JP6685231B2 - 中空糸膜モジュールのプライミング方法 - Google Patents
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Description
また、本発明の他の目的は、前記プライミング方法を施した中空糸膜モジュールを用いて、細胞懸濁液から細胞濃縮液を短時間で効率よく製造する方法を提供することにある。
(1)導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法であって、
前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度35cm/分以上450cm/分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して15%以上充填する工程
を含むプライミング方法。
(2)プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が7mmHg以上29mmHg以下である前記(1)に記載のプライミング方法。
(3)前記内圧が陰圧である前記(2)に記載のプライミング方法。
(4)前記線速度が35cm/分以上300cm/分以下である前記(1)〜(3)のいずれかに記載のプライミング方法。
(5)プライミング液を前記中空糸膜モジュールの容積に対して70%以上充填する前記(1)〜(4)のいずれかに記載のプライミング方法。
(6)前記中空糸膜の内側にプライミング液を導入する前記(1)〜(5)のいずれかに記載のプライミング方法。
(7)前記導入口および前記導出口が前記中空糸膜の内側を通じて連通している前記(1)〜(6)のいずれかに記載のプライミング方法。
(8)中空糸膜の孔径が0.1μm以上1.0μm以下である前記(1)〜(7)のいずれかに記載のプライミング方法。
(9)前記プライミング液が、生理食塩液、輸液、血清または培地からなる群より選ばれる1種以上である前記(1)〜(8)のいずれかに記載のプライミング方法。
(10)前記(1)〜(9)のいずれかに記載のプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を中空糸膜モジュールの導出入口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。
(11)前記濾液排出口を少なくとも1つ以上備えた中空糸膜モジュールを用いる前記(10)に記載の細胞濃縮液の製造方法。
(12)細胞懸濁液を線速度500cm/分以上2000cm/分以下で中空糸膜モジュールの導出入口より導入する前記(10)または(11)に記載の細胞濃縮液の製造方法。
(13)細胞懸濁液を濾過速度1500mL/m2/分以上3750mL/m2/分以下で濾液出口より導出する前記(12)に記載の細胞濃縮液の製造方法。
ただし、以降の説明では、プライミング液を中空糸膜モジュールに導入するための口を「導入口」、プライミング液を中空糸膜モジュールから導出するための口を「導出口」として説明する。
なお、前記中空糸膜モジュールBは、濾液排出口4’を設け、かつ導出口8b側にポンプ11aおよび圧力計14aを設けるかわりに、導入口8a側の回路16にポンプ11a’および圧力計14a’を設けた以外は、前記中空糸膜モジュールAと同じ構成を有する。したがって、中空糸膜モジュールBの構成について、中空糸膜モジュールAと共通の構成については、特に必要がない限り説明を省略する。
前記孔径の上限は、1.5μm以下が好ましく、1.2μm以下がより好ましく、1.0μm以下がさらに好ましい。
前記中空糸膜の孔径は、中空糸膜の平均孔径を指し、一般的にパームポロメーターにより測定、算出される。
なお、前記中空糸膜の内側に形成される内径については、細胞懸濁液を通液できる大きさがあればよく、特に限定はない。
なお、有効濾過面積とは、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜内側の膜面積であり、本発明では、以下の式1:
(有効濾過面積(cm2))=π×(中空糸内径(cm))×(中空糸の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ(cm))×(中空糸本数(本))(式1)
で求めることができる。
本発明のプライミング方法において、中空糸膜内側に導入するプライミング液の線速度の下限は、35cm/分である。また、中空糸膜内側に導入するプライミング液の線速度の上限は、450cm/分であり、好ましくは420cm/分、より好ましくは300cm/分である。前記線速度が35cm/分未満であると、プライミング工程に時間がかかりすぎることが懸念され、また、450cm/分を超えると、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換される前に中空糸膜の内側がプライミング液により浸潤し、中空糸膜の外側にプライミング液を充填することができなくなる。
(総断面積(cm2))=(中空糸本数(本))×π×(中空糸内径(cm))×(中空糸内径(cm))÷4(式2)
で求めることができる。
若しくは、中空糸内径(cm)、濾過面積(cm2)、樹脂層部間の距離(cm)から、以下の式3:
(総断面積(cm2))=[(中空糸内径(cm)]×[濾過面積(cm2)]÷[樹脂層部間の距離(cm)] ÷4(式3)
で求めることができる。
(濾過面積(cm2))=π×(中空糸内径(cm))×(樹脂層部間の距離(cm))×(中空糸本数(本))(式4)
により求められた値のことである。
前記樹脂層部間の距離とは、中空糸を中空糸膜モジュール内上下2箇所で固定した樹脂層部の間の距離をさす。
(中空糸膜モジュールの容積(cm3))=(中空糸膜モジュールの総断面積(cm2))×(中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離(cm))(式5)
により算出される。
例えば、図1に示す中空糸膜モジュールAでは、プライミング液の導出口8b付近に備えられたポンプ11aを用いて線速を制御するために、内圧は陰圧になる。このように、内圧が陰圧になることで、プライミング液の中空糸膜の内側の導入と、中空糸膜外側の空気のプライミング液への置換とをより効率よく行うことができる。内圧の下限は8mmHg(1067Pa)であることが好ましく、上限は66mmHg(8799Pa)であることが好ましい。
また、図2に示す中空糸膜モジュールBのようにプライミング液の導入口8a付近にポンプ11a’を備えている場合には、前記ポンプ11a’を用いて中空糸膜モジュールB内に導入するプライミング液の線速を制御するために、内圧は陽圧になる。
なお、前記内圧の測定方法としては、前記中空糸膜モジュールAに充填された中空糸膜5の内側に導入されている液体の圧力を測定すればよい。例えば、図1に示すように、プライミング液の導出口8bとポンプ11aとを接続したチューブの任意の位置に圧力計14aを接続して内圧を測定すればよいし、図2に示すように、プライミング液の導入口8aとポンプ11a’とを接続したチューブの任意の位置に内圧を測定するための圧力計14a’を接続してもよい。
なお、前記外圧の測定方法としては、図1、2に示す中空糸膜モジュールA、Bに充填された中空糸膜5と胴部2との間隙にある液体の圧力を測定すればよく、例えば、図1において胴部2の側面に圧力計接続口15を設け、この圧力計接続口15に圧力計14bを接続して測定すればよい。
前記圧力差が7mmHg(933Pa)未満の場合は、線速が小さすぎてプライミング工程に時間がかかりすぎる。また、前記圧力差が29mmHg(3866Pa)を超えると、線速が大きすぎて、すぐに中空糸膜内側がプライミング液で完全に濡れてしまい、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換されない。
本発明のプライミング方法において、前記圧力差の下限は7mmHg(933Pa)が好ましく、また、前記圧力差の上限は29mmHg(3866Pa)が好ましく、22mmHg(2933Pa)がより好ましく、17mmHg(2266Pa)がさらに好ましい。
前記線速度が500cm/分以下であると、濃縮処理に時間がかかり効率的でない。2000cm/分を超えると、細胞へのせん断や圧力によるダメージが大きくなることが懸念される。
前記線速度の下限は500cm/分より大きいことが好ましく、800cm/分より大きいことがより好ましく、1200cm/分より大きいことがさらに好ましい。また、前記線速度の上限は2000cm/分であることが好ましく、1800cm/分がより好ましく、1500cm/分がさらに好ましい。
前記濾過速度とは、濾液排出口より排出される中空糸膜面積1m2あたりの濾液の流量(mL/分)を、時間(分)で除した値のことである。
前記濾過速度が1000mL/m2/分未満の場合、濃縮処理に時間がかかり効率的でない。4250mL/m2/分を超えると、細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。
また、前記濾過速度の下限は、1000mL/m2/分が好ましく、1250mL/m2/分がより好ましく、1500mL/m2/分がさらに好ましい。また、前記濾過速度の上限は、4250mL/m2/分が好ましく、4000mL/m2/分がより好ましく、3750mL/m2/分がさらに好ましい。
中でも、前記細胞懸濁液の濾過速度は、1500mL/m2/分以上3750mL/m2/分以下であることで短時間かつ回収効率の高い濃縮処理が可能となるため好ましい。
(膜面積(m2))=(中空糸の内径(m))×π×(樹脂層部間の距離(m))×(中空糸本数(本))
により算出される。
このとき、濾液排出口4側の流路を狭くするなどして中空糸膜に圧力をかけながら濾過することもできるし、濾過側のチューブにポンプなどの機械11bを設置して圧力をかけながら濾過を行ってもよく、一般的な中空糸膜モジュールで用いられる各種濾過方法を併用することができる。
例えば、前記製造方法で得られる細胞濃縮液をヒトや非ヒト動物に投与する各種疾患の治療方法に関する。
細胞回収率(%)とは、一定量まで濃縮した時点での細胞懸濁液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。
細胞数(個)は、細胞懸濁液を血球カウンター(シスメックス製、商品名「K−4500」)により測定し、白血球分画の細胞濃度を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量(mL)と細胞濃度(個/mL)の値の積で算出することができる。
細胞回収率(%)は70%以上であることが好ましく、85%以上がさらに好ましい。85%未満になると、細胞治療用途として患者に投与する際に必要な細胞数を確保できない可能性がある。さらに70%未満になると、細胞損失が大きすぎて細胞処理用途としての使用に適さないと判断される可能性が高い。
また、各実施例に記載した中空糸膜モジュールAの導入口8a、および導出口8bにそれぞれ塩化ビニルチューブをつなげた。導入口8aおよび導出口8bにつなげた塩化ビニルチューブのそれぞれの他方端は生理食塩液が貯留されたプラスチック製の貯留容器10に接続し、貯留容器10中の生理食塩液が中空糸膜モジュールAと貯留容器10との間を、チューブを介して循環できるように回路16を形成した。
導出口8b側の塩化ビニルチューブにはポンプ11aおよび内圧圧力計14aを設置し、生理食塩液が後述の実施例に記載した流速で流れるように設定した。
中空糸膜モジュールAの濾液排出口4にはチューブおよび二方活栓12を取り付け、チューブの端を廃液容器13と接続し、さらに前記チューブにはポンプ11bを設置して、濾液が後述の実施例に記載した流速で排出されるように設定し、二方活栓12を閉じた。
また、前記圧力計接続口15には外圧圧力計14bを取り付けた。
また、貯留容器10と中空糸膜モジュールAの導入口8aとを接続しているチューブに三方活栓17を取り付け、さらに、この三方活栓17にチューブを介してプラスチック製の回収容器18を接続した。
なお、外圧圧力計14bの値を中空糸膜の「外圧」とし、内圧圧力計14aの値を中空糸膜の「内圧」とした。
また、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ(cm)を中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離(cm)で除した値をパーセントで表示することによりプライミング液の充填効率(%)を算出した。
すなわち、導出口8bより細胞懸濁液を中空糸膜モジュールAに導入し、前記貯留容器10との間で細胞懸濁液を循環させながら濾液を濾液排出口4より排出した。
濾液の容量が一定量(70mL〜80mL)になるまで濃縮した後、二方活栓12を閉じ、チューブ、中空糸型分離膜5内の細胞濃縮液をポンプ11aにより流量75mL/分で導入口8aから押し出して導入口8aと貯留容器10との間にある回路16から分岐した回収容器18に回収した。
側面端部に濾液排出口4および圧力計接続口15を備えた直径4.5cm、高さ24cmの円筒型容器1に、ポリエーテルスルホン(PES)製の中空糸膜〔商品名:MFC−K1、中空糸内径570μm、孔径0.2μm、東洋紡社製〕300本を充填し、この中空糸膜の束5の両端を樹脂層部7で容器1内部に固定した。
このときの両端の樹脂層部7間の距離は23cmであった。次に、円筒型容器1の両端面に導入口8a、導出口8bが設けられた頭部(3、9)を取り付け、中空糸膜モジュールAとした。
このとき、内圧値は−8mmHg、外圧値は−1mmHg、圧力差の絶対値は7mmHgであった。
従って、プライミング液の充填効率(モジュール両端の樹脂層部7間の距離に対する中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さの割合)は、91%と算出された。
実施例1と同様の中空糸膜モジュールAを用いた。プライミング条件は、導出口8b付近の流量が230mL/分(線速度300cm/分)とした。
このとき、内圧値は−32mmHg、外圧値は−15mmHg、圧力差は17mmHgであった。
また、中空糸膜モジュールAの両端の樹脂層部7間の距離は23cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは17cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、74%と算出された。
濃縮条件は、プライミング液導出口8b付近の流量が450mL/分(線速度588cm/分)、濾液排出口4より排出される濾過速度は1823mL/m2/分とした。その結果、処理時間は364秒、細胞回収率は85%、生存率比は96%であった。
実施例1と同様の中空糸膜モジュールAを用いた。プライミング条件は、導出口8b付近の流量が322mL/分(線速度420cm/分)とした。このとき、内圧値は−34mmHg、外圧値は−12mmHg、圧力差は22mmHgであった。
また、中空糸膜モジュールAの両端の樹脂層部7間の距離は23cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは10cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、44%と算出された。
濃縮条件は、プライミング液導出口8b付近の流量が450mL/分(線速度588cm/分)、濾液排出口4より排出される濾過速度は1823mL/m2/分とした。その結果、処理時間は365秒、細胞回収率は73%、生存率比は97%であった。
実施例1と同様の中空糸膜モジュールAを用いた。プライミング条件は、導出口8b付近の流量が344mL/分(線速度450cm/分)とした。このとき、内圧値は−36mmHg、外圧値は−7mmHg、圧力差は29mmHgであった。
また、中空糸膜モジュールAの両端の樹脂層部7間の距離は23cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは4cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、17%と算出された。
濃縮条件は、プライミング液導出口8b付近の流量が450mL/分(線速度588cm/分)、濾液排出口4より排出される濾過速度は1823mL/m2/分とした。その結果、処理時間は363秒、細胞回収率は70%、生存率比は95%であった。
実施例1と同様の中空糸膜モジュールAを用いて、実施例1と同じ条件でプライミングを実施した。
濃縮条件は、プライミング液導出口8b付近の流量が600mL/分(線速度784cm/分)、濾液排出口4より排出される濾過速度は2422mL/m2/分とした。
その結果、処理時間は297秒、細胞回収率は76%、生存率比は98%であった。
混合セルロースエステル(ME)製の中空糸膜〔商品名:D06−M20U−06−N、中空糸内径600μm、孔径0.2μm、Spectrum社製〕が、側面端部に濾液排出口4および圧力計接続口15を備えた直径6.98mm、高さ68cmの円筒型容器1に濾過面積が335cm2になるよう充填され、中空糸膜の両端を樹脂層部7で固定された中空糸膜モジュールAを使用した。
このときの両端の樹脂層部7間の距離は65cmであった。これらの値を前記式3に代入することにより、中空糸膜の総断面積を0.077cm2と算出した。
プライミング条件は、導出口8b付近の流量が2.7mL/分(線速度35cm/分)とした。このとき、内圧値は−55mmHg、外圧値は−46mmHg、圧力差は9mmHgであった。また、中空糸膜モジュールAの両端の樹脂層部7間の距離は65cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の垂直方向の長さは62cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、95%と算出された。
混合セルロースエステル(ME)製の中空糸膜〔商品名:D06−M10U−06−N、中空糸内径600μm、孔径0.1μm、Spectrum社製〕が、側面端部に濾液排出口4および圧力計接続口15を備えた直径6.98mm、高さ68cmの円筒型容器1に濾過面積が335cm2になるよう充填され、中空糸膜の束5の両端を樹脂層部7で容器1内部に固定された中空糸膜モジュールAを使用した。
このときの両端の樹脂層部7間の距離は65cmであった。これらの値を前記式3に代入することにより、中空糸膜の総断面積を0.077cm2と算出した。
プライミング条件は、導出口8b付近の流量が2.7mL/分(線速度35cm/分)とした。このとき、内圧値は−66mmHg、外圧値は−46mmHg、圧力差は20mmHgであった。また、中空糸膜モジュール両端の樹脂層部7間の距離は65cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは46cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、71%と算出された。
実施例1と同様の中空糸膜モジュールAを用いた。プライミング条件は、導出口8b付近の流量が459mL/分(線速度600cm/分)とした。このとき、内圧値は−58mmHg、外圧値は−28mmHg、圧力差は30mmHgであった。
また、中空糸膜モジュールAの両端の樹脂層部7間の距離は23cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは1cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、4%と算出された。濃縮条件は、プライミング液導出口8b付近の流量が450mL/分(線速度588cm/分)、濾液排出口4より排出される濾過速度は1823mL/m2/分とした。
その結果、処理時間は364秒、細胞回収率は65%、生存率比は95%であった。
ポリエーテルスルホン(PES)製の中空糸膜〔商品名:D06−E500−05−N、中空糸内径500μm、分画500kD、Spectrum社製〕が、側面端部に濾液排出口4および圧力計接続口15を備えた直径6.98mm、高さ68cmの円筒型容器1に濾過面積が370cm2になるよう充填され、中空糸膜の束5の両端を樹脂層部7で容器1内に固定された中空糸膜モジュールAを使用した。このときの両端の樹脂層部7間の距離は65cmであった。これらの値を前記式3に代入することにより、中空糸膜の総断面積を0.071cm2と算出した。
プライミング条件は、導出口8b付近の流量が2.1mL/分(線速度35cm/分)とした。このとき、内圧値は−55mmHg、外圧値は89mmHg、圧力差は144mmHgであった。
また、中空糸膜モジュールAの両端の樹脂層部7間の距離は65cmであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは0cmであった。
従って、プライミング液の充填効率は、0%と算出された。
1.容器
2.胴部
3.頭部
4、4’.濾液排出口
5.中空糸膜の束
6.開口端
7.樹脂層部
8a.導入口
8b.導出口
9.頭部
10.貯留容器
11a、11a’.ポンプ
11b.ポンプ
12.二方活栓
13.廃液容器
14a、14a’.内圧圧力計
14b.外圧圧力計
15.圧力計接続口
16.回路
17.三方活栓
18.回収容器
Claims (13)
- 導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法であって、
前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度35cm/分以上450cm/分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して15%以上充填する工程
を含むプライミング方法。 - プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が7mmHg以上29mmHg以下である請求項1に記載のプライミング方法。
- 前記内圧が陰圧である請求項2に記載のプライミング方法。
- 前記線速度が35cm/分以上300cm/分以下である請求項1〜3のいずれか1項に記載のプライミング方法。
- プライミング液を前記中空糸膜モジュールの容積に対して70%以上充填する請求項1〜4のいずれか1項に記載のプライミング方法。
- 前記中空糸膜の内側にプライミング液を導入する請求項1〜5のいずれか1項に記載のプライミング方法。
- 前記導入口および前記導出口が前記中空糸膜の内側を通じて連通している請求項1〜6のいずれか1項に記載のプライミング方法。
- 中空糸膜の孔径が0.1μm以上1.0μm以下である請求項1〜7のいずれか1項に記載のプライミング方法。
- 前記プライミング液が、生理食塩液、輸液、血清または培地からなる群より選ばれる1種以上である請求項1〜8のいずれか1項に記載のプライミング方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を中空糸膜モジュールの導出入口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。
- 前記濾液排出口を少なくとも1つ以上備えた中空糸膜モジュールを用いる請求項10に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 細胞懸濁液を線速度500cm/分以上2000cm/分以下で中空糸膜モジュールの導出入口より導入する請求項10または11に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 前記濾液を濾過速度1500mL/m2/分以上3750mL/m2/分以下で濾液排出口より排出する請求項12に記載の細胞濃縮液の製造方法。
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