HERSTELLUNGSVERFAHREN FÜR HUMANE MONOKLONALE ANTIKÖRPER
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern und ihre Verwendung.
Der Nachweis von Tumorantigenen, bakteriellen- oder viralen Antigenen sowie von durch Mutation veränderten humanen Proteinen, die im Serum, im Urin oder in Geweben des Menschen in extrem niedrigen Konzentrationen vorliegen, erfordert Verfahren, die nicht nur sehr sensitiv, sondern auch hochspezifisch sind, üblicherweise werden hierfür
Verfahren, wie ein Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA, ELISA) oder Immunfluoreszenzassay (IFA) verwendet. In ihnen werden Antigene durch ihre spezifischen, indirekt markierten Antiseren nachgewiesen. Monoklonale Antikörper, die hier ebenfalls zum Nachweis von Antigenen verwendet werden, werden direkt oder auch indirekt markiert.
Es hat sich nun allerdings gezeigt, daß oftmals aus Tieren gewonnene Antiseren, insbesondere gegen Viren, nicht ausreichend sensitiv sind. Sie weisen dann häufig nur
Antikörper gegen einige wenige der viralen Antigene auf. Auch ist es vielfach nur möglich, monoklonale Antikörper gegen einzelne, nicht aber gegen alle Antigene eines Virus aus immunisierten Tieren zu erhalten.
Aufgrund solcher Erfahrungen versucht man nun auch Antikörper direkt aus B-Zellen von infizierten oder infiltrierten Personen zu isolieren und zu klonieren. Die Gewinnung solcher humaner monoklonaler Antikörper erweist sich jedoch als äußerst schwierig. Bereits das permanente Inkulturhalten von humanen B-Zellen verursacht große Probleme. So werden Versuche beschrieben, humane B-Zellen durch Virustransformation zu im ortalisieren. Auch werden humane B-Zellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert. Bis jetzt erwiesen sich diese Versuche jedoch nicht als geeignet, um
B-Zellen so zu kultivieren, daß humane monoklonale Antikörper hergestellt werden könnten.
Auch führten Versuche, in denen Chromosomen aus von humanen B-Zellen und Maus-Myelomzellen gebildeten Hybridomazellen isoliert und in Mikroorganismen transfiziert wurden, nicht zur gewünschten Expression von humanen monoklonalen Antikörpern.
Darüberhinaus ist zu bemerken, daß in Versuchen mit Hybridomazellen generell die Gefahr besteht, daß Chromosomenteile und somit auch Abschnitte von Immunglobulingenen verloren gehen. Unspezifisch bindende humane monoklonale Antikörper sind deshalb häufig die Folge.
Im weiteren werden Versuche beschrieben, humane Antikörper mit definierten Antigen-Bindungsregionen herzustellen, d.h. Antikörper zu konstruieren, deren konstante und variable Regionen von humanen Antikörpern stammen, während ihre Antigen-Bindungsregionen genau definiert und mittels Rekombination eingebracht werden. Solche Chimären Antikörper finden Anwendung in Patentschriften und relevanten Publikationen über die der Herstellung potentieller AIDS- und Tumor-Therapeutika.
Zu bemerken ist allerdings, daß bei der Klonierung von Chimären Antikörpern häufig Chromosomenverluste auftreten, so daß auch hier vielfach nur unspezifisch bindende humane monoklonale Antikörper erhalten werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, durch das spezifische humane monoklonale Antikörper hergestellt werden können.
Erfindungsgemäß wird dies in einem Verfahren erreicht, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:
a) Isolierung und Aufbereitung von antigenpräsentierenden Zellen, T-Helfer( )-Zellvorläufern und π
B-Zellvorläufern aus tumorinfiltrierten, mit prokaryontischen oder eukaryontischen Erregern, insbesondere Viren, infizierten oder eine erbliche Krankheit aufweisenden Personen,
b) Aktivierung der τn„-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von a) durch Anbindung an die antigenpräsentierenden Zellen von a) ,
c) Isolierung und Aufbereitung von B-Zellen aus tumorinfiltrierten, mit prokaryontischen oder eukaryontischen Erregern, insbesondere Viren, infizierten, eine erbliche Krankheit aufweisenden oder gesunden Personen,
d) Aktivierung der B-Zellen von c) durch Anbindung an die antigenaktivierten
und B-Zellvorläufer von b) , und
e) Klonierung der aktivierten B-Zellen von d).
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden antigenpräsentierende Zellen vorzugsweise aus der Pleuraflüssigkeit der angegebenen Personen isoliert. Dazu wird diese Flüssigkeit mit einem Puffer, vorzugsweise Hanks, verdünnt und zentrifugiert. Die pelletierten Zellen werden dann in Medium, das hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthält, aufgenommen und inkubiert.
Vorzugsweise enthält das Medium auch Stoffe, durch die
Zellen zur Proliferation angeregt werden. Als bevorzugte Stoffe werden dabei Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die aus den in der DE-OS 38 11 692 beschriebenen Farbstoffmolekülen A und B erhalten werden. Unter dem Farbstoffmolekül A versteht man das Kondensationsprodukt von Flavoprotein, nämlich jenes von Riboflavin-5'-monophosphatnatriumsalz mit alpha-Liponsäure, das nach Zugabe von Jodacetamid und Dialysieren nach Destillation zurückbleibt. Als Farbstoffmolekül B versteht man das weitere
Umsetzungsprodukt des Destillationsrückstandes mit einer Reaktionslösung aus l,4-Bis(4-methyl-5-phenyl-2-oxazolyl)-benzol und p-Terphenyl in einem organischen Lösungsmittel, dem Maleinsäureanhydrid zugesetzt ist, und das nach mehrstündigem Stehen auf einen neutralen pH-Wert eingestellt und in üblicherweise gereinigt ist. Zellen, die die angesprochenen Fluoreszenzfarbstoffe aufgenommen haben, erfahren nicht nur eine Wachstums-Stimulation, sondern werden auch fluoreszenzmarkiert und somit unter dem Mikroskop erkennbar. Erfindungsgemäß werden die angesprochenen
Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt gekoppelt, beispielsweise mit Proteinen oder Peptiden, eingesetzt. Sie werden dann als carriergebundene Fluoreszenzfarbstoffe bezeichnet.
Zellen, die sich bei der Inkubation mit dem angesprochenen Medium nicht festsetzen, werden durch mehrmaliges Waschen entfernt und von den adhärenten Zellen werden kontaminierende Fibroblasten, Makrophagen und Mesothelzellen abgetrennt. Aus fluoreszenzmarkierten antigenpräsentierenden Einzelzellen werden schließlich Klone herangezogen. Dazu wird ein serumfreies, die Proliferation antigenprasentierender Zellen förderndes Medium (nachstehend als serumfreies, antigenstimulierendes Medium bezeichnet) verwendet. Als Medium kann hierfür beispielsweise das
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handelsübliche Basismedium IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium) ohne L-Glutamin herangezogen werden. Diesem Medium werden Faktoren wie TCGF (Interleukin 2) und GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor) zugegeben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden T„-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer vorzugsweise aus Venenblut der angegebenen Personen isoliert. Die Zellen werden dabei durch mehrere Zentrifugationsschritte gesammelt und auf mit Blutgruppenseren und GM-CSF (vorstehend angegeben)
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beschichteten Petrischalen ausplattiert. Nicht-adhärente
Zellen werden ausgewaschen, während die festsitzenden Zellen in serumfreiem, antigenstimulierenden Medium (vorstehend angegeben) resuspendiert und aufbewahrt werden.
Die T- H,-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden durch
Anbindung an die antigenpräsentierenden Zellen aktiviert. Die Aktivierung verlauft in drei Phasen. Nach der Anbindung der T„n-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer an die antigenpräsentierenden Zellen wird IL-1 (Interleukin 1) gebildet. Dies führt zusammen mit der Stimulierung durch das Antigen zur Ausbildung von IL-2 Rezeptoren auf den T„π-Zellvorläufern.
werden zur
Freisetzung von IL-2 angeregt, wodurch die Proliferation der antigenaktivierten B-Zellvorläufer induziert wird.
Erfindungsgemäß werden T„n-Zellvorläufer und
B-Zellvorläufer vorsichtig mit fluoreszenzmarkierten antigenpräsentierenden Zellen gemischt und inkubiert. Nicht-adhärente Zellen werden ausgewaschen, während die festsitzenden Zellen in serumfreies, die Proliferation antigenpr sentierender Zellen nicht-forderndes Medium (nachstehend als serumfreies, nicht-antigenstimulierendes Medium bezeichnet) überführt und in diesem inkubiert werden. Als Medium kann beispielsweise das handelsübliche
Basismedium IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium) ohne L-Glutamin verwendet werden. Diesem Medium werden Faktoren wie LAF (Interleukin 1), TRF (T-cell replacing factor) und GM-CSF (vorstehend angegeben) zugegeben. Unter kurzer Einwirkung von UV-Licht und der Wegnahme des CO„-Druckes werden die antigenaktivierten T„-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer von den antigenpräsentierenden Zellen abgelöst. Anschließend werden die antigenaktivierten Zellvorläufer abzentrifugiert und in serumfreiem, nicht-antigensti ulierenden Medium (vorstehend angegeben) resuspendiert und aufbewahrt.
Zur Aktivierung von B-Zellen werden diese an die antigenaktivierten Tπ„-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer angebunden. Die B-Zellen reifen dann zu antikörperproduzierenden(-sezernierenden) Zellen (Plasmazellen) aus. Reife B-Zellen können dabei von unreifen B-Zellen durch Inkubation mit einem gegen ihr Oberflächenimmunuglobulin gerichteten Antikörper unterschieden werden. Reife B-Zellen synthetisieren ihr Oberflächenimmunuglobulin innerhalb von 24 h neu, während unreife B-Zellen dazu nicht in der Lage sind.
Erfindungsgemäß werden B-Zellen vorzugsweise aus Venenblut der angegebenen Personen isoliert. Die Zellen werden gewaschen, in serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium, dem vorzugsweise zur Proliferations-stimulierung der Zellen der vorstehend angegebene Fluσreszenzfarbstoff zugegeben wird, inkubiert, anschließend zentrifugiert und gewaschen. Die pelletierten Zellen werden erneut in gleichem Medium aufgenommen und vorsichtig mit antigenaktivierten T„π-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern gemischt und dann inkubiert. Durch das Einwirken von UV-Licht und dem CO^-Druckabfall werden die antigenaktivierten Vorläuferzellen abgelöst. Sie werden abzentrifugiert, während die festsitzenden aktivierten B-Zellen mehrmals in Medium gewaschen, zentrifugiert und erneut in Medium resuspendiert werden. Die aktivierten B-Zellen werden dann in Tüpfel von Mikrotiterplatten eingebracht und inkubiert. Die Platten werden zentrifugiert und nachdem Makrophagen und restliche Zellvorläufer entfernt sind, werden die aktivierten B-Zellen nochmals mit dem vorstehend angegebenen Fluoreszenzfarbstoff markiert und 8 Tage inkubiert. Alle zwei Tage wird die Antikδrperproduktion überprüft. Dazu werden die überstände der Tüpfel getestet. B-Zellen, deren Überstände positiv sind, werden Freßzellen oder Makrophagen zugegeben, wodurch die B-Zellen zur Proliferation angeregt werden. Nach Ausdifferenzierung zu antikörpersezernierenden
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Plasmazellen werden diese kloniert. Dazu werden die in den positiven überständen vorliegenden Zellen vereinzelt und kultiviert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, humane monoklonale Antikörper herzustellen, ohne daß dabei Rekombinations- oder Zeilfusionsverfahren angewandt werden müßten. So können die bei diesen Verfahren oftmals eintretenden Chromosomenverluste vermieden werden, wodurch auch die damit verbundene Gefahr, unspezifisch bindende Antikörper zu erhalten, ausgeschlossen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist ferner den großen Vorteil auf, daß nicht wie üblich Antikörper nur von einer begrenzten Zahl verschiedener, reifer humaner B-Zellen (Plasmazellen) erhalten werden, sondern daß durch die Verwendung von Tn-Zellvorläufern und B-Zellvorläufern noch das Gesamt-Potential aller in einer Person möglicher Antikörpervariationen ausgenutzt werden kann. Die Möglichkeit verschiedenste Antikörper zu erhalten, ist damit gegeben. So gelang es beispielsweise auch Antikörper gegen das HlV-Oberflächenprotein gp 120 und seinen Vorläufer gp 160 zu isolieren.
Erfindungsgemäß hergestellte humane monoklonale Antikörper besitzen wie bereits angesprochen die Fähigkeit, spezifisch zu binden, sie eignen sich also zum Nachweis ganz spezieller Antigene und damit zur Diagnose von Tumor-, erblichen oder durch prokaryontische oder eukaryontische Erreger, insbesondere Viren, hervorgerufenen Erkrankungen. Als virale Erkrankungen sind dabei besonders AIDS, Multiple Sklerose und Alzheimerische Krankheit gemeint, während als Tumorerkrankung insbesondere das Kleinzellen-Lungenkarzinom angesprochen ist.
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Erfindungsgemäß hergestellte humane monoklonale Antikörper eigenen sich darüberhinaus auch für therapeutische Maßnahmen, da aufgrund fehlender wirtsfremder Determinanten in behandelten Patienten keine gegen die erfindungsgemäß hergestellten Antikörper gerichtete Antikörperproduktion stattfindet.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung eines Fluoreszenzfarbstoffes.
Die kristallinen Farbstoffmoleküle A und B gemäß DE-OS 38 11 692 (Seite 2 und Anspruch 1) werden getrennt in PBS Puffer im Ultraschallbad bis zur klaren Lösung behandelt. Je 4 mmol der Farbstoffmoleküle A und B werden in
100 ml einer 0,1 N HC1 unter tropfenweiser Zugabe einer l%igen NaNO_-Lösung unter ständigem Rühren bei 4°C diazotiert.
Zur Vermeidung eines Überschusses von HN02 wird das Reaktionsgemisch mit Stärke-Jodid-Teststreifen kontrolliert. Liegt freies HNO„ vor, zeigt der Teststreifen eine blau-schwarze Färbung.
Nach Beendigung der Reaktion wird das Farbstoff-Konjugat 1 h bei 4°C dialysiert und steril filtriert.
Der gebrauchsfertige Fluoreszenzfarbstoff wird auf pH -7,5 eingestellt und im Kühlschrank aufbewahrt.
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1 Beispiel 2
Herstellung von carriergebundenem Fluoreszenzfarbstoff.
5 Durch Kopplung des gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoffes von Beispiel 1 mit Proteinen, Peptiden oder anderen Substanzen wird ein carriergebundener Fluoreszenzfarbstoff erhalten.
10 Die Kopplungsreaktion wird bei 4°C und einem pH-Wert von 9,0 durchgeführt.
Von einem Protein mit einem Molekulargewicht von 155.000 (IgG) werden 0,08 mmol zur Kopplung benötigt. Diese Proteinmenge wird in 100 ml Borat-Puffer, oder als
15 Alternative in Carbonat-Puffer, pH -9,0 unter leichtem
Rühren gelöst und der gebrauchsfertige Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 langsam unter ständiger pH-Kontrolle und leichtem Rühren an der Innenwand des Reaktionsgefäßes ablaufend der Proteinlδsung zugegeben. Nach beendeter Zugabe
20 wird die Reaktionslösung 2 h bei 4°C unter häufiger pH-Kontrolle gerührt, über Nacht wird die Reaktionslösung im Kühlschrank stehengelassen und danach 12 h gegen 5 - 7 L 0,15 M NaCl dialysiert. Nach Abschluß der Dialyse wird der pH-Wert auf 7,5 eingestellt.
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Die Kopplung kann alternativ auch mittels einer Gleichgewichtsdialyse vorgenommen werden, zwei Dialysekammern mit unterschiedlichen Membranen werden mit einem dazwischenliegenden Membranfilter Zusammengefügt und
30 luftdicht verschlossen.
In die Kammer, deren Membran, die Diffusion des gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoffes, nicht aber die des
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Proteins oder Peptides erlaubt, wird die Proteinlδsung eingebracht, in die andere Kammer der gebrauchsfertige Fluoreszenzfarbs off.
Das Gleichgewicht ist erreicht, wenn die Konzentration des freien Proteins auf beiden Seiten gleich ist. Die Messung von freiem und gebundenem Protein erfolgt im Fluorometer. Die Absorptions- und Emissionsspektren zeigen freie und gebundene Proteinmengen auf.
Hyaluronidase (MG 89.000) stellt einen wichtigen Diffusionsfaktor zum Einbau von Proteinen, Peptiden und anderen Substanzen in lebende Zellen dar. In 100 ml gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 wird 1 ml gelöste Hyaluronidase (in 0.9 % NaCl) pipettiert. Dann wird das Reaktionsgemisch 10 min bei 37°C stark gerührt, auf 4°C abgekühlt, dialysiert und auf pH -7,5 eingestellt. Für den Zelleinbau werden bestimmte Proteine, Peptide oder andere Substanzen mit dem gebrauchsfertigen Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 gekoppelt. Die
Einführung in die Zellen erfolgt nach den Anwendungsvorschriften "Gen Pulser TM-Transfektionsgerät,
Bio-Rad-Lab., Richmond, CA., USA.
Beispiel 3
Isolierung und Aufbereitung antigenprasentierender Zellen aus humaner Pleuraflüssigkeit.
Pleuraflussigkeiten von Tumor- oder HIV-Patienten werden zur Gewinnung antigenprasentierender Zellen verwendet.
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Die Pleuraflüssigkeit wird zentrifugiert und der erhaltene Zellniederschlag mit modifzierter Hanks Lösung gewaschen, zentrifugiert und zu 3 ml Aliquots abgefüllt.
Die präparierten Zellen (Aliquots) werden im Medium M 199, das mit 2%igem hitzeinaktivierten fötalen Kälberserum und 100,ul Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 1) ergänzt ist, resuspendiert und dann in Kulturflaschen überführt und 24 h kultiviert. Danach werden nicht-adhärente Zellen ausgewaschen und festsitzende markierte Zellen mit 0,25 M EDTA, pH - 7,5 behandelt, um kontaminierende Fibroblasten, Makrophagen und Mesothelzellen zu entfernen.
Spezifische Zellen werden dann in serumfreies, antigenstimulierendes Medium überführt. Es handelt sich um das Basismedium - IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium), ohne L-Glutamin, das mit Faktoren wie 1 U/ml TCGF, 0.1,ul/ml GM-CSF und 10,ul/ml Fluoreszenzfarbstoff (von
Beispiel 1) ergänzt wird. Die erhaltenen fflluuoorreesszzeennzzmmaarrkkiieerrtteenn KKlloonnee wweerrddeen in 100,ul Aliquots in flüssigem Stickstoff eingelagert,
Beispiel 4
Isolierung und Aufbereitung humaner T„ H-Zellvorläufer und
B-Zell-Vorläufer.
T„-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden nach dem bekannten "buffy coatB-Verfahren aus heparinisiertem
Venenblut von virusinfizierten oder tumorinfiltrierten Personen mit handelsüblichen Zentrifugationsmedien isoliert, gewaschen und in mit humanen A und B Blutgruppenseren beschichteten Petrischalen 6 h in feuchter Kammer bei 37°C inkubiert. Die Petrischalen waren zusätzlich mit GM - CSF (100/ul 1:10 und 100 ,ul 1:500)
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beschichtet, wobei das Volumen dem der Verwendung von Blutgruppenseren entsprach.
Nicht adhärente Zellen werden ausgewaschen und die festsitzenden Zellen bis zur Wiederverwendung in serumfreiem, antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 3) resuspendiert und im Kühlschrank aufbewahrt.
Beispiel 5
Isolierung und Aufbereitung humaner B-Zellen.
B-Zellen von HlV-infizierten oder tumorinfiltrierten Personen werden nach dem bekannten
Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugations-Ve fahren isoliert, gewaschen und 1 h bei 37°C unter Zugabe von 100,ul Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 in serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium inkubiert. Es handelt sich um das Basismedium-IMDM (Iscoves modified Dulbecco medium), ohne L-Glutamin, dem Faktoren wie 1 U/ml LAF, l.ul/ml TRF, 0,l,ul/ml GM-CSF und lO.ul/ml. Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 1) zugegeben werden. Anschließend wird 5 min bei 500 g zentri ugiert.
Der Zellniederschlag wird im Medium resuspendiert und die Zellsuspension wird dann auf 2x10 Zellen/ml eingestellt und aufbewahrt. Bei 9 - 20 % Fluoreszenzfarbstoff im Medium werden Zellzahlen von 4.85 x 10 bis 5.36 x 10 Zellen erreicht. Farbstoffkonzentrationen unterhalb von 50 % haben keinen negativen Effekt auf die Lebensfähigkeit der Zellen.
Beispiel 6
Anbindung humaner antigenprasentierender Zellen an humane
T„h-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer.
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100/Ul fluoreszenzmarkierte antigenpräsentie ende Zellen werden mit 100 ,ul T^-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer
/ " gemischt und 60 min bei 37°C und 5 % C0- inkubiert. Danach werden nicht-adhärente Zellen ausgewaschen. Die festsitzenden Zellen werden in serumfreies, nicht- antigenstimulierendes Medium (siehe Beispiel 5) überführt,
90 min bei 40°C inkubiert und dann zentrifugiert. Unter kurzer Einwirkung von UV-Licht und Luftdruckschwankungen lösen sich die antigenpräsentierenden Zellen vollständig von den antigenaktivierten T-^-Zellvorläufern und
B-Zellvorläufern ab.
Nach einer Zentrifugation werden die antigenaktivierten Zellvorläufer in serumfreiem, antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 3) resuspendiert und bis zu ihrem Gebrauch aufbewahrt.
Beispiel 7
Anbindung antigenaktivierter humaner T„πZellvorläufer- und
B-Zellvorläufer an humane B-Zellen
B-Zellen werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, vorbehandelt. 50/Ul fluoreszenzmarkierte, antigenaktivierte
T^-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden mit 50 ,ul
» / vorbehandelte B-Zellen vorsichtig gemischt und 60 min bei 37°C und 5 % CO„ inkubiert. Nichthaftende Zellen werden mit serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 5) ausgewaschen. Adhärente Zellen werden in serumfreiem,- nicht-antigenstimulierendem Medium 90 min
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bei 40°C und 5 % C0~ inkubiert. Anschließend findet eine kurze Einwirkung von UV-Licht (360-420 nm) und ein Druckabfall statt. Die antigenaktivierten τ„π-zellvorläufer und B-Zellvorläufer werden vollständig von den B-Zellen abgelöst. Aus dem überstand werden die antigenaktivierten T H-Zellvorläufer und B-Zellvorläufer abzentrifugiert.
Nachdem ferner Makrophagen und restliche Zellvorläufer entfernt sind, werden die B-Zellen nochmals mit 100,ul des
Fluoreszenzfarbstoffes (von Beispiel 1) markiert, dann aliquotiert und bei -20°C bis zu ihrem Gebrauch eingelagert q oder in Tüpfel von Mikrotiterplatten (1x10 Zellen/ml und
2x10 Zellen/ml) überführt und 8 Tage bei 37°C und 5 %
C02 inkubiert. Alle zwei Tage wird die Antikörperbildung überprüft.
Nach Stimulation durch Freßzellen oder Markophagen proliferieren die B-Zellen und differenzieren als Klone zu antikörpersezernierenden Plasmazellen aus.
Beispiel 8
Klonierung der antikörpersezernierenden Plasmazellen
Alle Tüpfel mit positivem überstand werden gesammelt. Je
O r nach Wahl werden 10 Freßzellen/ml oder 4x10 Makrophagen/ml in die Tüpfel der Mikrotiterplatten eingebracht. Die im positiven Überstand vorliegenden Zellen werden gezählt. Für die Klonierung sind 10 Zellen ausreichend.
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30 Zellen werden in 1 ml Medium von Beispiel 7 suspendiert und dann in 0,1 ml Aliquots ausplattiert. Die restlichen Zellen werden auf 10 Zellen/ml und dann so weiter bis 3 Zellen/ml eingestellt. Alle in Tüpfeln verteilten Zellen werden bei 37°C in feuchter Kammer inkubiert.
Aufbereitung von humanen Freßzellen und Makrophagen.
20 ml Frischblut werden mit serumfreiem, nicht-antigenstimulierenden Medium (siehe Beispiel 5) verdünnt und nach bekannten Verfahren mit Ficoll 15 min bei 500 g zentrifugiert. Rote Blutzellen und Polymorphe befinden sich dann am Rδhrchenboden. Periphere einkernige Blutzellen, so auch Monozyten liegen in der Zwischenphase. Diese Phase wird vorsichtig abgesaugt und mit demselben Volumen an dem Medium von Beispiel 5 versetzt und 5 min bei 500 g zentrifugiert. Der Zellniederschlag wird dann im Medium resuspendiert, gezählt und auf 3x10 Zellen/ml eingestellt. Das Gesamtvolumen sollte 10 ml nicht überschreiten. Diesem wird 1 ml Fluoreszenzfarbstoff von Beispiel 1 zugegegeben. Die Zellen werden dann mit Medium verdünnt und mit 5x10 Zellen/Tüpfel ausplattiert.
Beispiel 9
Aktivitätstest von erfindungsgemäß hergestellten HIV-Antikörpern gp 120/160.
Seren von 5 seropositiven/viruspositiven Patienten, 5 seropositiven/virusnegativen Patienten und 5 Normalpersonen werden isoliert und aufbereitet.
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Jeweils 200 ,ul aus diesen 15 Humanseren werden in je 3 Reihen einer mit HIV-Antigen beschichteten kommerziellen Mikrotiterplatte pipettiert und 1 h bei RT inkubiert und dann gewaschen. Jeweils 50,ul unverdünnter, 1:100 verdünnter, 1:500 verdünnter und 1:1000 verdünnter fluoreszenzmarkierter HIV-Antikörper gp 120/160 werden zugegeben, bevor 1 h bei RT inkubiert und dann gewaschen wird. Nach Zugabe von 100,ul Blockierungslösung (Sterilmolke) wird die Mikrotiterplatte 15 min stehengelassen, dann gewaschen und gemessen.
Auswertung:
Für die Auswertung von Ergebnissen im unteren Normalbereich bieten sich folgende Auswertungen an: Regressionsmethode - einfach linear und die gerichtete lineare Regression, Splite Interpolation und polygonale Interpolation.
Gerät-Enzymreader Behringwerke, 410 nm.
Berechnungsbeispiel: negative Kontrolle 0.050 positive Kontrolle 0.600 (0.050 + 0.600/2) = 0.325
Absorptionsratio: weniger als 2,5 negativ zwischen 2.5-5 Annahme von HIV-AK bis low-level größer als 5-11 high level
Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Mittelwert der 5 Seren der Normalpersonen: 0.058
Mittelwert der 5 seropositiven/viruspositiven Seren: 2.7
Mittelwert der 5 seropositiven/virusnegativen Seren: 1.85
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Beispiel 10
Immuncytochemischer Assay
Zellen werden mit einem nicht markierten Antiköprer reaktiviert, gewaschen, in chamber slides transferiert und auf dünn aufgetragenes Medium (von Beispiel 3) angesetzt und fixiert. Die zu untersuchenden Zellen werden mit 50 ,ug/ml L-Lysin oder mit carriergebundenem Fluoreszenzfarbstoff (von Beispiel 2) vorbehandelt. Ein Überschuß der L-Lysin
Bindungskapazität wird nach 10 Minuten mit 1 bis 2 Tropfen (25 ,ul bis 50 ,ul) Blockierungslδsung (sterile Molke) verhindert. Anschließend werden die Zellen mit Medium gewaschen, eine Stunde in feuchter Kammer mit einem erfindungsgemäß fluoreszenzmarkierten Antikörper oder mit einem nach üblichen Verfahren markierten Antikörper bei RT oder 37°C inkubiert (die Inkubationstemperatur hängt von der Art des Antikörpers ab), danach wieder mit Medium gewaschen und unter dem Mikroskop in den chamber slides untersucht.
Beispiel 11
Direkte und indirekte Membran-Immunfluoreszenz
Mit den Verfahren der direkten und indirekten Membran-Immunfluoreszenz kann Biopsie-Material, insbesondere Lymphknoten, sofort untersucht werden.
Für das direkte Test-Verfahren werden f ische-humane Lymphknoten mit einem Tropfen eines erfindungsgemäß fluoreszenzmarkierten und zusätzlich komplementverstärkten humanen monoklonalen Antikörpers beschickt, 10 Minuten inkubiert und mit physiologischer, steriler Kochsalzlösung gewaschen.
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Beim indirekten Test-Verfahren werden erfindungsgemäß hergestellte, jedoch keine Fluoreszenz aufweisende, komplementverstärkte, humane monoklonale Antikörper mit fluoreszenzmarkiertem Anti-Ig sichtbar gemacht.