WO2018062075A1 - 懸濁液を無菌的に処理するための器具 - Google Patents

懸濁液を無菌的に処理するための器具 Download PDF

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米満 吉和
結 原田
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米満 吉和
株式会社ガイアバイオメディシン
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Definitions

  • the present invention relates to aseptic processing of a suspension in which particles are dispersed in a liquid, for example, aseptically replacing a culture solution of a cell suspension with another solution.
  • the present invention is useful in fields such as life science, medicine, and production of therapeutic cells.
  • Patent Document 1 is intended to provide an apparatus for easily concentrating leukocyte components including stem cells in a short time by using a suction operation without using specific gravity difference sorting from blood.
  • an apparatus for concentrating white blood cell components including stem cells using means for allowing red blood cells and plasma to pass through a membrane filter having micropores and collecting components including white blood cells as non-filtered components is proposed.
  • This device can constitute a leukocyte fraction collection system circuit that collects leukocytes by backwashing using plasma by means of the path of plasma bag-leukocyte trap-collection bag, and means for transferring blood It is stated that the syringe can be used in a stationary state by providing a syringe in the circuit and using the syringe as a drive source, and there is no need to change the posture such as upside down.
  • Patent Document 2 discloses a cell suspension inlet, a filtrate outlet, and a method for producing a cell concentrate in a simple method without losing cells or damaging the cells in a short time.
  • Cell concentration using a cell suspension treatment device having a cell suspension outlet and a hollow fiber type separation membrane disposed between the cell suspension inlet and the cell suspension outlet A method for producing a liquid, wherein the average pore diameter of the inner pores of the hollow fiber separation membrane is 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, and the initial filtration rate of the filtrate is a line of cell suspension that flows in the hollow fiber
  • a method for producing a cell concentrate is proposed in which the value divided by the rate is 2.5 or less.
  • cells can be recovered with high efficiency while removing impurities such as proteins other than cells in the suspension, and a cell concentrate can be produced while reducing clogging of cells in the hollow fiber. States. And because it does not use clogging suppression methods such as backwashing of membranes that would cause cell loading, damage to cells is reduced, cell viability is increased, and treatment is performed in a sterile closed system. It is stated that concentrated cells can be provided for cell therapy.
  • JP 2012-139112 A Patent No. 5857713
  • NK cells transported in a frozen state first require a culture step for reactivation prior to administration to the patient. .
  • This culture process must be performed aseptically.
  • the culture fluid component must be removed from the cultured cells, and the obtained cells must be resuspended at a suitable cell concentration in a lactolin gel solution or the like suitable for infusion administration.
  • the culture medium can be removed by centrifuging the cells in a centrifuge tube and removing the supernatant culture medium.
  • the work must be performed aseptically and therefore must be performed in a clean room.
  • the present inventors diligently studied a method for performing a treatment for aseptically removing the suspension medium from a suspension containing particles such as cells.
  • a hollow fiber type filter By using a hollow fiber type filter, the liquid portion as the suspension medium can be efficiently removed from the particles as the suspension by passing the suspension through the hollow fiber. It has been found that a system using a hollow fiber is a completely closed system and can be configured as a circuit suitable for practical use that does not require an electric pump for liquid feeding, and has completed the present invention.
  • An instrument comprising at least the following for aseptically separating the liquid A from the suspension containing the suspension A and the suspension A: A hollow fiber separator for separating liquid A from the suspension, A hollow fiber separator comprising an inlet and an outlet for passing the suspension through to the inside of the hollow fiber, and at least one outlet for discharging the separated liquid A, which leads to the outside of the hollow fiber; A sterile connection connector for aseptically connecting the bag containing the suspension connected to the inlet of the hollow fiber separator in a non-sterile environment; A drainage bag connected to the outlet of the hollow fiber separator for storing the separated liquid A; and a liquid A separated from the inlet or outlet of the hollow fiber separator. Collection bag for storing suspended solids.
  • the instrument according to 1 further comprising: A bag containing at least one liquid B, which is connected to the inlet or the outlet of the hollow fiber separator and contains the liquid B for washing or collecting the suspended solid from which the suspension medium has been separated.
  • the instrument according to 2 comprising two bags containing liquid B.
  • the second liquid B bag is connected to the inlet of the hollow fiber separator, and the second liquid B bag is connected to the outlet of the hollow fiber separator. Appliances.
  • the device according to any one of 1 to 4 further comprising: A first clamp for closing the outlet of the hollow fiber separator, and a second clamp for closing the outlet of the hollow fiber separator.
  • kits according to 8 or 9, wherein the useful cells are any one selected from the group consisting of dendritic cells, NK cells, NKT cells, activated T cells, and CAR-T cells.
  • a method for preparing useful cells in which liquid A is aseptically separated from a suspension containing liquid A as a suspension medium and useful cells comprising the following steps: (1) Aseptically connect the suspension-containing bag holding the suspension to the sterile connection connector of the instrument described in any one of 1 to 7; (2) The suspension is supplied from the inlet of the hollow fiber type separator to the hollow fiber type separator whose outlet is blocked to separate the liquid A, and the liquid A thus separated is put into a drainage bag.
  • a method for preparing therapeutic cells from a cell suspension comprising the following steps: (1) Aseptically connect the cell suspension-containing bag holding the cell suspension to the sterile connection connector of the instrument described in 7; (2) The cell suspension is supplied from the inlet of the hollow fiber type separator to the hollow fiber type separator whose outlet is blocked to separate the culture solution, and the separated culture solution is stored in the drainage bag.
  • the cells from which the culture medium has been separated remain in the hollow fiber; (3) Supply a solution suitable for intravenous administration from the bag containing the first solution B to the hollow fiber separator with the outlet closed, and wash the cells from which the culture solution remaining inside the hollow fiber has been separated. ; (4) Supply a liquid suitable for intravenous administration from the second liquid B-containing bag to the hollow fiber separator with the outlet closed, push out the washed cells inside the hollow fiber, and store in the collection bag Get therapeutic cells.
  • the preparation method according to 13, wherein the cell is any one selected from the group consisting of dendritic cells, NK cells, NKT cells, activated T cells, and CAR-T cells.
  • processing such as removal of the suspension medium from the suspension, washing of the suspension, resuspension of the suspension in another suspension medium, etc., aseptically even in a non-sterile environment It can be performed. Further, according to the present invention, the processing can be performed without using an electric machine.
  • the numerical range “X to Y” includes the numerical values X and Y at both ends unless otherwise specified. “A and / or B” means at least one of A and B, unless otherwise specified.
  • the preparation method can be restated as a manufacturing method.
  • the suspension refers to a state in which a solid is dispersed in a liquid, and includes a suspended solid (a solid dispersoid) and a suspension medium (a dispersion medium that is a liquid).
  • the dispersion may not be uniform.
  • the instrument of the present invention is used for aseptically separating the liquid A from the suspension containing the suspension A and the suspension A.
  • Suspensions can be particles of various types, shapes and sizes, and are not particularly limited, but the present invention relates to nano particles made of polymeric micelles used as pharmaceutical, cosmetic or food acceptable particles, for example, DDS. It can be preferably applied to particles, powders used in cosmetics, cultured cells, therapeutic cells, and the like.
  • a particularly preferred example is a floating animal cell (hereinafter, the animal cell may be simply referred to as “cell”), and a more preferred example is the treatment (prevention, therapy) of a disease or condition in a human or non-human animal. Etc.) (cells for treatment).
  • the present invention and its embodiments may be described by taking the case where the device of the present invention is for treating therapeutic cells as an example. However, those skilled in the art will appropriately explain the description. In other cases, the present invention can be understood.
  • the liquid A which is a suspension medium can be various types of liquids depending on the suspended matter.
  • the liquid A is, for example, a liquid for storing cells or a culture liquid.
  • An example of a solution for storing cells is a culture solution containing components for protecting the cells from freezing damage, such as DMSO, glycerol, serum, and the like, if necessary.
  • the culture medium may be, for example, a DMEM, EMEM, RPMI-1640, ⁇ -MEM, F-12, F-10, M-199 or the like known as a basal medium for animal cell culture. Therefore, it can be appropriately selected and used.
  • the culture solution may contain components for cell proliferation, differentiation / induction, and activation. Such components include serum, cytokines, growth factors, hormones, and specifically include insulin, transferrin, serum albumin, IL-2, and the like.
  • the amount of the suspension and the liquid A can be appropriately determined according to the purpose.
  • the suspension may contain a number of cells on the order of 10 7 to 10 9 and the volume is 10 mL to 1 L. obtain.
  • the present invention provides an instrument comprising at least the following for aseptically separating liquid A from a suspension containing liquid A as a suspension medium and suspended solids: A hollow fiber separator for separating liquid A from the suspension, A hollow fiber type separator comprising at least one outlet for discharging the separated liquid A leading to the outside of the hollow fiber, and an inlet and an outlet for passing the suspension leading to the inside of the hollow fiber; A sterile connection connector for aseptically connecting the bag containing the suspension connected to the inlet of the hollow fiber separator in a non-sterile environment; A drainage bag for storing the separated liquid A connected to the outlet of the hollow fiber separator; A collection bag connected to the inlet or outlet of the hollow fiber separator for storing the suspended solid from which the liquid A has been separated.
  • the present invention also provides a kit for preparing therapeutic cells, comprising the following parts A and B: Part A: Part comprising the instrument of the present invention Part B: Part comprising a cell suspension-containing bag (7) comprising at least one sterile connector (4a, 9a) and containing useful cells together with a preservation solution and a culture solution
  • the kit can further include the following C part.
  • Part C A part comprising a culture solution-containing bag (8) containing a cell culture solution.
  • the device (part A) of the present invention includes at least a hollow fiber separator (1), a drainage bag (2) connected to a discharge port of the hollow fiber separator, an inlet or an outlet of the hollow fiber separator.
  • 1 includes a recovery bag (3) and a sterile connection connector (4b) connected to the inlet of the hollow fiber type separator.
  • the hollow fiber type separator (1) is further included.
  • the liquid B bag (5) connected to the outlet (12) and the liquid B bag (6) connected to the inlet (11) of the hollow fiber separator (1).
  • FIG. 1 also includes a suspension-containing bag (7) having a sterile connection connector (4a, 9a) as part B, and a sterile connection connector (9b) as part C. Shown is a bag (8) containing a liquid to be added to (7).
  • a suspension-containing bag (7) having a sterile connection connector (4a, 9a) as part B, and a sterile connection connector (9b) as part C.
  • the instrument of the present invention comprises a hollow fiber separator (1).
  • a hollow fiber type separator uses a hollow fiber type separation membrane (sometimes simply referred to as a hollow fiber. A straw-shaped membrane with numerous holes on the wall), and separation or concentration based on separation ability. , Used for purposes such as molecular sieve, dialysis, liquid exchange.
  • the hollow fiber separator is typically the one shown in the middle of the upper and lower views of FIG.
  • the hollow fiber type separator includes a straight body portion and header portions on both sides thereof.
  • the header portion includes an inlet (11) and an outlet (12) leading to the inside of the hollow fiber, and the body portion leads to the outside of the hollow fiber. At least one outlet (13, 14) is provided.
  • the body of the hollow fiber separator according to the present invention is filled with a bundle of dozens to thousands of hollow fibers. And a resin layer portion that forms the open end of the hollow fiber. Therefore, the inlet and outlet leading to the inside of the hollow fiber and the outlet are separated by the hollow fiber type separation membrane.
  • the suspension flows inside the hollow fiber of the hollow fiber separator, the suspension medium (liquid A) is filtered outside the hollow fiber, and the suspension medium is removed from the suspended matter.
  • the suspension medium liquid A
  • the suspension medium is removed from the suspended matter.
  • the hollow fiber used for the hollow fiber type separator has an inner diameter through which the suspended solid can pass and a pore diameter through which the suspended solid and the suspension medium (liquid A) can be separated.
  • the inner diameter can be 0.03 mm or more, preferably 0.1 mm or more, and more preferably 0.3 mm or more.
  • the upper limit of the inner diameter is not particularly limited, but from the viewpoint that the membrane area for processing increases due to the presence of many hollow fibers having a small diameter, and for example, those having a diameter of 2 mm or less are used. It is preferable to use the one of 1 mm or less.
  • the pore diameter (sometimes referred to as pore size) may be smaller than the cell.
  • it can be 0.05 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less, preferably 0.1 ⁇ m or more and 5 ⁇ m or less, and more preferably 0.15 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less. If the pore size is too small, a sufficient filtration rate cannot be obtained. On the other hand, if it exceeds 10 ⁇ m, cells to be treated may enter the pores, and the cell recovery rate may be reduced.
  • the hole diameter of the hollow fiber only needs to be a size that allows appropriate treatment of the target cells, that is, a size that can filter the suspension (liquid A) without passing the cells.
  • a hollow fiber having a relatively large pore diameter called a microflow (MF) type or a hollow fiber having a molecular fractionation ability called an ultraflow (UF) type has a relatively small pore diameter. It is preferable to select one using a large hollow fiber (having a relatively large fractional molecular weight).
  • the fractional molecular weight is the component that is desired to be removed (for example, culture solution component, cell proliferation, differentiation / induction, activation insulin, transferrin, serum albumin, IL-2 component).
  • the device of the present invention is for treating therapeutic cells, the number of cells processed at one time is considered to be ⁇ 2 ⁇ 10 9 , so that this amount can be stored hollow.
  • a hollow fiber separator having a total yarn inner volume may be selected.
  • the hollow fiber type separator may display the membrane area as an index representing the processing amount.
  • the membrane area of the hollow fiber type separation membrane is usually calculated by the following formula.
  • Membrane area (cm 2 ) hollow fiber inner diameter (cm) ⁇ ⁇ ⁇ hollow fiber length (cm) ⁇ number of yarns
  • the treatment of 1 ⁇ 10 7 cells is preferably performed by a hollow fiber type separator having a membrane area of 150 cm 2 using hollow fibers having an inner diameter of 0.7 mm and a pore diameter of 0.25 ⁇ m. I was able to. Moreover, since the total volume inside the hollow fiber of this hollow fiber type separator is calculated to be about 2.6 mL, the cell density can be concentrated to about 8 ⁇ 10 8 cells / mL by separating the culture solution. Then, up to about 2.0 ⁇ 10 9 cells can be stored inside the hollow fiber.
  • 1 ⁇ to handle 10 7 ⁇ 2 ⁇ 10 9 cells are membrane area by using a 10 cm 2 ⁇ 20,000 cm 2 hollow fiber type separators, can be suitably processed.
  • a separator having a certain membrane area sufficient separation can be achieved.
  • a separator having a membrane area of a certain value or less it is possible to suppress a reduction in cell recovery rate and cost.
  • the material of the hollow fiber is not particularly limited as long as the desired separation can be performed, but is preferably a material that can withstand sterilization. Moreover, when using for the treatment of the cell for a treatment, it is preferable that it is a raw material accept
  • PE polyethylene
  • PS polyethersulfone
  • PES polyethersulfone
  • mPES modified polyethersulfone
  • ME cellulose ester
  • sterilization means is not particularly limited, and heat sterilization such as autoclave and boiling, gas sterilization with a sterilizing gas such as ethylene oxide gas and hydrogen peroxide gas, ultraviolet rays, ⁇ rays Or irradiation sterilization with an electron beam etc. can be illustrated.
  • a sterilizing gas such as ethylene oxide gas and hydrogen peroxide gas, ultraviolet rays, ⁇ rays Or irradiation sterilization with an electron beam etc.
  • it is acceptable as a sterilization means for medical devices.
  • the material of the body part and the header part of the hollow fiber separator is not particularly limited as long as the desired separation can be performed, but is preferably a material that is transparent so that the separation can be visually confirmed and can withstand sterilization.
  • a block copolymer such as polysulfone, polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polyimide, polycarbonate, polymethylpentene, or polystyrene is preferable.
  • the material of the resin layer portion for fixing the hollow fiber type separation membrane is not particularly limited as long as the desired separation can be performed, but is preferably a material that can withstand sterilization.
  • a polyurethane resin, an epoxy resin, or a silicone resin is preferable.
  • the liquid A can be separated from the suspension containing the suspension A and the suspension A by a hollow fiber separator.
  • the liquid A is usually a culture solution containing components for cell proliferation, differentiation / induction, and activation.
  • the liquid A is preferably removed sufficiently.
  • such a component can be sufficiently removed from the therapeutic cells by using a hollow fiber separator.
  • the apparatus of the present invention includes a drainage bag (2) for storing separated liquid A, which is connected to a discharge port (13, 14) of a hollow fiber type separator (1), and a hollow fiber type separator.
  • a collection bag (3) connected to the inlet (11) or the outlet (12) of the liquid for storing the suspended solid from which the liquid A has been separated.
  • the collection bag (3) can be a bag suitable for infusion (infusion bag).
  • the recovery bag (3) is connected to the inlet (11) or the outlet (12) of the hollow fiber separator (1). It is preferable to be connected to the opposite side across the container (1). That is, when the collection bag (3) is connected to the inlet (11) of the hollow fiber separator (1), at least one bag containing liquid B (at the outlet (12) of the hollow fiber separator (1) ( 5) and when the recovery bag (3) is connected to the outlet (12) of the hollow fiber separator (1), at least one liquid is connected to the inlet (11) of the hollow fiber separator (1). It is preferable that the B bag (5) is connected. By adopting such a configuration, the suspension B is stored in the collection bag (3) so that the suspension B from which the liquid A in the hollow fiber separator (1) is separated is pushed out. Because it can.
  • the collection bag (3) is also preferably connected through a switchable connecting portion of the flow path such as a three-way stopcock (iv).
  • the device of the present invention separates the suspension medium connected to the inlet (11) or outlet (12) of the hollow fiber separator (1) in addition to the drainage bag (2) and the recovery bag (3).
  • at least one (for example, two) connector for easily connecting the bag containing liquid B may be provided.
  • the connector can be a sterile connection connector for aseptically connecting in a non-sterile environment.
  • the portion where the hollow fiber separator (1), the drainage bag (2) and the recovery bag (3) are connected, and the bag (5, 6) containing the liquid B are separately sterilized by sterilization means suitable for each. After that, it can be connected aseptically.
  • Liquid B is a liquid used for washing the suspended solid and / or replacing the liquid A and resuspending the suspended solid.
  • Various liquids can be selected as the liquid B depending on the purpose.
  • the liquid B for washing cells has a buffering effect.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS Tris buffered saline
  • HEPES buffered saline HEPES buffered saline
  • Ringer's solution lactated Ringer's solution, Ringer's acetate Ringer's solution
  • glucose aqueous solution or the like 5% glucose aqueous solution or the like.
  • a fluid acceptable for infusion is used.
  • liquids are Ringer's solution (lactic Ringer's solution, Ringer's acetate Ringer's solution, bicarbonated Ringer's solution, etc.), physiological saline, 5% glucose aqueous solution, and the like.
  • the amount of the liquid B can be appropriately determined according to the intended use of the liquid B, such as washing and resuspension for infusion. About 0.5 to 4 times.
  • two or more bags containing liquid B are provided, at least one is connected to the inlet (11) of the hollow fiber separator (1), and at least one is connected to the outlet (12).
  • Ligate one used for washing the suspension and the other used for recovery and resuspension.
  • washing can be performed in a sufficient amount, and the suspended matter is resuspended in an accurate amount of liquid B.
  • Can be recovered can be recovered.
  • liquid feeding for cleaning and liquid feeding for recovery are performed in opposite directions, so that it can be expected that the recovery rate is high, and there are fewer tube connection points in the entire instrument. There is a merit in manufacturing the instrument.
  • the bag (6) containing the liquid B connected to the inlet side of the hollow fiber separator is connected via a switchable connecting portion of the flow path such as a three-way stopcock (v).
  • each bag is not particularly limited, and may be determined appropriately according to the amount of liquid A to be separated, the amount of suspended solids to be stored, the amount of liquid B required, and the like. can do.
  • a pillow type bag, a cylindrical tank type bag, a container tank type bag, a square tank type bag, etc. can be used, and a capacity of 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 500 mL, 1 L, 5 L, 10 L, 20 L, 50 L, etc. Can be used as appropriate.
  • the drainage bag (2) can be selected to have a volume of 50 mL to 5 L, and the collection bag (3) has a volume suitable for infusion, for example, about 50 mL to 1 L. Can be selected.
  • the bag (5, 6) containing the liquid B can be selected, for example, with a capacity of about 50 mL to 1 L.
  • the material of the bag is not particularly limited as long as it is a soft resin material that can be deformed by applying pressure to the bag to extrude the contents, but it is transparent or translucent so that liquid movement and storage can be confirmed visually It is preferable that the material be resistant to sterilization. Specific examples include polyethylene, polypropylene, polybutadiene, ethylene / vinyl acetate copolymer (EVA), ethylene / vinyl alcohol copolymer resin (EVOH), and polyvinyl chloride (vinyl chloride).
  • the bag material is preferably not a halogen-based material and does not use the plasticizer DEHP.
  • the material of the bag is preferably one that is recognized as a medical device.
  • the instrument of the present invention comprises a sterile connection connector (4b) connected aseptically in a non-sterile environment to a bag containing suspension connected to an inlet (11) of a hollow fiber separator (1).
  • the non-sterile environment refers to a normal open environment that is not in a special facility such as a clean room, for example, a doctor's office, hospital room, laboratory, home, and the like.
  • the aseptic connection connector (4b) does not require a special machine such as an aseptic connection device, and can connect two tubes without exposing the inside of the tube to an external atmosphere. it can.
  • Aseptic connector (4b) includes, for example, Paul Medlock connector and Kleenpak (registered trademark) connector, Sartreus Stedim Biotech Opta (registered trademark) STF-I connector, Millipore Lynx (registered trademark) It can be one of two parts aseptic connector, such as ST connector, AsperQuik® connector from Colder Products.
  • the aseptic connection connector (4b) is not particularly limited as long as it can perform the intended connection, but is preferably a material that can withstand sterilization suitable for other parts such as a bag.
  • the material of the aseptic connection connector (4b) can be, for example, polycarbonate, silicone rubber, polyethylene, or polyethersulfone.
  • the hollow fiber separator, each bag, and the sterile connection connector and the like are connected in a liquid-tight manner (a state in which water does not leak), and a tube can be used for the connection. .
  • the tube material is not particularly limited as long as it is a soft resin material that can liquid-tightly connect the hollow fiber separator, bag, and connector, but can be sterilized together with those materials if necessary, and the movement of the liquid can be visually observed. It is preferable that it is transparent or semi-transparent so that it can confirm by this.
  • polyolefins such as polyethylene, polypropylene, ethylene-propylene copolymer, ethylene-vinyl acetate copolymer (EVA), polystyrene, polyamide, polyimide, poly- (4-methylpentene-1), ionomer, acrylic Resins, polyesters such as polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), various thermoplastic elastomers such as styrene, polyolefin, polyvinyl chloride, polyurethane, polyester, and polyamide, silicone resin, polyurethane, etc. Or copolymers, blends, and polymer alloys mainly composed of these.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PBT polybutylene terephthalate
  • various thermoplastic elastomers such as styrene, polyolefin, polyvinyl chloride, polyurethane, polyester, and polyamide, silicone resin, polyurethane, etc.
  • the instrument of the present invention may include various members as required in addition to the hollow fiber separator, the bag, and the aseptic connection connector.
  • a clamp for example, a clamp, a sampling port, a stopcock, a clave connector and the like.
  • a plurality of second clamps (ii, iii) can be provided to close each of the second clamps (ii, iii).
  • the device of the present invention may be provided with three-way activity (iv, v) in place for switching the flow path or for branching the flow path.
  • the suspension containing the suspension A, liquid A, and suspended solids can be in the form of being stored in the bag (7) before being processed by the device of the present invention.
  • the kit provided by the present invention includes, as part B, a part comprising a bag (7) containing such a suspension, in addition to part A comprising the above-described instrument.
  • the bag (7) containing the suspension is preferably provided with a sterile connection connector (4a) for aseptically connecting to the device of the present invention.
  • the bag (7) containing the suspension may also be provided with a further sterile connection connector (9a) for aseptically connecting to the bag (8) containing other solutions.
  • the kit of the present invention may include a bag (8) containing another solution.
  • the bag (8) containing the other solution is preferably provided with a sterile connection connector (9b) for aseptically connecting to the bag (7) containing the suspension.
  • a sterile connection connector (9b) for aseptically connecting to the bag (7) containing the suspension.
  • an example of another solution contained in the bag (8) is a liquid containing components for culturing and activating the therapeutic cells. Specifically, components for cell proliferation, differentiation / induction, activation (for example, serum, cytokine, growth factor, hormone, specifically insulin, transferrin, serum albumin, IL-2 etc.).
  • kit Since the kit is divided into A part, B part and C part, each can be kept at an appropriate temperature until just before use.
  • part A can be stored at room temperature
  • part B can be stored frozen
  • part C can be stored refrigerated.
  • the kit may also include other parts in addition to the A part, the B part, and the C part.
  • it may include a medium on which information such as the connection method, usage procedure, and precautions for the A part, B part, and C part is recorded.
  • the present invention also provides a method for preparing useful cells in which liquid A is aseptically separated from a suspension containing liquid A as a suspension medium and useful cells, comprising the following steps: A hollow fiber type separator (provided with an inlet and an outlet for passing the suspension through to the inside of the hollow fiber, and at least one outlet for discharging the separated liquid A leading to the outside of the hollow fiber.
  • a hollow fiber type separator (provided with an inlet and an outlet for passing the suspension through to the inside of the hollow fiber, and at least one outlet for discharging the separated liquid A leading to the outside of the hollow fiber.
  • the liquid A is separated by supplying the suspension from the inlet to the hollow fiber separator with the outlet closed, and the separated liquid A is discharged from the outlet, and the liquid A is usefully separated.
  • a method for preparing useful cells in which liquid A is aseptically separated from a suspension containing liquid A as a suspension medium and useful cells including the following steps is provided: (1) Aseptically connecting the suspension-containing bag holding the suspension to the sterile connector of the instrument of the present invention described above; (2) The suspension is supplied from the inlet of the hollow fiber type separator to the hollow fiber type separator whose outlet is blocked to separate the liquid A, and the liquid A thus separated is put into a drainage bag.
  • Useful cells that have been pooled and from which fluid A has been separated remain inside the hollow fiber; (3)
  • the liquid B prepared in advance is supplied from the outlet of the hollow fiber type separator to the hollow fiber type separator whose discharge port is blocked to extrude useful cells inside the hollow fiber and stored in a collection bag.
  • Examples of useful cells are cells (therapeutic cells) used for the treatment (prevention, therapy, etc.) of diseases or conditions in humans or non-human animals. That is, the present application also provides a method for preparing therapeutic cells from a cell suspension comprising the following steps (1) to (3): (1) Aseptically connecting the cell suspension-containing bag holding the cell suspension to the sterile connector of the instrument of the present invention described above; (2-1) The cell suspension is supplied from the inlet of the hollow fiber separator to the hollow fiber separator whose outlet is blocked to separate the culture solution, and the separated culture solution is discharged at this time.
  • the step (1) can further include the following steps: (0) A culture solution is aseptically added to a cell storage bag containing cells frozen together with the storage solution to obtain a cell suspension-containing bag in which the cell suspension is retained.
  • FIG. 2 shows an example of using the instrument of the present invention when the useful cell preparation method of the present invention is carried out.
  • the present invention and its embodiments will be described with reference to FIG. 2 as necessary, with reference numerals shown in FIG. 2 being quoted in parentheses.
  • Step (1) is a step of aseptically connecting the cell suspension-containing bag holding the cell suspension to the aseptic connection connector of the instrument of the present invention. Specifically, the cell suspension bag (7) is connected to an instrument equipped with the sterile connection connector (4b) using the sterile connection connector (4a), and processing by the instrument is started.
  • Step (2) is a step of supplying the cell suspension from the inlet of the hollow fiber separator to the hollow fiber separator whose outlet is blocked to separate the culture solution. Specifically, in a state where the three-way stopcock (iv, v) is appropriately set, the bag (7) containing the cell suspension is pressurized, and the suspension is discharged from the inlet (11) of the hollow fiber separator. Supply to the mold separator. At this time, the flow path connected to the outlet (12) of the hollow fiber separator is closed by the first clamp (i), so that at least a part of the liquid A as the suspension medium passes through the hollow fiber membrane. Then, it is stored in the drainage bag (2) through the discharge ports (13, 14) of the hollow fiber separator (1). On the other hand, the cells from which at least a part of the liquid A has been separated remain inside the hollow fiber.
  • the step for washing the cells may be performed before the step (3). Specifically, the three-way cock (iv) is switched, the bag (6) containing the liquid B is pressurized, and the liquid B is supplied to the hollow fiber separator from the inlet (11) of the hollow fiber separator. Wash the cells remaining inside the hollow fiber with B. Liquid B passes through the hollow fiber membrane and is stored in the drainage bag (2) through the discharge ports (13, 14) of the hollow fiber separator (1).
  • Step (3) is a step of supplying the liquid B from the outlet of the hollow fiber type separator to the hollow fiber type separator whose outlet is blocked, pushing out useful cells inside the hollow fiber, and storing it in a collection bag It is.
  • the first clamp (i) is released, the three-way stopcock (v) is switched, the liquid B-containing bag (5) is pressurized, and the liquid B is hollowed from the outlet (12) of the hollow fiber separator. Supplied to the thread separator.
  • the cells inside the hollow fiber are pushed out by the liquid B by closing the flow path connected to the discharge port (13, 14) of the hollow fiber separator with the second clamp (ii, iii). Then, it passes through the inlet (11) of the hollow fiber separator (1) and is stored in the recovery bag (3).
  • the suspension medium is replaced with the liquid B from the liquid A.
  • the bag (7) containing the suspension contains the therapeutic cells and is frozen for storage and transport, and thawed prior to administration in the medical facility where the patient is, and again In some cases, cells are cultured and subjected to treatment such as activation.
  • the step (0) of aseptically adding the culture solution to the cell storage bag containing the cells frozen together with the storage solution can be performed.
  • the bag (7) containing the suspension is aseptically connected to the bag (8) containing the solution for culturing / activation using the aseptic connector (9a, 9b), The solution for activation is introduced into the bag (7) containing the suspension.
  • liquid can be fed by pressurizing a bag containing liquid.
  • a device that adjusts the amount of liquid by applying a constant pressure to the bag from the outside can be used.
  • Such an instrument is called a pressure bag or a disposable pressure bag and is commercially available.
  • a commercially available pressure bag is usually provided with a pressure meter, and liquid feeding can be performed while checking the degree of pressure.
  • the present invention relates to aseptic separation of liquid A from a suspension containing liquid A as a suspension medium and the suspended matter.
  • the suspended matter are research, examination, treatment, production of useful substances. It is a useful cell preferably used in the above.
  • useful cells are not particularly limited, specifically, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), hematopoietic stem cells, bone marrow stromal cells, mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal cells Adipose-derived stromal stem cells, pluripotent adult stem cells, T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK (Natural killer) cells, NKT (Natural killer T) cells, regulatory T cells, etc.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • hematopoietic stem cells bone marrow stromal cells
  • mesenchymal stem cells adipose-derived mesenchymal cells
  • Adipose-derived stromal stem cells pluripotent adult stem cells, T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK (Natural killer) cells, NKT (Natural killer T) cells
  • Lymphocyte system cells macrophages, monocytes, dendritic cells, granulocytes, erythrocytes, platelets, somatic cells such as nerve cells, muscle cells, fibroblasts, hepatocytes, cardiomyocytes, or gene transfer and differentiation And the like can be mentioned.
  • the present invention is suitable for treating therapeutic cells used for the treatment of diseases or conditions of human or non-human animals, among useful cells.
  • therapeutic cells include dendritic cells, NK cells, NKT cells, activated T cells (Th1 cells, which are functional subgroups of effector T cells resulting from activation when naive T cells encounter an antigen) , Th2 cells, TFH cells, Th17 cells, Treg cells, etc.), and CAR-T cells (Chimeric antigen-receptor-T cells).
  • Diseases or conditions to which therapeutic cells can be applied prepared according to the present invention include cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, allergies and the like.
  • K562 cells human leukemia cell line
  • RPMI1640 containing 10% fetal bovine serum (Nichirei Biosciences, catalog number 171012-500ML) and 100 units of penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin (Nacalai Tesque, catalog number 26253-84).
  • the cells were cultured in a medium (Wako Pure Chemical Industries, catalog number: 189-02025) (hereinafter referred to as medium).
  • medium Wako Pure Chemical Industries, catalog number: 189-02025)
  • This cell solution (30 mL) is microza hollow fiber type pencil type module (Asahi Kasei Chemicals, ASA PMP-003, using polyethylene hollow fiber, hollow fiber inner diameter 0.7mm, effective membrane area 150cm 2 , nominal pore diameter from one side inlet 0.25 ⁇ m) using a 50 mL syringe (Terumo, catalog number SS-50ESZ).
  • a tube Saint-Gobain Co., Ltd., C-Flex 374-500-3, made of thermoplastic elastomer
  • the tube (Saint-Gobain Co., Ltd., C-Flex 374-125-2) was connected, and the tip of the tube was put into a drainage vessel to collect the drainage (see the upper part of FIG. 3).
  • a 50 mL syringe containing 50 mL of lactolin gel solution (Fusan Yakuhin Co., Ltd., JAN code 4 987197 900152) was directly used. Connected. The plunger was pushed, the lactolin gel solution was introduced, and the eluate from the inlet was collected (referred to as recovered solution 1) (see the lower part of FIG. 3). Cells in the collected liquid 1 were diluted 2-fold using 0.4% trypan blue solution (Life Technologies, catalog number 15250-061), and counted using a Neubawell calculator. As a result, 50 mL of 1.55 ⁇ 10 5 cells / mL was recovered (7.75 ⁇ 10 6 cells, recovery rate: 77.5%).

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Abstract

懸濁液から懸濁媒を無菌的に分離するための手段を提供することを課題とする。少なくとも以下を備える器具を提供する:懸濁液から液Aを分離するための中空糸型分離器であって、中空糸内側に通じる、懸濁液を通過させるための入口および出口、および中空糸外側に通じる、分離された液Aを排出するための少なくとも一つの排出口を備える、中空糸型分離器;中空糸型分離器の入口に連結された、懸濁液を含むバッグを非滅菌環境において無菌的に接続するための、無菌接続コネクタ;中空糸型分離器の排出口に連結された、分離された液Aを貯留するための排液バッグ;および中空糸型分離器の入口または出口に連結された、液Aが分離された懸濁質媒を貯留するための回収バッグ。

Description

懸濁液を無菌的に処理するための器具
 本発明は、粒子が液体中に分散した懸濁液の無菌的な処理、例えば細胞懸濁液の培養液を無菌的に他の液に置換すること、に関する。本発明は、ライフサイエンス、医療、および治療用細胞の製造等の分野で有用である。
 患者に投与することによりがん等の疾患の処置に用いられる治療用細胞の調製に際しては、多くの場合、まず生体から採取した細胞群から必要な細胞のみを分離することを要する。また、得られた細胞は、通常、体外で誘導、増殖、活性化等のための培養工程を経るが、患者への投与に際しては、培養液由来の成分を除去する必要がある。
 特許文献1は、血液から比重差選別によらず、吸引操作を用いて短時間で容易に幹細胞を含む白血球成分を濃縮する装置を提供することを課題としてなされたものであり、赤血球の変形能に着目し、微細孔を有する膜フィルタを用いて赤血球や血漿などを通過させ、白血球を含む成分を非ろ過成分として回収する手段を用いた幹細胞を含む白血球成分を濃縮する装置を提案する。この装置は、血漿バッグ-白血球捕捉器-回収バッグの径路によって、血漿を利用して逆洗して白血球を回収する白血球分画回収系回路を構成することができること、および血液を移送させる手段としてシリンジを回路中に設け、シリンジを駆動源として用いることにより装置を静置して用いることができ、上下反転等の姿勢変更が不要である旨が述べられている。
 また特許文献2は、簡便な方法で、短時間に、細胞をロスすることなく、細胞へ大きなダメージを与えることなく、細胞濃縮液を製造する方法として、細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び、前記細胞懸濁液入口と前記細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、前記中空糸型分離膜の内側の孔の平均孔径が0.1μm~10μmであり、かつ、ろ液の初期ろ過速度を中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値が2.5以下である、細胞濃縮液の製造方法を提案する。そしてこの方法によれば、縣濁液中の細胞以外の蛋白質などの夾雑物を取り除きつつ、高効率に細胞を回収でき、中空糸における細胞の目詰まりを低減しながら細胞濃縮液を製造できる旨を述べている。そして、細胞の負荷となるような膜の逆洗浄による目詰まりの抑制方法等を使用しないので、細胞へのダメージが少なくなり、細胞生存率が高くなること、また、無菌的な閉鎖系で処理することが可能なので、濃縮された細胞は細胞治療用として提供できることが述べられている。
特開2012-139112号公報(特許第5785713号) 国際公開WO2013/061859
 治療用の細胞を調製するためには、効率のみならず、品質および安全性の確保の面からの検討も必要である。また特殊な設備を要さず、一般の医療施設の現場で簡便な操作により効率よく調製することができれば、当該医療を享受できる患者数の飛躍的な増加が期待できる。本発明者らは、再生医療等製品(細胞治療、遺伝子治療)の製造に関わる技術の研究・開発を重ね、実用可能なNK細胞GMP製造技術の確立に至り、最終製剤設計を進めてきた。その中で、完全閉鎖系による操作の重要性に着目するに至った。
 高活性NK細胞はその活性を維持したまま凍結/融解することができないため、凍結した状態で輸送されたNK細胞は、患者への投与の前に、まず再活性化のための培養工程を要する。この培養工程は無菌的に行う必要がある。次いで培養された細胞から培養液成分を除去し、得られた細胞を、点滴投与に適したラクトリンゲル液等に適切な細胞濃度で再懸濁しなければならない。培養液の除去は、遠心分離技術により、細胞を遠心管中で沈降させ、上清である培養液を除去することにより行えるが、作業を無菌的に行う必要から、クリーンルーム内での実施を要し、特別な設備と熟練した技術者を擁する施設でなければ、患者に投与するための細胞が調製できないという問題があった。
 凍結された細胞を培養し、また治療に際しては培養した細胞から培養液を除去し、必要に応じ洗浄や点滴液に懸濁する操作を完全閉鎖回路で行うことができれば、治療用細胞としての安全性がより高まることに加え、一般の医療施設のような非滅菌環境下でも対応することができる。
 また細胞培養液のみならず、懸濁液を無菌的に処理できる簡易なシステムがあれば、治療用細胞の調製以外も種々の場面への適用が期待できる。
 本発明者らは、細胞のような粒子を含む懸濁液から懸濁媒を無菌的に除去するような処理を行う方法について鋭意検討した。その結果、中空糸型のフィルタを用い、懸濁液を中空糸内を通過させることにより懸濁質である粒子から懸濁媒である液体部分を効率よく除去することができ、またこのような中空糸を用いたシステムは、完全閉鎖系であり、かつ送液のための電動のポンプも要さない実用に適した回路として構成することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
 本発明は、以下を提供する。
[1]懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液から液Aを無菌的に分離するための、少なくとも以下を備える器具:
・懸濁液から液Aを分離するための中空糸型分離器であって、
 中空糸内側に通じる、懸濁液を通過させるための入口および出口、および
 中空糸外側に通じる、分離された液Aを排出するための少なくとも一つの排出口
を備える、中空糸型分離器;
・中空糸型分離器の入口に連結された、懸濁液を含むバッグを非滅菌環境において無菌的に接続するための、無菌接続コネクタ;
・中空糸型分離器の排出口に連結された、分離された液Aを貯留するための排液バッグ;および
・中空糸型分離器の入口または出口に連結された、液Aが分離された懸濁質を貯留するための回収バッグ。
[2]さらに以下を備える、1に記載の器具:
・中空糸型分離器の入口または出口に連結された、懸濁媒が分離された懸濁質を洗浄または回収するための液Bを含む、少なくとも1つの液B入りバッグ。
[3]液B入りバッグを2つ備える、2に記載の器具。
[4]第一の液B入りバッグが中空糸型分離器の入口に連結されており、第二の液B入りバッグが中空糸型分離器の出口に連結されている、2または3に記載の器具。
[5]さらに以下を備える、1~4のいずれか1項に記載の器具:
・中空糸型分離器の出口を塞ぐための第一のクランプ、および
・中空糸型分離器の排出口を塞ぐための第二のクランプ。
[6]懸濁質が細胞であり、液Aが培養液である細胞懸濁液から培養液を無菌的に分離するための器具であり;
中空糸型分離器の中空糸が、細胞懸濁液が通過可能な内径、および細胞と培養液を分離可能な孔径を有するものである、1~5のいずれか1項に記載の器具。
[7]細胞が静脈投与される治療用細胞であり、細胞懸濁液の培養液を静脈投与に適した液に無菌的に置換するための器具であり;
中空糸型分離器の入口に連結された第一の液B入りバッグ、および中空糸型分離器の出口に連結された第二の液B入りバッグを備え、液Bが静脈投与に適した液である、6に記載の器具。
[8]下記を含む、治療用細胞調製用キット:
・7に記載の器具;および
・少なくとも一つの無菌接続コネクタを備える、保存液とともに有用細胞を含む、保存細胞入りバッグ。
[9]さらに下記を含む、8に記載のキット:
・細胞培養液を含む、培養液入りバッグ。
[10]有用細胞が、樹状細胞、NK細胞、NKT細胞、活性化T細胞、およびCAR-T細胞からなる群より選択されるいずれかである、8または9に記載のキット。
[11]以下の工程を含む、懸濁媒である液Aと有用細胞を含む懸濁液から、液Aが無菌的に分離された有用細胞を調製する方法:
(1)1~7のいずれか1項に記載された器具の無菌接続コネクタに、懸濁液が保持された懸濁液入りバッグを無菌接続し;
(2)懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して液Aを分離し、このとき分離された液Aは排液バッグに貯留され、液Aが分離された有用細胞は中空糸の内側に残留し;
(3)予め準備した液Bを、中空糸型分離器の出口から、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の有用細胞を押し出し、回収バッグに貯留する。
[12]以下の工程を含む、細胞懸濁液から、治療用細胞を調製する方法:
(1)7に記載された器具の無菌接続コネクタに、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを無菌接続し;
(2)細胞懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して培養液を分離し、このとき分離された培養液は排液バッグに貯留され、培養液が分離された細胞は中空糸の内側に残留し;
(3)第一の液B入りバッグから静脈投与に適した液を、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側に残留する培養液が分離された細胞を洗浄し;
(4)第二の液B入りバッグから静脈投与に適した液を、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の洗浄済細胞を押し出し、回収バッグに貯留し、治療用細胞を得る。
[13]工程(1)の前に、さらに下記の工程を含む、12に記載の調製方法:
(0)保存液とともに凍結された細胞を含む細胞保存バッグに、培養液を無菌的に加えて、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを得る。
[14]細胞が、樹状細胞、NK細胞、NKT細胞、活性化T細胞、およびCAR-T細胞からなる群より選択されるいずれかである、13に記載の調製方法。
 本発明により、非滅菌環境下であっても無菌的に、懸濁液からの懸濁媒の除去、懸濁質の洗浄、懸濁質の別の懸濁媒への再懸濁等の処理を行うことができる。また本発明により、電動の機械を用いずに、当該処理を行うことができる。
本発明の器具、およびキットの例 本発明の器具による処理時の例 細胞導入時および細胞回収時を示す図 回収率のグラフ
 数値範囲「X~Y」は、特に記載した場合を除き、両端の数値XおよびYを含む。「Aおよび/またはB」は、特に記載した場合を除き、AおよびBのうちのすくなくとも一方の意である。調製方法は製造方法と言い換えることができる。
<処理の対象となる懸濁液、懸濁質、懸濁媒(液A)>
 本発明の器具により、種々の懸濁液を処理することができる。懸濁液とは、固体が液体中に分散した状態のものをいい、懸濁質(固形の分散質)と、懸濁媒(液体である分散媒)を含む。分散は、均一でなくてもよい。
 本発明の器具は、懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液から液Aを無菌的に分離するために用いられる。懸濁質は、種々の種類、形状およびサイズの粒子であり得、特に限定されないが、本発明は、医薬、化粧品、または食品として許容される粒子、例えば、DDSとして用いられる高分子ミセルによるナノ粒子、化粧品に用いられる粉体、培養細胞、治療用細胞等に好ましく適用することができる。特に好ましい例は、浮遊性の動物細胞(以下、動物細胞を、単に「細胞」ということがある。)であり、さらに好ましい例は、ヒトまたは非ヒト動物における疾患または状態の処置(予防、治療等)に用いられる細胞(治療用細胞)である。なお、以下では本発明、およびその実施態様を、本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合を例に説明することがあるが、当業者であれば、その説明を適宜、他の場合にも当てはめて本発明を理解することができる。
 懸濁媒である液Aは、懸濁質に応じた様々な種類の液体であり得る。懸濁質が浮遊性の細胞であるとき、液Aは、例えば、細胞を保存するための液、または培養液である。細胞を保存するための液の例は、必要に応じ、細胞を凍結障害から保護するための成分、例えばDMSO、グリセロール、血清等を含む、培養液である。培養液は、細胞の種類に応じて、例えば、動物細胞培養用の基礎培地として知られる、DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等の中から、適宜選択して用いることができる。培養液は、細胞の増殖、分化・誘導、活性化のための成分を含んでいてもよい。このような成分には、血清、サイトカイン、増殖因子、ホルモンが含まれ、具体的には、インスリン、トランスフェリン、血清アルブミン、IL-2等である。
 懸濁液、および液Aの量は、目的に応じて適宜とすることができる。本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合、懸濁液は107~109オーダーの数の細胞を含んでいる場合があり、液量としては、10mL~1Lであり得る。
<器具、キット>
 本発明は、懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液から液Aを無菌的に分離するための、少なくとも以下を備える器具を提供する:
・懸濁液から液Aを分離するための中空糸型分離器であって、
 中空糸外側に通じる、分離された液Aを排出するための少なくとも一つの排出口、および
 中空糸内側に通じる、懸濁液を通過させるための入口および出口
を備える、中空糸型分離器;
・中空糸型分離器の入口に連結された、懸濁液を含むバッグを非滅菌環境において無菌的に接続するための、無菌接続コネクタ;
・中空糸型分離器の排出口に連結された、分離された液Aを貯留するための排液バッグ;
・中空糸型分離器の入口または出口に連結された、液Aが分離された懸濁質を貯留するための回収バッグ。
 本発明はまた、下記A部およびB部を含む、治療用細胞調製用のキットを提供する:
A部:本発明の器具からなる部分
B部:少なくとも一つの無菌接続コネクタ(4a、9a)を備える、保存液や培養液とともに有用細胞を含む、細胞懸濁液入りバッグ(7)からなる部分
 キットはさらに、下記C部を含むことができる。
C部:細胞培養液を含む、培養液入りバッグ(8)からなる部分。
 本発明の器具、およびキットの例を、図1に示した。本発明の器具(A部)は、少なくとも、中空糸型分離器(1)、中空糸型分離器の排出口に連結された、排液バッグ(2)、中空糸型分離器の入口または出口に連結された、回収バッグ(3)、中空糸型分離器の入口に連結された無菌接続コネクタ(4b)を含むが、図1に示した態様においては、さらに中空糸型分離器(1)の出口(12)に連結された液B入りバッグ(5)と、中空糸型分離器(1)の入口(11)に連結された液B入りバッグ(6)を備えている。図1には、他に、B部として、無菌接続コネクタ(4a、9a)を備える、懸濁液入りバッグ(7)と、C部として無菌接続コネクタ(9b)を備え、懸濁液入りバッグ(7)に加えるための液が入ったバッグ(8)が示されている。以下では、必要に応じ、図1を参照し、図1中に示された符号を括弧内で引用しつつ、本発明、およびその実施態様を説明する。
[中空糸型分離器]
 本発明の器具は、中空糸型分離器(1)を備える。中空糸型分離器とは、中空糸型分離膜(単に、中空糸ということもある。ストロー状であり、壁面に無数の孔がある膜。)を使用し、分離、または分離能に基づく濃縮、分子ふるい、透析、液交換等の目的のために用いるものをいう。中空糸型分離器は、典型的には、図3の上図および下図の中央に示されるものである。中空糸型分離器は、ストレートな胴部とその両側のヘッダー部からなり、ヘッダー部は、中空糸内側に通じる入口(11)および出口(12)を備え、胴部は、中空糸外側に通じる少なくとも一つの排出口(13、14)を備える。本発明における中空糸型分離器の胴部は、当業者によく知られているように、内部に中空糸を数十本から数千本程度束ねたものが充填されており、束を容器内部に固定するとともに、中空糸の開口端を形成する樹脂層部を備える。そのため中空糸内側に通じる入口および出口と、排出口が中空糸型分離膜により隔てられた構造となっている。
 本発明においては、中空糸型分離器の中空糸内側を懸濁液が流れ、中空糸の外側に懸濁媒(液A)がろ過され、懸濁質から懸濁媒が除去される。中空糸型分離器をこのように用いることにより、膜面における懸濁液の流速が十分に速く、またクロスフロー(タンジェンシャルフローともいう。)効果により懸濁質が膜面に付着しにくい。そのため高い圧力負担を要さずに懸濁媒を迅速に除去することができ、懸濁質へのダメージが少なく、かつ懸濁質を高濃度にまで濃縮できる。
 中空糸型分離器に用いられる中空糸は、懸濁質が通過可能な内径、および懸濁質と懸濁媒(液A)を分離可能な孔径を有するものである。懸濁質が細胞である場合、内径は0.03mm以上とすることができ、0.1mm以上であることが好ましく、0.3mm以上であることがより好ましい。内径の上限値は特に限定されないが、径の小さい中空糸が多く存在することにより処理のための膜面積が大きくなり、効率的に分離が行えるとの観点からは、例えば2mm以下のものを用いることができ、1mm以下のものを用いることが好ましい。
 懸濁質が細胞である場合、孔径(ポアサイズということもある。)は、細胞より小さければよい。例えば、0.05μm以上10μm以下とすることができ、0.1μm以上5μm以下であることが好ましく、0.15μm以上1μm以下であることがより好ましい。孔径が小さすぎると、十分なろ過速度が得られない。また10μmを超えると、処理する細胞が孔に入りこむことで、細胞の回収率が低下する可能性がある。
 中空糸の孔径は、対象とする細胞が適切に処理できるサイズ、すなわち細胞を通過させずに懸濁液(液A)をろ過できるサイズであればよいので、中空糸型分離器として既存のものを用いる場合は、マイクロフロー(MF)型といわれる孔径の比較的大きい中空糸を用いたものか、またはウルトラフロー(UF)型といわれる分子分画能を有する中空糸のうち、孔径が比較的大きい(分画分子量が比較的大きい)中空糸を用いたものを選択するとよい。UF型を選択する場合、分画分子量が、除去したいと考える成分(例えば、培養液成分、細胞の増殖、分化・誘導、活性化のためのインスリン、トランスフェリン、血清アルブミン、IL-2成分)を通過させるのに十分な大きさであるものを選択するとよい。中空糸型分離器として既存のものを用いる場合、製造者が表示する公称の孔径サイズに基づき、選択することができる。あるいは、中空糸の孔径として、走査型電子顕微鏡観察において計測される20個の孔の直径(楕円の場合は長径)を平均したものを基準としてもよい。
 中空糸型分離器の中空糸の内側には、効率的に十分な処理が行えるとの観点からは、処理しようとする懸濁液に含まれる懸濁質をすべて格納できることが好ましい。本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合、1回で処理される細胞数は、~2×109個であると考えられるので、この量を格納することができる中空糸内側総容積を有する中空糸型分離器を選択するとよい。中空糸内側総容積は、次の式で計算することができる。
 中空糸内側総容積(mL、またはcm3)=[中空糸内径(cm)/2]2×π×中空糸長さ(cm)×中空糸本数(本)
 中空糸型分離器は、その処理量を表す指標として、膜面積が表示される場合がある。中空糸型分離膜の膜面積は、通常、次の式で計算される。
 膜面積(cm2)=中空糸内径(cm)×π×中空糸長さ(cm)×糸本数
 本発明者らの検討によると、内径0.7mm、孔径0.25μmの中空糸を用いた膜面積150cm2の中空糸型分離器により、1×107個の細胞の処理を好適に行うことができた。また、この中空糸型分離器の中空糸内側総容積は約2.6mLと計算されるので、培養液を分離することにより細胞密度を 8×108個/mL程度にまで濃縮することができるとすると、中空糸内部に 2.0×109個程度までの細胞を格納することができる。
 したがって、1×107~2×109個の細胞を処理するためには、膜面積が10cm2~20,000cm2の中空糸型分離器を用いることにより、好適に処理することができる。
膜面積がある程度大きい分離器を用いることにより、十分な分離が達成できる一方で、膜面積が一定値以下の分離器を用いることにより、細胞の回収率の低下やコストを抑えることができる。
 中空糸の素材は、目的の分離を行うことができる限り、特に限定されないが、滅菌に耐える素材であることが好ましい。また、治療用の細胞の処理に用いる場合は、医療用具として許容される素材であることが好ましい。具体的には、ポリオレフィン系またはポリスルホン系の高分子材料であることが好ましく、より特定すると、ポリエチレン(PE)、ポリスルホン(PS)、ポリエーテルスルホン(PES)、修飾ポリエーテルスルホン(mPES)、混合セルロースエステル(ME)であることがより好ましい。
 なお、本発明に関し、滅菌というときは、手段は特に限定されず、オートクレーブや煮沸のような熱滅菌、酸化エチレンガスや過酸化水素ガスのような殺菌性のガスによるガス滅菌、紫外線、γ線、または電子線等による照射滅菌を例示することができる。好ましくは、医療用具の滅菌手段として許容されるものがよい。
 中空糸型分離器の胴部およびヘッダー部の素材は、目的の分離が行える限り、特に限定されないが、分離が目視で確認できるように透明であり、かつ滅菌に耐える素材であることが好ましい。具体的にはポリスルホン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、またはポリスチレン等のブロック共重合体であることが好ましい。中空糸型分離膜を固定する樹脂層部の素材も、目的の分離が行える限り、特に限定されないが、滅菌に耐える素材であることが好ましい。具体的には、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、またはシリコーン樹脂であることが好ましい。
 中空糸型分離器により、懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液から液Aを分離することができる。本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合、液Aは通常、細胞の増殖、分化・誘導、活性化のための成分を含む培養液であるが、このような成分は、患者に投与する際には十分に除去されていることが好ましい。本発明においては、中空糸型分離器を用いることにより、このような成分を、治療用細胞から十分に除去することができる。
[バッグ]
 本発明の器具は、中空糸型分離器(1)の排出口(13、14)に連結された、分離された液Aを貯留するための排液バッグ(2)、および中空糸型分離器の入口(11)または出口(12)に連結された、液Aが分離された懸濁質を貯留するための回収バッグ(3)を備える。回収バッグ(3)は、本発明の器具が点滴により静脈投与される治療用細胞の処理のために用いるものである場合は、点滴に適したもの(点滴用バッグ)とすることができる。
 回収バッグ(3)は、中空糸型分離器(1)の入口(11)または出口(12)に連結されるが、後述する、1つの液B入りバッグ(5)とは、中空糸型分離器(1)を挟んで、逆の側に連結されることが好ましい。すなわち、中空糸型分離器(1)の入口(11)に回収バッグ(3)が連結される場合は、中空糸型分離器(1)の出口(12)に少なくとも1つの液B入りバッグ(5)が連結され、中空糸型分離器(1)の出口(12)に回収バッグ(3)が連結される場合は、中空糸型分離器(1)の入口(11)に少なくとも1つの液B入りバッグ(5)が連結されることが好ましい。このような構成とすることにより、液Bを中空糸型分離器(1)内の液Aが分離された懸濁質を押し出すようにして、回収用バッグ(3)に懸濁質を貯留することができるからである。回収バッグ(3)はまた、三方活栓(iv)等の流路の切り替え可能な接続部を介して連結されていることが好ましい。
 本発明の器具は、排液バッグ(2)、および回収バッグ(3)のほか、中空糸型分離器(1)の入口(11)または出口(12)に連結された、懸濁媒が分離された懸濁質を洗浄または回収するための液Bを含む、少なくとも1つの(例えば2つの)液B入りバッグ(5、6)を備えていてもよい。あるいは、液B入りバッグを容易に接続するための少なくとも1つの(例えば2つの)コネクタを備えていてもよい。コネクタは、非滅菌環境において無菌的に接続するための、無菌接続コネクタとすることができる。中空糸型分離器(1)、排液バッグ(2)、および回収バッグ(3)を連結した部分と、液B入りバッグ(5、6)とは、それぞれに適した滅菌手段により別個に滅菌した後に、無菌的に接続することができる。
 液Bは、懸濁質を洗浄するため、および/または液Aと置換し、懸濁質を再懸濁するために用いられる液である。液Bとしては、目的に応じ、種々の液を選択しうるが、本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合、細胞の洗浄のための液Bとしては、緩衝効果のあるリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline;PBS)、トリス緩衝生理食塩水(Tris Buffered Saline;TBS)、HEPES緩衝生理食塩水(HEPES Buffered Saline)、生理食塩水、リンゲル液(乳酸リンゲル液、 酢酸リンゲル液 、重炭酸リンゲル液等)、5%グルコース水溶液等を用いることができる。点滴のために細胞を再懸濁するためには、点滴するのに許容される液が用いられる。このような液の例は、リンゲル液(乳酸リンゲル液、 酢酸リンゲル液 、重炭酸リンゲル液等)、生理食塩水、5%グルコース水溶液等である。
 液Bの量は、洗浄、点滴のための再懸濁等、液Bの使用目的に応じて適宜とすることができるが、通常、中空糸型分離器で処理される懸濁液または液Aの0.5~4倍程である。
 好ましい態様においては、液B入りバッグ(5、6)を2つ以上備え、少なくとも1つを中空糸型分離器(1)の入口(11)に連結し、少なくとも1つを出口(12)に連結し、一方を懸濁質の洗浄のために用い、他方を回収、および再懸濁のために用いる。洗浄ための液Bと回収・再懸濁のための液Bを分けることにより、十分な量で洗浄を行うことができ、また正確な量の液Bに懸濁質を再懸濁した状態で、回収することができる。また、このような構成により、洗浄のための送液と回収のための送液を逆方向に行うことになり、回収率が高くなることが期待できるほか、器具全体においてチューブの接続箇所を少なくすることができ、器具の製造上のメリットがある。中空糸型分離器の入口側に連結される液B入りバッグ(6)は、三方活栓(v)等の流路の切り替え可能な接続部を介して連結されていることが好ましい。
 それぞれのバッグの個数、タイプ(型)、および容量は、特に限定されず、分離される液Aの量、貯留される懸濁質の量、必要な液Bの量等に応じて、適宜とすることができる。例えば、ピロー型バッグ、円筒タンク型バッグ、コンテナータンク型バッグ、角型タンク型バッグ等を用いることができ、50mL、100mL、200mL、300mL、500mL、1L、5L、10L、20L、50L等の容量のものを適宜使用することができる。治療用細胞の処理のためには、排液バッグ(2)は、50mL~5Lの容量のものを選択することができ、回収バッグ(3)は、点滴に適した容量、例えば50mL~1L程度の容量のものを選択することができる。また、液B入りバッグ(5、6)は、例えば50mL~1L程度の容量のものを選択することができる。
 バッグの素材は、バッグに圧力を加えて変形させ、内容物を押し出すことができるよう軟質樹脂材料であれば、特に限定されないが、液の移動や貯留が目視で確認できるように透明または半透明であり、かつ滅菌に耐える素材であることが好ましい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブタジエン、エチレン・酢酸ビニル共重合体(EVA)、エチレン・ビニルアルコール共重合樹脂(EVOH)、ポリ塩化ビニル(塩ビ)等が例示できる。バッグの素材はまた、環境に配慮して、ハロゲン系素材でなく、また可塑剤DEHPを使用しないものがより好ましい。本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合、バッグの素材は、医療用具として認められたものであることが好ましい。
[無菌接続コネクタ]
 本発明の器具は、中空糸型分離器(1)の入口(11)に連結された、懸濁液を含むバッグを非滅菌環境において無菌的に接続するための、無菌接続コネクタ(4b)を備える。非滅菌環境とは、クリーンルームのような特別な施設内ではない通常のオープンな環境、例えば、病院や医院の診察室、病室、研究室、家庭等を指す。
 無菌接続コネクタ(4b)は、無菌接続装置のような特別な機械を要さず、2つのチューブを、チューブ内を外部雰囲気に曝すことなく接続できるものをいい、市販のものを利用することができる。無菌接続コネクタ(4b)は、例えば、ポール社のMedlockコネクタ、およびKleenpak(登録商標)コネクタ、ザルトリウムステディムバイオテック社のOpta(登録商標)STF-Iコネクタ、ミリポア社のLynx(登録商標)STコネクタ、コールダープロダクツ社のAseptiQuik(登録商標)コネクタのような、2つの部品からなる無菌接続コネクタの一方であることができる。
 無菌接続コネクタ(4b)は、目的の接続を行うことができるものである限り、特に限定されないが、バッグ等の他のパーツに適した滅菌に耐える素材であることが好ましい。
無菌接続コネクタ(4b)の素材は、例えば、ポリカーボネート、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリエーテルスルホンとすることができる。
[チューブ]
 本発明の器具においては、中空糸型分離器、各バッグ、および無菌接続コネクタ等のパーツは、液密(水が漏れない状態)に連結されており、連結には、チューブを用いることができる。
 チューブの素材は、中空糸型分離器、バッグ、コネクタを液密に連結できる軟質樹脂材料であれば、特に限定されないが、必要に応じそれらの素材とともに滅菌することができ、液の移動が目視で確認できるように透明、または半透明であることが好ましい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン-プロピレン共重合体、エチレン-酢酸ビニル共重合体(EVA)等のポリオレフィン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリ-(4-メチルペンテンー1)、アイオノマー、アクリル系樹脂、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)等のポリエステル、スチレン系、ポリオレフィン系、ポリ塩化ビニル系、ポリウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系等の各種熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂、ポリウレタン等、またはこれらを主とする共重合体、ブレンド体、ポリマーアロイが挙げられる。
[他のパーツ]
 本発明の器具は、上記の中空糸型分離器、バッグ、および無菌接続コネクタ以外に、必要に応じ各種の部材を備えていてもよい。例えば、クランプ、サンプリングポート、活栓、クレーブコネクタ等である。
 好ましい態様においては、中空糸型分離器(1)の出口(12)を塞ぐための第一のクランプ(i)、および中空糸型分離器の排出口を塞ぐための第二のクランプ(ii、iii)を備える。第二のクランプ(ii、iii)は、排出口が複数ある場合はそれぞれを塞ぐために複数備えることができる。また本発明の器具は、流路を切り替えるため、または流路を分岐させるために、三方活性(iv、v)を適所に備えていてもよい。
[B部]
 懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液は、本発明の器具により処理される前は、バッグ(7)に収納された形態とすることができる。本発明により提供されるキットは、上述の器具からなるA部のほか、B部として、このような懸濁液を含むバッグ(7)からなる部分を含む。懸濁液を含むバッグ(7)は、本発明の器具に無菌的に接続するための無菌接続コネクタ(4a)を備えていることが好ましい。懸濁液を含むバッグ(7)はまた、他の溶液を含むバッグ(8)に無菌的に接続するための更なる無菌接続コネクタ(9a)を備えていてもよい。
[C部]
 本発明のキットは、他の溶液を含むバッグ(8)を含んでいてもよい。他の溶液を含むバッグ(8)は、懸濁液を含むバッグ(7)に無菌的に接続するための無菌接続コネクタ(9b)を備えていることが好ましい。本発明の器具が治療用細胞を処理するためのものである場合、バッグ(8)に含まれる他の溶液の例は、治療用細胞を培養し、活性化するための成分を含む液であり、具体的には、上述した培養液に、細胞の増殖、分化・誘導、活性化のための成分(例えば、血清、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、具体的には、インスリン、トランスフェリン、血清アルブミン、IL-2等)を含んだものである。
 キットにおいては、A部、B部、およびC部に分割されているために、使用直前まで、それぞれを適温に保つことができる。例えば、A部は常温保存し、B部は凍結保存し、およびC部は冷蔵保存することができる。
 キットはまた、A部、B部、およびC部以外に、他のものを含んでいてもよい。例えば、A部、B部、およびC部の接続方法、使用手順、注意事項等の情報を記録した媒体を含んでいてもよい。
<有用細胞の調製方法>
 本発明はまた、以下の工程を含む、懸濁媒である液Aと有用細胞を含む懸濁液から、液Aが無菌的に分離された有用細胞を調製する方法を提供する:
・中空糸型分離器(中空糸内側に通じる、懸濁液を通過させるための入口および出口、および中空糸外側に通じる、分離された液Aを排出するための少なくとも一つの排出口を備える。)の入口から、懸濁液を、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して液Aを分離し、分離された液Aを排出口から排出させ、液Aが分離された有用細胞を中空糸の内側に残留させ;
・予め準備した液Bを、中空糸型分離器の出口から、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側に残留された有用細胞を押し出し、有用細胞を回収する。
 あるいは、以下の工程を含む、懸濁媒である液Aと有用細胞を含む懸濁液から、液Aが無菌的に分離された有用細胞を調製する方法を提供する:
(1)上述の本発明の器具の無菌接続コネクタに、懸濁液が保持された懸濁液入りバッグを無菌接続し;
(2)懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して液Aを分離し、このとき分離された液Aは排液バッグに貯留され、液Aが分離された有用細胞は中空糸の内側に残留し;
(3)予め準備した液Bを、中空糸型分離器の出口から、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の有用細胞を押し出し、回収バッグに貯留する。
 有用細胞の例は、ヒトまたは非ヒト動物における疾患または状態の処置(予防、治療等)に用いられる細胞(治療用細胞)である。すなわち本願は、以下の工程(1)~(3)を含む、細胞懸濁液から、治療用細胞を調製する方法も提供する:
(1)上述の本発明の器具の無菌接続コネクタに、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを無菌接続し;
(2-1)細胞懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して培養液を分離し、このとき分離された培養液は排液バッグに貯留され、培養液が分離された細胞は中空糸の内側に残留し;
(2-2)第一の液B入りバッグから静脈投与に適した液を、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側に残留する培養液が分離された細胞を洗浄し;
(3)第二の液B入りバッグから静脈投与に適した液を、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の洗浄済細胞を押し出し、回収バッグに貯留し、治療用細胞を得る。
 工程(1)の前には、さらに下記の工程を含むことができる:
(0)保存液とともに凍結された細胞を含む細胞保存バッグに、培養液を無菌的に加えて、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを得る。
 図2に、本発明の有用細胞の調製方法を実施する際の、本発明の器具の使用時の例を示した。以下では、必要に応じ、図2を参照し、図2中に示された符号を括弧内で引用しつつ、本発明、およびその実施態様を説明する。
 工程(1)は、本発明の器具の無菌接続コネクタに、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを無菌接続する工程である。具体的には、細胞懸濁液入りバッグ(7)を無菌接続コネクタ(4a)を利用し、無菌接続コネクタ(4b)を備える器具と連結し、器具による処理を開始する。
 工程(2)は、細胞懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して培養液を分離する工程である。具体的には、三方活栓(iv、v)を適切に設定した状態で、細胞懸濁液入りバッグ(7)を加圧し、懸濁液を中空糸型分離器の入口(11)から中空糸型分離器に供給する。このとき、中空糸型分離器の出口(12)に連結した流路を第一のクランプ(i)で塞いでおくことにより、懸濁媒である液Aの少なくとも一部が中空糸膜を通過し、中空糸型分離器(1)の排出口(13、14)を通して排液バッグ(2)に貯留される。一方、液Aの少なくとも一部が分離された細胞は、中空糸の内側に残留する。
 工程(2)の後、工程(3)の前に、細胞の洗浄のための工程を実施してもよい。具体的には、三方活栓(iv)を切り替え、液B入りバッグ(6)を加圧し、液Bを中空糸型分離器の入口(11)から中空糸型分離器に供給することにより、液Bで中空糸の内側に残留する細胞を洗浄する。液Bは中空糸膜を通過し、中空糸型分離器(1)の排出口(13、14)を通して排液バッグ(2)に貯留される。
 工程(3)は、液Bを、中空糸型分離器の出口から、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の有用細胞を押し出し、回収バッグに貯留する工程である。具体的には、第一のクランプ(i)を解除し、三方活栓(v)を切り替え、液B入りバッグ(5)を加圧して液Bを中空糸型分離器の出口(12)から中空糸型分離器に供給する。このとき、中空糸型分離器の排出口(13、14)に連結した流路を第二のクランプ(ii、iii)で塞いでおくことにより、中空糸の内側の細胞が液Bで押し出され、中空糸型分離器(1)の入口(11)を通過して、回収バッグ(3)に貯留される。回収バッグ(3)に貯留された細胞懸濁液は、懸濁媒が液Aから液Bに置換されている。
 治療用細胞を調製する場合、懸濁液を含むバッグ(7)は、治療用細胞を含み、保存や輸送のために凍結されており、患者のいる医療施設において、投与前に解凍し、再度、細胞を培養し、活性化等の処理をする場合がある。このような場合、工程(1)の前に、保存液とともに凍結された細胞を含む細胞保存バッグに、培養液を無菌的に加える工程(0)を実施することができる。具体的には、懸濁液を含むバッグ(7)を培養・活性化のための溶液を含むバッグ(8)に無菌接続コネクタ(9a、9b)を利用して無菌的に接続し、培養・活性化のための溶液を懸濁液を含むバッグ(7)に導入する。
 本発明においては、液の入ったバッグを加圧することにより送液することができる。加圧に際しては、バッグに外から一定圧を加えることによって、液量を調整する器具を用いることができる。このような器具は、加圧バッグ、あるいはディスポ加圧バッグと呼ばれ、市販されている。市販の加圧バッグは通常、圧力メーターを備えており、加圧の程度を確認しながら送液を行うことができる。
<用途、その他>
 本発明は、懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液から液Aを無菌的に分離することに関するが、懸濁質の例は、研究、検査、治療、有用物質の生産等において好ましく用いられる有用細胞である。有用細胞は、特に限定されないが、具体的には、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、造血幹細胞、骨髄ストローマ細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、T細胞、B細胞、キラーT細胞(細胞障害性T細胞)、NK(Natural killer)細胞、NKT(Natural killer T)細胞、制御性T細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板など、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞または、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞を挙げることができる。
 本発明は、有用細胞のうち、特にヒトまたは非ヒト動物の疾患または状態の処置のために用いられる治療用細胞を処理するのに適している。治療用細胞の例として、樹状細胞、NK細胞、NKT細胞、活性化T細胞(ナイーブT細胞が抗原と遭遇して活性化された結果生じるエフェクターT細胞の機能的な亜群であるTh1細胞、Th2細胞、TFH細胞、Th17細胞、Treg細胞等を含む。)、およびCAR-T細胞(Chimeric antigen receptor-T cell)を挙げることができる。
 本発明により調製された、治療用細胞が適用可能な疾患または状態には、がん、感染症、自己免疫疾患、アレルギー等が含まれる。
 K562細胞(ヒト白血病細胞株)は、10%牛胎児血清(ニチレイバイオサイエンス, カタログ番号171012-500ML)および100ユニットのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン(ナカライテスク, カタログ番号26253-84)を含むRPMI1640培地(和光純薬工業、カタログ番号:189-02025)(以下、培地とする)で培養した。ノイバウェル計算盤(エルマ販売株式会社,カタログ番号03-202-1)を使用してK562細胞の細胞数をカウントし、107個のK562細胞を30 mLの培地に懸濁させて、細胞液を準備した。
 この細胞液(30 mL)を片側の導入口よりmicroza中空糸タイプペンシル型モジュール(旭化成ケミカルズ, ASA PMP-003、ポリエチレン製中空糸を使用、中空糸内径0.7mm、有効膜面積150cm2、公称孔径0.25μm)に50 mLシリンジ(テルモ、カタログ番号SS-50ESZ)を用いて導入した。この時、導入口と反対側の原水出口は、チューブ(サンゴバン株式会社, C-フレックス374-500-3、熱可塑性エラストマー製)を繋げクランプを使用して塞ぎ、濾水出口及び瀘水ドレイン口には、チューブ(サンゴバン株式会社, C-フレックス374-125-2)をつなげて、チューブの先は、排液入れに入れて、排液を回収した(図3上参照)。
 次に、濾水出口及び瀘水ドレイン口をクランプで塞ぎ、原水出口のチューブを取り除いた後、50 mLのラクトリンゲル液(扶桑薬品株式会社, JANコード4 987197 900152)を入れた50 mLシリンジを直接接続した。プランジャーを押し、ラクトリンゲル液を導入し、導入口からの溶出液を回収した(回収液1とする)(図3下参照)。回収液1中の細胞を0.4%トリパンブルー溶液(ライフテクノロジーズ, カタログ番号15250-061)を用いて2倍に希釈して、ノイバウェル計算盤を用いてカウントした。その結果、1.55x105 細胞数/mLが50 mL回収された(7.75 x 106細胞, 回収率:77.5%)。
 さらに50 mLのラクトリンゲル液を、50 mLシリンジを用いて原水出口側より導入し、導入口からの溶出液を回収した(回収液2とする)。回収液2の細胞数をノイバウェル計算盤を用いてカウントした。その結果、5.0 x104 細胞数/mLが50 mL回収された(2.50 x 106細胞, 回収率:25.0%)。
 回収液1と回収液2を合計すると約100%になり、導入した細胞全てが回収された。結果を下表および図4に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
1 中空糸型分離器
2 排液バッグ
3 回収バッグ
4 無菌接続コネクタ
5、6 液B入りバッグ
7 懸濁液入りバッグ
8 他の溶液(培養液)入りバッグ
11 入口
12 出口
13、14 排出口
i 第一のクランプ、
ii、iii 第二のクランプ
iv、v 三方活栓
A 器具からなる部分
B 懸濁液入りバッグからなる部分
C 他の溶液(培養液)入りバッグからなる部分

Claims (14)

  1. 懸濁媒である液Aと懸濁質を含む懸濁液から液Aを無菌的に分離するための、少なくとも以下を備える器具:
    ・懸濁液から液Aを分離するための中空糸型分離器であって、
     中空糸内側に通じる、懸濁液を通過させるための入口および出口、および
     中空糸外側に通じる、分離された液Aを排出するための少なくとも一つの排出口
    を備える、中空糸型分離器;
    ・中空糸型分離器の入口に連結された、懸濁液を含むバッグを非滅菌環境において無菌的に接続するための、無菌接続コネクタ;
    ・中空糸型分離器の排出口に連結された、分離された液Aを貯留するための排液バッグ;および
    ・中空糸型分離器の入口または出口に連結された、液Aが分離された懸濁質を貯留するための回収バッグ。
  2. さらに以下を備える、請求項1に記載の器具:
    ・中空糸型分離器の入口または出口に連結された、懸濁媒が分離された懸濁質を洗浄または回収するための液Bを含む、少なくとも1つの液B入りバッグ。
  3. 液B入りバッグを2つ備える、請求項2に記載の器具。
  4. 第一の液B入りバッグが中空糸型分離器の入口に連結されており、第二の液B入りバッグが中空糸型分離器の出口に連結されている、請求項2または3に記載の器具。
  5. さらに以下を備える、請求項1~4のいずれか1項に記載の器具:
    ・中空糸型分離器の出口を塞ぐための第一のクランプ、および
    ・中空糸型分離器の排出口を塞ぐための第二のクランプ。
  6. 懸濁質が細胞であり、液Aが培養液である細胞懸濁液から培養液を無菌的に分離するための器具であり;
    中空糸型分離器の中空糸が、細胞懸濁液が通過可能な内径、および細胞と培養液を分離可能な孔径を有するものである、請求項1~5のいずれか1項に記載の器具。
  7. 細胞が静脈投与される治療用細胞であり、細胞懸濁液の培養液を静脈投与に適した液に無菌的に置換するための器具であり;
    中空糸型分離器の入口に連結された第一の液B入りバッグ、および中空糸型分離器の出口に連結された第二の液B入りバッグを備え、液Bが静脈投与に適した液である、請求項6に記載の器具。
  8. 下記を含む、治療用細胞調製用キット:
    ・請求項7に記載の器具;および
    ・少なくとも一つの無菌接続コネクタを備える、保存液とともに有用細胞を含む、保存細胞入りバッグ。
  9. さらに下記を含む、請求項8に記載のキット:
    ・細胞培養液を含む、培養液入りバッグ。
  10. 有用細胞が、樹状細胞、NK細胞、NKT細胞、活性化T細胞、およびCAR-T細胞からなる群より選択されるいずれかである、請求項8または9に記載のキット。
  11. 以下の工程を含む、懸濁媒である液Aと有用細胞を含む懸濁液から、液Aが無菌的に分離された有用細胞を調製する方法:
    (1)請求項1~7のいずれか1項に記載された器具の無菌接続コネクタに、懸濁液が保持された懸濁液入りバッグを無菌接続し;
    (2)懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して液Aを分離し、このとき分離された液Aは排液バッグに貯留され、液Aが分離された有用細胞は中空糸の内側に残留し;
    (3)予め準備した液Bを、中空糸型分離器の出口から、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の有用細胞を押し出し、回収バッグに貯留する。
  12. 以下の工程を含む、細胞懸濁液から、治療用細胞を調製する方法:
    (1)請求項7に記載された器具の無菌接続コネクタに、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを無菌接続し;
    (2)細胞懸濁液を、中空糸型分離器の入口から、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して培養液を分離し、このとき分離された培養液は排液バッグに貯留され、培養液が分離された細胞は中空糸の内側に残留し;
    (3)第一の液B入りバッグから静脈投与に適した液を、出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側に残留する培養液が分離された細胞を洗浄し;
    (4)第二の液B入りバッグから静脈投与に適した液を、排出口が塞がれた中空糸型分離器に供給して中空糸内側の洗浄済細胞を押し出し、回収バッグに貯留し、治療用細胞を得る。
  13. 工程(1)の前に、さらに下記の工程を含む、請求項12に記載の調製方法:
    (0)保存液とともに凍結された細胞を含む細胞保存バッグに、培養液を無菌的に加えて、細胞懸濁液が保持された細胞懸濁液入りバッグを得る。
  14. 細胞が、樹状細胞、NK細胞、NKT細胞、活性化T細胞、およびCAR-T細胞からなる群より選択されるいずれかである、請求項13に記載の調製方法。
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