WO2019059279A1

WO2019059279A1 - 細胞懸濁液を調製するためのデバイス、システム及び方法

Info

Publication number: WO2019059279A1
Application number: PCT/JP2018/034816
Authority: WO
Inventors: 林　真司
Original assignee: 株式会社カネカ
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2019-03-28

Abstract

細胞含有試料から細胞懸濁液を、細胞に対し低負荷条件で効率的に調製することができるシステムを提供する。　本発明は、第１容器１００、第２容器２００及び第３容器３００を備え、第２容器２００の第２空間２１４にメッシュシート２１５を備える、細胞懸濁液を調製するための細胞懸濁液調製用デバイス２と、中空糸分離膜モジュール４００を備える、細胞懸濁液を濃縮又は洗浄するための濃縮洗浄装置３とを備える、細胞含有試料から酵素処理により細胞懸濁液を調製するための、細胞懸濁液調製システム１を提供する。

Description

細胞懸濁液を調製するためのデバイス、システム及び方法

　本発明は、生体組織等の細胞含有試料から細胞懸濁液を調製するのに適したシステム、及び、該システムを用いて細胞含有試料から細胞懸濁液を調製する方法に関する。
　本発明はまた、生体組織等の細胞含有試料から細胞懸濁液を調製するのに適したデバイスに関する。

　細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、患者に接種する方法が用いられている。これらの治療に用いる細胞は、治療に適した溶液に懸濁され、又は適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から細胞を採取した場合、治療に十分な細胞濃度でないことがあり、また、生体から採取した細胞を体外でさらに培養した場合、組織由来の夾雑物や培地成分などを含んでいることが多い。したがって、生体から採取又は培養した細胞を治療に用いるためには、夾雑物や培地成分を取り除き、治療に適した溶液などに懸濁された状態とし、治療に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。

　前記目的を解決するため、遠心分離を用いた濃縮、洗浄操作が知られている。例えば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離を用いる方法が開示されている（特許文献１）。しかし、このように遠心分離を用いる方法は、装置が大型になること、細胞に負荷がかかること、及びコストが増大することにより利用できる施設が限定されてしまうことが懸念される。さらに遠心分離により細胞を沈殿させた後の細胞懸濁液の上清を、細胞の洗浄のために取り除く際に、細胞が大気に開放される可能性があり、汚染等の問題が挙げられる。

　これに対して、コンパクトで簡便な装置である中空糸分離膜を用いた細胞懸濁液の分離、ろ過方法が提案されている（特許文献２）。本出願人も、中空糸型分離膜を用いる細胞濃縮液の製造方法として、例えば、細胞懸濁液を受け入れるための細胞懸濁液入口と、該細胞成分を実質上含まない液体を排出するための濾液出口と、細胞懸濁液を排出するための細胞懸濁液出口と、前記細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された分画分子量が１０００ｋＤ以下の中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いることを特徴とする細胞懸濁液の濃縮方法（特許文献３）などを提案している。

　一方、有用細胞を含む生体組織から有用細胞を分離する方法として、消化酵素で生体組織を分解して有用細胞を遊離させ、その後に遠心分離、濾過等の分離工程を経て有用細胞を回収する方法が知られている。

　例えば特許文献４の実施例１では、５０ｍＬ容の遠心チューブに、脂肪組織とコラゲナーゼ液とを収容し、３７℃、１２０回／ｍｉｎの条件で１時間振盪させて酵素反応を行い、その後にフィルターろ過及び遠心分離を行い、沈渣として沈降細胞集団（ＳＶＦ画分）を取得することが記載されている。

　特許文献５には、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置として、第１シートの物質と、前記第１シートの物質に結合された第２シートの物質と、前記第１シートの物質と前記第２シートの物質との間で画成された複数のチャンバとを備える装置が開示されている。そして、複数のチャンバとして、流入口及び流出口を含む試料解離チャンバ、前記試料解離チャンバの前記流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバ、及び、前記試料解離チャンバに流体連通する流入口と、流出口とを含む細胞精製チャンバが開示されている。そして、試料解離チャンバは、その内部にメッシュフィルタを更に含み、細胞精製チャンバは、その内部に、試料解離チャンバにおけるメッシュフィルタよりも細孔寸法の小さいメッシュフィルタを更に含む。そして、試料解離チャンバ内で脂肪組織試料を、コラゲナーゼ等の酵素を含む解離溶液により処理して、脂肪組織試料を解離することが開示されている。

特表２００７－５２４３９６号公報特許第２９２８９１３号公報特開２０１２－２１０１８７号公報国際公開第２００８／０１８４５０号特表２０１５－５０００３１号公報

　中空糸分離膜モジュールを用いた細胞懸濁液の濃縮洗浄方法は、細胞への負荷が小さいため好ましい。

　一方、中空糸分離膜モジュールによる濃縮洗浄処理に供するための細胞懸濁液の調製方法として、その後に中空糸分離モジュールで処理するのに適した細胞懸濁液の調製方法は従来検討されていない。例えば、特許文献４に記載されているような、細胞含有試料の酵素処理後に遠心分離を行い細胞懸濁液を調製する方法は、細胞への負荷が大きいため、その後に中空糸分離膜モジュールを用いて細胞を低負荷で処理する利点を生かすことができないと考えられる。また、特許文献５では、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置が記載されているが、脂肪組織試料の酵素処理を行う試料解離チャンバ内にメッシュフィルタが配置されているため、メッシュフィルタが目詰まりし易く細胞の分離に適していないと考えられる。

　本発明は、細胞含有試料の酵素処理による細胞懸濁液の調製から、中空糸膜分離モジュールを用いた細胞懸濁液の濃縮洗浄までを行い、細胞含有試料から細胞懸濁液を、細胞に対し低負荷条件で効率的に調製することができるシステム、並びに、該システムを用いた細胞懸濁液の調製方法を提供する。本発明はまた、細胞含有試料の酵素処理により、中空糸膜分離モジュールに供給するのに適した細胞懸濁液を調製するためのデバイスを提供する。

　本発明者らは、驚くべきことに、以下の特徴を備える細胞懸濁液調製用デバイスと濃縮洗浄装置とを組み合わせることにより、細胞含有試料から細胞懸濁液を細胞に対し低負荷条件で効率的に調製することができることを見出し、以下の発明を完成するに至った。

（１）細胞懸濁液調製システムであって、
　細胞懸濁液を調製するための細胞懸濁液調製用デバイスと、細胞懸濁液調製用デバイスにより調製された細胞懸濁液を濃縮又は洗浄するための濃縮洗浄装置とを備え、
　細胞懸濁液調製用デバイスが、第１容器及び第２容器を備え、
　第１容器が、
　第１空間を内包する第１容器本体と、
　第１空間からの液体の排出口が形成された第１排出部と
を備え、
　第２容器が、
　第２空間を内包する第２容器本体と、
　第２空間を第１区画と第２区画とに区切るように配置されたメッシュシートと、
　第１容器の第１空間から第１排出部の排出口を通じて排出される液体を、第１区画へ投入するための投入口が形成された第２投入部と、
　第２区画からの液体の排出口が形成された第２排出部と
を備え、
　濃縮洗浄装置は
　中空糸分離膜と、中空糸分離膜を収容する収容容器とを備え、収容容器には、中空糸分離膜へ供給される液体の導入口と、中空糸分離膜で処理された液体の導出口と、中空糸分離膜での濾液を排出する濾液排出口とが形成されている、中空糸分離膜モジュールと、
　中空糸分離膜モジュールの導出口から導入口まで液体を循環させる循環流路と、
　循環流路の途中に配置される貯留容器と、
　循環流路中の液体を中空糸分離膜モジュールの導出口から導入口に送液する送液部と
を備え、
　貯留容器が、
　循環流路を流れる液体を貯留する貯留空間を内包する貯留容器本体と、
　細胞懸濁液調製用デバイスで処理した液体を貯留空間に供給するための供給口が形成された供給部と
を備えることを特徴とする、細胞懸濁液調製システム。
（２）細胞懸濁液調製用デバイスが、第３容器を更に備え、
　第３容器が、
　第３空間を内包する第３容器本体と、
　第２容器の第２区画から排出される液体を、第３空間へ投入するための投入口が形成された第３投入部と
を備える、（１）に記載の細胞懸濁液調製システム。
（３）細胞懸濁液調製用デバイスにおいて、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間、及び、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間の少なくとも一方が、予め接続されている、（２）に記載の細胞懸濁液調製システム。
（４）細胞懸濁液調製用デバイスにおいて、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間、及び、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間の一方のみが予め接続されており、他方が接続可能である、（３）に記載の細胞懸濁液調製システム。
（５）第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間が接続可能であり、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間が予め接続されている、（４）に記載の細胞懸濁液調製システム。
（６）細胞懸濁液調製用デバイスにおいて、第１容器の第１排出部と、第２容器の第２投入部とが予め接続されている、（１）に記載の細胞懸濁液調製システム。
（７）メッシュシートの細孔径が５０～３００μｍである、（１）～（６）のいずれかに記載の細胞懸濁液調製システム。
（８）第２容器本体が、メッシュシートを間に介して対向する第１側壁と第２側壁とを含み、
　第１側壁とメッシュシートとが第１区画を囲い、
　第２側壁とメッシュシートとが第２区画を囲い、
　第２投入部が、第１側壁の周縁部とメッシュシートの周縁部との間に、第２投入口を介して第１区画と外部とを連通するように配置されており、
　第２排出部が、第２側壁の周縁部とメッシュシートの周縁部との間に、第２排出口を介して第２区画と外部とを連通するように配置されており、
　第１側壁、第２側壁及びメッシュシートが周縁部において一体化されて第２容器を形成している、（１）～（７）のいずれかに記載の細胞懸濁液調製システム。
（９）第２投入部と、第２排出部とが、第２容器本体の対向する位置に配置されており、
　第２投入部の第１区画の側の端の、第１側壁と第２側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ１、
　第２排出部の第２区画の側の端の、第１側壁と第２側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ２、
　Ｗ１とＷ２との平均値をＷ、
　第２投入部の第１区画の側の端と、第２排出部の第２区画の側の端との間の距離をＤ
としたとき、
　Ｄ／Ｗが１３以上である、（８）に記載の細胞懸濁液調製システム。
（１０）第１容器が、洗浄液を第１空間に投入するための洗浄液投入部を備える、（１）～（９）のいずれかに記載の細胞懸濁液調製システム。

（１１）（１）～（１０）のいずれかに記載の細胞懸濁液調製システムを用いて、細胞含有試料から細胞懸濁液を調製する方法であって、
　第１容器の第１空間内に、細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液を収容し、第１容器を振盪させながら細胞含有試料の酵素処理を行う工程１と、
　工程１後に、工程１で生成した第１容器の第１空間内の酵素処理液の少なくとも一部を、第２容器の第１区画に移動させ、第２容器のメッシュシートを通過させて第２容器の第２区画の側に細胞懸濁液を生成する工程２と、
　工程２で生成した細胞懸濁液を濃縮洗浄装置の貯留容器の貯留空間に供給する工程３と、
　貯留空間に供給された細胞懸濁液を、送液部により、循環流路を経由して送液して、中空糸分離膜モジュールの導入口に導入し、濾液を濾液排出口から排出しながら、中空糸分離膜により処理し、処理された細胞懸濁液を、導出部から循環流路に導出し、導入口まで循環させる工程４と
を含む方法。
（１２）細胞含有試料が生体試料であり、
　工程１で生成した第１容器の第１空間内の酵素処理液が油層と水層との二層に分離するまで第１容器を静置する層分離工程を、工程１と工程２との間に含み、
　層分離工程の後に行う工程２では、その途中で、第１容器の第１空間内の水層が第２容器の第１区画に移動した時点で、第１容器と第２容器の間の酵素処理液の移動を停止し、第１容器の第１空間内に洗浄液を加えて、第１空間内に残留した油層と洗浄液とを混合し、混合液が油層と水層との二層に分離するまで第１容器を静置し、静置後に水層を第２容器の第１区画に移動させる洗浄工程を１回以上行う、
（１１）に記載の方法。

（１３）細胞懸濁液調製用デバイスであって、
　第１容器及び第２容器を備え、
　第１容器が、
　第１空間を内包する第１容器本体と、
　第１空間からの液体の排出口が形成された第１排出部と
を備え、
　第２容器が、
　第２空間を内包する第２容器本体と、
　第２空間を第１区画と第２区画とに区切るように配置されたメッシュシートと、
　第１容器の第１空間から第１排出部の排出口を通じて排出される液体を、第１区画へ投入するための投入口が形成された第２投入部と、
　第２区画からの液体の排出口が形成された第２排出部と
を備えることを特徴とする、細胞懸濁液調製用デバイス。
（１４）第３容器を更に備え、
　第３容器が、
　第３空間を内包する第３容器本体と、
　第２容器の第２区画から排出される液体を、第３空間へ投入するための投入口が形成された第３投入部と
を備える、（１３）に記載の細胞懸濁液調製用デバイス。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１７－１８０５６４号の開示内容を包含する。

　本発明のシステム、デバイス及び方法により、細胞含有試料から細胞懸濁液を効率的に調製することができる。

本発明の細胞懸濁液調製システムの一実施形態の全体構成を示す模式図である。図１には細胞懸濁液調製用デバイスとして第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイスを示す。本発明の細胞懸濁液調製システムに用いることができる、第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイスの第１容器を示す図である。本発明の細胞懸濁液調製システムに用いることができる、第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイスの第２容器及び第３容器を示す図である。図３に示すＩ－Ｉ線での断面の模式図である。図３に示すＩＩ－ＩＩ線での断面の模式図である。本発明の細胞懸濁液調製システムに用いることができる濃縮洗浄装置の一実施形態を示す図である。細胞懸濁液調製用デバイスの第１容器を用いた洗浄方法を説明するための図である。第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイスを示す模式図である。第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイスを示す模式図である。第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイスと、濃縮洗浄装置とを備える、細胞懸濁液調製システムの全体構成を示す模式図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。

＜用語、材料＞
　細胞含有試料としては生体組織、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで調製した細胞培養物等が例示できる。生体組織は典型的には動物より採取した生体組織であり、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などに由来する生体組織が挙げられる。本明細書で開示する方法は特に脂肪組織から間質血管画分（ＳＶＦ）細胞を取り出すのに有用である。

　脂肪組織とは典型的には哺乳動物の脂肪組織であり、例えば、ヒト由来の皮下脂肪、内臓脂肪、白色脂肪、褐色脂肪である。脂肪組織は、任意の形状であってよく、例えば、脂肪組織をハサミ等の鋭利な器具を用いて破砕したもの、濾し器等を用いてミンチ状にしたもの、脂肪吸引法を用いて分解したものであってよい。ここで脂肪吸引法とは、一般的な美容成形外科で行なわれている吸引法であれば特に限定されず、例えば、超音波脂肪吸引、カニューレ等を用いたパワードリポサクション、シリンジ吸引等による方法である。
　有核細胞とは、細胞内に核を有する細胞である。

　細胞懸濁液に含まれる細胞としては、生体組織幹細胞、白血球、単球、顆粒球、リンパ球、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周細胞等、細胞治療や実験等の目的で採取が必要とされる有核細胞が例示できる。生体組織幹細胞は、好ましくは、脂肪由来間葉系幹細胞、脂肪由来間質幹細胞であり、より好ましくは細胞表面のＣＤ３４、７３、９０、１０５、１０６、１３３、１６６から選ばれる少なくとも一つを発現している脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞である。

　細胞含有試料から細胞を遊離させるための酵素としては、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、アミノペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びそれらのリコンビナントから選ばれる少なくとも１種の分解酵素が使用できる。細胞含有試料として生体組織、特に脂肪組織を用いる場合には、酵素としては、短時間に、かつ低侵襲で分解するという観点から、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ、トリプシン及びヒアルロニダーゼから選択される少なくとも１種の分解酵素が好ましい。

　酵素を溶解して酵素液を調製するための水系媒体、細胞含有試料の酵素処理を行うため水系媒体、細胞を懸濁するための水系媒体、酵素処理された細胞含有試料を洗浄するための洗浄液、及び／又は、濃縮洗浄装置により細胞懸濁液を洗浄するための洗浄液としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ブドウ糖液、リンゲル液、ハンクス液、注射溶液、培地、等張液等の水系媒体を用いることができる。

＜細胞懸濁液調製システム＞
　本発明の細胞懸濁液調製システムの一実施形態を図１～６を参照して以下に説明する。
　図１に示す通り、細胞懸濁液調製システム１は、細胞懸濁液を調製するための細胞懸濁液調製用デバイス２と、細胞懸濁液を濃縮又は洗浄するための濃縮洗浄装置３とを備える。
　以下に、細胞懸濁液調製用デバイス２の構成、濃縮洗浄装置３の構成、細胞懸濁液調製システム１を用いて細胞懸濁液を調製する方法について説明する。

＜細胞懸濁液調製用デバイスの構成＞
　細胞懸濁液調製用デバイス２は、第１容器１００、第２容器２００及び第３容器３００を備える。図１～３には、細胞懸濁液調製用デバイス２の第１実施形態を示す。

　第１実施形態に係る細胞懸濁液調製用デバイス２における第１容器１００の構造について説明する。
　第１容器１００は、図２に示すように、第１空間１１４を内包する第１容器本体１１０と、第１空間１１４への材料の投入口１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃがそれぞれ形成された、第１投入部１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃからなる第１投入部１２０と、第１空間１１４からの液体の排出口１３１Ａ、１３１Ｂが形成された、第１排出部１３０Ａ、第１排出部１３０Ｂからなる第１排出部１３０とを備える。

　第１投入部１２０Ａは、第１空間１１４への材料の投入口１２１Ａを形成する管部１２２Ａと、管部１２２Ａの入口を連通可能に封鎖するメスルアーロック１２３Ａと、メスルアーロック１２３Ａを保護する着脱自在の蓋部１２４Ａと、管部１２２Ａを通る液体を濾過するフィルター部１２５Ａとを備える。

　第１投入部１２０Ｂは、第１空間１１４への材料の投入口１２１Ｂを形成する管部１２２Ｂと、管部１２２Ｂの入口を連通可能に封鎖するニードルレスポート１２３Ｂと、ニードルレスポート１２３Ｂを保護する着脱自在の蓋部１２４Ｂとを備える。

　第１投入部１２０Ｃは、第１空間１１４への材料の投入口１２１Ｃを形成する管部１２２Ｃと、管部１２２Ｃの入口を連通可能に封鎖するニードルレスポート１２３Ｃと、ニードルレスポート１２３Ｃを保護する着脱自在の蓋部１２４Ｃとを備える。

　第１排出部１３０Ａは、第１空間１１４からの液体の排出口１３１Ａを形成する管部１３２Ａと、管部１３２Ａの出口を連通可能に封鎖するニードルレスポート１３３Ａと、ニードルレスポート１３３Ａを保護する着脱自在の蓋部１３４Ａとを備える。

　第１排出部１３０Ｂは、第１空間１１４からの液体の排出口１３１Ｂを形成する管部１３２Ｂと、管部１３２Ｂの出口を連通可能に封鎖するニードルレスポート１３３Ｂと、ニードルレスポート１３３Ｂを保護する着脱自在の蓋部１３４Ｂとを備える。

　第１実施形態では、第１容器１００は第１投入部１２０を３つ備えるが、１つのみ、２つのみまたは４つ以上の第１投入部を備えてもよい。第１投入部１２０は、第１容器１００の第１空間１１４での細胞含有試料の酵素処理に用いる材料（例えば細胞含有試料、酵素、酵素液等）、或いは、第１空間１１４内での細胞含有試料の洗浄に用いるための洗浄液を第１空間１１４に投入するために用いられる。

　第１実施形態では、第１容器１００は、第１排出部１３０を２つ備えるが、１つのみ又は３つ以上の第１排出部を備えてもよい。第１排出部１３０は、細胞含有試料を酵素処理して形成される遊離細胞を含む酵素処理液の少なくとも一部を第１空間１１４から排出するために用いられる。

　第１容器本体１１０は、第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２とを対向配置し、周縁部を熱融着により接合して袋体としたものである。第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２が熱融着により接合した部分を融着部１１３とする。第１容器本体１１０には、第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２との間に第１空間１１４が形成されている。なお、図２は、第１空間１１４が空の状態の第１容器１００の平面模式図であり、図示しないが、第１空間１１４に細胞含有試料及び酵素を含む反応混合液が収容されると、第１容器本体１１０は袋状に膨張する。第１空間１１４において細胞含有試料の酵素処理が行われる。第１投入部１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃの管部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃは、それらの一方の端部が、第１容器本体１１０の長手方向の一端の辺上の、第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２との間に配置され、その周りの第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２が熱融着により接合されて、第１容器本体１１０と一体化されている。同様に、第１排出部１３０Ａ、１３０Ｂの管部１３２Ａ、１３２Ｂは、それらの一方の端部が、第１容器本体１１０の長手方向の他端の辺上の、第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２との間に配置され、その周りの第１樹脂シート１１１と第２樹脂シート１１２が熱融着により接合されて、第１容器本体１１０と一体化されている。

　第１実施形態では第１容器本体１１０の第１投入部１２０が配置される側の辺の両端の、融着部１１３よりも外側の部分に、貫通孔１１５、１１５が形成されている。貫通孔１１５はフックなどに掛けるために用いることができる。

　第１樹脂シート１１１及び第２樹脂シート１１２並びに各管部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃは、柔軟性を有する材料により形成されることが好ましい。柔軟性を有する材料の具体例としては、軟質塩化ビニル、塩化ビニル、ポリウレタン、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリエチレンやポリプロピレンのようなポリオレフィン、スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体又はその水添物及びスチレン－イソプレン－スチレン共重合体またはその水添物等の熱可塑性エラストマー、ならびに、熱可塑性エラストマーとポリオレフィン及びエチレン－エチルアクリレート等の軟化剤との混合物等の、柔軟性を有する樹脂が挙げられる。第１樹脂シート１１１及び第２樹脂シート１１２は、少なくとも一部を透明または半透明の材料からなるものとすると、内部の細胞懸濁液の様子を目視で観察できるため好ましい。第１樹脂シート１１１及び第２樹脂シート１１２の内側面は、ナシジ加工されていると、細胞懸濁液の排出時に残液を少なくすることができるため好ましい。

　続いて第２容器２００の構造について説明する。
　第１実施形態に係る細胞懸濁液調製用デバイス２における第２容器２００は、図３～５に示す通り、第２空間２１４を内包する第２容器本体２１０と、第２空間２１４を第１区画２１４－１と第２区画２１４－２とに区切るように配置されたメッシュシート２１５と、第１区画２１４－１への液体の投入口２２１が形成された第２投入部２２０と、第２区画２１４－２からの液体の排出口２３１が形成された第２排出部２３０とを備える。

　第２投入部２２０は、第１区画２１４－１への液体の投入口２２１を形成する管部２２２と、管部２２２の入口に取り付けられ、第１容器１００の第１排出部１３０Ａ、１３０Ｂのニードルレスポート１３３Ａ、１３３Ｂと接続可能なオスコネクター２２３と、オスコネクター２２３を保護する蓋部２２４と、管部２２２の外側に取り付けられ、管部２２２内の投入口２２１の流路を開閉するためのローラークランプ２２５とにより構成される。

　第２排出部２３０は、第２区画２１４－２からの液体の排出口２３１を形成する管部２３２により構成される。

　第２容器本体２１０は、内部にメッシュシート２１５を保持することができ、かつ内部に保持する細胞等に影響を与えるようなものでなければ、どのような材質のもので、どのように形成されていてもよい。

　第２容器本体２１０とメッシュシート２１５は、例えば、図４及び５に示すように、メッシュシート２１５を間に介して対向する、第１側壁の実施形態である第３樹脂シート２１１と、第２側壁の実施形態である第４樹脂シート２１２とを含み、第３樹脂シート（第１側壁）２１１と第４樹脂シート（第２側壁）２１２との間に第２空間２１４が形成され、第３樹脂シート（第１側壁）２１１とメッシュシート２１５とが第２空間２１４の第１区画２１４－１を囲い、第４樹脂シート（第２側壁）２１２とメッシュシート２１５とが第２空間２１４の第２区画２１４－２を囲うように構成することができる。第３樹脂シート（第１側壁）２１１、第４樹脂シート（第２側壁）２１２及びメッシュシート２１５は概ね円形の平面形状を有し、第３樹脂シート（第１側壁）２１１と第４樹脂シート（第２側壁）２１２とは寸法が略同じであり、メッシュシート２１５の寸法はそれよりも小さく形成されている。この実施態様では、第３樹脂シート２１１と、第４樹脂シート２１２と、メッシュシート２１５は、第３樹脂シート２１１の周縁部２１１Ａ、第４樹脂シート２１２の周縁部２１２Ａ、及び、メッシュシート２１５Ａの周縁部２１５Ａにおいて熱融着により一体化されて、融着部２１３を形成している。なお、図４及び５は、第２空間２１４が空の状態の第２容器２００断面模式図である。第３樹脂シート２１１及び第４樹脂シート２１２が柔軟性を有する樹脂シートである場合、第２空間２１４内に液体を収容したときに、第３樹脂シート２１１及び第４樹脂シート２１２の中央部分が外方に向けに膨出して形状が変化し、第２空間２１４の容積が増す。容積が増した第２空間２１４内で後述するメッシュシート２１５による夾雑物の除去を行うことができる。

　第２容器本体２１０は、少なくとも一部を透明または半透明の材料からなるものとすると、内部の細胞懸濁液の様子を目視で観察できるため好ましい。第２容器本体２１０を構成する第３樹脂シート２１１及び第４樹脂シート２１２の材料は、接着剤を用いずに熱融着により接着可能なものであると、製造工程の簡素化を図ることができ、かつ接着剤の細胞への影響を考慮しなくてもよいため好ましい。

　第３樹脂シート２１１及び第４樹脂シート２１２並びに各管部２２２、２３２は、柔軟性を有する材料により形成されることが好ましい。柔軟性を有する材料の具体例としては、第１容器１００の第１樹脂シート１１１及び第２樹脂シート１１２並びに各管部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃに用いることができる樹脂材料として例示したものと同じである。第３樹脂シート２１１及び第４樹脂シート２１２の内側面は、ナシジ加工されていると、細胞懸濁液の排出時に残液を少なくすることができるため好ましい。

　メッシュシート２１５は、第２空間２１４を第１区画２１４－１と第２区画２１４－２とに区切るように配置される。メッシュシートとしては、水等の液体を透過させることができ、好ましくは、必要な細胞を通過させることができるものを用いる。メッシュシート２１５は、細孔径が５０～３００μｍの範囲であることが好ましい。細孔径がそのような範囲であれば、生体組織の酵素処理物に含まれる未消化の組織塊やデブリスなどの夾雑物を、メッシュの目詰まりを発生させずに除去し、必要な細胞のみを通過させることができる。この効果を一層発現させるためには細孔径は、好ましくは５０μｍ以上、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下である。また、メッシュシート２１５は、開孔率が４０％以上、特に４５％以上であると、目詰まりが発生しづらく好ましい。

　なお、本明細書において「メッシュ」とは、面状に広がりを有し、一方の表面から他方の表面へと貫通する複数の細孔が二次元的に配置され網目構造が形成されている材料を意味する。メッシュの例としては、繊維が網目構造を形成するように織られてなるものや、厚さ方向に貫通した複数の細孔が形成されたメンブレン等が挙げられるがこれらには限らない。メッシュには、一般的に「スクリーン」と呼ばれるものも包含される。メッシュにより構成されたシートを「メッシュシート」と称する。本明細書において「メッシュ」は、前記網目構造を有さず且つ三次元細孔を有する材料（例えば、繊維状多孔性媒体やスポンジ状構造物であり、前記網目構造を有さず且つ三次元細孔を有する材料）とは異なる概念である。メッシュシート２１５の材質は、材料の安全性や安定性、入手容易性の観点から、合成樹脂材料、例えばナイロン、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の少なくとも１種より選択される合成高分子やヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属が挙げられる。２種以上の材料を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属からなる群から選択される２種以上の材料の組み合わせが好ましい。メッシュシート２１５は、少なくとも第２空間２１４に液体を入れた際に、メッシュシート面がほぼ平坦となるよう第２容器本体２１０内に設けられている。メッシュシート２１５は液体を透過することができるものであるため、投入口２２１を通じて投入された液体中の液状媒体、溶解成分及びメッシュシートを透過できる大きさの成分は、メッシュシート２１５を透過して第２区画２１４－２も移動し、メッシュシート２１５を透過できない大きさの成分は第１区画２１４－１に留まる。

　メッシュシートの細孔径とは、メッシュシートの一方の表面から他方の表面へと貫通する細孔を、貫通方向に沿って観察することにより特定される、細孔の内周の輪郭に内接する最大内接円の直径の平均値を意味する。平均値は、例えば細孔を５０個以上、好ましくは１００個以上観察して得られた値から算出することが好ましい。メッシュシートが、繊維が網目構造を形成するように織られてなるものである場合、細孔径はメッシュの平均目開きと等しい。平均目開きは、例えばルノメーターを用いて測定した単位長（例えば１インチ）あたりの繊維数に基づいて算出することができる。

　メッシュシートの開孔率は、メッシュシートを平面視したときの、全体の面積に対する、開孔部分を合計した面積の割合を指す。

　第２投入部２２０と第２排出部２３０は、どのように設けてもよいが、例えば、第２容器本体２１０およびメッシュシート２１５の相対関係を前述したような図４及び５に示した構成、すなわち第３樹脂シート２１１と第４樹脂シート２１２とを対向配置し、その間にメッシュシート２１５を配置する構成の場合、第２投入部２２０の管部２２２は、第３樹脂シート２１１の周縁部２１１Ａとメッシュシート２１５の周縁部２１５Ａとの間に、管部２２２内の投入口２２１を通じて第１区画２１４－１と外部とが連通されるように配置し、第２排出部２３０の管部２３２は、第４樹脂シート２１２の周縁部２１２Ａとメッシュシート２１５の周縁部２１５Ａとの間に、管部２３２内の排出口２３１を介して第２区画２１４－２と外部とが連通されるように配置する。より具体的には、第２投入部２２０の管部２２２は、第３樹脂シート２１１の周縁部２１１Ａとメッシュシート２１５の周縁部２１５Ａとの間に挟み込むように配置することができ、第２排出部２３０の管部２３２は、第４樹脂シート２１２の周縁部２１２Ａとメッシュシート２１５の周縁部２１５Ａとの間に挟み込むように配置することができる。

　第２投入部２２０と第２排出部２３０は、メッシュシート２１５に対する相対的な位置が上記に説明したとおりであれば、第２容器本体２１０のいずれの位置に設けられていてもよい。しかしながら、第２容器本体２１０において第２投入部２２０と第２排出部２３０を互いに対向する位置に設けると、第１容器１００の第１排出部１３０からの第２投入部２２０への酵素処理液の投入から、第２排出部２３０からの細胞懸濁液の排出までの処理をスムーズに行うことができるため好ましい。なお、「互いに対向する位置に設ける」とは、例えば図３～５に示したように第２容器本体２１０が円形の平面形状をしている場合、円の中心を間に介して対向する一対の位置の一方に第２投入部２２０を設け、他方に第２排出部２３０を設けることを指す。

　第２容器２００の特に好ましい実施形態では、（ｉ）第２投入部２２０の管部２２２の、第１区画２１４－１の側の端２２２’の、第３樹脂シート２１１と第４樹脂シート２１２とが対向する方向に沿った幅をＷ１とし、（ｉｉ）第２排出部２３０の管部２３２の、第２区画２１４－２の側の端２３２’の、第３樹脂シート２１１と第４樹脂シート２１２とが対向する方向に沿った幅をＷ２とし、かつ（ｉｉｉ）第２投入部２２０の管部２２２の、第１区画２１４－１の側の端２２２’と、第２排出部２３０の管部２３２の、第２区画２１４－２の側の端２３２’との間の距離をＤとし、Ｗ１とＷ２との平均値をＷとした場合、Ｄ／Ｗが１３以上である。Ｄ／Ｗが大きいほど、第２容器２００内での液体の流れる方向に対して、メッシュシート２１５の成す角度が小さくなり、メッシュシート２１５を通過しない成分の堆積によるメッシュシート２１５の目詰まりを抑制することができる。この効果はＤ／Ｗが１３以上である場合に特に高い。この実施形態では、第２投入部２２０の管部２２２と、第２排出部２３０の管部２３２とが、同軸上に位置するように配置されていることが好ましい。

　続いて、第１実施形態に係る細胞懸濁液調製用デバイス２における第３容器３００の構造を説明する。

　第１実施形態の第３容器３００は、図３に示すように、第３空間３１４を内包する第３容器本体３１０と、第３空間３１４への液体の投入口３２１が形成された第３投入部３２０と、第３空間３１４からの液体の排出口３３１が形成された第３排出部３３０とを備える。

　第３容器本体３１０は、概ね長方形の第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２とを対向配置し、周縁部を熱融着により接合して袋体としたものである。第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２が熱融着により接合した部分を融着部３１３とする。第３容器本体３１０には、第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２との間に第３空間３１４が形成されている。なお、図３は、第３空間３１４が空の状態の第１容器１００の平面模式図である。図示しないが、第３空間３１４に細胞懸濁液が収容されると、第３容器本体３１０は袋状に膨張する。第３空間３１４に、第２容器２００でメッシュシート２１５を通過して排出された細胞懸濁液が貯留される。

　第３投入部３２０は、第３空間３１４への液体の投入口３２１を形成する管部３２２により構成される。第３投入部３２０の管部３２２の上流側端は、第２容器２００の第２排出部２３０の管部２３２の下流側端と接続されており、第２排出部２３０の管部２３２と、第３投入部３２０の管部３２２とは、一体となって、第２容器２００の第２空間２１４の第２区画２１４－２から第３容器３００の第３空間１４までを連通する流路を形成する。第３投入部３２０の管部３２２は、第３容器本体３１０の長手方向の一端の辺上の、第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２との間に配置され、その周りの第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２が熱融着により接合されて、第３容器本体３１０と一体化されている。

　第３排出部３３０は、第３空間３１４から排出される液体の流路となる排出口３３１を形成する管部３３２と、管部３３２の出口を連通可能に封鎖するニードルレスポート３３３と、ニードルレスポート３３３を保護する着脱自在の蓋部３３４とにより構成されている。管部３３２は、ニードルレスポート３３３が配置されていない側の端部が、第３容器本体３１０の長手方向の他端の辺上の、第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２との間に配置され、その周りの第５樹脂シート３１１と第６樹脂シート３１２が熱融着により接合されて、第３容器本体３１０と一体化されている。第５樹脂シート３１１及び第６樹脂シート３１２並びに各管部３２２、３３２は、柔軟性を有する材料により形成されることが好ましい。柔軟性を有する材料の具体例としては、第１容器１００の第１樹脂シート１１１及び第２樹脂シート１１２並びに各管部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃに用いることができる樹脂材料として例示したものと同じである。第５樹脂シート３１１及び第６樹脂シート３１２の内側面は、ナシジ加工されていると、細胞懸濁液の排出時に残液を少なくすることができるため好ましい。

　第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２では、第１容器１００の第１排出部１３０と、第２容器２００の第２投入部２２０とは、上記の通り、分離されているが、液体を流通可能に接続可能なように構成されており、第２容器２００の第２排出部２３０と第３容器３００の第３投入部３２０とは、第２排出部２３０の管部２３２と、第３投入部３２０の管部３２２とが一体となって、液体を流通できるように予め接続されている。すなわち、第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２は、図２に示す第１容器１００と、図３に示す、第２容器２００と第３容器３００とが予め接続されたものとの組み合わせである。なお、本発明の細胞懸濁液調製用デバイスでは、第１容器、第２容器及び第３容器の接続の形態は特に限定されない。容器間の接続の様式が異なる本発明の細胞懸濁液調製用デバイスの他の具体的な実施形態として、第２実施形態（図８参照）及び第３実施形態（図９参照）を後述する。また、図示しないが、第１容器、第２容器、第３容器が全て切り離し可能なものも、本発明の細胞懸濁液調製用デバイスの一例である。

　第１容器、第２容器、第３容器を備える細胞懸濁液調製用デバイスは、好ましくは、第１～第３実施形態に示すように、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間、及び、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間の少なくとも一方が、予め接続されている。この場合、細胞懸濁液調製用デバイスは１つ又は２つの部分により構成されていることになり、３つの部分により構成されている場合と比較して取扱いが容易である。

　第１容器、第２容器、第３容器を備える細胞懸濁液調製用デバイスは、更に好ましくは、第１又は第２実施形態に示すように、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間、及び、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間の一方のみが予め接続されており、他方が接続可能である。この場合、細胞懸濁液調製用デバイスは２つの部分により構成されていることになり、第１容器を用いた酵素処理、第２容器を用いたメッシュ濾過処理等の処理が容易となる。また、細胞懸濁液調製用デバイスをガス滅菌する際に処理後のガスが抜け易い点でも有利である。

　第１容器、第２容器、第３容器を備える細胞懸濁液調製用デバイスは、更に好ましくは、第１実施形態に示すように、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間が接続可能に分離されており、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間が予め接続されている。この場合、第２容器及び第３容器とは分離された状態の第１容器中で酵素処理を行うことができるため、酵素処理が容易となる。

　なお、第１～第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２における第３容器３００は、第１容器１００及び第２容器２００による処理を経て生成した細胞懸濁液を貯留するための容器である。このため、第２容器２００の第２排出部２３０が後述する濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の供給部６１１に接続可能である場合には、第３容器は不要である。第３容器を備えない細胞懸濁液調製用デバイスの具体的な実施形態として、第４実施形態（図１０参照）を後述する。第１容器及び第２容器を備え第３容器を備えない細胞懸濁液調製用デバイスは、好ましくは、第４実施形態に示すように、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部とが予め接続されている。この場合、細胞懸濁液調製用デバイスは１つの部分により構成されていることになり取扱いが容易である。

＜濃縮洗浄装置の構成＞
　図６に示す実施形態の濃縮洗浄装置３は、中空糸分離膜モジュール４００と、中空糸分離膜モジュール４００の導出口４１２から導入口４１１に液体を循環させる循環流路６０１と、循環流路６０１の途中に配置される貯留容器６１０と、循環流路６０１中の液体を中空糸分離膜モジュール４００の導出口４１２から導入口４１１に送液する送液部である第１ポンプ６０４とを備える。

　中空糸分離膜モジュール４００は、中空糸分離膜４０１と、それを収容する収容容器４１０とを備える。収容容器４１０は、中空糸分離膜４０１へ供給される液体を導入する導入口４１１が形成された上流側頭部４１４と、中空糸分離膜４０１で処理された液体を導出する導出口４１２が形成されている下流側頭部４１５と、上流側頭部４１４と下流側頭部４１５とを接続する胴部４１６とを含む。胴部４１６には、中空糸分離膜４０１での濾液を排出する濾液排出口４１３が形成されている。

　胴部４１６の内部には、多数の中空糸分離膜４０１の束４０２と、胴部４１６の上流側端において、中空糸分離膜４０１の束４０２を、中空糸分離膜４０１の上流側開口端４０３が上流側頭部４１４に向くように固定し、隣接する中空糸分離膜４０１の間及び束４０２と胴部４１６の内周面との隙間を埋める上流側樹脂層部４２１と、胴部４１６の下流側端において、中空糸分離膜４０１の束４０２を、中空糸分離膜４０１の下流側開口端４０４が下流側頭部４１５に向くように固定し、隣接する中空糸分離膜４０１の間及び束４０２と胴部４１６の内周面との隙間を埋める下流側樹脂層部４２２とが配置されている。胴部４１６の上流側端は上流側頭部４１４により被冠されており、胴部４１６の下流側端は下流側頭部４１５により被冠されている。この構成により、導入口４１１及び導出口４１２は、中空糸分離膜４０１の内側の空間を介して連続しており、濾液排出口４１３は、導入口４１１及び導出口４１２とは、中空糸分離膜４０１を構成する膜壁により隔てられ、連続しない構造となっている。

　中空糸分離膜モジュール４００では、導入口４１１から供給された細胞懸濁液が上流側開口端４０３から中空糸分離膜４０１の内側に導入される。導入された細胞懸濁液は、中空糸分離膜４０１の内側の空間を満たしながら、中空糸分離膜４０１の膜壁に設けられた微細孔を通過して中空糸分離膜４０１の外側に夾雑物や培地成分を含む濾液が排出され、この濾液は濾液排出口４１３から中空糸分離膜モジュール４００から排出される。一方、中空糸分離膜４０１の内側にある濃縮された細胞懸濁液は下流側開口端４０４から、導出口４１２を通って中空糸分離膜モジュール４００の外に導出される。

　中空糸分離膜４０１の束４０２は、中空糸分離膜４０１を１０～１０００本程度束ねたものであることが好ましい。

　中空糸分離膜４０１を構成する樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料が好ましく用いることができる。この中でも、ポリスルホン系又はセルロース系の親水性の高分子材料がより好ましく用いることができる。さらに、ポリエーテルスルホン、セルロースエステルが材料の安全性、安定性、入手のしやすさから最も好適に用いることができる。

　また、中空糸分離膜４０１の膜壁に設けられた微細孔の孔径は０．１μｍ以上１．５μｍ以下が好ましい。前記孔径が０．１μｍ以上であることにより、細胞懸濁液の濃縮時に不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去することができるため好ましい。一方、前記孔径が１．５μｍ以下であると、細胞懸濁液を濃縮する工程において微細孔への細胞の詰まりが生じ難く、細胞回収率が向上するため好ましい。前記孔径は、１．５μｍ以下が好ましく、１．２μｍ以下がより好ましく、１．０μｍ以下がさらに好ましい。前記孔径は、中空糸分離膜の平均孔径を指し、一般的にパームポロメーターにより測定、算出される。

　収容容器４１０の素材としては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。

　上流側樹脂層部４２１及び下流側樹脂層部４２２の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂等一般的な接着材料が好ましく用いることができる。

　本実施形態の濃縮洗浄装置３は更に、中空糸分離膜モジュール４００の導出口４１２と導入口４１１とを接続し、導出口４１２から導入口４１１に液体を循環させる循環流路６０１と、中空糸分離膜モジュール４００の濾液排出口４１３に接続され、濾液を排出する排出流路６０２と、循環流路６０１の分岐部６２０において分岐した回収流路６０３とを備える。

　図６に示す実施形態の貯留容器６１０は、循環流路６０１の途中に配置されている。循環流路６０１のうち、貯留容器６１０よりも上流側の部分、すなわち中空糸分離膜モジュール４００の導出口４１２から貯留容器６１０までの間を上流側の循環流路６０１Ａとし、貯留容器６１０よりも下流側の部分、すなわち貯留容器６１０から中空糸分離膜モジュール４００の導入口４１１までの間を下流側の循環流路６０１Ｂとする。

　貯留容器６１０は、循環流路６０１を流れる液体を貯留する貯留空間６１５を内包する貯留容器本体６１６と、上流側の循環流路６０１Ａに接続され、上流側の循環流路６０１Ａから貯留空間６１５への液体の出口が形成された循環出口部６１３と、下流側の循環流路６０１Ｂに接続され、貯留空間６１５から下流側の循環流路６０１Ｂへの液体の入口が形成された循環入口部６１２と、細胞懸濁液調製用デバイス２で処理された液体（具体的には細胞懸濁液調製用デバイス２を用いて調製された細胞懸濁液）の供給口が形成された供給部６１１と、貯留空間６１５内の圧力を調節するためのエアフィルター６１４と、を備える。図６では、上流側の循環流路６０１Ａが循環出口部６１３に接続され、下流側の循環流路６０１Ｂが循環入口部６１２に接続された例を示す。循環流路６０１を、中空糸分離膜モジュール４００の導出口４１２から導入口４１１に向けて送液される液体は、その途中で、貯留容器６１０の貯留空間６１５を経由する。また、貯留容器６１０の貯留空間６１５に供給された成分は、中空糸分離膜モジュール４００の導入口４１１に向けて循環流路６０１中を流れる。

　循環流路６０１のうち下流側の循環流路６０１Ｂには、循環流路６０１中の液体を中空糸分離膜モジュール４００の導出口４１２から導入口４１１へ送液するための第１ポンプ６０４が配置されている。循環流路６０１の、分岐部６２０と貯留容器６１０との間には第１バルブ６０７が配置されている。回収流路６０３は、細胞懸濁液を回収するための回収容器（図示せず）に接続されており、回収流路６０３の途中に第２バルブ６０８が配置されている。排出流路６０２は、濾液を貯留する廃液容器６３０に接続されており、排出流路６０２の途中には、第３バルブ６０６と、濾液を廃液容器６３０に送液する第２ポンプ６０５が配置されている。

　貯留容器６１０に細胞懸濁液を貯留した状態で、第１バルブ６０７を開き、第２バルブ６０８を閉じた状態で第１ポンプ６０４を駆動すると、細胞懸濁液は、循環入口部６１２から循環流路６０１を経由して中空糸分離膜モジュール４００の導入口４１１に送液され、中空糸分離膜４０１を通過して処理され、導出口４１２から導出され、循環出口部６１３から循環流路６０１を経由して貯留容器６１０に戻る。このように循環流路６０１内で細胞懸濁液を循環させて濃縮又は洗浄を繰り返すことにより、所望の細胞濃度にまで濃縮又は洗浄された細胞懸濁液が生成される。

　本実施形態では、細胞懸濁液を洗浄する場合には、貯留容器６１０の供給部６１１に、洗浄液を充填した洗浄液容器（図１に示す洗浄液容器５００）を接続し、洗浄液を貯留容器６１０に導入して第１ポンプ６０４を駆動する。こうして循環流路６０１内の細胞懸濁液の濃縮又は洗浄が所望の程度に達した後、第１バルブ６０７を閉じ、第２バルブを開き、第１ポンプ６０４を駆動して、細胞懸濁液を、回収流路６０３を経由して回収する。回収流路６０３の末端に、適当な回収容器（図示せず）を接続して細胞懸濁液を回収することができる。回収容器は濃縮洗浄装置３の一部として提供される必要はなく、ユーザーが別途用意した回収容器を用いてもよい。例えば、回収流路６０３の末端にニードルレスポートが接続されており、それと接続可能なオスコネクターを備える回収容器を接続することや、回収流路６０３の末端と、回収容器の側から延びる管の末端とを無菌接合機を用いて接続することにより、回収流路６０３の末端に回収容器を接続することができる。

　中空糸分離膜４０１の膜壁を通過した濾液は、第２ポンプ６０５により、濾液排出口４１３から排出流路６０２を通り廃液容器６３０まで圧送される。このとき、第３バルブ６０６を調節することにより濾液の流れを調節できる。

　第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合、図１に示すように、貯留容器６１０の供給部６１１は、細胞懸濁液調製用デバイス２の第３容器３００の第３排出部３３０のニードルレスポート３３３と、流路７０１を介して接続し通液できるように形成されていることが好ましい。図１に示す実施形態では、流路７０１には更に途中の分岐部７１０から分岐した分岐流路７０２が接続されており、分岐流路７０２の末端には洗浄液を収容した洗浄液容器５００が接続されている。そして、流路７０１の、分岐部７１０と、第３容器３００の第３排出部３３０との間の部分には第４バルブ７１１が設けられ、分岐流路７０２には第５バルブ７１２が設けられている。細胞懸濁液を収容する第３容器３００のニードルレスポート３３３と、貯留容器６１０の供給部６１１とを、流路７０１介して接続し、第４バルブ７１１を開放し第５バルブ７１２を閉じることで、細胞懸濁液を第３容器３００から貯留容器６１０に移して貯留することができる。また、第４バルブ７１１を閉じ第５バルブ７１２を開放することで、洗浄液を洗浄液容器５００から貯留容器６１０に移して貯留することができる。貯留容器６１０に細胞懸濁液又は洗浄液を貯留した状態で第１ポンプ６０４を駆動すると、細胞懸濁液又は洗浄液は、循環入口部６１２から、循環流路６０１に供給され、中空糸分離膜モジュール４００による細胞懸濁液の濃縮又は洗浄が行われる。図１では図示しないが、流路７０１及び／又は分岐流路７０２内の液体を送液する送液ポンプが更に設けられていてもよい。

＜第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス＞
　次に、図８を参照して、第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を説明する。なお、第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２の各部材と同じ機能を有する部材については同じ符号を付し、その説明を省略する。

　図８に示す第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２では、第１容器１００の第１排出部１３０の排出口１３１を形成する管部１３２と、第２容器２００の第２投入部２２０の投入口２２１を形成する管部２２２とが、一体となって管部８０１を形成している。管部８０１により、第１容器１００の第１排出部１３０と、第２容器２００の第２投入部２２０とが、液体を流通できるように予め接続されている。そして、管部８０１内の流路１３１、２２１を開閉するためのローラークランプ２２５が、管部８０１の外側に取り付けられている。一方で、第２容器２００の第２排出部２３０は、排出口２３１を形成する管部２３２と、管部２３２の出口を連通可能に封鎖するニードルレスポート２３３と、ニードルレスポート２３３を保護する蓋部２３４とを備える。一方、第３容器３００の第３投入部３２０は、投入口３２１を形成する管部３２２と、管部３２２の入口を連通可能に封鎖するオスコネクター３２３と、オスコネクター３２３を保護する蓋部３２４とを備える。本実施形態では第２容器２００の第２排出部２３０のニードルレスポート２３３と、第３容器３００の第３投入部３２０のオスコネクター３２３とが接続可能に構成されている。

　すなわち、図８に示す第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２では、第１容器１００の第１排出部１３０と第２容器２００の第２投入部２２０とが液体を流通可能に予め接続されており、且つ、第２容器２００の第２排出部２３０と第３容器の第３投入部３２０とは分離されているが、液体を流通可能に接続することができる。

　図８に示す第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２において、第３容器３００は、第３排出部３３０を有する。第３排出部３３０のニードルレスポート３３３と、図６に示す貯留容器６１０の供給部６１１とは、直接的に又は図１に示すような流路７０１を介して間接的に通液可能に接続できるように構成されており、第３容器３００の第３排出部３３０と、貯留容器６１０の供給部６１１とを直接的又は間接的に接続した状態で、細胞懸濁液を第３容器３００から貯留容器６１０に移して貯留することができる。貯留容器６１０に細胞懸濁液を貯留した状態で濃縮洗浄装置３の第１ポンプ６０４を駆動すると、細胞懸濁液は、循環入口部６１２から、循環流路６０１に供給され、中空糸分離膜モジュール４００により処理される。

＜第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス＞
　次に、図９を参照して、第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を説明する。なお、第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２の各部材と同じ機能を有する部材については同じ符号を付し、その説明を省略する。

　図９に示す第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２では、第１容器１００の第１排出部１３０の排出口１３１を形成する管部１３２と、第２容器２００の第２投入部２２０の投入口２２１を形成する管部２２２とが、一体となって管部８０１を形成している。管部８０１により、第１容器１００の第１排出部１３０と、第２容器２００の第２投入部２２０とが、液体を流通できるように予め接続されている。そして、管部８０１内の流路１３１、２２１を開閉するためのローラークランプ２２５が、管部８０１の外側に取り付けられている。

　図９に示す第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２では、第２容器２００の第２排出部２３０の排出口２３１を形成する管部２３２と、第３容器３００の第３投入部３２０の投入口３２１を形成する管部３２２とが、一体となって管部９０１を形成している。管部９０１により、第２容器２００の第２排出部２３０と、第３容器３００の第３投入部３２０とが、液体を流通できるように予め接続されている。

　すなわち、図９に示す第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２では、第１容器１００の第１排出部１３０と第２容器２００の第２投入部２２０とが液体を流通可能に予め接続されており、且つ、第２容器２００の第２排出部２３０と第３容器の第３投入部３２０とが液体を流通可能に予め接続されている。

＜第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス＞
　次に、図１０を参照して、第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２及びそれと組み合わせて用いる濃縮洗浄装置３の例を説明する。なお、第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２の各部材と同じ機能を有する部材については同じ符号を付し、その説明を省略する。

　図１０に示す第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２における相互に接続した第１容器１００及び第２容器２００は、図８に示す第２実施形態に細胞懸濁液調製用デバイス２での第１容器１００及び第２容器２００と同じである。
　一方、図１０に示す濃縮洗浄装置３は、図６に示す濃縮洗浄装置３と同じである。

　本実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２における第２容器２００の第２排出部２３０のニードルレスポート２３３は、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の供給部６１１と、直接的に又は図１０に示すように流路７０１を介して間接的に、接続可能である。本実施形態における貯留容器６１０は、循環流路６０１を流れる液体を貯留する機能を有するとともに、細胞懸濁液調製用デバイス２を用いて調製され、第２容器２００の第２空間２１４の第２区画２１４－２から第２排出部２３０の排出口２３１を通じて排出された細胞懸濁液を貯留する機能を有する。図１０に示す実施形態では、図１に示す実施形態と同様に、流路７０１には更に途中の分岐部７１０から分岐した分岐流路７０２が接続されており、分岐流路７０２の末端には洗浄液を収容した洗浄液容器５００が接続されている。そして、流路７０１の、分岐部７１０と、第２容器２００の第２排出部２３０との間の部分には第４バルブ７１１が設けられ、分岐流路７０２には第５バルブ７１２が設けられている。第２容器２００のニードルレスポート２３３と、貯留容器６１０の供給部６１１とを、流路７０１介して接続し、第４バルブ７１１を開放し第５バルブ７１２を閉じることで、第２容器２００で生成した細胞懸濁液を第２容器２００から貯留容器６１０に移して貯留することができる。また、第４バルブ７１１を閉じ第５バルブ７１２を開放することで、洗浄液を洗浄液容器５００から貯留容器６１０に移して貯留することができる。貯留容器６１０に細胞懸濁液又は洗浄液を貯留した状態で第１ポンプ６０４を駆動すると、細胞懸濁液又は洗浄液を含む細胞懸濁液は、循環入口部６１２から、循環流路６０１に供給され、中空糸分離膜モジュール４００による細胞懸濁液の濃縮又は洗浄が行われる。図１０では図示しないが、流路７０１及び／又は分岐流路７０２内の液体を送液する送液ポンプが更に設けられていてもよい。

＜細胞懸濁液の調製方法＞
　細胞懸濁液調製システム１を用いて、細胞含有試料から細胞懸濁液を調製する方法の一実施形態について説明する。

　本実施形態に係る方法は、第１容器１００の第１空間１１４内に、細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液を収容し、第１投入部１２０及び第１排出部１３０を閉鎖した状態で、第１容器１００を振盪させながら細胞含有試料の酵素処理を行う工程１と、工程１後に、工程１で生成した第１容器１００の第１空間１１４内の酵素処理液の少なくとも一部を、第２容器２００の第１区画２１４－１に移動させ、メッシュシート２１５を通過させて第２容器２００の第２区画２１４－２の側に細胞懸濁液を生成する工程２と、工程２で生成した細胞懸濁液を、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の貯留空間６１５に供給する工程３と、貯留空間６１５に供給された細胞懸濁液を、送液部である第１ポンプ６０４により循環流路６０１を経由して送液して、中空糸分離膜モジュール４００の導入口４１１に導入し、濾液を濾液排出口４１３から排出しながら、中空糸分離膜４０１により処理し、処理された細胞懸濁液を、導出口４１２から循環流路６０１に導出し、導入口４１１まで循環流路６０１中を循環させる工程４とを少なくとも含む。

　以下、各工程をより具体的に説明する。
　工程１では、第１容器１００の第１空間１１４に、第１投入部１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃのいずれかを通じて、細胞含有試料、酵素液等の材料を供給し、反応混合液を形成する。

　ここで図１～３に示す第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合、第１容器１００は、第２容器２００とは切り離し可能であるため、第１空間１１４に反応混合液を収容した第１容器１００は、それ単独で、振盪させ酵素処理を行うことができる。当然ながら、工程１は、第１投入部１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ及び第１排出部１３０Ａ、１３０Ｂを閉鎖した状態で行う。

　また、図８に示す第２実施形態又は図１０に示す第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合、工程１では、反応混合液を収容した第１容器１００を、第２容器２００と接続した形態で振盪させる。この場合もまた、第１投入部１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃを閉鎖し、第１排出部１３０をローラークランプ２２５により閉鎖した状態で振盪を行う。

　また、図９に示す第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合、工程１では、反応混合液を収容した第１容器１００を、第２容器２００及び第３容器３００と接続した形態で振盪させる。この場合もまた、第１投入部１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃを閉鎖し、第１排出部１３０をローラークランプ２２５により閉鎖した状態で振盪を行う。

　第１～第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２において、酵素処理が行われる第１容器１００と、メッシュシート２１５を用いた濾過を行う第２容器２００とが別の容器であることにより次の利点がある。細胞含有試料が脂肪組織等の生体組織である場合、酵素による分解反応後の酵素処理液は、第１容器１００内で静置すると、有用細胞が懸濁した水層と、脂肪細胞などの不要な油溶成分を含む油層とに層分離する。油溶成分はメッシュシート２１５の目詰まりの原因となる。第１容器１００と第２容器２００とが別の容器であることにより、工程１での振盪後、第１容器１００内で二層に層分離させたのちに、工程２において、有用細胞が懸濁した水層のみを第２容器２００に供給しメッシュシート２１５を通過させることができ、目詰まりを抑制することができる。

　第１～第３実施形態のように、第１容器１００、第２容器２００及び第３容器３００を備える細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合、工程２に先立って、第１容器１００、第２容器２００、第３容器３００がこの順で接続した細胞懸濁液調製用デバイス２を形成する。図１～３に示す第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合は、第１容器１００のニードレスポート１３３Ａ、１３３Ｂのいずれかに、第２容器２００のオスコネクター２２３を接続することで、第１容器１００、第２容器２００、第３容器３００をこの順で接続する。図８に示す第２実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合は、第２容器２００のニードレスポート２３３に、第３容器３００のオスコネクター３２３を接続することで、第１容器１００、第２容器２００、第３容器３００をこの順で接続する。図９に示す第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合は、工程１と工程２との間に接続操作は不要である。

　一方、第４実施形態のように、第１容器１００及び第２容器２００を備えるが第３容器３００を備えない細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合には、工程２に先立って、図１０に示すように、第２容器２００の第２排出部２３０のニードレスポート２３３と、貯留容器６１０の供給部６１１とを、直接的に又は流路７０１を介して間接的に接続することで、第１容器１００、第２容器２００、貯留容器６１０をこの順で接続する。

　第１容器１００及び第２容器２００を接続した細胞懸濁液調製用デバイス２を、鉛直方向上方から第１容器１００、第２容器２００の順となるように配置し、第１排出部１３０と第２投入部２２０とが接続して形成される流路を、ローラークランプ２２５を操作して開放すると、酵素処理液は、第１容器１００の第１空間１１４から、第２容器２００の第１区画２１４－１に流入し、メッシュシート２１５を通過できる液体成分、細胞等が第２区画２１４－２に至り細胞懸濁液が生成する。

　第１～第３実施形態のように、第１容器１００、第２容器２００及び第３容器３００を備える細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合には、工程２で生成した細胞懸濁液は、第２排出部２３０と第３投入部３２０とが接続して形成される流路を経由して、第２容器２００の第２空間２１４の第２区画２１４－２から第３容器３００の第３空間３１４に移動し貯留される。

　第４実施形態のように、第１容器１００及び第２容器２００を備え第３容器３００を備えない細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合には、工程２で生成した細胞懸濁液は、続いて、第２容器の第２排出部２３０と貯留容器６１０の供給部６１１とを接続した流路を経由して、第２容器２００の第２空間２１４の第２区画２１４－２から貯留容器６１０の貯留空間６１５に移動し貯留される。すなわち工程２と工程３を一連の工程として行うことができる。

　細胞懸濁液調製用デバイス２を用いて工程１及び工程２を含む方法により細胞懸濁液を調製する方法は、遠心分離等の操作を伴わないため、細胞への負荷が小さく好ましい。

　細胞懸濁液調製用デバイス２として、第１～第３実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合は、工程３において、工程２で生成した細胞懸濁液を濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の貯留空間６１５に供給するためには、図１に示すように、貯留容器６１０の供給部６１１に、細胞懸濁液調製用デバイス２の第３容器３００の第３排出部３３０のニードルレスポート３３３を接続し、細胞懸濁液を第３容器３００から貯留容器６１０の貯留空間６１５に移して貯留すればよい。細胞懸濁液調製用デバイス２として、第４実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合は、上記の通り、工程２で生成した細胞懸濁液が、第２容器２００の第２空間２１４の第２区画２１４－２から貯留容器６１０の貯留空間６１５に移動し貯留されることが工程３に該当する。

　工程４では、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の貯留空間６１５に細胞懸濁液を供給した状態で、第１ポンプ６０４を駆動することで、細胞懸濁液を、循環流路６０１を経由して送液し、中空糸分離膜モジュール４００の導入口４１１に導入し、濾液を濾液排出口４１３から排出しながら、中空糸分離膜４０１により処理し、処理された細胞懸濁液を、導出口４１２から循環流路６０１に導出し、再び導入口４１１まで循環させる。工程４を一定時間続けると、循環流路６０１と中空糸分離膜モジュール４００との間を細胞懸濁液が繰り返し循環することになる。この工程４により、細胞懸濁液に含まれる液体成分や夾雑物等が中空糸分離膜４０１の膜壁を通過する濾液として排出され、細胞懸濁液が濃縮又は洗浄される。更に、貯留容器６１０の貯留空間６１５に洗浄液を供給した状態で第１ポンプ６０４を駆動することで、細胞懸濁液を洗浄することができる。

　本実施形態の方法において、工程１及び工程２を経て調製された細胞懸濁液は、メッシュシート２１５での濾過を経ているのみであるため夾雑物が多い傾向があるが、工程３及び工程４により夾雑物を除去することができるため、最終的には夾雑物が少なく十分に洗浄された細胞懸濁液を得ることができ、再生医療等の目的に利用することができる。また、工程１、２と同様に工程３及び工程４も細胞に対する負荷が小さいため、本実施形態の方法は、細胞懸濁液を効率的に調製することができる。

　なお、濃縮洗浄装置は、工程４での細胞懸濁液の処理を行う前に、貯留容器に生理食塩水を供給し、送液部を駆動させて、中空糸分離膜モジュールを生理食塩水で満たすプライミングが必要であることが一般的である。

　第４実施形態のように、第１容器１００及び第２容器２００を備えるが第３容器３００を備えない細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合には、第２容器２００の第２区画２１４－２の側に細胞懸濁液を生成する工程２と、工程２に引き続き細胞懸濁液を第２容器２００の第２区画２１４－２から貯留容器６１０の貯留空間６１５に供給する工程３とを行う前に、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の貯留空間６１５に生理食塩水を収容し第１ポンプ６０４を駆動させてプライミングを行い、その後に、細胞懸濁液調製用デバイス２を用いて工程２及び工程３を手動で行って濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の貯留空間６１５に細胞懸濁液を供給し、その後に再び第１ポンプ６０４を駆動させて中空糸分離膜モジュール４００による処理（工程４）を行うことができる。

　一方、第１～第３実施形態のように第３容器３００を備える細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合には、濃縮洗浄装置３のプライミングは、工程３を行う前の適当な時点で行うことができる。特に好ましくは、工程１、工程２、工程２で生成した細胞懸濁液を第３容器３００に貯留する工程、並びに、図１に示す流路７０１を介して第３容器３００の第３排出部３３０を濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の供給部６１１に接続する工程（接続の時点では第４バルブ７１１を閉じる）までの一連の手動の工程を先に行う。その後に、濃縮洗浄装置３の送液部である第１ポンプ６０４を駆動させて、貯留容器６１０に予め貯留しておいた生理食塩水を中空糸分離膜モジュール４００に送るプライミング工程を行い、続いて、第４バルブ７１１を開放して細胞懸濁液を第３容器３００の第３空間３１４から濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の貯留空間６１５に供給し（工程３）、第１ポンプ６０４を駆動させて中空糸分離膜モジュール４００による処理（工程４）を行う。すなわち、濃縮洗浄装置３の第１ポンプ６０４を用い自動的に送液する工程であるプライミング工程及び工程４を一連の工程として行うことができる。このように、第１～第３実施形態のように第３容器３００を備える細胞懸濁液調製用デバイス２を用いる場合には、細胞懸濁液調製用デバイス２を用いた手動の操作と、濃縮洗浄装置３を用いた自動化された操作をそれぞれ一連の操作として行うことができるため、操作が簡便である。

＜工程１と工程２との間に行う洗浄＞
　上記実施形態に係る方法において、細胞含有試料が、生体試料、特に脂肪組織である場合の更に好ましい実施形態を、図７を参照して説明する。図７では、説明のため、第１容器１００の部分のみを示す。工程２において第１容器１００に接続される第２容器２００は図７中では省略する。

　上記実施形態に係る方法は更に、工程１で生成した第１容器１００の第１空間１１４内の酵素処理液Ａ（図７（Ａ）参照）が、油層Ｂと水層Ｃとの二層に分離するまで第１容器１００を静置する層分離工程（図７（Ｂ）参照）を、工程１と工程２との間に含み、層分離工程の後に行う工程２では、その途中で、第１容器１００の第１空間１１４内の水層Ｃが第２容器２００の第１区画２１４－１に移動した時点で、第１容器１００と第２容器２００の間の酵素処理液の移動を停止し（図７（Ｃ）参照）、次いで、第１容器１００の第１空間１１４内に洗浄液を加えて、第１空間１１４内に残留した油層Ｂと洗浄液とを混合して混合液Ｄを形成し（図７（Ｄ）参照）、混合液Ｄが油層Ｅと水層Ｆとの二層に分離するまで第１容器を静置し（図７（Ｅ）参照）、静置後に水層Ｆを第２容器２００の第１区画２１４－１に移動させる（図７（Ｆ）参照）ことを含む洗浄工程を１回以上行うことがより好ましい。ここで、水層Ｆを第２容器２００の第１区画２１４－１に移動させた時点で、第１容器１００と第２容器２００の間の酵素処理液の移動を停止し、油層Ｅが第２容器２００に流入しないようにすることがより好ましい。

　なお、第１容器１００と第２容器２００の間の酵素処理液の移動は、図３に示す、第２容器２００の第２投入部２２０に設けられたローラークランプ２２５を操作して投入口２２１を閉じることにより停止させることができ、ローラークランプ２２５を操作して投入口２２１を開放することにより開始させることができる。

　本実施形態の洗浄方法は、細胞含有試料が生体試料（特に脂肪組織）である場合において、工程１での酵素処理液が、目的とする細胞を含む水層と、脂質を含む成分（特に脂肪細胞）を含む油層とに分離することを利用したものである。従来、このような酵素処理液から水層中の細胞を回収するためには、遠心分離により水層と油層を分画し、水層を回収し、更に油層を洗浄し遠心分離して水層を回収することが一般的であったが、遠心分離は細胞に負荷がかかる問題があった。本実施形態の洗浄方法によれば、細胞に高負荷をかけることなく、目的とする細胞を含む水層を洗浄し回収することができる。また、本実施形態の洗浄方法を経て第１容器１００から排出された細胞含有水層は油溶成分が少ないため、工程２及び工程４での第２容器２００のメッシュシート２１５及び濃縮洗浄装置３の中空糸分離膜４０１の目詰まりが抑制され、細胞懸濁液を効率的に調製するのに役立つ。

（実施例１～３）
　細胞懸濁液調製用デバイスとして第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２を使用した。用いた第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２が備える第２容器２００において、上記で定義したＷは４．３ｍｍ、Ｄは６０ｍｍであり、Ｄ／Ｗは１３．９であり、メッシュシートの細孔径は７０μｍであった。

　３名の人（ドナー１、ドナー２、ドナー３）の脂肪組織１０ｍＬから、本明細書に記載の細胞懸濁液調製システム１を使用することで、細胞懸濁液を調製した。

　１０ｍＬの脂肪組織と１０ｍＬのコラゲナーゼ液（コラゲナーゼ濃度０．１ｗ／ｖ％となるようにコラゲナーゼを生理食塩液で溶解して調製）とを、細胞懸濁液調製用デバイス２の第１容器１００に収容し、第１容器１００を３７℃で３０分間振盪して酵素処理を行った。

　酵素処理後の細胞懸濁液を第２容器２００に通液後、第３容器３００に貯留し、図６に示す濃縮洗浄装置３にて、濃縮洗浄した。第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２の第３容器３００の第３排出部３３０と、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の供給部６１１との間は、図１に示すように、流路７０１及び、分岐部７１０から分岐し、末端に洗浄液容器５００が接続された分岐流路７０２を含む流路系により接続した。

　濃縮洗浄装置３による処理後の細胞懸濁液中に含まれる有核細胞数及び脂肪由来幹細胞数をフローサイトメーターおよびＢＤ　ＴｒｕｃｏｕｎｔＴｕｂｅｓを用いて測定した。有核細胞数は、ＣＤ３４陽性細胞数とＣＤ４５陽性細胞数の和から算出した。同様に、脂肪由来幹細胞数は、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４５陰性／ＣＤ３１陰性の細胞数から算出した。

（実施例４～６）
　実施例１～３と同じ３名の人（ドナー１、ドナー２、ドナー３）の脂肪組織５０ｍLから、本明細書に記載の細胞懸濁液調製システム１を使用することで、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液調製用デバイス２及び濃縮洗浄装置３は実施例１～３と同じものを用いた。第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２の第３容器３００の第３排出部３３０と、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の供給部６１１との間は、実施例１～３と同様に、図１に示すように、流路７０１及び、分岐部７１０から分岐し、末端に洗浄液容器５００が接続された分岐流路７０２を含む流路系により接続した。

　５０ｍＬの脂肪組織と５０ｍＬのコラゲナーゼ液（コラゲナーゼ濃度０．１ｗ／ｖ％となるようにコラゲナーゼを生理食塩液で溶解して調製）とを、細胞懸濁液調製用デバイス２の第１容器１００に収容し、第１容器１００を３７℃で３０分間振盪して酵素処理を行った。

　酵素処理後の細胞懸濁液を第２容器２００に通液後、第３容器３００に貯留し、図６に示す濃縮洗浄装置３にて、濃縮洗浄した。

（実施例７）
　１名の人（ドナー４）の脂肪組織１０ｍＬから、本明細書に記載の細胞懸濁液調製システム１を使用することで、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液調製用デバイス２及び濃縮洗浄装置３は実施例１～３と同じものを用いた。第１実施形態の細胞懸濁液調製用デバイス２の第３容器３００の第３排出部３３０と、濃縮洗浄装置３の貯留容器６１０の供給部６１１との間は、実施例１～３と同様に、図１に示すように、流路７０１及び、分岐部７１０から分岐し、末端に洗浄液容器５００が接続された分岐流路７０２を含む流路系により接続した。

　濃縮洗浄装置処理後の細胞懸濁液中に含まれる有核細胞数及び脂肪由来幹細胞数をフローサイトメーターおよびＢＤ　ＴｒｕｃｏｕｎｔＴｕｂｅｓを用いて測定した。有核細胞数は、ＣＤ３４陽性細胞数とＣＤ４５陽性細胞数の和から算出した。同様に、脂肪由来幹細胞数は、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４５陰性／ＣＤ３１陰性の細胞数から算出した。

（比較例１～３）
　実施例１～３と同じ３名の人（ドナー１、ドナー２、ドナー３）の脂肪組織２０ｍLから、遠心分離を使用することで、細胞懸濁液を調製した。

　遠沈管として、ポリプロピレン製の内容量が５０ｍＬの遠沈管を用いた。２０ｍLの脂肪組織と２０ｍＬのコラゲナーゼ液（コラゲナーゼ濃度０．１ｗ／ｖ％となるようにコラゲナーゼを生理食塩液で溶解して調製）とを遠沈管に収容した。３７℃、３０分間、酵素処理を実施し、遠心分離処理により８００Ｇにて複数回遠心することにより洗浄操作を行った。

　洗浄後の細胞懸濁液中に含まれる有核細胞数及び脂肪由来幹細胞数をフローサイトメーターおよびＢＤ　ＴｒｕｃｏｕｎｔＴｕｂｅｓを用いて測定した。有核細胞数は、ＣＤ３４陽性細胞数とＣＤ４５陽性細胞数の和から算出した。同様に、脂肪由来幹細胞数は、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４５陰性／ＣＤ３１陰性の細胞数から算出した。

（比較例４）
　実施例７と同じ人（ドナー４）の脂肪組織１０ｍLから、遠心分離を使用することで、細胞懸濁液を調製した。

　遠沈管として、ポリプロピレン製の内容量が５０ｍＬの遠沈管を用い、１０ｍLの脂肪組織と１０ｍＬのコラゲナーゼ液（コラゲナーゼ濃度０．１ｗ／ｖ％となるようにコラゲナーゼを生理食塩液で溶解して調製）とを遠沈管に収容した。３７℃、３０分間、酵素処理を実施し、遠心分離処理により８００Ｇにて複数回遠心することにより洗浄操作を行った。

　実施例１～７、比較例１～４の結果を表１に示す。

　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

１：細胞懸濁液調製システム
２：細胞懸濁液調製用デバイス
３：濃縮洗浄装置
１００：第１容器
１１４：第１空間
１１０：第１容器本体
１３０：第１排出部
２００：第２容器
２１４：第２空間
２１４－１：第１区画
２１４－２：第２区画
２１５：メッシュシート
２１０：第２容器本体
２２０：第２投入部
２３０：第２排出部
３００：第３容器
３１０：第３容器本体
３２０：第３投入部
４００：中空糸分離膜モジュール
４０１：中空糸分離膜
４１０：収容容器
４１１：導入口
４１２：導出口
４１３：濾液排出口
６０１：循環流路
６０４：送液部（第１ポンプ）
６１０：貯留容器
６１１：供給部
６１６：貯留容器本体

Claims

　細胞懸濁液調製システムであって、
　細胞懸濁液を調製するための細胞懸濁液調製用デバイスと、細胞懸濁液調製用デバイスにより調製された細胞懸濁液を濃縮又は洗浄するための濃縮洗浄装置とを備え、
　細胞懸濁液調製用デバイスが、第１容器及び第２容器を備え、
　第１容器が、
　第１空間を内包する第１容器本体と、
　第１空間からの液体の排出口が形成された第１排出部と
を備え、
　第２容器が、
　第２空間を内包する第２容器本体と、
　第２空間を第１区画と第２区画とに区切るように配置されたメッシュシートと、
　第１容器の第１空間から第１排出部の排出口を通じて排出される液体を、第１区画へ投入するための投入口が形成された第２投入部と、
　第２区画からの液体の排出口が形成された第２排出部と
を備え、
　濃縮洗浄装置は
　中空糸分離膜と、中空糸分離膜を収容する収容容器とを備え、収容容器には、中空糸分離膜へ供給される液体の導入口と、中空糸分離膜で処理された液体の導出口と、中空糸分離膜での濾液を排出する濾液排出口とが形成されている、中空糸分離膜モジュールと、
　中空糸分離膜モジュールの導出口から導入口まで液体を循環させる循環流路と、
　循環流路の途中に配置される貯留容器と、
　循環流路中の液体を中空糸分離膜モジュールの導出口から導入口に送液する送液部と
を備え、
　貯留容器が、
　循環流路を流れる液体を貯留する貯留空間を内包する貯留容器本体と、
　細胞懸濁液調製用デバイスで処理した液体を貯留空間に供給するための供給口が形成された供給部と
を備えることを特徴とする、細胞懸濁液調製システム。
　細胞懸濁液調製用デバイスが、第３容器を更に備え、
　第３容器が、
　第３空間を内包する第３容器本体と、
　第２容器の第２区画から排出される液体を、第３空間へ投入するための投入口が形成された第３投入部と
を備える、請求項１に記載の細胞懸濁液調製システム。
　細胞懸濁液調製用デバイスにおいて、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間、及び、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間の少なくとも一方が、予め接続されている、請求項２に記載の細胞懸濁液調製システム。
　細胞懸濁液調製用デバイスにおいて、第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間、及び、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間の一方のみが予め接続されており、他方が接続可能である、請求項３に記載の細胞懸濁液調製システム。
　第１容器の第１排出部と第２容器の第２投入部との間が接続可能であり、第２容器の第２排出部と第３容器の第３投入部との間が予め接続されている、請求項４に記載の細胞懸濁液調製システム。
　細胞懸濁液調製用デバイスにおいて、第１容器の第１排出部と、第２容器の第２投入部とが予め接続されている、請求項１に記載の細胞懸濁液調製システム。
　メッシュシートの細孔径が５０～３００μｍである、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞懸濁液調製システム。
　第２容器本体が、メッシュシートを間に介して対向する第１側壁と第２側壁とを含み、
　第１側壁とメッシュシートとが第１区画を囲い、
　第２側壁とメッシュシートとが第２区画を囲い、
　第２投入部が、第１側壁の周縁部とメッシュシートの周縁部との間に、第２投入口を介して第１区画と外部とを連通するように配置されており、
　第２排出部が、第２側壁の周縁部とメッシュシートの周縁部との間に、第２排出口を介して第２区画と外部とを連通するように配置されており、
　第１側壁、第２側壁及びメッシュシートが周縁部において一体化されて第２容器を形成している、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞懸濁液調製システム。
　第２投入部と、第２排出部とが、第２容器本体の対向する位置に配置されており、
　第２投入部の第１区画の側の端の、第１側壁と第２側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ１、
　第２排出部の第２区画の側の端の、第１側壁と第２側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ２、
　Ｗ１とＷ２との平均値をＷ、
　第２投入部の第１区画の側の端と、第２排出部の第２区画の側の端との間の距離をＤ
としたとき、
　Ｄ／Ｗが１３以上である、請求項８に記載の細胞懸濁液調製システム。
　第１容器が、洗浄液を第１空間に投入するための洗浄液投入部を備える、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞懸濁液調製システム。
　請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞懸濁液調製システムを用いて、細胞含有試料から細胞懸濁液を調製する方法であって、
　第１容器の第１空間内に、細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液を収容し、第１容器を振盪させながら細胞含有試料の酵素処理を行う工程１と、
　工程１後に、工程１で生成した第１容器の第１空間内の酵素処理液の少なくとも一部を、第２容器の第１区画に移動させ、第２容器のメッシュシートを通過させて第２容器の第２区画の側に細胞懸濁液を生成する工程２と、
　工程２で生成した細胞懸濁液を濃縮洗浄装置の貯留容器の貯留空間に供給する工程３と、
　貯留空間に供給された細胞懸濁液を、送液部により、循環流路を経由して送液して、中空糸分離膜モジュールの導入口に導入し、濾液を濾液排出口から排出しながら、中空糸分離膜により処理し、処理された細胞懸濁液を、導出部から循環流路に導出し、導入口まで循環させる工程４と
を含む方法。
　細胞含有試料が生体試料であり、
　工程１で生成した第１容器の第１空間内の酵素処理液が油層と水層との二層に分離するまで第１容器を静置する層分離工程を、工程１と工程２との間に含み、
　層分離工程の後に行う工程２では、その途中で、第１容器の第１空間内の水層が第２容器の第１区画に移動した時点で、第１容器と第２容器の間の酵素処理液の移動を停止し、第１容器の第１空間内に洗浄液を加えて、第１空間内に残留した油層と洗浄液とを混合し、混合液が油層と水層との二層に分離するまで第１容器を静置し、静置後に水層を第２容器の第１区画に移動させる洗浄工程を１回以上行う、
請求項１１に記載の方法。
　細胞懸濁液調製用デバイスであって、
　第１容器及び第２容器を備え、
　第１容器が、
　第１空間を内包する第１容器本体と、
　第１空間からの液体の排出口が形成された第１排出部と
を備え、
　第２容器が、
　第２空間を内包する第２容器本体と、
　第２空間を第１区画と第２区画とに区切るように配置されたメッシュシートと、
　第１容器の第１空間から第１排出部の排出口を通じて排出される液体を、第１区画へ投入するための投入口が形成された第２投入部と、
　第２区画からの液体の排出口が形成された第２排出部と
を備えることを特徴とする、細胞懸濁液調製用デバイス。
　第３容器を更に備え、
　第３容器が、
　第３空間を内包する第３容器本体と、
　第２容器の第２区画から排出される液体を、第３空間へ投入するための投入口が形成された第３投入部と
を備える、請求項１３に記載の細胞懸濁液調製用デバイス。