TWI741033B - 用以無菌處理懸濁液之器具、細胞製備用套組及細胞之製備方法 - Google Patents

用以無菌處理懸濁液之器具、細胞製備用套組及細胞之製備方法 Download PDF

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Abstract

本發明之課題在於提供一種用以自懸濁液中將懸濁介質無菌分離之方法。本發明提供一種至少具備以下之器具：中空纖維型分離器，其係用以自懸濁液中將液A分離者，且具備通向中空纖維內側且用以使懸濁液通過之入口及出口、及通向中空纖維外側且用以將分離所得之液A排出之至少一個排出口；無菌連接器，其係連結於中空纖維型分離器之入口，且用以將包含懸濁液之袋於非滅菌環境下無菌連接；排液袋，其係連結於中空纖維型分離器之排出口，且用以貯存分離所得之液A；及回收袋，其係連結於中空纖維型分離器之入口或出口，且用以貯存將液A分離所得之懸濁質媒。

Description

用以無菌處理懸濁液之器具、細胞製備用套組及細胞之製備方法
本發明係關於一種粒子分散於液體中之懸濁液之無菌處理、例如將細胞懸濁液之培養液無菌置換為其他液。本發明於生命科學、醫療、及治療用細胞之製造等領域起作用。
於製備用於藉由投予至患者而治療癌症等疾病之治療用細胞時，於大多數之情形時，首先需要從自活體採集之細胞群中僅將必要之細胞分離。又，所獲得之細胞通常經由用以於體外進行誘導、增生、活化等之培養步驟，但於向患者投予時，必須將源自培養液之成分去除。
專利文獻1係以提供自血液中不依據比重差篩選而使用抽吸操作於短時間內容易地將包含幹細胞之白血球成分濃縮之裝置作為課題而完成者，且著眼於紅血球之變形能力，提出將包含幹細胞之白血球成分濃縮之裝置，該裝置係利用使用具有微細孔之膜過濾器使紅血球或血漿等通過，將包含白血球之成分作為非過濾成分回收之方法。該裝置記述有如下主旨，即，可構成藉由血漿袋-白血球捕捉器-回收袋之路徑而利用血漿進行反洗將白血球回收之白血球區分回收系統迴路；及作為移送血液之機構將注射器設置於迴路中，將注射器用作驅動源，藉此可將裝置靜置使用，從而無需上下反轉等姿勢變更。
又，專利文獻2提出有一種細胞濃縮液之製造方法，該方法係作為以簡便之方法短時間內，不損耗細胞且不對細胞造成較大之損傷地製造細胞 濃縮液之方法，具備細胞懸濁液入口、濾液出口、細胞懸濁液出口、及配置於上述細胞懸濁液入口與上述細胞懸濁液出口之間之中空纖維型分離膜，且使用內壓過濾方式之細胞懸濁液處理器者，且上述中空纖維型分離膜之內側之孔之平均孔徑為0.1μm~10μm，且濾液之初期過濾速度除以流經中空纖維內之細胞懸濁液之線速度所得之值為2.5以下。而且，根據該方法，記述有可一面將懸濁液中之細胞以外之蛋白質等夾雜物去除，同時高效率地回收細胞，減少中空纖維中之細胞之堵塞，一面製造細胞濃縮液。而且，記述有因未使用成為細胞之負荷般之膜之反洗淨造成之堵塞之抑制方法等，故對細胞之損傷減少，從而細胞存活率增高，又，因可於無菌之封閉系統中進行處理，故可提供將經濃縮之細胞用於細胞治療。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2012-139112號公報(日本專利第5785713號)
[專利文獻2]國際公開WO2013/061859
為製備治療用之細胞，而不僅必須研究效率，而且必須研究確保品質及安全性。又，若無需特殊之設備，便可於一般之醫療設施之現場藉由簡便之操作而高效率地製備，則可期待可享受該醫療之患者數之飛躍性之增加。本發明者等人反覆進行與再生醫療等製品(細胞治療、基因治療)之製造相關之技術之研究、開發，確立了可實用之NK(natural killer，自然殺手)細胞GMP(GOOD MANUFACTURING PRACTICE，良好作業規範) 製造技術，發展了最終製劑設計。其中，實現了著眼於完全封閉系統下之操作之重要性。
高活性NK細胞係無法維持著其活性直接進行冷凍/解凍，故於冷凍之狀態下輸送之NK細胞於向患者投予之前，首先需要用以再活化之培養步驟。該培養步驟必須無菌進行。繼而，必須自所培養之細胞中將培養液成分去除，使所得之細胞以適當之細胞濃度再次懸浮於適合點滴投予之乳酸林格氏液等。培養液之去除係藉由利用離心分離技術使細胞於離心管中沈澱，將作為上清液之培養液去除而進行，但因必須無菌進行作業，故而必須於無塵室內實施，從而存在若非擁有特別之設備與熟練之技術者之設施，便無法製備用以投予至患者之細胞之問題。
只要可於完全封閉迴路中進行對經冷凍之細胞進行培養，又，於治療時自培養之細胞中將培養液去除，視需要進行洗淨或懸浮於點滴液中之操作，則不僅作為治療用細胞之安全性進一步提昇，而且亦可於一般之醫療設施般之非滅菌環境下進行應對。
又，只要具有不僅可將細胞培養液無菌處理，而且可將懸濁液無菌處理之簡易系統，則除了治療用細胞之製備以外，亦可期待應用於各種場合。
本發明者等人針對進行自包含細胞般之粒子之懸濁液中將懸濁介質無菌去除之處理之方法進行了努力研究。其結果，發現可藉由使用中空纖維型之過濾器，且使懸濁液通過中空纖維內，而自作為懸濁質之粒子中將作為懸濁介質之液體部分高效率地去除，又，使用此種中空纖維之系統係完全封閉系統，且可構成為亦無需用於送液之電動泵之適合實際使用之迴 路，從而完成了本發明。
本發明係提供以下者。
[1]一種器具，其係用以自包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液中將液A無菌分離，且至少具備以下：中空纖維型分離器，其係用以自懸濁液中將液A分離，且具備：通向中空纖維內側且用以使懸濁液通過之入口及出口、及通向中空纖維外側且用以將分離所得之液A排出之至少一個排出口；．無菌連接器，其係連結於中空纖維型分離器之入口，且用以將包含懸濁液之袋於非滅菌環境下進行無菌連接；．排液袋，其係連結於中空纖維型分離器之排出口，且用以貯存分離所得之液A；及．回收袋，其係連結於中空纖維型分離器之入口或出口，且用以貯存將液A分離所得之懸濁質。
[2]如1之器具，其更具備以下：．連結於中空纖維型分離器之入口或出口，且包含用以將懸濁介質被分離之懸濁質洗淨或回收之液B之至少1個裝有液B之袋。
[3]如2之器具，其具備2個裝有液B之袋。
[4]如2或3之器具，其中第一裝有液B之袋係連結於中空纖維型分離器之入口，且第二裝有液B之袋係連結於中空纖維型分離器之出口。
[5]如1至4中任一項之器具，其更具備以下：．第一夾具，其係用以阻塞中空纖維型分離器之出口；及．第二夾具，其係用以阻塞中空纖維型分離器之排出口。
[6]如1至5中任一項之器具，其係用以自懸濁質為細胞且液A為培養 液之細胞懸濁液中將培養液無菌分離之器具，且中空纖維型分離器之中空纖維具有細胞懸濁液可通過之內徑及可將細胞與培養液分離之孔徑。
[7]如6之器具，其中細胞係經靜脈投予之治療用細胞，該器具係用以將細胞懸濁液之培養液無菌置換為適合靜脈投予之液體之器具，該器具具備連結於中空纖維型分離器之入口之第一裝有液B之袋、及連結於中空纖維型分離器之出口之第二裝有液B之袋，且液B係適合靜脈投予之液體。
[8]一種治療用細胞製備用套組，其包含下述：‧如7之器具；及‧裝有保存細胞之袋，其具備至少一個無菌連接器，且包含保存液及有用細胞。
[9]如8之套組，其更包含下述：‧裝有培養液之袋，其包含細胞培養液。
[10]如8或9之套組，其中有用細胞係選自由樹狀細胞、NK細胞、NKT(natural killer T，自然殺手T)細胞、活化T細胞、及CAR-T細胞所組成之群中之任一種。
[11]一種包含以下之步驟之自包含作為懸濁介質之液A與有用細胞之懸濁液製備將液A無菌分離所得之有用細胞之方法，上述步驟係(1)將保持有懸濁液之裝有懸濁液之袋無菌連接於如1至7中任一項之器具之無菌連接器；(2)將懸濁液自中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將液A分離，此時分離所得之液A被貯存於排液袋，液A被 分離之有用細胞殘留於中空纖維之內側；(3)將預先準備之液B自中空纖維型分離器之出口供給至排出口被阻塞之中空纖維型分離器，將中空纖維內側之有用細胞擠出，且貯存於回收袋。
[12]一種包含以下之步驟之自細胞懸濁液製備治療用細胞之方法，上述步驟係(1)將保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋無菌連接於如7之器具之無菌連接器；(2)將細胞懸濁液自中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將培養液分離，此時分離所得之培養液被貯存至排液袋，培養液被分離之細胞殘留於中空纖維之內側；(3)自第一裝有液B之袋將適合靜脈投予之液體供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將殘留於中空纖維內側且培養液被分離之細胞洗淨；(4)自第二裝有液B之袋將適合靜脈投予之液體供給至排出口被阻塞之中空纖維型分離器，將中空纖維內側之已洗淨過之細胞擠出，且貯存於回收袋，獲得治療用細胞。
[13]如12之製備方法，其係於步驟(1)之前更包含下述步驟：(0)向包含與保存液一同地冷凍之細胞之細胞保存袋中無菌添加培養液，獲得保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋。
[14]如13之製備方法，其中細胞係選自由樹狀細胞、NK細胞、NKT細胞、活化T細胞、及CAR-T細胞所組成之群中之任一種。
根據本發明，即便於非滅菌環境下，亦可無菌地進行自懸濁液去除 懸濁介質、懸濁質之洗淨、懸濁質再次懸浮於其他懸濁介質等之處理。 又，根據本發明，不使用電動機械便可進行該處理。
1:中空纖維型分離器
2:排液袋
3:回收袋
4a:無菌連接器
4b:無菌連接器
5:裝有液B之袋
6:裝有液B之袋
7:裝有懸濁液之袋
8:裝有其他溶液(培養液)之袋
9a:無菌連接器
9b:無菌連接器
11:入口
12:出口
13:排出口
14:排出口
i:第一夾具
ii:第二夾具
iii:第二夾具
iv:三通活栓
v:三通活栓
A:包含器具之部分
B:包含裝有懸濁液之袋之部分
C:包含裝有其他溶液(培養液)之袋之部分
圖1係本發明之器具及套組之例。
圖2係本發明之器具進行之處理時之例。
圖3係表示細胞導入時及細胞回收時之圖。
圖4係回收率之圖表。
除了特別記載之情形以外，數值範圍「X~Y」包含兩端之數值X及Y。除了特別記載之情形以外，「A及/或B」意指A及B中之至少一者。製備方法可換言為製造方法。
<成為處理對象之懸濁液、懸濁質、懸濁介質(液A)>
可藉由本發明之器具而處理各種懸濁液。所謂懸濁液係指固體分散於液體中之狀態者，且包含懸濁質(固形之分散質)與懸濁介質(作為液體之分散介質)。分散亦可不均勻。
本發明之器具係用於自包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液中將液A無菌分離。懸濁質可能為各種種類、形狀及尺寸之粒子，並無特別限定，但本發明可較佳地應用於容許作為醫藥、化妝品或食品之粒子、例如用作DDS(drug delivery system，藥物遞送系統)之高分子微胞所形成之奈米粒子、用於化妝品之粉體、培養細胞、治療用細胞等。尤佳之例係浮游性之動物細胞(以下，有時將動物細胞簡稱為「細胞」)，進而較佳之例係用於人類或非人類動物中之疾病或狀態之處置(預防、治療等)之細胞(治療用細胞)。再者，以下，存在以本發明之器具為用以處理治療用細胞 者之情形為例，說明本發明及其實施態樣之情況，但只要為本技藝者，則可將該說明亦適當套用於其他情形而理解本發明。
作為懸濁介質之液A可為與懸濁質對應之各種種類之液體。於懸濁質為浮游性之細胞時，液A係例如用以保存細胞之液或培養液。用以保存細胞之液體之例係用以視需要保護細胞免受冷凍障礙之成分，例如包含DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)、甘油、血清等之培養液。培養液可對應於細胞之種類而自例如作為動物細胞培養用之基礎培養基而已知之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium，杜爾貝科改良伊格爾培養基)、EMEM(Eagle's minimal essential medium，伊格爾氏基本成分培養基)、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等之中適當選擇使用。培養液亦可包含用於細胞之增生、分化/誘導、活化之成分。此種成分中包含血清、細胞介素、增生因子、激素，具體而言為胰島素、運鐵蛋白、血清白蛋白、IL-2等。
懸濁液及液A之量可根據目的適當設定。於本發明之器具為用以處理治療用細胞者之情形時，存在懸濁液包含107~109級之數量之細胞之情形，且作為液量，可為10mL~1L。
<器具、套組>
本發明係提供一種器具，其用以自包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液中將液A無菌分離，且至少具備以下：．中空纖維型分離器，其係用以自懸濁液中將液A分離，且具備：通向中空纖維外側且用以將分離所得之液A排出之至少一個排出口、及通向中空纖維內側且用以使懸濁液通過之入口及出口； ．無菌連接器，其係連結於中空纖維型分離器之入口，且用以將包含懸濁液之袋於非滅菌環境下無菌連接；．排液袋，其係連結於中空纖維型分離器之排出口，且用以貯存分離所得之液A；及．回收袋，其係連結於中空纖維型分離器之入口或出口，且用以貯存液A被分離之懸濁質。
又，本發明係提供一種包含下述A部及B部之治療用細胞製備用之套組：
A部：包含本發明之器具之部分
B部：包含裝有細胞懸濁液之袋(7)之部分，該裝有細胞懸濁液之袋(7)具備至少一個無菌連接器(4a、9a)，且包含保存液或培養液、及有用細胞。
套組可更包含下述C部。
C部：含有細胞培養液之包含裝有培養液之袋(8)之部分。
將本發明之器具及套組之例示於圖1。本發明之器具(A部)至少包含中空纖維型分離器(1)、連結於中空纖維型分離器之排出口之排液袋(2)、連結於中空纖維型分離器之入口或出口之回收袋(3)、及連結於中空纖維型分離器之入口之無菌連接器(4b)，但於圖1所示之態樣中，更具備連結於中空纖維型分離器(1)之出口(12)之裝有液B之袋(5)、及連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)之裝有液B之袋(6)。於圖1中另外示出作為B部之具備無菌連接器(4a、9a)之裝有懸濁液之袋(7)、及作為C部之具備無菌連接器(9b)且裝有用以添加至裝有懸濁液之袋(7)中之液體之袋(8)。以下，視需要參照圖1，於括號內引用圖1中所示之符號，同時對本發明及其實施 態樣進行說明。
[中空纖維型分離器]
本發明之器具具備中空纖維型分離器(1)。所謂中空纖維型分離器係指使用中空纖維型分離膜(有時亦簡稱為中空纖維。吸管狀且壁面具有無數孔之膜)，且用於進行分離或基於分離能力之濃縮、分子篩、透析、液體更換等之目的。典型而言，中空纖維型分離器係示於圖3之上圖及下圖之中央者。中空纖維型分離器包含筆直之主體部及其兩側之集管部，集管部具備通向中空纖維內側之入口(11)及出口(12)，主體部具備通向中空纖維外側之至少一個排出口(13、14)。如業者所熟知，本發明中之中空纖維型分離器之主體部於內部填充有將數十根至數千根左右之中空纖維集束而成者，且具備將束固定於容器內部並且形成中空纖維之開口端之樹脂層部。因此，成為通向中空纖維內側之入口及出口與排出口被中空纖維型分離膜隔開之結構。
於本發明中，懸濁液流經中空纖維型分離器之中空纖維內側，懸濁介質(液A)被過濾至中空纖維之外側，自懸濁質中將懸濁介質去除。藉由以如上方式使用中空纖維型分離器，膜面上之懸濁液之流速極快，又，因交叉流(亦稱為切向流)效應，懸濁質不易附著於膜面。因此，無需較高之壓力負擔便可將懸濁介質迅速去除，從而對懸濁質之損傷較少，且可將懸濁質濃縮至高濃度。
中空纖維型分離器中使用之中空纖維具有懸濁質可通過之內徑、及可將懸濁質與懸濁介質(液A)分離之孔徑。於懸濁質為細胞之情形時，內徑可設為0.03mm以上，較佳為0.1mm以上，更佳為0.3mm以上。內徑之上限值並無特別限定，但根據因較多地存在直徑較小之中空纖維，用於處 理之膜面積增大，從而可有效率地進行分離之觀點，例如可使用2mm以下者，較佳為使用1mm以下者。
於懸濁質為細胞之情形時，孔徑(有時亦稱為孔隙尺寸)小於細胞即可。例如，可設為0.05μm以上且10μm以下，較佳為0.1μm以上且5μm以下，更佳為0.15μm以上且1μm以下。若孔徑過小，則無法獲得充分之過濾速度。又，若超過10μm，則存在因進行處理之細胞進入孔導致細胞之回收率降低之可能性。
中空纖維之孔徑只要為可適當地處理設為對象之細胞之尺寸、即可不使細胞通過地過濾懸濁液(液A)之尺寸即可，因此，於使用現有者作為中空纖維型分離器之情形時，選擇被稱為微流(MF)型之使用孔徑相對較大之中空纖維者、或被稱為超流(UF)型之使用具有分子區分能力之中空纖維中之孔徑相對較大(區分分子量相對較大)之中空纖維者即可。於選擇UF型之情形時，選擇區分分子量足夠使被認為欲去除之成分(例如培養液成分、用於細胞之增生、分化/誘導、活化之胰島素、運鐵蛋白、血清白蛋白、IL-2成分)通過之大小者即可。於使用現有者作為中空纖維型分離器之情形時，製造者可基於所顯示之標稱之孔徑尺寸而選擇。或者，作為中空纖維之孔徑，亦可將使掃描型電子顯微鏡觀察中測量之20個孔之直徑(於橢圓之情形時為長徑)平均所得者作為基準。
根據可有效率地進行充分之處理之觀點，較佳為可將需要進行處理之懸濁液中包含之懸濁質全部儲存於中空纖維型分離器之中空纖維之內側。於本發明之器具為用以處理治療用細胞者之情形時，認為1次處理之細胞數為~2×109個，因此，選擇具有可儲存該量之中空纖維內側總容積之中空纖維型分離器即可。中空纖維內側總容積可利用下述式計 算。
中空纖維內側總容積(mL或cm3)=[中空纖維內徑(cm)/2]2×π×中空纖維長度(cm)×中空纖維根數(根)
中空纖維型分離器存在顯示膜面積作為表示其處理量之指標之情形。中空纖維型分離膜之膜面積通常藉由下述式計算。
膜面積(cm2)=中空纖維內徑(cm)×π×中空纖維長度(cm)×纖維根數
根據本發明者等人之研究，可藉由使用內徑0.7mm、孔徑0.25μm之中空纖維且膜面積為150cm2之中空纖維型分離器，而較佳地進行1×107個細胞之處理。又，該中空纖維型分離器之中空纖維內側總容積經計算約為2.6mL，因此若可藉由將培養液分離而將細胞密度濃縮至8×108個/mL左右，則可於中空纖維內部儲存2.0×109個左右之細胞。
因此，為了處理1×107~2×109個細胞，而可藉由使用膜面積為10cm2~20,000cm2之中空纖維型分離器較佳地處理。可藉由使用膜面積一定程度較大之分離器，而達成充分之分離，另一方面，可藉由使用膜面積為固定值以下之分離器，而抑制細胞之回收率之低下或成本。
只要可進行目標之分離，則中空纖維之素材並無特別限定，但較佳為可耐受滅菌之素材。又，於用於治療用之細胞之處理之情形時，較佳為容許作為醫療用具之素材。具體而言，較佳為聚烯烴系或聚碸系之高分子材料，進一步確定，則更佳為聚乙烯(PE)、聚碸(PS)、聚醚碸(PES)、改質聚醚碸(mPES)、混合纖維素酯(ME)。
再者，關於本發明，於所謂滅菌時，方法並無特別限定，可例示高壓蒸氣滅菌器或煮沸之類之熱滅菌、氧化乙烯氣體或過氧化氫氣體之類滅菌性氣體之氣體滅菌、紫外線、γ射線或電子束等之照射滅菌。較佳為容 許作為醫療用具之滅菌方法者。
中空纖維型分離器之主體部及集管部之素材只要可進行目標之分離，則並無特別限定，但較佳為如可目視確認分離般之透明且耐受滅菌之素材。具體而言，較佳為聚碸、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚醯亞胺、聚碳酸酯、聚甲基戊烯或聚苯乙烯等嵌段共聚物。固定中空纖維型分離膜之樹脂層部之素材亦只要可進行目標之分離，則並無特別限定，但較佳為耐受滅菌之素材。具體而言，較佳為聚胺基甲酸酯樹脂、環氧樹脂或聚矽氧樹脂。
可藉由中空纖維型分離器而自包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液中將液A分離。於本發明之器具為用以處理治療用細胞者之情形時，液A通常為包含用於細胞之增生、分化/誘導、活化之成分之培養液，但此種成分較佳為於對患者投予時被充分地去除。於本發明中，可藉由使用中空纖維型分離器，而將此種成分自治療用細胞充分地去除。
[袋]
本發明之器具具備連結於中空纖維型分離器(1)之排出口(13、14)且用以貯存分離所得之液A之排液袋(2)、及連結於中空纖維型分離器之入口(11)或出口(12)且用以貯存液A被分離之懸濁質之回收袋(3)。回收袋(3)於本發明之器具為用於處理藉由點滴而靜脈投予之治療用細胞者之情形時，可設為適合點滴者(點滴用袋)。
回收袋(3)係連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)或出口(12)，但較佳為隔著中空纖維型分離器(1)連結於與下述1個裝有液B之袋(5)相反之側。即，較佳為於回收袋(3)連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)之情形時，至少1個裝有液B之袋(5)連結於中空纖維型分離器(1)之出口(12)， 且於回收袋(3)連結於中空纖維型分離器(1)之出口(12)之情形時，至少1個裝有液B之袋(5)連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)。其原因在於可藉由設為此種構成而以液B將中空纖維型分離器(1)內之液A被分離之懸濁質擠出之方式將懸濁質貯存於回收用袋(3)中。又，回收袋(3)較佳為經由三通活栓(iv)等可切換流路之連接部而連結。
本發明之器具除排液袋(2)及回收袋(3)以外，亦可具備連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)或出口(12)且包含用以將懸濁介質被分離之懸濁質洗淨或回收之液B之至少1個(例如2個)裝有液B之袋(5、6)。或者，亦可具備用以將裝有液B之袋容易地連接之至少1個(例如2個)連接器。連接器可設為用以於非滅菌環境下無菌連接之無菌連接器。將中空纖維型分離器(1)、排液袋(2)、及回收袋(3)連結而成之部分與裝有液B之袋(5、6)可於藉由各自適合之滅菌機構而個別地滅菌後無菌連接。
液B係用以將懸濁質洗淨及/或用以與液A置換使懸濁質再次懸濁之液體。作為液B，可根據目的選擇各種液體，但於本發明之器具為用以處理治療用細胞者之情形時，作為用於細胞之洗淨之液B，可使用具有緩衝效果之磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline；PBS)、三羥甲基胺基甲烷緩衝生理鹽水(Tris Buffered Saline；TBS)、HEPES緩衝生理鹽水(HEPES Buffered Saline)、生理鹽水、林格氏液(乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氫鹽林格氏液等)、5%葡萄糖水溶液等。為了進行點滴而要使細胞再次懸濁時，使用點滴所允許之液體。此種液體之例為林格氏液(乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氫鹽林格氏液等)、生理鹽水、5%葡萄糖水溶液等。
液B之量可根據洗淨、用於點滴之再次懸濁等液B之使用目的而適當 設定，但通常為中空纖維型分離器中經處理之懸濁液或液A之0.5~4倍左右。
於較佳之態樣中，具備2個以上之裝有液B之袋(5、6)，且將至少1個連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)，將至少1個連結於出口(12)，將其中一個用於懸濁質之洗淨，將另一者用於回收及再次懸濁。可藉由將用於洗淨之液B與用於回收、再次懸濁之液B分開，而以充分之量進行洗淨，又，可於使懸濁質再次懸浮於準確量之液B中之狀態下進行回收。又，藉由此種構成，而以反方向進行用於洗淨之送液與用於回收之送液，從而可期待回收率提昇，此外，可於器具整體中減少管之連接部位，從而具有器具之製造上之優勢。連結於中空纖維型分離器之入口側之裝有液B之袋(6)較佳為經由三通活栓(v)等可切換流路之連接部而連結。
各個袋之個數、類型(type)及容量並無特別限定，可根據進行分離之液A之量、被貯存之懸濁質之量、所需之液B之量等而適當設定。例如，可使用枕型袋、柱形槽型袋、集裝箱型袋、方型槽型袋等，且可適當使用50mL、100mL、200mL、300mL、500mL、1L、5L、10L、20L、50L等容量者。為處理治療用細胞，排液袋(2)可選擇50mL~5L之容量者，且回收袋(3)可選擇適合點滴之容量、例如50mL~1L左右之容量者。又，裝有液B之袋(5、6)例如可選擇50mL~1L左右之容量者。
袋之素材若為可對袋施加壓力使之變形，將內容物擠出之軟質樹脂材料，則並無特別限定，但較佳為如可目視確認液體之移動或貯存般為透明或半透明且耐受滅菌之素材。具體而言，可例示聚乙烯、聚丙烯、聚丁二烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、乙烯-乙烯醇共聚合樹脂(EVOH)、聚氯乙烯(氯乙烯)等。又，考慮到環境，袋之素材更佳為非鹵素系素材且 未使用塑化劑DEHP者。於本發明之器具為用以處理治療用細胞者之情形時，袋之素材較佳為作為醫療用具而被認可者。
[無菌連接器]
本發明之器具具備連結於中空纖維型分離器(1)之入口(11)且用以將包含懸濁液之袋於非滅菌環境下無菌連接之無菌連接器(4b)。所謂非滅菌環境係指並非如無塵室般之特別之設施內之通常開放之環境、例如醫院或個人診所之診察室、病房、研究室、家庭等。
無菌連接器(4b)係指無需如無菌連接裝置般之特別之機械便可將2個管不使管內曝露於外部氛圍地連接者，且可利用市售者。無菌連接器(4b)例如可為如Pall公司之Medlock連接器及Kleenpak(註冊商標)連接器、Sartorius Stedim Biotech公司之Opta(註冊商標)STF-I連接器、Millipore公司之Lynx(註冊商標)ST連接器、Colder Products公司之AseptiQuik(註冊商標)連接器之類包含2個零件之無菌連接器之其中一者。
無菌連接器(4b)若可進行目標之連接，則並無特別限定，但較佳為適合袋等其他零件且耐受滅菌之素材。無菌連接器(4b)之素材例如可設為聚碳酸酯、聚矽氧橡膠、聚乙烯、聚醚碸。
[管]
於本發明之器具中，中空纖維型分離器、各袋、及無菌連接器等零件係液密(不漏水之狀態)地連結，且連結中可使用管。
管之素材若為可將中空纖維型分離器、袋、連接器液密地連結之軟質樹脂材料，則並無特別限定，但可視需要而與該等素材一同地進行滅菌，且較佳為如可目視確認液體之移動般為透明或半透明。具體而言，可列舉：聚乙烯、聚丙烯、乙烯-丙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物 (EVA)等聚烯烴；聚苯乙烯、聚醯胺、聚醯亞胺、聚-(4-甲基戊烯-1)、離子聚合物、丙烯酸系樹脂、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)等聚酯、苯乙烯系、聚烯烴系、聚氯乙烯系、聚胺基甲酸酯系、聚酯系、聚醯胺系等各種熱塑性彈性體、聚矽氧樹脂、聚胺基甲酸酯等或以該等為主之共聚物、摻合物、聚合物合金。
[其他零件]
本發明之器具除上述中空纖維型分離器、袋、及無菌連接器以外，亦可視需要而具備各種構件。例如，夾具、取樣埠、活栓、克雷弗連接器等。
於較佳之態樣中，具備用以將中空纖維型分離器(1)之出口(12)阻塞之第一夾具(i)、及用以將中空纖維型分離器之排出口阻塞之第二夾具(ii、iii)。第二夾具(ii、iii)係於具有複數個排出口之情形時，為阻塞各個排出口而可具備複數個。又，為切換流路或使流路分支，本發明之器具亦可於適當之場所具備三方活性(iv、v)。
[B部]
包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液於藉由本發明之器具進行處理之前，可設為收納於袋(7)中之形態。由本發明提供之套組除包含上述器具之A部以外，亦包含包括袋(7)之部分作為B部，該袋(7)包含此種懸濁液。包含懸濁液之袋(7)較佳為具備用以無菌連接於本發明之器具之無菌連接器(4a)。又，包含懸濁液之袋(7)亦可具備用以無菌連接於包含其他溶液之袋(8)之另外之無菌連接器(9a)。
[C部]
本發明之套組亦可含有包含其他溶液之袋(8)。包含其他溶液之袋(8) 較佳為具備用以無菌連接於包含懸濁液之袋(7)之無菌連接器(9b)。於本發明之器具係於用以處理治療用細胞者之情形時，袋(8)中包含之其他溶液之例為包含用以培養治療用細胞使之活化之成分之液體，具體而言，該例為上述培養液中包含用於細胞之增生、分化/誘導、活化之成分(例如血清、細胞介素、增生因子、激素、具體而言胰島素、運鐵蛋白、血清白蛋白、IL-2等)者。
於套組中，為分割成A部、B部及C部，可直至將要使用之前將各者保持適當溫度。例如，A部可常溫保存，B部可冷凍保存，及C部可冷藏保存。
又，套組係除A部、B部及C部以外，亦可包含其他部分。例如，亦可包含記錄A部、B部及C部之連接方法、使用順序、注意事項等資訊之媒體。
<有用細胞之製備方法>
又，本發明提供一種包含以下步驟之自包含作為懸濁介質之液A與有用細胞之懸濁液製備將液A無菌分離所得之有用細胞之方法，上述步驟係‧自中空纖維型分離器(具備通向中空纖維內側且用以使懸濁液通過之入口及出口、及通向中空纖維外側且用以將分離所得之液A排出之至少一個排出口)之入口，將懸濁液供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將液A分離，使分離所得之液A自排出口排出，使液A被分離之有用細胞殘留於中空纖維之內側；‧將預先準備之液B自中空纖維型分離器之出口供給至排出口被阻塞之中空纖維型分離器，將殘留於中空纖維內側之有用細胞擠出，回收有用細胞。
或者，本發明提供一種包含以下步驟之自包含作為懸濁介質之液A與有用細胞之懸濁液製備將液A無菌分離所得之有用細胞之方法，上述步驟係(1)將保持有懸濁液之裝有懸濁液之袋無菌連接於上述本發明之器具之無菌連接器；(2)將懸濁液自中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將液A分離，此時分離所得之液A被貯存於排液袋，液A被分離之有用細胞殘留於中空纖維之內側；(3)將預先準備之液B自中空纖維型分離器之出口供給至排出口被阻塞之中空纖維型分離器，將中空纖維內側之有用細胞擠出貯存於回收袋中。
有用細胞之例係用於人或非人動物中之疾病或狀態之治療(預防、治療等)之細胞(治療用細胞)。即，本申請案亦提供一種包含以下步驟(1)~(3)之自細胞懸濁液製備治療用細胞之方法，上述步驟(1)~(3)係(1)將保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋無菌連接於上述本發明之器具之無菌連接器；(2-1)將細胞懸濁液自中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將培養液分離，此時分離所得之培養液被貯存於排液袋，且培養液被分離之細胞殘留於中空纖維之內側；(2-2)自第一裝有液B之袋將適合靜脈投予之液體供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將殘留於中空纖維內側且培養液被分離之細胞洗淨；(3)自第二裝有液B之袋將適合靜脈投予之液體供給至排出口被阻塞 之中空纖維型分離器，將中空纖維內側之已洗淨過之細胞擠出且貯存於回收袋，獲得治療用細胞。
可於步驟(1)之前更包含下述步驟：(0)向包含與保存液一同地冷凍之細胞之細胞保存袋無菌添加培養液，獲得保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋。
於圖2中示出實施本發明之有用細胞之製備方法時之本發明之器具之使用時之例。以下，視需要參照圖2，於括弧內引用圖2中所示之符號，同時對本發明及其實施態樣進行說明。
步驟(1)係將保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋無菌連接於本發明之器具之無菌連接器之步驟。具體而言，利用無菌連接器(4a)將裝有細胞懸濁液之袋(7)與具備無菌連接器(4b)之器具連結，開始器具之處理。
步驟(2)係將細胞懸濁液自中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之中空纖維型分離器，將培養液分離之步驟。具體而言，於適當設定有三通活栓(iv、v)之狀態下，對裝有細胞懸濁液之袋(7)進行加壓，將懸濁液自中空纖維型分離器之入口(11)供給至中空纖維型分離器。此時，利用第一夾具(i)預先將連結於中空纖維型分離器之出口(12)之流路阻塞，藉此使作為懸濁介質之液A之至少一部分通過中空纖維膜，流經中空纖維型分離器(1)之排出口(13、14)貯存於排液袋(2)。另一方面，液A之至少一部分被分離之細胞殘留於中空纖維之內側。
亦可於步驟(2)之後且步驟(3)之前實施用於細胞之洗淨之步驟。具體而言，切換三通活栓(iv)，對裝有液B之袋(6)進行加壓，將液B自中空纖維型分離器之入口(11)供給至中空纖維型分離器，藉此，利用液B將殘留於中空纖維之內側之細胞洗淨。液B係通過中空纖維膜，流經中空纖維型 分離器(1)之排出口(13、14)貯存於排液袋(2)。
步驟(3)係將液B自中空纖維型分離器之出口供給至排出口被阻塞之中空纖維型分離器，將中空纖維內側之有用細胞擠出，貯存於回收袋之步驟。具體而言，解除第一夾具(i)，切換三通活栓(v)，對裝有液B之袋(5)進行加壓，將液B自中空纖維型分離器之出口(12)供給至中空纖維型分離器。此時，利用第二夾具(ii、iii)預先將連結於中空纖維型分離器之排出口(13、14)之流路阻塞，藉此利用液B將中空纖維之內側之細胞擠出，使之通過中空纖維型分離器(1)之入口(11)貯存於回收袋(3)。貯存於回收袋(3)之細胞懸濁液係懸濁介質自液A置換為液B。
於製備治療用細胞之情形時，存在包含懸濁液之袋(7)包含治療用細胞，且為保存或輸送而冷凍，於存在患者之醫療設施，於投予前解凍，再次培養細胞進行活化等處理之情形。於此種情形時，可於步驟(1)之前實施向包含與保存液一同地冷凍之細胞之細胞保存袋無菌添加培養液之步驟(0)。具體而言，利用無菌連接器(9a、9b)將包含懸濁液之袋(7)無菌連接於包含用於培養/活化之溶液之袋(8)，將用於培養/活化之溶液導入至包含懸濁液之袋(7)。
於本發明中，可將裝有液體之袋藉由進行加壓而送液。於加壓時，可使用藉由自外部對袋施加固定壓力而調整液量之器具。此種器具被稱為加壓袋或者一次性加壓袋，且市售。市售之加壓袋通常具備壓力計，可一面確認加壓之程度，一面進行送液。
<用途、其他>
本發明係關於一種自包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液將液A無菌分離之技術，而懸濁質之例係較佳地用於研究、檢查、治療、有用 物質之生產等之有用細胞。有用細胞並無特別限定，但具體而言，可列舉：誘導性多能幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)、造血幹細胞、骨髄基質細胞、間葉系幹細胞、脂肪源性間葉系細胞、脂肪源性間質幹細胞、多能性成體幹細胞、T細胞、B細胞、殺手T細胞(細胞障礙性T細胞)、NK(Natural killer)細胞、NKT(Natural killer T)細胞、控制性T細胞等淋巴球系之細胞；巨噬細胞、單核球、樹狀細胞、顆粒球、紅血球、血小板等神經細胞、肌細胞、纖維芽細胞、肝細胞、心肌細胞等體細胞或經基因之導入或分化等處理之細胞。
本發明適合處理有用細胞之中尤其用於人或非人動物之疾病或狀態之治療之治療用細胞。作為治療用細胞之例，可列舉樹狀細胞、NK細胞、NKT細胞、活化T細胞(包含產生初始T細胞遇到抗原而被活化之結果之效應T細胞之功能性之亞族群即Th1細胞、Th2細胞、TFH細胞、Th17細胞、Treg細胞等)及CAR-T細胞(Chimeric antigen receptor-T cell，嵌合抗原受體T細胞)。
藉由本發明製備而成之治療用細胞可應用之疾病或狀態中包含癌症、感染症、自我免疫疾病、過敏等。
[實施例]
將K562細胞(人類白血病細胞株)於包含10%胎牛血清(Nichirei Biosciences，目錄編號171012-500ML)及100組青黴素、100μg/mL之鏈黴素(Nacalai Tesque，目錄編號26253-84)之RPMI1640培養基(和光純藥工業，目錄編號：189-02025)(以下，設為培養基)中進行培養。使用Neubauer計數器(Erma銷售股份有限公司，目錄編號03-202-1)對K562細胞之細胞數進行計數，使107個K562細胞懸浮於30mL之培養基中，準備 細胞液。
使用50mL注射器(TERUMO，目錄編號SS-50ESZ)，將該細胞液(30mL)自單側之導入口導入至microza中空纖維型鉛筆型模組(旭化成化學，ASAPMP-003，使用聚乙烯製中空纖維，中空纖維內徑0.7mm，有效膜面積150cm2，標稱孔徑0.25μm)。此時，將與導入口為相反側之原水出口連接於管(聖戈班股份有限公司，C-Flex374-500-3，熱塑性彈性體製)，使用夾具將該管阻塞，將管(聖戈班股份有限公司，C-Flex374-125-2)連接於濾水出口及濾水排放口，將管之前端置於排液容器中，回收排液(參照圖3上)。
繼而，利用夾具阻塞濾水出口及濾水排放口，將原水出口之管卸除後，直接連接裝有50mL之乳酸林格氏液(扶桑藥品股份有限公司，JAN編碼4987197900152)之50mL注射器。按壓柱塞，導出乳酸林格氏液，回收來自導入口之溶出液(設為回收液1)(參照圖3下)。使用0.4%錐蟲藍溶液(Life Technologies，目錄編號15250-061)將回收液1中之細胞稀釋成2倍，使用Neubauer計數器進行計數。其結果為，已回收50mL之1.55×105細胞數/mL(7.75×106細胞，回收率：77.5%)。
進而，使用50mL注射器自原水出口側導入50mL之乳酸林格氏液，將來自導入口之溶出液(設為回收液2)回收。使用Neubauer計數器對回收液2之細胞數進行計數。其結果為，回收到50mL之5.0×104細胞數/mL(2.50×106細胞，回收率：25.0%)。
將回收液1與回收液2累加求和，則成為約100%，所導入之細胞全部被回收。將結果示於下表及圖4。
[表1]
Figure 106132756-A0305-02-0026-1
1:中空纖維型分離器
2:排液袋
3:回收袋
4a:無菌連接器
4b:無菌連接器
5:裝有液B之袋
6:裝有液B之袋
7:裝有懸濁液之袋
8:裝有其他溶液(培養液)之袋
9a:無菌連接器
9b:無菌連接器
11:入口
12:出口
13:排出口
14:排出口
i:第一夾具
ii:第二夾具
iii:第二夾具
iv:三通活栓
v:三通活栓
A:包含器具之部分
B:包含裝有懸濁液之袋之部分
C:包含裝有其他溶液(培養液)之袋之部分

Claims (10)

  1. 一種器具，其係用以自包含作為懸濁介質之液A與懸濁質之懸濁液中將液A無菌分離，且至少具備以下：中空纖維型分離器，其係用以自懸濁液中將液A分離，且具備：通向中空纖維內側且用以使懸濁液通過之入口及出口、及通向中空纖維外側且用以將分離所得之液A排出之至少一個排出口；無菌連接器，其係連結於上述中空纖維型分離器之入口，且用以將包含懸濁液之袋於非滅菌環境下進行無菌連接；排液袋，其係連結於上述中空纖維型分離器之排出口，且用以貯存分離所得之液A；及回收袋，其係連結於上述中空纖維型分離器之入口或出口，且用以貯存將液A分離所得之懸濁質；該器具係用以將懸濁質為靜脈投予之治療用細胞、且液A為培養液之細胞懸濁液之培養液無菌置換為適合靜脈投予之液體之器具；上述中空纖維型分離器之中空纖維具有細胞懸濁液可通過之內徑及可將細胞與培養液分離之孔徑；該器具係具備連結於上述中空纖維型分離器之入口之第一裝有液B之袋、及連結於上述中空纖維型分離器之出口之第二裝有液B之袋，且液B係用以將液A被分離之治療用細胞洗淨或回收之適合靜脈投予之液體。
  2. 如請求項1之器具，其更具備以下：第一夾具，其係用以阻塞上述中空纖維型分離器之出口；及 第二夾具，其係用以阻塞上述中空纖維型分離器之排出口。
  3. 一種治療用細胞製備用套組，其包含下述：如請求項1或2之器具；及裝有保存細胞之袋，其具備至少一個無菌連接器，且包含保存液及有用細胞。
  4. 如請求項3之套組，其更包含下述：包含細胞培養液之裝有培養液之袋。
  5. 如請求項3之套組，其中有用細胞係選自由樹狀細胞、NK細胞、NKT細胞、活化T細胞、及CAR-T細胞所組成之群中之任一種。
  6. 如請求項4之套組，其中有用細胞係選自由樹狀細胞、NK細胞、NKT細胞、活化T細胞、及CAR-T細胞所組成之群中之任一種。
  7. 一種包含以下之步驟之自包含作為懸濁介質之液A與有用細胞之懸濁液製備將液A無菌分離所得之有用細胞之方法，上述步驟係(1)將保持有懸濁液之裝有懸濁液之袋無菌連接於如請求項1或2之器具之無菌連接器；(2)將懸濁液自上述中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之上述中空纖維型分離器，將液A分離，此時分離所得之液A被貯存於排液袋，且液A被分離之有用細胞殘留於中空纖維之內側； (3)將預先準備之液B自上述中空纖維型分離器之出口供給至排出口被阻塞之上述中空纖維型分離器，將中空纖維內側之有用細胞擠出，且貯存於回收袋。
  8. 一種包含以下之步驟之自細胞懸濁液製備治療用細胞之方法，上述步驟係：(1)將保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋無菌連接於如請求項1或2之器具之無菌連接器；(2)將細胞懸濁液自上述中空纖維型分離器之入口供給至出口被阻塞之上述中空纖維型分離器，將培養液分離，此時分離所得之培養液被貯存於排液袋，且培養液被分離之細胞殘留於中空纖維之內側；(3)自第一裝有液B之袋將適合靜脈投予之液體供給至出口被阻塞之上述中空纖維型分離器，將殘留於中空纖維內側且培養液被分離之細胞洗淨；(4)自第二裝有液B之袋將適合靜脈投予之液體供給至排出口被阻塞之上述中空纖維型分離器，將上述中空纖維內側之已洗淨過之細胞擠出，且貯存於回收袋，獲得治療用細胞。
  9. 如請求項8之製備方法，其係於步驟(1)之前更包含下述步驟：(0)向包含與保存液一同地冷凍之細胞之細胞保存袋中無菌添加培養液，獲得保持有細胞懸濁液之裝有細胞懸濁液之袋。
  10. 如請求項9之製備方法，其中細胞係選自由樹狀細胞、NK細胞、NKT細胞、活化T細胞、及CAR-T細胞所組成之群中之任一種。
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