JP2003319774A

JP2003319774A - 細胞濃縮方法

Info

Publication number: JP2003319774A
Application number: JP2002131348A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Hatanaka; 美博畑中
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2002-05-07
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2003-11-11

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】生物由来材料の細胞を濃縮する方法であっ
て、生物由来材料から遊離させた細胞懸濁液を、とりわ
け、膵臓器からのランゲルハンス島やインスリン産生細
胞へ分化する幹細胞や前駆細胞を含んだ細胞懸濁液を、
短時間に、かつ、簡便に濃縮する方法を提供する。【解決手段】生物由来材料から遊離させた細胞、例え
ば、膵臓細胞、の懸濁液を中空糸内に通過させることに
よって、生物由来材料の細胞を濃縮することを特徴とす
る細胞濃縮方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、膵臓などの生物由来材
料から遊離された細胞を、短時間に、かつ、簡便に濃縮
する方法に関する。特に、本発明は、酵素などによって
膵臓器などを消化した後、遊離させた組織又は細胞懸濁
液を中空糸内に通過させ、ランゲルハンス島などの特定
の細胞型群を含んだ細胞溶液を、迅速に、かつ、簡便に
濃縮する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病は日本のみならず世界的に広がっ
ている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行っ
た調査では、「糖尿病が強く疑われる人」が約６９０万
人存在し、この値に「糖尿病の可能性を否定できない
人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群
と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人
口は２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５
年では約３億人に達すると予測されている。

【０００３】近年、糖尿病の根治的治療法として、膵島
移植が注目を浴びるようになってきている。膵島移植は
生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、
ハイリスク例にも応用できる優れた糖尿病治療法として
期待されている。膵島移植は、糖代謝の改善による糖尿
病性二次病変の進行阻止または改善を目的としている
が、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法
でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病
（ＩＤＤＭ）は、まさに膵島移植の良い適応対象である
と考えられている。

【０００４】膵島移植は局所麻酔で可能なほどで、手術
侵襲が極めて小さいため糖尿病患者にとってより安全で
あり、血管吻合の必要がないため血管病変の進行により
膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能であ
る。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理
学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によ
る、いわゆるｂａｎｋｉｎｇも可能であるなど、膵（臓
器）移植と比較して多くの利点を有している。

【０００５】インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）
臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられて
いる。これは、インスリンを投与することにより患者自
身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が
回復してくるのを待つという考え方からであり、近年、
積極的に導入され、好結果が報告されている。このこと
は、ＮＩＤＤＭにおいても、膵島移植によって治療可能
であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が
低下してきている時期に膵島を移植すれば、再びβ細胞
機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も
考えられている。

【０００６】実験的医療の段階から始まった膵島移植
は、当初、成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よ
りカナダＥｄｍｏｎｔｏｎにあるＡｌｂｅｒｔａ大学に
おいて、新しい画期的なＥｄｍｏｎｔｏｎＰｒｏｔｏ
ｃｏｌが実施され、膵島移植施行７例全例がｉｎｓｕ
ｌｉｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔとなったということが
報告され（ＳｈａｐｉｒｏＡＭ，ＬａｋｅｙＪＲ
Ｔ，ＲｙａｎＥＡ，ＫｏｒｂｕｔｔＧＳ，Ｔｏｔｈ
Ｅ，ＷａｒｎｏｃｋＧＬ，ＫｎｅｔｅｍａｎＮＭ，
ＲａｊｏｔｔｅＲＶ：ＮＥｎｇＪＭｅｄ，３
４３，２３０−２３８（２０００）を参照。）、このｐ
ｒｏｔｏｃｏｌによる多施設共同トライアルも準備され
ている。

【０００７】このように、膵島移植の臨床研究までに発
展した理由としては、大動物膵よりの大量膵島分離法の
研究がなされ、１９８４年、Ｒｉｃｏｒｄｉらは独自の
自動膵島分離装置を考案し、ブタ、ヒト膵よりの大量膵
島分離に成功したことが大きい。膵島移植に利用される
膵島の分離、調製法として、一般的に、以下のような大
量膵島分離に関する技術が知られている。すなわち、こ
のような技術は、特表平２−５０４２２２２号公報（米
国特許第５０７９１６０号明細書に対応）や、Ｒｉｃｏ
ｒｄｉＣ，ＬａｃｙＰＥ，ＦｉｎｋｅＥＨ，Ｏｌ
ａｃｋＢＪ，ＳｃｈａｒｐＤＷ：Ｄａｉｂｅｔｅ
ｓ，３７，４１３−４２０（１９８８）に代表される文
献に記載されている。

【０００８】具体的な膵島の一般的な単離操作は、以下
の工程で行われる。まず、ヒトまたはブタの膵臓の膵管
に、コラゲナーゼ含有媒体の注入または灌流によって膵
臓を低温で消化し、その後、コラゲナーゼ含有媒体を注
入した膵臓を専用の消化チャンバー内に入れる。第２
に、プロテアーゼの有効な作用を可能にすべく、チャン
バー中の媒体の温度を上げて、膵臓を含有する消化チャ
ンバー中にプロテアーゼ含有媒体と共に入れ、適切な撹
拌を行いながら；第３に、消化チャンバー内の膵臓から
のランゲルハンス島の流出をジチゾン染色により顕微鏡
などで直接検出した後；第４に、新たな低温媒体を消化
チャンバー内に導入して、消化チャンバーから流出して
きた細胞を回収器中に流出させ回収する。最後に、回収
フラスコからの細胞懸濁液にフィコールなどの比重液に
よる勾配を与え、遠心分離してランゲルハンス島細胞を
含有する精製画分を回収する。

【０００９】上記の最後の工程をさらに詳細に述べる
と、細胞を回収した後に、デキストラン、フィコール
（Ｆｉｃｏｌｌ）、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）など
による勾配遠心分離が一般的に行われている。この方法
を行うため、回収フラスコからの細胞懸濁液にフィコー
ルなどによる勾配を与え、遠心分離してランゲルハンス
島細胞を含有する精製画分を回収する。

【００１０】遠心分離後のランゲルハンス島が集積する
画分を取得する方法としては、通常、ピペッティングに
より採取する方法、またはＣＯＢＥ２９１１のような装
置で所望の画分を分離取得する方法が挙げられる。大量
にランゲルハンス島を採取するためには、ＣＯＢＥ２９
１１の装置を用いるのが一般的である。しかしながら、
上記の方法の第３〜４の工程において、膵臓から遊離さ
れた細胞群を回収する為に１リットルから３リットル程
度の大量の生理的媒体が使用される。その後、回収され
た細胞懸濁液は、続いて行われる密度勾配遠心分離によ
るランゲルハンス島の分離精製を行う為に、遠心操作に
よって適当な量に濃縮するというきわめて煩雑な操作が
必要であった。

【００１１】膵島移植への期待は大きく膨らむ一方で、
臓器ドナー不足からくる移植用膵島細胞の絶対的不足が
指摘されている。そこで、幹細胞を大量に取得しインス
リン産生細胞に分化させるという再生医療的研究が注目
されている。Ｂｏｎｎｅｒ−ＷｅｉｒＳ，Ｔａｎｅｊ
ａＭ，ＷｅｉｒＧ．Ｃ．，Ｔａｔａｒｋｉｅｗｉ
ｃｚＫ，ＳｏｎｇＫＨ，ＳｈａｒｍａＡａｎｄ
Ｏ‘ＮｅｉｌＪ．Ｊ．，：ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，７９９９−８００４
（２０００）には、Ｒｉｃｏｒｄｉらの方法によって、
ヒトの膵臓を消化し、密度勾配遠心分離を行った後に、
膵島が集まる異なる比重層の界面画分と膵管上皮細胞な
どが集積する界面画分を集めて培養し、インスリン産生
細胞の増加が確認されているが、膵臓から遊離された細
胞群を濃縮する方法については、一切言及されていな
い。すなわち、これまで生物由来材料から遊離させた細
胞懸濁液を、迅速に、かつ、簡便に濃縮する方法は全く
知られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、生物由来材
料の細胞を濃縮する方法であって、生物由来材料から遊
離させた細胞懸濁液を、迅速に、かつ、簡便に濃縮する
方法を提供することを目的とする。とりわけ、本発明
は、膵臓器からのランゲルハンス島やインスリン産生細
胞へ分化する幹細胞や前駆細胞を含んだ細胞懸濁液を、
短時間に、かつ、簡便に濃縮する方法を提供することを
目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、生
物由来材料から遊離させた細胞懸濁液を中空糸内に通過
させることによって、生物由来材料の細胞を濃縮するこ
とを特徴とする細胞濃縮方法である。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。本明細書
に記載されている、生物由来材料とは、円口類、棘魚
類、板皮類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥
類、哺乳類に属する動物由来の、個体、器官、臓器、組
織のことをいう。生物由来材料の例として、動物個体、
胎児、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、副腎、脾臓、
胆臓、胎盤、食道、胃、腸、大腸、十二指腸、皮膚、
骨、軟骨、目、角膜、羊膜、筋肉、胆管、血管、神経な
どが挙げられる。とりわけ、近年の膵島移植や再生医療
の発展に鑑みて、膵臓、肝臓、胎盤、十二指腸、胆管が
好適に用いられ、近年の膵島移植の劇的な成績の向上を
考慮すると、膵臓がより好適に用いられる。

【００１５】本明細書に記載の、幹細胞とは、種々の細
胞に分化する能力を有する細胞のことを指し、通常、組
織や臓器中に存在する成人幹細胞または前駆細胞なども
含まれる。例えば、インスリンを産生するβ細胞へ分化
する幹細胞（または前駆細胞）は、膵臓の場合、膵管に
存在するという報告や肝臓細胞にも存在するということ
が知られている。本明細書に記載の、密度勾配遠心分離
とは、回収フラスコからの細胞懸濁液に、フィコール、
パーコール、デキストランなどの異なる比重液によって
勾配を与え、遠心分離して比重の異なる細胞群を分離す
る工程のことをいう。密度勾配遠心分離によって分離さ
れた大量のランゲルハンス島を回収する為には、通常、
ピペッティングによる方法や、ＣＯＢＥ２９１１のよう
な装置が用いられる。

【００１６】本明細書に記載の、中空糸とは、適当な膜
厚を有する中空状の構造体のことをいう。中空糸の内
径、長さ、膜厚及び孔径などのサイズには限定は無い
が、１０μｍ程度の幹細胞が中空糸内を通過することお
よび中空糸を束ねたモジュールを製作することを考慮す
ると、中空糸の内径は１０μｍ以上１ｃｍ以下が好まし
い。さらに、ランゲルハンス島のような２００μｍ前後
の大きさの細胞塊が通過することを考慮すると、２００
μｍ以上１ｃｍ以下であることがより好ましい。

【００１７】中空糸の長さは、細胞の濃縮及び回収効率
を考慮すると、０．５ｃｍ以上１００ｃｍ以下であるこ
とが好ましく、中空糸を束ねたモジュール成形を考慮す
ると、１ｃｍ以上５０ｃｍ以下がより好ましい。中空糸
の膜厚は、中空糸を束ねたモジュール成形及び機械的強
度を考慮すると１μｍ以上１ｃｍ以下であることが好ま
しく、より好ましくは５μｍ以上０．５ｃｍ以下であ
る。

【００１８】中空糸の膜の孔径は、水を通過させること
ができ、かつ、細胞が膜の孔からもれないサイズであれ
ばよく、１ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好まし
く、迅速に濃縮することを考慮すると、１０ｎｍ以上１
０μｍ以下であることがより好ましく、最も好ましくは
１０ｎｍ以上１μｍ以下である。中空糸の素材として
は、セルロース、セルローストリアセテート、セルロー
スジアセテート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリ
ル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリメチルメタクリ
レート、ポリアミド、エチレンビニルアルコール共重合
体、ポリフッ化ビニリデンなどが挙げられ、いずれの素
材も用いることができる。生体適合性や高透水性の中空
糸の製造を勘案すると、ポリスルホン、ポリアクリロニ
トリル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリアミド、ポ
リフッ化ビニリデンが好ましい。

【００１９】本発明の方法を、図１の、膵島移植のため
に膵臓からランゲルハンス島を分離し濃縮する工程図に
基づいて説明する。図１において、消化チャンバー１
は、流入口７と流出口８を有し、流出口８が中空糸モジ
ュール２の入口３と接続している。中空糸モジュール２
には、その内部に任意の本数の中空糸６が収容され、入
口３、中空糸内部を通過した液の出口４およびドレン回
収口５を有する。

【００２０】まず、膵臓の膵管にコラゲナーゼ含有媒体
を注入または灌流させて、膵臓を低温で消化し、その
後、コラゲナーゼ含有媒体を注入した膵臓を専用の消化
チャンバー１内に入れる。第２に、プロテアーゼの有効
な作用を可能にすべく、チャンバー中の媒体の温度を上
げて、膵臓を含有する消化チャンバー中に生理的媒体を
流入口７より流入させ、適切な撹拌を行いながら；第３
に消化チャンバー１内から細胞懸濁液を中空糸モジュー
ル２を経由して、中空糸モジュールの出口４から流出さ
せ、流出してきた液を採取してジチゾン染色により顕微
鏡などで直接検出した後；最後に、新たな低温媒体を流
入口７から消化チャンバー１内に導入して、消化チャン
バーから流出してきた細胞懸濁液を中空糸モジュール２
の入口３から中空糸モジュール内に組み込まれた中空糸
６内に導入し、中空糸の壁を通過して外壁に流出する、
細胞を含まない溶液を、中空糸モジュールのドレン回収
口５からドレン回収容器に回収する。一方、中空糸内部
を通過して濃縮された細胞懸濁液は、中空糸モジュール
の出口４から細胞回収容器に回収する。

【００２１】以上述べたように、本発明によると、膵臓
などの生物由来材料から遊離された細胞を、短時間に、
かつ、簡便に濃縮することができるので、ランゲルハン
ス島の分離精製のための密度勾配遠心分離作業に至るま
での細胞濃縮工程が簡便になり、目的のランゲルハンス
島の分離精製工程の時間を大幅に短縮し、かつ、作業を
容易にすることができる。したがって、膵膵島移植の臨
床現場において医療従事者の労働時間および患者への移
植時間の短縮に大いに貢献する。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、実施例をあげて本発明を具
体的に説明するが、本発明は、これに限定されるもので
はない。

【実施例１】ブタ膵臓の消化及び遊離細胞の濃縮ブタから摘出された膵臓の消化は、Ｒｉｃｏｒｄｉらの
方法を改良しておこなった。具体的には、屠殺場にてブ
タ膵臓摘出後、直ちに氷冷した。ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ緩
衝液）にコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、ｔｙｐｅ
Ｓ−１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した液
１００ｍｌを、氷冷した膵臓の膵管に挿入したカニュー
レによりゆっくりと注入した。その後、図１に示す、消
化チャンバー１の流入口７及び流出口８にシリコン製チ
ューブを接続した消化チャンバー１に、上記の膵臓とビ
ー球（直径２ｃｍ）７個を入れた。さらにコラゲナーゼ
溶液（１００）ｍｌと３７℃のＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎ
ｓ溶液を加え、スクリーン（ステンレス製メッシュ、孔
径：０．８５ｍｍ）を取り付け、チャンバーの蓋を閉め
て、震盪機にセットした。

【００２３】その後、１リットルのＨＢＳＳ溶液を満た
した生理的媒体供給容器からポンプを介して３７℃に加
熱した加熱回路（加熱ラジエーター）をゆっくりと通過
させ、流入口７から前記の溶液を消化チャンバー１内に
流入させながら、チャンバーを撹拌した。消化チャンバ
ーの流出口８から出てくる細胞群を含む溶液は、内径２
ｍｍ、長さ１０ｃｍ、膜厚０．５ｍｍのポリスルホン製
中空糸６を２０本束ねて収容したモジュール２を通過さ
せ、出口４から氷で冷やされた容器に回収した。その
際、中空糸膜を通って膜の外側に浸み出たドレン溶液
を、ドレン回収口５からドレン回収容器に回収した。

【００２４】中空糸内部を通過した細胞懸濁液を、中空
糸モジュールの出口４から流出させながら、経時的にそ
の細胞懸濁液の少量を採取し、Ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ溶液
によって染色し、分離ランゲルハンス島細胞の状態を顕
微鏡で観察した。Ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ染色によって、ラ
ンゲルハンス島が確認された後、生理的媒体としてＥｕ
ｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液を生理的媒体供給容器に満た
した。次いで、そのＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液が加
熱系回路（加熱ラジエーター）から氷で冷却された冷却
系回路（冷却ラジエーター）に流れるように、バルブを
切り替えた。

【００２５】その後、１リットルのＥｕｒｏＣｏｌｌ
ｉｎｓ溶液を満たした生理的媒体供給容器からポンプを
介して氷で冷却された冷却回路（冷却ラジエーター）を
ゆっくりと通過させ、前記溶液を流入口７から消化チャ
ンバー１内に流入させながら、チャンバーを撹拌した。
消化チャンバーの流出口８から出てくる細胞群を含む溶
液を、中空糸モジュール２の入口３から導入し、モジュ
ール内の中空糸の中空部を通過させた。そして、モジュ
ールの出口４から流出してくる細胞懸濁液を、氷で冷や
されたＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（米国，
Ｓｉｇｍａ社製）を添加した容器に回収した。その際、
ドレン溶液は、ドレン回収口５からドレン回収容器に回
収した。消化の全工程が終了した時点で、ドレン溶液１
リットルを回収した。すなわち、膵臓から消化遊離され
た細胞懸濁液は、２倍に濃縮されたことが確認された。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、膵臓などの生物由来材
料から遊離された細胞を、短時間に、かつ、簡便に濃縮
することができるので、ランゲルハンス島の分離精製の
ための密度勾配遠心分離作業に至るまでの細胞濃縮工程
が簡便になり、膵島移植のためのランゲルハンス島の分
離精製工程の時間が大幅に短縮され、かつ、その作業が
容易になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】膵臓からランゲルハンス島を遊離し、濃縮する
ための工程図。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物由来材料から遊離させた細胞懸濁液
を中空糸内に通過させることによって、生物由来材料の
細胞を濃縮することを特徴とする細胞濃縮方法。
【請求項２】生物由来材料が膵臓であることを特徴と
する請求項１記載の細胞濃縮方法。