JP2015008685A - 細胞濃縮液の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞懸濁液を濃縮するに際して、細胞の通液速度を速くせずとも、優れた細胞回収率を維持可能な細胞濃縮液の製造方法を提供する。【解決手段】中空糸型分離膜の内径が５４０〜６００μｍ、糸本数が２００〜３５０本であり、且つ、膜面積が０．０４ｍ２〜０．１３ｍ２である中空糸モジュールを用いて、（a）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、ろ液をろ液出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、（b）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、細胞懸濁液出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。中空糸モジュールの容積が５７〜１５２ｍｌであり、中空糸分離膜の孔径が０．１〜１μｍであり、中空糸分離膜の材質がポリエーテルスルホン系中空繊維である。【選択図】図１
Description
本発明は、中空糸型分離膜を充填した中空糸モジュール、及びそれを用いた細胞濃縮液の製造方法に関する。
細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、患者に接種する方法が用いられている。これら治療に用いる細胞は、治療に適した溶液に懸濁され、または適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から細胞を採取した場合、治療に十分な細胞濃度でないことがあり、また、体外で生体から採取した細胞をさらに培養した場合、組織由来の夾雑物や培地などを含んでいることが多い。したがって、生体から採取又は培養した細胞を治療に用いるためには、夾雑物や培地を取り除き、治療に適した溶液などに懸濁された状態とし（洗浄）、治療に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。
前記目的を達成するため、遠心分離を用いた濃縮、洗浄操作が知られていおり、たとえば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離を用いる方法が開示されている（特許文献１）。しかし、このように遠心分離を用いる方法は、装置が大型になること、及びコストが増大することにより利用できる施設が限定される。さらに細胞を洗浄する際には、遠心分離により沈殿させた細胞の上清を取り除くが、細胞が大気に開放され、汚染等が発生する危険があるという問題が挙げられる。
そこで、特許文献１に挙げられる問題を解決するために、中空糸型分離膜を用いたコンパクトで簡便な装置が提案されている（特許文献２）。
上述のような中空糸型分離膜を用いて細胞医療用途の細胞懸濁液を濃縮するに際しては、高い回収率で細胞を回収するために細胞懸濁液の通液速度を速くし、細胞が膜に接着することを防止する必要がある。しかし、細胞懸濁液の通液速度を速くすると、細胞へ強い力（シェアストレス）が加わるため細胞が損傷し、細胞生存率が減少する。その結果として生存している細胞の回収率の低下を引き起こす可能性がある（特許文献３）。
上述のような中空糸型分離膜を用いて細胞医療用途の細胞懸濁液を濃縮するに際しては、高い回収率で細胞を回収するために細胞懸濁液の通液速度を速くし、細胞が膜に接着することを防止する必要がある。しかし、細胞懸濁液の通液速度を速くすると、細胞へ強い力（シェアストレス）が加わるため細胞が損傷し、細胞生存率が減少する。その結果として生存している細胞の回収率の低下を引き起こす可能性がある（特許文献３）。
本発明の目的は、上記中空糸型分離膜を用いた細胞濃縮液の製造における問題点を解決することを課題とする。具体的には、細胞懸濁液を濃縮するに際して、細胞の通液速度を速くせずとも、優れた細胞回収率が維持可能な細胞濃縮液の製造方法を提供する。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の範囲の中空糸本数、膜面積、膜の内径を持つ中空糸モジュールを細胞濃縮に用いることで、細胞の通液速度を速くすることなく、優れた細胞回収率を維持して細胞濃縮液を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び前記細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を有し、該中空糸型分離膜の内径が５４０〜６００μｍ、糸本数が２００〜３５０本であり、且つ、膜面積が０．０４ｍ２〜０．１３ｍ２である中空糸モジュールを用いて、
（a）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、ろ液をろ液出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、
（b）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、細胞懸濁液出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程、
を含むことを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。
（２）中空糸モジュールの容積が５７〜１５２ｍLであることを特徴とする（１）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（３）中空糸型分離膜の孔径が０．１μｍ〜１μｍであることを特徴とする（１）または（２）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（４）中空糸型分離膜の材質がポリエーテルスルホン系であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（５）（ｂ）の工程前に、希釈液を用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄する工程を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（６）回収容器が液体を流出入できるポートを１つ以上具備することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（７）（ｂ）の工程後に、ポートを通じて細胞濃縮液を取り出す工程を含む（６）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（８）（ｂ）の工程後に、ポートを通じて薬剤を添加する工程を含む（６）または（７）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（９）（ｂ）の工程後に、回収容器を密封し分断する工程を含む（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法により得られた細胞濃縮液を、再度培養することを特徴とする細胞培養方法。
（１１）（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存することを特徴とする凍結保存方法。
（１）細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び前記細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を有し、該中空糸型分離膜の内径が５４０〜６００μｍ、糸本数が２００〜３５０本であり、且つ、膜面積が０．０４ｍ２〜０．１３ｍ２である中空糸モジュールを用いて、
（a）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、ろ液をろ液出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、
（b）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、細胞懸濁液出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程、
を含むことを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。
（２）中空糸モジュールの容積が５７〜１５２ｍLであることを特徴とする（１）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（３）中空糸型分離膜の孔径が０．１μｍ〜１μｍであることを特徴とする（１）または（２）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（４）中空糸型分離膜の材質がポリエーテルスルホン系であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（５）（ｂ）の工程前に、希釈液を用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄する工程を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（６）回収容器が液体を流出入できるポートを１つ以上具備することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（７）（ｂ）の工程後に、ポートを通じて細胞濃縮液を取り出す工程を含む（６）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（８）（ｂ）の工程後に、ポートを通じて薬剤を添加する工程を含む（６）または（７）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（９）（ｂ）の工程後に、回収容器を密封し分断する工程を含む（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法により得られた細胞濃縮液を、再度培養することを特徴とする細胞培養方法。
（１１）（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存することを特徴とする凍結保存方法。
本発明によれば、細胞懸濁液の濃縮に際して、細胞の通液速度を速くせずとも、高い細胞回収率を維持して細胞濃縮液を製造できる。さらに本発明は、懸濁液中に存在する蛋白質等の夾雑物を効率良く取り除くことができ、無菌的な閉鎖系で処理することが可能であることから、濃縮された細胞は治療用として提供できる。
以下に、本発明について説明する。
本発明の中空糸モジュールは、図１に示すとおり例示されるが、これに限定されるものではない。筒状容器１はストレートな胴部２とその両側の頭部３、ヘッダー部９からなり、頭部３にはろ過液出口４が備えられている。このろ過液出口は一方に備えられていても、両端に備えられていてもよい。この例ではヘッダー部９に細胞懸濁液入口８ａ、細胞懸濁液出口８ｂが設けられている。該筒状容器１内部には、装填された中空糸型分離膜の束５と、ヘッダー部９の内部に設けられた中空糸型分離膜の束５を容器内部に固定するとともに中空糸型分離膜の開口端６を形成している樹脂層部７、更に頭部３の内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部７および開口端６は、ヘッダー部９（或いは頭部３）に被冠された構造となっており、細胞懸濁液出入口８ａ、８ｂとろ過液出口４が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
本発明の中空糸モジュールは、図１に示すとおり例示されるが、これに限定されるものではない。筒状容器１はストレートな胴部２とその両側の頭部３、ヘッダー部９からなり、頭部３にはろ過液出口４が備えられている。このろ過液出口は一方に備えられていても、両端に備えられていてもよい。この例ではヘッダー部９に細胞懸濁液入口８ａ、細胞懸濁液出口８ｂが設けられている。該筒状容器１内部には、装填された中空糸型分離膜の束５と、ヘッダー部９の内部に設けられた中空糸型分離膜の束５を容器内部に固定するとともに中空糸型分離膜の開口端６を形成している樹脂層部７、更に頭部３の内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部７および開口端６は、ヘッダー部９（或いは頭部３）に被冠された構造となっており、細胞懸濁液出入口８ａ、８ｂとろ過液出口４が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
なお、図１に示した例では、各部分を筒状容器の胴部２、頭部３、ヘッダー部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、ヘッダー部９が筒状容器の頭部３に一体化したものや、筒状容器の胴部２と頭部３が別々のパーツから形成されている場合でも、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に細胞懸濁液出入口とろ過液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造を設計することが可能である。
本発明の中空糸モジュールにおいて、中空糸型分離膜の配置は直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に中空糸型分離膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。
本発明の中空糸モジュールの筒状容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好ましい。
中空糸型分離膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料用いることができ、透析に使用されている実績の観点からポリウレタン樹脂が特に好ましい。
本発明における中空糸型分離膜の糸本数とは、中空糸分離膜束中に含まれる中空糸型分離膜の本数を表す。本発明における中空糸型分離膜の糸本数は２００〜３５０本が好ましく、２５０〜３００本がより好ましい。糸本数が２００本未満であると細胞懸濁液を処理する際に中空糸型分離膜内部を通過する細胞濃度が高くなりすぎて細胞が中空糸型分離膜に詰まる懸念がある。また、糸本数が３５０本より多いと、中空糸型分離膜の総断面積が増加し、細胞が中空糸型分離膜内部を通過する際の通液速度が低下することで細胞が中空糸型分離膜に接着し、回収率が低下するという問題があり好ましくない。
本発明における中空糸型分離膜の内径とは、中空糸内空部分の直径を表す。本発明の中空糸型分離膜の内径は５４０〜６００μｍであることが好ましく、５６０〜５８０μｍであることがより好ましい。５４０μｍ未満であると、細胞懸濁液を処理する際に中空糸型分離膜内部を通過する細胞濃度が高くなりすぎて細胞が中空糸型分離膜に詰まる懸念がある。また、６００μｍを超えると、中空糸型分離膜の総断面積が増加するため、細胞が中空糸型分離膜内部を通過する際の速度が低下する。その結果、細胞が中空糸型分離膜に接着し、回収率が低下するため好ましくない。
本発明における中空糸型分離膜の膜面積（ｍ２）とは、（中空糸型分離膜の内径（μｍ））×π×（糸本数）×（中空糸の接着剤で挟まれているろ過側部分の長さ（ｃｍ））で表される面積を表す。膜面積は０．０４〜０．１３ｍ２が好ましく、０．０９〜０．１１ｍ２がより好ましい。膜面積が０．０４ｍ２未満であると、細胞懸濁液を処理するのに十分な量の内側膜面積を確保できないため、処理中に膜に細胞が詰まる懸念がある。また、膜面積が０．１３ｍ２を超えると中空糸型分離膜の断面積が増加するため、細胞が中空糸型分離膜内部を通過する際の速度が低下する。その結果、細胞が中空糸型分離膜に接着し、回収率が低下するため好ましくない。
本発明における中空糸モジュールの容積（ｍL）とは（中空糸の接着剤で挟まれているろ過側部分の長さ（ｃｍ））×（ケーシングの断面積(ｃｍ２)）であらわされる体積を表す。容積は５７〜１５２ｍLが好ましく、１００〜１５２ｍLがより好ましく、１４５〜１５２ｍＬがさらに好ましい。中空糸モジュールの容積が５７ｍＬより小さいと十分な膜面積を確保することができず、細胞が詰まることが懸念される。中空糸モジュールの容積が１５２ｍＬより大きいと、中空糸モジュール内部のろ液量が多くなり、洗浄効率が低下するため好ましくない。中空糸外部にあるろ液中に含まれるタンパク濃度が低下しづらくなるため好ましくない。
本発明における中空糸型分離膜の孔径とは中空糸内部と外部を連通する部分の直径である。中空糸型分離膜の孔径の下限としては０．１μｍ以上が好ましく、０．２μｍ以上がより好ましく、０．３μｍ以上がさらに好ましい。また中空糸分離膜の孔径の上限としては、1μｍ以下が好ましく、０．８μｍ以下がより好ましく、０．６μｍ以下がさらに好ましい。０．１μｍ未満であると、大きなろ過流量を得ることができない、又は不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できないため好ましくない。また、１μｍより大きいと、細胞が膜から漏れるという問題があり、好ましくない。ここで、中空糸型分離膜内側の孔径は、一般的な方法として知られるバブルポイント法によって測定することができる。
本発明に用いられる中空糸型分離膜の材質は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料が好ましく用いることができる。この中でも、ポリスルホン系、ポリオレフィン系又はセルロース系の高分子材料が好ましく用いることができる。さらに、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、セルロースエステルが材料の安全性、安定性、入手のしやすさから最も好適に用いることができる。
本発明で濃縮し得る細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板など、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞または、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞が例示される。中でも顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞に対して好適に用いることができる。
また、本発明で用いる細胞懸濁液としては、細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。または、上記に例示した細胞を生体外で培養液、例えば、ＤＭＥＭ，α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０や、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養した後の細胞懸濁液が例示される。
本発明により製造した細胞濃縮液をさらに洗浄してもよい。洗浄とは、細胞が懸濁されている体液や培地などを、希釈液に置換することである。これにより、濃縮液中の不要な夾雑物を取り除いたりすることができ、ヒトや動物への移植に好適に使用することができる。希釈液としては、生理食塩水、輸液、培地、蒸留水、無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体、緩衝液、培地、血漿等が挙げられ、特に安全性の観点から生理食塩水や輸液を好適に用いることができる。
また、本発明により分離される細胞は、白血病治療、心筋再生や血管再生、幹細胞疲弊疾患、骨疾患、軟骨疾患、虚血性疾患、血管系疾患、神経病、やけど、慢性炎症、心疾患、免疫不全、クーロン病等の疾患、豊胸、しわとり、美容成形、組織陥没症等の組織増大などの再生医療、Ｔ細胞療法、ＮＫＴ細胞療法、樹状細胞移入療法などの免疫療法、遺伝子導入した細胞を用いる遺伝子療法などに用いることも可能であるが、これらに限定されるものではない。また、分離された細胞をスキャフォールド等の構造材料に播種して治療に用いることも可能である。
本発明により製造、洗浄した細胞濃縮液をさらに培養してもよい。洗浄により懸濁されている液を置換しさらに培養することで、細胞数の増加、細胞の分化、形質転換、遺伝子導入などを行うことができる。細胞の増殖に用いられる培地としては、ＤＭＥＭ，α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０が挙げられ、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養してもよい。
本発明により医薬組成物を製造できる。上記の細胞濃縮液の製造方法に従って細胞を濃縮し、該濃縮細胞を製薬的に許容される添加剤と混合することで医薬組成物を製造できる。製薬的に許容される添加剤としては、例えば、抗凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。
本発明により製造、洗浄した細胞濃縮液をさらに凍結保存してもよい。細胞へのダメージを少なくできる点から、液体窒素を用いて凍結保存した方がよい。また、凍結保存した細胞を融解し、ヒトや動物への移植、研究に使用、または再度培養することができる。本発明により製造、洗浄した細胞は濃縮操作によるダメージが少ないことから、凍結保存や融解後の使用などにも好適に用いることができる。
本発明の中空糸モジュールは滅菌して用いてもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌や電子線滅菌やＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。
以下、本発明の中空糸モジュールを用いて細胞を分離する方法を例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更をすることができる。
本発明における中空糸モジュールを用いて細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、ろ液をろ液出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程とは、モジュール内に備えられた中空糸型分離膜に流入した細胞懸濁液が内圧ろ過により、細胞を実質上含まないろ液が中空糸型分離膜の外側にろ別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液が細胞懸濁液出口より流出する。なお、ここで細胞を実質上含まないろ液とは、その細胞の数が、流入前の細胞懸濁液中の細胞の数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。
先ず、中空糸モジュールの細胞懸濁液入口および出口にチューブ等を取り付け（処理器内の中空糸に細胞懸濁液が流入および流出する回路の一部となる）、更に取り付けたチューブを細胞懸濁液が入った細胞バッグなどの容器に連結し、バッグなどの容器と中空糸モジュールとの間で細胞懸濁液が循環できるようにする。なお、液を循環させるために、ポンプなどの機械をこの回路に介在させることが考えられる。また、ろ過液出口には廃液タンクなどに連絡されたチューブを連結しておくことが好ましい。このとき、回路の全体の取り付けは、無菌的な環境下で行われることが好ましい。また、この際に、細胞懸濁液出口側の流路を狭くするなどして、分離膜に圧力をかけることもできるし、ろ過側のチューブにポンプ等を用いて圧力をかけながらろ過を行ってもよく、一般的に中空糸型分離膜で用いられる各種ろ過方法を併用することができる。
一方、濃縮が進んだ後、バッファーなどの洗浄液を追加し、濃縮を繰り返すことで、細胞の洗浄や培地の交換を行うことができる。この際、洗浄液の投入は、循環回路のチューブに設けた流入口から行う。この際、無菌的に液を注入できる流入口を用いることが好ましい。
本発明における中空糸モジュールを用いて、細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、細胞懸濁液出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程とは、濃縮工程並びに洗浄工程後に実施する工程であり、細胞懸濁液を細胞懸濁液出口より流出させ、濃縮された細胞懸濁液を回収容器に回収する。なお、回収容器への回収は、循環回路のチューブに別途三方活栓などの流出口を設けて無菌的に行うことが好ましく、細胞懸濁液回収後は回収容器を回路から密封し分断することが可能であることが好ましい。また、細胞懸濁液を循環回路から回収容器に送液させるために、ポンプ等の機械をこの回路に介在させることが考えられる。回収容器の分断方法としては、クランプを使用してチューブを閉じ、その上流を切断する方法やチューブシーラーを使用した回路の熱溶着後の切断などが挙げられる。また、回収容器には、液体を流出入できるポートを１つ以上具備していることが好ましい。この際、ポートを通じて細胞濃縮液を取り出したり、薬剤を添加することを実施することができる。ポートとしては混注口などが挙げられる。
以下、実験結果を用いて本発明を説明する。なお、ここで細胞回収率とは、回収バックに回収した細胞懸濁液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。細胞数は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定し、白血球分画の細胞濃度を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量と細胞濃度より算出した。
各実験例における細胞濃縮の方法は、各実施例に記載した中空糸モジュールの入り口と出口に塩ビチューブをつなげた。プラスチック容器に細胞懸濁液を貯留させて、懸濁液がモジュールおよびチューブを循環できるように中空糸モジュールの両端から延びる塩ビチューブの両端を懸濁液中に垂らした。塩ビチューブにはポンプを設置し、懸濁液の流れが適当な流速に設定できるようにした。中空糸モジュールのろ液出口にもチューブを取り付け、こちらは廃液入れに注ぐように設置した。ポンプにより流速を調整し、回路に細胞懸濁液を循環させながらろ過を行った。一定量（８０〜１２０ｍL）まで濃縮した後、チューブや中空糸型分離膜内の細胞懸濁液をエアーで押し出した後、ポンプを停止し、プラスチック容器中の細胞懸濁液の細胞数を測定し、回収率を算出した。以下に実施例を示す。
（実施例１）
内径５４０〜６００μｍの中空糸２００本を、膜面積が０．０７ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は８７％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸２００本を、膜面積が０．０７ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は８７％であった。
（実施例２）
内径５４０〜６００μｍの中空糸２５０本を、膜面積が０．０９ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は８７％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸２５０本を、膜面積が０．０９ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は８７％であった。
（実施例３）
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．１１ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は９２％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．１１ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は９２％であった。
（実施例４）
内径５４０〜６００μｍの中空糸３５０本を膜面積が０．１３ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は９２％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸３５０本を膜面積が０．１３ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は９２％であった。
（実施例５）
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．０８ｍ２、容積１０６ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は９６％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．０８ｍ２、容積１０６ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は９６％であった。
（実施例６）
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．０４ｍ２、容積５７ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は８８％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．０４ｍ２、容積５７ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は８８％であった。
（比較例１）
内径５４０〜６００μｍの中空糸４００本を、膜面積が０．１４ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は５９％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸４００本を、膜面積が０．１４ｍ２、容積１５２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は５９％であった。
（比較例２）
内径８００μｍの中空糸６０本を、膜面積が０．０１３ｍ２、容積３２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は７８％であった。
内径８００μｍの中空糸６０本を、膜面積が０．０１３ｍ２、容積３２ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は７８％であった。
（比較例３）
内径６３０μｍの中空糸５９０本を、膜面積が０．１５ｍ２、容積１５０ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は５９％であった。
内径６３０μｍの中空糸５９０本を、膜面積が０．１５ｍ２、容積１５０ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は５９％であった。
（比較例４）
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．０２ｍ２、容積２８ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は７８％であった。
内径５４０〜６００μｍの中空糸３００本を、膜面積が０．０２ｍ２、容積２８ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は７８％であった。
（比較例５）
内径１０００μｍの中空糸２３０本を、膜面積が０．１５ｍ２、容積１２８ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は６７％であった。
内径１０００μｍの中空糸２３０本を、膜面積が０．１５ｍ２、容積１２８ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は６７％であった。
（比較例６）
内径３５０μｍの中空糸３０００本を、膜面積が０．８ｍ２、容積１８５ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は７５％であった。
内径３５０μｍの中空糸３０００本を、膜面積が０．８ｍ２、容積１８５ｍLのケースに入れ、モジュールとした。モジュール内部に培養活性化リンパ球を速度４５０ｍL／ｍｉｎで流しながら、ろ過速度２００ｍＬ／ｍｉｎで培養活性化リンパ球を濃縮した。次に、希釈液を使用して細胞を洗浄し、回収操作を実施して細胞懸濁液を回収したところ、細胞回収率は７５％であった。
表１より、中空糸型分離膜の内径が５４０〜６００μｍ、糸本数が２００〜３５０本であり、且つ、膜面積が０．０４ｍ２〜０．１３ｍ２、中空糸モジュールの容積が５７〜１５２ｍL、中空糸型分離膜孔径が０．１μｍ〜１μｍである中空糸型分離膜を使用して細胞懸濁液を処理することで、高い細胞回収率で細胞濃縮液を製造できることは明らかである。
上記より、本発明における製造方法を用いることにより、縣濁液中の細胞以外の蛋白質などの夾雑物を取り除きつつ、高効率に細胞を回収でき、中空糸における細胞の目詰まりが少なく細胞濃縮液を製造できる。更に細胞の負荷となるような洗浄方法等を使用しないので、細胞へのダメージが少なくなる。
したがって、本発明の方法により製造された細胞濃縮液を用いれば、無菌的な操作処理で目的細胞だけを効率的に濃縮でき、複数の中空糸を使用しないので材料の漏洩も防ぐことができ安全性が高いので、細胞治療用途の細胞も提供できるのである。
１．筒状容器
２．胴部
３．頭部
４．ろ過液出口
５．中空糸型分離膜の束
６．開口端（点線部）
７．樹脂層部（斜線部）
８ａ．細胞懸濁液入口
８ｂ．細胞懸濁液出口
９．ヘッダー部
２．胴部
３．頭部
４．ろ過液出口
５．中空糸型分離膜の束
６．開口端（点線部）
７．樹脂層部（斜線部）
８ａ．細胞懸濁液入口
８ｂ．細胞懸濁液出口
９．ヘッダー部
Claims (11)
- 細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び前記細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を有し、該中空糸型分離膜の内径が５４０〜６００μｍ、糸本数が２００〜３５０本であり、且つ、膜面積が０．０４ｍ２〜０．１３ｍ２である中空糸モジュールを用いて、
（a）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、ろ液をろ液出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、
（b）細胞懸濁液を細胞懸濁液入口より導入し、細胞懸濁液出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程、
を含むことを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。 - 中空糸モジュールの容積が５７〜１５２ｍLであることを特徴とする請求項１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 中空糸型分離膜の孔径が０．１μｍ〜１μｍであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 中空糸型分離膜の材質がポリエーテルスルホン系であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
- （ｂ）の工程前に、希釈液を用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄する工程を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 回収容器が液体を流出入できるポートを１つ以上具備することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
- （ｂ）の工程後に、ポートを通じて細胞濃縮液を取り出す工程を含む請求項６に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- （ｂ）の工程後に、ポートを通じて薬剤を添加する工程を含む請求項６または７に記載の細胞濃縮液の製造方法。
- （ｂ）の工程後に、回収容器を密封し分断する工程を含む請求項１〜８のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
- 請求項１〜９のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法により得られた細胞濃縮液を、再度培養することを特徴とする細胞培養方法。
- 請求項１〜９のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存することを特徴とする凍結保存方法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2019059279A1 (ja) * | 2017-09-20 | 2019-03-28 | 株式会社カネカ | 細胞懸濁液を調製するためのデバイス、システム及び方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003319774A (ja) * | 2002-05-07 | 2003-11-11 | Asahi Kasei Corp | 細胞濃縮方法 |
| JP2012210187A (ja) * | 2011-03-31 | 2012-11-01 | Kaneka Corp | 細胞懸濁液の濃縮方法 |
| WO2013061859A1 (ja) * | 2011-10-24 | 2013-05-02 | 株式会社カネカ | 細胞濃縮液の製造方法 |
-
2013
- 2013-06-28 JP JP2013136936A patent/JP6285649B2/ja active Active
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