DE69534179T2

DE69534179T2 - Ein verfahren zur kultivierung von bakterien, die proteine herstellen, deren expression durch temperatur reguliert wird

Info

Publication number: DE69534179T2
Application number: DE69534179T
Authority: DE
Inventors: Per Askelöf; Nils Carlin; Bo Nilsson; Agneta Paulsson
Original assignee: SBL Vaccin AB
Current assignee: SBL Vaccin AB
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2015-06-02
Also published as: SE9401921D0; JP3675824B2; ES2239321T3; PT759981E; CN1117859C; DE69534179D1; DK0759981T3; AU2634995A; CN1154716A; WO1995033825A1; US5935838A; EP0759981A1; EP0759981B1; ATE294232T1; MX9606032A; JPH10501406A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Bakterien. Genauer gesagt betrifft das Verfahren die Kultivierung von Bakterien mit Genen in Plasmiden, die oberflächen- oder membrangebundene Antigene oder andere Proteine kodieren und die in temperaturregulierter Weise exprimiert werden für die Erzeugung der gewünschten bakteriellen Produkte.
Hintergrund
Bakterien und Viren exprimieren häufig auf oder innerhalb ihrer Membran Proteine, die in einer bestimmten Umgebung als Träger für den Organismus wirken, um in einer bestimmten Weise mit einer Oberfläche zu assoziieren oder an eine Oberfläche anzuhaften. Eine solche Oberfläche kann die Innenwand des Gastrointestinaltrakts, des Ösophagus (Speiseröhre) oder jede andere biologische Oberfläche oder eine Membran in einem menschlichen oder tierischen Körper sein, wo ein Organismus eine optimale Umgebung für sein Wachstum antreffen kann. Membranproteine dieser Art werden häufig Kolonisationsfaktorantigene (CFA) oder Fimbrien genannt. In der Literatur werden andere Wörter wie Pili, Hämagglutinine, filamentöse oder fibrilläre Proteine für dieselbe Art von Substanzen verwendet. Für eine bessere Übersicht wird hier "CFA" verwendet, um alle diese Arten von Membranproteinen abzudecken, die auch einen antigenen Charakter aufweisen können.
Eine Anzahl von Bakterien, die von medizinischem Interesse sind, erzeugen nachweislich CFAs, assoziiert mit ihrer Membran. Unter diesen sind diejenigen, die für den Menschen besonders wichtig sind, Organismen, die den menschlichen Gastrointestinaltrakt und die Atemwege kolonisieren. Beispiele solcher Organismen, die den Gastrointestinaltrakt kolonisieren, sind enterotoxische Escherichia coli, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter, Shigellae, Salmonellae und Yersinia.
Von besonderem medizinischem Interesse ist enterotoxischer Escherichia coli (ETEC), da dieser Organismus einer der Hauptgründe für einen Durchfall bei Kindern in Entwicklungsländern ist und für mehr als eine Milliarde Diarrhöe-Episoden und mindestens eine Million Tote pro Jahr verantwortlich ist, im wesentlichen bei Kindern. Auf dieselbe Weise führen Vibrio cholerae und Campylobacter zu Durchfall bei Menschen in Entwicklungsländern. ETEC und Campylobacter sind auch der Hauptgrund für Durchfälle bei Reisenden in diesen Regionen. Helicobacter pylori wurde kürzlich aufgrund seiner Verbindung zu Magengeschwüren wichtig.
Für die meisten dieser Organismen wird die Erzeugung ihrer CFAs durch verschiedene Faktoren in der Umgebung kontrolliert, die wiederum regulatorische Gene in der Plasmid-DNA aktivieren können.
So ist es für ein Bakterium, das seine natürliche Wachstumsumgebung im menschlichen Intestinaltrakt hat, vorteilhaft, sein Wachstum und seine Überlebensmöglichkeit unter den Bedingungen des Intestinaltrakts zu optimieren. Anders ausgedrückt gibt es eine optimale Strategie für das Überleben, die die Erzeugung adhäsiver Proteine in der Umgebung impliziert, wo es geeignete Bedingungen für das Überleben gibt.
Wie aus der Literatur bekannt, ist ein solcher Parameter, der regulatorische Plasmidgene aktiviert die Temperatur, was impliziert, dass die Produktion von CFAs bei einer Anzahl von Bakterien temperaturreguliert ist. Etliche menschliche pathogene Organismen erzeugen bekanntlich CFAs bei Temperaturen nur oberhalb der Raumtemperatur und nicht bei Raumtemperatur. Einige dieser Organismen sind von spezifischem kommerziellem Interesse, da gezeigt wurde, dass es möglich ist, orale Vaccine gegen diese Organismen oder Bakterien zu erzeugen.
In der WO 92/14487 wird ein Verfahren zur Erzeugung und Verwendung eines oralen ETEC-Vaccins offenbart. Die ETEC-Bakterien werden bei 37°C aus Agarplatten auf Flüssigmedium gezüchtet, um kommerzielle Quantitäten der ETEC-Bakterien mit CFAs und ihrer Subkomponenten (CS-Antigene) zu erhalten. Diese darauffolgend formalingetöteten Bakterien können dann als orales Vaccin gegen die ETEC-Bakterien verwendet werden. Die CFA- und CS-Antigene funktionieren so als Antigene bei der immunologischen Verarbeitung, die im Intestinaltrakt stattfinden wird.
Bei der Einstellung der Produktion von ETEC-Bakterien mit CFAs auf einen großen Maßstab, wurde überraschend festgestellt, dass die Bakterien ihre Fähigkeit zur Erzeugung von CFAs in jeder neuen Generation immer mehr verloren. Bei der Untersuchung der Gründe hierfür wurde festgestellt, dass der Verlust der Fähigkeit der Bakterien zur Erzeugung von CFAs bei Temperaturen oberhalb der Raumtemperatur von einem Verlust des regulatorischen Gens begleitet ist, das in einem Plasmid der Bakterien lokalisiert ist.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Kultivierung von enterotoxischen Escherichia coli (ETEC) Bakterien gerichtet, die Gene in Plasmiden aufweisen, die für mindestens eine Art eines Kolonisationsfaktorantigens kodieren, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6 und die in temperaturregulierter Weise exprimiert werden für die Herstellung des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene), wobei das Verfahren umfasst:
Kultivieren der ETEC-Bakterien in einem Kulturmedium bei Raumtemperatur, so dass die Bakterien ihre Plasmide behalten und keine Expression des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene) auftritt;
weitere Kultivierung der ETEC-Bakterien in einem Kulturmedium bei 34 bis 39°C, so dass die Expression des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene) auftritt und
Ernten der ETEC-Bakterien, bevor sie ihre Plasmide verlieren.
Kolonisationsfaktorantigene können dann von den unter Verwendung eines solchen Verfahrens hergestellten ETEC-Bakterien isoliert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Raumtemperatur ungefähr 20°C.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der erste Kultivierungsschritt in zwei Schritten durchgeführt, zunächst auf einer Kulturplatte und dann in einem Flüssigkulturmedium.
In noch einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die weitere Kultivierung in einem Flüssigkulturmedium durchgeführt.
Diese bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ermöglichen es, ETEC-Bakterien mit Genen in Plasmiden zu kultivieren, die für mindestens eine Art eines Kolonisationsfaktorantigens kodieren, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6 und die in temperaturregulierter Weise in Industriefermentern in großem Umfang für eine Produktion in großem Umfang der gewünschten bakteriellen Produkte exprimiert werden.
Die in den Beispielen der Erfindung verwendeten ETEC-Bakterien können zur Expression von CS2 und CS3, CS4, CS1 oder CS5 in der Lage sein. Die weitere Kultivierung dieser Bakterien wird in den Beispielen bei 37°C durchgeführt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 illustriert die Kultivierung eines ETEC-Stamms, der CS2+CS3-Antigene exprimiert bei 20°C, 20° + 37°C und 37°C.
Beispiele
In den folgenden Beispielen wurde CFA-Medium als Kulturmedium verwendet. Die Zusammensetzung des flüssigen CFA-Mediums ist wie folgt: Casaminosäuren 1% (G/V), Hefeextrakt 0,078% (G/V), MgSO₄ 0,4 mM, MnCl₂ 0,04 mM, H₂O deionisiert, pH 7,4. Als Kulturplatten wurden CFA-Agarplatten verwendet. Diese beinhalten CFA-Medium mit 20 g/l zugefügtem Agar.
Beispiel 1
Ein ETEC-Stamm, der CS2+CS3-Antigene exprimiert, wurde aus –70°C entnommen und im Hinblick auf die Expression der Membrankomponenten wie folgt bewertet.
CFA-Agarplatten wurden mit dem Stamm CS2+CS3 inokuliert und bei 20°C oder 37°C 24 Stunden inkubiert. Die Bakterien wurden von den Platten geerntet und Proben, enthaltend jeweils 40 × 10⁶ Bakterien, wurden weiter in eine 800 ml (CFA-Medium) Schüttelkultur bei 20°C oder 37°C für weitere 24 Stunden inokuliert. Nach 70 Stunden wurde eine Probe von 4,5 ml von der 20°C Kultur genommen und weiter bei 37°C in einer 800 ml Schüttelkultur (CFA-Medium) kultiviert. Nach verschiedenen Intervallen wurde die Expression von CS2 mit einem ELISA-Verfahren unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, von dem gezeigt wurde, dass er eine Spezifität für das CS2-Antigen aufwies, analysiert. Alle ELISA-Ergebnisse wurden auf eine standardisierte Bakterienmenge, wie gemessen durch ihre optische Dichte, eingestellt. Die Ergebnisse, gemessen in willkürlichen ELISA-Einheiten, sind in Tabelle 1 präsentiert.
Tabelle 1
Die Daten in Tabelle 1 sind auch in 1 dargestellt.
Beispiel 2
Unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 wurden ETEC-Bakterien mit CS4-Antigen in flüssigem CFA-Medium gezüchtet. Nach einer Probennahme nach 31 Stunden wurde die Temperatur auf 37°C angehoben.
Die Ergebnisse, gemessen in willkürlichen ELISA-Einheiten, können in Tabelle 2 betrachtet werden.
Tabelle 2
Beispiel 3
Unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 wurden ETEC-Bakterien mit CS5-Antigen in flüssigem CFA-Medium gezüchtet. Nach einer Probennahme nach 31 Stunden wurde die Temperatur auf 37°C angehoben.
Das in willkürlichen ELISA-Einheiten gemessene Ergebnis kann in Tabelle 3 betrachtet werden.
Tabelle 3
Beispiel 4
Eine Kultur von ETEC-Bakterien, die das Antigen CS1 exprimierten, wurde über Nacht in flüssigem CFA-Medium auf einer Schüttelvorrichtung bei 37°C gezüchtet. Die Kolonien wurden auf CFA-Agar ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden Kolonien, die CSl-Fimbrien exprimierten, durch ein Kolonie-Blot-Verfahren unter Verwendung eines CSl-spezifischen Maus-monoklonalen Antikörpers als zweiten Antikörper nachgewiesen. Die Immunoblots wurden durch eine Nitro-blau-Tetranatriumsalzfärbung entwickelt. Individuelle CS1-Fimbrien-positive und negative Kolonien wurden gewählt und auf CFA-Agarplatten, wie oben beschrieben, verteilt kultiviert.
Diesmal wurde jede Platte mit einem Filter für den CS1-spezifischen monoklonalen Antikörper, wie oben beschrieben, durchsucht und auch mit einem Filter, der für eine Koloniehybridisierung mit einer von zwei radioaktiv markierten (32P)-Sonden verwendet wurde. Eine Sonde, die für das Strukturgen von CS1 (cooA) spezifisch war und eine Sonde, die für das regulatorische RNS-Protein (ms) spezifisch war.
Positive Kolonien: Alle Kolonien, die mit dem Antikörper-Assay als positiv bewertet wurden, wurden auch mit der rns-Sonde und der CS1-Sonde als positiv bewertet.
Negative Kolonien: Keine Kolonien, die mit dem Antikörper negativ bewertet wurden, zeigten irgendeine Reaktion mit der rns-Sonde, einige negative Kolonien hatten auch ihre Reaktivität gegenüber der CS1-Sonde verloren, jedoch hatten die meisten ihre CS1-Strukturgene behalten.
Als Schlussfolgerung gibt es einen begleitenden Verlust der CS1-Antikörperreaktivität (Expression von CS1-Fimbrien) und einen Verlust der Reaktivität zu der rns-Sonde (Verlust des Plasmids, das das rns-Gen kodiert).

Claims

Verfahren zur Kultivierung von enterotoxischen Escherichia coli (ETEC) Bakterien, die Gene in Plasmiden aufweisen, die für mindestens eine Art eines Kolonisationsfaktorantigens kodieren, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6 und die in temperaturregulierter Weise exprimiert werden für die Herstellung des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene), wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren der ETEC-Bakterien in einem Kulturmedium bei Raumtemperatur, so dass die Bakterien ihre Plasmide behalten und keine Expression des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene) auftritt; weitere Kultivierung der ETEC-Bakterien in einem Kulturmedium bei 34 bis 39°C, so dass die Expression des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene) auftritt und Ernten der ETEC-Bakterien, bevor sie ihre Plasmide verlieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin die Isolierung des (der) Kolonisationsfaktorantigens(antigene) aus den ETEC-Bakterien umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Raumtemperatur ungefähr 20°C beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die erste Kultivierung in zwei Schritten, zunächst auf einer Kulturplatte und dann in einem flüssigen Kulturmedium durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die weitere Kultivierung in einem flüssigen Kulturmedium durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die ETEC-Bakterien zur Expression von CS2 und CS3 in der Lage sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die ETEC-Bakterien zur Expression von CS4 in der Lage sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die ETEC-Bakterien zur Expression von CS1 in der Lage sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die ETEC-Bakterien zur Expression von CS5 in der Lage sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die weitere Kultivierung bei 37°C durchgeführt wird.