DE2802277A1 - Verfahren zur herstellung eines gegen boesartiges wachstum gerichteten immunologischen wirkstoffkomplexes aus zellen - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines gegen boesartiges wachstum gerichteten immunologischen wirkstoffkomplexes aus zellenInfo
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Description
2SQ2277
Dr. K.M. Jaeger Prof.Dr. H. Limburg
7841 Obereggenen Univer.-Frauenklinik des Saarlandes
Sonnenhof 665 Homburg/Saar
NACHQEREICHT j
Verfahren zur Herstellung eines gegen bösartiges Wachstum gerichteten immunologischen Wirkstoffkomplexes
aus Zellen
Leben von Ein- oder Vielzellern, einfach aufgebauten und komplizierten
Organismen wie auch des Menschen ist nur möglich durch die Existenz von Schutzmechanismen gegen exogene Störfaktoren wie unbelebte
giftige Substanzen, belebte Mikroorganismen wie Viren und Bakterien,
physikalische Einwirkungen wie extreme Temperaturen, lang- und kurzwellig..^ Strahlen wie Röntgen-, Radium- oder kosmische Strahlen.
Solche Störfaktoron könen unmittelbar und schnell durch Angriff
an empfindlichen Zellstrukturen töten; häufig wirken sie indirekt
durch vielgliedrige Kausalketten, die zur Lahmlegung von
lebensnotwendigen Synthesen oder Entgiftungsvorgangen führen. Bei
den letzten Mechanismen ist fast immer Eiweiß in irgendeiner Weise beteiligt. Die biologische Unschädlichmachung von zellfremden
oder sonstwie unverträglichen Eiweiß läuft über eine Fülle von großenteils ererbten, aber auch im individuellen Leben erworbenen
Abwehrmechanismen, deren Erkennung und therapeutische, aber auch prophylaktische Verwertung Aufgabe der Immunologie ist. Die Bekämpfung
und teilweise schon erreichte Ausrottung von Infektionskrankheiten
durch spezifische Sera, Impfstoffe, spezifische Antikörper usw. verläuft im Prinzip immer über das Modell der Antigen-Antikörper-Reaktion,
indem das unerwünschte Antigen - so gut wie immer ein Eiweißkörper oder eine eiweißhaltige Verbindung - durch das
spezifische Eiweiß des Antikörpers gebunden, damit unschädlich und der Komplex aus dem Zellinnern oder von der Zellmembran gelöst und
ausgeschieden wird; Dabei ist die Art der "Ausscheidung" noch Gegenstand der Forschung.
Es lag deshalb schon zu Beginn der modernen Immunologie-Forschung nahe, angesichts der zahlreichen Parallelen von Infektions-und bösartigen
Krankheiten auch Antikörper gegen das zellfremde, bösartige
Antigen-Eiweiß des Carzinoms, des Sarkoms oder der Blutkrebse herzustellen, wie dies Paul Ehrlich als maßgeblicher Begründer der
modernen Tumorforschung versuchte. Überraschenderweise mißlang^ eine
aktive oder passive immunologische Behandlung, obwohl später Hinweise
dafür gefunden wurden, daß es durchaus immunologische Mechanismen gegen Krebs gibt. Erzeugt man z.B. durch Implantation eines
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BAD OR?G|NAL
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NACHQEREICHT
krebserzeugenden Stoffes in einer Maus ein Carzinom und exstirpiert
dies rechtzeitig, so geht bei dieser Maus derselbe Tumor, der nicht operierte Mäuse tötet, nicht mehr an. Auch bei einem in
Afrika vorkommenden bösartigen Tumor, dem sog. Burkitt-Tumor,
findet man nach erfolgreicher Therapie mit chemotherapeutischen Präparaten im Blut der Geheilten Antikörper, die einen Burkitt-Tumorkranken
Patienten direkt, also ohne Chemotherapie heilen können. Trotzdem ist trotz immenser Ausdehnung der einschlägigen
Forschung in der ganzen Welt eine Immunotherapie des bösartigen
Wachstums noch nicht existent.
Nach allgemeiner Auffassung entsteht ein Carzinom durch Veränderung normaler Körperzellen· bösartiges Wachstum hat also
die Gegenwart normalen Gewebes zur Voraussetzung. Weiter ist bekannt, daß im gesunden Organismus ständig durch welche Einflüsse
auch immer bösartige Zellen entstehen, die aber unter Kontrolle der gesunden Umgebung bleiben, "abgebaut" werden und keinen
Tumor produzieren. Dieser tritt erst auf, wenn eine bestimmte Anzahl von bösartigen,-Zellen vorhanden ist, die nach Tierversuchen
bei Io bis Io Zellen liegt. Die übertragung einer einzelnen
Krebszelle auch auf einen schon krcbskranken Organismus bleibt in der normalen Umgebung ohne Folgen. Wenn unter diesen
Voraussetzungen aber immunologisch bestfalls Verlangsamungen,
aber keine Heilungen entstehen können, andererseits aber eine
Sporttanheilung bösartiger Gewächse sichergestellt ist, scheint
der Gedanke erlaubt, die generelle Gültigkeit der genannten Voraussetzungen in Frage zu stellen und nach anderen Erklärungsund Versuchsmöglichkeiten zu fragen. Ist also die gutartige und
die bösartige Zelle so grundverschieden von der normalen, wie
bisher angenommen wird? Ist die Entstehung einer bösartigen Zelle notwendiger v/eise Folge eines Einflusses beim Aufbau dieser Zelle
oder ist es nicht eher eine Störung des Abbaus der Zelle? Es ist
bekannt, daß eine zu hohe Zahl von Krebszellen die immunologischen Möglichkeiten des Organismus überfordert. Versagen also bei der
Entstehung des klinischen Krebses die normalen Abbau-Mechanismen,
z.B. der enzymatische Abbau des veränderten Krebszelleiweißes, das sons': wie Körper eiweiß behandelt, nun aber zu Antigenen an
anderen Sollbruchstellen für den Abbau wird und damit der Ausbreitung
des Tumors Vorschub leistet? Da es bisher eine Frühdiagnose des Carzinoms nicht gibt, ist ein therapeutisches,
auch immunologisches Eingreifen erst bei manifesten Tumor möglich.
Die Relation bösartige zu normalen Zellen ist aber im intakten Organismus nicht zu ändern? Die Operation, die Bestrahlung oder die
Chemotherapie versucht das, die Operation bei Frühdiagnose mit überzeugendem Erfolg; die Bestrahlung ist mit Nebenwirkungen verbunden,
die ihre tumorzellvermxndernde Wirkung, die dann auch über den immunologischen Abbauprozeß weiterläuft, überspielen
und damit letztlich unwirksam machen kann; die Problematik der Chemotherapie ist das Auftreten von Nebenwirkungen, die ihre Fortsetzung
verbieten und damit ihre Wirksamkeit begrenzen. Daraus folgt die Frage, ob man nicht die Verbesserung der Beziehung bösartige
zu normalen Zellen außerhalb des Organismus in vitro vornehmen und die normalen Zwischenabbauprodukte als immunologische
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Hilfe therapeutisch zuführen könnte.
Voraussetzungen und Methodik:
Voraussetzungen und Methodik:
Die moderne Lehre von der Entstehung des Lebens besagt, daß in
der Ursuppe präbiotisch komplizierte Substanzen wie Eiweiß, Nucleinsäuren, Enzyme und hormonartige Verbindungen entstanden,
aus denen in einzelnen Schritten Einzeller wurden, die sich gegen die harten Umgebungsbedingungen wie massive UV-Strahlung, kosmische
Strahlung, hohe osmotische Differenzen, hohe Temperaturen usw. erfolgreich zur Wehr setzten. Die Entstehungsbedingungen
würden wir heute ohne weiteres krebsbegünstigend, wenn nicht carzinogen nennen. Diese Zellen waren aber weder gut- noch bösartig,
weil ein solches Attribut für Einzelzellen sinnlos ist. Sie waren lebendig und entwickelten sich zu Vielzellern, die "normal"
waren und alle Regulationsmechanismen besaßen, die ihre Normalität sicherten. Die Erinnerung an das frühe Einzellerleben
wurde genetisch weitergegeben; ein Rückfall in die alten Stoffwechselgewohnheiten
kann offenbar immer wider vorkommen,um so leichter, als bei zunehmenden Altar die phylogenetisch jüngeren
Regulationsmechanismen schwächer werden, also z.B. die Eiweißsynthese, damit die Fermentsynthese auch aus den beim Zellabbau
entstehenden und wieder zu verwertenden Peptiden, Peptonen, Aminosäuren
nachläßt, sodaß aus einer genügenden Anzahl stammesgeschichtlich und individuell gesunder Einzel—Zellen ein bösartiger
Tumor werden kann.
Es kommt demnach darauf an, vorwiegend den normalen Zeil-Abbau zu sichern und Matrizen für die Entstehung von Antikörpern zu liefern,
die die zellinternen Antigene zu kontrollieren vermögen. Zu den normalen Möglichkeiten, die richtigen Matrizen zu liefern, gehören
körpereigene Strahlungen, die bei vielen Stoffwechselvorgängen entstehen, wie die mitogenetisehen Strahlen oder auch
schädigende Strahlen aus dem Blut, die normale Fibrolasten schwer zu schädigen und abzutöten vermögen (Jaeger 193o), ein Vorgang,
der durch Auswaschung der Gewebekulturen verlangsamt und mittels des Waschwassers auf andere normale Kulturen übertragen werden
kann.
Bei dem Versuch, die klinische Behandlung von Carzinomen mittels Chemotherapeutica sicherer zu machen, testeten Limburg und Krähe
1964 die verschiedenen Cytostatica-Typen wie alkylierende Substanzen, Antimetabolite und Mitosegifte hinsichtlich ihrer verschiedenen
Sensibilität auf menschliches Krebsgewebe in der Gewebekultur und fanden erhebliche Unterschiede, die es ermöglichten,
für die jeweilige Patientin eine optimale Cytostatica-Therapie zu betreiben. Es war nun überraschend festzustellen, daß durch die
Cytostatica in vitro erzeugten cytologischen Zeichen der Schädigung bis zum Zelltod mit denen durch die "Blutstrahlung"
(193o) hervorgerufenen bis in zahlreiche Einzelheiten übereinstimmten, wie ein Vergleich der Originalabbildungen überzeugend
dartut.
Aus diesem Befund ergab sich die Folgerung, daß der Abbau von Krebszellen unabhängig von der den Aufbau induzierenden Noxe einem
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( naohqereicht]
nur in engen Grenzen schwankenden Mechanismus festgelegten Musters
folgt. Die leichte Zugänglichkoit der Abbaumatrizen und das Nebeneinander
verschieden schwerer Schädigungsgrade in den Krebszellkulturen führte damit zu dem Versuch, dieses Material auf seine
immunogene Wirkung gegen Krebszellen direkt zu prüfen. Um das zeitraubende Screening an vielen Tiertumoren abzukürzen, verwandten wir
L-Zellen (Monolayer Mausfibrolasten Stamm 929) in vitro (Methodik siehe Riede et al. 1975), seit ca. 3o Jahren gezüchtete
Zellen, die aus einer einzigen^Zelle eines Mäusefibrosarkoms/.entwickelt
wurden, also genetisch völlig identisch sind; bei Reimplantation in eine gesunde Maus entwickelt sie sofort wieder den
Ausgangstumor mit großer Bösartigkeit. Die Streuung der Methode liegt unter 1%, sodaß die in vitro Testung der in vitro Wirkung
praktisch gleichgesetzt werden kann. Die Auspflanzung der Zellen am Ende des Versuches (168 Stunden) und die Färbung nach Feulgen
erlaubt, den exakten Angriffspunkt der jeweiligen Agens in der Zelle
sowie den Zeitpunkt im Zellzyklus zu bestimmen.
In unseren jahrelangen Untersuchungen der Cytostatica-Wirkung auf
menschliches Krebsgeweb/e in vitro wurde nicht ein Fall beobachtet
bei dem nicht Sensibilitäten auf meist mehrere, aber eben oft sehr differente Cytostatica angetroffen wurden.
Es wurde nun gefunden, daß die einmalige Einbringung von menschlichen
Krebszellen, die unter der Einwirkung von Cytostatica standen,
in einer standardisierten Menge von Io Zellen und/oder des zu ihrer
Züchtung verwandten Kulturmediums zu Hemmungen des L-Zellenwachstums
bis zu 85% aller Zellen führte; mit einer zweimaligen Gabe wären alle L-Zellen zu vernichten. Meist handelte es sich um Einwirkungen
im Sinne eines Blocks in der G-, - oder der G2 - Phase,
wobei die erzielten Ergebnisse voll reproduzierbar waren. Vollkommen unerwartet und überraschend erwies sich die hohe cytotoxische
Wirkung menschlicher Mammaca-Zellen, die nach unserer
Methode ohne Zusatz irgendeines Cytostaticums in völlig gleicher Weise gezüchtet worden waren. Neben dem Mamma-Ca fanden wir dies
überraschende Verhalten auch bei Ovarialcarzinomen, wenn auch zahlenmäßig seltener.
Die Deutung dieser Befunde läßt den Schluß zu, daß manche Carzinome noch im Besitz regulierender Faktoren sind, die in
vitro nachgewiesen werden können und fremde Krebszellen zu töten vermögen. Damit ist es gelungen, aus in vitro gezüchteten und
beliebig weiterzüchtbaren Krebszellen, deren Empfindlichkeit auf
bestimmte Cytostatica vorher ausgetestet wurde, und aus originär antigenen Ca-Zellen ein immunologisches Präparat herzustellen, das
durch Mischung der verschiedenen Aktivitäten alle den Abbau von Ca-Zellen immunologisch sichernde Matrizen enthält. Dieses Präparat
kann allein, in Kombination mit allen anderen änticarzinomatösen Maßnahmen angewandt werden. Die Verträglichkeit ist optimal, da es
sich ja um menschliche Zellen in niedriger Zahl handelt, vergleichbar etwa der i.m. Injektion von 1 ml Blut. Eine Kombination der
Präparation mit Mitogenen oder Adjuvantien wie etwa einem niedermolekularen Blutextrakt aus dem Blut junger Kälbeir kann durch vorherige
oder gleichzeitige Zugabe zu einem oder allen verwandten
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T5OFY
Zellen immunitätssteigernd wirken. Die für die erfindungsgemäße
Präparation verwandten Zellen können nach Erreichen des gewünschten Abbaus in vitro auch tiefgefroren und zur Herstellung
des anwendungsfertigen Präparates bei -80 gespeichert werden. Sie
werden in den gewünschten Mischungen entweder vor der Anwendung aufgetaut oder in fertiger Mischung lyophilisiert.
Die Endkonzentration der Mischung aus wenigstens drei different sensiblen und einem spontan wirksamen Zellstamm liegt bei 10
Zellen, kann aber bis auf 10 gesteigert werden.
Unmittelbar nach der Operation werden kleine, möglichst entfernt von etwaigen Nekrosen liegende KrebsStückchen steril entnommen,
in Phosphatpufferlösung gewaschen, der Antibiotica in gebräuchlicher Menge zugesetzt sind, trypsiniert und nach der Methode von
Limburg auf Sensibilität gegen die geläufigen Cytostatica getestet. Die nicht nur für die Testung benötigten Zellen werden bei ca.4 c
Steril aufgehoben, bis das Testergebnis vorliegt, dann die adaequaten Cytostatica zugesetzt, 48-72 Stunden ininkubiert, auf eine
Zellzahl von 10 pro ml eingestellt und entweder bei -80 aufbewahrt
oder mit zwei anderen Zelltypen von anderen Cytostaticasensibilität
sowie einem Mammaca-Tumor mit spontaner L-Zellabtätung im Verhältnis 1:4 zusammengegeben, in Ampullen von ImI steril abgeschmolzen
oder in der genannten Relation lyophilisiert.
Das intermediäre Tieffrieren entfällt, wenn genug geeignetes Zellmaterial
zur Fertigstellung des Endpräparates vorliegt. Die Präparation kann auch aus kontinuierlich gezüchteten DauerStämmen, wie
Heia u. ä. hergestellt werden? doch ist dann von Zeit zu Zeit die
antigene Wirksamkeit am L-Zell-Modell zu überprüfen.
Bei Leukämien sind die leu&ämisehen Zellen abzutrennen und in
einer Konzentration von 10 pro ml nach Austestung abzufüllen;
hier wird jedoch immer ein Mitogen für 24 Stunden zugegeben und
mitabgefüllt.
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Claims (7)
1.) Verfahren zur Herstellung antiblastischer, immunologischer Präparationen aus in vitro gezüchteten menschlichen Tumorzellen,
deren Sensibilität gegen verschiedene Cytostatica festgestellt und deren abtötende Wirkung auf L-Zellen
Stamm 929 nachgewiesen ist.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch, gekennzeichnet, daß
mindestens drei verschiedene sensible Tumoren verwandt werden, die auf nachgewiesen differente Zellzyklusstadien
wirken.
3.) Verfahren nach den Ansprüchen 1 und. 2, dadurch gekennzeichnet,
daß einer dieser drei Stämme ein spontan L-zelltoxLsches
Mamma-Ca-Material darstellt.
4·.) Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 3» dadurch gekenn-„
zeichnet, daß die Endkonzentration pro 1m 106 bis 10° Zellen beträgt.
5.) Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet,
daß leukämische Zellen vom übrigen Blut abgetrennt, 24- Stunden mit einem Mitogen, vorzugsweise einem
Exstrakt aus Eälberblut inkubiert und erst darm mit den Cytostatica getestet und lyophilisiert werden, bei einer
Endkonzentration von 10° Zellen.
6.) Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die different sensiblen Ca-Zellen tiefgefroren und das
fertige Präparat aus den tiefgefrorenen Stämmen zusammengesetzt
wird.
7.) Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen von der Kulturflüssigkeit getrennt und zu
zwei differenten Endproduktion verarbeitet werden.
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