JP6528399B2 - 細胞濃縮液の製造方法 - Google Patents
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Description
さらに、濃縮工程における線速度を2段階に設定することで、プライミングの操作を行わずに細胞濃縮液を製造することができ、また濃縮工程に要する処理時間を短縮しつつ細胞回収率の高い細胞濃縮液を得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
(1)導入口、導出口及び濾液排出口を備え、中空糸型分離膜が充填された中空糸膜モジュールを用いる細胞濃縮液の製造方法であって、
細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された濾液排出口から排出しながら細胞懸濁液を濃縮する工程、
前記濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替える工程、及び
洗浄液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記濾液排出口から排出しながら細胞を洗浄した後、細胞濃縮液を回収する工程
を含み、
前記細胞懸濁液を濃縮する工程において、2段階の線速度で濃縮し、前記2段階の線速度において、1段階目の線速度a(cm/分)と2段階目の線速度b(cm/分)がa<bの関係を満たし、前記1段階目の線速度aが35〜300cm/分であり、2段階目の線速度bが370〜1100cm/分であることを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。
(2)前記中空糸膜モジュールにおいて濾液排出口を2箇所設け、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口の位置を、中空糸膜モジュールの下側末端から前記濾液排出口のいずれか一方までの距離xが中空糸膜モジュールの垂直方向の長さLと比べてL/2≧xとなる位置に調整する前記(1)に記載の細胞濃縮液の製造方法。
(3)前記中空糸膜モジュールの垂直方向の長さL(cm)、2箇所の濾液排出口間の距離y(cm)との比率がL:y=3:1〜10:9である前記(2)に記載の細胞濃縮液の製造方法。
(4)前記中空糸膜モジュールの向きを変えることで前記濾液排出口の位置を切り替える前記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
(5)前記1段階目の線速度a(cm/分)と2段階目の線速度b(cm/分)の比率が、a:b=1:1.2〜1:32である前記(1)〜(4)のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
(6)細胞懸濁液を濃縮する工程の前に、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された前記濾液排出口から排気しながら、プライミング液を前記中空糸膜モジュール内に送液する工程を含む、前記(1)〜(5)のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
(7)前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の孔径が0.1μm以上である前記(1)〜(6)のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
(8)前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の内径が300〜1000μmである前記(1)〜(7)のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
頭部3Aには導入口6、頭部3Bには導出口7がそれぞれ設けられている。導入口6および導出口7は、中空糸膜の内側に細胞懸濁液が出入りする出入口のことであり、どちらから導入、導出させても良い。さらに、細胞懸濁液のみならず、洗浄液およびプライミング液についても同様である。なお、図1〜4では、中空糸膜モジュール1、1’の垂直方向上側の口を導入口6、垂直方向下側の口を導出口7として説明する。
例えば、図2に示す中空糸膜モジュール1においては、濾液排出口5a、5bが設けられており、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口として、垂直方向下側の前記濾液排出口5bを用いる。この場合、「中空糸膜モジュールの下側末端から濾液排出口までの距離x」とは、前記中空糸膜モジュール1内の導出口7の下方末端から濾液排出口5bの中心までの距離をいう。
xは中空糸膜モジュールの垂直方向の長さLと比べてL/2≧xとなる位置に調整されていれば特に限定されないが、具体的なxの値として、4〜25cmが好ましく、4〜20cmがより好ましく、4〜10cmがさらに好ましい。
Lの値は特に限定はないが、具体的には15〜50cmであることが好ましく、20〜40cmであることがより好ましい。
前記2箇所の濾液排出口間の距離yとは、例えば、図2に示す中空糸膜モジュール1において、垂直方向上側の濾液排出口5aの中心から下側の濾液排出口5bの中心までの距離をいう。
前記yの値は5〜45cmであることが好ましく、15〜45cmであることがより好ましい。
なお、細胞濃縮を行う際の中空糸膜は鉛直方向に配置されていても、水平方向に配置されていても、斜め方向に配置されていてもよいが、濾液排出口の切り替えることによる洗浄効果が発揮しやすい観点から、中空糸膜が鉛直方向に配置している方がより好ましい。
前記孔径は、1.5μm以下が好ましく、1.2μm以下がより好ましく、1.0μm以下がさらに好ましい。
前記孔径は、中空糸膜の平均孔径を指し、一般的にパームポロメーターにより測定、算出される。
また、前記に例示した細胞を生体外で培養した後の細胞懸濁液を使用することができる。細胞を生体外で培養するときの培養液の例としては、DMEM、α−MEM、MEM、IMEM、RPMI−1640等が挙げられる。また、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子を添加した培養液も使用できる。
本発明の細胞濃縮液の製造方法は、まず、細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口から送液し、濾液を前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された濾液排出口から排出しながら細胞懸濁液を濃縮する。
例えば、図1(a)、1(b)に示す中空糸膜モジュール1、1’では、垂直方向上側にある濾液排出口5aが本工程で用いる濾液排出口になる。
この場合、下側にある濾液排出口5bから濾液が排出されないように、前記濾液排出口5bの出口付近にあるバルブ13bを閉じておく。
中でも、1段階目で中空糸膜内の空気を膜外に十分に押し出し、2段階目で効率よく濃縮するという観点から、前記1段階目の線速度a(cm/分)と2段階目の線速度b(cm/分)の比率をa:b=1:1.2〜1:32の範囲に調整することが好ましく、a:b=1:10〜1:20の範囲に調整することがより好ましい。
このように2段階の線速度で濃縮を行う場合、1段階目については効率よく中空糸膜内の空気を膜外に押し出すことができ、2段階目については細胞へのダメージを極力低減させ、かつ短時間で細胞回収率の高い細胞濃縮液を製造する観点から、前記1段階目の線速度aが35〜300cm/分の範囲、2段階目の線速度bが370〜1100cm/分の範囲で調整すればよく、線速度bについては390〜590cm/分の範囲に調整することがより好ましい。
本発明では、前記濃縮工程後に、前記濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替える。このように濾液排出口の位置を切り替えることで、後述の洗浄工程を行った際に、中空糸膜モジュール内に残っている夾雑物や培地成分を含む濾液を速やかに中空糸膜モジュールの外部に排出することができる。
本発明では、前記切り替え工程後に、洗浄液を前記導入口または導出口から送液し、濾液を前記濾液排出口から排出しながら細胞を洗浄した後、細胞濃縮液を前記導出口から回収する。
前記洗浄・濃縮を続けながら、貯留容器12内にある細胞濃縮液をサンプリングして夾雑物および培養成分の濃度が所定量以下になったことを確認して、前記の洗浄を終了する。
次に、前記分岐部16と貯留容器12との間のバルブ13cを閉じ、分岐部16と回収容器17との間のバルブ13dを開き、再度、ポンプ14aを駆動して、細胞濃縮液を回収容器17に導入して回収する。
前記洗浄・濃縮を続けながら、貯留容器12内にある細胞濃縮液をサンプリングして夾雑物および培養成分の濃度が所定量以下になったことを確認して、前記の洗浄を終了する。
次に、前記分岐部16と貯留容器12との間のバルブ13cを閉じ、分岐部16と回収容器17との間のバルブ13dを開き、再度、ポンプ14aを駆動して、細胞濃縮液を回収容器17に導入して回収する。
また、本工程の洗浄条件としては、前記線速度に調整できればよく、例えば、濾過速度、中空糸膜面積などの他の条件については特に限定はない。
また、本発明では、前記濃縮工程の前に、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された前記濾液排出口から排気しながら、プライミング液を前記導入口または導出口から送液してもよい。
したがって、本発明は、前記製造方法で得られる細胞濃縮液をヒトや非ヒト動物に投与する各種疾患の治療方法に関する。
前記治療方法としては、細胞障害性T細胞、NK細胞、NKT細胞、樹状細胞などの免疫細胞を使用したがんに対する免疫細胞療法、間葉系幹細胞などの多分化能を有する生体幹細胞を使用した、骨、関節、血管、臓器などの組織再生に対する細胞移植治療法、間葉系幹細胞を使用した移植片対宿主病(GVHD)治療法が挙げられる。これらの治療に用いられる細胞は、iPS細胞、ES細胞より誘導した細胞や、各種遺伝子を導入した細胞を使用することもできる。さらに、前記製造方法で得られる細胞濃縮液は、細胞濃縮液に新鮮な培地を加え、再び培養を行う培地交換の用途としても好適に使用することができる。
死細胞率(%)は、細胞濃度が1mLあたり10の6乗個になるよう調製した各細胞懸濁液100μLに対し、via−probe(日本BD社製、商品名:BD Via−Probe Cell Viability Solution)を10μL加え10分間室温暗所で静置させた後、フローサイトメーター(日本BD社製、商品名:FACSCanto)に取り込み、via−probeの陽性率(%)として測定することができる。
以下に実施例を示す。
図3に示す態様の製造装置を用いた。すなわち、中空糸膜モジュール1の導入口6と導出口7に塩化ビニル製チューブをつなげ、導出口7側のチューブには流路の切り替えが可能な二股の分岐部16を設けた。分岐部16の一方の端部は回収容器17と接続し、もう一方の端部は貯留容器12に接続した。導入口6側のチューブも貯留容器12に接続し、溶液が中空糸膜モジュール1およびチューブ内を循環できるように回路11を形成した。前記回路11のチューブにはポンプ14aを設置し、細胞懸濁液の流れが適当な流速に設定できるようにした。
また、前記分岐部16と貯留容器12との間には二方活栓13c、前記分岐部16と回収容器17との間には二方活栓13dを設置して貯留容器12または回収容器17に細胞懸濁液の流路を切り替えられるようにした。
さらに、中空糸膜モジュール1の垂直方向上側の濾液排出口5a、垂直方向下側の濾液排出口5bにもそれぞれ二方活栓13a、13bを備えたチューブを取り付け、両方のチューブを合流させてポンプ14bを取り付け、こちらは廃液容器15に注ぐように設置した。なお、予め二方活栓13aを開き、二方活栓13bを閉じて、濾液が垂直方向上側の濾液排出口5aから排出されるようにしておいた。
前記濃縮工程終了後、二方活栓13aを閉じ、二方活栓13bを開いて、中空糸膜モジュールの垂直方向下側の濾液排出口5bから濾液を排出できるように切り替えた。
次に、貯留容器12内に生理食塩液を1000mL入れ、同様に450mL/分(線速度580cm/分)の流速で導入口6から中空糸膜モジュール1内に通液し、希釈された細胞懸濁液を循環させながら濾過を行うことで細胞懸濁液の洗浄を行った。
貯留容器12内の生理食塩液がなくなるまで濾過を行った後、回収容器17に連結したチューブに流路を切り替えて、中空糸膜モジュール1および回路11内の細胞濃縮液を75mL/分の速さで押し出して回収容器17に回収した。
また、全長Lは27cm、中空糸膜モジュール1端部からの濾液排出口5bの位置xは4cm、濾液排出口5a、5b間の距離yは18cmであった。
作製した中空糸膜モジュール1の濾過面積は0.12m2、中空糸型分離膜の総断面積は0.77cm2であった。
得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.89%、アルブミン除去率は99.83%、IgG除去率は99.96%であった。また、細胞回収率は88%、生存比率は97%であった。
実験系、送液速度および中空糸膜モジュールについては実施例1と同様とした。上記濃縮工程終了後、濾液排出口5aを濾液排出口5bに切り替える工程を実施し、洗浄を行った。このとき、中空糸膜モジュール1の全長Lは27cmであり、濾液排出口5bの位置xは13cm、濾液排出口5a、5b間の距離yは9cmであった。
その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.88%、アルブミン除去率は99.57%、IgG除去率は99.43%であった。また、細胞回収率は84%、生存比率は93%であった。
実験系、送液速度および中空糸膜モジュールについては実施例1と同様とした。上記濃縮工程終了後、濾液排出口5aを濾液排出口5bに切り替える工程を実施し、洗浄を行った。このとき、中空糸膜モジュール1の全長Lは27cm、濾液排出口5bの位置xは4cmであり、L:y=3:2であった。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.88%、アルブミン除去率は99.82%、IgG除去率は99.96%であった。また、細胞回収率は86%、生存比率は93%であった。
実験系および中空糸膜モジュールについては実施例3と同様とし、上記濃縮工程において、中空糸膜モジュール1の垂直方向上側の濾液排出口5aの位置まで細胞懸濁液が満たされるまでの線速度をa、細胞懸濁液を貯留している貯留容器12から全ての細胞懸濁液がなくなるまでの線速度をbとして、濃縮時の線速度を2段階に切り替えた。このときのa:b=1:26であった。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.89%、アルブミン除去率は99.92%、IgG除去率は99.97%であった。また、細胞回収率は84%、生存比率は98%であり、処理時間は10分であった。
実験系および中空糸膜モジュールについては実施例4と同様とし、a=40cm/分、b=580cm/分とした。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.92%、アルブミン除去率は99.91%、IgG除去率は99.98%であった。また、細胞回収率は87%、生存比率は93%であり、処理時間は13分であった。
実験系および中空糸膜モジュールについては実施例4と同様とし、a:b=1:3.5、a=40cm/分、b=140cm/分とした。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.94%、アルブミン除去率は99.92%、IgG除去率は99.96%であった。また、細胞回収率は73%、生存比率は95%であり、処理時間は31分であった。
実験系、送液速度および中空糸膜モジュールについては実施例1と同様とした。上記濃縮工程終了後、濾液排出口の位置を切り替えずに洗浄工程でも垂直方向上側の濾液排出口5aから濾液を排出した。このとき、中空糸膜モジュール1の全長Lは27cmであり、濾液排出口の位置xは22cmであった。また、L:y=27:0であった。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は99.84%、アルブミン除去率は99.14%、IgG除去率は98.81%であった。また、細胞回収率は
87%、生存比率は94%であった。処理時間は13分であった。
2.胴部
3A、3B.頭部
5a、5b.濾液排出口
6.導入口
7.導出口
8.中空糸膜の束
9.開口端
10.樹脂層部
11.回路
12.貯留容器
13a、13b、13c、13d.バルブ
14a、14b.ポンプ
15.廃液容器
16.分岐部
17.回収容器
Claims (8)
- 導入口、導出口及び濾液排出口を備え、中空糸型分離膜が充填された中空糸膜モジュールを用いる細胞濃縮液の製造方法であって、
細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された濾液排出口から排出しながら細胞懸濁液を濃縮する工程、
前記濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替える工程、及び
洗浄液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記濾液排出口から排出しながら細胞を洗浄した後、細胞濃縮液を回収する工程
を含み、
前記細胞懸濁液を濃縮する工程において、2段階の線速度で濃縮し、前記2段階の線速度において、1段階目の線速度a(cm/分)と2段階目の線速度b(cm/分)がa<bの関係を満たし、前記1段階目の線速度aが35〜300cm/分であり、2段階目の線速度bが370〜1100cm/分であることを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。 - 前記中空糸膜モジュールにおいて濾液排出口を2箇所設け、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口の位置を、中空糸膜モジュールの下側末端から前記濾液排出口のいずれか一方までの距離xが中空糸膜モジュールの垂直方向の長さLと比べてL/2≧xとなる位置に調整する請求項1に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 前記中空糸膜モジュールの垂直方向の長さL(cm)、2箇所の濾液排出口間の距離y(cm)との比率がL:y=3:1〜10:9である請求項2に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 前記中空糸膜モジュールの向きを変えることで前記濾液排出口の位置を切り替える請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 前記1段階目の線速度a(cm/分)と2段階目の線速度b(cm/分)の比率が、a:b=1:1.2〜1:32である請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 細胞懸濁液を濃縮する工程の前に、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された前記濾液排出口から排気しながら、プライミング液を前記中空糸膜モジュール内に送液する工程を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の孔径が0.1μm以上である請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の内径が300〜1000μmである請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
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