NO801388L - Fremgangsmaate for fremstilling av en suspensjon av svekkede carcinoma-celler - Google Patents

Description

Behandling av carcinom med cytostatiske midler har vært

kjent i lengre tid. Nesten alle cytostatika har den ulempe at de er meget giftige og generelt også virker skadelig på veksten av normale celler. Det er videre funnet at de kjente cytostatika ikke er like virksomme mot alle typer carcinom. Selv forskjellige pasienter som har tilsvarende carcinom vil ofte oppvise forskjellig respons på ett og samme cytostatikum. For å velge det optimale cytostatikum i slike tilfeller og utføre en selek-tiv behandling med dette, har Limburg og Krahe foreslått testing av vev-kulturer tatt fra det spesielle carcinom for sensitivitet overfor forskjellige cytostatiske midler for å tilveiebringe et onco-biogram. Se Deutsche Medizinische Wochenschrift,

vol. 89 (1964), side 1938.

Selv om den ovennevnte metode medfører den fordel at det

(de) berørte organ(er) hos pasienten ikke utsettes for den toksiske virkningen av cytostatika som ikke er effektive mot den aktuelle tumor-typen, blir pasienten allikevel direkte påvirket av et cytostatisk middel. Denne påvirkningen er vist å være skadelig, særlig når store doser administreres over et lenger tidsrom.

Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å fremstille

et preparat som skal anvendes for behandling av carcinom, og som er egnet for bruk enten alene eller sammen med et cytostatikum som er spesielt effektivt mot den aktuelle tumor-typen.

Preparatet må være tilfredsstillende godtågbart for pasienten.

Dette og andre formål med oppfinnelsen er oppnådd som det

vil fremgå av den følgende beskrivelse, eksemplene og kravene.

Carcinoma-celler anvendes som utgangsmateriale ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, og kan-erholdes ved konvensjonelle metoder. For eksempel kan cancer-celler fri-gjøres fra operativt eksplantert tumor-vev ved behandling med trypsin; se Limburg. et al, Deutsche Medizinische Wochenschrift,

vol. 89 (1964), side 1938, hvilket herved er beskrevet ved henvisningen. En foretrukket metode for å frembringe carcinoma-celler er som forklart i det følgende: Til å begynne med skjæres det ønskede ondartede tumor-vev ut under sterile betingelser ved et kirurgisk inngrep. Det behandles derefter med en trypsin-oppløsning og blir så dyrket på glimmer-flak i Leighton-rør. Det uttatte vev macereres og spaltes

mekanisk under sterile betingelser for å danne en masse av vev. Det må påsees at bare fast cancer-vev som er strukturelt intakt og fritt for vesentlige bestanddeler av blod og døde celler, anvendes. En oppløsning av 0,25% trypsin i en fosfatbufret fysiologisk saltoppløsning (PBS), som inneholder 100 enheter/ml penicillin og 0,1 mg/ml streptomycin for sterilisering, settes til denne massen som derefter omrøres ved 37°C. For visse typer fast vev med hardere konsistens, kan konsentrasjonen av trypsinoppløsningen økes til 2%. Efter ca. 20 minutter helles de frigjorte individuelle celler, uten deler av vev i den utstrekning det er mulig, over i en annen steril kolbe.

For å avbryte fortsatt virkning av trypsin på celle-suspensjonen som er hellet over i den andre sterile kolben, avkjøles suspensjonen til +4°C ved hjelp av et isbad. Denne metode med omrøring og avhelling gjentas inntil det ikke er mer fast vev i kolben som ble anvendt for trypsin-behandlingen. Når trypsin-behandlingen er fullført, grovfiltreres den avkjølte celle-suspens jonen , fortrinnsvis gjennom et gas-lag som er sterilt, men som ikke er behandlet med noen kjemikalier. Filtratet sentrifugeres ved ca. 800 til 1000 opm, og det separerte celle-sedimentet isoleres fra filtratet.

Trypsinbehandlingen kan utelates når det gjelder carcinoma-celler som allerede er tilgjengelige i form av individuelle celler, så som ascites-carcinomaceller og leukemiceller.

Cancer-cellene dyrkes derefter for å danne en celle-kultur, eller en celle-torv i henhold til kjente fremgangsmåter, f.eks. som beskrevet i den ovennevnte artikkel av Limburg.et al i Deutsche Medizinische Wochenschrift. Cellene dyrkes som illustrert i det følgende.

Celle-sedimentet fortynnes med et flytende næringsmedium for å gi en konsentrasjon på fra 2 til 4 millioner levedyktige celler pr. ml, og fordeles likt på 30 rør efter nøyaktig pipettering., En dråpe plasseres på et objektglass slik at fortynningsgraden kan konstateres. Fortynningen er tilfredsstillende når cal 20 celler kan iakttas i synsfeltet ved en forstørrelsesgrad på ca. 125. For prøverør-testen fylles 1 ml væske i hvert Leighton-rør. Det anvendte næringsmedium har fortrinnsvis følgende sammensetning:

100 enheter penicillin pr. ml og 0,1 mg streptomycin pr. ml tilsettes til næringsmediet for å sikre at det er sterilt.

Celle-suspensjonen inkuberes i inkubatoren ved 37°C. Celie-metabolisme indikeres ved forandring av farven på næringsmediet fra rødt til gult. Næringsmediet fornyes stadig når metabolisme har funnet sted. Veksten av kulturen undersøkes og overvåkes i et kjemiker-mikroskop med reflektert lys. Avhengig av typen utgangsmateriale, har kulturene forskjellige vekstkarakteristika. For eksempel kan celler fra endometrialt eller ovarialt carcinom vokse og danne et utmerket celle-monolag i løpet av 48 timer. Celler fra annen ondartet vekst, så som celler fra skjellcelle-carcinom trenger opptil 120 timer, avhengig av utviklingsgraden.

Sensitivitetstesten av cellekulturene overfor forskjellige cytostatiske midler utføres f .eks. også i' henhold til metoder som beskrevet av Limburg et al, Deutsche Medizinische Wochenskrift, angitt ovenfor. En illustrativ metode er som følger: Bare velutviklede cellekulturer testes. Avhengig av mengden av dyrket materiale som er- tilgjengelig, kan kulturen sensitivitets-testes mot hvilket som helst cytostatikum. En enkelt kultur kan sensitivitetstestes mot 10 til 20 kjemoterapéutiske midler samtidig, og disse settes til de respektive rør i en tilstrekkelig vekt-konsentrasjon. Hvert middel anvendt for sensitivitetstesting tilføres i samme konsentrasjon som det blir administrert til mennesker i for kontinuerlig eller periodisk behandling) verdiene i den følgende tabell er angitt som rettledning. De forskjellige cytostatika fremstilles i en farmasøytisk form og settes til de forskjellige prøverør.

Kontinuerlig overvåkning med et kjemiker-mikroskop vil

avsløre synlig morfologisk skade i de fleste tilfeller efter 24 timer, og når det anvendes antimetabolitter, efter 48 timer.

Ved in vitro forsøk, anvendes de følgende konsentrasjoner som er egnet for behandling. Disse doser er beregnet efter de konsentrasjoner for behandling av mennesker som anbefales av produsenten, i forhold til en gjennomsnittlig kroppsvekt på 60 kg eller til kvadratmeter kroppsoverflate og ca. 5000 ml blodvolum, efter hva tilfellet er.

Ved anvendelse av denne fremgangsmåten, kan fortynningen

av ethvert annet cytostatisk middel enkelt beregnes.

In vitro sensitivitets- testing

Sensitiviteten eller resistensen til en kultur av humant cancer-vev bestemmes ved en semi-kvantitativ metode. En kultur som er fullstendig resistent, vil svare helt til den i kontroll-røret. Delvis aktivitet indikeres ved delvis oppløsning av ca. 50% av cellene i synsfeltet. Høy sensitivitet avsløres ved at synsfeltet er fritt for levedyktige celler og bare omfatter noen få innskrumpede celler som er drept. Bare et slikt resultat betraktes som tegn på fullstendig sensitivitet. Gjennomsnittlig er det funnet at minst to kulturer som er behandlet med forskjellige cytostatiske midler viser seg å være sensitive.

Bare disse kulturer skal anvendes ved cellebehandlingen, som det vil bli forklart nedenfor. Slike undersøkelser er blitt utført på mer enn 3000 individuelle tilfeller, og har gitt det entydige resultat at celler fra hver av mange tumorer fra tilsvarende steder og/eller med tilsvarende histologi, men fra forskjellige pasienter, kan gi svært forskjellig respons på samme cytostatiske middel, og videre at celler fra metastaser kan reagere anderledes enn celler fra den primære tumor.

Sensitivitetstest av carcinoma-celle-kulturer overfor forskjellige cytostatiske midler kan utføres in vivo i buken på rotter.

In vivo sensitivitets- testing

Sensitivitetstesten overfor cytostatika utføres in vivo

i diffusjonskammere plassert i buken på rotter når mindre enn 20 g tumor-materiale er tilgjengelig. Cellesuspensjonen fremstilles på samme måte som ved in vitro-metoden. Diffusjons-kammeret består av to filtere plassert i to Teflon-ringer som er forbundet med skruer. Filtrene virker som en halv-gjennomtrengelig membran. Porestørrelsen velges slik at væske, elektrolytt og proteiner kan trenge gjennom membranen, mens celler.så som leukocytter, makrofager og lignende holdes tilbake. En egnet porestørrelse for filtrene er ca. 0,25 ym. Dette kammeret fylles med 0,3 ml av den fremstilte celle-suspens jonen .

Umiddelbart efter at de er laget istand, implanteres

kamrene i bukhulen til rotter av innavlet stamme BD2. To kammere anvendes for hvert dyr. Når kamrene er implantert,

lukkes bukhinnen og bukveggen. Ved anvendelse av denne metode, vokser 100% av tumorcellene som er holdt tilbake på membranfiltrene'.

På den femte dag efter implantasjonen av diffusjonskamrene

i buken på rottene, injiseres forskjellige cytostatiske midler i bukhulen til de respektive rottene. På samme måte som ved in vitro metoden, er den anvendte konsentrasjonen den samme som den som anvendes ved behandling av mennesker. 48 timer efter den siste injeksjonen avlives rottene og diffusjonskamrene tas ut. Membranfiltrene isoleres og fikseres, og cellene merkes i henhold til Papanicolaous metode. Den cytotoksiske virkning bestemmes i henhold til de ovenfor beskrevne morfologiske kriterier ved in vitro-testen.

Celle- svekkende behandling

Når cellene er blitt sensitivitetstestet mot forskjellige cytostatiske midler som beskrevet ovenfor, er det funnet at ubehandlede carcinoma-celler som har samme opprinnelse som de tidligere testede cellene, blir svekket ved behandlingen og fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

For å utføre fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er det vesentlig at når det optimale cytostatikum for en gitt cellekultur er blitt bestemt, behandles cellene med det utvalgte midlet på en slik måte at de ikke blir fullstendig drept, men bare delvis svekket. For å oppnå dette, må det påsees at inkubasjonstiden i nærvær av det cytostatiske midlet ikke er for lang. Som det kunne ventes, vil inkuberingstiden for hver kultur variere med de forskjellige cellekulturer, og med aktiviteten til det cytostatiske midlet. Den tiltagende svekkingen kan iakttas under et mikroskop med en forstørrelses-grad på ca. 125. Dette kan utføres av en dyktig fagmann, uten vanskelighet. Inkuberingen får fortrinnsvis pågå inntil en mikroskopisk undersøkelse viser at bare ca. 30 til ca. 70%, fortrinnsvis bare ca. 40 til ca. 60% av cellene synes å være intakte. Inkubasjonstid på fra ca. 4 til ca. 15 timer, fortrinnsvis fra ca. 6 til ca. 12 timer, har generelt vist seg å være egnet. Inkubasjonen utføres fortrinnsvis ved en temperatur på ca. 3 7°C.

For den svekkende behandlingen.anvendes hvert cytostatikum i den samme konsentrasjon som i den ovenfor beskrevne test.

Celle-svekkings-behandlingen utføres fortrinnsvis som følger. Celler som er oppnådd ved trypsinbehandling, som beskrevet ovenfor, og som ikke er blitt behandlet med et cytostatisk middel, suspenderes i et næringsmedium, plasseres i Roux-flasker og oppvarmes i en inkubator til 37°C. Det særlige cytostatikum som har gitt optimale resultater ved den ovennevnte test, innføres i flaskene i den konsentrasjon som er angitt i tabell 1.

Når cellene på egnet måte er blitt svekket i den grad det er ønsket, vaskes kulturen grundig for å fjerne det cytostatiske midlet. Dette trinn tjener til å redusere virkningen av det cytostatiske midlet på cellene og hovedsakelig til å hindre en fortsatt reaksjon mellom det cytostatiske midlet og cellene som eventuelt kan føre til at cellene blir drept. En fosfatbufret saltoppløsning foretrekkes som vaskevæské, selv om andre egnede fysiologisk forlikelige oppløsninger også kan anvendes.

Cellene som på denne måte er blitt svekket i den ønskede grad, sentrifugeres ved ca. 800 til ca. 1000 opm i 10 minutter og suspenderes fortrinnsvis i en fysiologisk godtagbar væske,

så som en fysiologisk saltoppløsning eller kalveserum. Konsentrasjonen av de således behandlede cellene i det resulterende farmasøytiske preparat som er klart for administrering efter fortynning, er fortrinnsvis ca. 10 celler pr. ml.

De farmasøytiske preparatene som skal fremstilles, fremstilles fortrinnsvis fra tumor-celler tatt fra den spesielle pasient som skal behandles. Dette vil sikre en særlig høy toleranse og optimal virkning. Det er klart at det vil være tilfeller hvor det av forskjellige grunner ikke er mulig å tilberede preparater fra celler tatt fra den pasienten som skal behandles, f.eks. fordi det ikke er tilstrekkelig tid til rådighet, eller fordi fagfolk som kan fremstille og teste carcinoma-celle-kulturer og det nødvendige utstyr for dette arbeidet, ikke er tilgjengelig. I slike tilfeller kan preparater fremstilt fra carcinomas-celler fra andre pasienter anvendes. Det er selvfølgelig mest foretrukket å behandle en pasient med et preparat fremstilt fra carcinomas-celler som tilsvarer det carcinom som skal behandles. F.eks. bør pasienter som lider av ovarialt carcinom behandles med preparater fremstilt fra celler tatt fra ovarialt carcinom hos andre pasienter. Det er også mulig å fremstille blandede preparater som inneholder celler fra forskjellige typer carcinom, så som svekkede celler fra bryst- og eggstokk-carcinomer.

De farmasøytiske preparatene er stabile i suspensjon i

ca. 4 uker ved en lagringstemperatur på ca. +4°C. For å øke holdbarheten til preparatene, kan de farmasøytiske preparatene raskt dypfryses til temperaturer så lavt som -80°. Dypfrosne er preparatene stabile i ca. 1 år. For dette formål forsegles og pakkes de fortrinnsvis med et lite overskudd av næringsmedium-oppløsning. De farmasøytiske preparatene kan også lagres over lenger tid i lyofilisert tilstand.

De farmasøytiske preparatene kan administreres på en hvilken som helst egnet og effektiv måte, så som subkutant eller intramuskulært, eller ved intravenøs infusjon. Administrering ved subkutan eller intramuskulær injeksjon foretrekkes.

Ved en foretrukket behandlingsmetode administreres ca. 1 ml av celle-suspensjonen fremstilt i henhold til oppfinnelsen, fortynnet til 10 ganger volumet og inneholdende ca. 10 celler, ved hver enkelt behandling. Behandlingen gjentas passende 5 eller 6 ganger med 48 timers mellomrom. Det er funnet at behandling med preparatene fremstilt i henhold til oppfinnelsen vil resultere i sterkt forbedret toleranse hos pasienten overfor det tilsvarende cytostatikum. Av denne grunn er det meget ønskelig å behandle en pasient med det cytostatiske midlet alene på vanlig måte<1>i henhold til kjente fremgangsmåter i ca. 8 dager efter behandlingssekvensen med preparatene fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Videre detaljer i denne henseende vil sees fra de følgende kliniske undersøkelser som tjener til å illustrere og forklare oppfinnelsen.

Eksempel

De følgende aktive bestanddeler og oppløsninger ble

anvendt:

Vaske- oppløsning - denne ble fremstilt ved å føre

80 ml. av oppløsning A, 100 ml av oppløsning B, 100 ml av

oppløsning C og 5 ml av en antibiotika-oppløsning inn i en beholder sammen med dobbeltdestillert vann for å gi 1000 ml oppløsning.

Oppløsning A - ble fremstilt ved oppløsning av følgende bestanddeler i 400 ml dobbeltdestillert vann:

O ppløsning B - ble fremstilt ved oppløsning i 500 ml dobbeltdestillert vann av: CaCl20,5 g

Oppløsning C - ble fremstilt ved oppløsning i 500 ml dobbeltdestillert vann av: MgCl2-6H20 0,5 g

Oppløsningene A, B og C ble sterilisert i en åutoklav

og lagret ved 4°C.

A ntibiotika- oppløsning

ble oppløst i 300 ml dobbeltdestillert vann og lagret ved -20°C.

Trypsin- oppløsning - ble fremstilt i et vannbad ved

37°C.

Oppløsningen ble filtrert under sterile betingelser og derefter fyllt i små flasker og lagret ved -20°C. For trypsinbehandlingen ble denne oppløsningen regulert til den ønskede konsentrasjon med vaskeoppløsning.

Behring IV næringsmedium

Blandingen ble filtrert under sterile betingelser og ble hellet på flasker og lagret ved -20°C. Før bruk ble næringsmediet justert til en pH-verdi i området 6,8 til 7,2 med natrium-hydrogenkarbonat-oppløsning (22 g NaHCO^ og 478 ml dobbelt-destillert vann).

H anks forrådsoppløsning A - de følgende bestanddeler ble oppløst i 250 ml dobbeltdestillert vann og lagret ved 4°C:

Hanks forrådsoppløsning B - de følgende bestanddeler

ble oppløst i 240 ral dobbelt-destillert vann og lagret ved 4°C:

Fenol- rødt- oppløsning

Fenol-rødt ble oppløst kaldt i natriumhydroksydoppløsningen

i løpet av ca. 30 minutter, og oppløsningen ble fyllt opp til et volum på 50 ml med dobbeltdestillert vann. Oppløsningen ble lagret ved 4°C.

TCM- oppløsning

Dobbeltdestillert vann ble satt til de to forrådsoppløsninger for

å gi 500 ml. Pulveret ble oppløst i den resulterende oppløsningen.

G lutamin- oppløsning

Dobbeltdestillert vann ble satt til forrådsoppløsningene i et volum på 100 ml. Glutamin-pulveret ble oppløst i den resulterende oppløsningen.

Vitamin- oppløsning

Dobbelt-destillert vann ble satt til forrådsoppløsningene til et volum på 900 ml og vitaminene ble tilsatt. Den resulterende opp-løsningen ble derefter filtrert under sterile betingelser og

fylt på små flasker på 100 ml og lagret ved -20°C.

Kalve- serum

Føtalt kalveserum (Boehringer, Mannheim) ble lagret ved

-20°C og tint i et vannbad ved 37°C før bruk.

Vev (50 g) ble skåret ut fra et ovarialt carcinom hos

en 46 år gammel pasient i stadiet T4N5Mlc og ble.manuelt findelt sammen med 700 ml av en trypsin-oppløsning fortynnet til en konsentrasjon på 0,5% og fylt på en 1000 ml kolbe. Blandingen ble omrørt i 10 minutter med en magnetisk rører. Væsken på toppen ble derefter hellet over i en isavkjølt kolbe med samme størrelse. Dette trinn med omrøring av vev-trypsin-blandingen og avhelling av den overliggende væske ble gjentatt 4 ganger. Den fjerde gjentagelsen resulterte i en klar overliggende væske. De samlede avdekanterte væsker og det gjenværende vev ble derefter filtrert gjennom steril gas. Filtratet ble sentrifugert ved 800 til 1000 o.p.m. i 10 minutter. Vaskeoppløsning (100 ml.) ble hellet over bunnfallet. Den resulterende blanding ble sentrifugert på nytt og felt ut.

Det resulterende sedimentet ble nøyaktig pipettert med

5 ml næringsmedium og ble derefter fylt opp med næringsmedium til et totalt volum på ca. 400 ml. Efter denne fortynning viste undersøkelse med et Zeiss invert-mikroskop med en forstørrelse på 125 ca. 20 til 25 celler i synsfeltet. Den' fortynnede celle-suspensjonen ble fordelt på en serie prøverør, 1 ml pr. rør, og i Roux flasker, 100 ml pr. flaske. Veksten og metabolismen til cellene ble iakttatt og registrert hver dag i 6 dager. Så snart næringsmedium-oppløsningen viste farve-forandring fra rødt til gult, ble næringsmediet fornyet.

God cellevekst ble registrert efter at celle-suspensjonen hadde vært inkubert i en inkubator ved o7°C i 6 dager.

Celle-kulturene i rørene ble underkastet in vitro-testen forklart ovenfor med de cytostatiske midler angitt i tabell 1

i de konsentrasjoner som er angitt der. Efter 24 timer ble den morfologiske skaden bestemt under et mikroskop. Celle-suspensjonen viste seg å være sensitiv overfor de følgende cytostatiska: Adriblastin, Vincristin og Proresid. Alle de andre angitte cytostatiske midlene, 6 i dette tilfelle, var ineffektive.

Fire Roux-flasker som inneholdt celle-suspensjonen erholdt i henhold til den ovennevnte metode, ble derefter laget istand. Adriblastin, Vincristin og Proresid ble anvendt for å behandle innholdet i de respektive flasker i de konsentrasjoner som er angitt i tabell 1. Celle-suspensjonen i den gjenværende flaske ble ikke behandlet, og tjente som kontrollprøve. Efter at det cytostatiske midlet hadde fått virke på cellene i 12 timer, ble prøvene undersøkt under mikroskop, og bare 60% av cellene ble funnet å være intakte. Cellene ble derefter separert ved sentrifugering ved 800 til 1000 o.p.m. i 10 minutter^10 ml friskt næringsmedium ble hellet på sedimentet. De således erholdte svekkede cellene ble suspendert i frisktnæringsmedium i en konsentrasjon på 10 g celler pr. ml. Suspensjonen ble lagret ved 4°C.

In vitro test

1 ml av en ubehandlet celle-suspensjon inneholdende

10 c celler ble plassert i hvert av flere prøverør. Disse cellene var erholdt ved den ovennevnte behandling av carcinoma-vev med trypsin, men var ikke blitt behandlet med et cytostatisk middel. I 6 dager ble 0,3 ml av et av de ovennevnte preparater bestående av celler som var blitt svekket med Adriblastin, Vincristin eller Proresid, daglig satt til hvert rør. Under denne undersøkelsen ble rørene holdt i en inkubator ved en temperatur på 37°C. Efter 7-9 dager var ca. 80 til 90% av de ubehandlede cellene i hvert rør ødelagt av preparatet fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Eftersom det cytostatiske midlet var grundig vasket ut av preparatene, antas det at dette var et resultat av en intercellular reaksjon.

Klinisk behandling

Basert på resultatene av de ovennevnte undersøkelser

så vel som ytterligere forsøk av lignende karakter og efter tilsvarende forsøk på cellearter fra dyretumorer, ble preparatene fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse anvendt for klinisk terapi. Med ett unntak led alle pasientene av cancer i uhelbredelig stadium og var til tross for operasjoner, strålebehandling og/eller cytostatisk behandling på stadiet T 4 N3-5 Mlc i henhold til klassifiseringen innført av Union International contre le Cancer. Den gjenværende levetiden for slike pasienter: er gjennomsnittlig mindre enn 60 dager.

Preparatene fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble anvendt hovedsakelig som støttende immun-terapi i et forsøk på å

styrke immunsystemet før en cytostatisk behandling med de tilsvarende cytostatika. Ialt 22 pasienter ble behandlet,

som alle var fullt informert om sin tilstand og den planlagte behandlingsmåte. 14 av pasientene led av ondartet ovarial tumor (en av dem av mesosigmoid tumor som tilbakevendende vekst),

fire av bryst-carcinom, en av pankreas-carcinom, en av et retothelialt sarkom, en av coecum-carcinom og en av livmor-cårcinom.

Vev som var angrepet av kreft ble tatt fra pasientene ved kirurgisk inngrep og ble behandlet i henhold til den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for fremstilling av de nye preparatene. Annenhver dag ble individuelt fremstilte celle-suspensjoner på tilsammen 6 til 8 10 ml porsjoner administrert intraglutealt til hver pasient. Hver 10 ml porsjon inneholdt 10 celler,

dvs. 1 ml av preparatet i næringsoppløsning og 9 ml fysiologisk saltoppløsning eller kalveserum. I noen tilfeller ble eventuelt 1 ml Lidocain-oppløsning (Xylocaine) i en konsentrasjon på 0,5% administrert med hver 10 ml porsjon. I denne første sekvens var antall injeksjoner avhengig av det antall celler som var tilgjengelig, og i de fleste tilfellene ga dette 5 til 8 injeksjoner med 48 timers intervaller. Efter en ventetid på 8-20 dager (når det gjelder pasienter i ytterst dårlig tilstand bør ventetiden være oppimot den øverste grense) ble den cytostatiske behandlingen utført i henhold til de individuelle test-resultatene, i de fleste tilfeller i henhold til følgende skjema: 1 mg Vincristin injisert intravenøst, 6 timer senere Adriblastin injisert intravenøst i en mengde på 40 mg pr m kroppsoverflate; 48 timer senere cyklofosfamid eller Proresid i en mengde på 25 mg pr. kg kroppsvekt, oppløst i samme konsentrasjon i 500 ml fysiologisk saltoppløsning. På grunn av toksisiteten til Adriblastin lot man det være et opphold på 3 uker før neste cytostatiske behandlingssekvens, inntil totalt 550 mg av det midlet var administrert. Hvis det forekom resistens efter testresultater, ble det skiftet over til andre cytostatiske midler, så som 5-FU, metotrexat Leukoverin o.l.

med ukentlige mellomrom.

Denne behandlingen resulterte i en subjektiv og objektiv bedring hos alle pasientene. Det var ingen lokale eller generelle bivirkninger. Selv om celle-suspensjonen må ansees som giftig, medførte injeksjonen ingen lokal eller generell rødflamming eller hevelse. Smerte eller tilsvarende reaksjon på preparatet ble ikke registrert. Bedringen var så varig

at i alle tilfellene kunne den normalt farlige cytostatiske behandling begynne efter en periode på 20 dager maksimalt.

Fire av de ovennevnte 22 pasienter ble ikke gitt

påfølgende cytostatisk behandling fordi de nektet, eller fordi tumorene tydelig var for langt kommet. Allikevel overlevet disse pasientene usedvanlig lenge. F.eks. ble en kvinne på 60 som hadde bryst-tumor større enn en knyttneve og ben-metastaser og også påvist hjerne-metastaser, underkastet en enkel fjerning av brystet og gitt påfølgende behr.ndling med preparatet fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Uten ytterligere behandling levet hun i 270 dager.

Fem pasienter ble også behandlet med heterologe carcinoma-celle-suspensjoner og oppviste meget god toleranse.

Den gjennomsnittlige overlevelsestiden for alle pasientene er hittil 350 dager, noe som er nesten 6 ganger det tidligere gjennomsnittet. Fem pasienter var i live efter 245 til 665 dager. Av disse har tre ikke hatt tilbakevendende svulster og to

har hatt tilbakevendende svulster som har reagert på behandling. Alle de behandlede pasientene har god generell helsetilstand.

Resultatet av behandlingen med preparatene fremstilt

i henhold til oppfinnelsen, på to av de ovennevnte 22 pasientene og på en ytterligere pasient, vil bli beskrevet i det følgende.

1) En pasient på 46 år ble lagt inn på sykehuset fordi hun

led av bryst-tumor på begge sider som hadde eksistert i 2 år,

og store underlivs-tumorer. Den generelle tilstanden til pasienten var meget dårlig. Efter en generell forbehandling, ble begge brystene, som var sterkt angrepet av cancer, så vel som de tilknyttede lymfeknutene i armhulene, fjernet ved to operasjoner i juni 19 78. 14 dager senere ble livmoren og de to tumorene på eggstokkene fjernet. Det gjenværende kreftangrepne vev i omentum og på peritoneum, i lymfeknutene og på andre steder kunne ikke fjernes ved operasjon. Pasienten fikk ikke strålebehandling, men fikk 12 injeksjoner med preparatet fremstilt i henhold til oppfinnelsen, fra forbehandlede carcinoma-celler fra hennes

egen kropp (fremstilt som angitt i eksemplet ovenfor) og ble derefter underkastet den kombinerte kjemoterapi. Pasienten kom seg helt i løpet av immun-terapien, og oppviste derefter høy toleranse overfor de cytostatiske midlene. Efter 12 måneder fortalte pasienten at hun følte seg i utmerket form.

Hun var fullt ut istand til å utføre sitt arbeide, og hadde ingen klager. Den kliniske undersøkelsen viste ingen tilbakevendende svulst, hverken i underlivet eller i brystet. Ved begynnelsen av behandlingen var hun på tumor stadium T4 N5 Mlc.

2) En pasient på 32 hadde en stor tumor i underlivet da hun

ble lagt inn på sykehuset. Livmoren og de to adnexa var blitt fjernet på et annet sykehus ett år tidligere for behandling, av ganske stor ovarial cancer. Hun hadde også fått cytostatisk behandling for det tidligere tilfellet. Efter tilbakefallet ble en mesosigma tumor omtrent på størrelse med et barnehode fjernet, Denne var utviklet som en tilbakevendende svult efter det tidligere ovariale carcinom. Det var umulig å fjerne mesosigma-tumoren fullstendig i friskt vev. Hun hadde også metastaser i lymfeknutene på bekken-veggen. Pasienten ble gitt post-operativ støtte-immun-terapi som besto av 12 injeksjoner med preparater fremstilt ved behandling av celler fra hennes egne tumorer. Fordi pasienten derefter flyttet, kunne hun ikke få påfølgende cytostatisk behandling. Pasienten kom flere ganger tilbake for undersøkelse. 11 måneder efter at immun-terapien ble påbegynt, var hun i utmerket form, uten noen klinisk indikasjon på tilbakevendende svulster. Hele underlivet er fritt for tumor.

3) En 41 år gammel pasient, som ikke er innbefattet i den

ovenfor omtalte gruppen fordi hun var på Tl stadiet, ble lagt inn på sykehuset fordi hun hadde en liten, muligens cancerøs knute i venstre brystkjertel. Resultatene av mammografi, termografi og punktur-cytologi var positive for venstre side og tvilsomme når det gjaldt en annen liten knute på høyre side (Papanicolaou 3). Histologi av tumor-vev fjernet fra venstre bryst, avslørte et hardt mamma-carcinom (Tl Nx Mo) ca. 2 cm i diameter. Denne pasientens tilfelle beskrives for seg, fordi hun var det eneste tidlige tilfelle. Pasienten var enig i enkel mastektomi av venstre bryst, men nektet ytterligere foranstaltninger, særlig på høyre bryst. Hun nektet også cyto-

statisk eller annen påfølgende behandling, men godtok cellebehandling. Hun ble gitt en heterolog cellebehandling med bryst-carcinom-celler som var erholdt fra en annen pasient,

og behandlet efter fremgangsmåten beskrevet i henhold til oppfinnelsen. Celle-behandlingen ble utført i henhold til rutinen beskrevet ovenfor, og omfattet 6 intramuskulære injeksjoner av 10 ml celle-suspensjoner inneholdende 10 celler hver, hver annen dag. 12 måneder efter behandlingen hadde pasienten ingen indikasjoner på tilbakevendende svulstvekst. Den mistenkte tumoren på høyre bryst var fullstendig forsvunnet.

Det vil fremgå av det ovenstående at det ikke var mulig

å administrere tilstrekkelig store doser i det fleste tilfeller på grunn av mangel på materiale. Det ville være ønskelig å gi hver pasient som lider av carcinom, selv på et tidlig stadium, en behandling som består av en sekvens med 5 eller 6 injeksjoner hver 48. time i en måned, derefter hver treje måned, derefter i tilsvarende måneder fire påfølgende halvår og derefter i tilsvarende måneder i flere påfølgende år. En slik behandling kan bare utføres med heterologe cancer-celler, men disse bør om mulig være tatt fira tilsvarende..organer, i de tilfeller hvor ingen autologe celler er tilgjengelige. De heterologe cancer-cellene kan blandes i forholdet 1:1 med lyofiliserte cancer-celler,

som ikke trenger å være forbehandlet.

Uten å være bundet av.noen spesiell teori eller virknings-måte synes det som om preparatene fremstilt i henhold til oppfinnelsen er virksomme ved behandling av carcinom på følgende grunnlag: Denne metoden for cancerbehandling ble utviklet basert på den antagelse at ondartet vev-vekst begynner på grunnlag av selvstyrt, stadig utbredende og overdreven formering av kropps-spesifikke celler. Prinsippet ved metoden synes for en stor del å bestå i en forbedring av den immunologiske tilstanden til pasienten før den cytostatiske behandlingen ved gjentatte injeksjoner av ultrafiltrater av kropps-spesifikke, cytostatisk forbehandlede carcinoma-celler, som ovenfor beskrevet.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for isolering, kultivering og dyrking av utvalgte carcinoma-celler, karakterisert ved de følgende trinn: (1) carcinoma-celler tilveiebringes; (2) cellene kultiveres og inkuberes i et næringsvekstmedium under celle-dyrknings-betingelser for å frembringe en celle-kultur; (3) flere forutbestemte porsjoner av cellekulturen ifølge trinn (2) utsettes for forskjellige cytostatiske midler, og den synlige morfologiske skaden på hver porsjon observeres; (4) det cytostatiske midlet som gir synlig morfologisk skade på disse mottagelige cellene, utvelges; (5) den resterende del av cellekulturen fra trinn (2) behandles med det cytostatiske midlet fra trinn (4), og inkuberes i en slik grad at fra ca. 30 til 70% av disse cellene er intakte under mikroskopisk undersøkelse, og at disse cellene ikke blir fullstendig drept, men bare delvis svekket; (6) de svekkede cellene fra trinn (5) vaskes med en fysiologisk godtagbar opplø sning for å fjerne så godt som fullstendig alt cytostatisk middel fra nevnte svekkede celler, og ■ (7) de således behandlede cellene suspenderes i en fysiologisk godtagbar væske for fremstilling av et farmasøytisk godtagbart preparat.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at inkubasjonen ifølge trinn (5) utføres over en periode på ca. 4-15 timer, fortrinnsvis ca. 6 til 12 timer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at inkubasjonen ifølge trinn (5) utføres ved en temperatur pa ca. 37 C.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at inkubasjonen ifølge trinn (5) utføres slik at fra ca. 40 til ca. 60% av cellene forblir intakte.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en suspensjon av svekkede utvalgte carcinoma-celler som er mottagelige for cytostatisk påvirkning av et utvalgt cytostatisk middel, karakterisert ved at en cellekultur av carcinomaceller behandles med et cytostatisk middel som cellene er sensitive overfor, og inkuberes over en så lang tid at mikroskopisk undersøkelse viser at bare ca. 30 til ca. 70% av de således behandlede cellene er intakte, og derefter vaskes de således svekkede cellene med en fysiologisk godtagbar oppløsning for å fjerne det cytostatiske midlet.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det i henhold til trinn (1) tilveiebringes ascites-carcinomaceller eller leukemi-celler.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at den resulterende oppløsning av svekkede celler dypfryses.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at den resulterende oppløsning av svekkede celler lyofiliseres.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at en porsjon av den resulterende oppløsning av svekkede celler dypfryses og en porsjon av den resulterende oppløsning av svekkede celler lyofiliseres, den dypfrosne og den lyofiliserte porsjon oppbevares under lagringsbetingelser, og derefter tines den frosne porsjon og blandes med en lik mengde av lyofiliserte celler.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at de svekkede cellene fra trinn (5) separeres ved sentrifugering med en hastighet på ca. 800 til 1000 opm, og derefter vaskes i henhold til trinn (6).