis der Expansion der Makrophagen, bei welchen HIV in das Gen des wachstumsfördernden Faktors PDGF-B inseriert ist.
Darüber hinaus wurde das arteriosklerotische Plaque-Gewebe mit PCNA gefärbt, einer Verbindung, welche nur sich teilende Zellen durch Wechselwirkung mit aktiv in Synthese befindlicher DNA färbt. Eine solche histologische Färbung zeigte, dass Makrophagen gefärbt wurden und sich daher in dem Plaque-Gewebe zum Zeitpunkt, als das Gewebe erhalten wurde, aktiv teilten. Von proliferierenden Makrophagen, welche ein rearrangiertes PDGF-B-Gen besitzen, wird hierin gezeigt, mit der Zellproliferationskrankheit Arteriosklerose assoziiert zu sein. Das Rearrangement des PDGF-B-Gens beruht in diesem Fall auf der HIV-Insertion.
Ein Aufzeigen der Makrophagen-Klonalität in Arteriosklerose-Patienten weist auf Makrophagen als Induktoren der Endothelproliferation und resultierenden Plaquebildung hin. Eine solche Diagnose ist nützlich beim Auswählen von Makrophagen als dem Ziel einer Arteriosklerosebehandlung.
Behandlung von Zellproliferationskrankheit, welche mit klonalen Makrophagen assoziiert ist
Gegen Makrophagen gerichtete Therapien werden hierin beschrieben. Solche Therapien schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Zuführung zytotoxischer Mittel an Makrophagen durch Liposomen ein. Liposomen werden normalerweise durch phagozytische Zellen, wie Makrophagen, aufgenommen. Während der Phagozytose eines Cytotoxin-enthaltenden Liposoms wird ein Cytotoxin, wie Dichlormethylen-Bisphosphonat, intrazellulär freigesetzt, wodurch der phagozytische Makrophage getötet wird (Van Rooijen, N., und Sanders, A. (1994) siehe oben).
Die Therapien können sich auch gegen PDGF und die zellulären Quellen von PDGF richten. Faktoren, welche PDGF-Funktion beeinflussen, werden von verschiedenen Forschern getestet (zum Beispiel: PDGF/PDGFR-Wechselwirkungs-Inhibitor, 2-Brommethyl-5-chlorbenzolsulfonylphthalimid (Mullins, D. E., et al. (1994) Arteriosclerosis and Thrombosis 14: 1047–1055); Glucocorticoid-Inhibition von Thrombin-induzierter PDGF-A-Expression (Nakano, T., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22941–22947); 3-Deazaadenosin-Inhibition der Thrombin-induzierten PDGF-Expression (Shanker, R., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 9376–9382); Acetylsalicylsäure inhibiert PDGF-Freisetzung (Vissinger, H., et al. (1993) Angiology 44: 633–638); in der Nahrung befindliche Omega-3-Fettsäuren verringern PDGF-mRNA (Kaminski, W. E., et al. (1993) Blood 81: 1871–1879); Anti-PDGF-Antikörper inhibiert neointimale glatte Muskel-Akkumulation (Ferns, G. A., et al. (1991) Science 253: 1132); und Tyrophostine inhibieren PDGF-induzierte DNA-Synthese (Bilder, G. E., et al. (1991) Am. J. Physiology 260: C721–730). Die Aktivität auf dem Gebiet der auf PDGF abzielenden Behandlungen attestiert die Bedeutung, welche man PDGF bei der Arteriosklerose zuschreibt. Somit liefert die Diagnose der PDGF-Mutagenese, welche zu Makrophagen-Klonalität und Zellproliferation führt, dem Arzt nützliche Informationen, um den Patienten richtig zu behandeln, insbesondere in frühen Stadien von Arteriosklerose.
Ein Kit für die Diagnose von Makrophagen-induzierter Zellproliferationskrankheit wird offenbart. Das Kit der Erfindung ist nützlich für die Diagnose der Beteiligung von klonalen Makrophagen durch Testen von DNA von Makrophagen, welche aus einem Zellproliferationskrankheit-Gewebe isoliert wurden. Die Klonalität wird festgestellt, wenn DNA mehr als 5% monoklonale DNA aus Makrophagen enthält. Das Kit der Erfindung beinhaltet Nukleinsäure-Primer für das Amplifizieren von DNA einer HIV-enthaltenden Zelle (z. B. eines Makrophagen). Die Nukleinsäureprimer für die Amplifikation von HIV-enthaltender DNA hybridisieren präferenziell an Regionen der 5'- und/oder 3'-Long-Terminal-Repeats (LTRs), so dass eine DNA-Synthese in entgegengesetzten Richtungen für eine IPCR-Analyse geprimed wird. In dem Kit eingeschlossen sind eine oder mehrere markierte (z. B. radioaktiv markierte; biotinylierte oder anderweitig standardmarkierte) Sonden für eine RFLP-Analyse von genomischer DNA hinsichtlich Klonalität, wobei ein Priming von HIV-Sequenzen nicht erwünscht ist (z. B. in nicht-HIV-verwandten Zellproliferationskrankheiten). Eine solche Sonde hybridisiert an einen genetischen Lokus, der eine gewöhnliche Stelle der viralen Integration ist, welche zur zellulären Proliferation führt. Beispielhafte Loci schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, c-fes/fps, c-sis und andere die Zellproliferation steuernde Gene ein.
Anwendung
Die Erfindung wird für den frühen Nachweis und die Diagnose von klonal expandierten Makrophagen in durch Zellproliferation erkranktem Gewebe angewandt, wie präkanzerösem oder kanzerösem Gewebe, Lymphom, Gehirn von AIDS-Demenz-Patienten, arteriosklerotischen Gewebe und Nieren-Glomeruli. Die Klonalität in Makrophagen zeigt eine frühe Stufe der Zellproliferationskrankheit an, welche durch klonale Makrophagen induziert wird, weil spätere Stufen häufig auch klonale Populationen des umgebenden Gewebes enthalten. Somit sind das diagnostische Verfahren und Kit der Erfindung bei der Diagnostizierung der Beteiligung von HIV an einem gegebenen Zellproliferations-Schaden oder Tumor; zur Diagnostizierung der Beteiligung von klonal expandierten Makrophagen, welche das Wachstum von umgebenden Gewebe induzieren; zum Aufzeigen des Stadiums eines Tumorwachstums zur Unterstützung bei der Bewertung der Krankheit eines Patienten; und zur Bereitstellung von Information über die Natur des durch Zellproliferation erkrankten Gewebes, so dass man, falls angezeigt, einer alternativen Behandlung nachgehen kann, nützlich.
Die wachstumsstimulierenden Makrophagen, von welchen durch das diagnostische Verfahren der Erfindung bestimmt wurde, mit der Zellproliferations-Läsion assoziiert zu sein, können durch ein Behandlungsverfahren angezielt werden. Durch Inhibieren oder Beseitigen der Cytokin-herstellenden Makrophagen, welche mit dem Zellproliferationsschaden assoziiert sind, wird das Wachstum des umgebenden Gewebes substanziell blockiert. Das Behandlungsverfahren kann ferner eine ergänzende Behandlung von Makrophagen sowie dem Wachstums-induzierten umgebenden Gewebe vorsehen, was zu einer vollständigen Behandlung des Lymphoms mit gemischtem Immunphänotyp, von AIDS-Demenz, Arteriosklerose, Nephropathie oder einem anderen Zellproliferationskrankheits-Gewebe führt.
Die Erfindung ist nützlich bei der Diagnostizierung mehrerer Krankheiten, welche assoziiert sind mit der primären klonalen Expansion eines Zelltyps (wie einem Makrophagen oder einer follikulären dendritischen Zelle), welcher eine sekundäre Zelle zur Proliferation veranlasst. Die Krankheiten, welche mittels der Erfindung diagnostiziert werden können, sind, ohne Einschränkung darauf, in der Tabelle II, Spalte 1, aufgelistet. Der Zelltyp (primäre Zelle), welcher anfänglich expandiert (durch HIV-Insertion oder genetische Veränderung, welche zur Expansion führt) und welcher andere Zellen dazu veranlasst, zu proliferieren, wird in der Spalte 2 angegeben. Die Zellen (sekundäre Zellen), welche auf die induzierenden Signale antworten und proliferieren, sind in der Spalte 3 dargestellt. Die Erfindung ist auch nützlich zur Diagnostizierung anderer Krankheiten, in welchen klonal expandierte Induktor-Zellen die Proliferation von Antworter-Zellen in frühen Stadien einer Zellproliferationskrankheit fördern, wie, ohne Einschränkung darauf, in der Tabelle II gezeigt.
Tabelle II Zusammenfassung von Krankheiten, welche durch die Erfindung diagnostiziert werden können
Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Patentansprüche.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isolierter Makrophage eines Säugers, in dessen Genom eine retrovirale transkriptionsregulierende DNA-Sequenz integriert ist, welche derartig relativ zu einem Zellproliferationsgen des Makrophagen positioniert ist, dass die Gegenwart der transkriptionsregulierenden DNA-Sequenz und des Zellproliferationsgens zur Makrophagenproliferation führt.
Makrophage von Anspruch 1, wobei die transkriptionsregulierende DNA-Sequenz eine funktionelle Promotorsequenz ist, welche die Expression des Zellproliferationsgens erhöht.
Makrophage von Anspruch 1, wobei die transkriptionsregulierende DNA-Sequenz eine funktionelle Enhancer-Sequenz ist, welche die Expression des Zellproliferationsgens erhöht.
Makrophage von Anspruch 1, wobei das Zellproliferationsgen ein Onkogen ist.
Makrophage von Anspruch 4, wobei das Onkogen aus der c-fes/fps, c-myc, c-sis und ras umfassenden Gruppe gewählt wird.
Makrophage von Anspruch 1, wobei die transkriptionsregulierende Sequenz eine Enhancer/Promotor-Sequenz in einem "Long-Terminal-Repeat" eines humanen Immunschwäche-Virus ist.
Makrophage von Anspruch 1, welcher ein humaner Makrophage ist.
Makrophage von Anspruch 1, welcher ein Gewebe-Makrophage ist.
In-vitro-Verfahren zum Screenen nach einem therapeutischen Kandidaten-Mittel, welches die Lebensfähigkeit eines Makrophagen vermindert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren eines Makrophagen gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche mit einem therapeutischen Kandidaten-Mittel in vitro; und Bestimmen des Effekts des Kandidaten-Mittels auf die Lebensfähigkeit des Makrophagen.
Verfahren zum Screenen nach einem therapeutischen Kandidaten-Mittel, welches die Lebensfähigkeit eines Makrophagen vermindert, in vivo, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Kontaktieren eines Makrophagen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem Kandidaten-Mittel in einem nicht-humanen Tier, wobei das nicht-humane Tier einen den Makrophagen umfassenden Tumor aufweist; und b) Bestimmen des Effekts, falls vorhanden, des Kandidaten-Mittels auf den Makrophagen.
Verfahren von Anspruch 10, wobei der Wirt eine Maus ist.
Verfahren von Anspruch 10, wobei der Tumor in einem Gewebe des Wirtes vorliegt, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Haut, Peritoneum und Milz.
In-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von klonal expandierten Makrophagen in einem Gewebe eines Säugers, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bestimmen, mittels einer Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik, des Vorhandenseins einer retroviralen transkriptionsregulierenden DNA-Sequenz, integriert an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen in der DNA eines Makrophagen in dem Gewebe, in vitro, wobei die Stelle ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Integration zur klonalen Expansion des Makrophagen führt.
Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von klonal expandierten Makrophagen in einer Probe in vitro, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bestimmen, mittels einer Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik, des Vorhandenseins einer retroviralen transkriptionsregulierenden DNA-Sequenz in der Makrophagen-DNA, integriert an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen eines Makrophagen, in vitro, wobei die Stelle ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die retrovirale Integration zur klonalen Expansion des Makrophagen führt.
Verfahren von Anspruch 12, wobei das Verfahren, vor dem Bestimmen, das Trennen eines Makrophagen von anderen Zellen des Gewebes umfasst.
Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Hybridisierungstechnik eine in-situ-Hybridisierung ist.
Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik ein Nukleinsäurefragment verwendet, welches nachweisbar markiert ist.
Verfahren von Anspruch 13, wobei das Bestimmen an aus dem Gewebe extrahierter DNA vorgenommen wird.
Verfahren von Anspruch 14, wobei das Bestimmen an aus den Makrophagen extrahierter DNA vorgenommen wird.
Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die retrovirale Sequenz eine humane Immunschwäche-Virus-Sequenz ist.
Verfahren von Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei a) die Hybridisierungstechnik eine inverse Polymeraseketten-Reaktion ist; und b) die Hybridisierung unter Verwendung eines Paares von Nukleinsäure-Primern, welche an die retrovirale transkriptionsregulierende DNA-Sequenz hybridisieren, durchgeführt wird.
Verfahren von Anspruch 21, worin das Paar von Nukleinsäure-Primern an die Long-Terminal-Repeat-Sequenzen der retroviralen Sequenz hybridisiert.
Verfahren von Anspruch 22, worin die retrovirale Sequenz eine humane Immunschwäche-Virus-Sequenz ist.
Verfahren von Anspruch 18, wobei das Bestimmen durch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse durchgeführt wird.
Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das Zellproliferationsgen ein Onkogen ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus c-fes/fps, c-myc, ras und c-sis, und wobei das Bestimmen durch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse durchgeführt wird.
Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Lokalisierung der Integration der transkriptionsregulierenden DNA-Sequenz das z-Exon des fur-Gens ist, und wobei das Bestimmen durch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse durchgeführt wird.
Kit zum Diagnostizieren der Gegenwart eines klonal expandierten Makrophagen in einem Gewebe oder einer Probe durch das Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das Kit Folgendes umfasst: ein Paar Nukleinsäureprimer für die Amplifikation einer DNA-Sequenz, isoliert aus einem Makrophagen des Gewebes oder der Probe, wobei das Primerpaar an eine retrovirale transkriptionsregulierende DNA-Sequenz hybridisiert, integriert an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen in der DNA eines Makrophagen in dem Gewebe oder der Probe, wobei die Stelle ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Integration zur klonalen Expansion des Makrophagen führt.
Kit zum Diagnostizieren der Gegenwart eines klonal expandierten Makrophagen in einem Gewebe oder einer Probe durch das Verfahren von Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das Kit Folgendes umfasst: eine Nukleinsäuresonde für die Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Analyse von DNA, isoliert aus dem Gewebe oder der Probe, wobei die Integration einer retroviralen transkriptionsregulierenden Sequenz an einer Stelle relativ zu einem Zellproliferationsgen in der DNA eines Makrophagen mit Makrophagen-Proliferation assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresonde spezifisch an eine DNA-Sequenz nahe einer Stelle der retroviralen Integration hybridisiert, welche mit zellulärer Proliferation assoziiert ist.
Kit gemäß Anspruch 27 oder Anspruch 28, ferner umfassend ein Mittel zum Trennen eines Makrophagen von einer Nicht-Makrophagen-Zelle aus dem Gewebe oder der Probe.
Kit gemäß Anspruch 29, wobei das Trennungsmittel einen Antikörper gegen ein Makrophagen-spezifisches Zelloberflächenprotein und ein Mittel zum Nachweisen des Antikörpers umfasst.
Kit gemäß Anspruch 27, wobei das Paar von Nukleinsäureprimern an Long-Terminal-Repeat-Sequenzen der retroviralen Sequenz hybridisiert.
Kit gemäß Anspruch 31, wobei die retrovirale Sequenz eine humane Immunschwäche-Virus-Sequenz ist und das Primerpaar an Long-Terminal-Repeat-Sequenzen der humanen Immunschwäche-Virus-Sequenz hybridisiert.