NO861553L - Angiogen faktor og fremgangsmaate for frembringelse av angiogenese. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er generelt rettet mot preparater og fremgangsmåter for neovaskularisasering in vivo i mennesker og dyr, og vedrører spesielt angiogene faktorer og fremgangsmåter for indusering av angiogenese ved anvendelse av oment-avledede preparater.

Angiogenese, dannelsen av nye blodkar og følgelig forøket blodsirkulasjon, og angiogene faktorer, kjemiske preparater som initierer og bevirker dannelsen av nye blodkar og sirkulasjon, har vært et velstudert område i mange år. Mye av denne interessen bygger på det faktum at normalt vev hos mennesker og dyr kan inneholder spormengder av angiogene sammensetninger, men ikke viser noen angiogen aktivitet bortsett fra den normale prosessen med vekst og utvikling av vev og organer. Angio-geneser og angiogene faktorer er observert, isolert og renset hoved-sakelig fra patologisk vev av forskjellige typer. F.eks. har betydningen av vekselvirkningen mellom vertsvaskulaturen og overlevelsen og veksten av faste ondartede tumorer vært kjent i over et århundre [Virchow, R., "Die Krankhaften Geshwulste", Hirshwald, Berlin, 1863; Thiersch, C, "Der Epithelialkrebs, Nanentlich Der Haut Mit Atlas", Lipzig, 1865]. Imidlertid ble den første klare demonstrasjonen av eksistensen av en menneskelig, angiogen faktor demonstrert av Greenblatt og Schubik i deres transfilter diffusjonsstudier [J. Nati. Cancer Inst. 41:111-124 (1968)]. Senere undersøkelser av denne tumor angiogene faktoren har gitt store for-skjeller og avvikelser ved beskrivelse av sammensetningen og egenskapene for den aktive faktoren [Folkman et al., J. Exp. Med. 133:275 (1971); Weiss et al., Br. J. Cancer 40:493 (1979); McAuslan et al., Exp. Cell Res. 119:181-190 (1979); Fenselau et al., J. Biol. Chem. 256:9611 (1981)]. Disse undersøkelsene av den tumor angiogene faktoren har ført til samtidig forsøksinnsats av andre for ytterligere eller tilsvarende kjemiske preparatet. Disse innbefatter: isoleringen av en angiogen faktor fra synovialvæske som ligner på den fra tumorer som har en molekylvekt på ca. 200-300 dalton [Brown et al., Lancet 1:682:685 (1980)]. En protein-holdig angiogen faktor fra humane myokardialinfarkter varierende fra 300-1 x 10<5>dalton [Kumar et al., Lancet 11:364-367 (1983)]. Angiogene faktorer i glassvæsken fra mennesker med diabetisk retinopati og i retina fra dyr innbefattende proteiner og polypeptider opp til 70 000 dalton i molekylvekt [Hill et al., Experientia 39:83-585 (1983); D. Amore et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:3068-3072 (1981); Kissun et al., Br. J. Ophth. 66:165-169 (1982)]. Isoleringen av et angiogent protein fra sårvæske som har en molekylvekt mellom 2000 og 14 000 dalton [Banda et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:7773-7777 (1982)]. Proteinkomplekser varierende fra 100 000-200 dalton fra humant amono-korion og placenta som viser angiogen aktivitet [Burgoes, H., Eur. J. Clin. Invest. 13:289-296

(1983)]. Dårlig definerte vandige ekstrakter som stimulerer neovaskularisering fra 3T3 adipocyter og humanfollikkelvæske [Castellot et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:5597-5601 (1982); Frederick et al., Science 224:389-390 (1984)].

Den samlede effekten og konklusjonen som trekkes fra disse forskjellige forskningsinnsatsene kan sammenfattes som følger: For det første har den angiogene faktoren, uavhengig av kilde, nesten alltid vist seg av natur å være et proten, et proteinkompleks eller et polypeptid. For det andre har de sanne kjemiske strukturene av disse preparatene som er i stand til å initiere eller formidle angiogenese, hittil ikke blitt beskrevet nøyaktig i detalj; tvert imot foreligger det variasjoner og avvikelser i resultatene fra forskjellige forskningsgrupper vedrørende molekylvekten. mellom multiplisiteten av forbindelser som vekselvirker slik at den angiogene effekten tilveiebringes, og ved evnen (eller den manglende evnen) til å oppnå et homogent renset preparat. Til sist har den overveldende majoriteten av angiogene faktorer som hittil er beskrevet måttet anvendes som implanterte pellets eller preparater som langsomt frigir den aktive faktoren over tid for å bevirke angiogenese; dette antas å skyldes den korte levetiden, den høyere diffusibiliteten og den relativt lave biologiske aktiviteten av faktorene.

En totalt forskjellig fremgangsmåte til angiogenese er den kirurgiske anvendelsen av intakt oment i normalt eller traumatiserte vev i legemet ifølge Harry S. Goldsmith og hans medarbeidere [Goldsmith et al., Arch. Surg. 106:695-698 (1973); Goldsmith et al., Am. J. Surg. 130:317-320

(1975); Goldsmith et al., Am. J. Surg. 129:263-265 (1975); Goldsmith et al., Stroke 9:224-229 (1978); Goldsmith, H.S., Rev. Surg. 24:379-380 (1967); Goldsmith, H.S., Surgery 88:732-736 (1980); Goldsmith et al., "Application Of Intact Omentum To The Normal And Traumatized Spinal Cord" i Spinal Cord Reconstruction, Raven Press, New York, 1983, sidene 235-244]. Disse bestrebelsene demonstrerte at den kirurgiske tilknytningen an intakt oment direkte på overflatene av hjernen eller ryggraden resulterte i vaskulære anastomoser mellom omentet og de andre vevene tilstrekkelig til å forhindre infarktdannelse selv i nærvær av en middels cerebral arterieunderbinding. Undersøkelse med det blotte øyet og mikroskopisk histologiske undersøkelser viste betydelig utvikling av vaskulære forbindelser mellom omentet i hvert av de undersøkte vevene i de avlivede dyrene. Det finnes imidlertid ingen beskrivelse av eller indikasjon på, i noen av disse rapportene vedrørende de spesielle faktorene, kjemiske eller fysiologiske, som forårsaker den demonstrerte neovaskulariseringen. Videre det det langt fra klart fra noen av disse rapporterte resultatene, at omentfaktorene har noen likhet med de proteinholdige faktorene som er avledet fra tumorer og lignende som beskrevet tidligere.

En angiogen faktor er tilveiebragt som innbefatter et biologisk aktivt lipid preparat oppnådd ved ekstraksjon av en lipid fraksjon fra et omenthomogenat under anvendelse av minst ett organisk oppløsnings-middel, lipidfraksjonen innbefatter oksygen, hydrogen og karbon og har en molekylvekt i området 150-1100 dalton. Denne angiogene faktoren kan innføres i på forhånd valgte seter i legemet ved injeksjon eller ved kirurgisk implantering og skaper rask og potent vaskularisering i løpet av dager.

Den detaljerte beskrivelen av foreliggende oppfinnelse kan forstås klarere og mer fullstendig når den ses i sammenheng med den vedlagte tegningen hvori: Fig. 1 er et skjematisk diagram som viser den foretrukne fremgangs måten for ekstraksjon og fraksjonering av omentvev; Fig. 2 er et bilde som viser dannelse av nye blodkar i hornhinnen sett med det blotte øyet 10 dager etter injeksjon; Fig. 3 er et bilde av et histologisk slide som viser den mikroskopiske dannelsen av nye blodkar i hornhinnen etter 10 dager; Fig. 4 er bilder fra Gamma-kameraundersøkelser av høyre og venstre ben av en katt 3 dager etter kirurgi og oment lipidinjeksjon; Fig. 5 er bilder fra Gamma-kameraundersøkelse av høye og venstre ben av en katt 6 dager etter kirurgi og oment lipidinjeksjon; Fig. 6 er et bilde fra Gamma-kameraundersøkelse av høyre og venste ben av en katt 9 dager etter kirurgi og oment lipidinjeksjon; Fig. 7 er en kurve som viser økningen i neovaskulariseringen i høyre ben av en katt etter omentlipidinjeksjon som en funksjon av tid; Fig. 8 er et bilde fra en Gamma-kameraundersøkelse som viser vaskulariseringen i en katt som rekonvaliserer etter kirurgi uten anvendelse av det angiogene preparatet; Fig. 9 er et bilde fra en Gamma-kameraundersøkelse som viser den

forreste delen av benet på katten i fig. 8;

Fig. 10 er et bilde fra Gamma-kameraundersøkelse som viser den bakre

delen av et ben av katten i fig. 8;

Fig. 11 er en kurve som viser elueringen av under fraksjoner I-V

innbefattende det ekstraherte lipidpreparatet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et potent angiogent preparat og en fremgangsmåte for tilveiebringelse av angiogenese som innbefatter et lipid preparat oppnådd fra omentet hos pattedyr og er resultatet av en ekstraksjon ved anvendelse av minst et organisk oppløsningsmiddel. Det angiogene materialet oppnådd ved denne fremgangsmåten fra omentet foreligger i store mengder, og inneholder minst en potent angiogen faktor som vil forårsake utviklingen av tallrike neovaskulære forbindelser i levende vev. Lipidpreparatet selv er heterogent i sammensetning og er funnet å inneholde minst fem lipidlignende underfraksjoner som vekselvirker med hverandre slik at den mest potente angiogene virkningen tilveiebringes. De aktive lipid-lignende molekylene i under fraksjonene er sammensetninger innbefattende oksygen, hydrogen og karbon og har molekylvekter i området 150-1100 dalton. Deler av disse aktive lipidmolekylene er alifatiske hydrokarbonpreparater inneholdende ikke mer enn 20 karbonatomer pr. kjede. Av denne grunn er det foretrukket at den ekstraherte lipidpreparatformen innbefatter alle lipidunderfraksjonene som en heterogen blanding.

Den lipidangiogene faktoren avledet fra omentet oppnås ifølge det skjematiske diagrammet for omentvevekstraksjon og fraksjonering vist i fig. 1.

Den foretrukne fremgangsmåten for tilveiebringelse av det angiogene lipidpreparatet er som følger. Voksne hunnkatter med vekt 2,4-3,2 kilogram (heretter "kg") ble bedøvet med en intramuskulær injeksjon av ketamin ved en foretrukket dose på 7,0 milligram pr. kilogram (heretter "mg/kg"). Når de var bedøvet, ble det foretatt en laparotomi ved en midtlinjeoppskjæring ifølge konvensjonelt kjente kirurgiske fremgangsmåter. Omentet ble fjernet kirurgisk og plassert i en steril plastpose holdt ved 4°C for øyeblikkelig bearbeidelse. Samtidig ble det også fjernet subkutant fett og dette ble behandlet på samme måte som omentvevet for anvendelse som en ikke-omentlipidkontroll. Ved anvendelse av egnet aseptisk teknikk ble omentet veid, spredt ut på en plastoverflate og skåret i enkeltstykker med størrelse ca. 4 cm^ ved anvendelse av kirurgiske sakser. Disse individuelle omentstykkene, som varierte i vekt fra 7 til 66 g, ble plassert i en steril "Waring"-blander inneholdende 300 milliliter (heretter "ml") av fosfatbufret saltvannsoppløsning (heretter "PBS") som på forhånd var avkjølt til 4°C. Omentstykkene ble blandet i 5 minutter ved 20 500 opm slik at man fikk et omenthomogenat som deretter ble plassert i sterile 250 ml plastflasker og sentrifugert ved 1600 ganger tyngdekraften i en avkjølt sentrifuge ved 4°C i 20 minutter. Etter sentrifugering var tre distinkte og separerbare fraksjoner synlige i flaskene: en pellet av blandet sammensetning; et uklart homogenat inneholdende i det vesentlige salt det proteinholdige materialet, og en flytende, kremfarget lipid kake. Hver av disse fraksjonene ble isolert individuelt.

Pelleten av blandet sammensetning ble i sin helhet kastet. Den uklare homogenatfraksjonen ble fullstendig mettet (dvs. 100%) med vandig ammoniumsulfat som virket slik at det utfelte alt proteinet i denne fraksjonen. Undersøkelse av den uklare homogenatfraksjonen og det totale utfelte proteinet (resuspendert i PBS) avslørte at ingen av disse preparatene hadde noen angiogen aktivitet overhodet. Følgelig ble det vist at den angiogene faktoren i omentet ikke synes å innbefatte verken et protein eller et polypeptid i noen betydelig grad.

Lipid fraksjonen isolert som en flytende lipidkake var sammensatt av to distinkte lag: en øvre skumholdig sammensetning og et tettere, kompakt lag som var mørkere i farge enn det øvre. Hvert lag ble undersøkt og funnet å inneholde en aktiv angiogen faktor i betydelig mengde. Av denne grunnen innbefatter hvert av disse lipidlagene individuelt og i kombinasjon den aktive lipidfraksjonen per se ifølge foreliggende oppfinnelse. Vekten av lipidkaken innbefattende begge lagene ble funnet å være ca. 93% av den samlede vekten av omentet hvorfra den var avledet og det er lipidkaken som benyttes til å fremstille det konsen-trerte organiske ekstraktet innbefattende den aktive angiogene faktor-sammensetningen.

Aktive lipid f rak sjoner ble ekstrahert ved å anvende mengdene og andelene av lipidkake angitt i tabell I nedenfor.

De angitte mengdene lipidkake ble blandet med ca. 21 ml av et organisk oppløsningsmiddel innbefattende kloroform og metanol (2:1, v/v) i en "Eberbach" 8575"-mikroblander og homogenisert i to minutter. Lipid/organisk oppløsningsmiddelhomogenatet ble deretter sentrifugert ved 200 ganger tyngdekraften i en klinisk sentrifuge ved romtemepratur i 10 minutter slik at man fikk en klar supernatant av gylden farge og et partikkelformig bunnfall. Supernatanten ble isolert ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter og underkastes rotasjonsfordampning ved 37"C under vakuum for fullstendig å fjerne kloroform/metanoloppløsnings-midlet. Andre fremgangsmåter for fjernelse av oppløsningsmiddel er kjente innen teknikken og kan benyttes i stedet for rotasjonsfordampning. En viskøs væske ble oppnådd som deretter fortrinnsvis ble suspendert i ca. 4 ml PBS for anvendelse.

Den angiogene aktiviteten av de ekstraherte vandige suspenderte lipidpreparatene ble undersøkt på følgende måte: En serie hvite New Zealand kaniner ble bedøvet med intravenøst pentobarbitol (30 mg/kg). Fra hvert preparat vist i tabell I ble en enkelt 50 mikroliters injeksjon av den vandige lipidsuspensjonen utført gjennom en nål nr. 25 plassert intrastromalt i hornhinnen på hvert øye. Hornhinnene på dyrene ble undersøkt med det blotte øyet og med et operasjonsmikroskop på andre, fjerde, sjette, åttende og tiende dag etter okkulærinjeksjonen. Vekst av blodkar og nærvær av eventuelle ødem og/eller betennelser i hornhinnen ble registrert. På den tiende dagen ble kaninene individuelt avlivet etter den visuelle bedømmelsen og histologiske preparater, farget med hemato-xylin og eosin på konvensjonell måte, ble oppnådd fra seks mikrometer tykke seksjoner skåret fra de formalinfikserte utskrapte øynene.

Den angiogene responsen ble gradert som følger: 0 anga ingen angiogenese og en klar hornhinne; 1+ anga dilatering av scleralkar med dannelse av rød farge registrert ved limbus; 2+ anga flere individuelle blodkar migrerende fra lumbus to tredjedeler av veien til injeksjonsstedet; 3+ anga mange blodkar med utstrekning fra limbus til injeksjons-posisjonen innbefattende 10-20 % av hornhinnen; 4+ anga tett blodkardannelse med utstrekning fra limbus til injeksposisjonen innbefattende minst 30-40% av hornhinnen.

For sammenligningsformål ble det også fremstilt og undersøkt en vandig suspensjon av oment lipidkaken og et vandig preparat av det subkutane ikke-omentfettet. Fettpreparatet uten oment ble fremstilt ved å blande en 3 g porsjon av det fettholdige subkutane vevet med 4 ml PBS og homogenisere denne blandingen ved anvendelse av Eberbach-mikroblanderen i 2 minutter ved 4°C. Tilsvarende ble en vandig suspensjon av omentlipidkaken fremstilt ved å homogenisere 4 g porsjoner av lipidkaken med 4 ml PBS i mikroblanderen i 2 minutter ved 4°C. Homogenatet av hele omentet før sentrifugering til proteinholdige fraksjoner og lipidfrak-sjoner ble også undersøkt. Resultatene er gjengitt i tabell II nedenfor. Resultatene antyder at utmerket angiogen aktivitet ble observert etter en enkelt sentral hornhinneinjeksjon av 50 mikroliter av kloroform/metanol - lipidekstraktet. Til sammenligning ble bare minimal angiogen aktivitet registrert med PBS homogenatet av det totale omentet og med PBS homogenatet av lipidkaken før ekstraksjon. Overhodet ingen angiogenese fant sted i disse tilfellene etter- injeksjonen av PBS alene eller det subkutane ikke-omentfett PBS homogenatet. En komplikasjon var imidlertid, som det fremgår av resultatene i tabell II, at det injiserte kubkutane fettet tatt fra bukveggen hos katt forårsaket alvorlig betenn-else av hornhinnen i løpet av to dager etter hornhinneinjeksjonen.

Forløpet for den angiogene responsen i hornhinnen på det injiserte vandige suspenderte kloroform/metanollipidpreparatet fulgte et ensartet mønster med rask utvikling og intens aktivitet. Etter injeksjonen av den ekstraherte lipidfraksjonen ble det observert en mild betennelsesreaksjon i hornhinnen i løpet av 24 timer som avtok i løpet av 48 timer. Denne innledende betennelsen er kjennetegnet ved en svak uklarhet av hornhinnen med meget svakt erythem i scleralområdet som ofte ble ledsaget av en svak utsondring fra øyet. En pannus, tilsynekomsten av et teppe av blodkar rundt kanten av hornhinnen, med interstitiell blodkardannelse ble klart synlig 3 til 4 dager etter injeksjonen. På den syvende til tiende dagen hadde blodkarene dannet et tett og rikt strukturert nettverk i hornhinnen. Dette er vist på bildet i fig. 2. Histologisk undersøkelse av de utskrapte øynenene på den tiende dagen viste tallrike kapillarer inne i hornhinnestroma; et bilde av den histologiske seksjonen som viser slike tallrike kapillarer i stroma er vist i fig. 3.

Det skal spesielt bemerkes at den oppløsningsmiddelekstraherte lipidfraksjonen i vandig medium initierer og opprettholder angiogenese etter bare en enkelt injeksjon av en 50 mikroliters dose. Selv om mekanismen for denne angiogeneprosessen og responsen på det nåværende tidspunkt er ukjent, fremgår det at injeksjonen av den ekstraherte lipidfraksjonen fra omentet initierer og utvikler dannelse av nye blodkar som blir organisert til tette, velstrukturerte, vaskulærnettverk i løpet av 7 til 10 dager.

Et andre forsøk ble utført for å demonstrere de neovaskulariserende virkningene av det ikke-vandige lipidpreparatet på en posisjon hvor normal vaskularisering i vevet med hensikt var ødelagt. Voksne hunnkatter ble bedøvet med en intramuskulær injeksjon av ketamin ved anvendelse av en dose på 7 ml/kg. Hver katt ble plassert i ryggleie og et snitt ble foretatt mellom kneet og lyskefolde på begge bakben. Lårarteriene ble isolert, underbundet, og fjernet mellom lysken og den første dype lårgrenen (Hunter's kanal). Snittet ble lukket og hver katt ble straks gitt en intravenøs injeksjon av tinnklorid/teknesium-99 som'festes til og radioaktivt merker de røde blodcellene i vevet. Plasseringen og mengden av dette radionukleotidet kan identifiseres ved å anvende en Gamma-kameraundersøkelse. På denne måten kan blodkar og kapillarrør som fører de radioaktivt merkede røde blodcellene spesifikt visualiseres.

Tinnklorid/fosfatpreparatet ble kommersielt oppnådd fra New England Nuclear Company under varemerket "Pyrolite" og inneholdt 10 mg natriumpyrofosfat, 30 mg natriumtrimetafosfat, og 0,95 mg tinnklorid. Dette preparatet ble rekondisjonert ved tilsats av 2,0 ml PBS og 1,0 ml av denne oppløsningen ble injisert intravenøst i bronchialvenen på katten. 20 minutter senere ble det injisert en intravenøs dose på 10m Curries av Technesium-99m for å radiomerke de røde blodcellene i dette vevsområdet. Kjernebilledsveip og digital integrering av blodstrøm ble observert og fulgt ved anvendelse av et "DTS-1600 ADAC" laboratorieinstrument koblet til en fysiologisk synkronisator, modell "RC3000", oppnådd fra Brattle Instruments.

Etter at kattene var kirurgisk preparert ble det foretatt et "grunnlinje" - sveip for bakgrunnsradioaktivitet på den kirurgiske posisjonen, etterfulgt av injeksjon av mellom 6-7 ml av kloroform/metanolekstraktet og inndampet viskøst flytende lipid intramuskulært i like mengder på to på forhånd valgte og merkede områder på den høyre benet i området hvor lårarterien var fjernet. En placeboinjeksjon inneholdende bare PBS ble utført på to tilsvarende valgte og merkede posisjoner på det venstre benet. Under normale forhold er kroppens kjente reaksjon på denne typen kirurgi å forsøke å opprette sideordnet blodsirkulering til det skadede vevet ved at det dannes nye kapillarer og blodkar i området hvor blodarterien er ødelagt. Ved å følge og sammenligne hastigheten og graden av ny blodsirkulasjon i hvert ben etter operasjonen oppnås en direkte og verifiserbar vurdering av de angiogene egenskapene og potensen for det kloroform/metanolekstraherte lipidpreparatet på nøyaktig måte.

Senere intravenøs injeksjon av tinnklorid/technecium-99m-preparatet ble utført på på forhånd valgte posisjoner på hvert ben og hvert ben ble underkastet kjernesveip 3, 6 og 9 dager etter operasjonen. Resultatene av disse kjernesveipene er vist i figurene 4-6 som eksemplifiserer virkningene av lipidfraksjonen for neovaskularisering i en representativ katt. Resultatene viser at økningen i blodkarsdannelse i det høyre benet av katten (injisert med omentlipidpreparatet) hadde betydelig høyere integrerte radioaktivitetstellinger pnn det venstre (kontroll) benet. 72 timer etter operasjonen ble det observert en 29,6% forskjell i radioakti-vitet; 6 dager etter operasjonstiden ble det observert en 38,2% økning i radioaktiviteten i det høyre benet sammenlignet med det venstre; og etter 9 dager viste omfanget av neovaskulariseringen i det høyre benet en 65,8% økning sammenlignet med det venstre benet. Bildene i figurene 4-6 gir synlige bevis på de betydelige forskjellene i dannelsen av nye blodkar ved anvendelse av den kloroform/metanolekstraherte lipidfraksjonen. En kurve som viser en lineær økning av radioaktiviteten (i tellinger) som sammenligner vaskulariseringen i det lipidinjiserte benet med vaskulariseringen i benet med injisert saltvannsoppløsning er tilveiebragt i fig. 7. Resultatene viser et omfang på 0,25% pr. time i økning av neovaskulariseringen i det høyre benet sammenlignet med det venstre. Dette viser klart den angiogene virkningen av lipisfraksjonen slik det fremgår ved den betydelige økningen i dannelse av nye blodkar og vaskulær organi-sering o struktur i det høyre benet. Disse resultatene overser imidlertid muligheten for en felles systemisk virkning ved anvendelse av lipiseks-traktpreparatet som ble vist å ha betydning ved følgende ekstra kontroll-forsøk.

I dette ekstra kontrollforsøket ble en annen katt underkastet operasjon for å fjerne lårarteriene som beskrevet ovenfor. Men i dette tilfellet ble det ikke gitt noen injeksjon av noen art. Gamma-kamerasveip utført med 3 og 6 dagers intervaller etter operasjonen er vist i figurene 8-10. Sveipet av høyre og venstre ben er vist i fig. 8 hvori ingen tydelig forskjell i sirkulasjon i nye sideordnede blodkar er synlig etter 3 dagers varighet. Fig. 9 viser et ben sett forfra den sjette dagen etter operasjon og fig. 10 viser benet sett bakfra den samme dagen. Sveipene viser ingen forskjell i tellinger mellom de to benene ved noe som helst tidspunkt etter operasjonen og en mye mindre grad av neovaskularisering sammenlignet med det tidligere forsøket. Neovaskulariseringen var betydelig mindre i dette ekstra forsøket enn i det venstre (kontroll) benet i det tidligere forsøket. På grunn av dette og det faktum at i foregående forsøket viste det venstre benet på katten (injisert kontroll) en relativt høyere grad av neovaskularisering (selv om den var betydelig mindre enn i det høyre benet), er det grunnlag for å tro at deler av lipidpreparatet i det høyre benet sannsynligvis ble overført systemisk til det venstre benet i de tidligere forsøkene. g

I alle disse eksemplene anvendte fremgangsmåten for fremstilling av lipidpreparatet det kloroform/metanolorganiske oppløsningsmidlet i fig. 1 for ekstraksjonsprosessen. Selv om dette er det foretrukne organiske oppløsningsmidlet for lipid ekstraksjon, er andre organiske oppløsnings-midler like nyttige. Disse innbefatter kloroform/metanol i l:l-forhold; kloroform/metanol/1NHCL i 4:2:3-forhold; vevssurgjøring ved anvendelse av IN HCL etterfulgt av to ekstraksjoner med kloroform/etanol i Is-forhold etterfulgt av metanolekstraksjon; og et kloroform/metanoloppløs-ningsmiddel i 1:2-forhold etterfulgt av en andre ekstraksjon med metanol alene. Andre organiske oppløsningsmidler som er vel karakteriserte og kjente innen teknikken kan også benyttes til å ekstrahere lipidfraksjonen fra omenthomogenatet. Disse innbefatter etyleter, metylenklorid, metyl-isobutylketon, og tetrahydrofuran; deres nyttighet som organiske oppløsningsmidler må imidlertid korreleres toksiske og betennelsesskap-ende restegenskaper, dersom slike er tilstede, når ekstraktet etter fjernelse av oppløsningsmidlet innføres i levende vev. Ekstra oppløsnings-midler antas, uavhengig av deres polaritet, styrke, oppløselighet, viskosi-tet, eller andre fysikalske egenskaper, å være nyttige for ekstsraksjons-prosessen forutsatt at oppløsningsmidlet senere fjernes og det ikke foreligger noen resterende biologiske virkninger på lipidekstraktet.

Kloroform/metanol (2:1, v/v) lipidekstraktet illustrert i fig. 1 ble viderekarakterisertnår det gjelder komponentdeler eller underfraksjoner ved anvendelse av væskekromatografi. For disse kromatografiske fraksjo-neringene ble fremgangsmåtene beskrevet i A. Kuksin, "Chromatography Part B"' (redaktør E. Heftmann), Elsevier, New York, 1983. Ved foreliggende fremgangsmåte ble 5,0 ml av kloroform/metanollipidekstraktet plassert på en kromatografikolonne inneholdende silikagel (100-200 mesh, Sigma Chemical Company) som på forhånd var bragt i likevekt med kloroform. Andre kromatografiske pakningsmaterialer som er nyttige for fraksjonering innbefatter kiselsyrekolonner, DEAE-cellulosekolonner, og "Sephadex LH-20" -kolonner. Ved anvendelse av silikagelkolonnene ble elueringer utført i rekkefølge ved anvendelse av 100 ml porsjoner av følgende oppløsningsmidler: kloroform; etylacetat; etylacetat/metanol (3:1); metanol/vann (4:1) etterfulgt av 200 ml av en oppløsningsmiddelblanding innbefattende kloroform/metanol/^ddiksyre/vann (25:15:4:2). De individuelle elueringsfraksjonene ble oppnådd og målt ved anvendelse av utraviolett lys ved 280 nanometer. Resultatene er vist i fig. 11 på kurveform og angir utvinningen av under fraksjonene I-V individuelt. Etterfølgende undersøkelse av hver av disse lipidunderfraksjonene viste at angiogen aktivitet bare var tilstede i under fraksjon V, uten noen registrerbar angiogen virkning fra noen av underfraksjonene I-IV. Den samlede aktiviteten av under fraksjon V var imidlertid målbart mindre enn kloroform/metanollipidekstraksjonspreparatet som opprinnelig ble oppnådd. Det ble senere funnet at underfaktorer I-IV, selv om de ikke har noen angiogen aktivitet på egenhånd, når de blandes med underfraksjon V virker slik at de forøker og forsterker aktiviteten og potensen av den angiogene preparatet som en helhet.

Kloroform/metanollipidpreparatet innbefattende underfraksjonene I-V ble også underkastet massespektrumanalyse. Resultatene viser at det ekstraherte lipidpreparatet som en helthet innbefatter en rekke lipidmolekyler i blanding varierende i molekylvekt fra 150-1100 dalton. Det antas at disse lipidmolekylene selv innbefatter et lipidfragment og en eller flere alifatiske hydrokarbonkjeder, hvor hver kjede fortrinnsvis er mindre enn 10, men ikke mer enn 20 karbonatomer i lengde og varierende i vekt fra 40-350 dalton. Videre antas det noen av disse lipidmolekylene som har en molekylvekt i området fra 350-600 dalton kan kombineres slik at det dannes molekylære aggregater som varierer i vekt fra 800-1100 dalton. Mens aggregatene, lipidmolekylene og lipidfragment ene alltid innbefatter karbon, hydrogen og oksygen i kombinasjon, innbefatter noen molekyl-aggregater og lipidmolekyler også nitrogen og fosfor. Hvert av prepa ratene som ble analysert og undersøkt (det kloroform/metanolekstraherte vandige lipidpreparatet og underfraksjoner I-V) ble vist å være hetero-gene av natur og å inneholde den ovenfor omtalte variasjonen av sammensetninger. Av disse grunnene er alle lipidpreparater avledet fra oment som ekstraheres ved hjelp av minst et organisk oppløsningsmiddel og som viser angiogen aktivitet ved innføring i levende vev innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Anvendelsene av foreliggende oppfinnelse er terapeutiske i situasjoner hvor det foreligger klinisk behov for et forøket antall kapillarer eller dannelse av nye blodkar. De gnærliggende anvendelsene innbefatter følgende: Ved forbrenninger og sårheling: To hovedproblemer som øyeblikkelig truer livene for sterkt forbrente pasienter er for stort væsketap og massiv infeksjon. Den nåværende medisinske behandlingen innbefatter gjentilførsel av væske og en øyeblikkelig lukning av sår med hudautoplastikk, trans-plantasjon av kadaverhud eller svinehud. Andre på det nåværende tidspunkt kjente fremgangsmåter innbefatter anvendelsen av en bilateral polymer membran for aseptisk å lukke brannsår i huden hos mennesker samtidig som den senere tjener som et templat for dannelsen av ny hud. I løpet av dette tidsrommet finner imidlertid ofte truende infeksjoner sted, spesielt hos pasienter med tredje grads forbrenning. Inkorporering av angiogene preparater i kunstig hud vil lette dannelsen av nye blodkar ved heling av sår og vil derfor minimalisere farene for infeksjon.

Noen brudd i legemet, som i det nedre skinnebenområdet, er kjent for tendensen til forsinket heling eller at bruddet ikke gror. Grunnen til dette er den normalt forekommende reduksjonen i blodtilførsel til den nedre delen av benet. Tilsatsen av en angiogen faktor mellom og rundt bruddstedet ved en slik plassering antas å akselerere og også muliggjøre bruddheling.

Ved kardiovaskulær sykdom: En velkjent respons på myocardielinfarkt-dannelse er den langvarige reparasjonen av hjertevevet ved at det gror inn nye blodkar fra det omgivende myokardium. Naturen av den stimu-lansen som induserer angiogenese i hjerte under disse betingelsene er ikke kjent på det nåværende tidspunkt. Anvendelsen av de nye angiogene preparatene kan forhindre hjerteanfall ved en forøkning av blodsirkula-sjonen gjennom nye blodkar til angina hjertevevet før dette vevet utvikler infarkt. Behandling med det nye angiogene preparatet og metodologien vil også akselerere rekonvalesensen etter myokardiell infarktdannelse og vil også være fordelaktig for pasienter med koronarokklusjoner med eller uten angina.

Ved slag: Cerebral arteriell insufficiens forårsaker slag hos ca. en halv million nye pasienter pr. år i USA alene. Tilsvarende vil transiente ischaemiske anfall, definert somp episoder av neurologisk dysfunksjon etterfulgt av rekonvalesens i løpet av 24 timer, finne sted hos opptil 50% av pasientene før de har et hovedslag. Innføring av foreliggende angiogene preparat vil forbedre vaskulariseringen i cerebrum, redusere faren for transiente ischaemiske anfall i betydelig grad, og kan benyttes som en terapeutisk fremgangsmåte over tid for behandling av slike pasienter.

Ver perifere vaskuærsykdommer: Blodstrømmen i ekstremitetene, ben og armer, er ofte redusert hos pasienten på grunn av alder, sykdom, kirurgi, og trauma. Innføringen av det angiogene preparatet ifølge foreliggende opfinnelse vil forøke blodstrømmen i ekstremitetene og skape ny vaskularisering, nye blodkar og kapillarer, i ekstremitetene slik at blod-strømmen forøkes i de områdene hvor det mest påkrevet.

Den omtalte oppfinnelsen er ikke begrenset i form eller omfang av annet enn de vedlagte kravene.

Claims (1)

1. Angiogent preparat,karakterisert vedat det innbefatter: et lipid preparat oppnådd ved ekstraksjon av en lipid fraksjon fra et omenthomogenat ved anvendelse av minst ett organisk oppløsnings-middel, lipidet i fraksjonen innbefatter oksygen, hydrogen og karbon og har en molekylvekt i området fra 150-1100 dalton. i

2- Angiogent preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det lipide preparatet videre innbefatter en alifatisk hydrokarbonkjede ikke mer enn 20 karbonatomer i lengde. i

3. Angiogent preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det lipide preparatet innbefatter aktive og inaktive underfraksjoner. ) 4. Angiogent preparat ifølge krav 4,karakterisert vedat den inaktive underfunksjonen øker den biologiske aktiviteten av den aktive underfraksjonen.55. Angiogent preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det lipide preparatet innbefatter et lipid molekyl som har en molekylvekt i området 150-600 dalton. D 6. Angiogent preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat lipidpreparatet innbefatter et aggregat som har eh molekylvekt i området 800-1100 dalton.57. In vivo fremgangsmåte for neovaskularisering av vev,karakterisert vedat den innbefatter trinnene: fremstilling av et angiogent preparat innbefattende et lipid— preparat som oppnås ved ekstraksjon av en lipidfraksjon fra et oment - homogenat ved anvendelse av minst ett organisk oppløsningsmiddel, hvor lipidet i fraksjonen innbefatter oksygen, hydrogen og karbon og har en molekylvekt i området 150-1100 dalton; innføring av det angiogene preparatet på et på forhånd valgt sted i et behandlingsobjekt; og det angiogene preparatet får vekselvirke med objektets vev.

8. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat det angiogene preparatet innføres i objektets vev ved hjelp av injeksjon.

9. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat det angiogene preparatet videre innbefatter en alifatisk hydrokarbonkjede ikke mer enn 20 karbonatomer i lengde.

10. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat det angiogene preparatet videre innbefatter aktive og inaktive underfraksjoner.

11. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 10,karakterisert vedat de inaktive underfraksjonene forøker aktiviteten av de aktive underfraksjonene i det angiogene preparatet.

12. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat den på forhånd valgte posisjonen er valgt fra gruppen bestående av brannsår, sår, hjernevev, bengrakturer, lemmer, og vaskulært vev.

13. In vivo fremgangsmåte for neovaskularisering av muskelvev,karakterisert vedat den innbefatter trinnene: fremstilling av et angiogent preparat innbefattende et lipid— preparat som oppnås ved ekstraksjon av en lipid fraksjon fra et oment - homogenat ved anvendelse av minst ett organisk oppløsningsmiddel, hvor lipidet i fraksjonen innbefatter oksygen, hydrogen og karbon og har en molekylvekt i området 150-1100 dalton; det angiogene preparatet innføres i muskelvevet på et objekt; og det angiogene preparatet får vekselvirke med objektets muskelvev.

14. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 13,karakterisert vedat muskelvevet er hjertevev.

15. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 13,karakterisert vedat muskelvevet innbefatter skjelettmuskulatur. Endrede patentkrav

1. In vivo fremgangsmåte for neovaskularisering av vev,karakterisert vedat den innbefatter trinnene: fremstilling av et angiogent preparat innbefattende et lipid— preparat som oppnås ved ekstraksjon av en lipidfraksjon fra et oment - homogenat ved anvendelse av minst ett organisk oppløsningsmiddel, hvor lipidet i fraksjonen innbefatter oksygen, hydrogen og karbon og har en molekylvekt i området 150-1100 dalton; innføring av det angiogene preparatet på et på forhånd valgt sted i et behandlingsobjekt; og det angiogene preparatet får vekselvirke med objektets vev.

2. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat det angiogene preparatet innføres i objektets vev ved hjelp av injeksjon.

3. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat det angiogene preparatet videre innbefatter en alifatisk hydrokarbonkjede ikke mer enn 20 karbonatomer i lengde.

4. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat det angiogene preparatet videre innbefatter aktive og inaktive underfraksjoner.

5. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 10,karakterisert vedat de inaktive underfraksjonene forøker aktiviteten av de aktive underfraksjonene i det angiogene preparatet.

6. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 7,karakterisert vedat den på forhånd valgte posisjonen er valgt fra gruppen bestående av brannsår, sår, hjernevev, bengrakturer, lemmer, og vaskulært vev.

7. In vivo fremgangsmåte for ' neovaskularisering av muskelvev,karakterisert vedat den innbefatter trinnene: fremstilling av et angiogent preparat innbefattende et lipid-preparat som oppnås ved ekstraksjon av en lipid fraksjon fra et omenthomogenat ved anvendelse av minst ett organisk oppløsningsmiddel, hvor lipidet i fraksjonen innbefatter oksygen, hydrogen og karbon og har en molekylvekt i området 150-1100 dalton; det angiogene preparatet innføres i muskelvevet på et objekt; og det angiogene preparatet får vekselvirke med objektets muskelvev.

8. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 13,karakterisert vedat muskelvevet er hjertevev.

9. Fremgangsmåte for neovaskularisering ifølge krav 13,karakterisert vedat muskelvevet innbefatter skjelettmuskulatur.

10. Delvis renset preparat oppnådd fra pattedyr omenta,karakterisert vedet lipidinnhold og ved at det har systemisk angiogen eller blodstrømforøkende aktivitet.

11. Preparat ifølge krav 10,karakterisert vedat den angiogene eller blodstrømforøkende virkningen er systemisk rettet mot det påvirkede området.

12. Preparat ifølge krav 10,karakterisert vedat lipidpre paratet oppnådd ved ekstraksjon av pattedyroment med et oppløsnings-middel innbefattende minst et organisk oppløsningsmiddel.

13. Preparat ifølge krav 12,karakterisert vedat oppløs-ningsmidlet er kloroform-metanol. •

14. Preparat ifølge krav 10-13,karakterisert vedat den angiogene aktiviteten bestemmes ifølge kanin-hornhinneforsøket.

15. Preparat ifølge krav 10-13,karakterisert vedat den angiogene eller blodstrømforøkende aktiviteten bestemmes ifølge et radioaktivt neovaskulariseringsforsøk på katteben.

16. Preparat ifølge krav 10-13,karakterisert vedat fraksjonen inneholdende lipid innbefatter et ion av molekylvekt ca. 150-1100 dalton.

17. Preparat ifølge krav 10-13,karakterisert vedat det er i stand til separering i aktive og inaktive under fraksjoner.

18. Preparat,karakterisert vedat det innbefatter den aktive under fraksjonen ifølge krav 17.

19. Aktiv underfraksjon ifølge krav 18,karakterisert vedat den angiogene eller blodstrømforøkende aktiviteten forbedres i kombinasjon med den inaktive under fraksjonen ifølge krav 18.

20. Aktive preparat ifølge krav 10-13,karakterisert vedat de er i stand til neovaskularisering eller blodstrømforøkning hos pattedyr som har vaskulær skade eller insuffisiens.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av preparater som er aktive ved angiogenese eller blodstrømforøkning fra pattedyroment,karakterisert vedat den innbefatter at omentet ekstraheres med et oppløsningsmiddel innbefattende minst ett organisk oppløsningsmiddel hvori det oppnås en lipid fraksjon som er aktiv ved angiogenese eller blodstrøm f o røkning.

22. Fremgangsmåte for neovaskularisering eller blodstrømforøkning i pattedyrvev,karakterisert vedat den innbefatter at pattedyret ved vaskulær skade elelr insuffisiens utsettes for det angiogene, aktive preparatet ifølge kravene 10-13.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat neovaskulariseringen eller blodstrømforøkningen innbefatter, men ikke er begrenset til, heling av, eller akselerasjon av helingen av: sår, ulcuser, forbrenninger, benfrakturer eller brudd, brudd, myocardialinfarkter, skade på grunn av slag, cerebral arteriell insuffisiens, koronarokklusjoner, begrenset blodstrøm, skadede blodkar, og redusert blodstrøm til ekstremitetene.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 22-23,karakterisert vedat preparatet ifølge kravene 10-13 systemisk retter seg inn mot det påvirkede området.

25. Anvendelse av angiogene aktive preparater som har systemisk aktivitet og er fremstilt fra pattedyroment som et medikament eller del av et medikament for neovaskularisering eller forøkning av blodstrømmen i pattedyrvev.

26. Anvendelse ifølge krav 25,karakterisert vedat neovaskulariseringen eller blodstrømforøkningen innbefatter at et patte-dyrobjekt med vaskulær skade eller insuffisiens utsettes for de aktive preparatene ifølge kravene 10-13.

27. Anvendelse ifølge krav 26,karakterisert vedat de aktive preparatene systemisk retter seg inn mot området med vaskulær skade eller insuffisiens.

28. Anvendelse ifølge krav 27,karakterisert vedat neovaskulariseringen eller blodstrømsforøkningen innbefatter, men ikke er begrenset til, heling av eller akselerasjon av heling av sår, ulcuser, forbrenninger, benfrakturer eller brudd, .biocardialinfarkter, skade forårsaket av slag, korronarokklusjoner, cerebral arteriell insuffisiens, begrenset blodstrøm, skadede blodkar og nedsatt blodstrøm til ekstremitetene.