NO326130B1 - Fremgangsmate for seleksjon og testing av forbindelser som inhiberer eller stimulerer klonal cellevekst - Google Patents

Description

HVA OPPFINNELSEN OMFATTER

Den aktuelle oppfinnelsen omfatter en metode som selekterer og tester stoff(er) som hemmer klonal cellevekst og bruken av sliké stoffer. Medikamenter som inneholder slike stoff vil være i stand til å nedsette eller oppheve kloning både av normale celler og tumorceller. Det skulle derfor være mulig å nedsette eller eventuelt hindre malign sykdom, metastaser fra eksisterende tumor eller atheromatose.

Eksporten av maligne celler som er transplantert til et sted i subcutis er vist å bli hemmet eller helt hindret ved å benytte samme substans som hemmet veksten av kloner. Denne effekten viste ingen avhengighet av celletettheten slik som hemningen av kloneinhiberingen gjorde. Det er antatt at oppdagede hemmere eller fremmere av klonevekst også vil være aktive mot andre sykdommer hvor kloning av celler kan være involvert i patogenesen, for eksempel ved utvikling av atheromatose.

Det må anføres at stoff som stimulerer kloning av celler kan finnes ved den samme metoden og at disse kan være karsinogene. Av profylaktisk hensyn er det viktig å være klar over om medikamenter kan fremkalle slik aktivitet og om aktivitet knyttet til interne fysiologiske stoff eller stoff og agens som opptrer under sykdom, produseres i kroppen eller skyldes fødeinntak eller kommer fra andre ytre kilder.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

En grunnleggende antakelse for at maligne svulster eller deres metastaser oppstår, er at de vanligvis har opprinnelse fra enkeltceller som blir klonet før primærtumor eller metastasen utvikles. En hemning av denne prosessen skulle derfor være av det gode. Kloneprosessen er et "svakt punkt" eller en periode i cellens liv som har spesielle behov. I cellekultur lettes kloneprosessen av spesielle vekstfaktorer som kondisjonert medium, serum, insulin, insulinlignende vekstfaktor, veksthormon, cytokiner, stoff som Mito+ (se eksperiment nr. 3).

Under den embryonale organogenesen oppstår det mange nye kloner. Etter hvert vil disse klonene danne organer som til sammen vil gi et helt individ. Når det oppstår svulster senere i livet er de også klonet. Nye kloner i et ferdig utviklet individ synes ikke å passe sammen med allerede klonede, naturlige organer. Konsekvensen blir svulster som gir alt fra ingen til letal konsekvens for individet.

Et medikament som kan minske eller stoppe en kloning av normale eller tumorceller skulle hindre eller til og med stoppe starten av ondartet sykdom eller metastaser fra en slik. Men det er viktig å være oppmerksom på at medikamentet bare virker mot kloning av celler. Veksten av eksisterende multicellulære svulster trenger ikke å bli stoppet siden ingen ekstra kloning av disse svulstene med mange celler er nødvendig for deres fortsatte vekst.

Derfor vil behandling av ondartet vekst med selektive klonale inhibitorer bare stoppe celler som ligger fra hverandre, ikke multi-cellulære svulster. De sistnevnte må fjernes ved bestråling eller annen konvensjonell behandling. Den cytostatiske aktiviteten, om den finnes hos klonale inhibitorer, vil antakelig være mye mindre enn hos de klassiske cytostatika. Derfor er det antatt at det vil være mulig å fortsette behandlingen over et mye lengre tidsintervall med selektive klone inhibitorer som ikke har vanlig cytostatisk aktivitet. En kontinuerlig behandling av selekterte kreftpasienter kan antakelig beskytte mot tilbakefall på en måte som ikke er mulig med klassiske cytostatika.

De kreftpasientene som antas å ha mest nytte av slik behandling er de som har blitt radikalt behandlet og som ikke har kjente metastaser eller hvor kjente metastaser kan fjernes eller nøytraliseres. Statistisk sett vil noen av de pasientene som er konvensjonelt behandlet senere få tilbakefall eller nye metastaser. Det er antatt at bruk av stoff funnet ved foreliggende metode vil redusere eller i noen tilfeller stoppe tilbakefall.

Pasienter med kjent restsvulst kan antakelig også få det bedre siden eksport av metastaserende celler fra restsvulsten antakelig vil stoppe opp. Dette vil sannsynligvis gi et mer godartet forløp av tumorsykdommen.

Leukemi uten solide svulster kan være et godt valg for slik behandling siden lokal hemning av effekten i områder med opphopning av celler er antatt å være liten og utvikling av resistens mot kjemoterapi nedsatt siden nye kloner vil bli betydelig redusert i antall.

Behandling som har som mål å redusere eller stoppe spredning av metastaser er etterlengtet ved konvensjonell kreftbehandling. Ved konvensjonell behandling kan man miste kontroll over utviklingen av metastaser.

Hos personer som har stor risiko for å få maligne svulster, for eksempel familiær brystkreft eller tykktarmskreft, vil egnede medikamenter som er oppdaget ved hjelp av foreliggende oppfinnelses metode antakelig ha en verdifull profylaktisk effekt.

Arteriosklerose er vist å bestå av klonede celler som enten er utviklet de novo eller fra tidligere klonede celler. Vekststimulerende substanser kan være en viktig patogen faktor og det har blitt vist at strekking av dyrkede celler kan frigjøre slike. Strekking av celler i arteriene forekommer sannsynligvis hovedsakelig i kurvaturene i de tykkere partiene av arteriene som vist i koronararteriene (E. Tjøtta, The distribution of Atheromatosis in the Coronary Arteries, J. Atherosclerosis Res. 3 (1963) 253-261). Disse delene av arteriene er altså signifikant mer affisert enn de rettere partiene som ble bøyd mindre. Tynnere deler av disse arteriene ble ikke rammet av atheromatose sannsynligvis som følge av at samme grad av bøyning ville gi mindre lokal strekking av arterieveggen. I tillegg vil mekaniske faktorer og infeksjoner kunne øke porene med den følge at vekstfaktorer fra serum kunne finne veien inn i åreveggen. Eksperimenter som beskrives senere viser klart at vekstfaktorer øker klonal vekst i agar av normale celler.

Videre kan tilbakefall av Herpes virus infeksjon fremskyndes av lokalt eller generelt cellehenfall som UV lys, lav temperatur, menstruasjon etc. Det er vist at ultralyd og frysetining av celler kan frigjøre insulinlignende vekstfaktor. Strekking av celler i åreveggen kan frigjøre denne faktoren som angitt ovenfor. Derfor er det mulig at Herpes virus som er funnet i årevegg vil "søke" de deler av åren hvor knekkbøyning induserer disse faktorer og muligens delta i den lokale patogenesen.

Større kloner eller atheromer vil det sannsynligvis være vanskelig å bekjempe ved disse substansene på grunn av at en lokal opphopning av klonede normale celler også er vist å hemme effekten i cellekultur. Profylakse er sannsynligvis lettere. Slik behandling vil kunne forebygge restenose i forbindelse med innlegging av stenter, etter en bypass operasjoner eller endarterectomier.

For pasienter med familiær høy risiko vil det være rimelig med spesifikk profylakse. Men for "mannen i gata" er det antakelig bedre med profylakse basert på mat, vitaminer eller naturprodukter som planteekstrakter. Men da må disse produktene være testet på forhånd.

Sensitiviteten av individuelle maligne svulster skal kunne testes i tester basert på kloning. Det er oppfinnerens syn at konsekvensen av funnene i eksisterende tester ikke har blitt fortolket riktig. Et eksempel på dette er en artikkel skrevet av David H. Kern and Carl A. Bertelsen i International Advances in Surgical Oncology 7:187-213 (1984); Present Status of Chemosensitivity Assays. I denne artikkelen blir fire studier sammenfattet i Tabell II på side 198 med følgende konklusjon: " It is evident from each of these studies that the assay is very accurate for predicting tumor resistance. However, the assay is only about 60% accurate for predicting tumor sensitivity to a given agent." Det er oppfinnerens mening at denne diskrepans har en spesiell forklaring. Når et medikament tester positivt for aktivitet mot en spesiell svulst, betyr det at medikamentet er aktivt som en klonehemmer siden testen som er benyttet var en test hvor kloner ble hemmet av medikamentet. Men medikamentet trenger ikke å være fullt ut effektivt, eller overhode effektivt mot svulster som har rukket å bli multicellulære. Bare stoff som har en generell anti-mitotisk eller annen cytostatisk aktivitet i tillegg til klone hemning vil kunne antas å være i stand til å stoppe både post-klonal og klonal vekst.

Et negativt resultat i en slik klonetest, vil indikere at det ikke er noen effekt på kloning og ingen annen anti-vekst effekt som kunne være virksom mot noen av stadiene i utviklingen av tumor.

Derfor kan et positivt resultat av en slik klonehemningstest lede onkologen på villspor og få han/henne til å tro at medikamentet kan benyttes også til å behandle svulster som er større enn et visst maksimum.

Av tidligere publisert materiale som danner teknikkens stand kan nevnes

Macpherson og Montagnier som i Virology Vol 23 (1964) side 291-294 beskriver

agar suspensjonkultur for selektiv en test for celler transformert av polyomavirus viser at at bare celler transformerte celler kan danne kolonier i bløt agar.

WO Al 0100585 utgjør også teknikkens stand ved at patentet beskriver anvendelse av 4-OH-OPB eller hydroperoxy-3,5-dioxypyrazolidin eller en ekvivalent for anvendelse i et medikament mot HIV infeksjon.

I det følgende vil det bli presentert data som indikerer at en hemmer av kloning er mer aktiv når cellene såes ut ved lav tetthet sammenlignet med høyere tetthet. Slik høy lokal celletetthet synes å hemme effekten av klone hemmere og blir kalt "collocation inhibition of clonal inhibitors" eller på norsk: hemning av klonehemmere i områder med høy lokal celletetthet. Man antar at dess mindre denne hemningen av klonehemmerne er, dess mer toksisk vil substansen være overfor kroppen med alle dens organer.

De presenteres også resultater av undersøkelser av mulige kandidater angående hemning av starten på cellemigrering eller overføring av maligne celler til andre steder i legemet.

Det nye ved denne oppfinnelsen sammenlignet med kjent teknikk er at den har en tretrinns test for screening eller testing av effekten til et medikament, potensielt medikament, matvare, tilsetningsstoff for matvarer, toksiner, potensielle toksiner, eller komponenter fra legemet, for eksempel hormoner, for spesifikk hemning eller stimulering av klonevekst.

Tidligere tester av legemidler eller potensielle medikamenter for anti-cancer effekt har altså bare vært enfaset. Det er oppfinnerens mening at slike tester er omtrentlige og i tillegg er blitt mistolket. Trefase-testen i foreliggende oppfinnelsen vil, i motsetning til tidligere tester, gi mer presise data av den antatte kliniske effekt av mulige legemidler. Dataene som oppnås med den beskrevne metoden, vil indikere optimalt klinisk stadium for et spesielt medikament og også indikere hvilket stoff som kunne være optimalt for en spesiell pasient og om og hvorledes konvensjonell behandling må inkluderes i behandlingsopplegget.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen omfatter:

en metode for seleksjon og testing av medikamenter, potensielle medikamenter, matvarer, tilsetningsstoffer til matvarer, toksiner, potensielle toksiner, komponenter fra fysiologiske eller patologiske prosesser, inkludert mikrober, resultatet av fysiske effekter (for eksempel radioaktivitet og ultralyd) på legemet, deler av legemet eller på effekten av slike substanser med spesifikk klonehemming eller klonestimulerende effekt. Oppfinnelsens metode omfatter det følgende: En klonal test for å studere effekten på cellekloning av disse substansene og;

en test som viser hemming eller oppheving av klonehemmerne eller de fysiske effektene på kloneprosessen og på toksisiteten i områder hvor celletettheten økes og;

tester for slike substansers eller fysiske effekters evne til å influere på utviklingen av metastaser på annen måte enn på kloning, for eksempel på eksport av metastaserende celler fra en malign tumor eller område med tumorceller.

Stoff som er funnet ved denne metoden kan brukes til å produsere et farmasøytisk produkt eller prosedyrer som inngår i behandling eller profylakse av cancer, arteriosklerose, autoimmunitet, avstøtning av transplantater og utfallet av eksponering for radioaktivitet eller annen fysisk effekt.

Den aktuelle oppfinnelsen er basert på antakelsen av at kloning er det "svake punkt" når en malign tumor eller metastase utvikles og at legemidler kan bli selektert i cellekultur dersom de viser tilstrekkelig hemning av kloneprosessen.

Eksporten av metastaserende celler fra en lokalisasjon av tumorceller er vist å kunne stoppes av en klonehemmer, 4-OH-OPB. Men andre tumorceller i høy lokal konsentrasjon synes ikke å hemme denne effekten.

Metoden i denne oppfinnelsen er egnet til screening av mange substanser og vil sannsynligvis gjøre det mulig å oppdage mange ikke toksiske, aktive inhibitorer av kloneprosessen.

Etter at det mulige legemidlet er selektert i cellekultur er det også behov for å studere den toksiske effekten i cellekultur, dyr eller menneske og å teste det inhiberende potensiale på svulster og på tumorcellenes spredning i kroppen.

Med en effektiv klonehemning kan behandlingen av ondartede svulster sannsynligvis bli mye mer aggressiv enn før, siden sjansen for å få nye metastaser vil bli redusert eller helt opphevet. I stedet for palliativ behandling kan sub-radikal tumor behandling bli aktuell siden klonehemning og medikamenter med anti-sprednings effekt kan stoppe den fryktede disseminering av maligne celler.

Etter konvensjonell radikal kreftbehandling vil mange pasienter utvikle tilbakefall eller fjernmetastaser som sannsynligvis i de fleste tilfeller kommer fra tause enkeltceller. Klonehemmere er antatt å stoppe slike celler. I de beskrevne eksperimenter med mus ble minst 100000 tumorceller som var transplantert til peritoneum stoppet.

Det andre aspektet for testen er å oppdage klonestimulatorer. Oppfinneren har vist effekten av noen; insulin, kondisjonert medium, serum og Mito+ (eksperiment nummer 3). Klonestimulering kan meget vel ha carcinogen effekt eller stimulere til utvikling av atheromatose og kan derfor gi resultater av interesse for utvikling av nye medikamenter, kontroll av legemidler, matvarer, tilsetningsstoffer i matvarer, konserveringsmidler, mikrober og kjemikalier.

Resultatene vil også være av interesse for studiet av fysiologiske prosesser, vevsvæsker hos friske og syke, særlig med svulstlidelser og infeksjoner. Men også arteriosklerose kan skyldes kloning av celler på innsiden av arterieveggen. Personer med øket risiko for svulster med genetisk, miljømessig, toksisk eller fysisk årsak, eller arteriosklerose eller annen sykdom som kunne relateres til kloning, kan studeres med det mål å finne effektive midler blant stoff som har effekt på den klonale veksten.

Siden metastaser kan oppstå fra enkeltceller vil hver av dem representere en subklon. Det er oppfinnerens erfaring, etter å ha gjort mange kloneforsøk, at nesten hver ny klon består av celler som ter seg forskjellig sammenlignet med opphavet eller de andre klonene. Det er antatt at dette også ville hende i kroppen, når den maligne prosess skrider frem. For å unngå slike svulster med en rekke forskjellige egenskaper, må produksjonen av nye metastaserende kloner hemmes som angitt. Dette vil sannsynligvis også hemme utviklingen av terapiresistente kloner.

Fremdeles er konvensjonell kreftbehandling antatt å være nødvendig ved diagnosetidspunktet, siden tumor alltid vil bli større enn enkeltceller eller noen få slike celler. Men indikasjonen for behandling som har som mål å kurere sykdommen kan utvides siden klonehemningen kan redde de som allerede har små metastaser og hemme eksport av nye metastaserende celler. Denne siste effekten kan indusere en mindre malign eller til og med benign oppførsel av den gjenværende svulsten.

Dersom tumorceller persisterer i kroppen, kan en klonehemmer gis for å hemme eller stoppe videre kloning eller spredning av maligne celler. Svulster som allikevel klarer å vokse under behandlingen, skulle fortrinnsvis kunne elimineres ved hjelp av konvensjonelle midler som kirurgi eller bestråling, etc. Tidsperioder forandret til lang tid.

DEFINISJONER

Den brukte betegnelsen "kloneinhibitor" eller "selektiv klonehemmer" refererer seg til substanser som er i stand til å hemme enkeltceller som såes i agarmedium, eller på overflate eller i flytende medium å danne kolonier.

Termen "primær tumor" er definert som en spontant oppstått tumor i dyr eller mennesker eller tumorer som er resultat av behandling med carcinogen, mikroorganismer eller fysiske stimuli (for eksempel bestråling).

Begrepet "metastase" er definert som en spredning av dattersvulst i kroppen fra en primær tumor eller metastase eller en transplantert tumor.

Termen "svakt punkt" er en periode i utviklingen av en svulst eller metastase hvor ikke alle svulstceller eller kloner kan vokse. Også i vevskultur vil kloning av en celle, spesielt normale, trenge spesielt medium med spesielt tilskudd som kan stimulere vekst. Allikevel vil ikke alle celler være i stand til å formere seg. Antall som klarer seg er avhengig av sammensetningen av mediet og på cellenes kondisjon. Det er antatt at noen kjemiske substanser kan være i stand til å hemme prosessen selektivt i perioden "svakt punkt".

Termen "klonestimulator" blir brukt om stoff eller fysiske stimuli som kan øke antallet og hastigheten på dannelsen av cellekloner i kultur og sannsynligvis også i organismen. Slike kan ha carcinogen effekt. Man antar at den beskrevne metode i foreliggende søknad kan erstatte eller supplementere data som oppnås med Ames test for carcinogen aktivitet.

Termen "hemning av klonehemmere i områder med lokal høy celletetthet" svarer til det engelske "collocation inhibition of clonal inhibitor" og er definert som en forholdsmessig hemning eller nøytralisasjon av den lokale effekt av en klonal veksthemmer på grunn av høy celletetthet i den spesielle lokalisasjonen. Cellene har selv den egenskapen at de kan nedsette eller oppheve klonehemningen dersom de er tilstede i høy nok tetthet i det aktuelle området.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen omfatter en metode som kan selektere og teste for spesifikk anti-klone eller klonestimulerende effekt hos medikamenter, potensielle medikamenter, matvarer, tilsetningsstoffer til matvarer, toksiner, potensielle toksiner, bestanddeler av fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert mikrober, virkningen av fysiske påvirkninger som for eksempel radioaktivitet eller ultralyd på kroppen eller deler av kroppen eller på slike substanser.

En velkjent årsak til økt forekomst av malign lidelse er eksponering for radioaktivitet. Oppfinneren har observert at frigjøring av vekstfaktorer fra celler som blir frysetirit eller utsatt for ultralyd, kan stimulere klonabilitet. Derfor kan også fysiske effekter på celler påvirke evnen til klonabilitet. Siden nedsatt klonabilitet har sammenheng med anti-cancer effekt, vil det motsatte, stoff som stimulerer klonal vekst, antakelig virke cancinogent eller fremme utviklingen av metastaser.

Ved hjelp av metoden er det identifisert substanser som har potensiale til å bli effektive klonehemmere eller stimulatorer. Klonehemmere er av interesse i behandlingen eller profylaksen av flere sykdommer eller lidelser. Nedarvede eller fenotypiske abnormiteter vil kunne bli oppdaget før sykdom utvikles (for eksempel kreft).

Disse substansene eller prinsippene som kan forandre klonal vekst, vil kunne bli av interesse for reproduktiv- eller annen fysiologi samt embryologi. Embryologi og reproduktiv fysiologi siden hovedprosessen er utvikling av nye kloner, og normal fysiologi siden forandringer i eldre alder synes å skape et bedre miljø for abnorm klonevekst.

Da oppfinneren forsto at kloning var det "svake punktet" i fremveksten av en ondartet svulst eller dens metastaser, skjønte han også at stoffene kunne bli selektert i cellekulturer om de viste tilstrekkelig inhibisjon av kloneprosessen.

Etter denne seleksjonen i kultur ble det behov for å studere den toksiske effekten i cellekulturer, dyr eller mennesker og å teste det hemmende potensialet på svulster og effekten på spredningen av tumorceller i organismen.

Som eksempel på cellelinjer er de normale baby-hamster nyrecellene, BHK21/cl3, og dens polyoma virus transformerte avkom (S100T1) blitt benyttet for studiet av cellekloning og hemning av denne ved hjelp av stoff som virker mot cancer.

Denne anti-klone effekten kan bli nøytralisert eller redusert ved å øke den lokale konsentrasjonen av cellene. Det er viktig å merke seg, siden det viser at substansene som har spesifikk anti-klonal effekt mister effekten så snart mange av de cellene det dreier seg om konsentreres opp eller at kloneprosessen fører til kolonier.

Jo høyere denne "avgiftende" eller "inaktiverende" effekten som skyldes lokalt konsentrert celletetthet er, dess mindre toksisk er en substans antatt å være for organismen som sådan. Slike substanser vil man anta kan brukes over lang tid for å forebygge tilbakefall eller utvikling av metastaser, men ikke for å hemme veksten av tumorer større enn et visst maksimum.

Data fra testing av om kloner hemmes, om det foreligger toksisitet og hemning av den påviste klonehemningen i områder med høy celletetthet og effekten på metastatisk spredning (se senere) vil være viktige for rangeringen av substanser som skal testes. Hvis disse resultatene i tillegg blir sammenlignet med tidligere undersøkte og bedre kjente kandidater, vil det være mulig å sette opp en prioritetsliste av slike kandidatmidler som bør undersøkes nøyere.

Når man tester mulige midler for behandling av en bestemt pasient, vil disse resultatene ha betydning: evnen til å hemme oppvekst av kloner, hemmer de effekten i områder med høy celletetthet og, om mulig, vil midlet hemme utvikling av metastaser? Samlet vil disse resultatene være bedre for å kunne forutsi klinisk effekt enn bare å undersøke den første av disse: effekten på oppvekst av kloner. Slike data vil også gi en pekepinn for i hvilket stadium bestemte midler kan benyttes og hvilket middel som må antas å være optimalt for den bestemte pasienten.

Metodene i foreliggende oppfinnelse vil oppdage substanser som gir øket antall kloner og/eller vekst og spredning av metastaser og/eller primære svulster.

Endelig er vurderingen av evnen til å redusere eksporten av metastaserende celler også vital i klinikken. Et eksempel på en slik test hvor det ble benyttet Ehrlich carcinom er beskrevet (eksperiment nummer 9). Et behandlingsregime etter dette opplegget er antatt å redusere eller eliminere sjansen for metastatisk spredning gjennom og etter nødvendig konvensjonelt opplegg, hovedsakelig som kirurgi, bestråling eller cytostatika. Veksten av tumorvev antas imidlertid ikke å avta dersom svulstene er over en viss størrelse. Det er imidlertid oppfinnerens mening at slike svulster vil oppføre seg mer som godartede svulster siden behandlingen antakelig vil stoppe sekundær spredning.

Dyreeksperimentene i forbindelse med oppfinnelsen viser at andre celler i dyret ikke virker som nemmere av klonehemningen når det gjelder Ehrlich karsinomet. En av de testede substansene; 4-OH-OPB, før kjent for å kunne behandle virusinfeksjoner, synes fullt aktiv mot tumorceller i peritoneum hos mus, selv om cellemengden i organer nær peritoneum langt overskrider cellemengden av de injiserte tumorcellene.

Ehrlich ascites tumor hos mus blir brukt som et godt eksempel på frittliggende tumorceller som er i stand til å utvikle maligne kolonier etter hva som er antatt å være klonelignende prosesser etter transplantering i bukhulen. Ved behandling umiddelbart vil disse cellene lett hemmes og kan ikke gjenfinnes på det tidspunktet ubehandlet kontrollmus dør med massiv affeksjon.

Men utsettelse av behandlingen i en dag eller mer vil gjøre sykdommen resistent for selv mange ganger høyere dose enn hva som er nødvendig for å kurere den ondartede lidelsen dersom behandlingen startet straks.

Dess høyere dosen er av intraperitonealt injisert 4-OH-OPB, jo lavere er det nødvendige antall Ehrlich celler som skal til for å danne lokal svulst etter subkutan injeksjon .

En hemmende effekt på en antatt migrasjon av metastaserende Ehrlich tumor celler når 4-OH-OPB benyttes vil forklare disse observasjonene, siden ubehandlet kontroll bare utvikler ascites og ingen lokal tumor på de subkutane injeksjonsstedene.

Derfor er det i det minste to forskjellige effekter av 4-OH-OPB, en er hemning av klonevekst, den andre er en anti-metastatisk effekt som hemmer eksport av metastaserende celler utgått fra de subkutant transplanterte cellene. Lokal konsentrasjon av tumorceller hemmer den første effekten, men ikke den andre. Oppfinneren har vist at 4-OH-OPB hemmer veksten og migrasjonen av celler som kommer fra et område som inneholder mange transplanterte tumorceller. Det er ikke tidligere blitt vist at den oppdagede substansen 4-OH-OPB har evne til å selektivt hemme klonal vekst og at den også kan hemme eksport av metaserende celler.

Midlet letter imidlertid veksten av cellene som er blitt mer tettpakket, sannsynligvis på grunn av mindre migrering som ville ha "fortynnet" dem. Behandling ser ut til å kunne indusere en mer benign oppførsel av den transplanterte mengden av svulstceller som fremdeles er i stand til å vokse på det stedet dersom den lokale cellemengden er stor nok.

Forklaringen på eksperimentet med mus er i overensstemmelse med eksperimenter i cellekulturer, hvor til og med små kolonier er mye mer motstandsdyktige overfor behandling enn enkle celler. Det er antatt at etter 24 timers utsettelse eller mer før starten på behandling etter transplantasjon av Ehrlich ascites i mus, vil noen celler ha hatt sjansen til å starte å vokse. Dette kan ha skapt steder med flere nye celler eller kolonier hvor den økede celletettheten er i stand til å oppheve, eller betydelig nedsette, effekten av hemmeren av klonet cellevekst.

Etter injeksjon av Ehrlich celler subkutant startet sannsynligvis de injiserte cellene straks å "migrere" til bukhulen. Denne forflytning syntes å være så effektiv at bare peritoneum inneholdt tumorceller etter subkutan injeksjon av slike celler i ubehandlet kontroll.

Etter intraperitoneal injeksjon av kloneinhibitoren 4-OH-OPB ble imidlertid ingen

spredning av tumorceller fra disse subkutane injeksjonene funnet i bukhulen. Videre må resultatene av testing av inhibitorer av tumores fra individuelle pasienter tolkes riktig og behandling startes mens påviste svulster eller metastaser blir fjernet eller inaktivert. Det er håp om å få kontroll av gjenværende enkeltceller som har metastasert etter

oppstarting av slik behandling. Brukt på denne måten antar man at den vil bli

livreddende hos mange pasienter. Det er også en mulighet for at slik behandling av inoperable svulster vil hemme eller stoppe utviklingen av metastaser.

Når det gjelder spontane eller induserte svulster, vil profylakse være relevant når det er stor risiko for å bli rammet, for eksempel av familiær brystkreft eller tykktarmskreft. En viktig mulighet for å studere spontane svulster kan være tester på dyr som får spontane svulster. Profylaktiske midler mot utvikling av spontane svulster skulle imidlertid først og fremst bli selektert i kulturer av normale celler som stimuleres slik at de blir i stand til å danne kolonier i bløt agar (for eksempel eksperiment nummer 6).

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter:

en fremgangsmåte omfattende seleksjon og testing av medikamenter, potensielle medikamenter, matvarer, tilsetningsstoffer til matvarer, toksiner, potensielle toksiner, komponenter fra fysiologiske eller patologiske prosesser, inkludert mikrober, virkningen av fysiske påvirkninger på kroppen eller deler av kroppen med spesifikk anti-klone eller klonestimulerende effekter, som omfatter a) in vitro klonetest for å studere virkningen av nevnte substanser på kloning av celler; b) test på nevnte substansers hemmende effekt av celleopphoping in vitro eller in vivo på dyr; c) in vivo tester på dyr for å studere utviklingen av cellene i metastaser og lokale svulster på andre måter enn gjennom kloning.

I det følgende vil hvert trinn i oppfinnelsens metode bli forklart i større detalj.

Klonetesten

Klonetesten omfatter:

a) utsæd av celler i bløtt agarmedium som evt. kan inneholde vekstfaktor(er); b) behandling og inkubering av spesielle geler (for eksempel agarose som stivner ved ultra lav temperatur); c) inkubering ved egnet temperatur og atmosfære og;

d) overvåking av cellekulturene og utviklingen av kloner.

Klonetesten kan utføres i flytende medium eller på plater med små brønner. Celler som

såes i bløt agar kan utvikle kloner. Vanligvis er det bare transformerte celler som vil danne kloner i bløt agar. 10,8 % bløt agar (Sigma agarose Type DC eller Type DCA) som topp agar lag med Eagle's MEM og 10 % føtalt bovint serum var bare S100T1 (polyoma

virus transformert BHK21/cl3 cellelinje) i stand til å danne kolonier ved kloning, ikke de normale cellene disse kom fra. Normale celler behøver stimulering av vekstfaktorer (eksperiment nummer 3).

I en utførelse av oppfinnelsen ble det brukt en baby hamster nyrecellelinje (BHK21/cl3) og en linje fra disse som var blitt transformert med et polyoma virus som ga små plakk (S100T1). Viruset og BHK21/cl3 celler ble begge mottatt fra Macpherson's laboratorium i Glasgow. Våre funn (eksperiment nummer 3) er begge i overensstemmelse med Macpherson og Montagnier's rapport (Macpherson og Montagnier Virology, Vol. 23 (1964) side 291-294) som viste at bare transformerte celler kunne danne kolonier i bløt agar. Mange andre celler er sannsynligvis egnet i denne testen, og vi må nevne disse: Maligne celler, normale celler, cellelinjer, transformerte celler og celler fra pasientsvulster eller celler fra immunsystemet (for eksempel milten) som klones selektivt etter immunisering (eksperiment nummer 10). De siste kan også detekteres eller kvantifiseres ved å bruke for eksempel Jerne's klassiske test.

Andre kloneteknikker, for eksempel kloning i flytende medium og i små brønner i plater, er mulig for å finne klonehemmere.

Tilsetning av andre vekstfaktorer enn insulin kan være relevant, spesielt for normale celler som vokser i agar. Eksperimentell testing av noen eksempler er beskrevet senere (eksperiment nummer 3 og 6). Normale celler kan være relevante for å finne substanser som er i stand til å hemme carcinogenese siden maligne svulster antas å utvikle seg fra mer eller mindre normale celler i kroppen.

Resultatet av eksperiment nummer 3 og 6 viser klart at det er mulig å studere klonal vekst og hemning av klonal vekst ved bruk av normale celler (BHK21/cl3), etter tilsetning av vekststimulerende substanser til disse kulturene. Noen slike nevnes her: Kondisjonert medium stimulerer veksten av kloner både fra normale og transformerte celler. Effekten kan bli kraftig øket ved konsentrasjon og kan være viktig ved bruk av tumorceller fra pasienter.

Insulin er en meget viktig faktor som stimulerer veksten av kloner av normale celler, men sannsynligvis ikke transformerte eller tumorceller.

Faktorer i serum er potente vekststimulatorer for alle celler, men serum alene er ikke nok for kloning av normale BHK21/cl3-celler i agar.

Også insulinlignende vekstfaktor vil sannsynligvis stimulere kloning av normale celler, men ikke av de polyoma virustransformerte.

Cytokiner.

Serumsparende midler som Mito+ ble funnet å tillate vekst av normale celler sammen med små mengder serum. En kombinasjon av flere av de nevnte faktorene er også aktiv.

I eksperiment nummer 4 og 6 blir stoffet 4-OH-OPB testet for hemning av kloning av BHK21/cl3 celler og de polyoma virustransformerte S100T1 cellene under vekst i agar. Resultatet viste klart at ingen vekst eller hemmet vekst ble observert i kulturer som ble behandlet med 4-OH-OPB.

Til slutt, det andre aspektet ved testen, nemlig at kloningen økes i stedet for nedsettes, skulle kunne gjøres ved at testen utføres på lignende måte. Basert på teorien om at kloning er viktig for utviklingen av kreft eller metastaser vil en økning av klonabilitet som følge av bruk av kjemisk stoff, fysiske effekter, infeksiøse agens etc. indikere en mulig carcinogen effekt samt stimulering av utviklingen av metastaser og mulig virkning på andre patologiske tilstander hvor kloning kan være delaktig i etiologien (for eksempel atheromatose).

Hemmende innflytelse på klonehemmerne av høyt lokalt celletall.

I denne testen inngår:

a) transplantasjon til dyr av oppslemmede tumorceller, for eksempel Ehrlich ascites på mus, eller å så ut celler som tidligere beskrevet i eksperimentelle cellekulturer; b) supplere testen med substanser som er beskrevet ovenfor og;

overvåke dyrene som er transplantert med tumorceller eller de eksperimentelle

cellekulturene

Etter selektering av stoff ved hjelp av cellekultur er det behov for å studere toksisk effekt i cellekulturer, dyr eller mennesker og å teste hemmende potensiale på svulster i dyr.

Et godt eksempel på en tumor som er egnet for å studere tumorceller som blir klonet vivo er Ehrlich ascites tumor hos mus. Tumorcellene som høstes fra ascites hos mus er nesten alltid solitære. Transplantert til et nytt dyr vil disse cellene fordele seg over store overflater i peritoneum og på transplantasjonstidspunktet har cellene ikke noen sjanse til å danne aggregater som kunne motstå en eventuell klonehemning. Dersom behandlingen imidlertid blir utsatt en dag, vil det ikke være enkelt å oppnå klonehemning (eksperiment nummer 8). Dette er antatt å være forårsaket av lokal økning i celletetthet eller "collocation" forårsaket av vekst eller aggregater eller begge deler. Også eksperimenter utført i cellekultur indikerer en nedsatt veksthemning etter at cellene har fått vokse først eller har blitt sådd ut tettere (eksperiment nummer 5 og 6).

Test for påvirkning av utviklingen av metastaser

Test for påvirkning av utviklingen av metastaser omfatter:

a) injeksjon av forskjellig antall av tumorceller på forskjellige steder i dyret for å undersøke cellenes evne til å danne metastaser og lokale svulster; b) anvende tidligere omtalt middel og; c) observere midlets evne til å påvirke migreringen av tumorcellene og utviklingen

av lokale svulster i dyrene eller kolonier i cellekultur.

Utviklingen av metastaser avhenger av celler som kan migrere fra en primær tumor eller primært transplantasjonssted og vokse på det nye stedet som kan være mer attraktivt. Det er separate tester for å undersøke effekten av mulige midler etc. på hvert av disse stadiene: Den første testen består av å injisere forskjellig antall Ehrlich carcinomceller på seks forskjellige subkutane steder på mus som blir behandlet med intraperitoneale injeksjoner av de stoffene som skal undersøkes, for eksempel 4-OH-OPB (eksperiment nummer 9). Behandlingen stoppet effektivt migreringen av tumorceller til peritoneum. Cellene ble sannsynligvis stoppet på det opprinnelige subkutane stedet hvor den lokale cellekonsentrasjonen derfor ble høyere enn i ubehandlet kontroll. Ved å operere med forskjellig celletall på de forskjellige injeksjonsstedene vil antall voksende svulster indikere hvilket celletall som er nødvendig for å utvikle svulster hos behandlede og ubehandlede dyr.

Neste test er en klonehemmende test som kan utføres i cellekultur eller hos mus eller om nødvendig i andre dyr.

I den første testen benyttes fortrinnsvis tumorceller som er i stand til å gi metastaser (for eksempel Ehrlich carcinom, eksperiment nummer 9). Den andre kan også benytte den samme transplantable ascitestumor som injiseres intraperitonealt hos mus som behandles med stoffet som skal testes (for eksempel 4-OH-OPB, eksperiment nummer 7 og 8). I cellekultur har den polyoma virustransformerte BHK21/cl3 cellelinjen S100T1 blitt benyttet som eksempel (eksperiment nummer 2,4-6).

Hvert stoff som viser seg å ha en effekt på klonabiliteten må videre evalueres for om lokal økning i celletetthet hemmer eller modifiserer denne effekten. Den lokale celletettheten synes bare å påvirke virkningen på kloneveksten, men affiserer ikke stoffenes effekt på eksporten av metastaserende celler.

Videre må resultatene av testing av individuelle pasienter for effekt av turnorhemmere tolkes korrekt og behandling institueres etter eller under behandling med sikte på å fjerne svulster eller inaktivere svulster eller metastaser som er for store eller ikke kan fjernes. Det er håp om å få kontroll med metastaser av enkeltceller etter å ha startet slik behandling. Brukt som beskrevet, er det antatt at denne effekten vil bli livreddende hos en rekke pasienter.

Denne behandlingen antas å kunne redusere eller stoppe eksporten av metastaser til og med fra større svulster som kan være inoperable siden lokal celletetthet ikke synes å influere på effekten på eksporten av metastaserende celler.

Det har ikke blitt vist tidligere at den oppdagede substansen 4-OH-OPB har evnen til å virke som en selektiv klonehemmer og hemme eksporten av metastaserende celler.

Denne oppfinnelsen omfatter en trefasisk test. En substans, 4-OH-OPB, funnet ved hjelp av denne testen er vist å stoppe vekst av Ehrlich carcinom celler transplantert til peritoneum på mus dersom musene ble behandlet straks.

Eksport av Ehrlich celler fra det subkutane injeksjonsstedet blir sannsynligvis også stoppet. Den lokale ansamling av Ehrlich celler måtte imidlertid være høyere enn et visst minimum for å understøtte lokal tumorvekst i behandlede dyr. For å holde den lokale ansamlingen av relativt få injiserte tumorceller på et nivå hvor lokal vekst var mulig, krevdes det ganske høye doser av 4-OH-OPB. Dersom antallet tumorceller var relativt lavt, måtte det ennå høyere doser til av 4-OH-OPB for å få lokal vekst. Det betyr at både antallet celler og konsentrasjonen av 4-OH-OPB virker i samme retning. Oppfinneren tror at 4-OH-OPB øker den lokale tettheten av tumorceller på grunn av at de ikke lenger migrerer eller at de migrerer i mindre grad enn uten behandling. Bare dersom den lokale tumorcellekonsentrasjonen blir høyere enn et visst minimum, vil lokal tumorvekst kunne starte.

Stoffene som hemmer klonal cellevekst

De substansene som man finner med den foreliggende oppfinnelsen kan benyttes til å lage farmasøytiske produkter til profylakse eller behandling av kreft, arteriosklerose, autoimmunitet, avstøtning av transplantater eller patologiske prosesser relatert til vekst som kan skyldes radioaktivitet eller andre fysiske effekter.

Med hensyn til spontane eller primære svulster, kan profylakse være relevant dersom det er stor fare for å få sykdommen, for eksempel familiær brystkreft eller colon cancer. Stoff som hemmer vekst av kloner, bør testes for å ekskludere for sterk hemning av immunsystemet. Immunsystemet er ganske avhengig av dets evne til å produsere kloner som er effektive mot nye infeksjoner. Bruken av stoff som hemmer veksten av maligne kloner, vil kunne være av stor betydning for profylaksen av kreft og utvikling av metastaser, men vil også kunne affisere fysiologiske prosesser negativt, for eksempel de naturlige kloneprosessene i immunsystemet og organogenesen hos et foster.

For å undersøke graden av nedsatt kloning i immunsystemet kan Jeme's test i mus være adekvat. Røde blodlegemer fra får injiseres i mus. Få dager deretter blir celler fra milten hos disse studert. Dersom antall celler som produserer lyse av saueblodlegemer er innen et akseptabelt nivå, vil sannsynligvis funksjonen av immunsystemet bli tilstrekkelig god under behandlingen. Siden dyr tåler ganske høye doser av 4-OH-OPB, er det sannsynlig at stoff med hemning av klonal vekst av tumor eller normale celler ikke trenger å ekskluderes som fremtidige medikamenter på grunn av denne mulige immunologiske bivirkning.

Men klonehemmere kan allikevel være farlige for fosterutviklingen siden utviklingen av organer er basert på kloner.

Stoffet 4-OH-OPB som ikke er et klassisk cytostatikum ble funnet ved hjelp av oppfinnelsens metode som omfatter deteksjon av mulige midler som egner seg for

kreftbehandling eller behandling av andre sykdommer hvor kloning er en sentral del av patogenese (for eksempel arteriosklerose). Dette stoffet kan bli et medikament som ikke tidligere har blitt vist å inneha den nevnte effekten. 4-OH-OPB er sannsynligvis mindre giftig enn noen cellegift, men allikevel i stand til å stoppe progresjon av tumor når den maligne prosessen er i dens mest utsatte periode, dvs. under kloneprosessen. Dette

stoffet kan bli brukt for produksjon av farmasøytiske preparat til behandling eller profylakse av kreft, arteriosklerose eller resultatet av radioaktivitet eller andre fysiske effekter. Det kan bli mulig å gi aktive doser av stoffene som finnes ved hjelp av metoden i oppfinnelsen uten å fremkalle vevs eller organskade eller akkumulasjon av symptomer som er uforenlige med dosering over lang tid.

Siden kloneprosessen er antatt å være vanskeligere for cellen å gå igjennom enn vanlig celledeling, antas det at det i kroppen må være lettere å hemme den initiale kloningen av en primær tumor og til og med starten av metastaser fra enkle eller noen få celler enn å stoppe allerede klonede større tumorer. Eksporten av celler fra "større" svulster eller en lokalisasjon rik på tumorceller kan imidlertid hemmes under behandling. Denne effekten er antatt å indusere en mer benign oppførsel hos den maligne svulsten og kanskje en virkelig forandring fra malign til benign vekst.

Diskusjon

Det er viktig å verifisere anti-tumor-effekten i dyr for stoff som oppdages ved metoden som er nevnt ovenfor. Tumorceller kan injiseres inn i bukhulen og stoffet som testes kan injiseres på det samme stedet. Tumorceller kan injiseres i lymfeårer for å studere utviklingen av svulster i lymfeknuter eller injisert i andre hulrom eller vev for å studere veksten på slike steder. Hematogen spredning av tumorceller kan dessuten studeres ved intravenøse eller intrarterielle injeksjoner av transplantable tumorceller.

Resultater oppnådd med å bruke transformerte eller tumorceller antas å vise mulige effekter på utviklingen av tumormetastaser bedre enn om man benyttet normale celler. Kloning av normale celler i bløt agar trenger vekstfaktorer tilsatt mediet. Hemmere av dette systemet vil sannsynligvis gi resultater som er relevante for utviklingen av primær cancer eller arteriosklerose.

Vekstfaktorene i eksperimentene er eksempler blant mange andre relevante substanser.

Det er viktig å kjenne utbredelsen, eliminasjonen og transporten i kroppen av de testede medikamentkandidater. Når midlet injiseres i det samme hulrom som svulsten (for eksempel peritoneum), er ingen transport gjennom sirkulasjonen nødvendig. Men injeksjon av stoffet på andre steder enn hvor den transplantable tumoren blir inokulert, vil gi data som viser hvor effektiv transporten gjennom sirkulasjonssystemet kan være. Stoff som hemmer insulin eller insulinlignende vekstfaktor kan være mer effektiv mot primære svulster eller atheromatose siden disse faktorene ikke blir antatt å stimulere transformerte celler (E. Tjøtta, Arch. Ges. Virusforsch. 25, 363-364, 1968). Serum og kondisjonert medium i kombinasjon stimulerer imidlertid både transformerte og normale celler og hemmere av disse faktorer vil kunne hemme veksten av både primære og metastaserende svulstceller.

Flere substanser som sannsynligvis vil virke som selektive kloneinhibitorer vil bli nevnt og, dersom mulig, undersøkt. Resultatene fra eksperiment nummer 5 og 6 viser klart at kulturene av polyoma virustransformerte baby hamster nyreceller (BHK21/cl3, S100T1) behandlet med stoffet 4-OH-OPB viser mindre vekstaktivitet enn kontrollen som ikke mottar 4-OH-OPB.

Det er antatt at mitotiske hemmere som OH-urea, kolchicin eller podophyllotoksin eller deres derivater vil gi eksempler som er aktive i denne forbindelse. Også kjemisk struktur som ligner på 4-OH-OPB kan vise seg å være aktive. Videre representerer NSAID'ere en meget interessant gruppe, de er funnet å nedsette forekomsten av maligne svulster. Det samme kan sies om vitaminer og mineraler, særlig slike som har antioksydative egenskaper. Disse gruppene vil sannsynligvis ha kandidater med aktivitet som virker mot utvikling av tumorer og eksport av metastaserende celler.

Dersom kloning er en viktig del av utviklingen av arteriosklerose, som mange tror, vil profylaktisk behandling være forventet å være effektiv. Plakk som er større enn en viss størrelse er ikke antatt å reagere fordi midlet vil hemmes av den anti-klonale effekten som skyldes lokal opphopning av lignende celler. Dersom HSV (Herpes simplex) er involvert, kan 4-OH-OPB allikevel være effektiv overfor større plakk siden midlet besitter en anti-viral effekt (eksperiment nummer 1 la,b og 12). Dette er en spekulering som trenger verifikasjon.

Også benigne svulster ellers, for eksempel i huden (nevi, vorter, café-au-lait flekker, aldringsvorter etc.) kan være sensitive. Sykdommer som har øket mitoseaktivitet, som psoriasis, er antatt å kunne dra nytte av behandling.

Sera fra pasienter med Down's syndrom vil bli testet for å se om vekststimulering av kloner kan bli forskjellig fra normale menneskers. Dersom klonestimuleringen er forandret i disse sera, kan det kanskje forklare hvorfor disse menneskene har mindre forekomst av arteriosklerose og høyere forekomst av Alzheimers sykdom.

I litteraturen ble stoffet 1-1-dimetylhydrazin som øker utviklingen av plakk i Jerne's test (se eksperiment nr. 10) rapportert å ha carcinogen effekt. Derfor er det sannsynlig at også andre stoff med lignende effekt i Jerne's test eller andre klonale tester kan ha kreftstimulerende effekt.

Visse 4-hydroksy-3,5-diokso-pyrazolidiner er beskrevet i litteraturen for behandling av HIV infeksjoner og noen andre virale infeksjoner, tropisk spastisk paraparese, autoimmune sykdommer, transplantatavstøtning og spesielle svulster som Sezary syndrom, mycosis fungoides, T-celle lymfom og Kaposis sarkom. Eksemplet som er brukt i de beskrevne eksperimentene er 4-OH-OPB, som er 4-butyl-4-hydroksy-2(p-hydrokdyfenyl)-l-fenyl-3,5-pyrazolidinedion- med den generelle formel: hvor Ra - Rd defineres som i tabellen nedenfor:

Immunsuppressive og anti-neoplastiske medikamenter som er tilgjengelige kan ha hemmende effekt på tumorcellenes klonabilitet og kanskje også hemme metastatisk migrasjon. Økt lokal celletetthet kan imidlertid delvis eller helt nøytralisere effekten på klonabilitet dersom substansene har lav toksisitet. Denne kunnskapen er sannsynligvis meget viktig ved pasientbehandling, spesielt når det gjelder slike med ondartet svulst. Siden de fleste cytotoksiske medikamenter brukt mot kreft også er antatt å ha en mindre eller større effekt mot klonal vekst, er det muligheter for å finne egnede kandidater blant disse som kunne bli brukt i reduserte, mindre toksiske konsentrasjoner over lengre tid og gi effekt som beskrevet for klonehemmere.

Derfor kan substanser som det er gitt eksempler på i det følgende bli potensielle kandidater og vil bli testet ved hjelp av metodene i oppfinnelsen i oppfinnerens laboratorium.

Immunosuppressive medikamenter

De non-steroide anti-inflammatoriske eller anti-reumatiske midlene har i flere tilfeller blitt funnet å beskytte mot utviklingen av maligne svulster.

Oppfinneren antar at i mange tilfeller vil medlemmer av gruppen som innehar en slik aktivitet også vise kloneinhibisjon med hemning av denne i lokalt celletette områder, siden toksisiteten vanligvis er lav.

Ved testing vil det være naturlig å inkludere test for hemning av metastatisk migrering. Slik kunnskap vil sannsynligvis være av betydning ved pasientbehandling, spesielt av dem med malign lidelse.

Anti-inflammatoriske og anti-reumatiske midler unntatt steroider

Eksperiment nummer 1

(Se figur 1)

Agarkonsentrasjonen som ga vekst av polyoma virus transformerte baby hamster nyre celler (BHK21/cl3) har blitt testet. Det var viktig å finne den agarkonsentrasjonen som ga vekst av cellelinjen etter transformasjon med polyoma virus, mens de normale, ikke transformerte, ikke kunne vokse.

Det var ingen signifikant vekst av normale BHK21/cl3 celler i agar 5 dager etter utsæd av 600000 celler i 0,3 ml bløtt agarose topplag (Sigma type IX ultra-low gelling temperatur) i brønner av Falcon 24 brønners vevskultur plater. Bunnlaget besto av 0,6 ml av 1,65 % av den samme agarosen. Polyoma virus transformerte BHK21/cl3 celler viste imidlertid vekst i 0,8 % agarose, ikke i 1,2 %. Dette er i overensstemmelse med funn gjort av MacPherson I og Montagnier L (1964).

Eksperiment nummer 2:

Dose respons av kloneinhibitoren 4-OH-OPB i agarkultur med cellelinjen S100T1 som er polyoma virus transformerte BHK21/cl3 celler.

(Se Figur 2)

Omkring 400000 celler av S100T1, den polyoma virus transformert BHK21/cl3 cellelinjen, ble sådd ut i 50 ml Falcon sentrifugerar i 1 ml medium med 1,5 % Sigma type IX, ultra-low gelling temperatur agarose og RPMI1640 med 2,8 % FBS and 0,22 % Mito+. Toppmedium ble ikke tilsatt.

4-OH-OPB: Final konsentrasjon var fra 500 til 3000 nM.

Etter utsæd og blanding ble rørene plassert i kjøleskap i 1 time for å stivne den "ultra low melting point" agarosen.

Eksperimentet ble stoppet etter 3 dager i inkubator.

Resultat etter 3 dager:

Konklusjon:

Dette eksperimentet viste klart en hemning av klonevekst av 4-OH-OPB i en konsentrasjon av 500 nM eller høyere. Tidligere viste 300 nM ingen hemning. Veksten av den ubehandlede kontrollen var signifikant, men liten. Årsaken kan være den relativt høye agarkonsentrasjonen i dette eksperimentet. Se bilder nedenfor.

Eksperiment nummer 3:

Vekst av normale baby hamster nyreceller (BHK21/cl3) i agar medium med kondisjonert medium, insulin eller serumspareren Mito+.

(Se Figur 3)

Dette eksperimentet benyttet BHK21/cl3 celler dyrket i Falcon plater med 24 brønner. Hver brønn mottok 120000 celler utsådd i et topplag med 0,3 ml med 0,8% ultra low gelling temperatur agarose (type IX, Sigma). Dette laget ble plassert oppå 0,3 ml bunnlag med 3% av den samme agarosen. Mediet inneholdt Eagles MEM and RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS). Mediet ble tilsatt enten: 15 % kondisjonert medium (fra BHK21/cl3 kulturer), serumspareren Mito+ eller 0,1 i.u. Insulin Actrapid (Novo) eller med to eller alle tre i kombinasjon.

Det er observert vekst i alle brønnene som inneholdt 1,2 eller 3 av de undersøkte mulig vekststimulerende stoff. Bare brønner uten tilsetning bortsett fra serum i Eagles MEM viste ikke vekst. Det betyr at normale BHK21/C13-celler ikke vil vokse i agar dersom det ikke er ekstra vekststimulerende stoff tilsatt. Det at et lignende bløtt agar medium ikke ga vekst av normale celler ble først rapportert av MacPherson I and Montagnier L (Virology, Vol. 23 (1964) side 291-294).

Eksperiment nummer 4:

Stoffet 4-OH-OPB testet for mulig klonehemning av celler utsådd i bløt agar.

(Se Figur 4)

S100T1, polyoma virus transformerte BHK21/cl3 celler, ble utsådd i 1 ml bløtt agar medium i Falcon 50 ml sentrifugerar. Dette laget besto av 1 ml 1,1 % Ultra-low gelling temperatur agarose (Sigma, Type IX). På toppen av agarlaget ble det tilsatt 0,5 ml flytende medium. Det inneholdt kondisjonert medium fra BHK21/C13 kulturer, 2,8% føtalt kalveserum og 0,22% av serumspareren Mito+. Begge mediene inneholdt Eagles MEM, agar mediet også RPMI1640.

Resultater: Disse er sammenfattet i tabellen.

Konklusjon;

Selv etter 7 dager ble det ikke observert vekst i kulturer behandlet med 3jjM 4-OH-OPB noe som syntes å gi perfekt klonehemning.

Eksperiment nummer 5:

4-OH-OPB dose respons diagram ved overflatevekst av BHK21/cl3 (normal baby hamster nyrecellelinje) og disses polyoma-transformerte avkom, cellelinjen S100T1.

(Se Figurene 5-8)

Konklusjon:

Som vist i figurene behøves det omtrent 3 ganger høyere konsentrasjon av 4-OH-OPB for total hemning av veksten på plastoverflate av BHK21/cl3, den normale baby hamster nyrecellelinjen, sammenlignet med S100T1, de samme cellene etter transformering med polyoma virus.

Eksperimentet viste også at celletettheten er viktig for effekten av 4-OH-OPB. Ved avkortning av distansen mellom nabocellene synes å øke vekstpotensialet for klonene og å nedsette effekten av kloneinhibitoren 4-OH-OPB. Dersom det er tilfelle vil kloning av celler av samme slag som ligger lengst fra andre bli hemmet mest. Dette er i overensstemmelse med våre dyreeksperimenter som viser komplett hemning av Ehrlich ascites transplantert i bukhulen hos mus dersom musen blir behandlet straks. Behandling som begynner neste dag eller 3 dager etter transplantasjonen, etter at cellene har hatt sjansen til å dele seg, vil ikke kurere den maligne sykdommen selv om dosen øker omtrent 9 ganger i forhold til den minimale dose som var nødvendig for å helbrede tumorsykdommen når man startet straks.

Normale celler ble hemmet mindre av 4-OH-OPB enn de transformerte. Inhibisjon av naboceller er antatt å være mindre for transformerte enn for normale cellelinjer, men gjenstår å bli vist.

Eksperiment nummer 6:

Dose respons av 4-OH-OPB målt som nedsettelse av klonevekst i bløt agar av insulinstimulerte (Novo Actrapid) BHK21/cl3 (normal baby hamster nyrecellelinje) og av S100T1 (polyoma-transformert avkom av disse)

Målet med dette eksperimentet var å se om tilsetning av 4-OH-OPB virket forskjellig

dersom tilsatt etter utsæden av cellene i agar sammenlignet med umiddelbar behandling. Agarkulturer ble laget i 24 brønners Falcon plater. Hver inneholdt to agarlag på 0,3 ml. Bunnlaget inneholdt 1,75 % Sigma agarose, type II, A-6877 og topplaget 120000 celler i 0,8 % ultra low gelling temperatur Sigma agarose type IX, A-5030. Mediet inneholdt omtrent like deler Eagle og RPMI 1640 med 10 % FBS. Insulin (Actrapid, Novo) i en konsentrasjon av 0,1 i.u./ml ble bare tilsatt BHK21/cl3 cellekulturene.

S100T1 celler ble gitt 4-OH-OPB straks (2. kolonne) i tabellen nedenfor og ble sammenlignet med celler i den samme platen, se kolonne 3, som var ubehandlet.

Fotografert etter en dag: (Se Figur 9)

S100T1 celler ble gitt 4-OH-OPB straks (2. kolonne i tabellen) og ble sammenlignet med celler i den samme platen, kolonne 3), som var ubehandlet. Fotografert etter en dag:

(Se Figur 10)

BHK21/cl3 celler fikk 4-OH-OPB straks (2. kolonne) og ble sammenlignet med celler i samme plate, kolonne 3, som da var ubehandlet. Fotografert etter en dag:

(Se Figur 11).

BHK21/cl3 celler fikk 4-OH-OPB straks (2. kolonne) og ble sammenlignet med celler i samme plate, kolonne 3, som da var ubehandlet. Fotografi etter en dag:

(Se Figur 12)

S100T1 celler ble gitt 4-OH-OPB straks (2. kolonne) og etter 1 dag (3. kolonne) Kontroll uten behandling i kolonne 4. Fotografert etter 2 dager.

(Se Figur 13)

S100T1 celler ble gitt 4-OH-OPB straks (2. kolonne) og etter 1 dag (3.kolonne) Kontroll uten behandling i kolonne 4. Fotografert etter 2 dager.

(Se Figur 14)

BHK21/cl3 celler ble gitt 4-OH-OPB straks (2. kolonne) og etter 1 dag (3. kolonne). Kontroll uten behandling i kolonne 4. Fotografert 2 dager etter utsæd:

(Se Figur 15)

BHK21/cl3 celler ble gitt 4-OH-OPB straks (2. kolonne) og etter 1 dag (3. kolonne). Kontroll uten behandling i kolonne 4. Fotografert 2. dag etter utsæd.

(Se Figur 16)

Konklusjon:

• Bestemte brønner i to 24 brønners Falcon vevskulturplater fikk et fast bunnlag og et mykt topplag med agarmedium. Det myke laget fikk 120000 celler (enten BHK21/cl3 eller S100T1, polyoma virus transformerte BHK21/cl3). • Andre eksperimenter har gitt holdepunkter for redusert effekt av klonehemning av 4-OH-OPB dersom det utsådde celleantallet var høyt som i dette eksperimentet. • I en komplett undersøkelse for å finne nye midler bør også inngå utsæd av få celler i agartesten for å sammenligne og evaluere effekten av lokal celletetthet og toksisitet i agarkulturer. • Dersom behandling av S100T1 med 4-OH-OPB startet straks etter utsæd ble det funnet god klonehemning om konsentrasjonen av 4-OH-OPB var over 1 |^M.

Men en utsettelse av behandlingen i 24 timer ga bare en liten veksthemning selv med 30 |iM, en svært høy dose. • BHK21 /c 13 viste mindre hemning enn S100T1 celler ved samme 4-OH-OPB konsentrasjon. Fotografering etter 24 timer viste en liten, men signifikant effekt på klonehemning av 10 uM eller høyere når behandlingen startet straks. Etter 48 timer viste fotografier av kulturer behandlet ved utsæd mindre effekt av 10 \ xM 4-OH-OPB, men det besto fortsatt en effekt. • Dersom behandlingen startet først etter 24 timer ble det imidlertid ikke funnet noen effekt. Altså var det bare transformerte celler som viste en liten effekt dersom første behandling startet 24 timer etter utsæd. • Det er tydelig også fra dette eksperimentet at den transformerte cellelinjen S100T1 reagerte bedre på klonehemning med 4-OH-OPB enn den normale cellelinjen (BHK31/cl3) disse cellene kom fra. • Det andre funnet er at de cellene som har startet å danne kolonier ikke lengre er påvirkelige. • Det ble bare påvist ett unntak fra denne regelen: S100T1 hemmet av 30 |j.M med start dagen etter utsæd. Ved denne konsentrasjonen av 4-OH-OPB viste også små kolonier hemning av veksten. Dette kan indikere at det ikke er utelukkende enkeltceller fra S100T1 som kan hemmes dersom 4-OH-OPB dosen er høy nok. Men det var bare de transformerte cellene som viste denne responsen, ikke de normale cellene de transformerte kom fra.

Eksperiment nummer 7:

Musetest av 4-OH-OPB som behandling av mus transplantert med Ehrlich's muse ascitestumor.

Målet med dette eksperimentet var å se om 4-OH-OPB var i stand til å hemme eller stoppe veksten av en transplantabel musetumor, Ehrlich ascites.

Eksperimentet beskriver transplantasjon av de maligne cellene fra Ehrlich's muse ascites tumor til to voksne hanmus (NMRI/Bom). Hver av disse mottok 100000 celler intrapeirtonealt. En mus ble behandlet med intraperitoneale injeksjoner av 4-OH-OPB to ganger i uken. Etter 19 dager var den ubehandlede musen moribund og begge ble drept og undersøkt. Ingen svulst ble funnet i den behandlede musen. Den ubehandlede musen hadde imidlertid 250 millioner maligne celler i ascitesvæsken og en ert/bønnestor tumor i abdominalveggen hvor injeksjonskanylen var stukket inn under transplantasjonen.

Ehrlich ascites celler oppbevart i flytende nitrogen ble tint, vasket og suspendert i RPMI 1640 uten FBS (pH 6,9) i et volum av 1 ml med 100000 celler for hver mus.

Beregning av 4-OH-OPB dose:

Den behandlede mus hadde en vekt av 45,5 gram. Mengden av ekstracellulær væske er 45,5<*>20/70=13 g. For å oppnå 2,5 uM av 4-OH-OPB i 13 g trengs x ml av 20 mM oppløsning av 4-OH-OPB i DMSO. Utregning: 13 g <*> 2500 nM=20000000 nM <*> x. Løst med hensyn på x: x=l,62 ul.

Dersom 1,62 jj.1 blir løst i 1 ml celle suspensjon, vil konsentrasjonen bli:

2,5 uM<*>13ml/lml= 32,5 uM.

Cellene ble injisert 90 minutter etter tilsetningen av 4-OH-OPB til suspensjonen. Kontrollen mottok samme cellesuspensjon uten 4-OH-OPB.

Injeksjonsdatoer for 4-OH-OPB til behandlet mus:

8. januar var kontrollmusen fortsatt syk med utspilt abdomen og den var blek og hadde få bevegelser. I venstre fossa iliaca/venstre lyske var det en tumor av størrelse som bønne/ert.

Den behandlede musen var komplett normal uten noen palpable tumores eller tegn på ascites eller anemi. Musen var svært interessert i å unnslippe når lokket på buret ble løftet av.

Bilder (se nedenfor) ble tatt før og etter døden og etter åpning av abdomen og thorax. Seksjon viste ingen patologiske forandringer i den behandlede musen. Der var ikke væske i abdomen og ingen tegn til tumores i lunger, lever, nyrer, milt eller ellers i abdomen, thorax eller på kroppens overflate.

Men den andre musen hadde en utspilt abdomen full av hemorrhagisk ascites. Det var større ansamlinger av fibrinøst materiale subfrenisk og på omentene med erythrocytter og tumorceller. I venstre lyske/fossa iliaca var det en tumor, svarende til det stedet hvor injeksjonen av celler ble foretatt. Størrelse: ert/bønne, lappedelt, fast. Lever, nyrer og lunger var blekere enn i behandlet mus, klart som følge av stort blodtap inn i peritoneum. Ingen tumorinfiltrasjon i lever, nyrer milt eller lunger ble observert. (Se

Figurene 17 og 18.)

Konklusjon:

Det var ingen observerbar tumor eller ascites i musen som fikk behandling for transplantert Ehrlich carcinom i peritoneum. Denne musen viste også en komplett normal oppførsel.

Den andre, kontrollen som ikke fikk behandling, var anemisk og bevegde seg med vanskelighet i buret etter 19 dager. Den utviklede ascites inneholdt nesten en kvart milliard maligne celler og fibrinøst materiale flere plasser intrapeirtonealt. I tillegg hadde denne musen en relativt stor svulst i lyske/fossa iliaca regionen, stedet hvor tumorcellene ble injisert.

Dette eksperimentet viser at der er mulig at behandling med 4-OH-OPB er i stand til komplett å stoppe utviklingen av en malign tumor som ble transplantert til peritoneum. Men en endelig konklusjon kan ikke trekkes uten flere eksperimenter som omfatter "titrering" av parametere som midlets dose, tumorcelleantall og tid.

Eksperiment nummer 8:

Testing av mus som er transplantert med Ehrlich's muse ascitestumor og behandlet med 4-OH-OPB.

Målet med eksperimentet var å stadfeste at 4-OH-OPB er i stand til å stoppe veksten av den transplantable Ehrlich ascites tumor i mus. Videre ble det prøvd å finne den laveste aktive dosen.

Preparering av celler for injeksjon:

De frossede og tinte Ehrlich ascites cellene ble fortynnet i et volum av 1 ml RPMI (pH 6,9) for hvert dyr. Det skal helst ikke være serum i mediet siden musene kan bli immunisert og senere utvikle anafylaksi.

4-OH-OPB dosering:

Behandlede mus:

Vekten av musene er denne gangen omtrent 70 % av de musene som fikk 4-OH-OPB sist. Derfor reduseres celletallet til 7-80000 og det injiserte volumet til 0,8 <*> 0,7=0,56 ml.

Eksperimentet viser at det er mulig å stoppe utviklingen av ascites etter transplantasjon av Ehrlich ascites til mus dersom 4-Oh-OPB blir injisert to ganger i uken. Den estimerte konsentrasjonen ekstracellulært må være over 120 nM, her 370 nM eller mer for å være effektiv. Den første behandlingen startet med injeksjon av 4-OH-OPB i cellesuspensjonen 90 minutter før transplantasjonen.

Dersom terapien startet etter 24 timer eller senere med doser i abdomen på 36-38 jxM kom det utvikling av ascites eller ascites med solid tumor i tillegg. Men den neoplastiske utviklingen ble muligens noe hemmet sammenlignet med ubehandlet kontroll.

Eksperiment nummer 9

Undersøke 4-OH-OPB som behandling av mus transplantert med Ehrlich's muse ascites.

Målet for eksperimentet var å se om 4-OH-OPB kunne miste aktivitet ved transport gjennom blod til stedet for transplanterte tumorceller. I dette eksperimentet ble 4-OH-OPB injisert i peritoneum hos mus som ble gitt forskjellig antall Ehrlich celler i hvert av 6 subkutane steder.

Ehrlich ascites ble oppbevart i flytende nitrogen etter det første eksperimentet på mus i desember/januar 2001. Cellene fra ascites hos den ubehandlede kontrollmusen ble da frosset på serum med 10 % DMSO. Cellene ble tint i vann ved 37°C, fortynnet i serum og pelletert ved lav sentrifugehastighet etter tilsetning av 2 ml FBS for å fjerne DMSO. Preparering av celler for injeksjon:

Cellene ble fortynnet i et volum av 0,6 ml RPMI (som hadde en pH omkring 6,9) til hvert dyr. Intet serum ble tilsatt.

Nummer 2, den ubehandlede kontrollen ble injisert med samme antall av tumorceller, men hadde mange maligne celler i væsken. (Se Figurene 21 og 22.)

Konklusjon:

Eksperimentet var påtenkt å finne om 4-OH-OPB injisert intraperitonealt kunne bli transportert gjennom blod til de transplantable tumorcellene som ble injisert subkutant. • Doseringen av kandidatmidlet 4-OH-OPB var meget høy i en mus. Organene i peritoneum som lever, milt og muligens nyrene ble affisert. Organene i thorax ble ikke makroskopisk affisert, men dyret døde av haemorrhagisk effusjon i thorax, sannsynligvis som et resultat av samme toksiske reaksjon som produserte lignende væske i peritoneum. • Men denne musen var den eneste som hadde to tumores i abdominalveggen svarende til stedene for injeksjon av 6250 og 31250 Ehrlich ascites celler. De to musene som mottok mindre doser av midlet hadde bare en tumor og kontrollen som ikke fikk 4-OH-OPB hadde ingen slik tumor på injeksjonsstedet. • Årsaken til dette kan være at veksten av solide svulster, men ikke ascites, ble stimulert av behandlingen. • Det eneste dyret som fikk virkelig Ehrlich ascites var kontrollen, men den var den eneste uten medisinering. Ingen av de andre fikk ascites. • Siden kontrollen viste utvikling av ascites også etter at ingen celler hadde blitt injisert i peritoneum, må cellene ha blitt transportert til peritoneum fra injeksjonsstedet. Det kan indikere at ved å gi dyrene 4-OH-OPB reduserte det eksporten av Ehrlichceller fra injeksjonsstedene til peritoneum. Dersom dette er tilfelle vil en redusert eksport av celler øke antallet celler i de primære injeksjonsstedene sammenlignet med ubehandlede kontroller. Dersom det lokale celletallet når verdier over den grensen som er nødvendig for utvikling av lokal tumor, vil solide svulster kunne utvikles lokalt.

Den påståtte retensjon av celler på injeksjonsstedene vil øke "collocation" eller den lokale celletetthet i forhold til hos ubehandlede. En høynet lokal resistens som følge av dette mot 4-OH-OPB vil så gjøre tumores mulig, spesielt på injeksjonssteder som inneholder mange celler. Dette er allerede observert i dette eksperimentet.

Dersom dette er tilfelle vil 4-OH-OPB inneha en annen egenskap i tillegg til å hemme kloning. Denne tilleggseffekten er en hemning av metastatisk eksport av injiserte maligne celler fra injeksjonsstedet til det stedet hvor tumorcellene åpenbart foretrekker å vokse, peritoneum. Videre synes denne hemningen av metastatisk eksport av celler ikke å reduseres av høy lokal celletetthet. • Denne effekten sammen med klonehemning og nedsettelse av klonehemning av 4-OH-OPB som skyldes høy lokal celletetthet av tumorcellene, var komplett ukjent før eksperimentet ble gjort. • Når man tester kandidatmidler mot kreft må test for hemning av metastaseeksport inkluderes for at det skal bli en full evaluering av hver kandidat. • Det vil bli forsøkt å verifisere disse funn og synspunkter gjennom flere eksperimenter.

Eksperiment nummer 10:

Ehrlich ascites transplantert til peritoneum hos mus som ble behandlet med 4-OH-OPB injisert subkutant.

Immunisering av mus som har blitt behandlet med 4-OH-OPB 1-2 måneder forut og nå samtidig med immuniseringen.

Oppsett: 4 mus, hvite Bom/NMRI:

Midlet som ble testet i dette eksperimentet er 4-OH-OPB. Det hemmer Ehrlich ascites dersom det injiseres sammen med cellene i peritoneum i en konsentrasjon av 4 uM eller høyere. LD50 kan være omkring 200 mM i ekstracellulær væske (kalkulert som 2/7 av dyrevekten). Derfor er det langt igjen før toksisitet skulle forekomme.

Injeksjon 20. mars 2002. De subkutane injeksjonene ble utført først og dernest intraperitoneale injeksjoner som hver gang startet på nr. 1 og endte på nr. 4. Tidsdifferensen mellom nr. 1 og 4 var ca. 15-20 minutter for transplantasjonen og omtrent den samme for medikasjonen.

Den intraperitoneale injeksjonen av Ehrlichceller ble gitt litt utenfor det infiltrerte området fra samme side og mer distalt.

Oppløsningene ble preparert omtrent en time før behandling. 4-OH-OPB batchen brukt var 060/56A fra Syntagon.

Dersom mus nr. 3 er beskyttet vil tilsvarende dose hos menneske på 70 kg kunne beregnes slik: Mus 4; 31,3 g mottok 8,76 ul av 20 mM 4-OH-OPB i DMSO. Dette volumet, 8,76 ul inneholder 6,808 mg/ml<*> 0,00876 ml= 0,0596 mg per dose til musen. (1 M=340,4 mg/ml, 20 mM=340,4mg/ml <*> 0,02=6,808 mg/ml) 70 kg menneske: 0,0596 mg/31,3 g <*> 70000 g=133 mg.

Dette svarer til 19,3 uM dersom oppløst i ekstracellulær væske, 2/7 av totalvekten

(20000 uM <*> 8,76 ul=x <*> 31300ul <*> 2/7, x=19,3 uM)

Til sammenligning: (se fil mi-in3sd side 40) 4,7 uM 4-OH-OPB er effektiv dersom injisert direkte inn i peritoneum ved transplantasjonen.

Dersom 200 mg gir omtrent 2 uM i ekstracellulær væske må dosen heves til omkring: 200mg <*> 19/5 uM = 760 mg

Da var alle dyrene friske og det vil bli utført seksjon til slutt. De ble veid og undersøkt for om det fantes svulster. Ingen ble funnet.

Miltene ble fjernet og omtrent halvparten ble knust med 0,5 ml Eagle's MEM for ekstrahering av miltceller som ble sådd ut i bløt agar på toppen av solid agar i Petriskåler med 8,5 cm i diameter.

Dyrene ble drept ved cervical dislokasjon den 21.05.02 og miltene ble straks lagt i kald Eagle's medium for transport. Det gikk omtrent 5 timer før agarskålene ble ferdige for inkubering i 5 % CO2 og 37°C. Men de to første skålene ble for bløte i topplaget. Etter 1-2 timers inkubering inneholdt begge mange plakk som var vanskelige å telle. Derfor ble det laget nye skåler den neste dagen med mindre antall celler fra de to siste halvpartene av de to første musenes milter.

• Konklusjon:

• Den minste dosen av 4-OH-OPB forandret ikke signifikant det påviste antallet av plakk som ble dannet av musemilt etter immunisering med fåreblodlegemer.

• Men middels'og høye doser av 4-OH-OPB reduserte antallet signifikant.

• De to plakkene som ble sett i skålen fra det 4. dyret behøver ikke å være absolutt sikre plakk. Derfor er det en mulighet for at store doser destruerer eller inaktiverer alle tidligere naturlig forekommende celler med aktivitet mot de røde blodlegemene. • Dernest har vi nå bevis for at 4-OH-OPB kan bli transportert til et organ som inneholder mange erytrocytter og at det produseres biologisk effekt i dette organet. Men mengden av 4-OH-OPB som blir transportert og mengden som er blitt borte på samme tid er ikke lett å estimere ut fra disse resultatene.

Obduksjoner: Musene ble obdusert og ingen tumor eller ascites eller andre suspekte væsker ble funnet. Nummer 3 hadde 0,15 ml blod i thorax etter cervikal dislokasjon. Ingen suspekte celler ble funnet i blodet før eller etter haemolyse av røde blodlegemer.

Musevekt i gram før og etter eksperimentet med graderte doser 4-OH-OPB/30 g musevekt:

(Se Figur 23)

Dyrene ble behandlet med 4-OH-OPB samtidig med injeksjon av røde blodlegemer.

(Se Figur 23). I tillegg hadde dyrene blitt behandlet med 4-OH-OPB i samme dose to ganger ukentlig i en måned. Men de siste 26 dagene før den siste dosen var det ikke blitt gitt behandling.

Grunnen for å gi behandling med 4-OH-OPB de første fire ukene var for å se om det ville virke inn på virkningen av transplanterte Ehrlich ascites celler som ble injisert i starten av eksperimentet. Men disse cellene ville ikke slå an og affiserte selv ikke den ubehandlede kontrollen. Musene som var uaffiserte og friske fikk så sin siste biomarkør, de røde fåreblodlegemene sammen med sin siste dose 4-OH-OPB.

Eksperiment nummer lia:

Dersom Herpes virus er sensitivt overfor 4-OH-OPB kan en salve eller liniment som inneholder stoffet være effektive mot utslettet.

Testing av HSV1 mot 4-OH-OPB.

Denne muligheten bør bli undersøkt siden innsatsen før markedsføring kan bli vesentlig mindre enn om stoffet skulle tas inn.

Oppsett:

RK13 celler og HSV1 ble mottatt fra Hoddevik,. Virus ble oppbevart i -75°C. Virus merket HS1 KBR-stock, s:NN v:11252 Vero 81 h:231092 Cytopathogenitet etc. avlest 14. mai

Fortynninger:

Medium: Eagle med 5 % FBS.

Viruset ble ikke fortynnet. AV-1101 er fortynnet i et volum av 50 ul: ul medium i hver brønn:

50 ul AV-1101 til hver brønn, fortynningene merket som medium/AV 1101, 20 mM i DMSO ble fortvnnet 1/10 i medium:

AV-1101: 20 mM fersk løsning i 0,68 ml DMSO. Før tilsetning til celler fortynnet i 1/10 medium, så fortynnet som angitt i tabellen ovenfor.

Titrering av rekken som ble utsådd med 1000 ni HSV 15. mai og avlest 16. mai:

Konklusjon:

10 uM AV-1101 synes nødvendig for å kurere infeksjonen i cellekultur. Titrene av HSV i de ubehandlede kulturene atskiller seg ikke fra de brønnene som har fått mindre 4-OH-OPB etter avlesningen etter 4 dager. En salve vill kunne være i stand til å gi denne konsentrasjonen i hudceller med infeksjon.

Eksperiment nummer 11b: Nytt eksperiment for å se om Herpes virus er sensitivt overfor AV-1101

Denne mulighet trenger å bli kontrollert siden det siste eksperimentet viste en hemning som startet på 10000 nM med AV-1101. Inokulatet ble ikke fjernet siste gang før man foretok titreringen. Denne gangen fjernes mediet på kulturene dagen før titrering. Oppsett: RK13 celler og virus ble mottatt fra Hoddevik. Viruset ble lagret i -75°C og ble frosset 13. mai ved -20°C. Det ble tint like før utsæd.. Virus merket: HS1 KBR-stock, s:NN v: 11252 Vero81 h:231092

Avlesningen av infiserte kulturer ble foretatt dagen etter utsæd (22. mai), men viste bare små forandringer. Da ble mediet fjernet og erstattet med nytt.

Celler: RK13 fraNIPH.

Cytopathogenitet etc. avlest 23. mai,:

Denne gangen er ld 100 % degenerasjon. lg= 100 % konfluens i bunnen.. Fortynninger:

Medium: Egale med 5 % FBS.

Ufortynnet virus tilsatt. AV-1109 ble fortynnet i 50 ul volum: og tilsatt ved utsæd:

50 ul AV-1101 i hver brønn, fortynninger vist som medium/AV-1101, 20 mM i DMSO ble fortynnet 1/10 i medium:

AV-1101: 20 mM ble laget i 0,68 ml DMSO 8 dager før eksperimentet. Før tilsetning til forsøket ble løsningen fortynnet 1/10 i medium og titrert bakover som vist i tabellen ovenfor.

0 Titrering avlest to dager etter utsæd av rekken som fikk 2000 ni HSV pr.brønn23. mai. Avlest 26. mai:

Avlest 27. mai, se tabell nedenfor:

Konklusjon:

Denne gangen er hemningen 10 ganger bedre enn gangen før. Forskjellen fra første gang var at dagen etter infisering av cellekulturer tilsatt forskjellige mengder 4-OH-OPB ble mediet skiftet for å fjerne inokulatet av HSV. I tillegg ble de originale HSV 1 infiserte og behandlede kulturene inkubert en dag mer, i 48 timer. Produksjonen av virus ble så målt ved titrering i 4-fold fortynninger. (Se Figur 24).

Resultatet av denne titreringen viste en mye bedre hemning enn før. 1000 nM hemmet godt. Dette betyr at AV-1101 inkorporert i en salve ville ha god sjanse til å produsere konsentrasjoner i epitelcellene høyere enn 1000 nM.

Det betyr at AV-1101 i en salve har god sjanse til å produsere en konsentrasjon høyere enn 1000 nM i epidermale celler. Det vil være viktig med videre studier for å se om den kjemiske aktiviteten er varig. DMSO er vist å beskytte AV-1101 og sur pH er også viktig for stabiliteten og god for huden. Men DMSO kan ha en dårlig lukt og et annet oppløsningsmiddel trengs.

Dernest bør dyreforsøk overveies utført dersom adekvate hudlesjoner kan induseres i forsøksdyr. Kaniner, marsvin og mus er mottakelige for hudinfeksjoner.

Eksperiment nummer 12:

Et eksperiment for å undersøke om Herpes virus 2 er sensitivt overfor 4-OH-OPB.

Det er viktig at dette blir undersøkt siden de to siste eksperimentene som benyttet HSV1 viste en hemning ved konsentrasjoner mellom 1000 nM og 10000 nM av 4-OH-OPB. De beste resultatene ble oppnådd dersom viruset ble fjernet før titreringen. Også denne gangen er det foretatt fjerning av medium og inokulat dagen før titrering.

Oppsett:

RK13 celler og HSV2 ble mottatt fra dr. Hoddevik. Virusmerking: HS2 12225, bruksstock på HE. 30.5.95. Virus ble oppbevart i -75°C, det ble tint og brukt til infeksjon av en 75 cm<2> flaske med RK13 celler. Etter anslag som omfattet nesten alle cellene i flasken ble innholdet nedfrosset dagen før eksperimentet startet.

Avlesning av infiserte kulturer som ble smittet 24 timer forut, er vist i tabell nedenfor. Mediet ble fjernet og erstattet av medium som inneholdt Eagles MEM og 5% FBS.

Fortynninger ved infeksjon med forskjellige mengder HSV2:

Medium: Eagle with 5% FBS.

Ufortynnet virus tilsatt etter tining. Medievolumer før AV-1 lOlble fortynnet i 50 ul volumer, 23. juni. :

50 ul AV-1 lOlble tilsatt hver brønn, fortynninger angitt som medium/AV-1101, 20 nM i DMSO fnrtvrmtet 1/10 i medium :

AV-1101: 20 mM i 0,68 ml DMSO ble laget 26. juni 2002. Før tilsetningen til celler fortynnet 1/10 i medium, deretter titrert baklens i medium som indikert i tabellen ovenfor.

Cytopatogenitet etc. avlest 24. juni:

Denne gangen angir ld 100 % degenerasjon. lg= 100 % dekning av bunnen. Titrering av rekken som er utsådd med 2000 ni HSV 25. juni. Avlest 26. juni:

(Se Figur 25)

Konklusjon:

Herpes type 2 infeksjon i kulturer behandlet med 4-OH-OPB viste hemmet produksjon av HSV2 for konsentrasjoner over 100 nM. Ved 3000 nM er hemningen knapt 3 log etter inkubering av titreringen i 3 dager. Maksimal hemning opptrådte etter behandling med 30 uM og var minst 5,5 log.

HSV er en hyppig årsak til herpes genitalis, og burde kunne behandles med salve eller annen ekstern behandling som inneholder 4-OH-OPB. Ingen signifikant forskjell ble funnet mellom hemningen oppnådd ved behandling av kulturer med HSV1 eller HSV2. Det burde være mulig å få salve eller liniment testet hos mennesker med HSV2 infeksjon.

Eksperiment nummer 13:

Kolchicin og 4-OH-OPB som hemmere i en tetthetsgradient av BHK21/cl3 S100T1 celler i agarkultur.

Oppsett:

Agarkonsentrasjonen i dette eksperimentet er satt til 0,8 % (ultra low gelling temperature, Sigma). Hensikten med eksperimentet er å se om tilsetning av 4-OH-OPB og Kolchicin virker på lignende måte ved tilsetning til BHK21/cl3 S100T1 celler i agar. Dersom dette er tilfelle kunne man kanskje oppnå anticancer effekt in vivo med et medikament (Kolchicin) som er i bruk hos mennesker ved andre lidelser. Det neste mulige mål skulle være å se om celler som er sådd ut i en tetthetsgradient i agar kunne gi en direkte demonstrasjon av forskjellig veksthemning i regioner med høy eller lav celletetthet etter tilsetning av hemmere som 4-OH-OPB eller Kolchicin.

Agar med celler:

Celler: Polyoma virus transformerte BHK21/cl3, S100T1, ble dyrket på 75 cm<2> flasker i Eagle's medium med 5 % føtalt kalveserum. Cellelaget i kulturene ble vasket med en blanding av like deler versene 2 mM og trypsin 0,25% og så behandlet med 1,5 ml av den samme blandingen i 16 minutter i 37°C inntil cellene ble totalt atskilt fra hverandre. Føtalt kalveserum (0,7 ml) ble tilsatt til hver høsting. Etter sentrifugering ble supernatanten kastet og cellene ble slemmet i 1 ml FBS. Cellene lå enkeltvis.

Det ble benyttet Falcon vevskulturbrett med 24 brønner:

De transformerte cellene i dette eksperimentet fikk ikke insulin siden eksperimenter ikke tilsier at det er behov for dette når cellene er transformert med polyoma virus. I dette eksperimentet ble 193000 celler tilsatt til hvert topplag i den blandingen av bløt agar som er beskrevet her. Så ble topplaget tilsatt mer av samme agarblanding uten celler. Denne tilsetningen ble utført fra samme side av brønnen for å lage en celle tetthetsgradient. Alt ble gjort før topplagets agar ble stivnet i kjøleskap.

Agar lag: Ultra-low gelling temperature agarose (Sigma A-2576, Lot 19H0821) i dobbelt destillert vann. Konsentrasjoner er angitt ovenfor og hvorledes de ble fremstilt og fortynnet.

Sigma agarose, type II, A-6877 lot 49H0380 ble brukt i dette eksperimentet som bunnlag med 1,76 %.

Før tilsetning av 4-OH-OPB ble platene satt i 5 % CO2 atmosfære og i kjøleskap i 45 minutter for å stivne topplaget med agar. Deretter ble brettet plassert på benken i 2,5 timer før 10 ul av en bestemt fortynning av hemmeren ble tilsatt i midten av topplaget. Kontrollen fikk ikke hemmer. Etterpå ble brettet satt i 37 graders inkubator.

Den finale fortynningen ble oppnådd ved overføring fra skyggebelagte "brønner" med initial fortynning ble overført til korresponderende skyggebelagte brønner med final fortynning i samme kolonne i et volum av 10 ul til totalt medievolum 200 ul, unntatt # som fikk 3 ul fra den siste initiale fortynningen.

Tredje dag ble det tatt bilder av de 6 brønnene. Det er tydelig at bare kontrollen viser klonevekst i en viss avstand fra den sentrale cellemassen. Denne sentrale massen syntes å vokse omtrent like fort i alle brønnene. Eksperimentet var utført på en måte som ga en celletetthets gradient. Hvor det var flest celler viste alle omtren den samme veksthastigheten. Men forskjellen var tydelig hvor celletettheten var lav.

Konklusjon:

Dette eksperimentet viser at:

c) De dosene som er benyttet av Kolchicin og 4-OH-OPB hemmer ikke veksten i områder med høy celletetthet. d) Kolchicin og 4-OH-OPB vil hemme veksten i områder med lav celletetthet selv med de laveste dosene som er benyttet. e) Cellekultur og dyreeksperimenter som det henvises til i denne søknaden viser at høy lokal celletetthet nedsetter eller blokkerer den veksthemmende virkningen

av 4-OH-OPB. Dette er også tilfelle I dette eksperimentet. Men i det samme bildet er det demonstrert full hemning av tynt utsådde celler. Dette er sannsynligvis også en god illustrasjon av hva som er vist angående metastatisk eksport av celler fra område med mange slike celler. Påvirket av klonehemmere som 4-OH-OPB eller Kolchicin er ikke enkeltceller i stand til å vokse dersom de befinner seg på en viss avstand fra hovedmassen av celler.

f) Denne "perifere" veksthemningen er hva som er nødvendig for å stoppe metastasering fra voksende maligne celler. Og høy lokal celletetthet i et område

vil ikke affisere effekten bare en kort avstand utenfor. Dette har også blitt verifisert i andre eksperimenter i dette skrivet når det ble benyttet 4-OH-OPB.

Eksperiment nummer 14

Effekt av celletetthet på klonevekst av MT4 celler som blir hemmet av 4-OH-OPB.

Spørsmål:

1. Er det en celletetthet som det ikke nytter å gå under for å få vekst?

2. Vil 4-OH-OPB virke forskjellig på klonevekst i områder med lav celletetthet sammenlignet med områder som har høy celletetthet?

Oppsett: Kryssfortynning av celler (MT4 dyrket på Gibco's føtale bovine serum., Katalog nr. 10106-169, Lot nr. 40F5426F) og 4-OH-OPB (Syntagon):

Fortynningene i nederste rekke ble foretatt i Falcon vevskulturbrett med 4x6 brønner ilO-fold steg.

Fortynningene av 4-OH-OPB ble foretatt minutter før bruk fra 20 mM stokk-løsning i 10 uM og 3 uM fortynninger ble foretatt først og hver av disse ble videre fortynnet i 1/10 steg.

Konklusjon:

Svaret på det første spørsmålet: "Er det en celletetthet som det ikke nytter å gå under for å få vekst?" er ikke så lett å gi ut fra disse data siden vi sannsynligvis ikke har ventet lenge nok på vekst av celler i brønner med mindre enn 5000 celler. Men det er sannsynligvis mindre sannsynlig av disse få cellene er i stand til å danne kolonier enn de som er utsådd med høyere celletall.

Det siste spørsmålet: "Vil 4-OH-OPB virke forskjellig på klonevekst i områder med lav celletetthet sammenlignet med områder som har høy celletetthet?" vil nå bli behandlet: Den laveste dosen av 4-OH-OPB som hemmer veksten av kloner av MT4 celler i en cellekultur med flytende medium ble funnet. Konsentrasjonen av 4-OH-OPB som hemmet kolonivekst var omtrent 2 log mindre i MT4 kulturer med 5000 celler enn i kulturer med 500000 celler. Forklaringen på dette er sannsynligvis ikke at hver celle trenger en viss mengde 4-OH-OPB som må bindes til postulerte reseptorer på cellen for å få full klonehemning siden det i agarkulturer som utsåes med celler som er gradientfortynnet vil opptre sterkere hemning i områder med minst cellefortynning. Dette eksperimentet viser en nær lineær korrelasjon mellom 4-OH-OPB konsentrasjonen og antall celler i dobbelt logaritmisk skala. Fra dette eksperimentet alene synes det logisk å konkludere at mange celler er i stand til å depletere mediet for 4-OH-OPB. Med få celler i kulturen vil kanskje hver celle få mer inhibitor enn dersom der er mange celler i kulturen. Men der er både dyre- og cellekultur-eksperimenter som indikerer en annen konklusjon.

Som nevnt ovenfor viste slike eksperimenter at kulturer med celler som er utsådd i tetthetsgradient i agar signifikant klonehemming ved bruk av 4-OH-OPB bare i områder med få celler, ikke i områder med mange celler. Siden det er antatt at innen den samme kulturen må tilgangen til 4-OH-OPB være lik for alle cellene, må den mest sannsynlige forklaringen være at cellene i tynt utsådde områder er mer sensitive overfor 4-OH-OPB enn cellene i tettere utsådde områder.

Resultatene av dyreeksperimenter blir også tatt i betraktning her. Disse eksperimentene viste at inokulatet som besto av enkle tumorceller kunne danne aggregater like etter transplantasjonen eller de injiserte tumorcellene kunne danne aggregater like etter transplantasjonen eller de injiserte tumorcellene ville kunne bli så konsentrerte at antiklone-effektene av 4-OH-OPB-behandling opphørte. Under slike forhold kunne Ehrlich svulsten være i stand til å fortsette veksten og til slutt drepe dyret.

På den andre siden vil ikke et stort antall av andre celler i nabolaget til enkle tumorceller som er transplantert til et dyr utøve den samme nøytraliserende effekten overfor 4-OH-OPB's virkning på tumorcellene.

På dette tidspunkt synes denne hypotesen å være riktig:

En påvirkning mellom tumorceller som følge av nær kontakt vil kunne hemme den antiklonale effekten av 4- OH- OPB. Dersom distansen mellom tumorcellene øker antar man at det kan ventes en svakere interaksjon mellom disse cellene. Til og med dersom mange andre normale celler, som er ubeslektet med tumorcellene, er til stede i samme område vil effekten av 4- OH- OPB ikke oppheves.

Slik vil interaktive effekter mellom beslektede celler i nær kontakt ed hverandre blokkere postulerte cellereseptorer for 4- OH- OPB.

(Se Figur 27).

Eksperiment 14

(Se Figur 28)

Eksperiment nummer 15

Screening av ikke steroide anti-inflammatoriske medikamenter (NSAID'er) eller andre potensielle medikamenter for antiklone effekt ved bruk av polyoma virus transformerte BHK21/cl3 celler, linjen S100T1, som vokser i bløtt agarmedium.

Spørsmål: Er der substanser andre enn 4-OH-OPB som har antiklone aktivitet? Vil de kunne finnes blant mitosehemmere, NSAID'er eller alminnelige smertestillende medikamenter?

Agarkulturer ble foretatt i brønner av Falcon 24 brønners vevskultur plate. Hver av disse inneholdt to agarlag på 0,3 ml. Bunnlaget inneholdt 1,75 % Sigma agarose, type II, A-6877 lot 49H0380 og topplaget med 3200 celler i 0,8 % ultra lav gelling temperature Sigma agarose type IX-A, A-2576 lot 19H0821. Mediet inneholdt både Eagle og RPMI 1640 med 10 % FCS.

Agar med celler:

Celler: De polyoma virus transformerte S100T1 cellene ble dyrket på 75 cm flasker med Eagles medium med 5 % føtalt kalveserum. Cellelaget i kulturflaskene ble skyllet med en blanding av like deler Versene 2mM og Trypsin 0,25 % og så behandlet med 1,5 ml av den samme blandingen i 30 minutter i 37°C inntil cellene var blitt totalt skilt fra hverandre. Føtalt kalveserum (0,7 ml) ble tilsatt til hver høstning. Etter sentrifugering ble supernatanten kastet og cellene ble slemmet i 1 ml FCS. Cellene var alle blitt enkeltceller. Hver brønn mottok 32000 celler. Brett: 24 brønners Falcon vevskultur brett mottok et bunnlag som var sammensatt som i

tabellen:

Neste tabell viser sammensetningen av topplaget med 0,8 % agar:

#: ultra low gelling temperature agarose type IX-A, Sigma A-2576, Lotl9H0821

Før tilsetning av 4-OH-OPB eller de andre stoffene ble platene satt i kjøleskap i en time for at topplaget skulle stivne. Kontrollen ble ikke tilsatt noe spesielt. Brettet avlest etter 14 dager:

Konklusjon:

4-OH-OPB hemmet klonal vekst i en konsentrasjon på 2 og 20 uM. I fremtiden vil også lavere konsentrasjoner bli testet.

Kolchicin hemmet ikke klonal vekst ved konsentrasjoner på 0,01-0,1 uM.

Diphenhydantoin hemmet ikke klonevekst signifikant ved en konsentrasjon på 10-100 uM.

Podofyllotoksin hemmet signifikant ved 0,3 uM, men det var fortsatt noen kloner der. Det var ikke signifikant hemning ved 0,03 uM.

Piroxicam hemmet tvilsomt ved 50 uM, men ikke ved 5 uM.

Diclofenac viste ikke signifikant hemning ved 10-100 uM. Men en sannsynlig signifikant økning i klonevekst ble observert ved 10 uM.

Ibuprofen viste ikke signifikant hemning ved 100 uM. Hemningen ved 1000 uM behøver ikke å være reell siden brønnen inneholdt 30 ul DMSO. Dette kan være toksisk (se neste eksperiment).

Naproxen hemmet signifikant ved 500 uM, men DMSO toksisitet kan være virksom som nevnt for Ibuprofen.

Acetylsalisylsyre inhiberte muligens signifikant, men ikke komplett ved 100 uM. Ved 1000 uM var hemningen komplett, men kan delvis skyldes DMSO som nevnt for Ibuprofen.

(Se Figur 29)

Eksperiment nummer 16:

Testing av medikamenter eller potensielle medikamenter for anti-klone effekt ved bruk av polyoma virus transformerte BHK21/cl3 celler, klonen S100T1, som vokser i bløt gar.

Spørsmål: Er det andre substanser enn 4-OH-OPB som kan ha antiklone effekt? Vil slike kunne finnes blant mitosehemmere eller NSAID'er eller alminnelige smertestillende medikamenter? Hva med Kolchicin som testet positivt før? Det var negativt sist. Også de andre som testet positivt tidligere skulle vært testet igjen. Celler: Den polyoma virus transformerte cellelinjen S100T1 ble dyrket på 75 cm flasker i Eagles medium med 5 % føtalt kalveserum. Cellelaget på dyrkningsflaskene ble skyllet med en blanding av like deler Versene 2 mM og Trypsin 0,25 % og så behandlet med 1,5 ml av den samme blandingen i 16 minutter i 37°C inntil cellene ble liggende helt enkeltvis. Føtalt kalveserum (0,7 ml) ble tilsatt hver høstning. Etter sentrifugering ble supernatanten kastet og cellene ble slemmet i FCS. Cellene var alle enkeltceller.

Agarlagene:

Agarkulturer ble fremstilt i brønner i Falconbrett med 24 slike beregnet på vevskulturer. Brønnene inneholdt to lag, hvert med 0,3 ml agar. Mediet inneholdt både Eagle og RPMI1640 med 10 % FCS.

Ultra-low gelling temperature agarose (Sigma A-2576, Lotl9H0821) ble brukt i topplaget og Sigma agarose, type II, A-6877, Lot 49H0380 i bunnlaget. Konsentrasjonene er angitt i tabellene ovenfor. Agarosen ble tilsatt til dobbelt destillert vann og oppløst ved oppvarming i mikroovn.

Før tilsetning av 4-OH-OPB eller de andre stoffene ble platene satt i kjøleskap i en time for at topplaget med agar skulle stivne.

Kontrollen mottok ikke noe med mindre det er angitt.

Konklusjon:

Tabell som sammenfatter hvilken signifikans resultatene har for Kolchicin ved avlesning etter 14 dager:

Denne tabellen viser klart at det kan være forskjeller mellom de to Kolchicinpreparatene.

Lot 60K1932 var ikke så effektiv og oppbevaring og frysing reduserte effekten ytterligere.

Det er mulig at terapeutiske doser av Kolchicin kunne hemme kloning. Men effekten er ikke så god som for 4- OH- OPB.

Etter 21 dager oppførte lot 60K1932 seg som ved avlesningen etter 14 dager. Men lot 28H1229 syntes å ha mistet noe aktivitet siste uke.

Signifikansen når det gjelder Podofyllotoksin-resultatene er sammenfattet i denne

tabellen etter avlesning etter 14 dager:

Oppbevaring nedfrosset i 8 dager reduserte ikke aktiviteten, men kan kanskje øke aktiviteten i stedet.

Dosering i et område som kan være terapeutisk viste en sannsynlig anti-klone aktivitet som ikke var så god som for 4- OH- OPB.

For Podofyllotoksin er signifikansen av resultatene avlest etter 21 dager sammenfattet i denne tabellen:

Oppbevaring nedfrosset i 8 dager kan kanskje nedsette aktiviteten i følge avlesning etter 3 uker.

Dosering i et område som kan være terapeutisk viste en mulig anti- klone aktivitet som ikke var så god som for 4- OH- OPB og mindre signifikant enn resultatene avlest etter 2 uker.

Signifikansen for resultater avlest etter 14 dager vedrørende Ibuprofen, Naproxen, Acetylsalicylsyre and 4-OH-OPB:

DMSO-konsentrasjonen ved undersøkelsen av stoff nummer 8 og 10 kunne, etter senere eksperimenter, interferere som klonal vekstinhibitor siden konsentrasjonene var omtrent 1 %.

Resultatene vedrørende nummer 9, Naproxen, kunne aksepteres som mulig signifikante siden konsentrasjonen av DMSO ikke overskred en kritisk grense.

Resultatene for de høyeste konsentrasjonene av Ibuprofen og Acetylsalisylsyre, kunne imidlertid ikke aksepteres siden DMSO kunne virke hemmende i seg selv. Men disse medikamentene viste mulig eller sannsynlig signifikant klone-hemning når de ble tilsatt kulturene i lavere konsentrasjoner.

Resultatene viste at Naproxen og Acetylsalisylsyre sannsynligvis hadde en kolonihemmende aktivitet ved dosering innen et område som kan være terapeutisk. For Ibuprofen og Naproxen var det mulig at samme aktivitet fantes. Kontrollen 4- OH- OPB var klart bedre enn noen av de andre.

(Se Figur 30)

Eksperiment nummer 17:

Verifisering av observasjoner angående de mitotiske inhibitorer Kolchicin and Podofyllotoksin som hemmer kloneveksten og introduksjon av Etoposide, et derivat av Podofyllotoksin.

Spørsmål: Hvor effektivt hemmer Kolchicin, Podofyllotoksin og dettes derivat Etoposide kloneveksten sammenlignet med effekten av 4-OH-OPB, og hvilken konsentrasjon av oppløsningsmidlet DMSO vil kunne virke inn på resultatene?

Oppsett:

Fortynninger, konsentrasjons:

#: Seriefortynninger: 20 ul ble tatt fra 20 mM DMSO oppløsning. Etter blanding med 180 ml medium 2 ul av denne fortynningen ble fortynnet videre ved å blande med 198 ul medium for å få en final fortynning av DMSO oppløsningen på 1/1000.

<*>: Til forskjell fra de andre som ble løst i DMSO som 20 uM, ble Etoposide oppløst i DMSO som 40 mM.

a; Mengdene og konsentrasjonene for lav, medium og høy konsentrasjon atskilt ved komma.

I de to tidligere eksperimentene var det benyttet omtrent 40000 celler pr. brønn eller 66666 celler pr. ml. I disse eksperimentene ble den initiale veksten hemmet mer enn antatt sammenlignet med andre eksperimenter. Derfor ville det sannsynligvis være bedre å benytte høyere celleantall pr. brønn. Omtrent 120000 celler pr. brønn som ble benyttet denne gangen er antatt å være mer optimalt.

Målet med eksperimentet var å se om tilsetning av andre stoff enn 4-OH-OPB hemmet klonal vekst i agar når tilsatt S100T1 celler, en polyoma virus transformert cellelinje avledet fra BHK21/cl3.

Agarkulturer ble anlagt i Falcon vevskultur brett med 24 brønner med to agarlag på 0,3 ml hver. Bunnlaget inneholdt 1,75 % Sigma agarose, type II, A-6877, Lot 49H0380 og topplaget 120000 celler i 0,8 % ultra low gelling temperature Sigma agarose type DC-A, Sigma A-2576, Lotl9H0821.

Agar med celler:

Celler: S100T1 celler som er polyoma virus transformerte BHK21/cl3 celler ble dyrket på 75 cm flasker i Eagles medium med 5 % føtalt kalveserum. Cellelaget i kulturflaskene ble vasket med Versene 2 mM og and Trypsin 0,25 % and så behandlet med 1,5 ml av den samme blandingen i 16 minutter ved 37°C til cellene ble totalt skilt fra hverandre. Til hver høstning ble det tilsatt 0,7 ml føtalt kalveserum. Etter sentrifugering ble supernatanten kastet og cellene ble slemmet i 1 ml FCS. Cellene lå fortsatt enkeltvis.

Før tilsetning av 4-OH-OB eller en av de andre stoffene ble platene satt i kjøleskap i en time for stivning av den bløte agaren på toppen.

Stoffene ble tilsatt til de forskjellige S100T1 cellekulturene i agar. Kontrollbrønner fikk ikke noen tilsetning eller DMSO i den ul mengde som er angitt i tabellen.

Cellepreparatet inneholdt ikke aggregerte celler etter å ha blitt trypsinert i 16 minutter og inneholdt litt mer enn 3,6 mill celler. Hver brønn fikk 144000 celler. Konklusjon: Ingen av de testede inhibitorer (Kolchicin, Podofyllotoksin, or Etoposide) hemmet klonal cellevekst så effektivt som 4-OH-OPB. Alle tre syntes å tillate veksten av noen få små cellekloner i sparsomt utsådde områder i agaren.

Etoposide syntes å ha den beste hemningen av celler i tett utsådde områder. Derfor kan dette være den beste kandidaten for kombinasjon med 4-OH-OPB i korte behandlingsperioder.

Det er kjent at Kolchicin tolereres i lengre perioder, en fordel dersom nødvendig for behandlingen.

Langtids toksisitet for Podofyllotoksin og Etoposide er kjent å være høy og stemmer med den signifikante veksthemningsom er funnet hvor det er høy celletetthet.

De testede vekstinhibitorene består av to grupper, inhibitorene som hemmer cellevekst både i områder med høy og lav celletetthet, podofyllotoksin-gruppen, og inhibitorer som bare hemmet klonal cellevekst i områder med lav celletetthet, 4-OH-OPB and Kolchicin.

Særlig for middels 4-OH-OPB konsentrasjoner er det god vekst av kolonier i områder med høy celletetthet, men ingen vekst områder med lav celletetthet.

Kolchicin hemmet ikke områder med høy celletetthet signifikant. Bare høye doser syntes å hemme veksten av celler signifikant i områder med lav celletetthet. Men i dette eksperimentet kunne man ikke observere komplett klonehemning i disse områdene.

Begge stoffene i Podofyllotoksin gruppen oppførte seg likt, vekst i områder med høy celletetthet ble hemmet signifikant, og områder med lav tetthet, som også viste veksthemning, viste ikke komplett veksthemning.

Disse funn tyder på at Podofyllotoksin eller Etoposide kan være toksisk overfor celler i områder med tett cellevekst. Dette er i overensstemmelse med kjent relativt høy toksisitet i kroppen. I tillegg hemmer de klonal vekst i områder med få celler, men sannsynligvis ikke komplett, noe som er nødvendig for en fullstendig kontroll med metastaser.

Testing av DMSO viste en omtrent uaffisert vekst opp til omtrent 1 % konsentrasjon i bløt agarkultur. 29,2 ul/700 ul eller 4 % hemmet dannelsen av kloner, men ikke komplett.

I situasjoner hvor kloner skal til å vokse fra enkeltceller eller fra oligocellulære klumper, noe man antar hender dersom effektiv anti-klonal behandling ikke er iverksatt, kan det være hensiktsmessig å kombinere 4-OH-OPB med Etoposide. Toksisiteten vil begrense Etoposids bruk til noen dager hver gang. Det er antatt at 4-OH-OPB vil kunne tolereres over mye lengre perioder.

Situasjonen for Kolchicin er ikke klar etter dette eksperimentet siden det er tvil om stoffets effekt på kloneveksten i sparsomt utsådde områder.

Når større tumores opptrer, enten palpable eller detektert ved røntgenundersøkelse eller lignende teknikker, er 4-OH-OPB sannsynligvis ikke å anbefale. Men 4-OH-OPB må antas å forebygge at metastatiske celler forlater tumor. Dette er spesielt viktig ved kirurgi, men kan bli av verdi også ved kjemisk behandling eller bestråling.

Eksperimenter på mus transplantert med Ehrlich's carcinom subkutant indikerte at eksporten av tumorceller fra tumorcelledeponiene stoppet når de fikk 4-OH-OPB. I tillegg vil denne behandlingen stoppe fremveksten av tumorceller som har rukket frem til fjerne organer.

Vil mus transplantert med Ehrlich carcinom i peritoneum kunne reddes selv om behandlingen starter dagen etter transplantasjonen dersom ikke bare 4- OH- OPB blir gitt til dyret, men en kombinasjon av Etoposide og 4- OH- OPB, det siste i en dose som ikke er effektiv alene?

Et kontrolldyr skulle motta en moderat dose av 4- OH- OPB dagen etter transplantasjonen for å stadfeste tidligere funn av manglende helbredelse.

Vil Kolchicin alene stoppe nedslag av transplanterte Ehrlich tumorceller dersom midlet blir blandet med de transplanterte cellene før de blir injisert slik det ble gjort for 4- OH-OPB?

(Se Figur 31)

Eksperiment nummer 18:

Behandling av mus med 4-OH-OPB i kombinasjon med Tarivid og prøve behandling med Kolchicin mot Ehrlich karsinom transplantert til peritoneum.

Spørsmål: Vil mus transplantert med Ehrlich carcinom i peritoneum kunne reddes selv om behandlingen starter dagen etter transplantasjonen dersom ikke bare 4- OH- OPB blir gitt til dyret, men en kombinasjon av Etoposide og 4- OH- OPB, det siste i en dose som ikke er effektiv alene?

Et kontrolldyr skulle motta en moderat dose av 4- OH- OPB dagen etter transplantasjonen for å stadfeste tidligere funn av manglende helbredelse.

Vil Kolchicin alene stoppe nedslag av transplanterte Ehrlich tumorceller dersom midlet blir blandet med de transplanterte cellene før de blir injisert slik det ble gjort for 4- OH-OPB?

Frosset og tint Ehrlich ascites celler ble fortynnet i et volum av 1 ml RPMI (pH~6,9) for hvert dyr. Det ble ikke tilsatt serum for å unngå immunisering av musene. Celletall: 90000 tumorceller i 0,7 ml RPMI ble injisert intraperitonealt til hvert dyr.

Totalt celletall i ampullen: 7,5 mill. celler. Cellene ble tint og 2 ml FCS ble tilsatt før sentrifugering ved lav hastighet. Supernatanten ble helt av og cellene blandet med RPMI 164 medium for å oppnå en konsentrasjon 10 ganger den finale: 1,286 mill/ml. Så ble separate rør gjort klar for hvert dyr. Cellene i røret til dyr nr. 3 fikk Kolchicin en time før injeksjonen som vist i tabellen på dag 0.

Hvert dyr fikk ca. 0,7 ml av cellesuspensjonen på 1,286 mill/ml eller 0,9 millioner celler injisert til hver.

Dosering:

Kolchicin: 434 ul Eagles medium ble fylt i to rør. 9,7 ul 20 mM Kolchicin i DMSO ble tilsatt det første røret. Etter blanding ble det samme volumet overført fra dette røret til det siste røret. Innholdet i det siste røret ble injisert intraperitonealt på mus nummer 3 på dager angitt i tabellen ovenfor. 4-OH-OPB: 478 ul Eagles medium ble pipettert over i hvert av tre rør og det ble tilsatt 22,25 ul 20 mM 4-OH-OPB i DMSO til det første røret. Etter blanding av innholdet i dette første røret ble samme volum og 23,6 ul overført herfra til hver av de to neste rørene. Innholdet av de siste to rørene ble injisert intraperitonealt til hver av mus nummer 1 og 2 respektivt. Tidspunk for injeksjoner er vist i kalendertabellen ovenfor.

Konklusjon:

Svaret på det første spørsmålet: " Vil mus transplantert med Ehrlich carcinom i peritoneum kunne reddes selv om behandlingen starter dagen etter transplantasjonen dersom ikke bare 4- OH- OPB blir gitt til dyret, men en kombinasjon av Etoposide og 4-OH- OPB, det siste i en dose som ikke er effektiv alene? " er NEI.

Resultatet svarer til resultatene av in vitro eksperimentene som synes å vise at Etoposide ikke hemmer tynt utsådde polyoma transformerte S100T1 celler komplett. Men et in vitro eksperiment som studerer den kombinerte effekten av de to inhibitorene er ikke gjort.

Som antatt: Et kontrolldyr som mottok en moderat dose av 4- OH- OPB dagen etter transplantasjonen stadfestet tidligere funn av manglende helbredelse.

Svaret på det siste spørsmålet: " Vil Kolchicin alene stoppe nedslag av transplanterte Ehrlich tumorceller dersom midlet blir blandet med de transplanterte cellene før de blir injisert slik det ble gjort for 4- OH- OPB? " er også NEI. Konsentrasjonene som er antatt å være temmelig høye ga ikke en fullstendig beskyttelse mot utviklingen av transplantabel Ehrlich tumor.

Dette resultatet svarer til in vitro eksperimenter med Kolchicin som ikke viste komplett klonehemning for tynt utsådde celler. Dette står i motsetning til det som er funnet for 4-OH-OPB som effektivt hemmet slik vekst. (Se Figur 32).

Tabell som viser korrelasjonen mellom egne eksperimenter som undersøkte signifikansen overfor klonehemning av noen medikamenter i cellekultur og antallet av sitater når følgende spørsmål ble stillet i Medline eller Google: Navn på medikament AND (cancer prevention).

Resultatene i denne tabellen kan tyde på en mulig korrelasjon mellom funn i cellekultur og antall sitater på Internett. Siden hver sitering ikke er studert i detalj er det ikke tillatt å konkludere bestemt bare basert på denne observasjonen.

Et eksempel på å benytte metoden i cellekultur er induksjon av klonevekst av polyoma virus transformerte baby hamster nyreceller med cellelinjen S100T1 i bløt agar. Metoden omfattet registrering av celleklonene som var i stand til å vokse i sparsomt og tett utsådde områder i kulturene som ble utsådd som en tetthetsgradient og behandlet med hvert av stoffene som ble undersøkt. En test som viser klonehemming eller det motsatte må etterprøves i dyreeksperimenter som benytter transplantabel svulst.

Slike eksperimenter kan gi funn som trenger videre konfirmering ved undersøkelser på mennesker med kreft. Men resultatene som oppnås ved testing av medikamenter som gir øket klonevekst kan ikke verifiseres ved forsøk på mennesker siden det er uetisk å gjøre slike forsøk. Dyreeksperimenter eller det å studere krefthyppighet hos pasienter som har blitt behandlet med slike midler kan gi holdepunker som er nødvendige for å stoppe medisinsk bruk. Et eksempel på en slik kandidat er Diclofenak (Voltaren) som ble "oppdaget" i et av eksperimentene som er beskrevet her.

Sammenfatning og konklusjoner hovedsakelig basert på de siste 5 eksperimentene: Basert på eksperimenter som omfatter nr. 14 ( tidligere nr. 13), kan denne hypotesen være være aktuell: Nær celle- cellekontakt mellom tumorceller vil oppheve den antiklonale effekten av 4-OH- OPB. Dersom distansen mellom tumorcellene øker, vil en svakere interaksjon være ventet mellom disse beslektede cellene. Selv om mange andre normale celler, som ikke er beslektet med tumorcellene, er til stede i samme område vil effekten av 4- OH-OPB på tumorcellene ikke avta.

Derfor kan interaktive effekter mellom beslektede celler i nær kontakt med hverandre blokkere postulerte cellereseptorer for 4- OH- OPB.

Basert på eksperiment nummer 15 er den følgende konklusjonen mulig:

4-OH-OPB hemmet klonal vekst ved de undersøkte konsentrasjonene, 2 og 20 uM.

Kolchicin hemmet ikke klonal vekst i konsentrasjoner fra 0,01-0,1 uM. Diphenhydantoin hemmet ikke klonal vekst signifikant i konsentrasjoner 10-100 uM. Podofyllotoksin hemmet signifikant ved 0,3 uM, men hadde sannsynligvis noen få upåvirkede kloner. Det var ikke noen signifikant hemning ved 0,03 uM.

Piroxicam hemmet muligens signifikant ved 50 uM, men ikke ved 5 uM.

Diclofenac viste ingen signifikant hemning ved 10-100 uM. Men det ble observert en sannsynlig signifikant økning i klonevekst ved 10 uM. Dette kan bety en kreftfremkallende egenskap som må ha konsekvens for dets bruk hos mennesker. Ibuprofen viste en ikke signifikant hemning ved 100 uM. Klonehemning ved 1000 uM behøver ikke å være reell siden den omfattet at brønnen også fikk 30 ul DMSO. Det kunne være toksisk (se neste eksperiment).

Naproxen hemmet sannsynligvis signifikant ved 500 uM, men DMSO toksisitet kan kanskje virke inn som for Ibuprofen.

Acetylsalicylsyre hemmet kanskje signifikant, men ikke komplett ved 100 uM. Ved 1000 uM er hemningen komplett, men kan delvis være forårsaket av DMSO som nevnt for Ibuprofen.

Basert på forsøk nummer 16 er følgende konklusjon mulig:

Resultatene ble avlest etter to eller tre uker. Resultater avlest etter 3 uker ble ikke tatt med i denne forkortede konklusjon siden den opprinnelige tilsetningen ikke ble fortsatt. Resultatene syntes mest relevante dersom de ble avlest etter 2 uker.

Denne tabellen viser klart at der kan være forskjell mellom de to Kolchicinpreparatene. Lot 60K1932 var ikke så effektiv og lagring og frysing reduserte ytterligere effekten.

Det kan være mulig at terapeutiske doser av Kolchicin kunne inhibere kloning. Men effekten er ikke så god som for 4- OH- OPB.

For Podofyllotoksin er signifikansen for resultatene som ble avlest etter 14 dager summert i denne tabellen.

Dosering innen et område som kunne være terapeutisk klargjorde en sannsynlig anti-klone aktivitet som ikke var så god som for 4- OH- OPB.

Dosering innen et område som kunne være terapeutisk klargjorde en mulig anti- klone aktivitet som ikke var så god som for 4- OH- OPB og mindre signifikant enn resultater avlest etter 2 uker.

Signifikans for resultater avlest etter 14 dager for Ibuprofen, Naproxen, Acetylsalicylsyre og 4-OH-OPB:

DMSO konsentrasjon for stoff nummer 8 og 10 kunne interferere som en klonal veksthemmer siden konsentrasjonene var over ca. 1 % som ble funnet i et senere eksperiment.

Resultatet for nummer 9, Naproxen, kunne bli akseptert som mulig signifikant siden konsentrasjonen av DMSO ikke gikk over det kritiske nivået.

Resultatene med hensyn på de høyeste konsentrasjonene av Ibuprofen og Acetylsalicylsyre kunne imidlertid ikke aksepteres siden DMSO i seg selv kunne hemme. Men disse medikamentene viste mulig eller sannsynlig klonehemning når de ble tilsatt kulturene i lavere konsentrasjon.

Resultatene viste at Acetylsalisylsyre sannsynligvis hadde en hemmende virkning på kolonier ved dosering innen et område som kunne være terapeutisk. For Naproxen og Ibuprofen eksisterte sannsynligvis samme aktivitet.

Kontrollen 4- OH- OPB var klart bedre enn noen av de andre.

Basert på eksperiment nummer synes den følgende konklusjon mulig:

Ingen av de undersøkte hemmerne (Kolchicin, Podofyllotoksin eller Etoposide) hemmet klonal cellevekst så effektivt som 4-OH-OPB. Alle de tre syntes å tillate veksten av noen få kloner i sparsomt utsådde områder i agaren.

Etoposide syntes å gi den beste hemningen av celler i de tett utsådde områdene. Derfor kan disse være de beste kandidatene til å kombinere med 4-OH-OPB gjennom korttids behandling.

Det er kjent at Kolchicin blir tolerert gjennom lengre perioder, en fordel som dersom det er nødvendig.

Lang tids toksisitet for Podofyllin og Etoposide er kjent å være høy og passer med den signifikante veksthemningen som er funnet i tette områder.

De undersøkte vekstinhibitorene besto av to grupper, inhibitorer som hemmet cellevekst i områder med både høy og lav celletetthet, Podofyllotoksin gruppen, og inhibitorer som bare hemmet klonal vekst i områder med lav celletetthet, 4-OH-OPB og Kolchicin. Spesielt for middels konsentrasjoner av 4-OH-OPB var det god vekst av kolonier i områder med høy celletetthet, men ikke vekst i områder med lav celletetthet.

Kolchicin hemmet ikke de områdene som hadde høy celletetthet signifikant. Bare høy dose syntes å hemme veksten områder med lav celletetthet signifikant. Men i dette eksperimentet kunne man ikke observere noen komplett klonehemning i disse områdene.

Begge stoffene i Podofyllotoksin gruppen oppførte seg på samme måte, vekst i områder med høy celletetthet ble signifikant hemmet og lavtetthets områdene, som også viste hemning, viste ikke komplett klonehemning.

Disse funnene indikerte at Podofyllotoksin eller Etoposide kunne være toksiske overfor celler i tett utsådde områder. Dette stemmer med at det er en relativt høy toksisitet i kroppen. I tillegg hemmer de klonal vekst i tynt utsådde områder, men sannsynligvis ikke komplett som må kreves for effektiv kontroll av metastaser.

Testing av DMSO resulterte i nesten uaffisert veksthemning opp til omkring 1 % konsentrasjon i bløt agar kultur. 29,2 ul/700 ul or 4 % inhiberte dannelse av kloner, men ikke komplett.

Tabellen nedenfor viser det som er antatt å være de viktigste fordelene eller manglene ved de undersøkte substansene dersom de benyttes i behandlingen av kreft (Etoposide er allerede i bruk):

I situasjoner hvor kloner vokser fra enkeltceller eller fra klumper med fa celler, en situasjon som vel finner sted om behandling mot klonevekst ikke har startet, kan det kanskje være fordelaktig å kombinere 4-OH-OPB med Etoposide. Toksisiteten vil hindre Etoposide fra å bli brukt over mer enn noen få dager om gangen. Det er antatt at 4-OH-OPB ville kunne tolereres over mye lengre tid.

Situasjonen for Kolchicin er ikke klar etter eksperimentene siden der er tvil omkring stoffets effekt på klonevekst i sparsomt utsådde områder.

Når større tumores opptrer, enten palpable eller oppdaget på røntgen eller ved hjelp av lignende metoder, er ikke 4-OH-OPB antatt å kunne brukes alene. Men 4-OH-OPB er antatt å

forebygge metastatiske celler i å forlate tumor. Dette er spesielt viktig ved kirurgi, men kunne bli av verdi også ved kjemisk behandling eller bestråling.

Eksperimenter på mus transplanter med Ehrlich's carcinom subkutant indikerte stopp i at tumorcellene forlot området med mange tumorceller under behandling med 4-OH-OPB. I tillegg vil dette vil denne behandlingen sannsynligvis stoppe at tumorcellene slår seg ned i fjerne organer.

Basert på eksperiment nummer 18 synes den følgende konklusjon mulig:

Svaret på det første spørsmålet: " Vil mus transplantert med Ehrlich carcinom i peritoneum kunne reddes selv om behandlingen starter dagen etter transplantasjonen dersom ikke bare 4- OH- OPB blir gitt til dyret, men en kombinasjon av Etoposide og 4-OH- OPB, det siste i en dose som ikke er effektiv alene? " er NEI.

Resultatet svarer til resultatene av in vitro eksperimentene som synes å vise at Etoposide ikke hemmer tynt utsådde polyoma transformerte S100T1 celler komplett. Men et in vitro eksperiment som studerer den kombinerte effekten av de to inhibitorene er ikke gjort.

Som antatt: Et kontrolldyr som mottok en moderat dose av 4- OH- OPB dagen etter transplantasjonen stadfestet tidligere funn av manglende helbredelse.

Svaret på det siste spørsmålet: " Vil Kolchicin alene stoppe nedslag av transplanterte Ehrlich tumorceller dersom midlet blir blandet med de transplanterte cellene før de blir injisert slik det ble gjort for 4- OH- OPB? " er også NEI. Konsentrasjonene som er antatt å være temmelig høye ga ikke en fullstendig beskyttelse mot utviklingen av transplantabel Ehrlich tumor.

Dette resultatet svarer til in vitro eksperimenter med Kolchicin som ikke viste komplett klonehemning for tynt utsådde celler. Dette står i motsetning til det som er funnet for 4-OH-OPB som effektivt hemmet slik vekst.

Svaret på det første spørsmålet: " Vil mus transplantert med Ehrlich carcinom i peritoneum kunne reddes selv om behandlingen starter dagen etter transplantasjonen dersom ikke bare 4- OH- OPB blir gitt til dyret, men en kombinasjon av Etoposide og 4-OH- OPB, det siste i en dose som ikke er effektiv alene? " er NEI.

Resultatet svarer til resultatene av in vitro eksperimentene som synes å vise at Etoposide ikke komplett hemmer tynt utsådde polyoma transformerte S100T1 celler. Men et in vitro eksperiment som studerer den kombinerte effekten av de to inhibitorene er ikke gjort.

Som antatt: Et kontrolldyr som mottok en moderat dose av 4- OH- OPB dagen etter transplantasjonen stadfestet tidligere funn av manglende helbredelse.

Svaret på det siste spørsmålet: " Vil Kolchicin alene stoppe nedslag av transplanterte Ehrlich tumorceller dersom midlet blir blandet med de transplanterte cellene før de blir injisert slik det ble gjort for 4- OH- OPB? " er også NEI. Konsentrasjonene som er antatt å være temmelig høye ga ikke en fullstendig beskyttelse mot utviklingen av transplantabel Ehrlich tumor.

Dette resultatet svarer til in vitro eksperimenter med Kolchicin som ikke viste komplett klonehemning for tynt utsådde celler. Dette står i motsetning til det som er funnet for 4-OH-OPB som effektivt hemmet slik vekst.

Ved vurderingen av eksperimentene i denne søknaden sammen med supplementet synes metoden for seleksjon og testing av stoff som kan hemme eller stimulere klonevekst å virke godt. Den beste indikasjonen på at metoden fungerer er resultatene som er oppnådd ved transplantasjon av Ehrlich's tumor til mus. Både lokal vekst og spredning av metastaser synes å bli hemmet komplett dersom behandlingen med 4-OH-OPB starter straks.

Dette midlet har vist bedre resultater enn andre kjente substanser for å hemme carcinogenese. Graden av signifikant hemning av klonevekst i testen har blitt korrelert med antall internett sitater som relaterer disse midlene til forebygging av kreft. Korrelasjonen ser ut til å være god.

Diclofenak, en av de testede medisiner viste sannsynlig stimulering av klonal vekst. Dette resultat kan indikere en carcinogen aktivitet av midlet som trenger å verifiseres i nye forsøk.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte omfattende seleksjon og testing av medikamenter, potensielle medikamenter, matvarer, tilsetningsstoffer til matvarer, toksiner, potensielle toksiner, komponenter fra fysiologiske eller patologiske prosesser, inkludert mikrober, virkningen av fysiske påvirkninger på kroppen eller deler av kroppen med spesifikk anti-klone eller klonestimulerende effekter, karakterisert ved at den omfatter: a) In vitro klonetest for å studere virkningen av nevnte substanser på kloning av celler; b) test på nevnte substansers hemmende effekt av celleopphoping in vitro eller in vivo på dyr; c) in vivo tester på dyr for å studere utviklingen av cellene i metastaser og lokale svulster på andre måter enn gjennom kloning.

2. Fremgangsmåten i følge krav 1, karakterisert ved at substansene som anvendes omfatter: 4-OH-OPB med analogen l,2-difenyl-4-hydroxy-4- [2-(fenylsulfinyl)etyl] -3,5 -pyrazolidinedion samt mitosehemmeren Kolchicin, og carcinogenesehemmerne Ibuprofen, Naproxen og klonestimulatoren Diclofenac.

3. Fremgangsmåten ifølge ett eller flere av kravene 1-2, karakterisert ved at nevnte klonetest omfatter: a) utsæd av celler i agar med eller uten vekstfaktor(er): b) behandling eller inkubering av spesielle geler. c) inkubering i egnet temperatur eller atmosfære og; d) oppfølging av cellene og utviklingen av kloner.

4. Fremgangsmåten ifølge ett eller flere av kravene 1-3, karakterisert ved at den utføres med klonetest i flytende medium eller i avgrensende brønner.

5. Fremgangsmåten ifølge ett eller flere av kravene 1-4, karakterisert ved at nevnte celler omfatter: maligne celler, normale celler, cellelinjer, transformerte celler, celler fra pasientenes egen tumor, normale celler fra kroppen som celler fra immunsystemet som blir kloneselektert etter immunisering hvor de sistnevnte kan påvises og kvantifiseres.

6. Fremgangsmåten ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte vekstfaktor(er) omfatter insulin, serum, insulinlignende vekstfaktorer, cytokiner, eller serumsparere og kondisjonert medium eller en kombinasjon av disse.

7. Fremgangsmåten ifølge et av kravene 1-6, karakterisert v e d at nevnte substansers hemmende effekt av celleopphoping in vitro eller in vivo på dyr omfatter; a) transplantasjon av tumorceller til et dyr, for eksempel Ehrlich ascites til mus eller utsæd av eksperimentelle cellekulturer med cellene omfattet av krav 4; b) tilsette testen eller gi forsøksdyret substanser nevnt omfattet av krav 1 og eller 2 og; c) følge opp tumorcellene i dyret eller cellene i eksperimentelle cellekulturer.

8. Fremgangsmåten ifølge et eller flere av kravene 1-7, karakterisert ved at de nevnte tester for påvirkning av utviklingen av metastaser omfatter: a) injeksjon av tumorceller i dyrene for å teste evnen til å utvikle metastaser eller lokale svulster; b) benytte testsubstansen(e) omfattet av krav 1 og eller 2 og; c) overvåke den evnen som substansen(e) har til å påvirke cellenes frigjøring, migrering og evne til å danne lokal svulst.

9. Fremgangsmåten ifølge krav 8, karakterisert ved at de nevnte tumorceller er Ehrlich carcinom celler.