DE4216355A1 - Verfahren zur bereitstellung von antigen-spezifischen b- und t-lymphozyten sowie davon erhaltene monoklonale antikoerper - Google Patents
Verfahren zur bereitstellung von antigen-spezifischen b- und t-lymphozyten sowie davon erhaltene monoklonale antikoerperInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Bereitstellung Antigen-spezifischer B- und T-Lymphozyten,
bei dem aus Körperflüssigkeiten und/oder Geweben von
Säugetieren antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten
isoliert, diese zu einer spezifischen Adhäsion gemeinsam
inkubiert und nach üblichen Verfahren kultiviert werden.
Ein solches Verfahren ist aus Maeda, T. et al., Hybridoma,
Band 5, Nr. 1 (1986): 33-41 bekannt.
Es hat sich nun gezeigt, daß dieses Verfahren in großem Maße
zu unspezifischen, nicht-Antigen-spezifischen B- und
T-Lymphozyten führt.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde,
ein Verfahren bereitzustellen, mit dem dies vermieden werden
kann.
Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß in obigem
Verfahren die adhärenten Zellen von den nicht-adhärenten
abgetrennt und nur die adhärenten Zellen, nicht aber die
nicht-adhärenten kultiviert werden.
Erfindungsgemäß werden antigenpräsentierende Zellen und
Lymphozyten aus verschiedenen Körperflüssigkeiten und/oder
Geweben von Säugetieren isoliert. Als Körperflüssigkeit sind
hier insbesondere Blut, Lymphe, Pleura-, Peritoneal- und
Gelenkflüssigkeit sowie Liquor cerebrospinalis zu nennen.
Die Körperflüssigkeiten können sowohl gesunden wie auch
kranken Säugetieren entnommen werden. Gleiches gilt auch für
Gewebe, von denen insbesondere Milz, Lymphknoten,
Knochenmark, Haut und Tumore anzugeben sind. Als Säugetiere
sind insbesondere Mensch, Haus- und Labortier gemeint, wobei
unter Haustier auch Nutztier zu verstehen ist.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können Körper
flüssigkeiten und/oder Gewebe von ein oder mehreren
Säugetieren stammen. Es ist nicht zwingend, daß bei
Verwendung mehrerer Säugetiere diese alle einer der
vorstehend genannten Gruppen angehören. Genausowenig
beschränkt sich das erfindungsgemäße Verfahren nur auf
Säugetiere, vielmehr umfaßt es alle Lebewesen des
Tierreichs, aus denen obige Zellen isoliert werden können.
Zur Isolierung der antigenpräsentierenden Zellen und der
Lymphozyten können bekannte Verfahren, beispielsweise das
Ficoll-Hypaque-Zentrifugationsverfahren, angewandt werden.
Hierzu werden Körperflüssigkeiten direkt eingesetzt, während
solide Gewebe und Tumore erst nach Einzelpräparation durch
Zerkleinerung und Verdauung mit üblichen Enzymen, wie
Kollagenase-Dispase oder Trypsin, unter Bedingungen, wie 1 h
bei 37°C, zentrifugiert werden. Die antigenpräsentierenden
Zellen und die Lymphozyten werden in der Interphase erhalten
und dann mehrmals einer Waschung mit einem physiologischen
Puffer, beispielsweise PBS, pH 7.2, unterzogen.
Erfindungsgemäß werden die antigenpräsentierenden Zellen von
den Lymphozyten getrennt. Hierfür können bekannte Verfahren
verwendet werden. Vorzugsweise werden die Zellen in einem
Kulturgefäß mit serumfreiem Medium, beispielsweise BPMI 1640
oder GG-Medium, unter üblichen Bedingungen, wie 37°C und 5%
CO2 inkubiert. Das Kulturgefäß weist eine Beschichtung mit
Plasma oder Serum auf, wobei dieses aus dem gleichen Säuge
tier (autolog) oder einem der gleichen Spezies (allogen)
stammt, aus dem die antigenpräsentierenden Zellen und die
Lymphozyten isoliert worden sind. Die antigenpräsentierenden
Zellen adhärieren spontan an die Beschichtung, wohingegen
die Lymphozyten in Suspension bleiben. Nach einstündiger
Inkubation werden die Lymphozyten abpipettiert, während die
antigenpräsentierenden Zellen zurückbleiben.
Erfindungsgemäß werden die Lymphozyten von supprimierenden
Zellen befreit, wozu sie beispielsweise mit Leucin
methylester (1,25 mM), 30 min bei Raumtemperatur behandelt
und dann mehrfach in vorstehend angegebenem, serumfreien
Medium gewaschen werden.
Die antigenpräsentierenden Zellen werden dagegen aktiviert,
wobei sie entsprechend ihres Reifezustands unterschiedlich
behandelt werden. Antigenpräsentierende Zellen aus solidem
Gewebe sind vielfach ausgereift und somit hochaktiv. Im
Gegensatz dazu sind sie aus Körperflüssigkeiten oftmals
nicht ausgereift und werden daher etwa 24 h in vorstehend
angegebenen Kulturgefäßen inkubiert, wobei z. B. vorstehend
angegebenes CG-Medium verwendet wird. Vorteilhafterweise
werden hierbei Faktoren zur Induktion, wie Interleukin-1,
Interleukin-6, Adenosin oder Dibutyryl-cAMP, zugegeben.
Desweiteren liegen antigenpräsentierende Zellen aus
Knochenmark zumeist noch als Vorläuferzellen vor und werden
daher in einem der vorstehend angegebenen Medien etwa 1
Woche inkubiert. Diesem werden Faktoren, wie Linolsäure
(4 µg/ml), Vitamin D3 (2,5 M), Vitamin E (0,1%),
Multi-CSF (2 U/ml) und M-CSF (3 U/ml) zugegeben.
Erfindungsgemäß wird den antigenpräsentierenden Zellen
Antigen zugegeben. Seine Menge liegt z. B. im Bereich von 1
pg - 10 µg/ml Kulturmedium. Es wird wenige Minuten bis 24
Stunden zugegeben. Als Antigen sind ganze oder Teile von
Zellen, Krankheitserregern und/oder Biomolekülen zu nennen.
Unter Zellen sind dabei sowohl normale wie auch
virusmodifizierte und krankhaft entartete zu verstehen. Die
Krankheitserreger umfassen Viren, Bakterien und Allergene,
während zu den Biomolekülen Antikörper, Mediatoren, Enzyme
und Neurotransmitter zu rechnen sind.
Die Antigene können als solche allein oder gekoppelt mit
üblichen Carriermolekülen eingesetzt werden, wobei beide
auch in Gemischen mit gängigen Adjuvantien verwendet werden.
In manchen Fällen kann es aber von Vorteil sein, auf die
Zugabe von Antigen zu verzichten, insbesondere dann, wenn
die antigenpräsentierenden Zellen bereits im Organismus
hinreichend mit Antigen in Kontakt gekommen sind. Dies ist
insbesondere bei aus einem Tumor und aus rheumatischem
Gewebe isolierten Zellen der Fall. Desweiteren kann es hier,
wie auch in anderen Fällen, von Vorteil sein, ganz auf die
vorstehend angegebene Trennung von antigenpräsentierenden
Zellen und Lymphozyten zu verzichten und die aus dem
Ficoll-Hypaque-Zentrifugations
verfahren erhaltene Interphase direkt weiter zu verwenden.
Erfindungsgemäß werden die antigenpräsentierenden Zellen und
die Lymphozyten zu einer spezifischen Adhäsion gemeinsam
inkubiert. Hierzu werden die Zellen in vorstehend angegebene
Kulturgefäße eingebracht, wobei die Lymphozyten in 10- bis
1000fachem Überschuß vorliegen, und mit einem der
vorstehend genannten Medien kultiviert. Als
Kultivierungszeit sind 15 min bis 2 Tage bei 37°C oder
maximal 24 h bei 4°C anzugeben.
Erfindungsgemäß werden die nicht-adhärenten Zellen von den
adhärenten abgetrennt. Hierzu werden erstere durch
vorsichtiges Spülen von den an den beschichteten
Kulturgefäßen adhärenten Zellen abgezogen. Desweiteren
werden, wenn schwimmende, aneinander adhärente Zellen
vorliegen, die nicht-adhärenten durch eine wenige Minuten
dauernde
Geschwindigkeits-Sedimentation bei 1 bis 1500 g abgetrennt.
Erfindungsgemäß werden die adhärenten Zellen weiter nach
üblichen Verfahren kultiviert. Sie werden in vorstehend
angegebenen Kulturgefäßen inkubiert. Als Medium wird ein
vorstehend genanntes verwendet, dem proliferationsfördernde
Faktoren, wie Interleukin-2, -4 oder -6 zugegeben werden
können. Auch kann ein konditioniertes Medium, das
beispielsweise von permanenten Zellkulturen gewonnen wird,
zugesetzt werden. Die Inkubation führt zur Proliferation von
antigenspezifischen B- und T-Lymphozyten. Unspezifische
Lymphozyten werden nur in äußerst geringer Menge gebildet.
Nach 4tägiger Inkubation werden Antikörper in den
Überständen erhalten, deren Menge durch weitere Inkubation
gesteigert werden kann. Vorteilhaft ist es auch, jeweils
nach einer Woche frisches Medium mit
proliferationsfördernden Faktoren zuzugeben. Gegebenenfalls
können auch antigenpräsentierende Zellen zugegeben werden,
wobei diese jedoch den ursprünglich eingesetzten entsprechen
sollen.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Antikörper sind insbesondere
nach Klonierung hochspezifisch gegen die verwendeten
Antigene. Es handelt sich dann um monoklonale Idiotyp-
Antikörper, ferner auch um Anti-Idiotyp-Antikörper, wenn als
Antigen ein Antikörper eingesetzt worden ist.
Die erfindungsgemäß erhaltenen, antigenspezifischen B- und
T-Lymphozyten sind in sich äußerst homogen. Sie eignen sich
insbesondere nach Klonierung zur Isolierung von spezifischen
Nukleinsäurevorstufen, beispielsweise mRNA, die dann für
Genklonierungszwecke und zur Vermehrung spezifischer
Nukleinsäuresequenzen über bekannte Techniken,
beispielsweise PCR-Verfahren genutzt werden können. Ferner
eignen sich die erfindungsgemäß hergestellten B- und
T-Lymphozyten zur adoptiven Immuntherapie. Desweiteren
können sie auch durch übliche Verfahren, wie Fusion mit
Hybridomzellen, immortalisiert werden. Die erfindungsgemäß
erhaltenen B-Lymphozyten können darüberhinaus durch Zugabe
von Anti-CD4 0-Antikörpern weiter kultiviert und expandiert
werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Aus gesunden, mit Tetanusantigen immunisierten Spendern
wurden, wie vorstehend beschrieben, antigenpräsentierende
Zellen und Lymphozyten über das
Ficoll-Hypaque-Zentrifugationsverfahren isoliert und in
Kulturgefäßen mit autologer Plasmabeschichtung voneinander
getrennt. Die Lymphozyten wurden durch Behandlung mit Leucin
methylester von supprimierenden Zellen befreit, während die
antigenpräsentierenden Zellen 24 h, wie vorstehend
beschrieben, mit 0, 1 und 10 ng Tetanustoxoid/ml Medium
inkubiert wurden. Das Antigen wurde anschließend
ausgewaschen.
Die antigenpräsentierenden Zellen und die Lymphozyten wurden
in vorstehend beschriebenen Kulturgefäßen mit CG-Medium
gemeinsam inkubiert. Die Lymphozyten lagen in 200fachem
Überschuß vor. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die nicht
adhärenten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren entfernt.
Den adhärenten Zellen wurde frisches Medium, ergänzt mit
konditioniertem Medium, zugegeben. Nach 6 Tagen Inkubation
wurden Zellzahl, Gesamtantikörpermenge und spezifische
Antikörpermenge bestimmt. Die spezifische Antikörpersynthese
wurde in einem ELISA mittels eines an Plastik gebundenen
Tetanustoxoids als Antigen bestimmt. Die unspezifische
Antikörpersynthese wurde ebenfalls in einem ELISA bestimmt,
bei dem ein gegen humanes Ig gerichteter Maus-Antikörper
verwendet wurde.
Die Ergebnisse in der Figur zeigen folgendes: In Abwesenheit
von antigenpräsentierenden Zellen (m-AC) findet sich in den
gespülten Ansätzen keine signifikante spezifische Anti
körpersynthese, während diese in den Ansätzen in Anwesenheit
von m-AC (schraffierte Säulen) vorliegt. Bei Zugabe von 10
ng/ml Antigen ist die Ausbeute am höchsten. Bei 1 ng/ml
stark, und selbst ohne Zugabe des Antigens findet sich eine
signifikante, spezifische Antikörperproduktion. Die
Gesamtantikörpermenge (rechte Ordinate) ist in diesen
Ansätzen außerordentlich niedrig (Δ). In den
nicht-gespülten Kontrollen, bei denen also adhärente und
nicht-adhärente Zellen vorliegen, finden sich zwar
signifikante Mengen von spezifischem Antikörper, jedoch
liegt auch eine sehr hohe Menge an nicht-spezifischen
Antikörpern vor. Gleichzeitig ist die Zellzahl in den
nicht-gespülten Kontrollen etwa um den Faktor 10 höher als
in den gespülten Ansätzen.
Dies unterstreicht, daß in den erfindungsgemäßen Verfahren
antigenspezifische B- und T-Lymphozyten bevorzugt
bereitgestellt, nicht-antigenspezifische dagegen weitgehend
ausverdünnt werden.
Claims (13)
1. Verfahren zur Bereitstellung Antigen-spezifischer B- und
T-Lymphozyten, bei dem aus Körperflüssigkeiten und/oder
Geweben von Säugetieren antigenpräsentierende Zellen und
Lymphozyten isoliert, diese zu einer spezifischen
Adhäsion gemeinsam inkubiert und nach üblichen Verfahren
kultiviert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die
adhärenten Zellen von den nicht-adhärenten getrennt und
nur die adhärenten Zellen, nicht aber die nicht
adhärenten kultiviert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Körperflüssigkeiten Blut, Lymphe, Pleura-,
Peritoneal- und Gelenkflüssigkeit sowie Liquor
cereprospinalis umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Gewebe Milz, Lymphknoten, Knochenmark, Haut und
Tumore umfassen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Säugetiere Mensch, Haus- und
Labortier umfassen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeiten und/oder
Gewebe aus ein oder mehreren Säugetieren stammen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch
gekennzeichnet, daß vor Inkubation zur Adhäsion die
antigenpräsentierenden Zellen aktiviert und die
Lymphozyten von supprimierenden Zellen befreit werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Aktivierung der antigenpräsentierenden Zellen die
Zugabe von Antigen umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
als Antigen ganze oder Teile von Zellen, Krankheits
erregern und/oder Biomolekülen zugegeben werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellen normale, virusinfizierte und krankhaft
entartete, die Krankheitserreger Viren, Bakterien und
Allergene und die Biomoleküle Antikörper, Mediatoren,
Enzyme und Neurotransmitter umfassen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Inkubation zur Adhäsion in mit
Plasma oder Serum beschichteten Kulturgefäßen erfolgt,
wobei das Plasma oder Serum zumindest aus einem der
Säugetiere stammt, das zur Isolierung der antigen
präsentierenden Zellen, und Lymphozyten herangezogen
worden ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch
gekennzeichnet, daß die üblichen Kultivierungsverfahren
die Klonierung und Fusion mit Myelomzellen umfassen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch
gekennzeichnet, daß die üblichen Kultivierungsverfahren
für die B-Lymphozyten die Klonierung und Zugabe von
Anti-CD 40 Antikörpern umfassen.
13. Antikörper, erhalten nach dem Verfahren nach einem der
Ansprüche 1-12.
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