ES2625893T3 - Sistemas, procedimientos y composiciones para optimizar injertos enriquecidos con tejido y células - Google Patents

Abstract

Dispositivo (300) para la preparación de tejido para un injerto de tejido adiposo, que comprende: una bolsa flexible, plegable (200) que tiene una primera cámara (280) y una segunda cámara (290) que están definidas por medio de un filtro (210) que tiene poros; un separador situado en el interior de la segunda cámara (290), en que dicho separador (330) tiene una pantalla de separación (330) que tiene poros que son mayores que los poros del filtro; y en el que dicho separador define una tercera cámara en el interior de la segunda cámara (290), y en el que los poros de dicho separador tienen aproximadamente de 300 a 30.000 micras, y en el que el separador tiene uno o varios nervios, tirantes y otras características que crean un espacio entre la envoltura exterior (340) y el filtro; una abertura de entrada (220) conectada a la bolsa flexible, plegable (200) en el que dicha abertura de entrada está configurada para permitir la introducción aséptica de tejido adiposo en la primera cámara (280); y una abertura de salida (240) conectada a la bolsa flexible plegable, en el que la abertura de salida (240) está configurada para extraer asépticamente líquido y células de la segunda cámara (290).

Description

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DESCRIPCION

Sistemas, procedimientos y composiciones para optimizar injertos enriquecidos con tejido y celulas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud provisional U.S.A. N° 61/174.800, presentada el 1 de Mayo de 2009 por Peterson y otros, y titulada “SISTEMAS, PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA OPTIMIZAR INJERTOS DE TEJIDO Y CELULAS”.

Sector tecnico de la invencion

Las realizaciones dadas a conocer en esta memoria se refieren, en general, a composiciones que comprenden injertos, implantes o preparaciones trasplantables que comprenden tejido adiposo con y sin una poblacion de celulas regenerativas derivadas de celulas adiposas (por ejemplo, una poblacion concentrada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas que comprende celulas madre) y procedimientos y sistemas para la preparacion, optimizacion y aplicacion de las mismas.

Antecedentes de la invencion

La transferencia de tejido adiposo a diversas zonas del cuerpo es un procedimiento cosmetico, terapeutico y estructural relativamente corriente que implica la recogida de tejido adiposo de una ubicacion y la reimplantacion del tejido recogido y, a menudo procesado, en otra ubicacion (ver Coleman 1995; y Coleman 2001). Mientras que es utilizado ampliamente para la reparacion de pequenos defectos cosmeticos tales como pliegues faciales, arrugas, marcas de pustulas y cavidades; la transferencia de tejido adiposo ha sido utilizada recientemente para el aumento y la reconstruccion cosmetica o terapeutica del pecho (Bircoll y Novack 1987; y Dixon 1988), y el aumento de los gluteos (Cardenas-Camarena, Lacouture y otros 1999; de Pedroza 2000; y Peren, Gomez y otros 2000).

En el pasado, los injertos de tejido adiposo y los procedimientos de transferencia de tejido adiposo han estado plagados de dificultades y de efectos colaterales incluyendo necrosis, absorcion del implante por el cuerpo, infecciones (Castello, Barros y otros 1999; Valdatta, Thione y otros 2001), calcificaciones y cicatrices (Huch, Kunzi y otros, 1998), inconsistencia del injerto, (Eremia y Newman 2000), escasa durabilidad, y otros problemas que surgen de la falta de neovascularizacion y de la necrosis del tejido trasplantado. Uno de los mayores problemas de la transferencia de tejido adiposo es la absorcion del implante por el cuerpo y la conservacion del volumen de los injertos de tejido adiposo despues de la transferencia. Cuando el tejido adiposo es recogido o lavado, el espacio entre los fragmentos individuales del tejido adiposo recogido se llena de llquido (por ejemplo, agua, sangre, soluciones tumescentes, aceite). Cuando este tejido y la mezcla de fluidos son implantados en un receptor, la porcion llquida es absorbida rapidamente por el cuerpo con el resultado de perdida de volumen. El proceso mediante el cual una cantidad de fluido es extralda del tejido y de la mezcla de fluidos se denomina frecuentemente como “secado del tejido adiposo” o “deshidratacion del tejido adiposo”. El contenido de leucocitos y de globulos rojos de la sangre y similares en el interior de un injerto de tejido adiposo puede afectar asimismo significativamente al volumen del injerto conservado despues del trasplante del injerto, debido a la induccion o a la exacerbacion de una respuesta inflamatoria. Otro aspecto de la retention del tejido se refiere a la cantidad de llpido en el interior del injerto de tejido adiposo. Se comprende que la presencia de llpido libre (significando llpidos liberados de los adipocitos muertos o danados; denominados asimismo aceite) en los injertos de tejido adiposo pueden tener como resultado la induccion o la exacerbacion de una respuesta inflamatoria con una actividad fagocltica sustancial y la consiguiente perdida de volumen del injerto.

Es asimismo conocido que la mezcla de tejido adiposo sin procesar con una poblacion concentrada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas soluciona muchos de los problemas asociados con los injertos de tejido adiposo y con la transferencia de tejido adiposo, tal como se ha descrito anteriormente. Concretamente, suplementando un tejido adiposo no procesado con poblaciones concentradas de celulas derivadas de las adiposas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas incrementa el peso, la vascularization y la retencion de injertos grasos. (Ver la patente U.S.A. N° 7.390.484 y la solicitud pendiente conjuntamente con la publication de la patente U.S.A. N° 2005/0025755). Los fragmentos de tejido adiposo suplementados o mezclados con una poblacion concentrada de celulas que incluye celulas madre derivadas de las adiposas presentan una neoangiogenesis y una perfusion mejoradas en injertos, si se compara con tejidos sin suplementar solos, en modelos animales. Ademas, los injertos de tejido adiposo suplementados con celulas regenerativas derivadas de las adiposas que comprenden celulas madre derivadas de las adiposas, muestran un incremento de la retencion y del peso del injerto a lo largo del tiempo si se compara con injertos sin suplementar. (Ver la publicacion de la solicitud de patente U.S.A. N° 2005/0025755). Ademas el procesado de tejido adiposo en un recorrido cerrado del fluido esteril reduce en gran manera la posibilidad de infection. La mejora en la transferencia autologa de tejido adiposo descrita anteriormente que se observa en los modelos animales ha sido tambien reproducida en estudios cllnicos humanos. Sin embargo, el aislamiento y la depuration de poblaciones concentradas de celulas regenerativas derivadas de las adiposas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas (ADSC), implica habitualmente una serie de etapas de lavado, digestion, filtrado y centrifugado que puede reducir el rendimiento en celulas viables, requiere equipos mecanicos y personal cllnico especializado y/o puede poner en riesgo la calidad, el aspecto, la longevidad, la hidratacion o la eficacia del injerto. Ademas, el documento EP0040427 se refiere a una bolsa de recogida que tiene una primera

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camara y una segunda camara que estan definidas mediante un filtro que tiene poros, una abertura de entrada y de salida. El documento U.S.A. 6.316.247 se refiere a un sistema y un procedimiento para preparar tejido para un injerto adiposo. El documento EP0919249 se refiere al conjunto de un filtro para la sangre que comprende el cuerpo de una bolsa que tiene una entrada del flujo de sangre y una salida del flujo de sangre y esta cargada con un material filtrante y una vasija de alojamiento para alojar dicho cuerpo de la bolsa, y un procedimiento de recuperacion de los componentes sangulneos mediante la utilization del conjunto filtrante.

La necesidad de planteamientos adicionales para la preparation y la optimization de injertos de tejido y de implantes y para aislar y/o concentrar celulas regenerativas derivadas de las adiposas, se manifiesta.

CARACTERiSTICAS DE LA INVENCION

Las realizaciones descritas en esta memoria se refieren a dispositivos para procesar injertos de tejido adiposo, as! como a planteamientos para la preparacion de injertos de tejido adiposo y a injertos de tejido adiposo suplementados con celulas regenerativas derivadas de celulas adiposas. De este modo, la invention se refiere a un dispositivo -300- para preparar tejido para un injerto de tejido adiposo que comprende:

una bolsa flexible, plegable -200-, que tiene una primera camara -280- y una segunda camara -290- que estan definidas mediante un filtro -210- que tiene poros;

un separador situado en el interior de la segunda camara -290-, en el que dicho separador -330- comprende una pantalla de separation -330- que tiene poros que son mayores que los poros del filtro; y en el que dicho separador define una tercera camara en el interior de la segunda camara -290-, y en el que los poros de dicho separador tienen aproximadamente desde 300 hasta aproximadamente 30.000 micras, y en el que el separador comprende uno o varios nervios, tirantes y otras caracterlsticas que crean un espacio entre la envoltura exterior -340- y el filtro;

una abertura de entrada -220- conectada a la bolsa flexible y plegable -200-, en la que dicha abertura de entrada esta configurada para permitir la introduction aseptica de tejido adiposo en la primera camara -280-; y

una abertura de salida -240- conectada a la bolsa flexible y plegable, en la que la abertura de salida -240- esta configurada para extraer asepticamente llquido y celulas de la segunda camara -290-.

Ademas, la invencion se refiere tambien a un procedimiento para realizar un injerto de tejido adiposo, que comprende:

(a) introducir una primera portion de tejido adiposo sin procesar en la primera camara -280- de un primer dispositivo segun la invencion;

(b) aclarar la primera porcion de tejido adiposo sin procesar mediante la adicion de una solution fisiologica de lavado a la primera camara -280-; y

(c) extraer el fluido de la segunda camara -290- del primer dispositivo, en la que el fluido es seleccionado de entre el grupo consistente en agua, solucion fisiologica de lavado, sangre y llpido libre, o cualquier combination de los mismos, secando de este modo el tejido adiposo.

Diversas realizaciones facilitadas en esta memoria se refieren a dispositivos para preparar tejido para un injerto de tejido adiposo. En algunas realizaciones, el dispositivo puede incluir una bolsa flexible y plegable que tiene una primera camara y una segunda camara, las cuales estan definidas por medio de un filtro que tiene poros. El dispositivo puede incluir asimismo un separador situado en el interior de la segunda camara, y una o varias aberturas de entrada y una abertura de salida conectada a la bolsa flexible, plegable. La abertura de entrada puede estar configurada para permitir la introduccion aseptica de tejido adiposo en la primera camara; y la abertura de salida puede estar configurada para extraer asepticamente llquido y celulas de la segunda camara.

En algunas realizaciones, el separador puede ser una estructura porosa que flota libremente en el interior de la segunda camara. En algunas realizaciones, el separador puede ser una estructura porosa que define una tercera camara en el interior de la segunda camara. En algunas realizaciones, el separador puede incluir un material que absorbe llpido, tal como una pantalla de malla de poliester o similar. En algunas realizaciones, el separador puede ser una estructura porosa que tiene poros que son mas grandes que los poros del filtro del sistema. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los poros del separador tienen un tamano de poro que puede ser mayor o igual a unas 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 veces el tamano del poro de los poros del filtro. En algunas realizaciones, el tamano del poro del separador puede estar comprendido entre unas 300 y 2.000 pm. En algunas realizaciones, el tamano del poro del filtro puede ser mayor o igual a unas 30 pm, por ejemplo, entre aproximadamente 30 pm y aproximadamente 200 pm. En algunas realizaciones, el tamano del poro del filtro es de 35 pm.

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En algunas realizaciones, la abertura de entrada puede estar configurada para ser fijada a una canula, al tiempo que mantiene esteril el recorrido del fluido o del tejido.

En algunas realizaciones, el dispositivo puede incluir un segundo dispositivo, en el que el segundo dispositivo es un dispositivo de aislamiento de celulas regenerativas derivadas de las adiposas. En algunas realizaciones, el dispositivo de aislamiento de las celulas regenerativas derivadas de las adiposas puede estar fijado al primer dispositivo para preparar tejido para un injerto de tejido adiposo al tiempo que mantiene un recorrido cerrado. En algunas realizaciones, el dispositivo de aislamiento de las celulas regenerativas derivadas de las adiposas puede ser un dispositivo tal como el descrito anteriormente en esta memoria. En algunas realizaciones, el segundo dispositivo puede estar conectado al dispositivo para la preparacion de tejido para un injerto de tejido adiposo mediante un conducto que puede estar configurado para transferir celulas regenerativas aisladas derivadas de las adiposas desde el segundo dispositivo a la primera camara del dispositivo para la preparacion de tejido para un injerto de tejido adiposo. En algunas realizaciones, el conducto puede incluir una conexion en Y.

Algunas realizaciones facilitadas en esta memoria se refieren a un procedimiento para producir un injerto de tejido adiposo. El procedimiento puede incluir las etapas de obtener una primera porcion de tejido adiposo sin procesar; aclarar la primera porcion de tejido adiposo sin procesar con una solucion fisiologica; y deshidratar el tejido adiposo aclarado hasta una cantidad de hidratacion que sea menor que la cantidad de la hidratacion presente en la primera porcion de tejido adiposo sin procesar antes de la deshidratacion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido adiposo aclarado es deshidratado hasta un contenido en llquido que es menor que aproximadamente 1/2, 1/3, o 1/4 de veces (preferentemente aproximadamente 1/3 de veces) que el de dicha primera porcion de tejido adiposo sin procesar antes de la deshidratacion.

En algunas realizaciones, la solucion fisiologica puede ser solucion de lactato de Ringer, solucion de acetato de Ringer, solucion salina, solucion salina tamponadora de fosfato, solucion de PLASMALYTE™, soluciones de cristaloides y de fluidos IV, soluciones coloidales y fluidos IV, cinco por ciento de dextrosa en agua (D5W), solucion de Hartmann o similares.

En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir adicionalmente las etapas de aislar una poblacion de celulas regenerativas derivadas de las adiposas de una segunda porcion de tejido adiposo y poner en contacto el tejido adiposo deshidratado con la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas en condiciones que permiten que la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas atraviese por permeacion el tejido adiposo deshidratado. En algunas realizaciones, la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas no es sometida a centrifugado antes de ser puesta en contacto con el tejido adiposo deshidratado. En algunas realizaciones, la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas puede ser preparada en un dispositivo dado a conocer anteriormente en esta memoria, mediante el contacto del tejido adiposo presente en la primera camara del dispositivo, por ejemplo, con unos medios de liberacion de celulas de la matriz del tejido conectivo y una solucion enzimatica que comprende colagenasa en unas condiciones que liberan dichas celulas. En algunas realizaciones, las condiciones que liberan dichas celulas incluyen calor, enfriamiento, digestion mecanica, ultrasonidos o liberacion asistida por laser, u otros medios conocidos en la tecnica y descritos en la patente U.S.A. N° 7.390.484. En algunas realizaciones, la etapa de contacto puede ser llevada a cabo en un segundo dispositivo (por ejemplo, un dispositivo que tenga la misma estructura que el primer dispositivo) fijado al primer dispositivo.

Algunas realizaciones, se refieren a un procedimiento para producir un injerto de tejido adiposo que incluye las etapas de obtener una primera porcion de tejido adiposo sin procesar introduciendo la primera porcion de tejido adiposo sin procesar en la primera camara de un dispositivo descrito anteriormente; anadir una solucion fisiologica de lavado a la primera camara con el tejido adiposo sin procesar para aclarar el tejido adiposo sin procesar; y extraer el fluido (por ejemplo, agua, solucion fisiologica de lavado, sangre, llpido libre, o similar, o cualquier combination de los mismos) de la segunda camara del dispositivo, secando de este modo el tejido adiposo y reduciendo el contenido en llpido libre.

En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir adicionalmente las etapas de aislar una poblacion de celulas regenerativas derivadas de las adiposas de una segunda porcion de tejido adiposo y poner en contacto el tejido adiposo deshidratado con la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas en unas condiciones que permiten que la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas atraviese por permeacion el tejido adiposo deshidratado. En algunas realizaciones, la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas no es sometida a centrifugado antes de ser puesta en contacto con el tejido adiposo deshidratado. En algunas realizaciones, la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas es preparada en un dispositivo dado a conocer en esta memoria mediante el contacto del tejido adiposo presente en la primera camara del dispositivo, por ejemplo, con unos medios de liberacion de celulas de la matriz del tejido conectivo y una solucion enzimatica que comprende colagenasa en unas condiciones que liberan las celulas. En algunas realizaciones, dichas condiciones que liberan las celulas incluyen calor, enfriamiento, digestion mecanica, ultrasonidos o liberacion asistida por laser, u otros medios conocidos en la tecnica y descritos en la patente U.S.A. N° 7.390.484. En algunas realizaciones, la etapa de contacto puede ser llevada a cabo en un segundo dispositivo (por ejemplo, un dispositivo que tiene la misma estructura que el primer dispositivo) fijado al primer dispositivo.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un diagrama que ilustra, a modo de ejemplo, los procedimientos de suplementado del injerto dados a conocer en esta memoria.

La figura 2 muestra un diagrama de bloques de un recipiente flexible de recogida.

La figura 3 muestra un sistema, a modo de ejemplo, utilizado para optimizar un injerto de tejido adiposo. El injerto puede ser suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas.

La figura 4 muestra aberturas y adaptadores en el sistema -300-.

La figura 5 muestra la membrana exterior -310- del sistema -300-.

La figura 6 muestra el filtro -320- del sistema -300-.

La figura 7 muestra la pantalla de separacion -330- del sistema -300-.

La figura 8 muestra, a modo de ejemplo, cierres estancos -311- del sistema -300-.

La figura 9 es una vista, en perspectiva, de un sistema -300- con aberturas y adaptadores -600-.

La figura 10 es una vista, en corte, de un conjunto -600- de la abertura del tejido utilizada con las aberturas del sistema -300-.

La figura 11 es una vista, en corte, de un conjunto -600- de la abertura del tejido utilizado con las aberturas del sistema -300-.

La figura 12 es una vista, en corte, de una tapa -610- utilizada con el conjunto -600- de la abertura del tejido.

La figura 13 es una ilustracion, a modo de ejemplo, de un sistema -800- utilizado para optimizar un injerto de tejido adiposo.

Las figuras 14A y 14B son vistas, en perspectiva, a modo de ejemplo de un dispositivo de enriquecimiento del tejido. La figura 14A muestra un receptaculo con una primera camara para el procesado de tejido adiposo, y una segunda camara, para suplementar el tejido adiposo con lipo-digestato para realizar injertos. La figura 14B representa una plataforma o un cuerpo envolvente para el receptaculo mostrado en la figura 14A.

La figura 15 es un grafico de barras que muestra el porcentaje del contenido en agua (v/v) de tejido adiposo sin procesar (control), tejido adiposo preparado mediante un procedimiento de preparacion por gravedad (Gravedad), tejido adiposo preparado mediante un procedimiento de centrifugado (Centrifugado) y tejido adiposo secado preparado segun los procedimientos y sistemas descritos en esta memoria (PureGraft).

La figura 16 es un grafico de barras que muestra el porcentaje del contenido en llpido (v/v) de tejido adiposo sin procesar (control), tejido adiposo preparado mediante un procedimiento de preparacion por gravedad (Gravedad), tejido adiposo preparado mediante un procedimiento de centrifugado (Centrifugado) y tejido adiposo secado preparado segun los procedimientos y sistemas descritos en esta memoria (PureGraft).

La figura 17 es un es un grafico de barras que muestra el contenido de globulos rojos (RBC) por gramo de tejido normalizado con respecto al contenido de globulos rojos presentes por gramo de tejido en el interior de injertos preparados segun los procedimientos y sistemas descritos en esta memoria (PureGraft). Se muestran los datos del tejido adiposo sin procesar (control), tejido adiposo preparado mediante un procedimiento de preparacion por gravedad (Gravedad), tejido adiposo preparado mediante un procedimiento de centrifugado (Centrifugado), y tejido adiposo preparado segun los procedimientos y sistemas descritos en esta memoria (PureGraft).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA realizaciOn PREFERENTE

Las realizaciones dadas a conocer en esta memoria se refieren a procedimientos y sistemas para la produccion de injertos de tejido adiposo (por ejemplo, “injertos de grasa”) o implantes de tejido adiposo, tanto solos como suplementados, mejorados o reforzados con celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de celulas adiposas, celulas endoteliales y/o celulas progenitoras). Las realizaciones dadas a conocer en esta memoria estan basadas, en parte, en el descubrimiento de un dispositivo o sistema que puede ser utilizado para la preparacion rapida y la optimizacion de injertos de tejido adiposo, de implantes, y para la preparacion de injertos e implantes enriquecidos con una poblacion de celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre

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derivadas de las adiposas) mediante, por ejemplo, circulacion por gravedad y, si se desea, a falta de centrifugado, alta presion o filtrado en vacio. Tal como se describe en esta memoria mas adelante, los injertos de tejido adiposo preparados utilizando los dispositivos dados a conocer en esta memoria tienen reducidos niveles de fluido, de celulas sanguineas, y de lipido libre o contenido en aceite, comparados con los injertos preparados utilizando tecnicas convencionales. De manera destacable, los injertos de tejido adiposo preparados utilizando los dispositivos dados a conocer en esta memoria no es preciso que esten sometidos a potentes fuerzas mecanicas que pueden conducir a una disminucion de la viabilidad de la celula y a una reduccion de la retencion del injerto de tejido adiposo. Utilizando los dispositivos dados a conocer en esta memoria, se puede obtener un implante de tejido adiposo mas predictible y mas estable.

Las realizaciones dadas a conocer en esta memoria estan basadas asimismo, en parte, en el descubrimiento por parte de los solicitantes de que fragmentos intactos de tejido adiposo o de “matriz de tejido adiposo sin procesar” pueden ser utilizados para filtrar, unir y concentrar de este modo de manera efectiva, in situ, las celulas regenerativas derivadas de las adiposas que estan dispuestas en una solucion vis a vis o en una suspension de tejido adiposo digerido, o parcialmente o totalmente desagregado. En algunas realizaciones, se puede utilizar “tejido adiposo secado” o “tejido adiposo deshidratado” para filtrar, unir y concentrar de este modo de manera efectiva, in situ, celulas regenerativas derivadas de las adiposas dispuestas en forma de lipo-digestato. En algunas realizaciones la “matriz de tejido adiposo sin procesar” puede ser secada o deshidratada despues de anadir el lipo-digestato. En consecuencia, se ha comprendido que en algunas realizaciones, ya no se precisa una concentracion del componente celular de tejido adiposo desagregado antes del incremento, suplemento o refuerzo de un injerto de tejido adiposo o de un injerto graso.

A continuacion se hara referencia en detalle a las realizaciones actualmente preferentes de la invencion, de las cuales se muestran ejemplos en los dibujos adjuntos. Siempre que es posible se utilizan los mismos o similares numeros de referencia en los dibujos y en la descripcion para hacer referencia a las mismas partes o a partes similares. Se debe observar que los dibujos estan en una forma simplificada y no estan a una escala exacta. Con referencia a la invencion presente, unicamente a efectos de comodidad y de claridad, los terminos que indican direccion tales como, superior, inferior, izquierda, derecha, arriba, abajo, encima de, sobre, abajo, debajo de, posterior y frontal, son utilizados con respecto a los dibujos adjuntos.

El objetivo de la siguiente descripcion detallada, aunque comenta realizaciones a modo de ejemplo, debe ser interpretado como que abarca todas las modificaciones, alternativas y equivalentes de las realizaciones comprendidas dentro del alcance, tal como esta definido por las reivindicaciones adjuntas. Ciertos aspectos de la presente invencion pueden ser puestos en practica conjuntamente con diversas tecnicas de separacion de celulas o de tejidos que son utilizadas convencionalmente en la tecnica, y solamente una parte de las etapas del proceso habitualmente practicadas estan incluidas en esta memoria cuando son necesarias para proporcionar una comprension de la presente invencion.

Tejido adiposo secado

Algunas realizaciones dadas a conocer en esta memoria se refieren a procedimientos para producir injertos secados de tejido adiposo que pueden ser utilizados directamente en procedimientos de trasplante autologo, por ejemplo, trasplantes autologos, o que pueden ser reforzados con celulas (por ejemplo, celulas regenerativas derivadas de las adiposas, celulas madre derivadas de las adiposas, o similares), aditivos o similares antes del trasplante.

El termino “tejido adiposo” en algunos contextos se puede referir a grasa que incluye el tejido conectivo que almacena grasa. El tejido adiposo contiene multiples tipos de celulas regenerativas incluyendo celulas madre derivadas de las adiposas (las “ADSC”), celulas endoteliales, progenitoras y precursoras, pericitos, macrofagos, fibroblastos, celulas linfaticas que incluyen celulas linfaticas endoteliales, etc. unidas por medio de la matriz del tejido conectivo.

Una “unidad de tejido adiposo” se refiere a una cantidad diferenciada o medible de tejido adiposo que puede ser medida mediante la determinacion del peso y/o del volumen de la unidad. Una unidad de tejido adiposo se puede referir a la cantidad total de tejido adiposo extraida de un paciente, o a una cantidad que es menor que la cantidad total de tejido adiposo extraida del paciente. De este modo, una unidad de tejido adiposo puede ser combinada con otra unidad de tejido adiposo para formar una unidad de tejido adiposo que tenga un peso o un volumen que sea la suma de las unidades individuales.

El tejido adiposo utilizado en las realizaciones descritas en esta memoria puede ser obtenido mediante cualquier procedimiento conocido de un experto en la materia. Por ejemplo, el tejido adiposo puede ser extraido de un paciente mediante lipoplastia asistida por aspiracion, lipoplastia asistida por ultrasonidos, lipectomia escisional, lipoplastia mediante chorro de agua, o similar. Ademas los procedimientos pueden incluir una combination de dichos procedimientos, tales como una combinacion de lipectomia escisional y lipoplastia asistida por aspiracion. Preferentemente el tejido adiposo es recogido de una manera tal que preserva la viabilidad del tejido y de sus componentes celulares y minimiza la posibilidad de contamination del material recogido con organismos potencialmente infecciosos tales como bacterias y/o virus.

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En el caso de los procedimientos de lipoplastia asistida por aspiracion, el tejido adiposo es recogido mediante la insercion de una canula en el deposito de tejido adiposo, o cerca del mismo, presente en el sujeto, seguido de la aspiracion de la adiposidad a un dispositivo de aspiracion. La utilization de una jeringa u otro dispositivo similar puede servir para recoger cantidades relativamente moderadas de tejido adiposo (por ejemplo, desde 0,1 ml hasta varios centenares de mililitros de tejido adiposo). Los procedimientos que utilizan estos dispositivos relativamente pequenos tienen la ventaja de que los procedimientos pueden ser llevados a cabo solamente con anestesia local, a diferencia de la anestesia general. Los volumenes mayores de tejido adiposo por encima de estos margenes (por ejemplo, mayores de varios centenares de mililitros) pueden precisar anestesia general, a discretion del donante y de la persona que lleva a cabo el procedimiento de recogida. Cuando se desean extraer volumenes mayores de tejido adiposo, se puede utilizar en el procedimiento canulas relativamente grandes y dispositivos de aspiracion automatizados.

Los procedimientos de lipectomla escisional incluyen procedimientos en los que el tejido que contiene tejido adiposo (por ejemplo, piel) es extraldo mediante escision, tal como una diseccion quirurgica bajo visualization directa o indirecta del tejido que se esta escindiendo.

La cantidad de tejido adiposo recogido para su utilizacion en los procedimientos dados a conocer en esta memoria depende de un numero de variables que incluyen el Indice de masa corporal del donante, la disponibilidad de sitios accesibles para la recogida del tejido adiposo, la medication y condiciones preexistentes y concomitantes (tales como una terapia anticoagulante) y el objetivo para el que se va a recoger el tejido. El injerto de trasplantes de tejido adiposo ha demostrado que es dependiente de la dosis de celulas y tiene efecto umbral. De este modo, es probable que el principio general de que “mas es mejor” sea aplicado dentro de unos llmites determinados por otras variables y que cuando sea factible la recogida se debe recoger tanto tejido como sea posible.

En algunas realizaciones, por ejemplo en realizaciones en las que el tejido adiposo secado es utilizado para hacer un injerto de tejido adiposo reforzado o suplementado, la unidad de tejido adiposo es dividida en porciones. La primera portion del tejido adiposo no es digerida ni tampoco es procesada, ni aclarada o lavada para obtener tejido adiposo seco o deshidratado tal como se describe a continuation en esta memoria. La primera porcion de tejido adiposo sin procesar, secado o deshidratado puede servir de base para el injerto que es suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas y/o celulas endoteliales y/o celulas progenitoras) presentes en el lipo-digestato o en la poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas de la segunda porcion. Una porcion puede ser procesada tal como se describe mas adelante para soltar o liberar las celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de celulas adiposas, y/o celulas endoteliales y/o celulas progenitoras) desde la matriz de tejido conectivo para obtener un lipo-digestato o una poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas que comprende celulas regenerativas o celulas madre. Por ejemplo, se recogen dos unidades diferentes de tejido adiposo, por ejemplo, de las mismas o de diferentes zonas del sujeto o de diferentes sujetos. Una unidad puede ser procesada, tal como se describe mas adelante, para obtener lipo-digestato o una poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas que comprenden celulas regenerativas o celulas madre, y la otra unidad puede servir como base para el injerto graso que es suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, lipo-digestato y/o una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas, y/o celulas endoteliales y/o celulas progenitoras). En una realization, una o ambas unidades de tejido adiposo pueden ser conservadas en frlo de tal modo que el suministro del injerto al paciente pueda estar separado en el tiempo de la recogida del tejido. En una de dichas realizaciones, una o ambas unidades de tejido pueden ser conservadas en frlo en el interior del dispositivo o del sistema de la presente invention en el que las camaras del dispositivo estan fabricadas de materiales que conservan la integridad estructural y mecanica durante los procesos de conservation en frlo, almacenamiento en frlo, descongelado y posterior utilizacion, tal como se describe en esta memoria. En otra de dichas realizaciones, el lipo-digestato o la poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas que comprende celulas regenerativas incluyendo celulas madre derivadas de las adiposas, puede ser conservado en frlo antes de su utilizacion en el reforzamiento del injerto o del implante, tal como se describe en esta memoria.

El termino “secado”, tal como se utiliza en referencia a “tejido adiposo secado”, se refiere a una unidad de tejido adiposo que tiene un menor contenido de llquido, por ejemplo, agua u otro llquido (por ejemplo, un fluido tumescente) presente en el “tejido adiposo secado” comparado con el tejido adiposo sin procesar del mismo sitio y del mismo sujeto (por ejemplo, una unidad equivalente (w/w) de tejido adiposo tomada del mismo sitio y del mismo sujeto que el tejido adiposo que fue secado).

El termino “unidad equivalente” tal como se utiliza en esta memoria se puede referir a un volumen o un peso equivalente de tejido adiposo obtenido de un sujeto. Por ejemplo, una unidad equivalente puede significar un volumen (o un peso) equivalente de tejido adiposo obtenido de un sujeto. Por ejemplo, una unidad equivalente puede significar un volumen (o un peso) equivalente obtenido del mismo sitio (por ejemplo, gluteos, abdomen, muslo, espalda o similar) del mismo o de diferente sujeto.

“Tejido adiposo sin procesar” se refiere a tejido adiposo que no ha sido parcial o totalmente desagregado, es decir, sometiendo el tejido a una desagregacion mecanica y/o enzimatica. De este modo, el tejido sin procesar contiene fragmentos intactos de tejido que incluyen tejido conectivo unido a celulas regenerativas derivadas de las adiposas.

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Tal como se utiliza en esta memoria, “celula regenerativa derivada de celulas adiposas” se refiere a cualquier celula obtenida a partir de tejido adiposo, que produce o contribuye a una regeneracion parcial o completa, a la reconstruction o sustitucion de la estructura o la funcion de un organo, tejido, o unidad fisiologica, o sistema para proporcionar de este modo un beneficio terapeutico, estructural o cosmetico. Los ejemplos de celulas regenerativas incluyen: celulas madre derivadas de las adiposas (“ADSC”), celulas endoteliales, celulas endoteliales precursoras, celulas endoteliales progenitoras, macrofagos, fibroblastos, pericitos, celulas musculares lisas, preadipocitos, adipocitos diferenciados o des-diferenciados, queratinocitos, celulas progenitoras y precursoras unipotentes y multipotentes (y su progenie) y linfocitos.

En algunas realizaciones, el tejido adiposo secado tiene aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% (o cualquier porcentaje dentro de este margen) del contenido llquido (medido en volumen y/o en peso), de una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar. Por ejemplo, el tejido adiposo secado puede tener igual a o mas de aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces (o cualquier numero dentro de este margen) menos contenido de llquido que una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar. De manera similar, el termino “deshidratado” tal como se utiliza en referencia a “tejido adiposo deshidratado” se refiere a un menor contenido en agua presente en el “tejido adiposo deshidratado” comparado con un tejido adiposo sin procesar o con una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar. Por ejemplo, el tejido adiposo secado puede tener aproximadamente mas de o igual a 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o 10 veces (o cualquier numero dentro de este margen) menos contenido de agua que una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar.

En algunas realizaciones, el tejido adiposo “secado” descrito en esta memoria puede tener un contenido o un porcentaje menor de llpido y/o de globulos rojos o leucocitos comparado con una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar. En algunas realizaciones, el tejido adiposo secado puede tener menos de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% (o cualquier porcentaje dentro de este margen), (o cualquier numero dentro de este margen) de leucocitos en una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar y/o una unidad equivalente de tejido adiposo procesado utilizando un procedimiento de centrifugado, por ejemplo, en el que el tejido escindido es centrifugado en una centrlfuga de angulo fijo o en otra tecnica convencional de preparation. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido adiposo secado puede contener menos de aproximadamente 75%, menos de 80%, menos de 85%, menos de 90%, menos de 95%, o menos, o cualquier porcentaje dentro de este margen, del numero de leucocitos en una unidad equivalente de tejido adiposo.

En algunas realizaciones, el tejido adiposo secado dado a conocer en esta memoria puede tener menos de

aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,

55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 95% (o cualquier porcentaje dentro de este margen), (o cualquier numero dentro de este margen) de globulos rojos en una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar, o de tejido adiposo preparado utilizando un procedimiento de centrifugado, por ejemplo, en el que el tejido escindido es centrifugado en una centrlfuga de angulo fijo o mediante otro planteamiento convencional de preparacion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos en los sistemas dados a conocer en esta memoria contienen menos de aproximadamente el 75%, menos del 80%, menos del 85%, menos del 90%, menos del 95%, o menos, o cualquier porcentaje dentro de este margen, del numero de globulos rojos en una unidad equivalente de tejido adiposo.

En algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo secado dados a conocer en esta memoria tienen menos de

aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,

55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 95% (o cualquier porcentaje dentro de este margen), (o cualquier numero dentro de este margen) de llpido en una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar, o de tejido adiposo preparado mediante un protocolo convencional de centrifugado, por ejemplo, en el que el tejido adiposo escindido es centrifugado en una centrlfuga de angulo fijo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los implantes de tejido adiposo secado dados a conocer en esta memoria contienen menos de aproximadamente el 75%, menos del 80%, menos del 85%, menos del 90%, menos del 95%, o menos, o cualquier porcentaje dentro de este margen, del porcentaje del contenido de llpido libre presente en una unidad equivalente de tejido adiposo sin procesar.

En algunas realizaciones, el tejido adiposo secado se obtiene disponiendo tejido adiposo sin procesar en un dispositivo que incluye un filtro y un separador, tal como se describe con mas detalle mas adelante. El filtro puede dividir el dispositivo en dos camaras internas, definiendo de este modo una primera camara y una segunda camara o subsistema. El tejido adiposo se introduce en la primera camara o subsistema del dispositivo, y preferentemente no entra en la segunda camara del dispositivo. El filtro tiene una serie de poros que permiten la circulation libre de llquido, tal como agua, fluido tumescente, solution de lavado, (por ejemplo solution de lactato de Ringer, solution salina, PLASMALYTE™ y similares), llpido libre, aceite, celulas sangulneas, celulas de la lisis del tejido adiposo y componentes sangulneos en la segunda camara, pero el tamano del poro es tal que retiene el tejido adiposo no desagregado y los fragmentos de tejido en la primera camara. La segunda camara puede incluir un separador fabricado de un material que es absorbente de llpidos y/o de fluidos (por ejemplo, un diseno de malla que arrastra fluido desde la primera camara), tal como se describe con mas detalle mas adelante. En realizaciones preferentes, el separador esta fabricado de un material poroso, en el que los poros del separador son mas grandes que los poros del filtro.

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El tejido adiposo sin procesar en el interior de la primera camara es aclarado o lavado con una solucion fisiologica de lavado. En realizaciones preferentes, la solucion fisiologica de lavado es introducida asepticamente en el dispositivo. En algunas realizaciones, la solucion de lavado es introducida en la primera camara. En algunas realizaciones, la solucion de lavado es introducida en la segunda camara y pasa a traves del filtro al interior de la segunda camara entrando de este modo en contacto con el tejido adiposo en la misma. En algunas realizaciones, la solucion de lavado es introducida tanto en la primera camara como en la segunda camara.

En algunas realizaciones, el tejido adiposo y la solucion de lavado son agitados (por ejemplo, mediante inversion, compresion o sacudida del dispositivo de manera suave), con el objeto de facilitar el aclarado y la separacion del llpido libre, los leucocitos y los globulos rojos y el fluido tumescente del tejido adiposo en la primera camara. En otras realizaciones, el tejido adiposo en el interior de la primera camara esta en contacto con la solucion de lavado a la que se permite que sea evacuada o extralda de la primera camara del dispositivo sin agitacion, por ejemplo por gravedad o por fuerzas de absorcion.

En algunas realizaciones, el volumen de la solucion de lavado utilizada para aclarar el tejido adiposo puede ser mayor que el volumen del tejido adiposo. Solamente a modo de ejemplo, en algunas realizaciones, se puede utilizar una solucion de lavado mayor de o igual a aproximadamente 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 25 ml, 30 ml, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 650 ml, 700 ml, 750 ml, 800 ml, 850 ml, 900 ml, 950 ml, 1.000 ml, 1.100 ml, 1.500 ml, 2.000 ml o cualquier cantidad dentro de estos volumenes, para aclarar el tejido adiposo sin procesar.

Durante la etapa de lavado o de aclarado, el llquido, por ejemplo, solucion de lavado, llpido libre, aceite, celulas sangulneas, celulas lisadas del tejido adiposo y componentes sangulneos, y similares, pasan a traves de los poros del filtro entre la primera y la segunda camaras del dispositivo. De este modo, la segunda camara queda llena de llquido. El separador del interior de la segunda camara puede actuar para arrastrar y retener fluido de la primera camara hacia la segunda camara, por ejemplo, actuando como un dispositivo de absorcion. El desplazamiento del agua, del fluido tumescente, la sangre y el llpido libre desde la primera camara que aloja el tejido adiposo, seca y deshidrata el tejido adiposo. El fluido es extraldo de la segunda camara a traves de una abertura. En algunas realizaciones, el fluido es extraldo de la segunda camara utilizando una bomba o un aspirador. En algunas realizaciones, se permite que el fluido sea vaciado desde la abertura que sale de la segunda camara.

Los dispositivos a modo de ejemplo para producir tejido adiposo secado, as! como los injertos de tejido adiposo suplementado o reforzado son explicados con mas detalle mas adelante haciendo referencia a las figuras 2 a 13.

En algunas realizaciones, las etapas de adicion de la solucion de lavado y de la extraccion de los contenidos de la segunda camara son repetidas 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, o mas veces.

El tejido adiposo secado puede ser extraldo (preferentemente de manera aseptica) de la primera camara. En algunas realizaciones, el tejido adiposo secado es procesado adicionalmente (por ejemplo, mediante la adicion de un aditivo, tal como se describe con mas detalle mas adelante).

Injertos de tejido adiposo suplementado

En esta memoria se describen procedimientos y sistemas para producir injertos de tejido adiposo suplementados, mejorados o reforzados, por ejemplo, en los que el injerto es tejido adiposo sin procesar o tejido adiposo secado. Por ejemplo, en algunos procedimientos descritos en esta memoria, los injertos de tejido adiposo reforzados o suplementados con celulas regenerativas derivadas de las adiposas o celulas madre derivadas de las adiposas, por ejemplo, con lipo-digestato o una poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas que comprende celulas regenerativas o celulas madre. Preferentemente, las celulas regenerativas adicionales derivadas de las adiposas o las celulas madre derivadas de las adiposas son obtenidas del mismo sujeto. En algunas realizaciones, las celulas regenerativas derivadas de las adiposas o las celulas madre derivadas de las adiposas pueden ser de un sujeto diferente.

Mediante algunos de los procedimientos descritos en esta memoria se aplica directamente, por ejemplo, lipoaspirado (“lipo-digestato”) al tejido adiposo sin procesar, al tejido adiposo secado, o a la matriz de tejido adiposo sin procesar, y el tejido adiposo sin procesar, el tejido adiposo secado o la matriz de tejido adiposo sin procesar son utilizados como filtro o tamiz para retener componentes presentes en el lipo-digestato (por ejemplo, celulas regenerativas derivadas de las adiposas tales como una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas y/o celulas endoteliales y/o celulas progenitoras). Mediante este proceso se puede preparar rapidamente un injerto de tejido adiposo, un implante, o un injerto graso que ha sido enriquecido, suplementado o reforzado con dichas celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas y/o celulas endoteliales y/o celulas progenitoras) sin etapas adicionales de depuracion adicional o de aislamiento que pueden ser engorrosas, precisar mucho tiempo y pueden tener un impacto en la viabilidad de las celulas. Mediante algunos de los procedimientos descritos en esta memoria, por

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ejemplo, las poblaciones concentradas de celulas derivadas de las adiposas que comprenden celulas regenerativas o celulas madre son aplicadas directamente sobre el tejido adiposo sin procesar, sobre el tejido adiposo secado, o sobre la matriz de tejido adiposo sin procesar y sobre el tejido adiposo no procesado y el tejido adiposo secado.

A diferencia de los planteamientos actuales para aislar, depurar y concentrar las celulas regenerativas derivadas de las adiposas, algunos procedimientos dados a conocer en esta memoria utilizan la matriz intacta del tejido adiposo sin procesar, el tejido adiposo secado, para filtrar y concentrar suavemente las celulas regenerativas derivadas de las adiposas in situ, esto es, en la propia matriz y al hacerlo as! evitar danos a la celula producidos por el centrifugado, la membrana, el gel o el gradiente, el filtrado y otras manipulaciones mecanicas del lipo-digestato. Adicionalmente, el planteamiento descrito en esta memoria promueve una distribucion uniforme o sustancialmente completa de las celulas regenerativas exogenas derivadas de las adiposas (por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre derivadas de las adiposas, y/o celulas endoteliales y/o celulas progenitoras) en todo el injerto de tejido adiposo.

Tal como se utiliza en esta memoria, “composicion de celulas regenerativas” o “lipo-digestato” se refiere a la composicion de celulas habitualmente presentes en un volumen de llquido despues de que un tejido, por ejemplo, un tejido adiposo es lavado y desagregado, por lo menos parcialmente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composicion de celulas regenerativas o lipo-digestato puede comprender una solucion de celulas que comprende una poblacion de celulas derivadas de las adiposas que comprende celulas regenerativas derivadas de las adiposas, por ejemplo, celulas madre. En algunas realizaciones, las composiciones de celulas regenerativas pueden incluir muchos tipos diferentes de celulas regenerativas, incluyendo ADSC, celulas endoteliales, celulas endoteliales precursoras, celulas endoteliales progenitoras, macrofagos, fibroblastos, pericitos, celulas musculares lisas, preadipocitos, adipocitos diferenciados o des-diferenciados, queratinocitos, celulas progenitoras y precursoras unipotentes y multipotentes (y su progenie) y linfocitos. En algunas realizaciones, las composiciones de celulas regenerativas incluyen solo uno, solo dos, solo tres, solo cuatro o mas tipos de celulas regenerativas. Las composiciones de celulas regenerativas y los lipo-digestatos pueden, en algunas realizaciones, contener asimismo uno o mas contaminantes tales como colageno, que puede estar presente en los fragmentos de tejido. En algunas realizaciones, el lipo-digestato o solucion de celulas regenerativas esta sustancialmente libre de fragmentos intactos de tejido adiposo.

Tal como se utiliza en esta memoria “celula madre” se refiere a una celula regenerativa multipotente con potencial para diferenciarse en una diversidad de otros tipos de celulas que realizan una o varias funciones especlficas y tienen la capacidad de autorenovarse. Algunas de las celulas madre dadas a conocer en esta memoria pueden ser pluripotentes.

Tal como se utiliza en esta memoria “celula progenitora” se refiere a una celula regenerativa multipotente con potencial para diferenciarse en mas de un tipo de celulas. “Celula progenitora”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere asimismo a una celula regenerativa unipotente con potencial para diferenciarse solamente en un unico tipo de celula que realiza una o varias funciones especlficas y tiene una capacidad limitada o nula de autorenovarse. En particular, tal como se utiliza en esta memoria, “celula progenitora endotelial” se refiere a una celula unipotente o multipotente con potencial para diferenciarse en celulas endoteliales vasculares.

Tal como se utiliza en esta memoria “celula precursora” se refiere a una celula regenerativa unipotente con potencial para diferenciarse en un tipo de celula. Las celulas precursoras y su progenie pueden conservar una capacidad proliferativa extensiva, por ejemplo, linfocitos y celulas endoteliales que pueden proliferar en condiciones apropiadas.

Tal como se utiliza en esta memoria “numero de celulas madre” o “frecuencia de celulas madre” se refiere al numero de colonias observadas en un ensayo clonogenico con celulas adiposas derivadas (ADC) que estan dispuestas en una placa con una baja densidad de celulas (< 10.000 celulas/cavidad) y crecen en un medio de soporte del crecimiento MSC (por ejemplo, el medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 5% de suero equino y agentes antibioticos/antimicoticos. Las celulas pueden crecer durante dos semanas despues de lo cual los cultivos pueden ser tenidos con hematoxilina. Las colonias de mas de 50 celulas son anotadas como CFU-F. La frecuencia de celulas madre se calcula como el numero de CFU-F observadas por cada 100 celulas nucleadas en la placa (por ejemplo: 15 colonias contadas en una placa iniciada con 1.000 celulas ADC nucleadas dan una frecuencia de celulas madre de 1,5%). El numero de celulas madre se calcula como la frecuencia de celulas madre multiplicada por el numero total obtenido de celulas ADC nucleadas. Un porcentaje elevado (~ 100%) de CFU-F crecidas a partir de celulas ADC indica la molecula CD105 de la superficie de la celula que se expresa asimismo mediante celulas madre derivadas de la medula (Barry y otros, 1999). CD105 se expresa asimismo mediante celulas madre derivadas de tejido adiposo (Zuk y otros, 2002). En algunas realizaciones, el tejido adiposo puede ser procesado segun los procedimientos descritos en esta memoria para obtener lipo-digestato y/o una poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas, en la que, al menos, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de las celulas son celulas madre u otro tipo de celulas regenerativas de lipo-digestato o una poblacion de celulas concentradas derivadas de las adiposas.

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Preferentemente, el tejido adiposo es procesado para producir lipo-digestato o una solucion de celulas regenerativas en un sistema esteril cerrado con un recorrido fluido/tejido cerrado para evitar cualquier contacto con el ambiente exterior y eliminar la posibilidad de contaminacion del entorno. Los dispositivos utiles para el procesado de tejido adiposo y para producir lipo-digestato son conocidos en la tecnica. En realizaciones preferentes, el tejido adiposo es procesado para producir lipo-digestato al tiempo que manteniene un sistema completamente cerrado utilizando, por ejemplo, un dispositivo tal como el descrito en la patente U.S.A. N° 7.390.484. En algunas realizaciones preferentes, el procedimiento de procesamiento del tejido adiposo no incluye centrifugado, elutriacion, o cualesquiera otros planteamientos mecanicos para concentrar la poblacion de celulas que comprende celulas regenerativas derivadas de las adiposas que produce o tiene potencial para producir una disminucion de la viabilidad de las celulas regenerativas en la composition de celulas/lipo-digestato.

En algunas realizaciones, el proceso para obtener lipo-digestato incluye la extraction o la reduction del componente del tejido del adipocito maduro cargado de grasa de la portion o la unidad de tejido adiposo utilizada para producir el lipo-digestato o la poblacion de celulas concentradas derivadas de las adiposas. En algunas realizaciones, el tejido adiposo es sometido a una serie de etapas de lavado y desagregacion en las que, en primer lugar, el tejido es aclarado para reducir la presencia de llpidos libres (liberados de los adipocitos divididos) y de los elementos de la sangre periferica (liberada de los vasos sangulneos seccionados durante la recogida del tejido). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido adiposo es mezclado con una solucion salina isotonica, por ejemplo, una solucion salina tamponadora de fosfato, u otras soluciones fisiologicas (por ejemplo, PLASMALYTE® de la firma Baxter Inc., NORMOSO® de la firma Abbott Labs, o solucion Ringer de lactato). El tejido lavado puede ser desagregado a continuation para liberar adipocitos intactos y otras poblaciones de celulas de la matriz de tejido conectivo. En ciertas realizaciones, la totalidad del componente adipocito o el componente de celulas no regenerativas es separado del componente de celulas regenerativas del tejido adiposo. En otras realizaciones, solamente una porcion o porciones del componente adipocito es separada de las celulas regenerativas. Los fragmentos intactos de tejido adiposo pueden ser separados de las celulas y llpidos libres mediante diversos planteamientos que incluyen, pero no estan limitados a, filtrado, decantation, o sedimentation, o similar. Preferentemente, el tejido digerido no es sometido a centrifugado o a elutriacion.

En algunas realizaciones, el tejido adiposo utilizado para generar el lipo-digestato es desagregado totalmente, mientras que en otras realizaciones es desagregado solo parcialmente. Los fragmentos intactos de tejido adiposo, por ejemplo, de tejido adiposo sin procesar o lavado pueden ser desagregados utilizando cualquier tecnica o procedimiento convencional, incluyendo la fuerza mecanica (fuerzas de triturado o cizallado), digestion enzimatica con enzimas proteollticas solas o combinadas, tales como colagenasa, tripsina, lipasa, liberasa Hl, tal como se da a conocer en la patente U.S.A. N° 5.952.215, y pepsina, o una combination de procedimientos mecanicos y enzimaticos. Unos procedimientos adicionales que utilizan colagenasa que pueden ser usados para desagregar tejido adiposo son dados a conocer en las patentes U.S.A. N° 5.830.714 y 5.952.215 y en el documento de Williams, S. K., S. McKenney y otros (1995) “Selection y depuration de lotes de colagenasa para la digestion de tejido adiposo”. Trasplante de celulas 4(3): 281-9. En algunas realizaciones, se pueden utilizar proteasas neutras para desagregar tejido, en vez o ademas de colagenasa, tal como se da a conocer en Twentyman, P. R. y J. M. Yuhas (1980). “Utilization de proteasa bacterial neutra para la desagregacion de tumores en ratones y tumores esferoidales multicelulares”. Cancer Lett 9 (3): 225-8. En algunas realizaciones, el tejido adiposo es desagregado con una combinacion de enzimas, tal como una combinacion de colagenasa y tripsina, tal como se da a conocer en Russell, S. W., W. F. Doe y otros (1976) “Celulas inflamatorias en neoplasmas solidos en murinos. Desagregacion de tumores e identification de celulas inflamatorias constituyentes” Int. J Cancer 18(3): 322-30. En algunas realizaciones, el tejido adiposo puede ser desagregado utilizando una combinacion de una enzima tal como tripsina y disociacion mecanica, tal como se da a conocer en Engelholm, S.A., M. Spang-Thomsen y otros (1985) “Desagregacion de tumores humanos solidos mediante procedimientos mecanicos y enzimaticos combinados” Br J Cancer 51(1): 93-8.

En algunas realizaciones, una porcion del tejido adiposo es desagregada totalmente para separar las celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, celulas madre derivadas de las adiposas) de los adipocitos maduros y del tejido conectivo. En algunas realizaciones, una porcion del tejido adiposo es desagregada solo parcialmente. Por ejemplo, la desagregacion parcial puede ser realizada con una o varias enzimas que son extraldas antes, por lo menos, de una parte del tejido adiposo con respecto a la cantidad de tiempo que la enzima podrla ser dejada en otro caso para desagregar totalmente la porcion del tejido adiposo. Dicho proceso puede requerir menos tiempo de procesamiento.

En algunas realizaciones, una porcion o una unidad de tejido adiposo es lavada con una solucion salina tamponadora esteril isotonica y es incubada con colagenasa, con una concentration de colagenasa, una temperatura y un tiempo suficientes para producir la desagregacion adecuada. Preferentemente, las enzimas utilizadas para la desagregacion son las aprobadas para uso humano por la autoridad competente (por ejemplo la Administration U.S.A. de drogas y alimentos) y estan libres de microorganismos y de contaminantes tales como endotoxina. Las preparaciones adecuadas de colagenasa incluyen colagenasa recombinante y no recombinante. La colagenasa no recombinante se puede obtener en la firma F. Hoffmann-LaRoche Ltd., Indianapolis, Ind. y/o en Advance Biofactures Corp., Lynbrook, N.Y. Las colagenasas recombinantes se pueden obtener asimismo tal como se da a conocer en la patente U.S.A. N° 6.475.764.

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A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido adiposo es tratado con soluciones de colagenasa desde aproximadamente 0,5 pg/ml hasta aproximadamente 100 pg/ml, por ejemplo, colagenasa desde10 pg/ml hasta aproximadamente 50 pg/ml y es incubado a una temperatura desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 38°C desde aproximadamente durante 20 minutos hasta aproximadamente 60 minutos. Estos parametros variaran segun la fuente de la enzima de colagenasa, optimizados por estudios emplricos, con el objeto de validar que el sistema es efectivo para la extraction de las poblaciones deseadas de celulas en un marco de tiempos apropiado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido es incubado con una solution que comprende colagenasa durante 10 a 15 minutos, aproximadamente a 37°C.

Despues de la desagregacion, el lipo-digestato puede ser lavado/aclarado para extraer aditivos y/o subproductos del proceso de desagregacion, por ejemplo, colagenasa y/u otros agentes de desagregacion enzimaticos, y llpido libre recien liberado.

En algunas realizaciones, el lipo-digestato puede ser aplicado a una portion de tejido adiposo secado sin procesar, en condiciones que permitan que el lipo-digestato penetre a traves del tejido adiposo secado sin procesar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el lipo-digestato puede ser resuspendido dispuesto en capas encima (o debajo) de una porcion de tejido adiposo sin procesar, el tejido adiposo secado y el lipo-digestato son filtrados a traves del tejido adiposo sin procesar (o del tejido adiposo secado) utilizando las fuerzas gravitatiorias. En algunas realizaciones, el lipo-digestato es bombeado a traves del tejido adiposo sin procesar, por ejemplo utilizando una bomba peristaltica, aspirador o similar. En algunas realizaciones, el lipo-digestato es anadido al tejido adiposo sin procesar para crear una mezcla, y la mezcla es agitada o sacudida, mecanica o manualmente. Cuando el lipo-digestato es filtrado a traves del tejido adiposo sin procesar o mezclado con el mismo, las celulas regenerativas derivadas de las adiposas pueden quedar unidas por la matriz del tejido conectivo y la solucion salina y otros fluidos circulan a traves del tejido produciendo de este modo un injerto graso o un implante suplementado o mejorado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas (por ejemplo, comprendiendo las celulas regenerativas derivadas de las adiposas, celulas madre). En algunas realizaciones la circulation, por ejemplo de solucion salina, adipocitos maduros, globulos rojos y similares, es extralda a un recipiente de residuos. Los sistemas y dispositivos para generar injertos de tejido adiposo suplementado se comentan con mayor detalle mas adelante y una realization del procedimiento esta representada en el esquema mostrado en la figura 1.

La figura 1 muestra el esquema de un recorrido a modo de ejemplo para preparar un injerto de tejido adiposo suplementado. En la primera etapa, esta dispuesta una unidad de tejido adiposo en un recipiente cerrado/esteril (por ejemplo una bolsa flexible plegable o un recipiente rlgido tal como esta descrito en otra parte en esta memoria) a traves de una entrada. El tejido adiposo es aclarado/lavado y digerido en el interior del recipiente, al tiempo que mantiene un sistema cerrado, tal como esta descrito en esta memoria. En la realizacion mostrada en la figura 1 el primer recipiente tiene una entrada y una salida. El primer recipiente mostrado en la figura 1 muestra una entrada unica y una salida unica, sin embargo, un experto en la materia comprendera que los dispositivos descritos en esta memoria pueden incluir multiples entradas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas entradas y salidas. Preferentemente, la entrada o entradas y la salida o salidas estan configuradas para una adicion y/o extraccion asepticas de los contenidos (por ejemplo, tejidos, aditivos, soluciones y similares) en el primer recipiente.

En la realizacion dada a conocer en la figura 1, una segunda unidad de tejido adiposo o una porcion de la primera unidad de tejido adiposo esta proporcionada en un segundo recipiente (por ejemplo, una bolsa flexible plegable o un recipiente rlgido tal como esta descrito en otra parte en esta memoria). En la realizacion mostrada en la figura 1, el segundo recipiente tiene una entrada o entradas y una salida o salidas. La entrada del segundo recipiente esta configurada para la adicion de contenidos (por ejemplo, lipo-digestato o poblaciones concentradas de celulas derivadas de las adiposas) en el interior del recipiente, preferentemente al tiempo que se mantiene un recorrido cerrado esteril del fluido. La salida esta configurada para la extraccion de los contenidos, por ejemplo, el exceso de solucion de lavado, de llpido libre, sangre y similares del segundo recipiente.

En la realizacion mostrada en la figura 1, despues de la digestion, el lipo-digestato y los fragmentos no desagregados de tejido adiposo y el llpido libre forman diferentes capas en el interior del primer recipiente. La capa de lipo-digestato puede salir (por ejemplo, a traves de una bomba o aspirador tal como se muestra en la figura 1) a traves de una salida en el recipiente cerrado, y entrar, por ejemplo, a traves de un conducto que mantiene el sistema cerrado, en un recipiente separado que contiene tejido adiposo secado, sin procesar o lavado. El lipo-digestato del primer recipiente es mezclado con el tejido adiposo secado sin procesar en condiciones que permiten que las celulas regenerativas derivadas de las adiposas separadas en el lipo-digestato o la poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas, penetren a traves del tejido adiposo. En la figura 1, las celulas regenerativas son bombeadas a traves del tejido adiposo sin procesar o secado para crear el injerto de tejido adiposo suplementado.

En algunas realizaciones, todo exceso de lipo-digestato o de solucion concentrada de celulas derivadas de las adiposas es recirculado a traves del tejido adiposo secado, sin procesar, al segundo recipiente disponiendo un bucle aseptico en el segundo recipiente en el que el exceso de solucion de celulas regenerativas o de lipo-digestato se vacla a traves de una abertura de salida (salida) a un conducto que conduce a una abertura de entrada (entrada) en el recipiente que aloja el tejido adiposo.

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Se comprendera que al producir los injertos de tejido adiposo reforzado o suplementado descritos en esta memoria, los volumenes de las diversas unidades o porciones de tejido adiposo utilizadas para producir el lipo-digestato o las soluciones concentradas de celulas derivadas de las adiposas y que sirven de base o fundamento para el injerto de tejido adiposo que es suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas o lipo-digestato, pueden ser iguales o pueden ser diferentes. Por ejemplo, el volumen de tejido adiposo utilizado para producir el lipo-digestato puede ser, por lo menos, mayor o igual de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, o cualquier cantidad dentro de este margen, mas que el volumen de otra unidad de tejido adiposo. En algunas realizaciones, el volumen de tejido adiposo utilizado para producir el lipo-digestato puede ser, por lo menos, mayor o igual de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, o cualquier cantidad dentro de este margen, menor que el volumen de otra unidad de tejido adiposo. En algunas realizaciones, la proportion de lipo-digestato : tejido injertado es de aproximadamente 0,25:1, 0,5:1, 0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1, 1,75:1 o 2:1, o cualquier proporcion dentro de este margen. Preferentemente, la proporcion de lipo-digestato a tejido injertado es de menos de aproximadamente 1:1, tal como 0,5:1 o 0,25:1.

En algunas realizaciones, la portion de tejido adiposo procesado (por ejemplo, lipoaspirado digerido o una solution de celulas regenerativas) y/o una porcion de tejido adiposo sin procesar, de tejido adiposo secado, y/o un injerto de tejido adiposo suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas descrito en esta memoria, puede ser combinada, reforzada, suplementada, mejorada o mezclada con aditivos tales como otras celulas, tejido, fragmentos de tejido, hueso desmineralizado, o factores o agentes tales como aditivos que realizan el lisado de los adipocitos y/o de los globulos rojos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la porcion de tejido adiposo procesado y/o una porcion de tejido adiposo sin procesar (o de tejido adiposo secado), y/o un injerto de tejido adiposo suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas descrito en esta memoria puede ser combinada, suplementada, o mezclada con aditivos de factor de crecimiento tales como insulina o medicamentos tales como elementos de la familia de la tiaglitazona, antibioticos, compuestos biologicamente activos o inertes tales como coagulasas, inhibidores de reagregacion de las celulas, estructuras de plastico reabsorbibles, u otros aditivos previstos para mejorar el suministro, la eficacia, la tolerabilidad o la funcion de la poblacion.

En ciertas realizaciones, el tejido adiposo sin procesar, el tejido adiposo secado, el lipo-digestato y/o los injertos de tejido adiposo suplementados pueden ser suplementados con uno o varios agentes aditivos de diferenciacion celular, tales como citoquinas y factores de crecimiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones son suplementadas con agentes o factores angiogenicos. En algunas realizaciones, el tejido adiposo sin procesar, el tejido adiposo secado, el lipo-digestato, y/o los injertos adiposos suplementados descritos en esta memoria estan dotados de un factor o factores angiogenicos como un aditivo. Tal como se utiliza en esta memoria, el termino “angiogenesis” se refiere al proceso mediante el cual se generan nuevos vasos sangulneos a partir de la vasculatura y el tejido existentes (Folkman, 1995). Tal como se utiliza en esta memoria, el termino “factor angiogenico” o “protelna angiogenica” se refiere a cualquier protelna conocida, peptido, u otro agente capaz de promover el crecimiento de nuevos vasos sangulneos a partir de la vasculatura existente (“angiogenesis”). Los factores angiogenicos adecuados a utilizar en la invention incluyen, pero no estan limitados a: Factor de crecimiento de la placenta (Luttun y otros, 2002), Factor de estimulacion de colonias de macrofagos (Aharinejad y otros, 1995), Factor de estimulacion de colonias de granulocitos macrofagos (Buschmann y otros, 2003), Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, YEGF-D, VEGF-E (Mints y otros, 2002), neuroplina (Wang y otros, 2003), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-1, FGF-2(bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 (Botta y otros, 2000), Angiopoyetina 1, Angiopoyetina 2 (Sundberg y otros, 2002), eritropoyetina (Ribatti y otros, 2003), BMP-2, BMP-4, BMP-7 (Carano y Filvaroff, 2003), TGF-beta (Xiong y otros, 2002), IGF-1 (Shigematsu y otros, 1999), Osteopontina (Asou y otros, 2001), Pleyotropina (Beecken y otros, 2000), Activina (Lamouille y otros, 2002), Endotelina-1 (Bagnato y Spinella, 2003), y combinaciones de los mismos. Los factores angiogenicos pueden actuar de forma independiente o en combination entre si. Cuando actuan en combination, los factores angiogenicos pueden actuar asimismo de forma sinergica, con lo que el efecto combinado de los factores es mayor que la suma de los efectos de los factores individuales tomados por separado. El termino “factor angiogenico” o “protelna angiogenica” abarca tambien analogos funcionales de dichos factores. Los analogos funcionales incluyen, por ejemplo, porciones funcionales de los factores. Los analogos funcionales incluyen asimismo anticuerpos anti-idiotlpicos que se unen a los receptores de los factores y, de este modo, simulan la actividad de los factores que promueven la angiogenesis. Los procedimientos para generar dichos anticuerpos anti-idiotl picos son bien conocidos en la tecnica y estan descritos, por ejemplo, en el documento WO 97/23510.

De este modo, la presente invencion permite que los injertos de tejido adiposo sean aplicados a un paciente distinto del paciente del que se obtuvieron las celulas y/o el tejido, pudiendo ser administrados uno o mas agentes aditivos inmunosupresivos al paciente que recibe el injerto para reducir, y preferentemente evitar, el rechazo del trasplante. Los ejemplos de agentes inmunosupresivos adecuados con los procedimientos dados a conocer en esta memoria incluyen agentes que inhiben los recorridos de coestimulacion de celulas T - / celulas B, tales como los agentes que interfieren con el acoplamiento de celulas T y celulas B a traves de los recorridos CTLA4 y B7, tal como se da a

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conocer en la publicacion de la patente U.S.A. N° 20020182211. Otros ejemplos incluyen ciclosporina, mofetilo de miofenilato, rapamicina y globulina anti-timocito.

En algunas realizaciones, por lo menos una porcion del tejido sin procesar, el tejido adiposo secado el lipo-digestato y/o el injerto de tejido adiposo suplementado, son almacenados para una implantacion/infusion posterior. Por ejemplo, las composiciones dadas a conocer en esta memoria (es decir, tejido sin procesar, tejido adiposo secado, lipo-digestato, poblaciones concentradas de celulas adiposas derivadas de celulas adiposas y/o injerto de tejido adiposo suplementado) pueden ser divididas en mas de una unidad o una parte allcuota de tal modo que parte de la composicion es conservada para una aplicacion posterior mientras que parte es aplicada inmediatamente al paciente.

Al final del proceso, el injerto de tejido adiposo suplementado o reforzado puede ser cargado en un dispositivo de suministro tal como una jeringa, una estructura, una capsula absorbible o un implante para su colocacion en el receptor mediante, por ejemplo, tecnicas subcutaneas. En otras palabras, el injerto graso suplementado, mejorado o reforzado o el implante pueden ser colocados en el paciente mediante cualquier medio conocido de los expertos en la materia, por ejemplo, pueden ser introducidos en la dermis (subcutaneos), en el espacio del tejido o en el interior de los tejidos (por ejemplo, pecho, gluteos, o similares) o en otra ubicacion.

Dispositivos para producir injertos de tejido adiposo secado e injertos de tejido adiposo suplementados

Tal como se ha descrito anteriormente en esta memoria estan dispuestos dispositivos y/o sistemas para producir injertos de tejido adiposo secados y suplementados o reforzados. Volviendo a la figura 2, en ella se muestra un sistema a modo de ejemplo para la produccion de injertos de tejido adiposo adecuados para ser suplementados con celulas regenerativas derivadas de las adiposas. El sistema comprende un recipiente flexible de recogida -200-, por ejemplo, una bolsa de recogida de calidad medica con una capa de malla filtrante -210- que divide la bolsa en una primera camara interna -280- y una segunda camara interna -290-. En algunas realizaciones, el filtro puede comprender una pluralidad de aberturas o poros que permiten el paso de los contenidos, por ejemplo, adipocitos maduros, globulos rojos, solucion salina, y similares desde la primera camara interna al interior de la segunda camara interna. Preferentemente la pluralidad de poros en el filtro son mayores de aproximadamente 30 pm. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la pluralidad de aberturas en el filtro pueden ser mayores que, menores que o iguales a 30 pm, 35 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 110 pm, 120 pm, 130 pm, 140 pm, 150 pm, 160 pm, 170 pm, 180 pm, 190 pm, 200 pm, 210 pm, 220 pm, 230 pm, 240 pm, 250 pm, 260 pm, 270 pm, 280 pm, 290 pm, y 300 pm, o cualquier numero comprendido entre estos margenes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la pluralidad de aberturas en el filtro -210- pueden estar comprendidas entre aproximadamente 30 pm, hasta aproximadamente 500 pm, (por ejemplo, aproximadamente de 60 pm a 300 pm, tal como de 74 hasta aproximadamente 265 pm).

En algunas realizaciones, la primera camara interna -280- incluye dos aberturas -220-, -230-. En algunas realizaciones, la segunda camara interna -290- incluye una abertura -240-. En algunas realizaciones, el recipiente flexible de recogida -200- comprende un recipiente de lavado -250- para la solucion de lavado o de aclarado que esta acoplado funcionalmente a la camara interna de recogida -280- a traves de la abertura -220- para permitir el paso de la solucion desde el recipiente -250- a la camara interna -280- a traves de un recorrido cerrado del fluido. En algunas realizaciones, la abertura -240- esta acoplada funcionalmente a una bolsa de residuos -260- a traves de la cual los contenidos tales como los globulos rojos, la solucion fisiologica, los adipocitos maduros y similares son extraldos de la camara interna -290-.

En algunas realizaciones el tejido adiposo es anadido a la camara flexible de recogida -200- a traves de la abertura -220-. En algunas realizaciones, una solucion de aclarado como la solucion de lactato de Ringer, es anadida a la primera camara interna a traves de la abertura -230-. El recipiente flexible de recogida es agitado o sacudido a continuacion, por ejemplo, en un dispositivo de sacudida mecanica u otro dispositivo de agitacion. Los globulos rojos, el exceso de solucion de aclarado, las celulas lisadas y los adipocitos maduros y el llpido son extraldos del tejido presente en la camara -280-.

En algunas realizaciones, el sistema esta configurado para permitir la adicion aseptica de lipo-digestato a la camara interna -280- que aloja el tejido adiposo aclarado. Por ejemplo, el recipiente flexible de recogida -200- puede tener una abertura adicional para proporcionar un recorrido esteril de entrada al interior de la camara interna -280- por el que se puede dirigir el lipo-digestato.

Las figuras 3 a 13 muestran realizaciones adicionales de los sistemas dados a conocer en esta memoria para la produccion de injertos de tejido adiposo. Las figuras 3 y 4 muestran una configuracion a modo de ejemplo de un sistema -300- que proporciona un proceso esteril, cerrado, para controlar la hidratacion de un injerto de tejido adiposo, por ejemplo, para crear tejido adiposo secado. Por ejemplo, un problema corriente asociado a la preparacion de implantes de tejido adiposo se refiere a la impredictibilidad del comportamiento del implante despues de la implantacion, debido a la reabsorcion o a la absorcion de fluidos en el cuerpo procedentes del tejido injertado. Tal como se describe mas adelante, el sistema -300- proporciona al operario la posibilidad de reducir esta variabilidad mediante la creacion de un injerto mas seco que el que se obtiene convencionalmente del tejido adiposo. Ademas, este injerto o implante de tejido adiposo mas seco puede estar, opcionalmente, suplementado con

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lipo-digestato (o con poblaciones concentradas de celulas derivadas de las adiposas que comprenden celulas regenerativas) o aplicado directamente a un sujeto.

Las figuras 3 y 4 muestran la configuracion de una realizacion del sistema -300- para la preparacion de tejido adiposo secado. El sistema -300- comprende una primera envoltura exterior -310- y una segunda envoltura exterior -340- (denominadas conjuntamente y de manera intercambiable en esta memoria como “envolturas exteriores” o “envoltura exterior”) cerradas hermeticamente juntas para formar la capa exterior del sistema -300-. La figura 5 muestra, a modo de ejemplo, una envoltura exterior -310- (o -340-) utilizada en el sistema -300-. Tal como se describe mas adelante, las envolturas exteriores -310-, -340- pueden estar fijadas, unidas o selladas entre si para formar una bolsa flexible, plegable. La figura 8 muestra un detalle de un cierre estanco -311- a modo de ejemplo que puede ser utilizado en la fabrication del sistema -300-. La primera y la segunda envolturas exteriores -310- y -340- pueden estar fabricadas de cualquier material flexible de calidad medica conocido en la tecnica, por ejemplo, Clase VI de calidad medica USP o acetato de etil vinilo (EVA) de calidad medica. En algunas realizaciones, el material flexible que forma la primera y la segunda envolturas exteriores puede estar fabricado de cualquier material que se pueda unir a si mismo. En otras realizaciones, el material flexible que forma la primera y la segunda envolturas exteriores puede estar fabricado de cualquier material que pueda ser unido a si mismo y que pueda aprisionar y/o sellar cualquier otro material presente en el sistema o en los subsistemas. Las envolturas exteriores pueden estar fabricadas asimismo de un material que pueda resistir la conservation en frlo. Las envolturas exteriores pueden estar fabricadas asimismo de un material que pueda soportar un autoclave, materiales que sean transparentes o de colores, materiales que sean biocompatibles, materiales que sean resistentes a los fluidos corporales y/o materiales que sean esterilizables, por ejemplo, con radiation, oxido de etileno o calor seco.

Por ejemplo, el material puede ser EVA de calidad medica. Ademas, el material es tal que se pueda unir a si mismo y aprisionar otro material, por ejemplo, filtros presentes en el interior del sistema. La union se puede realizar por medio de procesos descritos adicionalmente en esta memoria tales como soldadura por RF. En ciertas realizaciones, las envolturas exteriores pueden ser selladas entre si mediante un doble sellado por calor a lo largo del perlmetro de las envolturas exteriores, como en el sistema -300- mostrado en las figuras 3 a 13. Las envolturas exteriores o cualquiera de los subsistemas pueden ser sellados utilizando adhesivos conocidos por los expertos en la tecnica. Se pueden considerar los tipos de adhesivos a utilizar incluyendo su mecanismo de action. Por ejemplo, se pueden utilizar adhesivos que se endurecen por la perdida del disolvente, adhesivos que se endurecen por perdida de agua, adhesivos que se endurecen mediante enfriamiento, adhesivos que se endurecen mediante reaction qulmica, adhesivos que no se endurecen y adhesivos sensibles a la presion. Se pueden considerar mecanismos tales como la adhesion mediante adsorcion flsica, adhesion mediante union qulmica, teorla electrostatica de la adhesion, enclavamiento mecanico, adhesion por interdifusion, capas llmite debiles, y adhesion sensible a la presion. Las superficies a unir deben ser tratadas tambien tales como la topografla de superficies, la termodinamica de superficies, y el analisis qulmico de superficies. Ciertas superficies a unir pueden requerir asimismo tratamientos previos particulares para un sellado optimo. Por ejemplo, se pueden considerar tratamientos previos apropiados para metales, tratamientos previos para materiales inorganicos, tratamientos previos para plasticos y tratamientos previos para elastomeros.

En algunas realizaciones, los sistemas y subsistemas creados poseen ventajosamente propiedades mecanicas que les permiten soportar tensiones. De este modo, se debe realizar un analisis global de tensiones, as! como un analisis por elementos finitos de las uniones adhesivas. La durabilidad de las uniones adhesivas debe ser asimismo evaluada. Por ejemplo, se deben considerar aditivos para reducir la degradation foto-oxidativa. El comportamiento de las uniones estructurales a metales en entornos humedos debe ser considerado. El agua y los adhesivos, el agua y las superficies adhesivas de interconexion, otros fluidos, y las uniones en madera deben ser asimismo considerados. En algunas realizaciones, puede ser necesario realizar un ensayo no destructivo utilizando ultrasonidos convencionales, dispositivos de ensayo de uniones, procedimientos de escaneado rapido y medicion de la adecuacion cohesiva. Asimismo, puede ser necesario evaluar el comportamiento al impacto de las uniones unidas con adhesivo. Por ejemplo, se puede evaluar un ensayo al impacto de adhesivos y de uniones fijadas con adhesivo, las caracterlsticas de los adhesivos bajo una alto Indice de carga y la distribution de tensiones y la variation en las uniones fijadas con adhesivo sometidas a impacto. Asimismo, puede ser deseable evaluar la fractura mecanica de uniones adhesivas. Por ejemplo, criterios de energla respecto a fallos, intensidad de tensiones, velocidad de liberation de energla, energla de adherencia termodinamica, intrlnseca, y practica, evaluation de la energla de fractura y durabilidad. Otros factores que pueden ser evaluados incluyen fatiga, amortiguacion de vibraciones, union de materiales similares y disimilares y materiales compuestos de union.

En una realizacion particular, las envolturas exteriores del sistema o de cualquiera de los subsistemas, o cualquier combination adecuada pueden ser selladas utilizando soldadura por radiofrecuencia (RF). La soldadura por rF es denominada asimismo como soldadura dielectrica o por alta frecuencia (HF). La soldadura por RF es un proceso de aplicacion de radiofrecuencia para fundir materiales juntos. La soldadura resultante puede ser tan fuerte como los materiales originales. La soldadura por RF se basa en determinadas propiedades del material a soldar para producir generation de calor en un campo electrico que varla rapidamente. Concretamente, el proceso implica someter las piezas a unir a un campo electromagnetico de alta frecuencia (13 - 100 MHz) aplicado entre dos varillas metalicas, que produce el calentamiento del material que va a ser fundido junto. Con la utilization de esta tecnica solamente se pueden soldar ciertos materiales. El policloruro de vinilo (PVC) y los poliuretanos son los termoplasticos mas

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corrientes que pueden ser soldados mediante el proceso de RF. Es posible soldar mediante RF otros pollmeros incluyendo nailon, PET, EVA y algunas resinas ABS aunque pueden requerir condiciones especiales. Por ejemplo, el nailon y el PET pueden ser son soldados si se utilizan varillas de soldadura precalentadas ademas de la energla de RF. La soldadura mediante RF puede no ser adecuada para PTFE, policarbonato, poliestireno, polietileno o polipropileno. No obstante, se ha desarrollado una calidad especial de poliolefina que tiene la capacidad de ser soldada mediante RF.

La funcion primaria de la soldadura por RF es formar una union en dos o mas grosores de material laminar. Al incorporar un borde cortante junto a la superficie de soldadura, el proceso puede soldar y cortar simultaneamente un material. El borde cortante comprime suficientemente el plastico caliente para permitir que el exceso de material sobrante sea recortado, por lo que el proceso se denomina a menudo como soldadura de corte y sellado. Es asimismo posible soldar piezas adicionales de material sobre la superficie de un producto.

En algunas realizaciones, el sistema y los subsistemas pueden ser sellados asimismo utilizando soldadura por ultrasonidos. Cuando se une material mediante soldadura ultrasonica, la energla requerida es en forma de vibraciones mecanicas. La herramienta de soldadura (sonotrodo) se acopla a la pieza a soldar y se desplaza en direccion longitudinal. La pieza a soldar permanece estatica. Las piezas que deben ser unidas son comprimidas simultaneamente una contra la otra. La accion simultanea de las fuerzas estaticas y dinamicas produce la fusion de las piezas sin tener que utilizar material adicional. Este procedimiento puede ser utilizado a escala industrial para unir tanto plasticos como metales que pueden ser utilizados en el sistema descrito en esta memoria. En el caso de soldadura ultrasonica de plasticos, el aumento termico en la zona de la union es producido por la absorcion de vibraciones mecanicas, la reflexion de las vibraciones en la zona de conexion y la friccion de las superficies de las piezas. Las vibraciones son introducidas verticalmente. En la zona de contraccion, se produce calor de friccion, de modo que el material se plastifica localmente, forjando una conexion indisoluble entre ambas piezas en un periodo de tiempo muy corto. El requisito previo es que ambas piezas a unir tengan un punto de fusion casi equivalente. La calidad de la union de la soldadura ultrasonica es muy uniforme debido a que la transferencia de energla y el calor interno liberado permanecen constantes y esta limitada a la zona de union. Con el objeto de obtener un resultado optimo, las zonas a unir deben estar preparadas para hacerlas adecuadas para la union por ultrasonidos. Ademas de la soldadura de plasticos, los ultrasonidos pueden ser utilizados tambien para remachar partes de trabajo del sistema descrito en esta memoria o para incrustar piezas de metal en el plastico segun se precise.

Un tecnico en la materia comprendera que el sistema dado a conocer en esta memoria puede estar fabricado de materiales distintos de los materiales flexibles descritos anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema o los componentes del sistema descrito en esta memoria pueden ser fabricados de metal. En dichas realizaciones, la soldadura ultrasonica de metales puede ser utilizada para unir o fijar entre si componentes del sistema. A diferencia de otros procesos, las piezas a soldar no se calientan hasta el punto de fusion, sino que son conectadas aplicando presion y vibraciones mecanicas de alta frecuencia. A diferencia de la soldadura de plasticos, las vibraciones mecanicas utilizadas en la soldadura ultrasonica de metales son introducidas horizontalmente. Concretamente, durante la soldadura ultrasonica de metales, se inicia un proceso complejo que implica fuerzas estaticas, fuerzas de cizallado oscilatorias y un moderado incremento de la temperatura en la zona de la soldadura. La magnitud de estos factores depende del grosor de las piezas de trabajo, su estructura superficial y sus propiedades mecanicas. Las piezas de trabajo son colocadas entre una parte fija de la maquina, es decir, el yunque y el sonotrodo, que oscila horizontalmente durante el proceso de soldadura a alta frecuencia (habitualmente 20 o 35 o 40 kHz). La frecuencia de oscilacion utilizada mas corrientemente (frecuencia de trabajo) es de 20 kHz. Esta frecuencia esta por encima de la que es audible por el oldo humano y permite asimismo el mejor uso posible de la energla. En el caso de procesos de soldadura que solamente requieren una pequena cantidad de energla, se puede utilizar una frecuencia de trabajo de 35 o 40 kHz.

El sistema -300- a modo de ejemplo mostrado en las figuras 3 a 13 comprende un primer y un segundo subsistema o una primera y una segunda camaras creadas mediante la insercion de un material filtrante -320- entre la envoltura exterior -310- y la envoltura exterior -340-. El primer subsistema o camara esta definido por el area entre la envoltura exterior -310- y el material filtrante -320-, y el segundo subsistema o camara esta definido por el area entre el material filtrante -320- y la envoltura exterior -340-. En ciertas realizaciones, un doble sellado calorlfico a lo largo del perlmetro del sistema -300- aprisiona el material filtrante -320-, de tal modo que se forman dos subsistemas o camaras distintos en el interior del sistema -300-. El material filtrante puede comprender una pluralidad de aberturas que teoricamente permitirlan el paso de la mayorla de ciertos contenidos, por ejemplo, llquidos, fluidos tumescentes, globulos rojos, soluciones de lavado (por ejemplo, solucion salina, solucion de lactato de Ringer y similares), residuos celulares y la retencion de la mayorla de ciertos contenidos, por ejemplo, adipocitos maduros, celulas regenerativas, celulas madre, celulas progenitoras y tejido conectivo. Los componentes que pasan a traves y los que son retenidos son determinados por el tamano de las aberturas en el material filtrante, es decir, generalmente los componentes mas pequenos que las aberturas pasan a traves y los componentes mas grandes que las aberturas son retenidos. En consecuencia, el material filtrante puede ser seleccionado en base al tamano de los componentes de interes. Se comprendera que dependiendo de las condiciones del sistema, por ejemplo, presion, flujo de aire, viscosidad, etc. el numero o el porcentaje de componentes mas pequenos que las aberturas en el material filtrante que pasaran a traves y el numero o el porcentaje de componentes mas grandes que las aberturas que seran retenidos, puede variar.

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Preferentemente, el material filtrante tiene una pluralidad de poros que permiten una comunicacion fluida en el interior o entre subsistemas. Los poros permiten que composiciones (o componentes de las mismas) introducidas en un subsistema se difundan en otro subsistema o viceversa. Los poros estan situados preferentemente en una zona sustancial de la superficie de cualquier filtro que pueda ser utilizado. En la figura 6 se muestra un filtro a modo de ejemplo.

Cualquier filtro que permita un exceso de llquidos, de globulos rojos o de residuos celulares puede ser utilizado en el sistema -300-. Por ejemplo, cualquier filtro que retenga adipocitos, celulas regenerativas y celulas madre o tejido conectivo puede ser utilizado. Algunas realizaciones dan a conocer un sistema -300- en el que los poros del material filtrante -320- pueden variar desde aproximadamente 1 micra hasta aproximadamente 750 micras, por ejemplo, 10,

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260,

270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490,

500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720,

730, 740 o 750 micras o cualquier numero o margen entre ellos. Preferentemente, la pluralidad de aberturas o poros en el material filtrante es mayor de 40 pm. Por ejemplo, en una realization, la pluralidad de aberturas en el material filtrante -320- puede tener 74 micras. En otras realizaciones, la pluralidad de aberturas puede variar desde aproximadamente 73 a 264 micras.

Tal como se muestra en las figuras 3 a 13, en algunas realizaciones, el segundo subsistema o camara, es decir, la zona entre el material filtrante -320- y la envoltura exterior -340- descrita anteriormente puede estar ademas dividida en dos subsistemas tales que se forma un tercer subsistema o camara. Por ejemplo, un separador -330-, por ejemplo una pantalla de separation, una malla o un filtro es insertado entre el material filtrante -320- y la envoltura exterior -340-. Un separador a modo de ejemplo que comprende una pantalla de separacion se muestra en la figura 7. El segundo y el tercer subsistemas o camaras pueden contener las soluciones, efluentes, residuos, desechos y otros materiales no deseados del primer subsistema. En ciertas realizaciones, el segundo y el tercer subsistemas o camaras son parcialmente distintos uno de otro. En algunas realizaciones, el segundo y el tercer subsistemas o camaras son totalmente distintos uno de otro. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el separador -330-, por ejemplo, la pantalla de separacion tiene un grado de libertad o es totalmente libre para flotar en el interior del segundo subsistema, de tal modo que se forma un tercer subsistema que no esta completamente separado del segundo subsistema. En otras realizaciones, el segundo y el tercer subsistemas son completamente distintos uno del otro porque el separador, por ejemplo, la pantalla de separacion o similar esta aprisionada entre las capas exteriores -310- y -340- utilizando cualquiera de los mecanismos de union conocidos en la tecnica o descritos en esta memoria, por ejemplo, union por adhesivos, soldadura por RF o soldadura ultrasonica. Un experto en la materia comprendera facilmente que se pueden utilizar varios planteamientos para fijar las diferentes capas del sistema -300-, por ejemplo, la primera y la segunda envolturas exteriores, el filtro y el separador pueden ser seleccionados para garantizar una resistencia optima del sellado.

En algunas realizaciones, el separador -330- (por ejemplo, una pantalla de separacion) esta configurado para minimizar el contacto entre el material filtrante -320- y la envoltura exterior -340-. Un contacto mlnimo impide que el material filtrante -320- y la envoltura exterior -340- queden adheridos uno al otro durante el procesamiento del tejido (por ejemplo, si se crea un vaclo en el interior de la bolsa). De este modo, la pantalla de separacion -330- crea un espacio entre el material filtrante -320- y la envoltura exterior -340-. En ciertas realizaciones, el separador puede comprender nervios, tirantes y otras caracterlsticas que crean un espacio entre la envoltura exterior -340- y el filtro -320-. En otras realizaciones, el lado de la envoltura exterior -340- que esta situado frente al material filtrante -320- puede ser rugoso para crear el espacio preciso, obviando de este modo la necesidad de un separador distinto. La creation de espacio entre el filtro y la envoltura exterior del sistema genera una fuerza en la bolsa que empuja, arrastra o absorbe el exceso de fluido procedente del tejido adiposo hacia el segundo y/o el tercer subsistema. El exceso de fluido puede ser dirigido a continuation a un recipiente de residuos. El espacio creado por el separador, por ejemplo, la pantalla de separacion -330- y/o el material utilizado para crear el separador estan asimismo disenados, configurados o seleccionados preferentemente para absorber el llpido presente en el tejido adiposo contribuyendo de este modo a extraer el llpido y los fluidos del tejido en el interior del primer subsistema o camara y a secar o deshidratar adicionalmente el tejido.

En ciertas realizaciones, el separador -330- esta fabricado de un material poroso y/o comprende una pluralidad de aberturas o poros. En ciertas realizaciones, la pluralidad de poros del separador -330- pueden tener aproximadamente desde 300 hasta aproximadamente 3.000 micras o cualquier cantidad dentro de este margen, por ejemplo aproximadamente desde 500 hasta aproximadamente 2.000 micras. Preferentemente, la pluralidad de aberturas o poros tienen un diametro que es mayor o igual a aproximadamente 300 micras, 400 micras, 500 micras,

600 micras, 700 micras, 800 micras, 900 micras, 1.000 micras, 1.100 micras, 1.200 micras, 1.300 micras, 1.400

micras, 1.500 micras, 1.600 micras, 1.700 micras, 1.800 micras, 1.900 micras, 2.000 micras, 2.100 micras, 2.200

micras, 2.300 micras, 2.400 micras, 2.500 micras, 2.600 micras, 2.700 micras, 2.800 micras, 2.900 micras, 3.000

micras o cualquier numero dentro de este margen. En una realizacion, la pluralidad de aberturas tienen aproximadamente 1.000 micras. En algunas realizaciones, el separador esta fabricado de un material poroso que tiene una zona abierta que es mayor o igual a aproximadamente 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30%, 32%, 35%, 36%, 38%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 65% o cualquier porcentaje dentro de este margen. Un experto en la materia comprendera que los poros de tamano mas

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grande permiten una transferencia o un vaciado mas rapido de material de la primera camara a la segunda camara, y que el tamano del poro del separador puede ser ajustado para equilibrar la absorcion y/o el vaciado o las propiedades de filtracion. En algunas realizaciones, el llquido y el llpido se adsorben a y o llenan las zonas abiertas del separador poroso. Los solicitantes han realizado el sorprendente descubrimiento de que en algunas realizaciones, los separadores que tienen unos poros mas grandes que los poros del material filtrante, facilitan la extraccion de fluido del tejido adiposo y de fluidos de la primera camara del sistema. De este modo, en algunas realizaciones, el separador, por ejemplo, la pantalla de separacion -330- es un material poroso en el que los poros tienen un diametro o un tamano mas grande que el material filtrante -320- descrito anteriormente.

En algunas realizaciones, el separador comprende un material biocompatible que atrapa o absorbe llpido y/o fluidos. Por ejemplo, los separadores pueden estar fabricados de un poliester, un nailon, rayon, nitrato de celulosa y acetato de celulosa. En algunas realizaciones, el separador esta fabricado de un material flexible, y en algunas realizaciones, el separador esta fabricado de un material rlgido. Preferentemente, el separador esta fabricado de una malla de poliester, por ejemplo, con un tamano de poro de 1.000 micras.

Tal como se muestra en las figuras 3 a 13, el sistema -300- puede tener una o varias aberturas para permitir la adicion o la extraccion de material hacia el interior y el exterior del sistema. Por ejemplo, el sistema -300- mostrado en las figuras3, 4, 8 y 9 tiene tres aberturas separadas. Las aberturas -400- y -500- estan en comunicacion con el primer subsistema, por ejemplo, la zona entre la envoltura exterior -310- y el material filtrante -320-. La abertura -600- esta en comunicacion con el segundo y/o el tercer subsistema, por ejemplo, la zona entre el material filtrante -320- y la pantalla de separacion -330- y/o la zona entre la pantalla de separacion -330- y la envoltura exterior -340-. Sin embargo, en algunas realizaciones, el sistema puede incluir solo una abertura o solo dos aberturas, por ejemplo, una abertura de entrada y una abertura de salida. En otras realizaciones, el sistema puede incluir mas de tres aberturas, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas aberturas.

En general, las aberturas comprenden por lo menos un orificio que se extiende desde el entorno al interior del sistema o subsistema o viceversa. Los orificios tienen un cierre hermetico y estanco al agua a lo largo de las costuras de las aberturas. Tal como se describe mas adelante, en algunas realizaciones, las aberturas estan configuradas para ser acopladas a uno o varios conectores, conductos, conjuntos de aberturas, adaptadores, tapas o jeringas.

Las aberturas pueden proporcionar un punto de acceso para la introduccion de diversos fluidos, por ejemplo, fluidos de lavado y aclarado y para la extraccion de dichos fluidos y de los efluentes. Preferentemente, las aberturas pueden estar cerradas (por ejemplo con una valvula). En algunas realizaciones, las aberturas pueden ser cerradas manualmente por medio de una pinza. En algunas realizaciones, las aberturas pueden ser cerradas por medio de una tapa. En algunas realizaciones, las aberturas comprenden valvulas de autocierre, por ejemplo, una valvula deformable que proporciona un flujo unidireccional de fluido o de contenidos hacia la camara o camaras internas del sistema pero no al exterior de las mismas. En otras realizaciones, las valvulas deformables proporcionan un flujo bidireccional. Las valvulas deformables pueden estar fabricadas de cualquier material deformable conocido en la tecnica, tal como caucho, neopreno, silicona, poliuretano o similar. En algunas realizaciones, las aberturas comprenden una valvula Luer activada. En algunas realizaciones las aberturas estan situadas en el sistema de tal modo que cuando el sistema se mantiene vertical una o mas valvulas estan situadas en la parte inferior, de tal modo que los fluidos y el efluente salen con la ayuda de la fuerza gravitatoria, de aspiracion o de presion. Otras aberturas pueden ser utilizadas asimismo con el sistema -300- de la invencion, por ejemplo, aberturas para la ventilacion, aberturas para anadir materiales o gases al sistema o subsistemas, etc.

Las aberturas en el sistema o en el subsistema pueden estar configuradas para ser interconectadas o acopladas directa o indirectamente (es decir, a traves de un adaptador) a una jeringa o un cateter utilizados para la aspiracion de material adiposo desde el cuerpo origen, de tal modo que el tejido adiposo es transportado directamente al sistema de forma anaerobica. De manera similar, una canula o una jeringa puede ser fijada a una abertura para el trasplante anaerobico del tejido refinado. En consecuencia, en algunas realizaciones, las aberturas en el sistema o en el subsistema estan configuradas para ser acopladas directa o indirectamente con jeringas desechables o reutilizables. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las aberturas estan configuradas para ser acopladas directa o indirectamente con una jeringa de 1 cm3, una jeringa de 2 cm3, una jeringa de 5 cm3, una jeringa de 10 cm3, una jeringa de 20 cm3, una jeringa de 50 cm3, una jeringa de 60 cm3, una jeringa de 100 cm3, una jeringa de 250 cm3, o similar. En algunas realizaciones, las aberturas estan configuradas para ser acopladas directa o indirectamente con una jeringa que tenga una punta con un gran orificio, por ejemplo, una jeringa Toomey.

En algunas realizaciones, el sistema -300- comprende un conjunto -700- de una abertura de acceso de tejido para facilitar el suministro o la eliminacion aseptica de contenidos (por ejemplo, tejido adiposo), desde y hacia la primera camara o subsistema. (Ver, por ejemplo, la figura 9). En las figuras 10 y 11 se muestra con mas detalle el conjunto -700- de la abertura de acceso de tejido. En algunas realizaciones, el conjunto de la abertura de acceso de tejido comprende una abertura -710- cillndrica con un gran orificio. El gran tamano del orificio -710- facilita el suministro y la extraccion de tejido en la primera camara. Una valvula de plastico deformable -720- puede proporcionar una barrera que impide que el material pase a traves de la abertura -710- al cuerpo de la abertura -730-. La valvula de plastico deformable -720- puede estar configurada para abrirse y permitir el flujo de los contenidos a traves del orificio hacia el cuerpo -730- de la abertura de acceso de tejido, conduciendolos a la primera camara del sistema

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mediante la introduction de la punta de una jeringa (no mostrada) en el mismo. La valvula de plastico deformable -720- vuelve a una position de cierre por defecto tras la extraction de la punta de la jeringa de la valvula, sellando de este modo la abertura y bloqueando la circulation de cualquier contenido (por ejemplo, tejido o llquido) fuera del cuerpo de la abertura de acceso de tejido cuando no se esta utilizando. En algunas realizaciones, el conjunto de la abertura de acceso de tejido esta configurado para ser conectado a una tapa -740- para proporcionar un cierre adicional a la abertura de acceso de tejido cuando la abertura no se esta utilizando. En la figura 12 se muestra una ilustracion mas detallada de una tapa -740- a modo de ejemplo. En algunas realizaciones, el conjunto de la abertura de acceso de tejido puede ser desmontado del sistema -300-. En algunas realizaciones, el conjunto de la abertura de acceso de tejido esta fijado o unido al sistema -300-, por ejemplo, a traves de un adhesivo tal como un adhesivo UV.

En algunas realizaciones, el adaptador o conector esta configurado para unir la punta de una jeringa a una abertura del sistema. Tal como se ha descrito anteriormente, los adaptadores tales como los conjuntos de la abertura de tejido pueden estar integrados a la abertura o aberturas o pueden ser extraldos de la misma. En algunas realizaciones, el adaptador o conector comprende un conector Luer. En algunas realizaciones, el adaptador o conector comprende un adaptador extralble que comprende una valvula deformable.

En algunas realizaciones, las aberturas del sistema pueden comprender, o estar conectadas a, un conjunto configurado para mas de una trayectoria del flujo, por ejemplo, un conector en Y o similar. En algunas realizaciones, el conector en Y esta configurado para permitir la obstruction de una o ambas trayectorias del flujo tal como se desee, por ejemplo, mediante el pinzado de los lumenes individuales o las trayectorias del flujo del conector en Y. En algunas realizaciones, el conector en Y comprende un conmutador situado en la union de los recorridos del flujo comun e individual del conector en Y de tal modo que pueden ser ajustados para permitir un flujo simultaneo a traves de cada trayectoria del flujo, de una trayectoria individual del flujo, o para obstruir ambas trayectorias del flujo segun se desee.

En algunas realizaciones, las aberturas del sistema pueden ser conectadas a conductos o tubos que permiten la comunicacion fluida con uno o varios sistemas o subsistemas, al tiempo que mantienen un recorrido cerrado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema -300- puede comprender opcionalmente una bolsa de residuos (no mostrada), un receptaculo de residuos (no mostrado), un conducto de residuos (no mostrado) y/o un recipiente de residuos (no mostrado). En ciertas de estas realizaciones, todos los subsistemas estan en comunicacion fluida entre si. En otras realizaciones, ninguno de los subsistemas esta en comunicacion fluida con los otros. En una realization concreta, un subsistema esta cerrado con respecto a los otros dos subsistemas, en la que los dos subsistemas estan en comunicacion fluida entre si. Preferentemente, la totalidad del sistema, incluyendo los subsistemas, es flexible permitiendo que el sistema sea de cualquier tamano o forma y que aloje una amplia gama de volumenes. Alternativamente, la totalidad del sistema, los subsistemas y los componentes asociados pueden ser rlgidos. O bien, algunos subsistemas y los componentes asociados pueden ser flexibles mientras que otros subsistemas y componentes asociados pueden ser rlgidos.

La figura 13 muestra una realizacion a modo de ejemplo de un sistema -800- que comprende un sistema -300-1- en conexion fluida con otros sistemas y subsistemas. Tal como se muestra en la figura 13, las aberturas -400-1- y -500-1- pueden conectarse a una fuente de solution de lavado -810-1- y a una bolsa de residuos -820-1-, respectivamente. El sistema -300-1- puede ser conectado a un sistema similar -300-2- al tiempo que mantiene un recorrido cerrado. Se introduce tejido adiposo en las primeras y segundas camaras de los sistemas -300-1- y -300-2-, tal como se ha descrito anteriormente en esta memoria, por ejemplo, a traves de las aberturas de entrada/extraccion de tejido -600-1- y -600-2- respectivamente. El tejido adiposo en el sistema -300-2- se utiliza para producir un injerto secado tal como se ha descrito anteriormente. El tejido adiposo en el sistema -300-1- es procesado para producir lipo-digestato o una poblacion concentrada de celulas derivadas de las adiposas que comprende celulas regenerativas. La abertura -500-1- o una abertura alternativa (no mostrada) puede ser conectada a una fuente de solucion, por ejemplo -810-1- configurada para la introduccion aseptica de solucion de lavado y/o de enzimas en la segunda camara del sistema -300-1- para el aclarado y la digestion del tejido. La abertura -400-1 - puede ser conectada a una bolsa de residuos -820-1-. El lipo-digestato de la primera camara de -300-1- puede ser transferido asepticamente al tejido adiposo secado del interior de la primera camara del sistema -300-2- a traves de un conducto (no mostrado) que conecta las aberturas -600-1- y -600-12- al tiempo que mantiene el sistema cerrado.

Los sistemas dados a conocer en esta memoria pueden producir injertos e implantes de tejido adiposo que tienen cantidades de material no deseado, tal como globulos rojos, leucocitos y llpido significativamente menores que unas cantidades equivalentes de tejido adiposo del mismo sujeto en el mismo sitio en que han sido procesados mediante procedimientos tales como centrifugado y/o separation convencional por gravedad. En algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos utilizando los sistemas dados a conocer en esta memoria tienen, por lo menos aproximadamente, menos de 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X (o cualquier numero dentro de este margen) de leucocitos que los presentes en una unidad equivalente de tejido adiposo que ha sido escindido del mismo sujeto y en el mismo sitio y preparado utilizando un procedimiento de centrifugado, por ejemplo, en el que el tejido escindido es centrifugado en una centrlfuga de angulo fijo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos en los sistemas dados a conocer en esta memoria contienen menos del 75%, menos del 80%, menos del 85%, menos del 90%, menos del 95%, o menos, o cualquier porcentaje comprendido entre ellos, del numero de leucocitos en una unidad equivalente de tejido adiposo del mismo individuo.

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En algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos utilizando los sistemas dados a conocer en esta memoria tienen por lo menos, aproximadamente menos de 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X (o cualquier numero dentro de este margen) de globulos rojos que en una unidad equivalente de tejido adiposo que ha sido escindido del mismo sujeto en el mismo sitio y preparado utilizando un procedimiento de centrifugado, por ejemplo, en el que el tejido escindido es centrifugado en una centrlfuga de angulo fijo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos en los sistemas dados a conocer en esta memoria contienen menos del 75%, menos del 80%, menos del 85%, menos del 90%, menos del 95%, o menos, o cualquier porcentaje comprendido entre ellos, del numero de globulos rojos en una unidad equivalente de tejido adiposo.

En algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos utilizando los sistemas dados a conocer en esta memoria tienen, por lo menos, aproximadamente menos de 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X (o cualquier numero dentro de este margen) de llpido que en una unidad equivalente de tejido adiposo que ha sido escindido del mismo sujeto y preparado utilizando un procedimiento de centrifugado, por ejemplo, en el que el tejido escindido es centrifugado en una centrlfuga de angulo fijo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los injertos de tejido adiposo producidos en los sistemas dados a conocer en esta memoria contienen menos del 75%, menos del 80%, menos del 85%, menos del 90%, menos del 95%, o menos, o cualquier porcentaje comprendido entre ellos, del porcentaje de contenido en llpido que en una unidad equivalente de tejido adiposo.

En adicion a la capacidad de producir injertos de tejido adiposo con menos componentes no deseados, los injertos producidos mediante los sistemas dados a conocer en esta memoria pueden presentar asimismo caracterlsticas de hidratacion que facilitan el suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas y/o la conservacion del implante. Concretamente, el estado de hidratacion de un injerto de tejido adiposo preparado tal como se ha descrito en esta memoria es de menos hidratacion que un injerto de una unidad equivalente de tejido adiposo aislado del mismo sujeto en el mismo sitio y preparado utilizando solamente la separation por gravedad.

Un experto en la materia comprendera, sin embargo que, en algunas realizaciones, los sistemas pueden ser disenados con una bolsa flexible que no esta compuesta de dos envolturas exteriores diferentes selladas entre si, sino que es, mas bien, una bolsa sin costuras. Un filtro puede estar sellado, unido o fijado en el interior de la bolsa sin costuras para definir un primer y un segundo subsistemas o camaras en el interior de la bolsa.

En la figura 14 se muestra un dispositivo -100- a modo de ejemplo para producir los injertos grasos suplementados, reforzados o mejorados o los implantes de tejido adiposo dados a conocer en esta memoria. La figura 14A muestra una vista, en perspectiva, de un receptaculo -10- que incluye, por lo menos, dos camaras -20-, -30-. Una camara -20- puede ser utilizada para producir lipo-digestato a partir de tejido sin procesar. La segunda camara -30- puede ser utilizada para recibir y almacenar tejido adiposo sin procesar para ser utilizado como el injerto graso en la generation del injerto de tejido adiposo suplementado.

En la realization mostrada en la figura 14, cada camara -20-, -30- tiene una abertura de entrada -40-, -50- de tejido, configurada para recibir tejido adiposo sin procesar. Sin embargo, se comprendera que, en algunas realizaciones, el receptaculo -10- tiene solamente una abertura de entrada de tejido. En algunas realizaciones, las aberturas de entrada de tejido -40-, -50- estan configuradas para ser conectadas operativamente a una canula (no mostrada) de tal modo que el lipoaspirado entra directamente en la camara o camaras -20-, -30- durante la liposuction. Por ejemplo, la abertura -40-, -50- de entrada del tejido puede estar acoplada a una canula (no mostrada) mediante tubos para definir una llnea de extraction de tejido. En algunas realizaciones, la canula puede ser una canula de liposuccion integrada de un solo uso y los tubos pueden ser tubos flexibles. La canula puede estar dimensionada para ser introducida en un sujeto con el fin de extraer tejido adiposo del sujeto. Los tubos utilizados en el sistema deben poder resistir la presion negativa asociada a la lipoplastia asistida por aspiration para reducir la posibilidad de un aplastamiento. Un dispositivo de aspiracion (no mostrado) tal como una jeringa o un aspirador electrico, entre otras cosas, puede estar acoplado al receptaculo -10- y configurado para proporcionar una presion negativa suficiente para aspirar tejido de un sujeto.

Las camaras -20-, -30- del receptaculo -10- pueden estar separadas flsicamente una de otra, de tal modo que el flujo de contenidos de una camara -20- (por ejemplo, la camara que contiene lipo-digestato) hacia la otra camara -30- (por ejemplo, la camara que contiene el injerto graso) esta controlado. En algunas realizaciones, las camaras estan en conexion fluida, por ejemplo, a traves de una abertura que puede ser sellada, para asegurar la circulation de los contenidos de una camara a la otra solamente cuando se desee. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el flujo de los contenidos de una camara -20- a otra camara -30- se produce a traves de un conducto. El conducto opcional puede incluir una o varias pinzas (no mostradas) para controlar el flujo de material entre los diversos componentes del sistema. Las pinzas pueden ser utilizadas para mantener la esterilidad del sistema mediante el sellado efectivo de diferentes zonas del sistema. Alternativamente, los conductos opcionales pueden incluir una o varias valvulas que controlan el flujo de material a traves del sistema. Las valvulas pueden ser valvulas electromecanicas de presion, valvulas neumaticas, valvulas hidraulicas o valvulas mecanicas. En algunas realizaciones, las valvulas pueden ser activadas o accionadas mediante un sistema de control que puede estar acoplado a palancas. Las palancas pueden ser manipuladas manualmente y/o automaticamente, por ejemplo mediante un dispositivo de procesamiento que puede activar las valvulas en condiciones de activation predeterminadas. En ciertas realizaciones automatizadas, la

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activacion de las valvulas puede ser parcialmente automatizada y estar parcialmente sometida a las preferencias del usuario, de tal modo que el proceso puede ser optimizado. En otras realizaciones mas, ciertas valvulas pueden ser activadas manualmente y otras automaticamente a traves de un dispositivo de procesamiento. Las valvulas pueden ser utilizadas asimismo conjuntamente con una o varias bombas, por ejemplo, bombas peristalticas o bombas volumetricas (no mostradas). Los conductos y/o las valvulas pueden incluir asimismo sensores, tales como sensores opticos, sensores ultrasonicos, sensores de presion o similares, que son capaces de distinguir entre los diversos componentes del fluido y los niveles del fluido que fluyen por el sistema.

En algunas realizaciones, una o ambas camaras pueden incluir una o varias aberturas -60- para la extraccion de residuos, por ejemplo, solucion fisiologica, adipocitos maduros, globulos rojos y similares, para la adicion de componentes, por ejemplo solucion de lavado, enzimas, celulas y similares o para una entrada de aire o una salida de ventilacion. En algunas realizaciones, la camara -30- puede incluir una abertura o salida -70- configurada para la extraccion aseptica del injerto graso suplementado. La salida -70- puede estar estructurada para hacer pasar la composicion (por ejemplo, injerto graso suplementado) desde la camara -30- a un sujeto en condiciones apropiadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede utilizar una jeringa para retirar la composicion, y la salida -70- puede alojar la aguja de la jeringa sin poner en riesgo la esterilidad del sistema o de la composicion. En realizaciones adicionales, la salida puede estar acoplada a un dispositivo que esta configurado para administrar la composicion, pero no para retirar la composicion, tal como una canula que administra la composicion mediante la aplicacion de una presion positiva para desplazar la composicion a traves de la canula. En consecuencia, la salida -70- puede estar configurada para permitir que la composicion contenida en la camara -30- pase a la canula (no mostrada). En otras realizaciones, la salida -70- puede comprender, o estar acoplada en un modo de un sistema cerrado al dispositivo para administrar la composicion tal como una jeringa o una canula para administrar la composicion mediante la aplicacion de una presion positiva.

En algunas realizaciones, una o ambas camaras -20-, -30- del receptaculo -10- pueden estar configuradas para recibir asepticamente soluciones y agentes, tales como soluciones de lavado (solucion fisiologica, y similares), agentes de desagregacion, u otros agentes o aditivos. El dispositivo puede incluir recipientes configurados para mantener su contenido en condiciones de esterilidad, por ejemplo, una bolsa plegable, tal como una bolsa IV utilizada en instalaciones cllnicas. Estos recipientes pueden tener conductos acoplados a una o a ambas camaras -20-, -30-. Por ejemplo, el dispositivo puede estar configurado de tal modo que un recipiente que contenga un agente de aclarado o de lavado (por ejemplo, PBS, PLASMALYTE®, NORMOSO®, o solucion de lactato de Ringer) pueda ser suministrado asepticamente a la camara -20- y a la camara -30-. En algunas realizaciones, el dispositivo -100- puede estar configurado de tal modo que un recipiente que contenga el agente de desagregacion acoplado al receptaculo -10- suministre el agente o agentes de desagregacion al interior de la camara -20-. Las soluciones y los agentes pueden ser suministrados al interior de las camaras -20-, -30- del receptaculo mediante cualquier modo reconocido por la tecnica, incluyendo la presion de la gravedad aplicada al exterior de los recipientes, o mediante la colocacion de una bomba volumetrica en los conductos. En realizaciones automatizadas, un dispositivo de procesamiento calcula varios parametros, por ejemplo, el volumen de solucion fisiologica y el tiempo y el numero de ciclos requeridos para el lavado, as! como la concentracion o la cantidad de agente de desagregacion y el tiempo requerido para la desagregacion en base a la informacion introducida inicialmente por el usuario (por ejemplo, el volumen de tejido a procesar). Alternativamente, las cantidades, tiempos, etc. pueden ser manipulados manualmente por el usuario. En algunas realizaciones, el dispositivo esta configurado para agitar o sacudir una o ambas camaras del receptaculo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dispositivo comprende una plataforma -80- de movimiento orbital configurada para agitar el contenido de la camara -20- durante el proceso de desagregacion.

Los componentes del receptaculo -10- pueden estar fabricados de materiales que no reaccionan con los tejidos o fluidos biologicos y no reaccionan con los agentes utilizados en el procesamiento de tejidos y fluidos biologicos. Ademas, los materiales de los que estan fabricados los diversos componentes deben poder resistir la esterilizacion, tal como la realizada mediante autoclave e irradiacion, incluyendo pero no limitada a la radiacion beta o gamma. En algunas realizaciones, el receptaculo esta fabricado de materiales desechables. En algunas realizaciones, el receptaculo puede estar fabricado de material no desechable, que puede ser utilizado mas de una vez. A modo de ejemplo, la tuberla y la empunadura de la canula pueden estar fabricadas de cualquier material adecuado tal como polietileno. La canula puede estar fabricada de acero inoxidable. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el receptaculo esta fabricado de policarbonato acrllico, ABS, acetato de etileno vinilo, o copollmeros de estireno butadieno (SBC). El recorrido del fluido del dispositivo esta preferentemente libre de pirogenos, es decir, adecuado para su utilizacion en sangre sin riesgo de transmision de enfermedades. En algunas realizaciones, el receptaculo -10- esta fabricado de un material que permite que el usuario determine visualmente el volumen aproximado de tejido presente en la camara.

En algunas realizaciones, el dispositivo incluye uno o varios dispositivos de control de la temperatura (no mostrados) que estan posicionados para ajustar la temperatura del material contenido en el interior de una o varias camaras -20-, -30- del sistema. El dispositivo de control de la temperatura puede ser un calentador, un refrigerador o ambas cosas, es decir, puede ser capaz de cambiar entre calentar y enfriar. El dispositivo de la temperatura puede ajustar la temperatura de cualquiera de los materiales que pasan a traves del dispositivo -100-, incluyendo los agentes de desagregacion, los agentes de re-suspension, los agentes de aclarado, los agentes de lavado o los aditivos. Por ejemplo, el calentamiento del tejido adiposo facilita su desagregacion mientras que el enfriamiento de la salida de

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celulas regenerativas es deseable para mantener su viabilidad. Asimismo, si son necesarios agentes calentados previamente para un optimo procesamiento del tejido, el papel del dispositivo de la temperatura serla el de mantener la temperatura predeterminada mas que aumentar o disminuir la temperatura.

En algunas realizaciones, el dispositivo -100- puede ser automatizado. En algunas realizaciones, el dispositivo -100- puede incluir un dispositivo de procesamiento (por ejemplo, un microprocesador o un ordenador personal) y programas de software asociados para proporcionar el control logico del sistema para operar y para automatizar una o varias etapas del proceso en base a entradas del usuario. En ciertas realizaciones, uno o varios aspectos del sistema pueden ser programables por el usuario a traves del software residente en el dispositivo de procesamiento. El dispositivo de procesamiento puede tener uno o varios programas de software preprogramados en la memoria de solo lectura (ROM). Por ejemplo, el dispositivo de procesamiento puede tener software preprogramado a medida para el procesamiento de la sangre, otro programa para procesar de tejido adiposo para obtener pequenos volumenes de celulas regenerativas y otro programa para procesar tejido adiposo para obtener grandes volumenes de celulas regenerativas. El dispositivo de procesamiento puede tener asimismo un software preprogramado que proporcione al usuario los parametros apropiados para optimizar el proceso en base a la entrada por el usuario de information pertinente tal como la cantidad de celulas regenerativas requeridas y diversas manipulaciones post-proceso, etc.

En algunas realizaciones, el software puede automatizar etapas tales como el control de la entrada y la salida de fluidos y tejidos a lo largo de ciertas trayectorias de las tubos mediante el control de las bombas y las valvulas del sistema; el control de la secuencia adecuada y/o la direction de activation; la detection de bloqueos con sensores de presion; mecanismos de mezclado, la medicion de la cantidad de tejido y/o de fluido a desplazar a lo largo de un recorrido concreto utilizando mecanismos volumetricos, el mantenimiento de las temperaturas de los diversos componentes utilizando dispositivos de control del calor; y la integration del proceso de desagregacion con mecanismos de temporizacion y software.

Los siguientes ejemplos se facilitan para demostrar situaciones particulares y ajustes en los que esta tecnologla puede ser aplicada y no estan previstos para limitar el alcance de la invention y de las reivindicaciones incluidas en esta description. Un cierto numero de publicaciones y de patentes han sido citadas anteriormente en esta memoria.

El siguiente ejemplo compara la pureza y la hidratacion de los injertos de tejido adiposo obtenidos utilizando el sistema dado a conocer en esta memoria con unidades equivalentes de tejido adiposo sin procesar, y con unidades equivalentes de injertos de tejido adiposo producido mediante separation por gravedad y centrifugado.

EJEMPLO 1

El tejido adiposo aspirado fue recogido en instalaciones cllnicas o bien mediante procedimientos de liposuction (N = 5), laser (N = 3) o la recogida en el cuerpo mediante chorro de agua (N = 2) en 10 sujetos humanos (N = 10). Las muestras de tejido aspirado fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos: (1) control; (2) separacion por gravedad; (3) centrifugado; y (4) preparation de injertos de tejido con PUREGRAFT™. Las muestras de control fueron analizadas directamente sin manipulation adicional. Las muestras del grupo de separacion por gravedad fueron dejadas aparte en una jeringa de 60 ml durante diez minutos. La portion fluida de las muestras fue desechada y el tejido adiposo restante fue analizado. En el caso del grupo de la centrifugation, las muestras fueron cargadas en una jeringa con tapa de 10 ml colocada en una centrlfuga IEC de angulo de rotor fijo y centrifugadas a 3.000 rpm (~ 1.200 g) durante 3 minutos. El llpido libre en la parte superior del tejido adiposo fue extraldo por aspiration y el que flotaba debajo fue vaciado despues del centrifugado y se analizo el tejido restante del injerto. Las muestras del grupo PUREGRAFT™ fueron lavadas en un sistema -300- descrito anteriormente en esta memoria (PureGraft™). En resumen, el tejido fue introducido en la primera camara del sistema -300- tal como se ha descrito anteriormente. El tejido fue lavado con 2X 150 ml de solution de lactato de Ringer. Se dejo que escurriera el exceso de fluido y el llpido de la segunda camara del sistema. El tejido secado fue extraldo a traves de la abertura de entrada del tejido y fue utilizado para el analisis resultante.

Los tejidos del injerto de cada uno de los cuatro grupos fueron centrifugados a continuation a 400 g durante cinco minutos en tubos conicos de 15 ml por triplicado con el objeto de separar los injertos en cuatro componentes; llpido libre, tejido adiposo, llquido y un nodulo de celulas que comprende globulos rojos y leucocitos. Los volumenes de la capa de llpido y de la capa llquida fueron anotados y calculados como porcentaje total del injerto de tejido. Se midio el volumen de la capa de llpido y de la capa de llquido de cada muestra, y fue utilizado para calcular el contenido de llquido y el contenido de llpido de las diferentes preparaciones. Tal como se muestra en la figura 15, el tejido adiposo preparado utilizando los procedimientos y sistemas descritos en esta memoria (PureGraft) tenia un contenido de agua significativamente menor si se compara con el tejido adiposo sin procesar (Control), o el tejido adiposo procesado mediante un procedimiento convencional por gravedad (Gravedad). Concretamente, el contenido medio de llquido del tejido preparado utilizando el sistema de la presente invencion fue de 9,3 ± 0,9%. Esto era significativamente mas bajo (p < 0,001) que el tejido preparado mediante separacion por gravedad (25,1 ± 1,8%). Tal como se muestra en la figura 16, el tejido adiposo preparado utilizando los procedimientos y sistemas descritos en esta memoria (PureGraft) tenia un contenido significativamente mas bajo en % (v/v) de llpido comparado con el tejido adiposo sin procesar (Control), el tejido adiposo preparado mediante un procedimiento convencional por

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gravedad (Gravedad) y el tejido adiposo preparado mediante un procedimiento convencional por centrifugado (Centrifugado). Concretamente, el nivel residual de Kpido libre en las muestras preparadas utilizando el sistema de la presente invencion tenia una media de 0,8 ± 0,3% de lipido libre comparado con el tejido de control (sin manipular) (11,5 ± 1,5%, p < 0,001), la separacion por gravedad (8, 9 ± 1,3%, p < 0,001), y el centrifugado (9,6 ± 1,8%, p < 0,001). Se debe observar que el contenido en lipido libre observado en los injertos preparados por centrifugacion (promedio de 9,6% en volumen del injerto) fue medido despues de la extraccion del Kpido libre observado durante la preparacion inicial del tejido. Es decir, el lipido libre evidente despues de la separacion del injerto en sus partes componentes es liberado de nuevo. Esto indica que el material del injerto preparado por centrifugado contenia adipocitos danados que liberaron su lipido durante el segundo centrifugado aplicado para separar el injerto en sus cuatro partes componentes. El hecho de que la aplicacion de la etapa del mismo segundo centrifugado a los injertos preparados con el del sistema de la presente invencion revelara un porcentaje marcadamente menor de Kpido libre (0,8% en volumen comparado con 9,6%) demuestra que los injertos preparados con el sistema de la presente invencion contenian menos adipocitos danados.

Para evaluar la pureza del injerto, se extrajeron muestras de los tubos de cada tejido del injerto y se analizo el contenido en sangre, contando los globulos rojos y los leucocitos por gramo de tejido con un contador Coulter. Los datos fueron normalizados a grupos de control y expresados como un porcentaje relativo del contenido tanto de RBC (globulos rojos) como de WBC (leucocitos) por gramo de tejido del injerto sin procesar. Todos los datos fueron expresados como promedio ± SEM. Se utilizo el ensayo de la t de Student para comparar las diferencias entre cada procedimiento de preparacion del injerto. Los datos mostrados en la figura 17 muestran que el tejido adiposo preparado utilizando los procedimientos y sistemas dados a conocer en esta memoria (PureGraft) tenian significativamente menos globulos rojos (RBC) por gramo de tejido, comparado con el tejido adiposo sin procesar (Control), el tejido adiposo preparado mediante un procedimiento convencional por gravedad (Gravedad) y el tejido adiposo preparado mediante un procedimiento convencional de centrifugado (Centrifugado). De este modo, mientras que la separacion por gravedad y el centrifugado elimino 47,8 ± 7,0% y 53,2 ± 5,4% de globulos rojos respectivamente, la preparacion utilizando el sistema de la presente invencion elimino el 98,1 ± 0,01% de globulos rojos del injerto. De manera similar, el contenido en leucocitos se redujo en un 58,7 ± 13,7% por gravedad, el 69,7 ± 5,2% por centrifugado y un 96,8 ± 0,01% utilizando el sistema de la presente invencion.

La presencia de agua, Kpido, adipocitos maduros y celulas sanguineas puede conducir a la perdida de volumen del injerto a lo largo del tiempo. Los datos mostrados en las figuras 15 a 17 demuestran que los sistemas descritos en esta memoria son utiles para la preparacion de injertos o implantes de tejido adiposo secado o deshidratado.

Los siguientes ejemplos describen la fabrication de un implante o un injerto de tejido adiposo suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas mediante los procedimientos descritos en esta memoria.

EJEMPLO 2

Se identifica un paciente que necesita o desea un implante de pecho. Se extrae una unidad de tejido adiposo del paciente y se la dispone en una unidad de procesamiento de celulas madre derivadas de celulas adiposas que, preferentemente, mantiene un recorrido cerrado del fluido esteril y del tejido. Por ejemplo, una canula esta conectada a un recipiente o camara (por ejemplo, una bolsa flexible) de recogida del tejido de la unidad de procesamiento de celulas madre derivadas de las adiposas, al tiempo que mantiene esteril el recorrido del fluido y del tejido. La liposuction se lleva a cabo mediante tecnicas establecidas para la extraccion de tejido adiposo del sujeto, y el tejido adiposo sin procesar extraido es arrastrado al recipiente/camara de recogida de tejido. Una primera portion del tejido es aclarada con PBS hasta que sustancialmente toda la solution fisiologica, los globulos rojos, los adipocitos maduros son extraidos (por ejemplo, con lavados sucesivos hasta que el tejido no es visiblemente de color rojo), y el efluente del lavado, por ejemplo, la solucion fisiologica, los globulos rojos, los adipocitos maduros, son extraidos asepticamente a traves de una abertura que esta unida al recipiente o camara de recogida de tejido, al tiempo que mantiene esteril el recorrido cerrado del fluido y del tejido. En algunas realizaciones, la abertura de los residuos esta conectada a un recipiente de recogida de residuos mediante un conducto y el recipiente de recogida de residuos puede estar configurado para estar sujeto a una fuente de vacio y el conducto y/o el recipiente de recogida de residuos puede tener una o varias valvulas. La primera porcion de tejido adiposo lavado puede ser almacenada a continuation en el recipiente/camara de recogida de tejido o transferida a un recipiente de almacenamiento o una camara para un procesamiento posterior.

Una segunda porcion de la unidad de tejido adiposo es aclarada en una segunda camara con PBS hasta que sustancialmente el tejido ya no es visiblemente de color rojo tal como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, el tejido adiposo obtenido por liposuccion es aclarado y lavado, tal como se ha descrito anteriormente, y posteriormente es dividido en una primera y una segunda porcion. La primera porcion es conservada para ser utilizada como el sustrato para la adicion de celulas regenerativas derivadas de las adiposas y la segunda porcion es utilizada para crear una suspension de celulas regenerativas derivadas de las adiposas de la forma siguiente. Una solucion enzimatica que comprende colagenasa es anadida asepticamente a la segunda porcion del tejido, al tiempo que mantiene esteril el recorrido cerrado del fluido/tejido. El tejido es incubado mientras es agitado a 37°C durante aproximadamente 1 hora. Se deja que la mezcla se pose, de tal modo que la solucion de lipo-digestato y celulas regenerativas derivadas de las adiposas se separa fisicamente del tejido adiposo sin digerir y

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del llpido. El lipo-digestato creado a partir de la segunda porcion de tejido adiposo es extraldo a traves de un conducto a la vez que mantiene esteril el recorrido del fluido/tejido.

El lipo-digestato separado es bombeado a continuation a traves de un conducto que esta conectado con la primera camara mediante un recorrido cerrado. El lipo-digestato es bombeado sobre y a traves de la primera porcion de tejido adiposo sin procesar en la primera camara. El componente no celular del lipo-digestato circula a traves de la primera porcion de tejido adiposo sin procesar hacia un recipiente de residuos a la vez que mantiene esteril el recorrido cerrado del fluido/tejido. El lipo-digestato puede ser filtrado a traves de la primera porcion del tejido adiposo sin procesar utilizando la gravedad o una fuente de aspiration. En algunas realizaciones, el lipo-digestato puede ser depositado en capas en la parte superior de la primera porcion del tejido adiposo sin procesar y las celulas regenerativas derivadas de las adiposas presentes en el lipo-digestato pueden ser obligadas a pasar a la matriz de la primera porcion de tejido adiposo sin procesar utilizando centrifugado (por ejemplo, una cesta de centrifugation a 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 o 800 g). Las celulas regenerativas derivadas de las adiposas del lipo-digestato son unidas mediante los fragmentos de tejido conectivo, produciendo un injerto graso suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas. El injerto graso suplementado o reforzado puede ser a continuacion proporcionado al sujeto con o sin una cubierta absorbible o un material capsular que tenga la forma de un pecho humano.

EJEMPLO 3

Se prepara un injerto graso suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas, tal como se describe en el Ejemplo 1. El injerto graso suplementado con celulas regenerativas derivadas de las adiposas es aplicado al rostro, gluteos, pecho o pantorrillas de un sujeto o para corregir cualquier defecto del tejido blando.

EJEMPLO 4

Se identifica un paciente que necesita o desea un implante graso. Se extrae una unidad de tejido adiposo del paciente tal como se ha descrito en esta memoria o como es conocido en la tecnica. Para optimizar el injerto, el sistema -300- esta orientado y una bolsa de residuos (no mostrada) conectada al sistema, ha sido dejada en el suelo. El tejido adiposo es introducido en el sistema -300- a traves de la abertura -600- de acceso al tejido que proporciona la comunicacion entre el entorno exterior y el interior del primer subsistema. Una jeringa Toomey u otra jeringa conocida en la tecnica puede ser utilizada para inyectar el lipo-aspirado a traves de la abertura. Esto se puede repetir hasta que se haya anadido la cantidad deseada de tejido, teniendo cuidado de no sobrepasar el volumen maximo del primer subsistema. Una vez anadido el lipo-aspirado, se cierra la pinza de presion del tubo de vaciado (no mostrado). Se introduce en el sistema -300- una solution de lavado y/o de aclarado tal como la solution de lactato de Ringer o una solucion fisiologica abriendo la mordaza (no mostrada) a traves de una abertura o por medio de una tuberla IV esteril. La cantidad de la solucion de lavado o de aclarado a anadir puede variar. En general, se introduce suficiente solucion de lavado en el sistema, de tal modo que la mayor parte del lipo-aspirado u otro tejido en el primer subsistema quede sumergido. Se anaden 150 ml de una solucion de lavado tal como de la solucion de lactato de Ringer. A continuacion se cierra la mordaza y se agita manualmente el sistema durante un breve periodo de tiempo, por ejemplo 15 segundos. La agitation puede ser en forma de inversion, rotation, oscilacion, etc. El sistema se agita mediante medios externos tales como una plataforma agitadora un agitador orbital, etc. Una vez el tejido ha sido lavado a fondo (tal como se determina mediante observation o despues de un intervalo de tiempo preestablecido), se abre una valvula de presion para el vaciado (no mostrada) o una abertura y bajo la fuerza gravitatoria el efluente pasa a traves del material filtrante -320- y de la pantalla de separation -330-. Se deja que el efluente se vacle durante un periodo de tiempo, por ejemplo de 3 minutos. Este ciclo puede ser repetido un cierto numero de veces. El ciclo se puede repetir hasta un total de cuatro lavados. Despues del ultimo ciclo de lavado, se debe dejar que el residuo escurra de cinco a diez minutos. En general, el vaciado maximo de los fluidos residuales se produce despues de unos 10 minutos de escurrido. En consecuencia, se crea un injerto graso lavado y secado que esta sustancialmente libre de sangre, de fluido tumescente y de llpido libre sin necesidad de equipos mecanicos y en un sistema cerrado esteril que es facil de manipular. Asimismo, este proceso puede ser completado en un tiempo tan corto como 20 minutos y el cirujano puede controlar el nivel de hidratacion deseado mediante la modification del tiempo que se deja que escurra el sistema durante la etapa final.

Si se desea enriquecer el injerto graso obtenido utilizando el sistema -300- con celulas regenerativas derivadas de las adiposas (ADRCs), la ADRC obtenida por cualquiera de los procedimientos descritos en esta memoria o conocidos en la tecnica (tales como mediante la utilization del sistema CELUTION®), puede ser anadida a traves de una abertura cerca de la bolsa de solucion de lactato de Ringer y acelerada con solucion de lactato de Ringer u otra solucion adecuada durante 5 segundos o mas. El sistema puede ser agitado a continuacion tal como se ha descrito en esta memoria durante, por ejemplo, 15 segundos y el injerto graso mejorado de ADRC puede ser inyectado a continuacion o colocado de nuevo en el paciente segun se precise.

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   REIVINDICACIONES

   1. Dispositivo (300) para la preparacion de tejido para un injerto de tejido adiposo, que comprende:

   una bolsa flexible, plegable (200) que tiene una primera camara (280) y una segunda camara (290) que estan definidas por medio de un filtro (210) que tiene poros;

   un separador situado en el interior de la segunda camara (290), en que dicho separador (330) tiene una pantalla de separacion (330) que tiene poros que son mayores que los poros del filtro; y en el que dicho separador define una tercera camara en el interior de la segunda camara (290), y en el que los poros de dicho separador tienen aproximadamente de 300 a 30.000 micras, y en el que el separador tiene uno o varios nervios, tirantes y otras caracterlsticas que crean un espacio entre la envoltura exterior (340) y el filtro;

   una abertura de entrada (220) conectada a la bolsa flexible, plegable (200) en el que dicha abertura de entrada esta configurada para permitir la introduccion aseptica de tejido adiposo en la primera camara (280); y una abertura de salida (240) conectada a la bolsa flexible plegable, en el que la abertura de salida (240) esta configurada para extraer asepticamente llquido y celulas de la segunda camara (290).
2. 2. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que el separador es una estructura porosa que flota libremente en el interior de dicha segunda camara (290).
3. 3. Dispositivo (300), segun la reivindicacion 2, en el que la bolsa comprende una primera envoltura exterior (310) y una segunda envoltura exterior (340) unidas por medio de un doble sellado por calor (311).
4. 4. Dispositivo (300), segun la reivindicacion 3, en el que el filtro (210) esta unido a la primera envoltura exterior (340) y a la segunda envoltura exterior (340) por medio de un doble sellado por calor.
5. 5. Dispositivo (300), segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el separador (330) comprende un material de absorcion de llpido.
6. 6. Dispositivo (300), segun la reivindicacion 5, en el que dicho material de absorcion de llpido es una pantalla de malla de poliester.
7. 7. Dispositivo (300), segun la reivindicacion 1, en el que el tamano del poro del separador (300) es mayor o igual aproximadamente a 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces el tamano del poro de dicho filtro.
8. 8. Dispositivo (300), segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la abertura de entrada (220) esta configurada para ser fijada a una canula, al tiempo que mantiene esteril el recorrido del fluido/tejido.
9. 9. Dispositivo (300), segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas un segundo dispositivo, en el que dicho segundo dispositivo esta fijado al primer dispositivo (300) y en el que el segundo dispositivo comprende un dispositivo que tiene la misma estructura del dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Dispositivo (300), segun la reivindicacion 9, en el que el segundo dispositivo esta conectado al dispositivo (300) de las reivindicaciones 1 a 8 mediante un conducto que esta configurado para transferir celulas regenerativas aisladas derivadas de las adiposas desde dicho segundo dispositivo a la primera camara (280) del dispositivo de las reivindicaciones 1 a 8.
11. 11. Procedimiento para producir un injerto de tejido adiposo, que comprende:

    (a) introducir una primera porcion de un tejido adiposo sin procesar en la primera camara (280) de un primer dispositivo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

    (b) aclarar la primera porcion de tejido adiposo sin procesar mediante la adicion de una solucion fisiologica de lavado a la primera camara (280); y

    (c) extraer fluido de la segunda camara (290) del primer dispositivo, en el que el fluido es seleccionado de entre el grupo compuesto de agua, solucion fisiologica de lavado, sangre y llpido libre, o cualquier combinacion de los mismos, secando de este modo el tejido adiposo.
12. 12. Procedimiento, segun la reivindicacion 11, que comprende ademas aislar una poblacion de celulas regenerativas derivadas de las adiposas de una segunda porcion de tejido adiposo y poner en contacto el tejido adiposo deshidratado de (c) con la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas en unas condiciones que permiten que la poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas atraviese por permeacion el tejido adiposo secado de (c).
13. 13. Procedimiento, segun la reivindicacion 12, en el que dicha poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas es preparada en un segundo dispositivo, teniendo dicho segundo dispositivo la misma estructura que el dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, mediante el contacto del tejido adiposo presente en

    5 dicha primera camara (290) de dicho segundo dispositivo con colagenasa, en unas condiciones que liberan dichas celulas.
14. 14. Procedimiento, segun la reivindicacion 13, en el que la etapa de puesta en contacto es realizada en el segundo dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, fijado al primer dispositivo (300).

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15. 15. Utilizacion del dispositivo (300) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparation de una poblacion aislada de celulas regenerativas derivadas de las adiposas.