JP6615577B2 - 細胞分離フィルターを用いた細胞濃縮液の製造方法 - Google Patents
細胞分離フィルターを用いた細胞濃縮液の製造方法 Download PDFInfo
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Description
〔1〕導入口及び導出口を備えた細胞分離フィルターを用いて細胞含有液から細胞濃縮液を製造する方法であって、
前記導入口から前記細胞含有液を分割して導入し、前記細胞分離フィルターに細胞を捕捉させた後、前記導出口から回収液を分割して導入し、前記細胞濃縮液を前記細胞分離フィルターから回収する工程を有し、且つ、最初に前記細胞分離フィルターに通液する細胞含有液の処理量(mL)と細胞含有液の全量(mL)の比(最初に前記細胞分離フィルターに通液する細胞含有液の処理量(mL)/細胞含有液の全量(mL))が、0.5以上、1未満であることを特徴とする方法。
〔2〕最初に前記細胞分離フィルターに通液する回収液の処理量(mL)と回収液の全量(mL)の比(最初に前記細胞分離フィルターに通液する回収液の処理量(mL)/回収液の全量(mL))が、0より大きく、0.61以下であることを特徴とする〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記導入口から細胞含有液を分割して導入する回数が2又は3回であることを特徴とする〔1〕又は〔2〕に記載の方法。
〔4〕前記導出口から回収液を分割して導入する回数が2又は3回であることを特徴とする〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕前記回収液が生理食塩水、細胞培養用培地、ヒドロキシエチルスターチ、及びデキストランの群より選択される1つ以上を含むことを特徴とする、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕細胞含有液が血液、骨髄液、臍帯血、月経血、細胞培養液、又はそれらの希釈液のいずれか1つである〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕前記導入口から細胞含有液を分割して導入する前に、前記導入口からプライミング液を導入し、前記細胞分離フィルターをプライミングする工程を含む、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔8〕前記導出口から回収液を分割して導入する前に、前記導入口から洗浄液を導入し、前記細胞分離フィルターを洗浄する工程を含む、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。
本発明は、導入口及び導出口を備えた細胞分離フィルターを用いて細胞含有液から細胞濃縮液を製造する方法であって、
前記導入口から前記細胞含有液を分割して導入し、前記細胞分離フィルターに細胞を捕捉させた後、前記導出口から回収液を分割して導入し、前記細胞濃縮液を前記細胞分離フィルターから回収する工程を有し、且つ、最初に前記細胞分離フィルターに通液する細胞含有液の処理量(mL)と細胞含有液の全量(mL)の比(最初に前記細胞分離フィルターに通液する細胞含有液の処理量(mL)/細胞含有液の全量(mL))が、0.5以上、1未満であることを特徴とする。
直径52mmのポリカーボネート製の円筒状容器に、ポリブチレンテレフタラート製の円形の不織布(細胞分離材)105枚を、積層状態で充填し、上下の開口部にノズル付押え部材を差し込み、その上からキャップでネジ止めし、細胞分離フィルターを作製した。まず生理食塩水50mLを入口側よりシリンジを用いて手押し3回通液した。次にCPD抗凝固の新鮮ウシ血液150mL(CPD:血液=1:4で混合した20%CPDを含むウシ末梢血)を重力落下により導入口より通液した。前記血液の全量である150mLを最初が140mL、残りが10mLとなるように分割して細胞分離フィルターに通液した後、血液の通液とは逆方向から6%ヒドロキシエチルスターチを、それぞれ11.5mLずつシリンジを用いて手押しで流し、合計23mLの回収液を得た。その後、処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター(シスメックス、K−4500)により測定し、血球細胞の回収率を算出した。試験条件詳細及び結果を表1、2に示す。
実施例1と同様にして細胞分離フィルターを作製した。次に実施例1と同様に生理食塩水を3回通液し、CPD抗凝固の新鮮ウシ血液150mL(CPD:血液=1:4で混合した20%CPDを含むウシ末梢血)を全量として、75mLずつ2回に分割し、それぞれ自然落下により導入口より通液した。次に血液の通液とは逆方向から6%ヒドロキシエチルスターチを、それぞれ11.5mLずつシリンジを用いて流し、合計23mLの回収液を得た。その後、処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター(シスメックス、K−4500)により測定し、血球細胞の回収率を算出した。試験条件詳細及び結果を表1、2に示す。
実施例1と同様にして細胞分離フィルターを作製した。次に実施例1と同様に生理食塩水を3回通液し、CPD抗凝固の新鮮ウシ血液150mL(CPD:血液=1:4で混合した20%CPDを含むウシ末梢血)を全量として、75mLずつ2回に分割し、それぞれ自然落下により導入口より通液した。次に血液の通液とは逆方向から6%ヒドロキシエチルスターチを、最初を3mL、残りを20mLとなるようにそれぞれ分割して流し、合計23mLの回収液を得た。その後、処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター(シスメックス、K−4500)により測定し、血球細胞の回収率を算出した。試験条件詳細及び結果を表1、2に示す。
実施例1と同様にして細胞分離フィルターを作製し、生理食塩水を3回通液した。その後CPD抗凝固の新鮮ウシ血液150mL(CPD:血液=1:4で混合した20%CPDを含むウシ末梢血)を全量として、全量を分割せずに自然落下により導入口より通液した。次に血液の通液とは逆方向から6%ヒドロキシエチルスターチを分割せずに全量の23mLを流した。その後、処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター(シスメックス、K−4500)により測定し、血球細胞の回収率を算出した。試験条件詳細及び結果を表1、2に示す。
実施例1と同様にして細胞分離フィルターを作製し、生理食塩水を3回通液した。その後CPD抗凝固の新鮮ウシ血液150mL(CPD:血液=1:4で混合した20%CPDを含むウシ末梢血)を全量として、75mLずつ2回に分割し、それぞれ自然落下により導入口より通液した。次に血液の通液とは逆方向から6%ヒドロキシエチルスターチを分割せずに全量の23mL流した。その後、処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター(シスメックス、K−4500)により測定し、血球細胞の回収率を算出した。試験条件詳細及び結果を表1、2に示す。
直径30mmのポリカーボネート製の円筒状容器に、レーヨン製の円形の不織布(細胞分離材)36枚を積層状態で充填し、ノズル、及び直径26mmの押さえ込み部材にて不織布を固定した細胞分離フィルターを作製した。生理食塩水30mLを導入口側より通液し、ヘパリンにより抗凝固した新鮮ブタ骨髄液合計60mL(ヘパリン50単位)を全量として、自然落下により導入口より30mLずつ2回に分割して通液した。次に骨髄液の通液と同方向からそれぞれ15mLの生理食塩水を流して洗浄し、その後それぞれ25mLずつのDMEM培地を骨髄液の通液とは逆方向から流し、合計50mLの回収液を得た。回収液をポリスチレン製シャーレ(直径10cm、IWAKI社)に移し、37℃、CO2インキュベーター内で培養を行った。2〜3日ごとに培地交換し、培養開始9日後にクリスタルバイオレットでコロニーを染色して出現したコロニー数を測定した。出現したコロニー数より間葉系幹細胞の総数を求めた。試験条件及び結果を表3及び4に示す。
実施例4と同様にして細胞分離フィルターを作製した。生理食塩水を導入口側より通液し、ヘパリンにより抗凝固した新鮮ブタ骨髄液60mL(ヘパリン50単位)を分割せずに自然落下により導入口より通液した。その後、骨髄液の通液と同方向からそれぞれ15mLの生理食塩水を流して洗浄し、分割せずに50mLのDMEM培地を骨髄液の通液した方向とは逆方向から流すことで回収液を得た。実施例4と同様の方法で回収できた総間葉系幹細胞(MSC)数をコロニー出現数より求めた。試験条件及び結果を表3及び4に示す。
Claims (7)
- 導入口及び導出口を備えた細胞分離フィルターを用いて細胞含有液から細胞濃縮液を製造する方法であって、
前記導入口から前記細胞含有液を分割して導入し、前記細胞分離フィルターに細胞を捕捉させた後、前記導出口から回収液を分割して導入し、前記細胞濃縮液を前記細胞分離フィルターから回収する工程を有し、且つ、最初に前記細胞分離フィルターに通液する細胞含有液の処理量(mL)と細胞含有液の全量(mL)の比(最初に前記細胞分離フィルターに通液する細胞含有液の処理量(mL)/細胞含有液の全量(mL))が、0.5以上、0.94以下であり、最初に前記細胞分離フィルターに通液する回収液の処理量(mL)と回収液の全量(mL)の比(最初に前記細胞分離フィルターに通液する回収液の処理量(mL)/回収液の全量(mL))が、0.13以上、0.5以下であることを特徴とする方法。 - 前記導入口から細胞含有液を分割して導入する回数が2又は3回であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記導出口から回収液を分割して導入する回数が2又は3回であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記回収液が生理食塩水、細胞培養用培地、ヒドロキシエチルスターチ、及びデキストランの群より選択される1つ以上を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 細胞含有液が血液、骨髄液、臍帯血、月経血、細胞培養液、又はそれらの希釈液のいずれか1つである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記導入口から細胞含有液を分割して導入する前に、前記導入口からプライミング液を導入し、前記細胞分離フィルターをプライミングする工程を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記導出口から回収液を分割して導入する前に、前記導入口から洗浄液を導入し、前記細胞分離フィルターを洗浄する工程を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
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