JPH10503656A - クローンマクロファージが関与する細胞増殖性疾患の診断と治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 前癌および癌組織におけるクローンマクロファージの存在は、クローンマクロファージ増加がＨＩＶ組み込みまたは他の遺伝的変異のために生じる疾患の早期段階を呈示する。クローンマクロファージの増加は周辺組織の増殖を誘発し、癌性腫瘍増殖をもたらす。本発明は、前癌および癌組織並びに他の細胞増殖性疾患組織におけるＨＩＶ付随、およびＨＩＶ非付随クローンマクロファージの増加を診断するための方法およびキットを提供する。本発明はまた、クローンマクロファージ増加および周辺組織の増殖によって誘発された細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 クローンマクロファージが関与する細胞増殖性疾患の診断と治療 関連出願との相互参照 本出願は、本出願人らが先に出願した米国特許出願第０８／２８６７４５号（ １９９４年８月５日出願、現在係属中）の一部継続出願である。この先の出願は 参照によって本明細書に含まれ、当該出願に対して本出願人らは３５ＵＳＣ§１ ２０に基づき優先権を主張する。 連邦政府による支援研究に関する記載 本発明は、少なくとも部分的には連邦政府の基金により達成され、したがって 連邦政府は本発明に関して一定の権利を有するであろう。 発明の分野 本発明の分野は、細胞増殖性疾患；ヒト免疫不全ウイルス：組換えマクロファ ージ；細胞増殖性疾患のマクロファージ関与の診断方法；診断で使用するキット ；およびマクロファージ誘発性組織増殖を伴う細胞増殖性疾患の治療方法に関す る。 発明の背景 制御不能の過剰細胞増殖は、毎年数千件の診断が下される生命に係わる疾患の 原因である。細胞増殖性疾患には、種々の癌の他、最近その病因と細胞増殖との 相関性が明らかになった疾患が含まれる。具体的な例は、エイズ脳症患者の脳内 の星状神経膠細胞の増殖、アテローム硬化症、レトロウイルス誘発性腎疾患に起 因する糸球体硬化症を含む。 リンパ腫はＨＩＶ感染患者における一般的な癌形態である。１９９２年に米国 でリンパ腫と診断された約３６０００の新規症例のうち、８から２７％がＨＩＶ 感染者と概算される(M.H．Gailら、J．Natl．Can．Int.(1991)83:695-701)。し たがって、ＨＩＶ関連リンパ腫は、ＨＩＶ感染者のケアに関与する医師にとって 主要な臨床的問題である。 エイズリンパ腫の生物学は異論が多くかつ複雑なようである。エイズ流行の初 期に重度の非ホジキン型リンパ腫（ＮＨＬ）がエイズ進行の危険性がある患者に 出現し始めた（J．Zieglerら、N．Eng．J．Med.(1984)311:565-570)。しかしな がら、過去数年でＨＩＶ感染患者におけるＮＨＬの発生は増加している(M.E．Ha rnlyら、Am．J．Epi.(1988)128(2):261-267;A．Levineら、Ann．Intern．Med.(1 984)100:7-13)。エイズ流行の拡大につれて、非ホジキン型リンパ腫が今後も変 わらずＨＩＶ感染患者におけるより重要な健康上の問題となるであろうというこ とは明らかである。根本にあるＨＩＶ疾患の治療がより成功するようになるにつ れ、さらに日和見感染がなく患者がより長期間生存するようになるにつれ、おそ らく一層多くのリンパ腫症例がこの患者集団で出現するであろう。 ＨＩＶ感染患者で進行する非ホジキン型リンパ腫は、２つの主要なサブカテゴ リーに分類される。すなわち、大型細胞リンパ腫と小型非固着細胞のバーキット リンパ腫である（J．Zieglerら、(1984)上掲書; D.M．Knowlesら、Blood(1989)7 3:792-799;M．Bermudezら、Am．J．Med.(1989)86:71-76;P．Gillら、J．Clin．O ncol.(1987)5:1322-1328; L.D．Kaplanら、JAMA（1989）261:719-724;D.M．Know lesら、Ann．Inter．Med.(1988)108:744-753; D.A．Lowenthalら、Cancer（1988 ）61:2325-2337）。主要リンパ腫の両方の種類で重度の新生物が形成され、もっ ぱらＢ細胞起源であるが（J．Zieglerら、(1984)上掲書; M．Subarら、Blood(19 88)72:667-671）、Ｔ細胞リンパ腫の頻度もまた増加している（C.A．Presantら 、Cancer（1987）60:1459-1461;S．Nasrら、Cancer（1988）61:947-951;B.Hernd ierら、第７回後天性免疫不全症候群国際会議、フローレンス、イタリア（1991 年 6月 16-21日））。ＨＩＶ疾患では、リンパ腫は拡散性の攻撃的傾向を示し、 約９０％がＢ細胞に起源を発し５−１０％がＴ細胞由来である。大型細胞リンパ 腫の約１／２が、本明細書にいう“混合免疫表現型”リンパ腫（それらリンパ腫 はＢ細胞、Ｔ細胞およびマクロファージの混合を含むため）である。エイズ関与 非ホジキン型リンパ腫の共通の特徴は、リンパ節外関与（８５−９７％）(L.D． Kaplanら、JAMA（1989）261:719-724; R.L．Burkesら、Arch．Intern．Med.(198 6)146:913-915; A．Balasubramanyanら、Chest（1986）90:234-246;J．Guarner ら、Arch．Pathol．Lab．Med.(1987)111:254-256; L．Kaplanら、Ann．Intern． Med.(1989)110:162; S.L．Friedman Gastroenterol．Clin．North．Am.（1988） 17:465-486)および中枢神経系の関与（３５％）(J．Baumgartnerら、J． Neurosurg.(1990)73:206-211;S.C．Formentiら、Cancer（1989）63:1101-1107； S．Ciricilloら、J．Neurosur.(1990)73:720-724)の他、現在行われている化学 療法プロトコルに対するその貧弱な反応(L.D．Kaplanら、(1989)上掲書;M．Berm udezら、Am．J．Med.(1989)86:71-76;P．Gillら、J．Clin．Oncol.(1987)5:1322 -1328;W．Urbaら、J．Natl．Can．Inst.(1990)10:29-37; L.D．Kaplanら、JCO（ 1991）9(6):929-940)である。 一般にリンパ腫は悪性疾患の非均質集団である。その生物学的態様は、痛みの 殆どない治療を必要としないものから長期生存者が殆どいない攻撃的悪性度のも のまで範囲が広い。リンパ腫の活動はホストの免疫状態によって影響を受ける。 Ｂ細胞リンパ腫のリスクは、細胞仲介性免疫不全をもつ患者で劇的に増加する。 これらの群で最も性状が調べられたものは同種異系移植を受けた免疫抑制者で、 そのような人々がリンパ腫を発症させるリスクは、一般集団のそれの５０から６ ０倍である。これらの患者は、典型的な単クローン性免疫芽細胞性リンパ腫から 多クローン性リンパ球増殖性疾患の攻撃型まで広がる一連のリンパ球増殖性疾患 を発症する(G．Frizzeraら、Cancer Res.(1981)41:4262-4279; D.W．Hantoら、C ancer Res.(1981)41:4253-4261; D.W．Hantoら、Ann．Surg.(1983)198:356-369) 。後者のリンパ球増殖性疾患は、しばしばエプスタイン−バーウイルス感染に関 与する（D.W．Hantoら、(1981)上掲書; I．Penn，Transplant．Proc.(1983)15( 付録１):S2790-S2797; W.T．Shearerら、N．Engl．J．Med.(1985)312:1151-1159 ）。臨床的にはこれら患者のリンパ腫はリンパ節外の場所に攻撃的に出現し、Ｈ ＩＶ関与リンパ腫間で共通の特徴を示唆し、さらに異系移植に連動するリンパ腫 の分子的臨床的特徴特性を示唆する。 ＨＩＶリンパ腫診断の主要な手段は、今でもホルマリン固定組織のヘマトキシ リンエオシン染色切片の鏡検である。長い間、病理学の専門家は臨床所見、死体 解剖の検証を用い、さらに試行錯誤を繰り返して組織学的な診断方法および癌の 分類を確立した。癌の的確な組織学的診断をもたず、また癌の過大評価の下に患 者に癌治療を実施している現状は、正確な診断の提供についての十分な動機とな ろう。伝統的な組織学的方法はリンパ腫の表現型分析、特に遺伝型分析によって 強化されるであろう。その場合、罹患組織の明瞭な分子的変化はまた、別の治療 形態を指示するであろう。 発明の要旨 本発明は、遺伝型分析を用いて細胞増殖性疾患のクローンマクロファージの関 与を診断する方法に関する。本発明の方法は、ＨＩＶ付随リンパ腫および非ＨＩ Ｖ性リンパ腫または他の癌とともに癌性細胞増殖性疾患（例えばエイズ脳症、ア テローム硬化症および腎症）を含む（ただしこれらに限定されない）種々の細胞 増殖性疾患に応用できる。本発明はまた、そのような診断方法のためのキット、 マクロファージにより誘発される細胞増殖性疾患（マクロファージ誘発細胞増殖 性疾患）の治療方法、並びにマクロファージ誘発癌の治療に有用な治療剤のイン ビボおよびインビトロスクリーニングに有用な組換え体（リコンビナント）マク ロファージに関する。 ＨＩＶリンパ腫は、しばしばクローンマクロファージの関与と連動し、さらに 該マクロファージには既知の腫瘍遺伝子、ｃ−ｆｅｓ（ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ）の 上流にＨＩＶＤＮＡが組み込まれているという発見が開示される。下記に詳細に 述べるように、マクロファージのクローン性は多くのＨＩＶ関連リンパ腫と密接 に関係する。マクロファージのクローン性は、ＨＩＶ非関連リンパ腫とも連動し ている。マクロファージの増加はサイトカインの分泌によって周囲の組織の増殖 を強化するかもしれない。サイトカインインターロイキン−６はミエローマおよ びハイブリドーマ細胞の増殖を引き起こすことが示された(C．Woodruffら、DNA & Cell Biology 11:587-592)。 マクロファージのクローン性の診断および、クローンマクロファージを標的と する治療は、細胞増殖性疾患の治療に新しい方向を提供する。開示するものは、 診断方法およびキットの他、クローンマクロファージ誘発ＨＩＶリンパ腫と一般 的なクローンマクロファージ誘発細胞増殖性疾患を克服する戦いにおいて役立つ 治療方法である。 したがって、本発明の特徴の１つは、哺乳類の罹患組織でクローンとして増加 したマクロファージの存在を以下の工程によって診断する方法である：先ず細胞 増殖病巣をもつと考えられる組織サンプルを得て、続いて分子生物学の分野で習 熟した技術を有する者にとり周知の標準的な技術により当該組織からＤＮＡを分 離する。分離ＤＮＡのクローンＤＮＡの存在は以下を含む標準的な技術によって 決定されるが、ただしこれらに限定されない。すなわち、ＩＰＣＲによるＨＩＶ 組み込み部位の分析（B．Shiramizuら、Cancer Res.(1994)54:2069-2072）；ウ イルス（例えばＨＩＶ）組み込みの共通部位近くのゲノム配列のＲＦＬＰ（制限 酵素断片多形；Restriction Fragment Length Polymorphism）分析；または免疫 グロブリン（Ｉｇ）遺伝子再編成（リアレンジメント）分析(R．Levyら、J．Exp ．Med.(1977)145:1014-1028)である。この分析は、後に続くサザン分析で５％単 クローン混合物のＤＮＡバンドの濃さを決定して被験ＤＮＡのクローン性を比較 する標準物質として用いることができるように、既知量のコントロール単クロー ンＤＮＡおよびコントロール多クローンＤＮＡを混合することを含む。この技術 を用いて、単クローンマクロファージとは、分析組織内に５％より多い単クロー ンＤＮＡ成分を含むと定義される。組み込みＨＩＶを含む組織サンプルのクロー ン性を決定するために好ましく用いられる逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ） 技術は、貴重な診断ツールであり下記で詳細に説明する。 本発明の目的はまたマクロファージ誘発前癌組織および癌組織（５％よりも多 い単クローンＤＮＡが当該組織に含まれるマクロファージから得られるような組 織）の診断用キットである。本発明のキットの特徴は、ＨＩＶ含有細胞（例えば マクロファージ）のＤＮＡを増幅させる核酸プライマーである。好ましくはＨＩ Ｖ含有ＤＮＡの増幅のための核酸プライマーは、ＩＰＣＲ分析のためにＤＮＡ合 成が反対方向で開始するように５’および／または３’の大末端繰り返し（ＬＴ Ｒ，long terminal repeat）領域とハイブリダイズする。該キットはまた、標識 （例えば放射性標識、ビオチン付加または他の標準的標識）または、ＨＩＶ配列 のプライミングが不要な（例えばＨＩＶ非関連癌）場合のクローン性についてゲ ノムＤＮＡのＲＦＬＰ分析を実施するための検出可能なプローブを含む。そのよ うなプローブは、遺伝的な変化が細胞増殖と密接に関係する遺伝的座位（例えば 細胞増殖を引き起こすウイルス組み込みの共通部位）とハイブリダイズする。そ のような部位には、ウイルスがその部位に組み込まれて増殖を促進する細胞増殖 遺伝子を活性化させる部位が含まれる。本発明のキットはまた、組織サンプル中 のマクロファージを分離し特定するためにマクロファージ特異的細胞表面蛋白の 検出用抗体を含む。 本発明の診断方法の特徴は、被験ＤＮＡとコントロールＨＩＶ含有ＤＮＡとを 比較して、該組織形態学においてＨＩＶ含有クローン細胞（例えばクローンマク ロファージ）の関与を呈示することである。クローンマクロファージの関与は、 まず初めに細胞を亜集団に分類し（蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）技術、ガラ スもしくはプラスチックへのマクロファージ吸着または当分野で周知の他の技術 によって）、続いてＤＮＡを分析することによって決定される。また別に、細胞 の混合集団から得たＤＮＡの分析は、その後の組織調製物の二重染色またはイン シトゥ（in situ、そのままの場所での）ハイブリダイゼーションによってクロ ーンＨＩＶとマクロファージとを相関させることによって実施される。 本発明の診断方法はまた、ＨＩＶ非関連マクロファージのクローン性の分析を 特徴とする。本方法は、前癌組織もしくは癌組織から得た細胞の混合物または予 め分類されたマクロファージ亜集団から得た被験ＤＮＡを分離し、続いてこの被 験ＤＮＡのＲＦＬＰ分析を実施することを含む。本発明のＲＦＬＰ分析は、ウイ ルス組み込み時の細胞増殖と密接な関係を有する共通のウイルス（例えばＨＩＶ ）組み込み部位をコードするゲノム配列とハイブリダイズする核酸プローブを利 用する。例えば、ｆｕｒ遺伝子のｚエクソン内のゲノムＤＮＡへのＨＩＶ組み込 みが、Ｔ細胞（B．Shiramizuら、(1984)上掲書）および本明細書で述べるように マクロファージの両方で観察された。 本発明の診断方法を用いて、ＨＩＶクローン性が存在しなければ、組織形態学 におけるＨＩＶ非関連クローンマクロファージの関与を示唆することができる。 ＨＩＶとマクロファージの両方の関与が存在しないかどうかはまた本発明のキッ トを用いて明らかにすることができる。マクロファージ関与の診断は、患者に適 切な治療計画を考案するために医師に重要な情報を提供する。 本発明の特徴はまた、細胞増殖遺伝子の発現がマクロファージの（増加）をも たらすように細胞増殖遺伝子が機能的に連結された転写／翻訳制御配列をそのゲ ノム内に組み込んだマクロファージである。細胞増殖は、サイトカインまたは他 の細胞増殖遺伝子（例えば腫瘍遺伝子）の発現が実質的に増加した結果であろう 。例えば、プロモーターまたはエンハンサー成分がその中に組み込まれていない マクロファージでのｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ発現と比較して下流のｃ−ｆｅｓ／ｆｐ ｓ 遺伝子の発現が実質的に増加されるような、そのようなマクロファージのｆｕ ｒ 遺伝子のｚエクソン中への強力なプロモーターおよびまたはエンハンサー成分 の組み込みは、近くの（ここで近くのとは転写開始部位から約１２ｋｂ、好まし くは約１０ｋｂ、より好ましくは約５ｋｂ以内を意味する）遺伝子の発現を増強 させることができる。前記の強力なプロモーターおよび／またはエンハンサー成 分は、例えばＨＩＶゲノム；不完全ＨＩＶゲノム（この場合ＨＩＶ３’ＬＴＲの エンハンサー領域は機能的である）；ＨＩＶ３’ＬＴＲのエンハンサー；または 他のプロモーターもしくはエンハンサー成分である。マクロファージのｃ−ｓｉ ｓ （ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子）内またはその近くのＨＩＶ組み込みはマクロファージ の増殖を促進する。 強力なプロモーター（さらに場合によってはエンハンサー成分）をコードし、 増殖を促進させる細胞増殖遺伝子に機能的に連結されたＤＮＡ配列のマクロファ ージゲノムへの組み込みは、標準的な分子生物学的技術（例えばトランスフェク トＤＮＡのリポゾームへの送達）によって達成される（例えば、「分子クローニ ング：実験室マニュアル」(Molecular Cloning; A Laboratory Manual)、Sambro okら、グリーン・パブリッシング・アシエーツ、コールドスプリングハーバー研 究所出版部(1989)；および「分子生物学の最新プロトコル」(Current Protocols in Molecular Biology)、Ausubelら、John Wiley & Sons，ニューヨーク(1989) を参照のこと）。リコンビナントマクロファージは、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ発現の 増加について本明細書で詳述する技術でスクリーニングされる。また別には、転 写／翻訳制御領域はＤＮＡ発現カセットの細胞増殖遺伝子に融合され、このカセ ットはマクロファージゲノムに組み込まれる。このカセットの細胞増殖遺伝子の 発現もまた細胞増殖をもたらす。リコンビナントマクロファージはまた、Ｂおよ びＴ細胞集団に導入したとき、非組換え体マクロファージと比較して細胞増殖を 強化することができるか否かについてスクリーニングされる。 例えば腫瘍遺伝子ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓまたはｃ−ｓｉｓのような細胞増殖制御 遺伝子の発現レベルが強化されたマクロファージは、そのようなマクロファージ の増殖を抑制する能力について治療薬をインビトロでスクリーニングするために 有用である。本発明のスクリーニング方法は、適切な培養液中でｃ−ｆｅｓ／ｆ ｐｓ またはｃ−ｓｉｓの発現レベルが実質的に増強されているリコンビナントマ クロファージ培養を提供する。この培養リコンビナントマクロファージに治療薬 を送達させるために、適切な製剤形態にある治療薬が該リコンビナントマクロフ ァージ培養に加えられる。該薬剤の投与効果は、細胞増殖の減少、細胞の生命活 性度の減少、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓまたはｃ−ｓｉｓの発現の減少、および／また はサイトカイン発現の減少としてモニターされる。細胞増殖および生命活性度を モニターする方法は当分野で周知である。ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓおよびサイトカイ ン発現をモニターする方法は本明細書で詳述する。モニターされる表現型におけ る低下を引き起こす治療薬は、表ＩＩに挙げたようなマクロファージ誘発癌の治 療のための候補化合物または候補製剤として選ばれる。 本発明の特徴は、リコンビナントマクロファージ（例えば、細胞増殖遺伝子の 発現強化のために転写制御配列を組み込まれたクローンとして増加したマクロフ ァージ）をホストから実質的に排除する能力について候補治療薬をインビボでス クリーニングする方法である。このリコンビナントマクロファージはホストの適 切な組織（例えば脾臓、末梢血液、皮膚、または骨髄）に注射され、リコンビナ ントマクロファージを含む腫瘍の増殖がモニターされる。続いて、マクロファー ジに優先的に取り込まれるように製剤化した候補治療薬を、ホストから該リコン ビナントマクロファージを実質的に排除するために有効な投与量で有効な間隔で さらに有効な期間ホストに投与する。 本発明のまた別の特徴は、クローンとして増加したマクロファージの存在によ って誘発された細胞増殖疾患の治療のための候補治療薬を特定する方法である。 このスクリーニング方法は、クローンとして増加したマクロファージ（例えば、 機能的な転写制御領域（例えばプロモーター／エンハンサー領域）に機能できる ように連結された増殖を促進させる細胞増殖遺伝子を含むリコンビナントマクロ ファージ）を含む哺乳類の腫瘍組織を哺乳類（例えば重篤な結合免疫不全（ＳＣ ＩＤ）マウス）へ移植することを含む。癌または他の細胞増殖性疾患は、移植組 織を含む哺乳類で進行させることが可能である。医薬的に有効量の候補治療薬を 哺乳類に投与し、薬剤の投与が、該腫瘍サイズの減少、クローンマクロファージ の生命活性度の減少、またはクローンマクロファージ増殖の減少をもたらすか否 かを決定する。 本発明の別の特徴は、第一に患部組織でクローンとして増加したマクロファー ジの存在を決定することによってクローンマクロファージ関与細胞増殖疾患を治 療する方法である。第二に、マクロファージによって優先的に取り込まれるよう に製剤化した治療薬を該患部組織を有する哺乳類（好ましくはヒト）に投与する ことによって、マクロファージは実質的に患部組織から排除される。この投与は 、マクロファージ（クローンとして増加したマクロファージを含む）を該哺乳類 から実質的に排除するために十分な投与量、間隔でおよび十分な期間実施される が、当該哺乳類のマクロファージ集団が再生されるように治療薬投与の中断を必 要とする。 本発明の別の特徴は、その治療薬が細胞増殖遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡを コードするＤＮＡである上記に説明した治療方法である。この標的となる細胞増 殖遺伝子は、ＨＩＶ組み込みの共通部位近く（すなわち該部位から１２ｋｂ以内 、好ましくは５ｋｂ以内）に位置する遺伝子で、この場合該ＨＩＶ組み込み共通 部位はクローンとして変異させるために本発明の診断方法によって明らかにされ る。アンチセンスコードＤＮＡをマクロファージゲノムに導入し、さらに該アン チセンスｍＲＮＡを発現させることによって細胞増殖遺伝子の発現は減少する。 本発明のまた別の特徴は、細胞増殖遺伝子の変異型をコードするＤＮＡを含む 治療薬であるが、それは、マクロファージゲノムの内在性細胞増殖遺伝子への組 み換えがゲノムに取り込まれた突然変異を生じるようなものである。この細胞増 殖遺伝子の変異は、遺伝子発現が実質的に排除されるか、または遺伝子発現が実 質的に機能できない遺伝子産物をもたらすようにデザインされる。 分子生物学分野の通常の技術を有する者には、細胞に遺伝子を導入するために は通常の種々の遺伝子移転方法のいずれも用いることができることは理解されよ う。例えば、細胞にＤＮＡを導入する物理的な方法には、微量注入（microinnje ction）(例えば、Capecchiら、Cell 22:479(1980)参照)、電気穿孔(electropora tion)(Reissら、Biochem．Biophys．Res．Commun．137:244(1986)を例えば参 照のこと)、および他の標準的な方法が含まれる。例えば燐酸カルシウムを用い る同時沈澱およびリポゾームへのＤＮＡ取り込みのような化学的方法は、哺乳類 細胞、本明細書で詳述するように特にマクロファージにＤＮＡを導入するために 用いられた。最後に、ウイルスベクター、特にネズミおよび鳥類レトロウイルス に由来するものを用いて哺乳類細胞に核酸を送りこむことができる(Gluzmanら、 ウイルスベクター(Viral Vectors)、コールドスプリングハーバー研究所、コー ルドスプリングハーバー、ニューヨーク(1988)を例えば参照のこと)。 本発明は、市販の細胞毒性治療薬、例えばトリコサンシン(trichosanthin)(J. D．Lifsonら、USPN4795739; USPN4869903; M.S．McGrathら、PNAS 86:2844-2848 (1989))、α−もしくはβ−モモカリン(momorcharin)（J.D．Lifsonら、上掲書 ）、他の一本鎖リボソーム不活性化蛋白、またはＨＩＶ抑制療法もしくは癌治療 の分野で周知の他の細胞毒性剤を利用することができる。この細胞毒は、複数の 薬剤の結合作用が細胞毒性効果をもたらすような多剤薬を含むことができる。 トリコサンシンは、トリコサンテス・キリロウイー(Trichosanthes kirilowii ) の根結節から得られた植物蛋白である。それはリシンＡ鎖のアミノ酸配列と相 同性を有し、さらに、リシンおよび種々の一本鎖リボソーム抑制蛋白（例えばモ モカリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（ＰＡＰ）、コムギ麦芽抑制物質 およびゲロニン(Xuejun)(J.D．Lifsonら、上掲書)）と同様なリボソーム抑制特 性を有する可能性がある。トリコサンシンおよびモモカリンは、マクロファージ を含むヒト血液細胞でＨＩＶ抗原の発現を抑制する(J.D．Lifsonら、上掲書))。 他の細胞毒性剤または増殖調節剤の例には、ダウノマイシン、マイトマイシン Ｃ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、５−ＦＵ、サイトシンアラビノシド、コ ルヒチン、サイトケラシンＢ、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチ ン、メトトレキセートなどが含まれる。さらにまた興味深いものは、微生物また は植物に由来する毒性剤である。その例には、天然に生じる毒素（例えばリシン 、アブリン、ジフテリア毒素、サポリンなど）の毒性サブユニットが含まれる。 例示的な毒性サブユニットには、ジフテリア毒素のＡ鎖、緑膿菌外毒素−Ａ、リ シンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、および種々の植物（例えばゲロニウ ム・マルチフロルム(Gelonium multiflorum)、フィトラッカ・アメリカーナ(Phy tolacca Americana) 、クロトン(Croton)、チグリウム(Tiglium)、ジャトロファ( Jatropha) 、クルカス(Curcas)、モモルディク(Momordic)、カランチア(Charanti a) 、レーカン(Reachan)）で見出される同様な活性を有する蛋白の酵素的に活性 な蛋白分解フラグメント、サポナリア・オフィシナリス(Saponaria officinalis ) 由来毒素サポリン（Thorpeら、J．Natl．Can．Inst.(1985)75:151）、チャイニ ーズキュウリ毒素、トリコサンシン(Yeungら、Intl．J．Peptide Protein Res.( 1985)27:325-333)が含まれる。これらの毒素の変異種、例えばＣＲＭ４５（Boqu etら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1976）73:4449-4453）もまた用いることが できる。 本発明の細胞増殖性疾患の治療方法の特徴は、リポゾーム内にマクロファージ 特異的細胞毒素または広域細胞毒性剤を含むリポゾーム調製物である。そのよう な細胞毒素含有リポゾームは、単核食細胞系の食細胞によって優先的に細胞毒素 含有リポゾームが取り込まれるように適切な大きさで調製される。マクロファー ジ“自滅”法で使用する好ましい細胞毒素は、報告（N．Van Rooijen & A．Sand ers，J．IMM．Methods 174:83-93(1994)）されたようにジクロロメチレン−ビス ホスホネート（Ｃｌ₂ＭＢＰまたはクロドロネート）である。 細胞毒素含有リポゾームのマクロファージへの照準化によって、送達の特異性 と取り込み強化が提供される。照準化は、マクロファージ特異的抗体（例えば抗 ＣＤ１４）をリポゾームへに取り込ませるか、または結合させることによって達 成される。治療用リポゾームの調製のための適切な脂質および他の物質並びに方 法は当分野で周知である（例えば以下を参照のこと：F.J．Martin & D．Papahad jopoulos，J．Biol．Chem．257:286-288(1982); F．Szoka & D．Papahadjopoulo s，Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9:467-508(1980)およびM.J．Ostro編、生物物 理から治療薬にわたるリポゾーム(Liposomes From Biophysics to Therapeutics )，Marcel Dekker，Inc.，ニューヨーク(1987)）。 本発明の癌治療方法のまた別の特徴は、細胞表面抗体−細胞毒素複合体のマク ロファージ細胞表面マーカーへの優先的結合に続いてマクロファージによって該 細胞毒素が優先的に取り込まれるように、抗マクロファージ細胞表面抗体が細胞 毒性剤に共有結合されているということである。該複合体の取り込みは、マクロ ファージにとって通常の食細胞的貧食過程によって行われる。 増殖調節剤および照準化剤（これは細胞外マトリックスへの結合を提供する） は、通常、酵素的な還元水解によって細胞内もしくは細胞外のいずれかで切断可 能な結合によって、または酸に対して不安定な結合によって連結することができ る。用いられる連結の種類は多くの要素によって左右されるが、特に増殖調節剤 の性状に依存する。例えば、該薬剤が効果を有するために細胞の内部に局在化さ せねばならないようなもの（例えば毒素分子たは毒素のＡ鎖）の場合、照準化部 分との結合は切断できることが好ましい。この照準化部分は、例えば血清アルブ ミン（特にヒト血清アルブミン）、ポリアミノ酸、デキストランなどによって直 接または間接的に当業者に周知の方法で薬剤に結合させることができる。担体分 子の使用によって、多数の増殖調節剤のリンカー分子への結合が可能になる。そ の数は、好ましくは抗増殖化合物の場合は担体分子１分子当たり１０から３０分 子、または毒素分子の場合は担体分子１分子当たり１から２分子である。 用いられる結合の種類はまた、該増殖調節活性の最終的目的地である細胞の種 類によって決定される。したがって、当該細胞が食細胞特性を有する場合（例え ば線維芽細胞およびマクロファージ）には、好ましくは照準化部分と増殖調節部 分との間の結合は、ｐＨまたは酸に対して不安定な結合である。また興味深いも のはペプチド結合で、これは酵素による加水分解に感受性で、この酵素はまた細 胞外マトリックスに存在する可能性がある。都合のよい結合には、したがってジ スルフィド、イミド、ヒドラゾン、アミドなどが含まれる。 本発明の癌治療方法のまた別の特徴は、通常の癌治療方法による該腫瘍の非マ クロファージ細胞の補完的治療で、クローンとして増加した腫瘍のマクロファー ジと該腫瘍の非マクロファージ細胞の両方がそれぞれ実質的に除去されるような ものである。 “クローンマクロファージ”または“クローンとして増加したマクロファージ ”とは、単一の先祖から生じる同一のコピーを意味する。 “ＤＮＡのクローン性”とは、識別することが可能なＤＮＡの性状、例えばＲ ＦＬＰ（制限酵素断片多形）、サザン分析による遺伝子の再編成（リアレンジメ ント）、ＩＰＣＲ、または当業者に周知の他の技術で決定されるような細胞集団 から分離されたＤＮＡの同一の程度を意味する。したがって、本発明の診断方法 の実施によって５％コントロールサンプルと等しいかまたはより強い濃さをもつ 明瞭なＨＩＶ特異的および／またはマクロファージ特異的ＤＮＡバンドパターン が生じた場合、組織サンプルは単クローンマクロファージ成分を有するという。 “５％コントロールサンプル”とは、既知の単クローンＤＮＡサンプルが全Ｄ ＮＡの５％を構成するように添加されている既知の多クローンＤＮＡサンプルを 意味する。 “プロモーター”とは、転写を指令するために十分な最小の配列をいう。本発 明にまた含まれるものは、外部のシグナルまたは薬剤に特異的もしくはそれらに よって誘発可能な細胞タイプについてプロモーター依存性遺伝子発現を制御可能 にさせるために十分なプロモーター成分である。そのような成分は天然の遺伝子 の５’または３’領域に位置するであろう。 “ゲノムに組み込まれる”とは、細胞（例えばマクロファージ）のゲノムＤＮ Ａ鎖内に直線的に取り込まれ、その末端の各々で該ゲノムＤＮＡに連結される外 来性ＤＮＡ（例えば発現カセットまたはウイルス配列）を意味する。発現カセッ トをコードする外来性ＤＮＡは、当該コード配列によって機能的なＲＮＡまたは 蛋白が生成されるように組み込まれる。外来性ウイルス配列は、近くの内在性配 列の発現が生じるように組み込まれる。 “エンハンサー”とは、実質的に野性型の水準を越えるよう発現を強化させる ために十分な最小の配列を意味する。本発明にまた含まれるものは、外部のシグ ナルまたは薬剤に特異的もしくはそれらによって誘発可能な細胞タイプについて 制御可能なプロモーター依存性遺伝子発現を強化させるために十分なエンハンサ ー成分である。そのような成分は天然の遺伝子の５’または３’領域に位置する であろう。 “医薬的に活性な量”とは、細胞または哺乳類に投与したとき所望の生理学的 効果（例えば細胞毒性、生命活性度の低下、または増殖の実質的低下）を生じる 薬剤（例えば治療薬）の量を指す。 “実質的な増加”または“実質的に越える”とは、発現、転写または他の過程 の野性型の水準を越える増加で、当該増加が野性型を少なくとも約５０％越える ものを指す。 “実質的減少”または“実質的低下”とは、発現、転写もしくは測定可能な表 現型の特徴の減少または低下で、それは野性型の水準の約８０％、好ましくは野 性型水準の約５０％、より好ましくは野性型水準の約１０％もしくはそれ未満に 当たる減少である。 “実質的に排除される”または“実質的に除去される”とは細胞数の減少を意 味し、これは、約５０％未満の細胞が活性を維持し、好ましくは約２０％未満、 より好ましくは１０％未満の細胞が活性を維持するようなものである。 “実質的に低下した生命活性度”とは、コントロール集団と比較して細胞集団 内の生存細胞の数の減少を指し、それは細胞の約５０％が生存し、好ましくは細 胞の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満が生存しているものである。 “前癌組織”とは、病理学分野で習熟した者にとって周知の組織学的検査およ び外科的病理学的評価によって過形成とされる哺乳類組織を指す。 “癌組織”とは、もはや増殖調節物質の正常な制御下にはない哺乳類組織を意 味する。哺乳類組織のこの癌性性状は、病理学分野で習熟した者にとって周知の 外科的病理学的評価によって決定される。 “アンチセンス”とは、問題の標的遺伝子の非コード鎖が構築物中で発現のた めに配置されている核酸を指し、これは、ｍＲＮＡとして発現される場合は、こ のアンチセンス一本鎖ｍＲＮＡは、その利用を調節しようとしている標的遺伝子 のｍＲＮＡと相補的であり、さらにこの標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズ する。このメッセンジャーＲＮＡの配列と相補的な配列は通常は少なくとも約１ ５ヌクレオチド、より通常では少なくとも約２０ヌクレオチド、好ましくは約３ ０ヌクレオチドまたはそれより大きく、より通常では長さが１０００ヌクレオチ ドより短い。 アンチセンス配列が結合する特定の部位およびアンチセンス配列の長さは、所 望される抑制の程度、配列の固有度、アンチセンス配列の安定性などによって変 動する。したがって、これらの要因は、特定のアンチセンス配列に関して既に得 られた経験に基づいて経験的に決定されるであろう。 “機能的に結合されて”とは、機能的プロモーター成分（転写および（利用可 能な場合には）翻訳の開始部位を含む）とその５’末端で融合され、さらに機能 的な転写および（利用可能な場合には）翻訳開始配列とその３’末端で融合され た発現されるべき核酸配列を指す。 “核酸プライマー”とは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始のため に対象となる核酸配列にハイブリダイズする一本鎖核酸配列（好ましくはＤＮＡ ）を意味する。本発明の核酸プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応法および、本 明細書およびシラミズらの報告（B．Shiramizuら、上掲書(1994)）で詳述する逆 ポリメラーゼ連鎖反応法で使用するためにデザインされている。 “標識核酸プローブ”とは、それに対して標識（例えば放射性標識；ビオチン 付加部分；または当分野で既知でありサザンおよびノーザン分析で有用な他の標 識）が結合されている一本鎖核酸配列を指す。本発明の診断方法で用いられる標 識プローブの核酸配列は、共通のＨＩＶ組み込み部位の近く（すなわち５ｋｂ以 内、好ましくは１ｋｂ以内）のゲノム配列とハイブリダイズする。この部位での ＨＩＶ組み込みは感染細胞の増殖が高まることと密接に関係する。そのような共 通の組み込み部位の例は、ＨＩＶ組み込みがマクロファージ増殖（本明細書で詳 述）またはＴ細胞増殖（B．Shiramizuら、上掲書(1994)）と密接に関係するｆｕ ｒ 遺伝子のｚエクソンである。 “細胞増殖”とは、コントロール集団の細胞増殖（例えば細胞分裂）の速度を 越えて被験集団の細胞増殖が高められることを意味する。すなわち、細胞増殖は コントロール集団より２０％高く、好ましくは５０％高く、より好ましくは１０ ０％より高い。 “細胞増殖性疾患”とは、組織の正常な細胞増殖と比較して過剰な細胞増殖に よって引き起こされる病的状態を意味する。そのような疾患にはリンパ腫、非類 リンパ腫性癌、エイズ脳症、アテローム硬化症、腎症、巣状分節状糸球体硬化症 が含まれるが、これらに限られるものではない。 “細胞増殖と密接に関係する遺伝子”とは細胞増殖促進遺伝子（例えば腫瘍遺 伝子）を指し、これは、ウイルスの組み込みまたは他の変異のために活性化され ると細胞増殖の強化をもたらす。細胞増殖遺伝子には、腫瘍遺伝子（例えば当分 野で周知のｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｓｉｓ）、および例 えばＩＬ−６およびＩＬ−１０のようなサイトカインをコードする遺伝子が含ま れるが、これらに限定されるものではない。活性化腫瘍遺伝子とは、哺乳類（特 にヒト）で新生物の成長の蓋然性を高める腫瘍遺伝子を意味する。細胞増殖と密 接に関係する遺伝子にはまた、サプレッサー遺伝子の遺伝子発現の抑制が細胞増 殖をもたらすような細胞増殖抑制遺伝子が含まれる。 “本質的に非機能性の変異型遺伝子”とは、野性型の水準の５０％、好ましく は２０％、より好ましくは１０％未満で発現されるか、または機能する遺伝子も しくはその遺伝子産物を意味する。 “マクロファージによる優先的取り込み”とは、細胞培養または哺乳類でマク ロファージ以外の他の細胞タイプの細胞より高い程度（２０％より高く、好まし くは５０％より高く、より好ましくは１００％より高い程度）で薬剤を取り込む ことができるマクロファージを指す。 “キット”とは、物質的成分（例えば特異的プライマー、標識プローブおよび 本発明の実施に有用な他の成分）の組合せを指す。本発明の診断用キットは、哺 乳類の組織サンプル中のクローンマクロファージの診断に有用な成分を含む。 “マクロファージ”とは、単球／マクロファージ系列の細胞を指し、これは脾 臓で見出されるか、または組織マクロファージへと分化している。これらの細胞 には、小胞性樹状突起細胞(follicular dendritic cell)（ＦＤＣ）、樹状突起 細胞、ランゲルハンス細胞とともに他の組織マクロファージが含まれる。本明細 書で述べるマクロファージは本体が非可染性のマクロファージで組織中での細胞 性残屑の清掃とは関係をもたない。“組織”とは、哺乳類から分離される一切の 物質を指し、体液（例えば血液、血清、脳脊髄液）または、本発明の方法による 分析のためにマクロファージを含む可能性がある一切の材料を含む。 “ＨＩＶ”とは、ヒト免疫不全ウイルスのＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株または 他の変種を指す。 本発明の方法および本発明のキットは、好ましくは、ヒトのクローンＨＩＶ関 与マクロファージ誘発癌およびヒトのＨＩＶ非関与マクロファージ誘発癌の診断 および治療のためにデザインされる。 本発明の他の特徴および利点は、その好ましい具体例に関する下記の説明およ び請求の範囲から明瞭であろう。 図面の簡単な説明 先ず図面を最初に説明する。図面 図１は、組み込み部位を検出するためのＩＰＣＲ方法の模式図である。プライ マーＣＷ１Ｂ（配列番号：１）およびＣＷ２Ｈ（配列番号：２）は、反対の向き でＬＴＲ領域と接する。プライマーとプローブの配列は示されている。プライマ ーとプローブの位置は、ｆｕｒ遺伝子の組み込み部位の遺伝子地図の上と下に矢 印で表示されている。 図２は、ヒトｃ−ｓｉｓへのＨＩＶ挿入の模式図である。 図３は、ＨＩＶがイントロン５に挿入されたヒトｃ−ｓｉｓ原始腫瘍遺伝子配 列の部分である。この配列を決定したＤＮＡは、エイズ脳症患者の脳脊髄液から 得たマクロファージ由来のＩＰＣＲ生成物であった。ヌクレオチド３４３位の挿 入が、既知ｃ−ｓｉｓ配列（HUMSIS5DEL 配列番号：６）と比較して被験遺伝子 （CSF2C2.DNA、配列番号：７）の相同性低下として観察される。 好ましい実施例の説明 以下に組織サンプル中のクローンＨＩＶの有無を決定する組成物および方法の 他に、本発明を実施するうえで有用な技術を詳述する。本発明の特徴を開示し説 明するために本明細書に記載する全ての刊行物は、参照により本明細書に含まれ る。下記実施例は説明のために提供されるのであって、制限と解されるべきでは ない。実験の部 ＨＩＶと非Ｂ細胞性悪性疾患の病理発生 上記で述べたように、幾つかのエイズ関与非Ｂ細胞性リンパ腫は、クローン型 のＨＩＶを含む。必要な治療を調査するためにクローンとして増加している細胞 の種類を決定することは有用であろう。前癌組織および癌組織におけるＨＩＶの 存在およびクローンの性状を決定するために、２種の混合免疫表現型リンパ腫お よび異常蛋白血症検体をもつ１つの血管免疫芽細胞性リンパ節症を調べた。これ らの症例の３例で高レベルのＨＩＶを同定したサザンブロット分析は、材料と方 法の項で述べるように実施した。これらのリンパ腫は、腫瘍内に最も多く存在す る単一のＨＩＶの型があることを明らかにした。これら組織検体の３例全てが混 合免疫表現型の形態を有し、それらのうち２例はクローン性ＢまたはＴリンパ球 を有してなかった。一方、１例はＴ細胞のクローン集団を有していた。 これらリンパ腫内のＨＩＶ配列の組み込み部位をマッピングするために、逆Ｐ ＣＲ（ＩＰＣＲ）と呼ばれる工程を実施した（B．Shiramizuら、上掲書(1994)） 。ＩＰＣＲ技法の模式図を図１に示す。この技術では、クローン型のＨＩＶの組 み込み部位は、ＨＩＶのＬＴＲ内の配列と相補的な互いに外側に向くＰＣＲプラ イマーを利用し、続いて制限酵素消化、連結およびＤＮＡ合成を実施して増幅さ れた。 図１に示すように、クローン型のＨＩＶが腫瘍内に存在するとき、１つまたは ２つのＰＣＲバンドをもつ単純なバンドパターンが一般には出現するであろう。 各バンドは隣接する細胞のゲノム配列を有するＬＴＲを示す。これら混合免疫表 現型検体由来の組み込み部位は、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ腫瘍遺伝子の丁度５’にあ るｆｕｒ遺伝子（染色体１５に存在）セグメントにあることがマッピングで示さ れた。これは、クローン性ＨＩＶ関与Ｔ細胞リンパ腫で認められた組み込み部位 と同じで（B．Shiramizuら、上掲書(1984)）、このことは、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ 腫瘍遺伝子の上流にＨＩＶが組み込まれることによって細胞の増加をもたらすこ とを示唆している。先に述べたＴ細胞リンパ腫と比較されるように、これら３つ の腫瘍に由来する腫瘍含有および非含有組織についてＩＰＣＲを実施した。クロ ーン性ＩＰＣＲ生成物がこれらの腫瘍から増幅されたが、一方これら症例の内の ２例から得た非関与リンパ節および脾臓では増幅配列は認められなかった。各腫 瘍から得た両方の増幅ＩＰＣＲ生成物とハイブリダイズする内部ＬＴＲ遺伝子プ ローブ（配列番号：３）を用いたサザン分析によって、各生成物はＬＴＲ配列を 有することが示された。ｆｕｒの３’エクソンの５’および３’末端の両末端の オリゴヌクレオチドを表す２つのｆｕｒプローブ（配列番号：４及び配列番号： ５）をこれらＩＰＣＲ生成物のサザン分析で用いた。各症例から得た１つのＬＴ Ｒ含有ＩＰＣＲ生成物は、このｆｕｒプローブとハイブリダイズしたが、これは 、ＨＩＶはｆｕｒ遺伝子の３’エクソンに組み込まれたことを示唆している。こ れら腫瘍の１つの配列分析によって、ｆｕｒ遺伝子のこのセグメントの存在部位 が確認された。マッピングによって、１つの検体の組み込み部位は、ｆｕｒの３ ’エクソン２２００塩基対の塩基対３０１位にあり、別の検体については、塩基 対１６５２位にあることが分かった。 ＩＰＣＲ分析の感受性を決定するために、最初のＴ細胞リンパ腫（B．Shirami zuら、上掲書(1984)）由来のＤＮＡを、同じ患者由来の過形成リンパ節から抽出 したＤＮＡで段階希釈した。このＩＰＣＲ技術は２から５％の感受性を有するが 、これは組み込まれたＨＩＶのクローン型はそれらが検体の２から５％を占める ならば増幅されるであろうという意味である（B．Shiramizuら、上掲書(1984)） 。いずれの型のＩＰＣＲ生成物もＨＩＶ感染者の過形成リンパ節または脾臓組織 では認められなかった。クローン型ＨＩＶは非Ｂ細胞性リンパ腫で見出される クローンＨＩＶの関与が非Ｂ細胞リンパ腫では一般的であるか否かを調べるた めに、ＩＰＣＲ分析を一群の非Ｂ細胞性悪性疾患について実施した。このＩＰＣ Ｒ法は材料と方法の項で詳述する。この群には、菌状息肉腫、皮下Ｔ細胞リンパ 腫、ＡＩＬＤ、ホジキン症、および混合免疫表現型リンパ腫をもつ患者から得ら れた検体が含まれる。表ＩはＩＰＣＲ分析の結果を示す。 結果は各サンプルのＩＰＣＲバンドの数の一覧表である。表中、ＭＦは菌状息 肉腫、Ｌｙｍはリンパ腫、ＡＩＬＤは血管免疫芽細胞性リンパ節症、ＫＳはカポ ジ肉腫を指す。３つの症例からはまた別の組織が用いられた（９：非関与リンパ 節、１５：非関与副腎および脳のカポジ肉腫、１７：非関与腎）が、これらは内 部陰性コントロールとして用いられた。ｆｕｒプローブに対するハイブリダイゼ ーションの結果（カラム５）は、ＩＰＣＲバンドを有するサンプルについて陽性 または陰性として示した。 表Ｉの結果は、分析した１８症例のうち１４症例が腫瘍ＤＮＡ内に存在するク ローン型ＨＩＶを有することを示唆した。ＨＩＶのクローン型が検出された各症 例では、１つまたは２つのＩＰＣＲ生成物が増幅された。増幅バンドの大きさは それを生じる検体間で変動したので、おそらくこのバンドはＰＣＲの人工的産物 ではない。いくつかの症例では、免疫表現型の結果によって腫瘍内に存在する細 胞中のＨＩＶの存在が確認された。ホジキン症検体ＵＭは、合胞体性変種ホジキ ン症で、この症例では腫瘍細胞の全てが、マクロファージ系列の細胞と関係を有 するリード−スターンバーグ（Reed-Sternberg）細胞であった。これらの細胞は 抗ＨＩＶｐ２４抗体で染色され、クローン型ＨＩＶはＩＰＣＲで同定された。Ｉ ＰＣＲ生成物の全てをまたサザン分析でＨＩＶ ＬＴＲプローブでハイブリダイ ズさせた。１３のＩＰＣＲ生成物のうち６生成物は、先に述べたｆｕｒプローブ とハイブリダイズしたが、このことはこれら６例の非Ｂ細胞性リンパ腫はｃ−ｆ ｅｓ／ｆｐｓ 腫瘍遺伝子のまさに５’に組み込まれたクローン型ＨＩＶをもつこ とを示している。 クローンＨＩＶの関与を４例のカポジ肉腫でしらべた。４検体のうち１例がク ローンＨＩＶのＩＰＣＲ生成物を示し、さらにＨＩＶｐ２４分析によってＨＩＶ の発現が腫瘍細胞に隣接するマクロファージに局在することが分かった。ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓは腫瘍組織で発現する 表Ｉの症例９および１０から抽出したＲＮＡについてノーザンブロット分析を 実施し、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓが当該ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ遺伝子の上流にＨＩＶが 組み込まれた腫瘍組織で発現されるか否かを決定した。ノーザンブロットによっ て、腫瘍ｍＲＮＡからの３キロ塩基対（ｋｂ）のｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓメッセージ の存在が示され、一方、同じメッセージは非腫瘍ｍＲＮＡからは得られなかった 。この３ｋｂメッセージは、９２キロダルトン（ｋｄ）のチロシンキナーゼをコ ードするｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓｍＲＮＡのために適切な大きさである（結果は示さ ない）。ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓｍＲＮＡがＦｅｓ蛋白を生じるか否かを決定するた めに、単クローン性抗Ｆｅｓ抗体をＡＴＣＣ（ＨＢ８５９５）から得て、一連の 免疫組織化学実験で用いた。Ｆｅｓ蛋白は、混合免疫表現型マクロファージに富 むリンパ腫の１つに存在する腫瘍細胞でしばしば検出されたが、一方、それは小 胞性過形成ＨＩＶ感染リンパ節内では頻繁には検出されなかった。 クローン型ＨＩＶは、またＡＩＬＤ（前リンパ腫状態を示すと考えられる病的 過程）にも存在した。ＡＩＬＤのＧＨ検体によって、抗ｐ２４抗体はマクロファ ージの細胞質に局在することが組織学的に示されたが、小胞性樹状突起パターン にもまたある程度の染色性が存在した。抗ｐ２４（茶色）および抗ｆｅｓ（赤色 ）による組織の二色性免疫組織化学分析によって、ｐ２４（ＨＩＶ由来）およびｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ （ＨＩＶ組み込み部位の下流に位置することによって活性化 される）の両方を発現する二重着色（オレンジ色）細胞の存在が示された。マク ロファージを吸着によってＧＨ ＡＩＬＤの脾臓から分離し、抗Ｆｅｓおよび抗 ｐ２４で二重染色した。オレンジ色のマクロファージが観察されたが、このこと はＦｅｓとｐ２４はマクロファージに同時に存在することを示している。したが って、Ｔ細胞またはＢ細胞のクローン型はＧＨ ＡＩＬＤに存在しなかったが、 ＡＩＬＤ関与マクロファージについて細胞内で発現されるＨＩＶおよびｐ２４の クローン型の発見は、クローン型ＨＩＶはクローンマクロファージ様細胞に存在 することを示唆している。凍結検体が利用可能である、表Ｉで示した症例では、 濃染Ｆｅｓはｐ２４染色のようにマクロファージ様細胞にもっぱら関与していた 。しかしながら１例では、ｐ２４染色を伴わずＦｅｓが濃く染まっていたが、ｃ −ｆｅｓ／ｆｐｓ 遺伝子の近くに（ｆｕｒの３’ｚエクソンに）豊富なクローン ＨＩＶが組み込まれていた（症例１１）。したがって、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ発現 は、ＨＩＶ遺伝子発現がなくともＨＩＶによって影響を受けることが可能である 。サイトカインはマクロファージ関与リンパ腫に関与する サイトカインは通常リンパ球増殖に関与する。インターロイキン−６（ＩＬ− ６）は、種々の細胞タイプによって産生される多形質発現性サイトカインで、免 疫反応、急性期反応および造血を調節する（S．Akiraら、Immunol Rev．127:25- 50(1992)）。多くの細胞タイプ（単球／マクロファージ、線維芽細胞、内皮、Ｂ およびＴリンパ球、軟骨細胞、星状神経膠細胞およびケアチナサイト(keatinacy te)を含む）がＩＬ−６を産生することができる。ＩＬ−６は、標的細胞の性状 に応じて増殖誘発、増殖抑制または分化誘発活性を発揮することができる。リン パ球の刺激に関しては、ＩＬ−６は、１）抗体産生プラズマ細胞へのＢ細胞の最 終分化、２）ＩＬ−２およびＩＬ−２レセプター誘発とＴ細胞の分化に関与する ことが示され、さらに３）ミエローマおよびハイブリドーマ細胞の増殖を引き起 こすことが示された(C．Woodruffら、DNA and Cell Biology 11:587-592(1992)) 。ＩＬ−６は、ＩＬ−６レセプター発現細胞の悪性化を引き起こすかもしれない （N．Tohyamaら、J．Exp．Med．171:389(1990)）。ＩＬ−６産生マクロファージ および内皮細胞は、エイズ関与大型免疫芽細胞性リンパ腫の初代培養に存在する ことが示された(D．Emilieら、Blood 80:498-504(1992))が、ＨＩＶ組み込みま たはクローンマクロファージ増加との密接な関係は報告されなかった。サイトカインのインビトロ抑制はリンパ球増殖を阻害する ＩＬ−６およびＩＬ−１０の細胞増殖に対するインビトロの影響について大型 細胞性リンパ腫の悪性腹水をもつ３人の患者を調べた。腹水は高濃度のＩＬ−６ およびＩＬ−１０を含み、さらにこれらサイトカインに対する中和抗体はリンパ 腫細胞の増殖を阻害した。この観察は、リンパ腫形成をインビボで誘発するＩＬ −６およびＩＬ１０のようなサイトカインと矛盾しない。類リンパ腫（lymphoid tumors）に関与するクローンとして増加したマクロファージ集団の存在は、サ イトカインを分泌することによってマクロファージは二次的に周囲の非癌化細胞 の過剰増殖を誘発し、その結果、腫瘍発生を引き起こす。組み込みＨＩＶを含みサイトカインを発現している細胞の同定 組み込みクローンＨＩＶを含むリンパ腫の多くは混合免疫表現型リンパ腫（こ れはＢ細胞、Ｔ細胞および極めて多数のマクロファージを含む）であるので、ど の細胞タイプがクローン型ＨＩＶを含むかを決定することは重要である。上記表 Ｉで述べたように、ＨＩＶがクローンとして組み込まれていることが判明した多 数の疾患類を報告した。これらには、菌状息肉腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、全身性 Ｔ細胞リンパ腫、混合免疫表現型／多クローン性リンパ腫、ＡＩＬＤおよびホジ キン症が含まれる。同じ方法が、組み込み型のＨＩＶをもつことが判明した種々 の区分のリンパ腫の分析に有用で、この場合、細胞の亜集団は、例えば細胞の分 類または二重染色によって分析してクローンＨＩＶを含む細胞タイプを同定でき る。クローン性についての非ＨＩＶマクロファージのＲＦＬＰ分析 マクロファージに富む細胞増殖性疾患の組織がＨＩＶを欠くことが判明した事 例について、細胞集団（例えばマクロファージ集団）のクローン性を、先ず細胞 表面マーカーの反応性にしたがって亜集団に分類することによって上記のように 決定した。マクロファージまたは他の細胞の亜集団を当業者に周知のＲＦＬＰ分 析によってクローン性について調べた。本発明のＲＦＬＰ分析は、制限消化して ゲルで分離したＤＮＡを特定の哺乳類（好ましくはヒト）のゲノムＤＮＡ領域と ハイブリダイズする核酸プローブで調べることを含む。 対象となるゲノム領域には、細胞の悪性化と密接な関係を有する共通のウイル ス（例えばＨＩＶ）組み込み部位に接する領域（例えば細胞増殖の制御と密接に 関係する遺伝子（例えば腫瘍遺伝子）の近くの部位）が含まれるが、これに限ら れるものではない。クローンマクロファージ増加と密接に関係するＨＩＶ組み込 み部位であると本明細書で示したｆｕｒ遺伝子ｚエクソンは、本発明の診断法を 用いるＲＦＬＰ分析によってクローン性を決定するために核酸プローブをハイブ リダイズさせる遺伝子領域の例である。遺伝子の変異または再編成（リアレンジ メント）は特定の遺伝子（例えば腫瘍遺伝子）の異常な発現を惹起することが可 能であることは分子生物学分野で周知である。したがって、ＨＩＶまたは他のウ イルスの組み込みは、しばしば観察される組み込み部位に隣接する遺伝子の異常 発現のためには必要とされない。ＨＩＶ組み込みマクロファージを含むリンパ腫の治療 ＨＩＶ組み込みクローンマクロファージを含むヒト脾臓組織（症例１０の組織 ）をＳＣＩＤマウスに注射した。コントロールＳＣＩＤマウスには正常な（ＨＩ Ｖ非関与、非癌性）脾臓組織を注射した。コントロールおよび被験マウスにおけ る腫瘍の増殖をモニターした。ＨＩＶ関与腫瘍の増殖速度は、コントロールのそ れを凌いだ。 マクロファージ誘発癌性組織の増殖を抑制するマクロファージ標的細胞毒性剤 の能力を説明するために、下記の実施例を報告する。（上記のように）ＨＩＶ組 み込みマクロファージ誘発癌性組織をもつＳＣＩＤマウスをコントロールと被験 群とに分ける。被験群１に、細胞毒性剤が優先的にマクロファージに到達するよ うに製剤化した細胞毒性剤を本発明の方法によって（例えばリポゾーム被包化細 胞毒）投与する。コントロール群１には、被験群に投与したものと同一であるが 細胞毒を含まない製剤を投与する。被験群１の腫瘍増殖をコントロール群１の腫 瘍増殖と比較する。 非マクロファージ性腫瘍組織の補完的治療は、さらに腫瘍の増殖を抑制する。 被験群２には、上記に述べた製剤としてマクロファージ標的細胞毒性剤を投与す る。被験群２には、細胞増殖疾患組織（例えば癌性組織）に優先的に向かう第二 の細胞毒性剤を投与する。コントロール群２には、癌性組織に向かう第二の細胞 毒性剤のみを投与する。被験群２の腫瘍増殖をコントロールと同様被験群１とも 比較し、増殖誘発マクロファージの治療とともに周辺組織の補完的治療を実施す る場合の有効性を決定する。補完的治療を施した場合、クローンとして増加した マクロファージおよび周辺組織の両者の増殖抑制は腫瘍の大きさを一層減少させ る。リンパ腫発生の病理モデル 本発明の発見は、ＨＩＶ疾患でのリンパ腫の段階的成長においてＨＩＶは直接 的役割を果たすかもしれないということである。ＨＩＶ感染クローンマクロファ ージは、多クローン性リンパ腫および多クローン性ＡＩＬＤに高頻度で存在した が、この場合クローンＢまたはＴ細胞マーカーは観察されなかった。個別にクロ ーン性を測定したとき（すなわち、クローン型ＨＩＶのマッピングのためのＩＰ ＣＲ）、ＨＩＶはこれらの腫瘍タイプではしばしばクローン型として存在するこ とが判明した。調査した症例では、このクローンＨＩＶは腫瘍関与マクロファー ジ内に存在し、したがって典型的にはマクロファージによって分泌されるサイト カインを介してリンパ腫の多クローン性増殖およびＡＩＬＤの血管増殖に寄与す ることができることを本発明者らは示した。１３の別々の腫瘍のうち６個の共通 の組み込み部位によって、マクロファージ誘発腫瘍形成の過程におけるｃ−ｆｅ ｓ／ｆｐｓ の役割が示唆された。これら腫瘍内の細胞の少なくとも５％がクロー ン型ＨＩＶを含み、先に調査した症例（この場合は悪性Ｔ細胞にＨＩＶが存在し ていた）を除き、ＨＩＶを発現していることが判明した細胞のみがマクロファー ジ系列の細胞であった。したがって、クローン感染したマクロファージ様細胞の 緩徐な増加はリンパ腫形成の初期段階を示し、さらに類リンパ性成分のマクロフ ァージ分泌サイトカイン（例えばＩＬ−６）による刺激のために、それは多クロ ーン性続いて単クローン性のリンパ腫の発達をもたらすというモデルを本出願人 らは提唱する。 １つの組織タイプ（例えばマクロファージ）に分離されるクローン性は、初期 段階のマクロファージ誘発腫瘍形成の指標となる。増殖刺激が幾つかのクローン の成長をもたらすので、後期段階では他の細胞タイプのクローン集団を含む可能 性が高まる。 類リンパ性クローンリンパ腫の発達はまた、染色体の転座のような事象によっ て過剰増殖組織でも起こりうる。この場合、マクロファージクローン集団内の染 色体転座は、腫瘍遺伝子の発現、または周辺組織での腫瘍形成をもたらすサイト カインの過剰発現を引き起こす。 リード−スターンバーグ細胞がサイトカイン（例えばＩＬ−６）の発現を介し て正味の腫瘍発達に寄与していると考えられるホジキン症の病態発生は、ｃ−ｆ ｅｓ／ｆｐｓ が均一にエイズ非関与ホジキン症のリード−スターンバーグ細胞内 に発現している上記に述べたＨＩＶ含有クローンマクロファージ誘発リンパ腫と 一致する（L.H．Trumperら、Blood 81:3097-3115(1993)）。実験データ：材料と方法 ＩＰＣＲによるＨＩＶ−１のクローン的組み込みの検出 ＩＰＣＲ（逆ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて、ＨＩＶがクローン的に組み込 まれているＨＩＶ感染者由来のリンパ腫を同定した。 先に報告された標準的技術(T．Maniatisら、分子クローニング：実験室マニュ アル、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニュ ーヨーク(1982))によって新鮮組織または凍結組織からＤＮＡを抽出した。パラ フィン包埋固定組織由来のＤＮＡは、例えばエッペンドルフチューブにこの組織 の薄切片を入れ、キシレンでパラフィンを除去することによって調製できる。エ タノールで洗浄後、サンプルをプロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）および１ ％ＳＤＳでＴＥＮ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、４０ｎＭ ＥＤＴＡ、１ ０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中で５０℃で２４時間消化した。プロテイナーゼＫ およびＳＤＳの濃度を続いてそれぞれ１ｍｇ／ｍｌおよび１％に調整し、さらに ２４時間保温を継続した。フェノールおよびクロロホルム：イソアミルアルコー ル抽出に続いて、酢酸ナトリウムとエタノールでＤＮＡを沈澱させ乾燥させた。 ＩＰＣＲは、上記のようなまたは当業者に周知の同等な技術によって新鮮、凍 結および固定組織から分離したＤＮＡについて実施した。この方法はシラミズら （B．Shiramizuら、上掲書(1994)）の記載にしたがって実施した。ＤＮＡ（０． １μｇ）をＳａｕ３Ａ（または他の通常の切断物質）で消化し、２００μｌの反 応物（１×リガーゼ緩衝液(NEB、ビバリー、マサチューセッツ)、４０ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ(NEB)）中で３６時間１５℃で連結した。ＤＮＡ濃度は環を形成 させるためにＤＮＡフラグメントの自己連結に適したものである。反応物をエタ ノール沈澱で精製し、続いてＩＰＣＲ（図１）（１００ｐｍｏｌのプライマー（ ＣＷ１ＢおよびＣＷ２Ｈ、図１）、１μｌの連結生成物、１×Ｔａｑ１ＤＮＡポ リメラーゼ緩衝液、２０ｎＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａｑ１ＤＮＡポリメラー ゼ(Promega Biotech、マジソン、ウィスコンシン)をシータス−パーキンエルマ ー・サーモサイクラー(Cetus-Perkin Elmer thermocycler，Cetus-Chiron製、エ メリービル、カリフォルニア)中で実施した。条件は、メルティング（溶融）が ９４℃で１．５分、アニーリングが５０℃で１．５分、鎖伸長が７２℃で３分、 合計６０サイクルであった。増幅生成物をエチジウム染色ゲル（１−２％アガロ ース／１．−２％ヌシーブ(NuSieve)ゲル、FMC Bioproducts製、ロックランド、 メーン）で分離した。増幅生成物を確認するために、アガロースゲルのＤＮＡを ナイロン膜に移し、標準的手法によるハイブリダイゼーションに供した(T．Mani atisら、上掲書(1982))。ハイブリダイゼーションに用いる核酸プローブは、 ＬＴＲＰ、Ｆｕｒ１およびＦｕｒ２であった（図１）。プローブをジゴキシゲニ ンで標識し、化学発光で（ベーリンガー−マンハイム、ドイツ）で検出するか、 または他の標準的な技術（例えば放射能標識、ビオチン化、蛍光標識）で標識し た。 クローンＨＩＶを含む細胞を同定するために、上記のように細胞集団を分類し 、各細胞タイプから分離したＤＮＡをＩＰＣＲで分析する。また別には、混合細 胞集団から分離したＤＮＡをＩＰＣＲで分析し、続いて二重染色を実施し特定の 細胞タイプでＨＩＶ生成物（例えばｐ２４）の位置を調べる。in situハイブリ ダイゼーションもまた、特定配列（例えばＨＩＶ）の存在場所の決定のためには （この場合、組み込まれたＨＩＶ配列は不活化されており、識別可能な蛋白を産 生しない）当分野で標準的である。抗ＣＤ１４抗体および抗ｐ２４抗体による二 重染色は、ＨＩＶを含有するマクロファージとして二重に染色された細胞を同定 するであろう。抗体染色は当分野で周知である。染色に用いられる抗体は、予め 標識（検出可能なマーカーに共有結合される）されていてもよく、また（識別可 能な）蛋白に結合させた後標識してもよい（例えば当分野で周知のビオチン−Ｉ ｇＧ／ストレプトアビジン系）。先に決定したＨＩＶ配列のクローン性は、抗ｐ ２４染色マクロファージは、癌性組織と密接に関係するマクロファージのクロー ンとして増加した集団のものであることを示唆する。フローサイトメトリーによる細胞分離 下記の方法は、いずれの細胞増殖性疾患組織、例えば腎、アテローム硬化症組 織、ＡＤＣ患者の脳組織またはリンパ腫にも応用できる。非マクロファージ性疾 患組織からマクロファージを分離する方法の例として、以下の方法を説明する。 新らしくリンパ腫と診断された、または凍結保存リンパ腫から、スチールメッ シュスクリーンに新鮮なリンパ腫組織を押しつけることによって単一細胞懸濁物 を調製する。ＩＰＣＲによりリンパ腫が単クローン性ＨＩＶを含む場合は、単一 細胞懸濁物は先に報告されたように単クローン性抗体で染色されるであろう(T.J ．Mercolinoら、発達時および疾患時のＣＤ５ Ｂ細胞(CD5B cells in developm ent and disease)、L．Herzenberg，K．Rawjesky & G．Haughton編、New York Academy of Science刊、(1992)409-421)。有用な抗体には以下が含まれる：抗Ｃ Ｄ１４（マクロファージを同定する）、抗ＣＤ４（マクロファージ同様ＣＤ４Ｔ 細胞を同定する）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０（Ｂ細胞を同定する）、抗ＣＤ３０（ Ｋｉ−１）、および抗ＣＤ１５（リード−スターンバーグ細胞を同定する）。細 胞は、ＦＡＣＳバンタージ(Vantage)細胞分類装置または、ＨＩＶ感染検体から 生きた細胞懸濁物の分類が可能な生物性危険物の封じ込め区画を備えた同等な装 置を用いて分類される。マクロファージは、最初にマクロファージ特異的細胞表 面抗体（例えば標識抗ＣＤ１４）を付加し、続いて細胞を分類しさらに抗ＣＤ１ ４付加細胞を採集することによって、混合集団中の他の細胞から個々に分類され る。この分類細胞検体を上記に述べたようにＩＰＣＲに付す。分類細胞の細胞遠 心調製物を標準的技術で抗ＨＩＶｐ２４抗体で染色し、クローン的に組み込まれ たＨＩＶを含む細胞はまたＨＩＶ構造決定基を含むか否かを調べる。分類された 細胞集団は、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）の実施にもまた 有用で、各細胞集団によって発現される一連のサイトカインを決定できる。 また別に、マクロファージは、ガラスまたはプラスチック（例えばガラスもし くはプラスチックビーズまたはガラスもしくはプラスチック容器の側面）への吸 着によって混合集団中の他の細胞タイプから分離することができる。非吸着性細 胞は除去され、必要に応じて別の分析に使用するために保持される。二重染色免疫細胞化学 当分野で周知の標準的な免疫ペルオキシダーゼプロトコルをわずかに改変して 二重抗体検出のために用いた(B.G．Herndierら、AIDS 8:575-581(1994))。ｐ２ ４抗体（DAKO、カーピンテリア、カリフォルニア）をＨＩＶ存在場所決定に用い た。ｃ−ｆｅｓ抗体は、アメリカ菌培養保存所から入手したハイブリドーマ培養 （ＨＢ８５９５）から調製した（ガイザースバーグ、メリーランド）。ｃ−ｓｉ ｓ 発現を検査する場合は、抗ｃ−ｓｉｓ抗体またはＰＤＧＦ−Ｂに対する抗体は 市販源から入手できる。 以下の技術は、クローンマクロファージを含むと思われるいずれの組織にも利 用できる。二重染色技法は、例としてＨＩＶおよびｃ−ｆｅｓ発現の検出に用い られる。 固定組織のスライドは弁別エタノールで水和させ、最後に蒸留水で洗浄する。 その後、スライドを燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％カゼインで３０分ブ ロックし緩衝性を付与する。ｐ２４抗体をスライド上で１時間室温で培養した。 続いてこのスライドをカゼイン−ＰＢＳで５分間洗浄した。さらにこのスライド をビオチン共役抗マウスＩｇＧとともに３０分室温で培養した。スライドをカゼ イン−ＰＢＳで５分洗浄し、続いてジアミノベンジジン培養を７−１０分実施し た。蒸留水で洗浄後５分間０．５％ＣｕＳＯ₄と培養し、さらに水で２分洗浄し た。続いてスライドを１ＮのＨＣｌで１０分培養し、その後水で洗浄し、さらに カゼイン−ＰＢＳで１５分培養した。続いてスライドを抗ｆｅｓまたは抗ｐ２４ 抗体とともに１時間室温で培養し、その後カゼイン−ＰＢＳで洗浄した。さらに このスライドをビオチン共役ＩｇＧ（ウマで作製した抗マウスＩｇＧ、BioGenex 製、サンラモン、カリフォルニア）とともに室温で３０分培養した。カゼイン− ＰＢＳで５分間洗浄してから、スライドをアルカリホスファターゼ共役ストレプ トアビジン（BioGenex）とともに室温で３０分培養した。カゼイン−ＰＢＳで５ 分間洗浄した後、ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（Vector Lab製）とともに１０−１５分培養し、水で２分間洗浄し、さらにヘマトキシリ ンで１分間対比染色を施した。スライドを水で１分洗浄し、続いて希釈アンモニ ア水で洗浄し、さらに弁別エタノールおよびキシレンの洗浄を実施した。この方 法は、またｐ２４染色にも有用である。抗体を検出する手段は当分野で周知であ る。上記の工程は具体例を提供するものである。ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ発現細胞の同定 ＨＩＶがｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓの上流にクローン的に組み込まれていることが判 明した腫瘍内でｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓを発現している細胞を同定するために、二色 免疫蛍光実験を固定し透過性にした細胞について上記に説明したように実施した 。上記の細胞タイプ同定用抗体を最初の免疫染色に用い、続いてオルトパーマフ ィクス(Ortho Permafix，Ortho Pharmaceuticals製、ラリタン、ニュージャージ ー)（または同等物）を用いて固定し透過性を付与した。該薬剤は、細胞内Ｆｅ ｓ蛋白の抗ｆｅｓ腫瘍遺伝子抗体（ＡＴＣＣＨＢ８５９５）による染色を可能に するであろう。正常なマクロファージで少量のＦｅｓが発現されるので、これら 二色実験を腫瘍組織とともにコントロールリンパ節組織で実施する。正常なマク ロファージはＦｅｓの活性型を発現しないので、Ｆｅｓ特異的ウサギ抗血清の活 性型もまた有用な染色として標準的技法で調製できる。第一段階の抗体は、直接 ＦＩＴＣに共役させ、一方、第二の抗ｆｅｓ抗体はフィコエルスリン標識第二段 階抗体を有する。 他の腫瘍遺伝子（例えばＰＤＧＦ−Ｂ）の発現は同じ方法で検出される。抗Ｐ ＤＧＦ−Ｂ抗体は市販源から入手可能である。サイトカインと細胞増殖遺伝子の発現 サイトカインおよび細胞増殖遺伝子発現を以下の標準的技法でモニターした。 分類した細胞集団から細胞性ＲＮＡを先に報告(P．Chomzynsky & N．Sacchi，An al．Biochem．162:145(1987))されたように抽出する。モロニー白血病ウイルス 逆転写酵素を用いて細胞性ＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを得る。既知のサイトカイ ンのｃＤＮＡとハイブリダイズするようにデザインしたサイトカインプライマー を用いるＲＴ−ＰＣＲを先の報告（L.H．Trumperら、上掲書(1993); Ca Brenner ら、Biotechniques，7:106(1989)）にしたがってｃＤＮＡについて実施する。有 用なプライマーには、インターロイキン１−１３、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ腫瘍遺伝 子、ｃ−ｓｉｓ（ＰＤＧＦ−Ｂ）腫瘍遺伝子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＮ Ｆ−α（腫瘍壊死因子−α）およびＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー 刺激因子）のためのプライマーが含まれるが、これらに限られるものではない。 プライマーは、関連する遺伝子の配列が知られており、さらに合成技術も日常的 であるので、当業者は容易にデザインし合成することができる。エイズ脳症群（ＡＤＣ）におけるマクロファージの関与 エイズ脳症群は、免疫抑制進行患者でもっぱら生じる重篤なＨＩＶ疾患の合併 症である。臨床的には、ＡＤＣの患者は著しい記憶の変化を示し、日々の役割を 果たすことができない。中枢神経系の重度の阻害があり、知性的なプロセスが鈍 化し最終的には昏睡と死に到る。病理学的には、エイズ脳症患者の脳は、部分的 に１）神経膠症（星状神経膠細胞の過剰増殖）、２）ニューロン消失および３） 多核巨細胞と小グリア細胞結節の発達を特徴とする。エイズ脳症患者の脳組織の 主要な特徴は、ＨＩＶ発現マクロファージの存在である(B.A．Watkinsら、Scie nce 249:549-583(1990))。痴呆の重篤度が高くなるにつれ脳組織内の感染マクロ ファージの頻度が高まる(S．Koenigら、Science 233:1089-1093(1986))。 増殖因子は、限定された標的細胞集団を刺激するポリペプチドホルモンである 。増殖因子の例には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様増殖因 子（ＩＧＦ−１およびＩＩ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮性 増殖因子（ＥＧＦ）おび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が含まれる。ＰＤＧＦは 、循環血小板の顆粒中に見出される陽イオン性、熱可溶性蛋白で、インビトロで 線維芽細胞による蛋白合成、コラーゲン産生を刺激し、さらに細胞増殖を刺激す ることが知られている。 それはまた、インビトロで有糸分裂促進剤として、さらに線維芽細胞、平滑筋 細胞、グリア細胞および星状神経膠細胞に対する化学走性剤として作用すること が知られている。 エイズ脳症患者の脳内のＨＩＶ感染マクロファージはクローンであることをこ こで示す。ＨＩＶ感染による脳内のクローンマクロファージの増殖は、神経膠症 をもたらす星状神経膠細胞増殖と密接な関係をもつことが提唱される。結果とし て、マクロファージ増殖の治療はＡＤＣ治療計画の標的である。 エイズ脳症の数人の患者の脳およびエイズ脳症の患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）か ら分離した一連のＤＮＡ検体について、ＨＩＶ ＬＴＲプライマーを用いる逆Ｐ ＣＲを実施した。ＨＩＶ ＬＴＲプライマーは標準的オリゴヌクレオチド合成に よって調製した。各プライマーの配列およびその長さは既知のＨＩＶ ＬＴＲ配 列から選択した（B．Shiramizuら、Cancer Res．54:2069-2072(1994)）。ＩＰＣ Ｒのプライマー配列（配列番号：１および配列番号：２）をこの例として用いた 。単クローン逆ＰＣＲ生成物がＣＳＦ検体を含む４検体で同定された。ＣＳＦ検 体由来ＩＰＣＲ生成物の配列を標準的技法で決定した。ＨＩＶ組み込み部位は、 図３に示すように、血小板由来増殖因子Ｂ遺伝子（ＰＤＧＦ−Ｂ）上にマッピン グされた。ウイルスＬＴＲ配列はヒトｃ−ｓｉｓ遺伝子（ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子） に挿入されていることが示された。 ２つの脳検体は、ｖ−ｓｉｓプローブ(Oncor製、ガイザースバーグ、メリーラ ンド)を用いたサザン分析により脳内にＲＦＬＰで同定されたＰＤＧＦ−Ｂ遺伝 子アレンジメントを有することが示された。この結果は、ＨＩＶ付随神経疾患を もつ患者から得られた脳および脳脊髄液に由来する少なくとも３検体のマクロフ ァージにおけるＰＤＧＦ−Ｂ関与を示唆している。 ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子（ｃ−ｓｉｓ）内のＨＩＶ組み込みは、持続的な星状神経 膠細胞の増殖および神経膠症と密接な関係を有する。これは、ＨＩＶ ＬＴＲエ ンハンサー成分がマクロファージＰＤＧＦ−Ｂの発現を高めることによって生じ るかもしれない。エイズ脳症はしたがって、星状神経膠細胞のための増殖因子を 本質的に産生するクローンマクロファージを伴う一次的過程で、これは、続いて ＡＤＣの症状の原因となる脳の二次的損傷を引き起こすであろう。したがって、 ＨＩＶ関与ＡＤＣが一次的脳損傷により発生し神経膠症をもたらすというよりは むしろ、クローンマクロファージが二次的な脳損傷を引き起こす神経膠症を惹起 する可能性がある。エイズ脳症におけるクローンマクロファージの関与の診断 脳脊髄液をエイズ脳症の症状を呈している患者から入手する。ＣＳＦからマク ロファージを分離し、ＩＰＣＲ、ＲＦＬＰまたは上掲書に記載された同様な方法 によってクローン性を調べた。クローン性によってマクロファージの増殖がこの 疾患に必要であることが示唆された。治療は、クローンマクロファージの脳から の実質的排除を目的とする。クローンマクロファージを排除する方法として、上 記の治療はエイズ脳症の治療として有用である。しかしながら、マクロファージ 細胞毒性剤は、神経膠症を誘発する脳内のマクロファージに到達させるために血 液脳関門を通過するものが選択される。増殖性疾患におけるマクロファージ関与の診断 循環血液マクロファージをクローンＨＩＶの存在について調べ、細胞増殖性疾 患が進行するおそれがある患者を予見する。マクロファージは血液から分離され る。ＤＮＡを本明細書で詳述するようにＩＰＣＲにより分析する。ＨＩＶのクロ ーン性を明らかにすることによって、患者がマクロファージ内にＨＩＶ挿入を有 し、このようなマクロファージはクローンとして増殖することが示唆される。患 者は、増殖マクロファージが侵入する組織内で細胞増殖性疾患を進行させるおそ れがあると考えられる。実質的に増殖マクロファージの数を減少させる細胞毒性 剤の投与は、細胞増殖性疾患の進行を予防またはその蓋然性を減少させるために 有用である。レトロウイルス誘発腎疾患におけるマクロファージの関与 ＨＩＶ誘発腎症は、エイズ患者に一般的な症状でＨＩＶ感染患者の１０−３３ ％が罹患している(N.D．Vaziriら、J．Nat．Med．Assoc．77:369-375(1985); T. K.S．Raoら、N．Engl．J．Med．310:669-673(1984); V．Pardoら、Ann．Int．Me d．101:429-434(1984); J.J．Bourgoignie Kidney int．37:1571-1584(1990))。 続発性新形成のモデルは、下記の観察を斟酌するときレトロウイルス誘発腎疾患 に応用できる。 糸球体間質細胞は、腎糸球体に関与する特殊化された細胞でマクロファージお よび収縮細胞の特性をもつ。糸球体における糸球体間質の増殖は、エイズ患者で 認められる最も普遍的な腎病巣である。 該病巣は腎症に関与し（T.K.S．Raoら、上掲書(1984)）、検死解剖でしばしば 認められる（V．Pardoら、上掲書(1984)）。糸球体間質の増殖は、内皮基底膜の 上皮性損傷に対する反応と通常考えられる。しかしながら、本明細書では糸球体 間質の増殖は、該病巣部のマクロファージの増殖に関与すると提唱される。増殖 マクロファージは、サイトカイン（例えばＩＬ−１，ＩＬ−６、ＴＧＦ−βおよ びＰＤＧＦ）を通じて相互連絡していると仮定された。これらのマクロファージ は、細胞増殖（ウイルス感染マクロファージの増殖）−これは順をおって該クロ ーンマクロファージが浸潤した糸球体間質細胞集団の増殖を誘発する−を指令す る遺伝子内または該遺伝子の近くの部位におけるウイルスの組み込みの結果とし てクローン増殖していると本明細書では提唱される。 ＨＩＶ疾患における最も一般的な腎不全の原因は、巣状分節状糸球体硬化症（ ＦＳＧＳ；T.K.S．Raoら、上掲書(1984)）に関与する腎症症候群である。ＦＳＧ Ｓの病理発生は複合的であるが、びまん性糸球体間質増殖を含む(W.G．Couser & R.J．Johnson，Am．J．Kidney Dis．23:193-198(1994))。ＦＳＧＳは糸球体構 造の部分的硬化症を特徴とし、これは上皮の増殖により始まり基質の蓄積がこれ に続くようである。 二次的なＦＳＧＳ（ＨＩＶ感染に付随しない）は、高血圧によってもたらされ る毛細管圧の増加による糸球体の損傷を伴う。二次的ＦＳＧＳの病巣は硬化性で 間葉細胞増殖を伴う(J．Floegeら、J．Clin．Investigation 92:2952-2962(1993 ))。サイトカイン（例えばＰＤＧＦおよびＴＧＦ−β）の発現は、糸球体毛細管 圧の増加によって変化すると言われている(S.J．Shanklandら、Circ．Res．75:8 44-853(1994))。輸液実験によって、ＰＤＧＦおよびｂＦＧＦは、糸球体間質の 増殖を誘発し、さらに糸球体において基質の蓄積を誘発できることが示された(J ．Floegeら、Am．J．Path．142:637-650(1993))。ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦ− Ｂ遺伝子のインビボ核酸導入は、基質の蓄積と糸球体間質の増殖をもたらした(Y ．Isakaら、J．Clin．Investigation 92:2597-2601(1993))。 クローンマクロファージにおけるＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子内へのＨＩＶ挿入（これ は結果として細胞増殖に関与する）の関与性に関する本明細書に開示した発見は 、ＦＳＧＳにおけるＨＩＶ関与のメカニズムを提供する。連続的病理発生は、糸 球体間質細胞の最初の増殖（新形成）を必要とし、そしてこれは、可能なＰＤＧ Ｆ源としてその後の間質細胞（例えば上皮細胞および線維芽細胞）の増殖を誘発 するかもしれない。腎疾患におけるクローンマクロファージの関与の診断は、疾 患の早期発見のみならず、増殖発信源（変質したサイトカイン産生マクロファー ジおよび糸球体間質細胞）を根絶するために実施される治療方法の開発を提供す る。クローンマクロファージ誘発糸球体間質増殖の診断 ネフローゼのような腎疾患（尿中蛋白）をもつと考えられる患者または腎不全 （ＢＵＮおよびクレアチンレベルの上昇）は、しばしば病理診断のために生検を 必要とする。この組織をＩＰＣＲ技法によってＨＩＶ組み込みについて調べる。 クローンＨＩＶ組み込みの細胞内分布は、組織を細胞性成分に解離させ、マクロ ファージを単離する組織の分離（人力または酵素的手法で）によって達成される 。分離マクロファージのＤＮＡを続いて上記のようにＩＰＣＲによって分析し、 マクロファージにおけるＨＩＶのクローン性を確認することができる。腎疾患に 付随する一定のＨＩＶ組み込み部位の発見は、増殖マクロファージはこの疾患と 密接な関係を有することを示唆する。クローンマクロファージの存在は、該患者 の異常なマクロファージ増殖および細胞増殖性疾患における関与を示唆する。 患者がＨＩＶに感染していることが分かっているかまたは疑いがある場合、そ のＤＮＡはさらにＨＩＶ ＬＴＲプライマーを用いるＩＰＣＲで分析し、隣接す るゲノム配列を増幅させる。隣接配列は、その後の配列分析またはサザン分析た めにベクターでクローニングされ、ＨＩＶが組み込まれている領域が同定される 。アテローム硬化症におけるクローンマクロファージの関与 レトロウイルス挿入性突然変異によって強化されたマクロファージ増殖は、ア テローム硬化症進行に役割を果たす、ということを本明細書で開示する。 アテローム硬化症プラークの形成は、血管内皮、内皮平滑筋細胞、内皮マクロ ファージおよび血清脂質との間の複雑な相互作用である。アテローム硬化症研究 によって、血清脂質動態の理解が強調された。幾人かの研究者はアテローム硬化 症プラークにおける細胞増殖と回復に集中した。アテローム硬化症をもたらす突 然変異は、ウイルスの挿入、非レトロウイルスの組み込み、またはサイトカイン の発現を変化させる他のいずれかの形態を含むかもしれない。その結果は、他の 細胞タイプ増殖の誘発および観察されたような増殖性疾患をもたらすクローンマ クロファージの増殖である。 マクロファージはアテローム硬化症プラークの構成成分である。プラークのマ クロファージ数は、循環単球の流入とマクロファージのin situ増殖に依存する( L.G．Spagnoliら、Atherosclerosis 88:87-92(1991))。アテローム硬化症のクロ ーン説は、血管壁の最内部における平滑筋細胞クローンの増殖に光を当てた(M． Akikawaら、Circ．Res．73:1000-1012(1993))。しかしながら、脂肪給餌ウサギ 実験系(M.E．Rosenfeld & R．Ross，Artherosclerosis 10:680-687(1990))およ びヒトのプラークの細胞サイクル分析(D．Gordonら、PNAS，USA 87:4600-4604(1 990))では、in situマクロファージ増殖は平滑筋増殖ほど頻度は高くないとして も共通点を有することが明らかである。 ＰＤＧＦはアテローム硬化症の病理発生の中心となるサイトカインである。ア テローム硬化症のプラーク形成時に血小板が付着し、下層内皮を損傷しアテロー ム硬化症に付随する症状の重要な事象をもたらす。付着血小板は外因性ＰＤＧＦ 源となり、一方、機械的因子（例えば剪断応力）(A.V．Sterpettiら、Eur．J． Vascul．Surgery 8:138-142(1994))および冠状痙攣(H．Ogawaら、4:437-442(199 3))は最内部の関与細胞からＰＤＦＧを遊離させることができる。 ヒトのアテローム硬化症病巣では、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−ＢのｍＲＮ Ａおよび蛋白が内皮細胞、平滑筋細胞およびマクロファージで発現される（T.B ．Barrett & E.P．Benditt，PNAS,USA 85:2810-2814(1988)）。ＰＤＧＦ−Ｂの 発現はマクロファージに局在し、ＰＤＧＦ−Ａの発現は、平滑筋アクチン発現細 胞に局在していた（T.B.Barrett & E.P．Benditt，上掲書(1988)）。 変異マクロファージの増殖に影響を与える突然変異誘発（例えばＰＤＧＦ−Ｂ 遺伝子へのレトロウイルス挿入性突然変異誘発を含む）は、アテローム硬化症に おけるクローンマクロファージの関与の診断のためのインジケーターとして用い ることができる。マクロファージはアテローム硬化症病巣部位に補充され、高コ レステロール血症または剪断応力に付随して血小板のような産生源に由来するＰ ＤＧＦによって増殖が誘発される。マクロファージ増殖の誘発因子としてのＰＤ ＧＦ−Ｂ遺伝子内またはその近くへのＨＩＶの挿入という本明細書で開示する発 見は、突然変異誘発（例えばレトロウイルス挿入突然変異誘発）によって、例え ばＰＤＧＦ−Ｂのような細胞増殖因子の突然変異誘発によってマクロファージが クローン状態（新生物形成状態）で維持されることを示唆している。サイトカイン遺伝子の突然変異誘発の診断とアテローム硬化症のクローン性 ＨＩＶ付随またはＨＩＶ非付随アテローム硬化症におけるクローンマクロファ ージの関与を示唆する遺伝的変化の診断は、以下の工程で実施される。標準的技 術、例えばフローサイトメトリーまたは表面（例えばガラスもしくはプラスチッ ク表面）への吸着によって、アテローム硬化症患者の血液からマクロファージを 分離する。マクロファージＤＮＡをサザン分析を実施してクローン性を決定し、 さらにＲＦＬＰ分析を実施して、可能な挿入突然変異誘発またはｃ−ｓｉｓ（Ｐ ＤＧＦ−Ｂ）遺伝子領域における遺伝的再編成（リアレンジメント）を決定する 。挿入突然変異によるＨＩＶの特異的関与は、先に詳述したようにＬＴＲプライ マーを用いてＩＰＣＲによって決定される。この分析はまた、その生成物がマク ロファージ増殖を誘発すると思われるいずれのサイトカイン遺伝子にも応用でき る。 マクロファージにおけるＨＩＶ挿入のクローン性は、アテローム硬化症に罹患 し心臓発作で死亡したエイズ患者のアテローム硬化症プラークを調べることによ って見出された。患者のアテローム硬化症プラーク、脾臓および腎臓の組織を分 離し、ＩＰＣＲプライマーＣＷ１Ｂ（配列番号：１）およびＣＷ２Ｈ（配列番号 ：２）を用いてＩＰＣＲによってＨＩＶの挿入とクローン性についてそのＤＮＡ を調べた。ＨＩＶクローン性は、ＨＩＶＬＴＲでハイブリダイズするプライマー によって増幅される２つのＤＮＡバンドとして観察される（図１参照）。ＩＰＣ Ｒ分析は、アテローム硬化症プラーク組織についてのみ２つの増幅ＤＮＡバンド を示したが、これはクローンＨＩＶが該組織に存在することを示唆している。脾 臓および腎臓サンプルについてはバンドは観察されなかった。続いて同じ組織サ ンプルからマクロファージを分離しＩＰＣＲによってそのＤＮＡを調べたところ 同じ結果が得られた。すなわち、アテローム硬化症プラーク由来のマクロファー ジのみがクローンＨＩＶを含んでいた。 この患者の脾臓または腎臓には細胞増殖性疾患の徴候はなく、さらにＩＰＣＲ の結果は、これら組織ではクローンＨＩＶの挿入は検出不能であることを示して いる。したがって、本明細書のＩＰＣＲ分析によって、例えばアテローム硬化症 のような細胞増殖疾患はＨＩＶクローン性と密接に関係することが示唆される。 ＨＩＶのＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子への挿入は、アテローム硬化症プラーク組織のマ クロファージから得たＤＮＡのＲＦＬＰ分析によって決定した。ヒトＰＤＧＦ− Ｂ遺伝子内の配列とハイブリダイズするｖ−ｃｉｓプローブ(Oncor製、ゲイザー スバーグ、メリーランド)を用いて、ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子が再編成（リアレンジ メント）されていることが認められた。したがって、ＩＰＣＲによって明らかに されるＨＩＶ挿入は、ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子の再編成（リアレンジメント）と密接 に関係することが示唆される。ＨＩＶクローン性は、増殖促進因子、ＰＤＧＦ− Ｂの遺伝子にＨＩＶが挿入されたマクロファージが増加した結果である。 さらに、アテローム硬化症プラーク組織をＰＣＮＡ（活発に合成活動を行って いるＤＮＡと相互作用することによって分裂細胞だけを染色する化合物）で染色 した。そのような組織学的染色によってマクロファージが染色され、したがって マクロファージは該組織が得られた時点でプラーク組織内で活発に分裂していた ことが示唆された。再編成（リアレンジメント）されたＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子をも つ増殖マクロファージは、細胞増殖性疾患、アテローム硬化症に密接に関係する ことをここで示す。この症例のＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子の再編成（リアレンジメント ）はＨＩＶ挿入による。 アテローム硬化症患者のマクロファージクローン性の開示は、内皮の増殖とそ の結果としてのプラーク形成の誘発因子としてのマクロファージを示唆する。そ のような診断は、アテローム硬化症治療の標的としてマクロファージを選択する 場合に有用である。クローンマクロファージと密接に関係する細胞増殖疾患の治療 マクロファージに対する治療をここで述べる。そのような治療にはリポゾーム による細胞毒性剤のマクロファージへの送達を含むが、これに限られるものでは ない。通常リポゾームは食細胞（例えばマクロファージ）に摂取される。細胞毒 性剤含有リポゾームの貧食時に細胞毒素（例えばジクロロメチレン−ビスホスホ ネート）が細胞内に遊離し、貧食マクロファージを死滅させる(N．Van Rooijen & A．Sanders，上掲書(1994))。 治療はまたＰＤＧＦおよびＰＤＧＦの細胞源にも向けられる。ＰＤＧＦ機能に 影響を与える因子は種々の研究者らによって調べられている。(例えば、「ＰＤ ＧＦ／ＰＤＧＦＲ相互作用抑制因子、２−ブロモメチル−５−クロロベンゼンス ルホニルフタルイミド」（D.E．Mullinsら、Arteriosclerosis and Thrombosis 14:1047-1055(1994)；「トロンビン誘発ＰＤＧＦ−Ａ発現の糖質コルチコイド抑 制」(T．Nakanoら、J．Biol．Chem．268:22941-22947(1993)；「トロンビン誘発 ＰＤＧＦ発現の３−デアザアデノシン抑制（R．Shankerら、J．Biol．Chem．267 :9376-9382(1992)；「アセチルサリチル酸はＰＤＧＦの遊離を抑制する」（H．V issingerら、Angiology 44:633-638(1993)；「食餌中のオメガ−３脂肪酸はＰＤ ＧＦｍＲＮＡを低下させる」(W.E．Kaminskiら、Blood 81:1871-1879(1993)；「 抗ＰＤＧＦ抗体は新生最内部平滑筋蓄積を抑制する」（G.A．Fernsら、Science 253:1132(1991)；「チロホスチンはＰＤＧＦ誘発ＤＮＡ合成を抑制する」（G.E. Bilderら、Am．J．Physiology 260:C721-730(1991)）。ＰＤＧＦを標的とする治 療分野の活発さは、アテローム硬化症におけるＰＤＧＦの重要性を証明している 。したがって、マクロファージクローン性および細胞増殖をもたらすＰＤＧＦ変 異の診断は、医師が患者（特にアテローム硬化症の初期段階の患者）を適切に治 療するために有用な情報を提供する。 ここではマクロファージ誘発細胞増殖性疾患の診断用キットが開示される。本 発明のキットは、細胞増殖性疾患の組織から分離されたマクロファージのＤＮＡ を調べることによって、クローンマクロファージの関与を診断するために有用で ある。単クローン性ＤＮＡが５％より多くマクロファージから得られるＤＮＡに 含まれるときクローン性が決定される。本発明のキットは、ＨＩＶ含有細胞（例 えばマクロファージ）のＤＮＡを増幅する核酸プライマーを特徴とする。ＨＩＶ 含有ＤＮＡの増幅用核酸プライマーは、５’および／または３’の大末端繰り返 し（ＬＴＲ）の領域と、ＤＮＡ合成がＩＰＣＲ分析のために反対方向に開始され るような形で優先的にハイブリダイズする。キットに含まれるものは、クローン 性についてのゲノムＤＮＡのＲＦＬＰ分析用の１つまたは２つ以上の標識（例え ば放射性標識、ビオチン付加、または他の標準的標識）プローブである。この場 合ＨＩＶ配列のプライミングは所望されない（例えばＨＩＶ非関連細胞増殖性疾 患）。そのようなプローブは、細胞増殖をもたらすウイルス組み込みの共通部位 である遺伝子座とハイブリダイズする。典型的な遺伝子座には、ｃ−ｆｅｓ／ｆ ｐｓ 、ｃ−ｓｉｓおよび他の細胞増殖制御遺伝子が含まれるが、これらに限られ るものではない。用途 本発明は、細胞増殖性疾患組織（例えば前癌もしくは癌組織、リンパ腫、エイ ズ脳症患者の脳、アテローム硬化症組織、腎糸球体）でクローンとして増加した マクロファージの早期検出および診断のために用いられる。マクロファージのク ローン性は、クローンマクロファージによって誘発される細胞増殖性疾患の初期 段階を示す。なぜならば、後期段階では同様に周辺組織のクローン集団も含むか らである。したがって、本発明の診断方法およびキットは、与えられた細胞増殖 性病巣または腫瘍のＨＩＶ関与の診断、周辺組織の増殖を誘発するクローンとし て増加したマクロファージの関与の診断、患者の疾患の判定の助けとなる腫瘍の 増殖ステージの表示および、表示があればまた別の治療に従うことができるよう な細胞増殖性疾患組織の性状についての情報の提供に有用である。 本発明の治療方法は、本発明の診断方法によって細胞増殖性病巣と密接に関係 があると決定された増殖刺激マクロファージを標的とするために有用である。細 胞増殖性病巣に付随するサイトカイン産生マクロファージを抑制または除去する ことによって、周辺組織の増殖は実質的に阻害される。本発明の治療方法は、混 合免疫表現型リンパ腫、エイズ脳症、アテローム硬化症、腎症または他の細胞増 殖性疾患組織の完全治療をもたらす、増殖を誘発された周辺組織だけでなくマク ロファージの補完的治療をさらに提供することによって役立つ。 本発明は、二次的な細胞の増殖を誘発する１つの細胞タイプ（例えばマクロフ ァージまたは小胞性樹状突起細胞）の一次的クローン増加に密接に関係する幾つ かの疾患の診断および治療に有用である。本発明による診断および治療が可能な 疾患は表ＩＩの縦の欄１に記載するが、これらに限られるものではない。最初に （増加をもたらすＨＩＶ挿入または遺伝的変化を介して）増加し、さらに他の細 胞の増殖を誘発する細胞タイプ（一次細胞）は縦の欄２に提示する。誘発シグナ ルに反応し増殖する細胞（二次細胞）は縦の欄３に表示する。本発明はまた、ク ローンとして増加した誘発細胞が、表ＩＩに示したような（ただしこれらに限定 されない）細胞増殖性疾患の初期ステージにおいて応答細胞の増殖を促進する他 の疾患の診断および治療にも有用である。 他の具体例は以下の請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハーンディアー、ブライアン アメリカ合衆国 94131 カリフォルニア 州 サンフランシスコ バン バレン 56 (72)発明者 シラミズ、ブルース アメリカ合衆国 94044 カリフォルニア 州 パシフィカ カーメル アベニュ 365

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． マクロファージの生命活性度を実質的に低下させる候補治療剤をスクリ ーニングする方法であって、当該方法が、マクロファージによる優先的取り込み に適した製剤として医薬的に有効量の候補治療剤を増殖マクロファージに投与す ることを含み、ここで当該取り込みが当該マクロファージの生命活性度の実質的 低下を生じる前記候補治療剤のスクリーニング方法。 ２． 哺乳類組織でクローン増加したマクロファージの存在を診断する方法で あって、当該方法が、当該組織細胞のＤＮＡにおけるクローンＤＮＡの存在を決 定することを含み、ここで当該決定が、当該組織サンプル中のマクロファージか ら分離したＤＮＡとハイブリダイズする少なくとも１つの一本鎖核酸フラグメン トを用いる前記診断方法。 ３． 当該決定の前に、当該方法が当該組織の他の細胞からマクロファージを 分離することを含む、請求の範囲第２項の方法。 ４． 請求の範囲第２項の方法において、 ａ）当該分離ＤＮＡがゲノムに組み込まれたウイルスのコピーを含み、 ｂ）当該決定が逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）法によって実施され、 ｃ）当該一本鎖核酸フラグメントが、当該ウイルスの配列とハイブリダイズす る一対の核酸プライマーを含んでなる請求の範囲第２項の方法。 ５． 請求の範囲第４項の方法において、 ａ）当該ウイルスがヒト免疫不全ウイルスで、さらに ｂ）当該核酸プライマー対が、当該ヒト免疫不全ウイルスの大末端繰り返し（ ＬＴＲ）配列とハイブリダイズする請求の範囲第４項の方法。 ６． 請求の範囲第２項の方法において、 ａ）当該決定がＲＦＬＰ分析によって実施され、さらに ｂ）当該一本鎖核酸フラグメントが、細胞増殖の実質的増加をもたらす遺伝的 変化と連動するゲノム配列にハイブリダイズする請求の範囲第２項の方法。 ７． 当該ゲノム配列がヒト免疫不全ウイルス組み込み部位である請求の範囲 第６項の方法。 ８． 当該遺伝的変化が、細胞増殖を促進する遺伝子の発現を実質的に増加さ せることとなる請求の範囲第６項の方法。 ９． 当該遺伝子が腫瘍遺伝子である請求の範囲第８項の方法。 １０． 当該腫瘍遺伝子が、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｒａｓおよび ＰＤＧＦ−Ｂを含む群から選ばれる請求の範囲第９項の方法。 １１． 当該配列が、ｆｕｒ遺伝子のｚエクソンである請求の範囲第６項の方 法。 １２． 当該配列がｃ−ｓｉｓ遺伝子である請求の範囲第６項の方法。 １３． マクロファージによる優先的取り込みに適した製剤状態にある、医薬 的に有効量の治療剤を含む哺乳類の細胞増殖性疾患を治療する方法で使用する組 成物であって、ここで、当該マクロファージの一部分が、増加クローンマクロフ ァージの存在がその組織で決定された哺乳類組織に存在し；当該取り込みが、当 該増加クローンマクロファージを当該哺乳類から実質的に排除することとなり； さらに当該哺乳類のマクロファージ集団が当該組成物の投与が中断された後再生 される、哺乳類の細胞増殖性疾患を治療する方法で使用するための組成物。 １４． 当該治療剤が細胞毒素である請求の範囲第１３項の組成物。 １５． 当該治療剤が、トリコサンシン、モモルカリン、ダウノマイシン、マ イトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、５−ＦＵ、サイトシンアラ ビノシド、コルヒチン、サイトカラシンＢ、ブレオマイシン、ビンクリスチン、 ビンブラスチン、メトトレキセート、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、サポ リン、ジフテリア毒素Ａ鎖、外毒素−Ａ、リシンＡ−鎖、アブリンＡ−鎖、モデ クシン（modeccin）Ａ−鎖、サポリンから成る細胞毒素群から選ばれる請求の範 囲第１４項の組成物。 １６． 当該製剤がリポゾーム製剤である請求の範囲第１３項の組成物。 １７． 当該製剤が、細胞毒素に共有結合させた抗−マクロファージ細胞表面 蛋白抗体である請求の範囲第１３項の組成物。 １８． 当該製剤が、ＨＩＶ感染マクロファージの細胞表面マーカーに対する 抗体で、当該抗体は細胞毒素に共有結合されている請求の範囲第１３項の組成物 。 １９． 当該組成物が、癌細胞を実質的に排除するために十分である医薬的に 有効量の、癌細胞に対して特に細胞毒性を有する第二の治療剤をさらに含む請求 の範囲第１３項の組成物。 ２０． マクロファージによる優先的取り込みに適した製剤状態にした治療剤 の医薬的有効量を含む、哺乳類の細胞増殖性疾患を治療する方法で使用する組成 物であって、ここで、当該マクロファージの一部分が増加クローンマクロファー ジの存在がその組織で決定された哺乳類組織に存在し、さらに当該取り込みが、 当該増加クローンマクロファージの実質的増殖低下をもたらす当該増加クローン マクロファージの増殖促進性細胞増殖遺伝子の発現における実質的低下を生じる 前記細胞増殖性疾患を治療する方法で使用する組成物。 ２１． 請求の範囲第２０項の組成物において、 ａ）当該治療剤が、増殖を促進させる細胞増殖遺伝子のアンチセンス配列をコ ードするＤＮＡであり、さらに、 ｂ）当該アンチセンス配列が、当該マクロファージの当該ゲノムへの組み込み のためにＤＮＡ配列に機能的に結合され、さらに当該マクロファージでの発現の ためにプロモーターに機能的に結合されている請求の範囲第２０項の組成物。 ２２． 当該細胞増殖性疾患が、リンパ腫、非類リンパ腫性癌、エイズ脳症、 アテローム硬化症、腎症および巣状分節状糸球体硬化症から成る群から選ばれる 請求の範囲第１３項および２０項の組成物。 ２３． 当該哺乳類がヒトである請求の範囲第２項、１３項または２０項に記 載の組成物。 ２４． ａ）その増幅が増加クローンＤＮＡを表示する、当該組織から分離したＤＮＡ 配列の増幅用の一対の核酸プライマー、 ｂ）そのＤＮＡの遺伝的変化が細胞増殖と連動する、当該組織から分離された ＤＮＡの制限酵素断片多形（ＲＦＬＰ）分析用核酸プローブ、および ｃ）マクロファージを特定するためのマクロファージ特異的細胞表面蛋白に対 する検出可能な抗体を含む、請求の範囲第２項の方法による哺乳類組織における クローン増加したマクロファージの存在を診断するためのキット。