DE3921211C1 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 3 ausgegebene Verfahren zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern und ihre Verwendung nach Anspruch 4.

Der Nachweis von Tumorantigenen, bakteriellen oder viralen Antigenen sowie von durch Mutation veränderten humanen Proteinen, die im Serum, im Urin oder in Geweben des Menschen in extrem niedrigen Konzentrationen vorliegen, erfordert Verfahren, die nicht nur sehr sensitiv, sondern auch hochspezifisch sind. Üblicherweise werden hierfür Verfahren, wie ein Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA, ELISA) oder Immunfluoreszenzassay (IFA) verwendet. In ihnen werden Antigene durch ihre spezifischen, indirekt markierten Antiseren nachgewiesen. Monoklonale Antikörper, die hier ebenfalls zum Nachweis von Antigenen verwendet werden, werden direkt oder auch indirekt markiert.

Es hat sich nun allerdings gezeigt, daß oftmals aus Tieren gewonnene Antiseren, insbesondere gegen Viren, nicht ausreichend sensitiv sind. Sie weisen dann häufig nur Antikörper gegen einige wenige der viralen Antigene auf. Auch ist es vielfach nur möglich, monoklonale Antikörper gegen einzelne, nicht aber gegen alle Antigene eines Virus aus immunisierten Tieren zu erhalten.

Aufgrund solcher Erfahrungen versucht man nun auch Antikörper direkt aus B-Zellen von infizierten oder infiltrierten Personen zu isolieren und zu klonieren. Die Gewinnung solcher humaner monoklonaler Antikörper erweist sich jedoch als äußerst schwierig. Bereits das permanente Inkulturhalten von humanen B-Zellen verursacht große Probleme. So werden Versuche beschrieben, humane B-Zellen durch Virustransformation zu immortalisieren. Auch werden humane B-Zellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert. Bis jetzt erwiesen sich diese Versuche jedoch nicht als geeignet, um B-Zellen so zu kultivieren, daß humane monoklonale Antikörper hergestellt werden könnten.

Auch führten Versuche, in denen Chromosomen aus von humanen B-Zellen und Maus-Myelomzellen gebildeten Hybridomazellen isoliert und in Mikroorganismen transfiziert wurden, nicht zur gewünschten Expression von humanen monoklonalen Antikörpern.

Darüber hinaus ist zu bemerken, daß in Versuchen mit Hybridomazellen generell die Gefahr besteht, daß Chromosomenteile und somit auch Abschnitte von Immunglobulingenen verloren gehen. Unspezifisch bindende humane monoklonale Antikörper sind deshalb häufig die Folge.

Im weiteren werden Versuche beschrieben, humane Antikörper mit definierten Antigen-Bindungsregionen herzustellen, d. h. Antikörper zu konstruieren, deren konstante und variable Regionen von humanen Antikörpern stammen, während ihre Antigen-Bindungregionen genau definiert und mittels Rekombination eingebracht werden. Solche chimären Antikörper finden Anwendung in Patentschriften und relevanten Publikationen über die Herstellung potentieller AIDS- und Tumor-Therapeutika.

Zu bemerken ist allerdings, daß bei der Klonierung von chimären Antikörpern häufig Chromosomenverluste auftreten, so daß auch hier vielfach nur unspezifisch bindende humane monoklonale Antikörper erhalten werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, durch das spezifische humane monoklonale Antikörper hergestellt werden können.

Erfindungsgemäß wird dies in einem Verfahren erreicht, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:

• a) Isolierung und Aufbereitung von antigenpräsentierenden Zellen, T-Helfer(T_H)-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern aus tumorinfiltrierten, mit prokaryontischen oder eukaryontischen Erregern, insbesondere Viren, infizierten oder eine erbliche Krankheit aufweisenden Personen,
• b) Aktivierung der T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von a) durch Anbindung an die antigenpräsentierenden Zellen von a),
• c) Isolierung und Aufbereitung von B-Zellen aus tumorinfiltrierten, mit prokaryontischen oder eukaryontischen Erregern, insbesondere Viren, infizierten, eine erbliche Krankheit aufweisenden oder gesunden Personen,
• d) Aktivierung der B-Zellen von c) durch Anbindung an die antigenaktivierten T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von b), und
• e) Klonierung der aktivierten B-Zellen von d).

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden antigenpräsentierende Zellen vorzugsweise aus der Pleuraflüssigkeit der angegebenen Personen isoliert. Dazu wird diese Flüssigkeit mit einem Puffer, vorzugsweise Hanks, verdünnt und zentrifugiert. Die pelletierten Zellen werden dann in Medium, das hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthält, aufgenommen und inkubiert.

Vorzugsweise enthält das Medium auch Stoffe, durch die Zellen zur Proliferation angeregt werden. Als bevorzugte Stoffe werden dabei Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die aus den in der DE-OS 38 11 692 beschriebenen Farbstoffmolekülen A und B erhalten werden. Unter dem Farbstoffmolekül A versteht man das Kondensationsprodukt von Flavoprotein, nämlich jenes von Riboflavin-5′-monophosphatnatriumsalz mit alpha-Liponsäure, das nach Zugabe von Jodacetamid und Dialysieren nach Destillation zurückbleibt. Als Farbstoffmolekül B versteht man das weitere Umsetzungsprodukt des Destillationsrückstandes mit einer Reaktionslösung aus 1,4-Bis(4-methyl-5-phenyl-2-oxazolyl)-benzol und p-Terphenyl in einem organischen Lösungsmittel, dem Maleinsäureanhydrid zugesetzt ist, und das nach mehrstündigem Stehen auf einen neutralen pH-Wert eingestellt und in üblicher Weise gereinigt ist. Zellen, die die angesprochenen Fluoreszenzfarbstoffe aufgenommen haben, erfahren nicht nur eine Wachstums-Stimulation, sondern werden auch fluoreszenzmarkiert und somit unter dem Mikroskop erkennbar. Erfindungsgemäß werden die angesprochenen Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt gekoppelt, beispielsweise mit Proteinen oder Peptiden, eingesetzt. Sie werden dann als carriergebundene Fluoreszenzfarbstoffe bezeichnet.

Zellen, die sich bei der Inkubation mit dem angesprochenen Medium nicht festsetzen, werden durch mehrmaliges Waschen entfernt und von den adhärenten Zellen werden kontaminierende Fibroblasten, Makrophagen und Mesothelzellen abgetrennt. Aus fluoreszenzmarkierten antigenpräsentierenden Einzelzellen werden schließlich Klone herangezogen. Dazu wird ein serumfreies, die Proliferation antigenpräsentierender Zellen förderndes Medium (nachstehend als serumfreies, antigenstimulierendes Medium bezeichnet) verwendet. Als Medium kann hierfür beispielsweise das handelsübliche Basismedium IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium) ohne L-Glutamin herangezogen werden. Diesem Medium werden Faktoren wie TCGF (Interleukin 2) und GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor) zugegeben.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer vorzugsweise aus Venenblut der angegebenen Personen isoliert. Die Zellen werden dabei durch mehrere Zentrifugationsschritte gesammelt und auf mit Blutgruppenseren und GM-CSF (vorstehend angegeben) beschichteten Petrischalen ausplattiert. Nicht-adhärente Zellen werden abgewaschen, während die festsitzenden Zellen in serumfreiem, antigenstimulierenden Medium (vorstehend angegeben) resuspendiert und aufbewahrt werden.

Die T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden durch Anbindung an die antigenpräsentierenden Zellen aktiviert. Die Aktivierung verläuft in drei Phasen. Nach der Anbindung der T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer an die antigenpräsentierenden Zellen wird IL-1 (Interleukin 1) gebildet. Dies führt zusammen mit der Stimulation durch das Antigen zur Ausbildung von IL-2 Rezeptoren auf den T_H-Zellvorläufer. T_H-Zellvorläufer werden zur Freisetzung von IL-2 angeregt, wodurch die Proliferation der antigenaktivierten B-Zellvorläufer induziert wird.

Erfindungsgemäß werden T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer vorsichtig mit fluoreszenzmarkierten antigenpräsentierenden Zellen gemischt und inkubiert. Nicht-adhärente Zellen werden abgewaschen, während die festsitzenden Zellen in serumfreies, die Proliferation antigenpräsentierender Zellen nicht-förderndes Medium (nachstehend als serumfreies, nicht-antigenstimulierendes Medium bezeichnet) überführt und in diesem inkubiert werden. Als Medium kann beispielsweise das handelsübliche Basismedium IMDM (Iscoves medified Dulbecco medium) ohne L-Glutamin verwendet werden. Diesem Medium werden Faktoren wie LAF (Interleukin 1), TRF (T-cell replacing factor) und GM-CSF (vorstehend angegeben) zugegeben. Unter kurzer Einwirkung von UV-Licht und der Wegnahme des CO₂-Druckes werden die antigenaktivierten T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von den antigenpräsentierenden Zellen abgelöst. Anschließend werden die antigenaktivierten Zellvorläufer abzentrifugiert und in serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium (vorstehend angegeben) resuspendiert und aufbewahrt.

Zur Aktivierung von B-Zellen werden diese an die antigenaktivierten T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer angebunden. Die B-Zellen reifen dann zu antikörperproduzierenden (-sezernierenden) Zellen (Plasmazellen) aus. Reife B-Zellen können dabei von unreifen B-Zellen durch Inkubation mit einem gegen ihr Oberflächenimmunuglobulin gerichteten Antikörper unterschieden werden. Reife B-Zellen synthetisieren ihr Oberflächenimmunuglobulin innerhalb von 24 h neu, während unreife B-Zellen dazu nicht in der Lage sind.

Erfindungsgemäß werden B-Zellen vorzugsweise aus Venenblut der angegebenen Personen isoliert. Die Zellen werden gewaschen, in serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium, dem vorzugsweise zur Proliferations-Stimulierung der Zellen der vorstehend angegebene Fluoreszenzfarbstoff zugegeben wird, inkubiert, anschließend zentrifugiert und gewaschen. Die pelletierten Zellen werden erneut in gleichem Medium aufgenommen und vorsichtig mit antigenaktivierten T_H-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern gemischt und dann inkubiert. Durch das Einwirken von UV-Licht und dem CO₂-Druckabfall werden die antigenaktivierten Vorläuferzellen abgelöst. Sie werden abzentrifugiert, während die festsitzenden aktivierten B-Zellen mehrmals in Medium gewaschen, zentrifugiert und erneut in Medium resuspendiert werden. Die aktivierten B-Zellen werden dann in Tüpfel von Mikrotiterplatten eingebracht und inkubiert. Die Platten werden zentrifugiert und nachdem Makrophagen und restliche Zellvorläufer entfernt sind, werden die aktivierten B-Zellen nochmals mit dem vorstehend angegebenen Fluoreszenzfarbstoff markiert und 8 Tage inkubiert. Alle zwei Tage wird die Antikörperproduktion überprüft. Dazu werden die Überstände der Tüpfel getestet. B-Zellen, deren Überstände positiv sind, werden Freßzellen oder Makrophagen zugegeben, wodurch die B-Zellen zur Proliferation angeregt werden. Nach Ausdifferenzierung zu antikörpersezernierenden Plasmazellen werden diese kloniert. Dazu werden die in den positiven Überständen vorliegenden Zellen vereinzelt und kultiviert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, humane monoklonale Antikörper herzustellen, ohne daß dabei Rekombinations- oder Zellfusionsverfahren angewandt werden müßten. So können die bei diesen Verfahren oftmals eintretenden Chromosomenverluste vermieden werden, wodurch auch die damit verbundene Gefahr, unspezifisch bindende Antikörper zu erhalten, ausgeschlossen werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist ferner den großen Vorteil auf, daß nicht wie üblich Antikörper nur von einer begrenzten Zahl verschiedener, reifer humaner B-Zellen (Plasmazellen) erhalten werden, sondern daß durch die Verwendung von T_H-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern noch das Gesamt-Potential aller in einer Person möglicher Antikörpervariationen ausgenutzt werden kann. Die Möglichkeit, verschiedenste Antikörper zu erhalten, ist damit gegeben. So gelang es beispielsweise auch Antikörper gegen das HIV-Oberflächenprotein gp 120 und seinen Vorläufer gp 160 zu isolieren.

Erfindungsgemäß hergestellte humane monoklonale Antikörper besitzen wie bereits angesprochen die Fähigkeit spezifisch zu binden. Sie eignen sich also zum Nachweis ganz spezieller Antigene und damit zur Diagnose von Tumor-, erblichen oder durch prokaryontische oder eukaryontische Erreger, insbesondere Viren, hervorgerufenen Erkrankungen. Als virale Erkrankungen sind dabei besonders AIDS, Multiple Sklerose und Alzheimerische Krankheit gemeint, während als Tumorerkrankungen insbesondere das Kleinzellen-Lugenkarzinom angesprochen ist.

Erfindungsgemäß hergestellte humane monoklonale Antikörper eignen sich darüber hinaus auch für therapeutische Maßnahmen, da aufgrund fehlender wirtsfremder Determinanten in behandelten Patienten keine gegen die erfindungsgemäß hergestellten Antikörper gerichtete Antikörperproduktion stattfindet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung eines zur Wachstums-Stimulierung von Zellen geeigneten Fluoreszenzfarbstoffes

Die kristallinen Farbstoffmoleküle A und B gemäß DE-OS 38 11 692 (Seite 2 und Anspruch 1) werden getrennt in PBS Puffer im Ultraschallbad bis zur klaren Lösung behandelt. Je 4 mmol der Farbstoffmoleküle A und B (8 mmol insgesamt) werden in 100 ml einer 0,1 N HCl unter tropfenweiser Zugabe einer 1%igen NaNO₂-Lösung unter ständigem Rühren bei 4°C diazotiert.

Zur Vermeidung eines Überschusses von HNO₂ wird das Reaktionsgemisch mit Stärke-Jodid-Teststreifen kontrolliert. Liegt freies HNO₂ vor, zeigt der Teststreifen eine blau-schwarze Färbung.

Nach Beendigung der Reaktion wird das Farbstoff-Konjugat 1 h bei 4°C dialysiert und steril filtriert.

Der gebrauchsfertige Fluoreszenzfarbstoff wird auf pH -7,5 eingestellt und im Kühlschrank aufbewahrt.

Beispiel 2 Herstellung von carriergebundenem Fluoreszenzfarbstoff

Durch Kopplung des gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoffes von Beispiel 1 mit Protein, Peptiden oder anderen Substanzen wird ein carriergebundener Fluoreszenzfarbstoff erhalten.

Die Kopplungsreaktion wird bei 4°C und einem pH-Wert von 9,0 durchgeführt.

Von einem Protein mit einem Molekulargewicht von 155 000 (IgG) werden 0,08 mmol zur Kopplung benötigt.

Diese Proteinmenge wird in 100 ml Borat-Puffer, oder als Alternative in Karbonat-Puffer, pH -9,0 unter leichtem Rühren gelöst und der gebrauchsfertige Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 wird langsam unter ständiger pH-Kontrolle und leichtem Rühren an der Innenwand des Reaktionsgefäßes ablaufend der Proteinlösung zugegeben. Nach beendeter Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffes wird die Reaktionslösung noch 2 h bei 4°C unter häufiger pH-Kontrolle gerührt. Über Nacht wird die Reaktionslösung im Kühlschrank stehengelassen und danach 12 h gegen 5-7 L 0,15 M NaCl dialysiert. Nach Abschluß der Dialyse wird der pH-Wert auf 7,5 eingestellt.

Die Kopplung kann alternativ auch mittels einer Gleichgewichtsdialyse vorgenommen werden. Zwei Dialysekammern mit unterschiedlichen Membranen werden mit einem dazwischenliegenden Membranfilter zusammengefügt und luftdicht verschlossen.

In der Kammer mit der Membran, die die Diffusion des gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoffes, nicht aber die des Proteins oder Peptides gestattet, wird die Proteinlösung eingebracht, in die andere Kammer der gebrauchsfertige Fluoreszenzfarbstoff.

Das Gleichgewicht ist erreicht, wenn die Konzentration des freien Proteins auf beiden Seiten gleich ist.

Die Messung von freiem und gebundenem Protein erfolgt im Fluorometer. Die Absorptions- und Emissionsspektren zeigen freie und gebundene Proteinmengen auf.

Hyaluronidase (MG 89 000) stellt einen wichtigen Diffusionsfaktor zum Einbau von Proteinen, Peptiden und anderen Substanzen in lebende Zellen dar.

In 100 ml gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 wird 1 ml gelöste Hyaluronidase (in 0.9% NaCl) pipettiert. Dann wird das Reaktionsgemisch 10 min bei 37°C stark gerührt, auf 4°C abgekühlt, dialysiert und auf pH -7,5 eingestellt. Für den Zelleinbau werden bestimmte Proteine, Peptide oder andere Substanzen mit dem gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 gekoppelt. Die Einführung in die Zellen erfolgt nach den Anwendungsvorschriften "Gen Pulser ^TM-Transfektionsgerät, Bio-Rad-Lab., Richmond, CA., USA.

Beispiel 3 Isolierung und Aufbereitung antigenpräsentierender Zellen aus humaner Pleuraflüssigkeit

Pleuraflüssigkeiten von Tumor- oder HIV-Patienten werden zur Gewinnung antigenpräsentierender Zellen verwendet.

Die Pleuraflüssigkeit wird zentrifugiert und der erhaltene Zellniederschlag mit modifizierter Hanks-Lösung gewaschen, zentrifugiert und zu 3 ml Aliquots abgefüllt.

Die präparierten Zellen (Aliquots) werden im Medium M 199, das mit 2%igem hitzeinaktivierten fötalen Kälberserum und 100 µl Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 2) ergänzt ist, resuspendiert und dann in Kulturflaschen überführt und 24 h kultiviert. Danach werden nicht-adhärente Zellen abgewaschen und festsitzende markierte Zellen mit 0,25 M EDTA, pH -7,5 behandelt, um kontaminierende Fibroblasten, Makrophagen und Mesothelzellen zu entfernen.

Spezifische Zellen werden dann in serumfreies, antigenstimulierendes Medium überführt. Es handelt sich um das Basismedium - IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium), ohne L-Glutamin, das mit Faktoren wie 1 U/ml TCGF, 0.1 µl/ml GM-CSF und 10 µl/ml Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 1) ergänzt wird. Die erhaltenen fluoreszenzmarkierten Klone werden in 100 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff eingelagert.

Beispiel 4 Isolierung und Aufbereitung humaner T_H-Zellvorläufer und B-Zell-Vorläufer

T_H-Zellvorläufer und/oder B-Zellvorläufer werden nach dem bekannten "buffy coat"-Verfahren oder diesem in etwas modifizierter Form durchgeführten Verfahren aus heparinisiertem Venenblut von virusinfizierten oder tumorinfiltrierten Personen mit handelüblichen Zentrifugationsmedien isoliert, gewaschen und in mit humanen A- und B-Blutgruppenseren beschichteten Petrischalen 6 h in feuchter Kammer bei 37°C inkubiert. Die Petrischalen waren zusätzlich mit GM-CSF (100 µl 1 : 10 und 100 µl 1 : 500) beschichtet, wobei das Volumen dem der Verwendung von Blutgruppenseren entsprach.

Nicht adhärente Zellen werden ausgewaschen und die festsitzenden Zellen werden bis zur Wiederverwendung in serumfreiem, antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 3) resuspendiert und im Kühlschrank aufbewahrt.

Beispiel 5 Isolierung und Aufbereitung humaner B-Zellen

B-Zellen von HIV-infizierten oder tumorinfiltrierten Personen werden nach dem bekannten Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugations-Verfahren isoliert, gewaschen und 1 h bei 37°C unter Zugabe von 100 µl Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 in serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium inkubiert. Es handelt sich um das Basismedium-IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium), ohne L-Glutamin, das mit Faktoren wie 1 U/ml LAF, 1µl/ml TRF, 0,1 µl/ml GM-CSF und 10 µl/ml Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 1) ergänzt wird. Anschließend wird 5 min bei 500 g zentrifugiert.

Der Zellniederschlag wird im Medium resuspendiert und die Zellsuspension wird dann auf 2×10⁶ Zellen/ml eingestellt und aufbewahrt. Bei 9-20% Fluoreszenzfarbstoff im Medium werden Zellzahlen von 4.85×10⁶ bis 5.36×10⁶ Zellen erreicht. Farbstoffkonzentrationen unterhalb von 50% haben keinen negativen Effekt auf die Lebensfähigkeit der Zellen.

Beispiel 6 Anbindung humaner antigenpräsentierender Zellen an humane T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer

100 µl fluoreszenzmarkierte antigenpräsentierende Zellen werden mit 100 µl T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer gemischt und 60 min bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Danach werden nicht-adhärente Zellen ausgewaschen. Die festsitzenden Zellen werden in serumfeies, antigenstimulierendes Medium (siehe Beispiel 3) zurückgeführt, 90 min bei 40°C inkubiert und dann zentrifugiert. Unter kurzer Einwirkung von UV-Licht und Luftdruckschwankungen lösen sich die antigenpräsentierenden Zellen vollständig von den antigenaktivierten T_H-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern ab.

Nach einer Zentrifugation werden die antigenaktivierten Zellvorläufer in serumfreiem, antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 3) resuspendiert und bis zu ihrem Gebrauch aufbewahrt.

Beispiel 7 Anbindung antigenaktivierter humaner T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer an humane B-Zellen

B-Zellen werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, vorbehandelt.

Eine Menge von 50 µl fluoreszenzmakierter, antigenaktivierter T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden mit der entsprechenden Menge von 50 µl vorbehandelter B-Zellen vorsichtig gemischt und 60 min bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.

Nichthaftende Zellen werden nach Inkubation mit serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 5) abgewaschen. Die adhärenten Zellen werden in serumfreies, nicht-antigenstimulierendes Medium zurückgeführt und 90 min bei 40°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach der Inkubation findet eine kurze Einwirkung von UV-Licht (360-420 nm) und ein Druckabfall statt. Die antigenaktivierten T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden vollständig von den B-Zellen abgelöst. Aus dem Überstand werden die antigenaktivierten T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer abzentrifugiert und in serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium (vorstehend angegeben) resuspendiert. Nachdem Makrophagen und restliche Zellvorläufer entfernt sind, können die B-Zellen nochmals mit 100 µl des Fluoreszenzfarbstoffes (von Beispiel 1) markiert, dann aliquotiert und bei -20°C bis zu ihrem Gebrauch eingelagert oder in Tüpfel von Mikrotiterplatten (1×10⁹ Zellen/ml und 2×10⁹ Zellen/ml) überführt und 8 Tage bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert werden. Alle zwei Tage wird die Antikörperbildung überprüft.

Nach Stimulation durch Freßzellen oder Markophagen proliferieren diese Zellen und differenzieren als Klone zu antikörpersezernierenden Plasmazellen aus.

Beispiel 8 Klonierung der antikörpersezernierenden Plasmazellen

Alle Tüpfel mit positivem Überstand werden gesammelt. Je nach Wahl werden 10⁸ Freßzellen/ml oder 4×10⁶ Makrophagen/ml in die Tüpfel der Mikrotiterplatten eingebracht.

Die im positiven Überstand vorliegenden Zellen werden gezählt. Für die Klonierung sind 10³ Zellen ausreichend.

30 Zellen werden in 1 ml Medium von Beispiel 7 suspendiert und dann in 0,1 ml Aliquots ausplattiert. Die restlichen Zellen werden auf 10 Zellen/ml und dann so weiter bis 3 Zellen/ml eingestellt. Alle in Tüpfeln verteilten Zellen werden bei 37°C in feuchter Kammer inkubiert.

Aufbereitung von humanen Freßzellen und Makrophagen

20 ml Frischblut werden mit serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 5 und 7) verdünnt und nach bekannten Verfahren mit Ficoll 15 min bei 500 g zentrifugiert. Rote Blutzellen und Polymorphe befinden sich dann am Röhrchenboden. Periphere einkernige Blutzellen, so auch Monozyten liegen in der Zwischenphase. Diese Phase wird vorsichtig abgesaugt und mit demselben Volumen an dem Medium von Beispiel 7 versetzt und 5 min bei 500 g zentrifugiert. Der Zellniederschlag wird dann im Medium resuspendiert, gezählt und auf 3×10⁷ Zellen/ml eingestellt. Das Gesamtvolumen sollte 10 ml nicht überschreiten. Dem Gesamtzellvolumen von 10 ml wird 1 ml Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 zugefügt. Die Zellen werden dann im Medium verdünnt und mit 5×10⁴ Zellen/Tüpfel ausplattiert.

Beispiel 9 Aktivitätstest von erfindungsgemäß hergestelltem HIV-Antikörper gp 120/160

Seren von 5 seropositiven/viruspositiven Patienten, 5 seropositiven/virusnegativen Patienten und 5 Normalpersonen werden isoliert und aufbereitet.

Jeweils 200 µl aus diesen 15 Humanseren werden in je 3 Reihen einer mit HIV-Antigen beschichteten kommerziellen Mikrotiterplatte pipettiert und 1 h bei RT inkubiert und dann gewaschen. Jeweils 50 µl unverdünnter, 1 : 100 verdünnter, 1 : 500 verdünnter und 1 : 1000 verdünnter fluoreszenzmarkierter HIV-Antikörper gp 120/160 werden zugegeben, bevor 1 h bei RT inkubiert und dann gewaschen wird. Nach Zugabe von 100 µl Blockierungslösung (Sterilmolke) wird die Mikrotiterplatte 15 min stehengelassen, dann gewaschen und gemessen.

Auswertung:
Für die Auswertung von Ergebnissen im unteren Normalbereich bieten sich folgende Auswertungen an:
Regressionsmethode - einfach linear und die gerichtete lineare Regression,
Spline Interpolation und polygonale Interpolation.

Gerät-Enzymreader Behringwerke, 410 nm.

Berechnungsbeispiel:
negative Kontrolle 0.050
	positive Kontrolle 0.600
	(0.050+0.600/2)=0.325
Absorptionsratio:	weniger als 2,5 negativ
	zwischen 2.5-5 Annahme von HIV-AK bis low-level
	größer als 5-11 high level

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Mittelwert der 5 Seren der Normalpersonen: 0.058
Mittelwert der 5 seropositiven/viruspositiven Seren: 2.7
Mittelwert der 5 seropositiven/virusnegativen Seren: 1.85

Beispiel 10 Immuncytochemischer Assay

Zellen werden mit einem nicht markierten Antikörper reaktiviert, gewaschen, in chamber slides transferiert und auf dünn aufgetragenes Medium (von Beispiel 3) angesetzt und dann fixiert. Die zu untersuchenden Zellen werden mit 50 µg/ml L-Lysin oder mit carriergebundenem Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 2) vorbehandelt. Ein Überschuß der L-Lysin Bindungskapazität wird nach 10 Minuten mit 1 bis 2 Tropfen (25 µl bis 50 µl) Blockierungslösung (sterile Molke) verhindert. Anschließend werden die Zellen mit Medium gewaschen, eine Stunde in feuchter Kammer mit einem erfindungsgemäß fluoreszenzmarkierten Antikörper oder mit einem nach üblichen Verfahren markierten Antikörper bei RT oder 37°C inkubiert (die Inkubationstemperatur hängt von der Art des Antikörpers ab), danach wieder mit Medium gewaschen und unter dem Mikroskop in den chamber slides untersucht.

Beispiel 11 Direkte und indirekte Membran-Immunfluoreszenz

Mit den Verfahren der direkten und indirekten Membran-Immunfluoreszenz kann Biopsie-Material, insbesondere Lymphknoten, sofort untersucht werden.

Für das direkte Test-Verfahren werden frische humane Lymphknoten mit einem Tropfen eines erfindungsgemäß fluoreszenzmarkierten und zusätzlich komplementverstärkten humanen monoklonalen Antikörpers beschickt, 10 Minuten inkubiert und mit physiologischer, steriler Kochsalzlösung gewaschen.

Beim indirekten Test-Verfahren werden erfindungsgemäß hergestellte, jedoch keine Fluoreszenz aufweisende, komplementverstärkte, humane monoklonale Antikörper mit fluoreszentmarkiertem Anti-Ig sichtbar gemacht.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• a) Isolierung und Aufbereitung von antigenpräsentierenden Zellen, T_H-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern aus tumorinfiltrierten, mit prokaryontischen oder eukaryontischen Erregern, insbesondere Viren, infizierten oder eine erbliche Krankheit aufweisenden Personen,
• b) Aktivierung der T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von a) durch Anbindung an die antigenpräsentierenden Zellen von a),
• c) Isolierung und Aufbereitung von B-Zellen aus tumorinfiltrierten, mit prokaryontischen oder eukaryontischen Erregern, insbesondere Viren, infizierten, eine erbliche Krankheit aufweisenden oder gesunden Personen,
• d) Aktivierung der B-Zellen von c) durch Anbindung an die antigenaktivierten T_H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von b), und
• e) Klonierung der aktivierten B-Zellen von d).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigenpräsentierenden Zellen aus der Pleuraflüssigkeit und die T_H-Zellvorläufer, B-Zellvorläufer und B-Zellen aus Venenblut isoliert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufbereitung der isolierten antigenpräsentierenden Zellen und der isolierten B-Zellen eine Proliferations-Stimulierung der Zellen umfaßt.

4. Verwendung der nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellten humanen monoklonalen Antikörpern zur Diagnose bei Tumor-, erblichen oder durch prokaryontische oder eukaryontische Erreger, insbesondere Viren, verursachten Erkrankungen.