WO2003062432A1 - Verfahren zur erhöhung der wirksamkeit eines inhibitors der aktivität einer tyrosinkinase - Google Patents

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WO2003062432A1
WO2003062432A1 PCT/EP2003/000604 EP0300604W WO03062432A1 WO 2003062432 A1 WO2003062432 A1 WO 2003062432A1 EP 0300604 W EP0300604 W EP 0300604W WO 03062432 A1 WO03062432 A1 WO 03062432A1
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dsrna
rna strand
medicament
combination
gene
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PCT/EP2003/000604
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Hans-Peter Vornlocher
Stefan Limmer
Roland Kreutzer
Heiko Van Der Kuip
Walter Aulitzky
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Ribopharma Ag
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    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
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    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Definitions

  • the invention relates to a method for increasing the effectiveness of an inhibitor of the intracellular activity of a tyrosine kinase.
  • the invention further relates to a medicament or a combination of medicaments for the therapy of a disease which is associated with an activity of a tyrosine kinase.
  • the invention further relates to a use for producing the medicament or the combination of medicaments.
  • the tyrosine kinase is always a tyrosine kinase encoded by a gene that is created by a mutation.
  • the mutation can be a gene mutation or a chromosome aberration.
  • Chromosome aberration is a structural change and defect in one or more chromosomes. This can result in the loss or duplication of genetic material. Translocation, inversion, deletion, insertion, duplication or ring formation can occur. In the duplication, individual chromosome sections are doubled. During the inversion, there is a chromosome section with an inverted nucleotide sequence. Deletion is the loss of a piece of a chromosome. In the case of a translocation, a piece exchange takes place between non-homologous chromosomes. Chromosome aberration can result in a gene fused from at least two genes.
  • this mutant gene thus created is under the control of a promoter, it can be expressed and thus cause impairment.
  • This impairment can be, for example, a disease of the haematopoietic system, such as acute myeloid leukemia (AML) or chronic myeloid leukemia (CML).
  • Reciprocal translocation between the long arms of chromosomes 9 and 22 is the cause of over 95% of chronic myelioic leukaemias (CML).
  • CML chronic myelioic leukaemias
  • the translocation leads to a fusion of sequences of the genes bcr and abl.
  • the expression of the fused gene produces the very stable fusion protein Bcr-Abl.
  • Bcr-Abl is a consitutively active tyrosine kinase, the activity of which is the cause of the clinical picture of CML.
  • the translocation mentioned is also found in 15 to 30% of patients with acute lympathetic leukemia (ALL) in adulthood and in about 2% of patients with acute myeloblastic leukemia.
  • CML is a myeloproliferative disease of the hematopoietic stem cells.
  • ALL acute lympathetic leukemia
  • CML is a myeloproliferative disease of the hematopoietic stem cells.
  • the expression of the Bcr-Abl tyrosine kinase leads to independence from external growth factors and has a pronounced anti-poptotic effect.
  • the Bcr-Abl tyrosine kinase influences DNA repair proteins.
  • Inhibitors of tyrosine kinase are used for the treatment of diseases whose symptoms are at least partly caused by the activity of a tyrosine kinase encoded by a gene produced by a mutation.
  • these are inhibitors of the Bcr-Abl tyrosine kinase.
  • imatinib which is also known as STI571 and is marketed by the Novartis company as imatinib mesylate under the trade names Gleevec and Glivec.
  • imatinib is also known as STI571 and is marketed by the Novartis company as imatinib mesylate under the trade names Gleevec and Glivec.
  • a method for inhibiting the expression of a target gene by means of a double-stranded oligoribonucleotide is known from WO 99/32619.
  • the known method aims at inhibiting the expression of genes in cells of invertebrates. For this it is necessary that the double-stranded oligoribonucleotide has a sequence identical to the target gene with a length of at least 25 bases.
  • a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell and a medicament are known from WO '00/44895.
  • an oligoribonucleotide with a double-stranded structure (dsRNA) is introduced into the cell.
  • a strand of the dsRNA has a region which, at least in sections, is complementary to the target gene and consists of at most 49 successive nucleotide pairs.
  • the medicament contains at least one dsRNA for inhibiting the expression of a given target gene, a strand of the dsRNA being at least partially complementary to the target gene.
  • the object of the present invention is to increase the effectiveness of an inhibitor of the activity of a tyrosine kinase encoded by a gene produced by a mutation in a cell. Furthermore, a medicament or a combination of medicaments for the therapy of a disease is to be provided, which is associated with an activity of a tyrosine kinase encoded by a gene resulting from a mutation. Furthermore, a use for the production of such a medicament or of such a combination of medicaments for therapy is to be provided.
  • a method for increasing the effectiveness of an inhibitor of the activity of a tyrosine kinase encoded by a first gene resulting from a mutation in a cell treated with the inhibitor is provided, wherein the expression of the first gene in the cell by RNA interference is inhibited.
  • the "gene” is generally understood to mean the section of a DNA strand of the double-stranded DNA in the cell which is complementary to a section of the other DNA strand of the double-stranded DNA, including all transcribed regions, which serves as a template for the transcription of the gene. So the gene is generally the sense strand.
  • RNA interference means the targeted inhibition of the expression of a gene by double-stranded RNA.
  • the double-stranded RNA can be introduced into the cell or first formed in the cell.
  • “Introduced” is understood here to mean that the dsRNA is absorbed into the cell. This can e.g. by lipofection or by the cell independently inoculating the dsRNA with or without aids.
  • the method can be an in vitro method.
  • RNA interference RNA interference
  • the inhibitor and the inhibition of expression by RNA interference mutually support one another in reducing the activity of the tyrosine kinase in the cell.
  • the sensitivity of, in particular partially resistant, cells can be increased to such an extent that the cells can be specifically killed by the inhibitor.
  • the inhibitor can interact with the RNA
  • Interference to achieve the desired effect can be dosed lower. Side effects of the inhibitor can be reduced. This is particularly important if the inhibitor has a lack of specificity.
  • Such an inhibitor inhibits not only the activity of the tyrosine kinase encoded by the first gene but also the activity of further enzymes when the dosage is required when the inhibitor is administered alone.
  • the inhibitor can be used in such low doses that the further enzymes are not significantly inhibited thereby.
  • the method according to the invention can thus have a higher specificity than a method in which the activity of the tyrosine kinase is inhibited only with the inhibitor.
  • the method is particularly efficient if the mutation is a chromosomal aberration in which the first gene was created by fusing at least two further genes at at least one fusion site.
  • the expression of such a gene can be inhibited particularly specifically because the sequence generated by the fusion occurs only once in the genome.
  • the other genes can be bcr and abl.
  • a particularly suitable inhibitor for the process is STI571. It has been shown for this inhibitor that in order to achieve a comparable effect, the dosage can be reduced by a factor of about 5 if the express Bcr-Abl tyrosine kinase is inhibited by means of RNA interference.
  • the RNA interference can be brought about by a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) which has a first RNA strand S1.
  • the RNA strand S1 has a region which is complementary to a section A of the first gene which contains the fusion site, at least in sections. Since the gene is usually the sense strand, the RNA strand S1 is generally complementary to an RNA transcript formed during the expression of the first gene or its processing product, such as e.g. B. an mRNA.
  • a dsRNA is present when the ribonucleic acid consisting of one or two ribonucleic acid strands has a double-stranded structure. Not all nucleotides of the dsRNA need to
  • RNA strand S1 is sectionally complementary to section A of the first gene if it is essentially complementary to it. Individual or a few non-complementary nucleotides do no harm if the
  • Nucleotides of the first gene, to which these are not complementary, are not in the region of the fusion site. This region can comprise up to three nucleotides on both sides of the fusion site.
  • the method can specifically inhibit the expression of fused genes coding for a tyrosine kinase to such an extent that a dosage of the inhibitor is sufficient to inhibit the activity of the tyrosine kinase, which can be many times lower than in the case of a treatment only with the inhibitor.
  • the section A containing the fusion site it can be achieved that the expression of normal, ie non-mutated or fused, genes is not also inhibited by the dsRNA.
  • Section A comprising the fusion site, preferably has at least two, in particular three, nucleotides on each side of the fusion site.
  • a section A for example 21 nucleotides long, z. B. three nucleotides on one and 18 nucleotides on the other side of the fusion site. This enables a particularly efficient and specific inhibition of the expression of the first gene to be achieved.
  • the dsRNA can be introduced into the cells.
  • the advantage over a method in which the dsRNA is formed in the cell is that the inhibition of the expression of the first gene can be better controlled from outside the cell and stopped immediately at any time.
  • dsRNA has a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 1 or 2, nucleotides.
  • a dsRNA has a better effectiveness in inhibiting the expression of the first gene than at least one end of a dsRNA without single-stranded overhangs.
  • One end is a region of the dsRNA, in which there is usually a 5 'and a 3' strand end.
  • One only dsRNA existing in the RNA strand S1 accordingly has a loop structure and only one end.
  • a dsRNA formed from the RNA strand S1 and an RNA strand S2 has two ends. One end is formed by one end of the strand S1 on the RNA and one end of the strand S2 on the RNA.
  • the single-stranded overhang is preferably located at the 3 'end of the RNA strand S1. This localization of the single-stranded overhang leads to a further increase in the efficiency of the process.
  • the dsRNA has a single-stranded overhang only at one end, in particular at the end located at the 3 ′ end of the RNA strand S1. The other end is smooth on a double ended dsRNA, i.e. without overhangs, trained.
  • a dsRNA has proven to be sufficiently stable and well effective both in various cell culture media and in blood serum.
  • the complementary region of the RNA strand S1 of the dsRNA can be any complementary region of the RNA strand S1 of the dsRNA.
  • RNA strand S1 of the dsRNA can have less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, nucleotides.
  • the number of these nucleotides is also the number of the maximum possible base pairs in the dsRNA.
  • the cohesion of the dsRNA brought about by the non-covalent linking of complementary nucleotides can be achieved by at least one further chemical, ie covalent, in particular by connection using a hexaethylene glycol linker.
  • lent linkage at one end of the dsRNA can be increased. It has proven to be particularly efficient if the link is formed between the 5 'end of the RNA strand S1 and the 3' end of a second RNA strand S2 of the dsRNA.
  • the dsRNA can be derived from the RNA strand S1 which corresponds to sequence No. 1 in accordance with the attached sequence listing, in particular at least 90%, preferably 100%, and from the sequence No. 2 according to the attached sequence listing, in particular at least 90%, preferably 100%, matching RNA strand S2.
  • a dsRNA is particularly effective in inhibiting the expression of a first gene fused from bcr and abl.
  • the cell can be leukocytes, in particular a myeloid cell, or a hematopoietic stem cell.
  • the invention relates to a medicament or a combination of medicaments for the therapy of a disease which is associated with an activity of a tyrosine kinase encoded by a first gene resulting from a mutation.
  • This contains at least one inhibitor of the activity of the tyrosine kinase and furthermore an agent which inhibits the expression of the first gene by RNA interference.
  • the drug or the combination of drugs should be dosed so that the inhibition of the expression of the gene and the inhibition of the activity of the tyrosine kinase can be achieved.
  • both the inhibitor and the agent can be used in very low doses in such a medicament. This allows
  • the mutation can be a chromosomal aberration, in which the first gene was created by fusion of at least two genes, in particular the genes bcr and abl, at at least one fusion site.
  • disease is preferably chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia or acute myeloblatic leukemia.
  • STI571 is preferably contained as an inhibitor in the medicament or in the combination of medicaments.
  • the agent is preferably a dsRNA, a first RNA strand S1 of the dsRNA having an area which is at least partially complementary to a section A of the first gene which contains the fusion site.
  • section A has at least two, in particular three, nucleotides on each side of the fusion site.
  • At least one end of the dsRNA preferably has a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 1 or 2, nucleotides.
  • the single-stranded overhang can be located at the 3 'end of the RNA strand S1.
  • the dsRNA has a single-stranded overhang only at one end, in particular at the end located at the 3 'end of the RNA strand S1. It has been found that such a dsRNA is sufficiently stable in the body. It is broken down or excreted more slowly in blood than a dsRNA with single-stranded overhangs at both ends. At the same time, it is more effective than a dsRNA with blunt ends on both sides of the dsRNA. This enables a low dosage.
  • the complementary region of the RNA strand S1 of the dsRNA can have 19 to 24, preferably 20 to 23, in particular 22, nucleotides.
  • the RNA strand S1 can have less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, nucleotides.
  • the cohesion of the dsRNA brought about by complementary nucleotide pairs is preferably increased by at least one further chemical linkage formed at one end of the dsRNA, in particular by connection by means of a hexaethylene glycol linker. The link is preferably between the 5 'end of the RNA strand S1 and the 3' end of one second RNA strand S2 of the dsRNA is formed.
  • the dsRNA preferably consists of the RNA strand S1 which corresponds to sequence No. 1 in accordance with the attached sequence listing, in particular at least 90%, preferably 100%, and that with sequence No. 2 in accordance with the Sequence listing, in particular at least 90%, preferably 100%, corresponding RNA strand S2.
  • the dsRNA may in "the drug or combination of drugs in a solution or from a micella- ren structure, preferably a liposome or is enclosed a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule, or bound to a polymeric nano- or microcapsule
  • a micellar structure, a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule can facilitate the uptake of the dsRNA in cells
  • the capsid can in particular be a viral natural capsid or an artificial capsid produced chemically or enzymatically or a structure derived therefrom
  • the polymeric nano- or microcapsule consists of at least one biodegradable polymer, eg polybutylcyanoacrylate, which can transport and release dsRNA contained in or bound to it in the body.
  • the medicament can have a preparation which is suitable for inhalation, oral intake or injection, in particular for intravenous or intraperitoneal injection or for injection directly into an infected bone marrow.
  • the preparation that is suitable for inhalation or injection can contain the dsRNA in a physiologically compatible solution, in particular a physiologically compatible buffer, preferably a phosphate-buffered saline solution.
  • a physiologically compatible solution in particular a physiologically compatible buffer, preferably a phosphate-buffered saline solution.
  • the invention further relates to the use of an inhibitor of the activity of a tyrosine kinase encoded by a first gene resulting from a mutation and of an agent which inhibits the expression of the gene by RNA interference for the production of a medicament or a combination of medicaments for the therapy of a disease which is associated with a Activity of the tyrosine kinase goes hand in hand.
  • an inhibitor of the activity of a tyrosine kinase encoded by a first gene resulting from a mutation and of an agent which inhibits the expression of the gene by RNA interference for the production of a medicament or a combination of medicaments for the therapy of a disease which is associated with a Activity of the tyrosine kinase goes hand in hand.
  • Figure 5 shows the survival rate of those treated with STI571
  • the inhibitor STI571 was obtained from Novartis AG, Lichstrasse 35, Basel CH-4002, Switzerland. A stock solution of a concentration of 10 mg / ml in DMSO / H 2 0 (1: 1) was prepared and stored at -20 ° C. The stock solution was used to use STI571 in the specified final concentrations.
  • the mouse cell line 32D comes from a bone marrow
  • the factor-independent growing Bcr-Abl-expressing oligoclonal cell lines 32Dp210 and 32Dp210-H396P were isolated by viral transfection of the starting line 32D with the retroviral vector Mig210, described in Pear WS, Miller JP, Xu L et al., Blood ( 1998) 92, pages 3780-3792, or the vector Mig210-H396P generated from this vector.
  • the production of such transfected cell lines is described in detail in Bai RY, Ouyang T, Montgomeryhing C et al. , Blood (2000) 96, pages 4319-4327.
  • the nucleotide with the base adenine at position 1551 of the is in the section corresponding to the cellular gene c-abl (accession number in the database GenBank, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892, USA: M14752) c-abl gene replaced by a nucleotide with the base cytosine.
  • the viruses required for transfection were identified by infection of the Phoenix Eco cell line - available under Stanford registration number SBR-422 from Stanford University Medical Center, Garry P. Nolan, Ph.D. , Baxter Laboratory for Genetic Pharmacology, Stanford University School of Medicine, 269 Campus Drive, CCSR, Rm. 3205, Stanford, California 94305- 5175, USA - with the retroviral vector Mig210.
  • the cell line 32Dp210-H396P has a reduced sensitivity to STI571.
  • the human cell line M07e comes from a patient with megacarcinoma leukemia. It is from the DSMZ - German
  • M07e cells require GM-CSF or IL-3 for proliferation.
  • the Bcr-Abl-expressing cell line MO7p210 was obtained by transfection of M07e cells with the plasmid pGD210, as described in Hallek M, Danhauser-Riedl S, Herbst R et al. , Br J Haematol. (1996), 94, pages 5-16.
  • Cell extracts were obtained as follows: cells were pelleted and taken up in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.6; 250 mM NaCl; 0.1% Triton X-100; 5 mM EDTA; supplemented with "complete" proteases -Inhibitor cocktail tablets, Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Germany, according to the manufacturer's instructions). After centrifugation at 4 ° C. for 30 minutes, the protein concentration was determined using the colorimetric method according to Bradford MM, Anal Biochem. (1976) 72, pages 248-254, and measured at 595 n in a spectrophotometer.
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • proteins from the SDS polyacrylamide gel were applied to a PVDF membrane (Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str.
  • Identical protein loadings of the traces of the SDS polyacrylamide gel can be determined by detecting the constitutively expressed protein GAP-DH with a specific antibody (1: 10000, "Mab to Glyceraldehyde-3-PDH", clone 6C5, order no .: H86504M, BIODESIGN International; 60 Industrial Park Road; Saco, Maine 04072, USA).
  • the membranes are washed with TBST (Tris buffered saline with 1% v / v Tween-20) and then with a horseradish-peroxidase-coupled secondary antibody (1: 10000; Jackson I munoResearch Laboratories, Inc., PO Box 9, 872 West Baltimore Pike, West Grove, PA, USA 19390).
  • 500,000 cells were pelleted and once each with ice-cold PBS (0.27M NaCL, 0.005M KCL, 0.015M NaHP0 x H 2 0, 0.003M KH 2 P0 4 , BIOCHROM AG, Leonorenstrasse 2-6 , D-12247 Berlin, Germany) and then washed with annexin binding buffer (10 M Hepes / NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2 ). The cell pellet was then taken up in 100 ⁇ l of annexin binding buffer and 5 ⁇ l of annexin V-FITC (order no. 556420, BD Biosciences, Tullastrasse 4,
  • the proportion of living cells in a population was determined using MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliium bromide).
  • MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliium bromide).
  • the tetrazole salt MTT which is yellow in aqueous solution, is converted into a violet formazane product (1- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -3, 5-diphenylformazane) by a dehydrogenase expressed in the cells of metabolically active cells in the mi ochondria by cleavage of the tetrazolium ring ) reduced.
  • MTT working solution 10 mg / ml in PBS, prepared from 50 mg / ml MTT in DMSO
  • 10 ⁇ l of MTT working solution 10 mg / ml in PBS, prepared from 50 mg / ml MTT in DMSO
  • 90 ⁇ l / well of lysis buffer 10% (w / v) sodium dodezyl sulfate, 20 mM HC1 in double-distilled water, pH 4.5
  • lysis buffer 10% (w / v) sodium dodezyl sulfate, 20 mM HC1 in double-distilled water, pH 4.5
  • the survival rate was determined in each case as a percentage of a value determined for treated cells of a value determined for untreated cells.
  • the double-stranded oligoribonucleotides used for transfections have the following sequences, designated in the sequence listing with No. 1 to No. 8:
  • BAFl dsRNA, one strand S1 of which is complementary to a section A containing the fusion site b3a2 of a gene bcr-abl fused from the genes bcr and abl (accession number in the GenBank database: AJ131466):
  • the vertical line in sequences No. 1 - No. 4 identifies the position corresponding to the fusion site.
  • K4 dsRNA serving as control, one strand S1 of which is complementary to a sequence of the 5-untranslated region of the bacterial neomycin resistance gene (Accession Number in the database GenBank: U55763):
  • S2 5'-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3 '(Sequence No. 6)
  • S1 3' -UCCUACUCCUAGCAAAGCGUACU-5 '(Sequence No. 5)
  • GAL2 dsRNA serving as a control, one strand S1 of which is complementary to a ⁇ -galactosidase gene (accession number in the GenBank database: U02451):
  • RNA single strands were synthesized using an RNA synthesizer (type Expedite 8909, Applied Biosystems, Rothstadt, Germany) and conventional chemical methods. The crude synthesis products were then cleaned using HPLC. NucleoPac PA-100, 9x250 mm from Dionex, were used as columns. 20 mM Tris, 10 mM NaCl0, pH 6.8, 10% acetonitrile was used as the low salt buffer and 20 mM Tris, 400 mM NaC10, pH 6.8, 10% acetonitrile as the high salt buffer. The flow was 3 ml / minute.
  • the hybridization of the single strands (10 ⁇ M each) to the double strand was carried out by heating the stoichiometric mixture of the individual strands to 95 ° C. for 5 minutes in 25 M Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl and then cooling to 37 ° C. over 30 minutes.
  • 32Dp210 cells were adjusted to a density of 3.2 x 10 6 cells per ml and MO7p210 cells to a density of 5 x 10 ⁇ cells per ml in cell culture medium. 800 ⁇ l of these cell suspensions were each mixed with 800 nM dsRNA in a 4 mm electroporation cuvette (PEQLAB - Biotechnologie GmbH, Carl-Thiersch-Str. 2b, D-91052 Er Weg, Germany).
  • the cells were electroporated using the EasyJect electroporator (PEQLAB - Biotechnologie GmbH) using a single pulse (250 V, 1800 ⁇ F, no limitation of the electrical resistance).
  • the 32Dp210 cells in 20 ml of cell culture medium supplemented with 1 ng / ml of recombinant murine IL-3 ("Recombinant Murine Interleukin-3", Order No. P030248, STRATHMANN BIOTECH AG, Feodor-Lynen-Str. 5, 30625 Hannover).
  • Mo7p210 cells were taken up in 10 ml cell culture medium with 100 ng / ml hGM-CSF (Leucomax® 150, Novartis Pharma GmbH, 90327 Nuremberg, Germany). This treatment was carried out four times every 24 hours. After the last electroporation, the cells were washed several times and cultivated further in cell culture medium without growth factor addition. Cells not treated with dsRNA were also subjected to electroporation as a control (electroporation control, EP in FIG. 3).
  • the Western blot shown in FIG. 1 shows that the treatment of 32Dp210 cells with BAF1 (lane 2) in contrast to the
  • 32Dp210 cells were cultured for 40 hours without growth factors and with STI571 in different doses.
  • the survival rate determined by means of MTT was determined as the average value ⁇ standard deviation of 3 test batches. 2 shows a representative experiment from a total of 3 independent experiments.
  • the apparent survival rate of STI571-treated 32Dp210 cells shows that the down-regulation of the Bcr-Abl-
  • Protein expression using BAFl significantly increased the sensitivity of the cells to STI571.
  • BAF2 filled triangles, top tip
  • dsRNA filled triangles, tip bottom
  • the IC 50 value denotes the concentration of STI571 at which a survival rate of 50% is achieved. This effect was also observed in MO7p210 cells.
  • MO7p210 cells have been treated with dsRNA as described.
  • the growth factor GM-CSF was then withdrawn from them and the cells were treated with 0.05 ⁇ M STI571 for 16 hours.
  • the percentage increase in the proportion of apoptotic M07p210 cells measured after STI571 treatment compared to the corresponding proportion in M07p210 cells not treated with STI571 is shown in FIG. 3 and FIG. 4.
  • FIG. 5 shows the survival rate of 32Dp210 cells (filled circles) and 32Dp210-H396P cells (open squares) treated with STI571 as a function of the concentration of STI571.
  • the IC50 values determined for this were 0.3 ⁇ M for 32Dp210 cells and 1.4 ⁇ M STI571 for 32Dp210-H396P cells.
  • the values are mean values ⁇ standard deviation from three experimental approaches.
  • FIG. 6 shows the relative survival rate of 32Dp210-H396P cells treated with STI571 after pretreatment with BAFl (filled triangles), BAF2 (filled circles) and without dsRNA (open squares).
  • An IC 50 value of 1.27 ⁇ M was determined for cells treated with BAF2 and of 1.56 ⁇ M STI571 for cells treated without dsRNA.
  • Treatment of the cells with BAF1 brought about a downregulation of the IC 50 value to 0.44 ⁇ M STI571. This shows that the effectiveness of STI571 can also be increased to such an extent in cells with a reduced sensitivity to STI571 that treatment is effective at a dose that is acceptable to a human or an animal.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Inhibitors der Aktivität einer Tyrosinkinase in einer Zelle. Die Tyrosinkinase wird dabei von einem durch eine Mutation entstandenen Gen kodiert. Zur Durchführung des Verfahrens wird die Zelle mit dem Inhibitor behandelt und zusätzlich die Expression des Gens durch RNA-Interferenz gehemmt.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Inhibitors der Aktivität einer Tyrosinkinase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Inhibitors der intrazellulären Aktivität einer Tyrosinkinase. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Medikament oder eine Kombination von Medikamenten zur Therapie einer Erkrankung, welche mit einer Aktivität einer Tyrosinkinase einher geht. Ferner betrifft die Erfindung eine Verwendung zur Herstellung des Medikaments oder der Kombination von Medikamenten. Bei der Tyrosinkinase handelt es sich dabei immer um eine von einem durch eine Mutation entstanden Gen kodierte Tyrosinkinase .
Die Mutation kann eine Genmutation oder eine Chromosomen- Aberration sein. Bei einer Chromosomen-Aberration handelt es sich um strukturelle Änderungen und Defekte an einem Chromosom oder mehreren Chromosomen. Dabei kann es zu einem Verlust oder zu einer Vervielfältigung von Genmaterial kommen. Es kann zu einer Translokation, einer Inversion, einer Deletion, einer Insertion, einer Duplikation oder einer Ringbildung kommen. Bei der Duplikation sind einzelne Chromosomenabschnitte verdoppelt. Bei der Inversion liegt ein Chromosomenabschnitt mit umgekehrter Nukleotidsequenz vor. Unter Deletion versteht man einen Stückverlust eines Chromosoms. Bei einer Translokation findet ein Stückaustausch zwischen nicht homologen Chromosomen statt. Bei einer Chromosomen-Aberration kann ein aus mindestens zwei Genen fusioniertes Gen entstehen. Steht dieses so entstandene mutierte Gen unter der Kontrolle eines Promotors, so kann es exprimiert werden und dadurch eine Beeinträchtigung hervorrufen. Diese Beeinträchtigung kann beispielsweise eine Erkrankung des hä atopoetisehen Systems sein, wie eine akute myeloische Leukämie (AML) oder eine chronisch myeloische Leukämie (CML) . Bei über 95% der chronisch myelioischen Leukämien (CML) ist eine reziproke Translokation zwischen den langen Armen der Chromosomen 9 und 22 die Ursache. Die Translokation führt zu einer Fusion von Sequenzen der Gene bcr und abl . Bei der Ex- pression des fusionierten Gens entsteht das sehr stabile Fusionsprotein Bcr-Abl . Bcr-Abl ist eine konsitutiv aktive Tyrosinkinase, deren Aktivität ursächlich für das Krankheitsbild der CML ist. Die genannte Translokation findet sich auch bei 15 bis 30% der Patienten mit akuter lympathischer Leukä- ie (ALL) im Erwachsenenalter und bei etwa 2% der Patienten mit akuter myeloblastischer Leukämie. Bei der CML handelt es sich um eine myeloproliferative Erkrankung der hämatopoeti- schen Stammzellen. In der Zellkultur wurde gezeigt, dass die Expression der Bcr-Abl-Tyrosinkinase zur Unabhängigkeit von externen Wachstumsfaktoren führt und eine ausgeprägte antia- poptotische Wirkung aufweist. Weiterhin beeinflusst die Bcr- Abl-Tyrosinkinase DNA-Reparaturproteine .
Zur Behandlung von Erkrankungen, deren Symptome von der Akti- vität einer von einem durch eine Mutation entstandenen Gen kodierten Tyrosinkinase zumindest mitverursacht werden, werden Inhibitoren der Tyrosinkinase eingesetzt. Im Falle der auf der genannten Translokation beruhenden CML sind dies Inhibitoren der Bcr-Abl-Tyrosinkinase. Einer dieser Inhibitoren ist Imatinib, welcher auch als STI571 bezeichnet wird und als Imatinibmesylat unter den Handelsnamen Gleevec und Glivec von der Firma Novartis vertrieben wird. Trotz hervorragender an- tileukämischer Wirkung scheint eine Heilung der CML durch Behandlung mit STI571 nicht möglich zu sein. In späten Stadien der Erkrankung werden nach anfänglicher Remission zahlreiche
Rezidive unter der Therapie beobachtet. Vollständige molekulare Remissionen sind bisher nicht beschrieben. Somit scheint ein kleiner Anteil der klonalen Zellen trotz Inhibition der Bcr-Abl-Tyrosinkinase zu überleben. Aus der WO 99/32619 ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens mittels eines doppelsträngigen Oligoribo- nukleotids bekannt. Das bekannte Verfahren zielt auf die Hemmung der Expression von Genen in Zellen von Invertebraten ab. Dazu ist es erforderlich, dass das doppelsträngige Oligoribo- nukleotid eine zum Zielgen identische Sequenz mit einer Länge von mindestens 25 Basen aufweist.
Ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle sowie ein Medikament sind aus der WO' 00/44895 bekannt. Bei dem Verfahren wird ein Oligoribonukleotid mit dop- pelsträngiger Struktur (dsRNA) in die Zelle eingeführt. Ein Strang der dsRNA weist einen zum Zielgen zumindest abschnittsweise komplementären aus höchstens 49 aufeinander folgenden Nukleotidpaaren bestehenden Bereich auf. Das Medikament enthält mindestens eine dsRNA zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens, wobei ein Strang der dsRNA zum Zielgen zumindest abschnittsweise komplementär ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Wirksamkeit eines Inhibitors der Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen Gen kodierten Tyrosinkinase in einer Zelle zu erhöhen. Weiterhin soll ein Medikament oder eine Kombination von Medikamenten zur Therapie einer Erkrankung bereit- gestellt werden, welche mit einer Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen Gen kodierten Tyrosinkinase einhergeht. Ferner soll eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments oder einer solchen Kombination von Medikamenten zur Therapie bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 16 und 33 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 1 bis 15, 17 bis 32 und 34 bis 49. Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Inhibitors der Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen ersten Gen kodierten Tyrosinkinase in einer mit dem Inhibitor behandelten Zelle vorge- sehen, wobei die Expression des ersten Gens in der Zelle durch RNA-Interferenz gehemmt wird. Unter dem "Gen" wird im Allgemeinen der Abschnitt eines DNA-Strangs der doppelsträngigen DNA in der Zelle verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Transkription des Gens als Matrize dienenden Abschnitt des anderen DNA-Strangs der doppelsträngigen DNA einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Bei dem Gen handelt es sich also im Allgemeinen um den Sinn-Strang.
Unter RNA-Interfe enz wird die gezielte Hemmung der Expressi- on eines Gens durch doppelsträngige RNA verstanden. Die dop- pelsträngige RNA kann dazu in die Zelle eingeführt oder erst in der Zelle gebildet werden. Unter "eingeführt werden" wird hier verstanden, dass eine Aufnahme der dsRNA in die Zelle erreicht wird. Das kann z.B. durch Lipofektion oder auch da- durch erfolgen, dass die Zelle die dsRNA selbständig mit oder ohne Hilfsmittel auf immt. Das Verfahren kann ein in vitro- Verfahren sein.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass durch die He - mung der Expression des für die Tyrosinkinase kodierenden Gens eine starke Erhöhung der Wirksamkeit eines in diesen Zellen wirksamen Inhibitors der Tyrosinkinase erreicht werden kann. Es gibt Zellen, bei welchen der Inhibitor nur vergleichsweise schlecht und in hohen Dosierungen wirkt. Solche Zellen sind z.B. gegenüber STI571 teilresistente Zellen, welche eine Bcr-Abl-Mutation aufweisen, wie sie bspw. aus von Bubnoff, N. et al . , The Lancet (2002), Band 359, Seiten 487- 491 bekannt ist. Sogar in solchen Zellen kann durch die Hemmung der Expression des für die Tyrosinkinase kodierenden Gens eine ausreichende Inhibition der Aktivität der Tyrosin- kinase erreicht werden. Eine solche Inhibition ist weder durch eine Hemmung der Expression des Gens durch RNA- Interferenz alleine noch durch den Inhibitor alleine möglich. Der Inhibitor und die Hemmung der Expression durch RNA- Interferenz unterstützen sich gegenseitig darin, in der Zelle die Aktivität der Tyrosinkinase zu vermindern. Die Sensitivi- tät von, insbesondere teilresistenten Zellen, kann dadurch soweit gesteigert werden, dass die Zellen durch den Inhibitor spezifisch zum Absterben gebracht werden können. Weiterhin kann der Inhibitor durch das Zusammenwirken mit der RNA-
Interferenz zum Erreichen der gewünschten Wirkung niedriger dosiert werden. Nebenwirkungen des Inhibitors können reduziert werden. Das ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn der Inhibitor eine mangelnde Spezifität aufweist. Ein solcher Inhibitor hemmt bei der bei alleiniger Verabreichung des Inhibitors erforderlichen Dosierung nicht nur die Aktivität der vom ersten Gen kodierten Tyrosinkinase sondern auch die Aktivität weiterer Enzyme. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann der Inhibitor so niedrig dosiert eingesetzt werden, dass die weiteren Enzyme dadurch nicht wesentlich inhibiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit eine höhere Spezifität aufweisen als ein Verfahren, bei dem die Aktivität der Tyrosinkinase nur mit dem Inhibitor gehemmt wird.
Besonders effizient ist das Verfahren, wenn die Mutation eine Chromosomen-Aberration ist, bei welcher das erste Gen durch Fusion von mindestens zwei weiteren Genen an mindestens einer Fusionsstelle entstanden ist. Die Expression eines solchen Gens lässt sich besonders spezifisch hemmen, weil die durch die Fusion generierte Sequenz nur einmal im Genom vorkommt. Bei den weiteren Genen kann es sich um bcr und abl handeln. Ein für das Verfahren besonders gut geeigneter Inhibitor ist STI571. Für diesen Inhibitor hat sich gezeigt, dass zum Erzielen einer vergleichbaren Wirkung die Dosierung etwa um den Faktor 5 reduziert werden kann, wenn gleichzeitig die Expres- sion der Bcr-Abl-Tyrosinkinase mittels RNA-Interferenz gehemmt wird.
Die RNA-Interferenz kann durch eine doppelsträngige Ribonu- kleinsäure (dsRNA) bewirkt werden, welche einen ersten RNA- Strang Sl aufweist. Dabei weist der RNA-Strang Sl einen zu einem die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A des ersten Gens zumindest abschnittsweise komplementären Bereich auf. Da es sich bei dem Gen üblicherweise um den Sinn-Strang handelt, ist der RNA-Strang Sl im Allgemeinen komplementär zu einem bei der Expression des ersten Gens gebildeten RNA-Transkript oder dessen Prozessierungsprodukt, wie z. B. einer mRNA. Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Ribonukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelsträngige Struktur aufweist. Nicht alle Nukleotide der dsRNA müssen
Watson-Crick-Basenpaarungen aufweisen. Insbesondere einzelne nicht komplementäre Basenpaare beeinträchtigen das Verfahren kaum oder gar nicht. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenen Strang, sofern die dsRNA aus zwei Strängen besteht. Der Abschnitt A "enthält" die Fusionsstelle, wenn sich auf einer Seite der Fusionsstelle mindestens ein Nukleotid befindet. Der Rest des Abschnitts A umfasst Nukleotide auf der anderen Seite der Fusionsstelle. Das bedeutet, dass sich die Fusionsstelle weder ganz am Anfang noch ganz am Ende des Abschnitts A befindet. Der Abschnitt A sollte mindestens 16 Nukleotide umfassen. Der RNA-Strang Sl ist abschnittsweise komplementär zu dem Abschnitt A des ersten Gens, wenn er im Wesentlichen dazu komplementär ist. Einzelne oder wenige nicht komplementäre Nukleotide schaden nicht, sofern sich die
Nukleotide des ersten Gens, zu denen diese nicht komplementär sind, nicht im Bereich der Fusionsstelle befinden. Dieser Bereich kann beiderseits der Fusionsstelle bis zu drei Nukleotide umfassen. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch das Verfahren spezifisch die Expression von fusionierten für eine Tyrosinkinase kodierenden Genen so weit gehemmt werden kann, dass eine Dosierung des Inhibitors zur Hemmung der Aktivität der Tyrosinkinase ausreichend ist, die um ein vielfaches niedriger sein kann als bei einer Behandlung ausschließlich mit dem Inhibitor. Durch die Auswahl des die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitts A kann erreicht werden, dass durch die dsRNA nicht auch die Expression normaler, d.h. nicht mutierter bzw. fusionierter Gene gehemmt wird.
Vorzugsweise weist der die Fusionsstelle umfassende Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle auf. Bei einem bspw. 21 Nukleotide langen Abschnitt A können dann z. B. drei Nukleotide auf der einen und 18 Nukleotide auf der anderen Seite der Fusionsstelle angeordnet sein. Dadurch ist eine besondere effiziente und spezifische Hemmung der Expression des ersten Gens zu erreichen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die dsRNA in die Zellen eingeführt werden. Der Vorteil gegenüber einem Verfahren, bei dem die dsRNA in der Zelle gebildet wird, besteht darin, dass die Hemmung der Expression des ersten Gens besser von außerhalb der Zelle gesteuert und jederzeit sofort beendet werden kann.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2 , Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Eine solche dsRNA weist gegenüber einer dsRNA ohne einzelsträngige Überhänge an mindestens einem Ende eine bessere Wirksamkeit bei der Hemmung der Expression des ersten Gens auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in wel- ehern ein 5'- und ein 3 ' -Strangende vorliegen. Eine nur aus dem RNA-Strang Sl bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf. Eine aus dem RNA-Strang Sl und einem RNA-Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dabei jeweils von einem auf dem RNA-Strang Sl und einem auf dem RNA-Strang S2 liegenden Strangende gebildet .
Vorzugsweise befindet sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl . Diese Lokalisation des einzel- strängigen Überhangs führt zu einer weiteren Steigerung der Effizienz des Verfahrens. In einem Ausführungsbeispiel weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des RNA- Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Das andere Ende ist bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Eine solche dsRNA hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blutserum als hinreichend beständig und gut wirksam erwiesen.
Der komplementäre Bereich des RNA-Strangs Sl der dsRNA kann
19 bis 24, vorzugsweise 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Inhibition des ersten Gens. Der RNA-Strang Sl der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare. Erstaunlicherweise ist es mit einer solchen dsRNA möglich, spezifisch die Expression des fusionierten ersten Gens zu hemmen ohne die Expression der weiteren Gene wesentlich zu beeinflussen.
Der durch die nicht kovalente Verknüpfung komplementärer Nukleotide bewirkte Zusammenhalt der dsRNA kann durch mindestens eine weitere, insbesondere durch Verbindung mittels ei- nes Hexaethylenglykol-Linkers gebildete chemische, d.h. kova- lente Verknüpfung an einem Ende der dsRNA erhöht werden. Als besonders effizient hat es sich erwiesen, wenn die Verknüpfung zwischen dem 5 ' -Ende des RNA-Strangs Sl und dem 3 ' -Ende eines zweiten RNA-Strangs S2 der dsRNA gebildet wird.
Bei einem aus den Genen bcr und abl fusionierten ersten Gen kann die dsRNA aus dem mit der Sequenz Nr. 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100%, übereinstimmenden RNA-Strang Sl und dem mit der Sequenz Nr. 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100%, übereinstimmenden RNA-Strang S2 bestehen. Eine solche dsRNA ist in der Hemmung der Expression eines aus bcr und abl fusionierten ersten Gens besonders wirksam. Bei der Zelle kann es sich zum einen Leukozyten, insbesondere eine myeloische Zelle, oder eine hämatopoetische Stammzelle handeln.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Medikament oder eine Kombination von Medikamenten zur Therapie einer Erkrankung, welche mit einer Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen ersten Gen kodierten Tyrosinkinase einher geht. Darin sind mindestens ein Inhibitor der Aktivität der Tyrosinkinase und weiterhin ein die Expression des ersten Gens durch RNA-Interferenz hemmendes Agens enthalten. Das Me- dikament oder die Kombination von Medikamenten ist so zu dosieren, dass die Hemmung der Expression des Gens und die Inhibition der Aktivität der Tyrosinkinase erreicht werden kann. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass in einem solchen Medikament sowohl der Inhibitor als auch das Agens sehr niedrig dosiert eingesetzt werden kann. Dadurch können
Nebenwirkungen eines hochdosiert eingesetzten Inhibitors weit gehend vermieden werden. Die Mutation kann eine Chromosomen- Aberration sein, bei welcher das erste Gen durch Fusion aus mindestens zwei Genen, insbesondere den Genen bcr und abl, an mindestens einer Fusionsstelle entstanden ist. Bei der Er- krankung handelt es sich bevorzugt um eine Chronische Myeloische Leukämie, eine Akute Lymphatische Leukämie oder eine Akute Myeloblatische Leukämie. Als Inhibitor ist bevorzugt STI571 in dem Medikament oder in der Kombination von Medika- menten enthalten. Bevorzugt ist das Agens eine dsRNA, wobei ein erster RNA-Strang Sl der dsRNA zu einem die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A des ersten Gens einen zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusi- onsstelle aufweist. Vorzugsweise weist zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf. Der einzelsträngige Überhang kann sich am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl befinden.
Besonders bevorzugt weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Es hat sich herausgestellt, dass eine solche dsRNA im Körper hinreichend beständig ist. Sie wird in Blut langsamer abgebaut bzw. ausgeschieden als eine dsRNA mit einzelsträngigen Überhängen an beiden Enden. Gleichzeitig ist sie wirksamer als eine dsRNA mit glatten Enden auf beiden Seiten der dsRNA. Dadurch ist eine niedrige Dosierung möglich.
Der komplementäre Bereich des RNA-Strangs Sl der dsRNA kann 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweisen. Der RNA-Strang Sl kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleo- tide aufweisen. Der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA wird bevorzugt durch mindestens eine weitere, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers gebildete, chemische Verknüpfung an einem Ende der dsRNA erhöht. Die Verknüpfung ist bevorzugt zwischen dem 5 ' -Ende des RNA-Strangs Sl und dem 3 ' -Ende eines zweiten RNA-Strangs S2 der dsRNA gebildet. In dem Medikament oder der Ko bination von Medikamenten besteht die dsRNA bevorzugt aus dem der Sequenz Nr. 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100%, übereinstimmenden RNA-Strang Sl und dem mit der Sequenz Nr. 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100%, übereinstimmenden RNA- Strang S2. Die dsRNA kann in" dem Medikament oder der Kombination von Medikamenten in einer Lösung oder von einer micella- ren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegen. Eine micellare Struktur, ein Kapsid, ein Kapsoid oder eine polymere Nano- oder Mikrokapsel kann die Aufnahme der dsRNA in Zellen erleichtern. Das Kapsid kann insbesondere ein virales natürliches Kapsid oder ein auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestelltes künstliches Kapsid oder eine davon abgeleitete Struktur sein. Die polymere Nano- oder Mikrokapsel besteht aus mindestens einem biolo- gisch abbaubaren Polymer, z.B. Polybutylcyanoacrylat. Sie kann darin enthaltene oder daran gebundene dsRNA im Körper transportieren und freisetzen.
Das Medikament kann eine Zubereitung aufweisen, die zur Inha- lation, oralen Aufnahme oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Injektion oder zur Injektion direkt in ein befallenes Knochenmark, geeignet ist. Eine zur Inhalation oder Injektion geeignete Zubereitung kann die dsRNA im einfachsten Fall in einer physiologisch verträgli- chen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einer phosphatgepufferten Salzlösung, enthalten. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einer solchen Lösung oder einem solchen Puffer gelöste dsRNA von den Zellen aufgenommen wird und die Expression des ersten Gens hemmt ohne dass die dsRNA dazu in ein besonderes Vehikel verpackt werden muss.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors der Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen ersten Gen kodierten Tyrosinkinase und eines die Expression des Gens durch RNA-Interferenz hemmenden Agens zur Herstellung eines Medikaments oder einer Kombination von Medikamenten zur Therapie einer Erkrankung, welche mit einer Akti- vität der Tyrosinkinase einher geht. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Verwendung können den Ansprüchen 34 bis 49 sowie der vorstehenden Beschreibung entnommen werden.
Nachfolgend werden anhand der Figuren Beispiele der Erfindung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Western-Blot-Analyse von Bcr-Abl, c-Abl,
Bcl-XL und p27 in 32Dp210-Zellen nach Behandlung der Zellen mit den dsRNAs BAF2 (Spur 1) und BAF1 (Spur 2 ) und ohne dsRNA ( Spur 3 ) ,
Fig. 2 die Überlebensrate von STI571-behandelten 32Dp210- Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration an STI571 mit und ohne Inhibition der Bcr-Abl- Expression durch RNA-Interferenz,
Fig. 3 die prozentuale Steigerung des Anteils apoptoti- scher an der Gesamtzahl der M07p210-Zellen nach STI571-Behandlung gegenüber dem entsprechenden An- teil bei nicht mit STI571 behandelten M07p210-
Zellen mit und ohne Inhibition der Bcr-Abl- Expression durch RNA-Interferenz ,
Fig. 4 die prozentuale Steigerung des Anteils apoptoti- scher an der Gesamtzahl der M07p210-Zellen nach STI571-Behandlung gegenüber dem entsprechenden Anteil bei nicht mit STI571 behandelten M07p210- Zellen nach Behandlung mit verschiedenen dsRNAs,
Fig. 5 die Überlebensrate von mit STI571 behandelten
32Dp210- und 32Dp210-H396P-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration an STI571 und
Fig. 6 die Überlebensrate von mit STI571 behandelten 32Dp210-H396P-Zellen mit und ohne Inhibition der
Bcr-Abl-Expression durch RNA-Interferenz .
Der Inhibitor STI571 wurde von der Novartis AG, Lichstrasse 35, Basel CH-4002, Schweiz bezogen. Es wurde eine Stocklö- sung einer Konzentration von 10 mg/ml in DMSO/H20 (1:1) hergestellt und bei -20°C gelagert. Die Stocklösung wurde verwendet um STI571 in den jeweils angegebenen Endkonzentrationen einzusetzen.
Die Maus-Zelllinie 32D entstammt einer Knochenmarks-
Lang eitkultur . Sie wurde bei der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Deutschland unter der Bestell-Nr. ACC 411 beezogen. Das Wachstum dieser Linie ist abhängig von exo- genem IL-3.
Die Faktor-unabhängig wachsenden Bcr-Abl exprimierenden oli- goklonalen Zelllinien 32Dp210 bzw. 32Dp210-H396P wurden durch virale Transfektion der Ausgangslinie 32D mit dem retrovira- len Vektor Mig210, beschrieben in Pear WS, Miller JP, Xu L et al., Blood (1998) 92, Seiten 3780-3792, bzw. dem aus diesem Vektor erzeugten Vektor Mig210-H396P hergestellt. Die Herstellung derart transfizierter Zelllinien ist detailliert beschrieben in Bai RY, Ouyang T, Miething C et al . , Blood (2000) 96, Seiten 4319-4327. Zur Erzeugung des Vektors Mig210-H396P wurde zunächst ein für die Bcr-Abl-Mutante mit dem Aminosäureaustausch H396P kodierendes Gen aus einer Probe eines gegenüber STI571 teilweise resistenten Patienten isoliert und amplifiziert, wie es in von Bubnoff, N. et al . , The Lancet (2002), Band 359, Seiten 487-491 beschrieben ist. Das Gen ist dann so in den Vektor Mig210 kloniert worden, dass das darin enthaltene bcr-abl-Gen durch das für die Bcr-Abl- Mutante H396P kodierende Gen ersetzt ist. Bei dem mutierten Gen ist in dem dem zellulären Gen c-abl (Accession Number in der Datenbank GenBank, National Institutes of Health, Bethes- da, Maryland, 20892, USA: M14752) entsprechenden Abschnitt das Nukleotid mit der Base Adenin an Position 1551 des c-abl- Gens durch ein Nukleotid mit der Base Cytosin ersetzt. Die für die Transfektion erforderlichen Viren wurden durch Infek- tion der Zellline Phoenix-Eco - unter der Stanford Registriernummer SBR-422 zu beziehen von Stanford University Medical Center, Garry P. Nolan, Ph.D. , Baxter Laboratory for Genetic Pharmacology, Stanford University School of Medicine, 269 Campus Drive, CCSR, Rm. 3205, Stanford, California 94305- 5175, USA - mit dem retroviralen Vektor Mig210 hergestellt.
Die Zelllinie 32Dp210-H396P weist eine verminderte Sensitivi- tät gegenüber STI571 auf.
Die humane Zelllinie M07e stammt von einem Patienten mit me- gakariozytärer Leukämie. Sie ist von der DSMZ - Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Bestell-Nr. ACC 104 zu beziehen. M07e-Zellen benötigen GM-CSF oder IL-3 zur Proliferation. Die Bcr-Abl-exprimierende Zelllinie MO7p210 wurde durch Transfektion von M07e-Zellen mit dem Plasmid pGD210 gewonnen, wie es in Hallek M, Danhauser- Riedl S, Herbst R et al . , Br J Haematol. (1996), 94, Seiten 5-16, beschrieben ist.
Alle Zellen wurden in RPMI 1640 (BIOCHROM AG, Leonorenstr. 2- 6, D-12247 Berlin, Deutschland) mit 2 mM L-Glutamin und 10 % FCS, im Folgenden als Zellkulturmedium bezeichnet, bei 37 °C und einer 5 % C02-Atmosphäre kultiviert.
Zellextrakte wurden wie folgt gewonnen: Zellen wurden pelle- tiert und in Lysepuffer aufgenommen (50 mM Tris-HCl, pH 7,6; 250 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; 5 mM EDTA; supplementiert mit "complete" Proteasen-Inhibitor Cocktail-Tabletten, Röche Dia- gnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Deutschland, nach Anweisung des Herstellers) . Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 4 °C wurde die Proteinkonzentration mit Hilfe der kolorimetrischen Methode gemäß Bradford MM, Anal Biochem. (1976) 72, Seiten 248-254, nachgewiesen und bei 595 n in einem Spektralphotometer gemessen.
Für die Western-Blot-Analyse wurden je 100 ßg Protein auf eine Spur eines SDS-Polyacrylamidgels aufgetragen und nach ihrer Größe mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE) aufgetrennt. Als SDS-Polyacrylamidgel wurde ein 1 mm dickes Flachbettgel mit Acrylamidkonzentrationen von 7,5 % im Trenngel und 4 % im Sammelgel verwendet. Nach der SDS-PAGE wurden Proteine aus dem SDS-Polyacrylamidgel auf eine PVDF- Membran (Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Deutschland) mittels einer Trans-Blot® SD-Transfercell (Bio-Rad Laboratories GmbH, Hei- demannstrasse 164, D-80939 München, Deutschland) elek- trophoretisch transferiert. Die Detektion von auf der Membran immobilisierten Proteinen erfolgte durch spezifische Antikörper gegen c-Abl (1 μg/ml, "purified mouse anti-Abi onoclonal antibody", Klon 8E6, Bestell-Nr. 554158, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, CA 92121, USA), Bcl-XL (1:1000, "purified mouse Bcl-X monoclonal antibody", Klon 2H12 , Bestell-Nr. 66461A, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, CA 92121, USA) und p27 (1:250, "purified mouse anti- p27Kipl monoclonal antibody", Klon G173-524, Bestell-Nr. 13231A, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, CA 92121, USA) . Gleiche Proteinbeladungen der Spuren des SDS- Polyacrylamidgels sind durch Detektion des konstitutiv expri- ierten Proteins GAP-DH mit einem dafür spezifischen Antikörper (1:10000, "Mab to Glyceraldehyde-3-PDH" , Klon 6C5 , Be- stell-Nr.: H86504M, BIODESIGN International; 60 Industrial Park Road; Saco, Maine 04072, USA) kontroliert worden. Die Membranen werden mit TBST (Tris buffered saline mit 1 % v/v Tween-20) gewaschen und anschließend mit einem Meerrettich- Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (1:10000; Jackson I munoResearch Laboratories, Inc., P.O. Box 9, 872 West Baltimore Pike, West Grove, PA, USA 19390) inkubiert. Vor dem Nachweis gebundener Sekundärantikörper durch Substratzugabe ("ECL Plus Western Blotting Detection Reagents", Bestell-Nr. RPN 2132, Amersham Biosciences Europe GmbH, Munzinger Strasse 9, D-79111 Freiburg, Deutschland) wurde die Membran nochmals in TBST gewaschen.
Zum Nachweis apoptotischer Zellen wurden 500 000 Zellen pelletiert und je einmal mit eiskaltem PBS (0,27M NaCL, 0,005M KCL, 0,015M NaHP0 x H20, 0,003M KH2P04, BIOCHROM AG, Leono- renstr. 2-6, D-12247 Berlin, Deutschland) und anschließend mit Annexin-Bindepuffer (10 M Hepes / NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) gewaschen. Dann wurde das Zellpellet in 100 μl Annexin-Bindepuffer aufgenommen und 5 μl Annexin V- FITC (Bestell-Nr. 556420, BD Biosciences, Tullastrasse 4,
69126 Heidelberg, Deutschland) zugegeben. Zur Unterscheidung früh-apoptotischer, spät-apoptotischer und nekrotischer Zellen wurden 10 μl Propidiumiodid zugesetzt. Viable und früh- apoptotische Zellen besitzen im Unterschied zu spät- apoptotischen und nekrotischen Zellen eine noch intakte Membran, die das Eindringen von Propidiumiodid in die Zelle verhindert. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln wurden 500 μl Annexin-Bindepuffer zugesetzt und die Probe in einem Durchflußzytometer analysiert. Der Anteil Annexin V-FITC- positiver und damit apoptotischer Zellen wurde mit Hilfe der Software CellQuest™ (BD Biosciences; 2350 Qu e Drive, San Jose, CA, USA 95131-1807) bestimmt.
Der Anteil lebender Zellen in einer Population ist mit Hilfe von MTT (3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltetrazoli- umbromid) bestimmt worden. Dabei wird das in wässriger Lösung gelbe Tetrazoliu salz MTT durch eine in den Mi ochondrien stoffwechselaktiver Zellen exprimierte Dehydrogenase durch Spaltung des Tetrazoliumrings zu einem violetten Formazan- Produkt (1- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -3 , 5-diphenylformazan) reduziert. Zur Bestimmung der Menge lebender Zellen wurden jeweils zu 1,5 x 105 Zellen in einer Vertiefung einer 96- well-Zellkulturplatte 10 μl MTT-Gebrauchslösung (10 mg/ml in PBS, hergestellt aus 50 mg/ml MTT in DMSO) gegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurden 90 μl/Vertiefung Lyse- puf er (10 % (w/v) Natriumdodezylsulfat, 20 mM HC1 in Aqua bidest., pH 4,5) zupipettiert . Dadurch wird ein Zellauf- schluss und die Freisetzung des Formazan-Produkts bewirkt. Die Bestimmung der Absorbtion gegenüber Luft erfolge bei 570 IM in einem ELISA-Reader . Die Überlebensrate ist jeweils als prozentualer Anteil eines für behandelte Zellen ermittelten Werts an einem für unbehandelte Zellen ermittelten Wert ermittelt worden.
Die für Transfektionen eingesetzten doppelsträngigen Oligori- bonukleotide weisen die folgenden, im Sequenzprotokoll mit Nr. 1 bis Nr. 8 bezeichneten, Sequenzen auf:
BAFl : dsRNA, deren einer Strang Sl zu einem die Fusionsstelle b3a2 enthaltenden Abschnitt A eines aus den Genen bcr und abl fusionierten Gens bcr-abl (Accession Number in der Datenbank GenBank: AJ131466) komplementär ist:
S2: 5'-CAGAGUUGAA|AAGCCCUUCAG-3' (Sequenz Nr. 2) Sl: 3 '-UCGUCUCAACUUlUUCGGGAAGUC-5' (Sequenz Nr. 1) BAF2 : dsRNA, die sich von BAF1 in den durch Fettdruck hervorgehobenen Basen unterscheidet und deren Strang Sl zum Gen bcr-abl in den drei hervorgehobenen Basen nicht komplementär ist :
S2 : 5 '-CAGUGUUGAU j AAGCCGUUCAG-3 ' (Sequenz Nr . 4) Sl : 3 ' -UCGUCACAACUA| UUCGGCAAGUC-5 ' (Sequenz Nr . 3 )
Der senkrechte Strich in den Sequenzen Nr. 1 - Nr. 4 kenn- zeichnet jeweils die der Fusionsstelle entsprechende Stelle.
K4 : als Kontrolle dienende dsRNA, deren einer Strang Sl zu einer Sequenz der 5 -untranslatierten Region des bakteriellen Neomycin-Resistenzgens (Accession Number in der. Datenbank GenBank: U55763) komplementär ist:
S2: 5'-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3 ' (Sequenz Nr. 6) Sl: 3 '-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUACU-5' (Sequenz Nr. 5)
GAL2 : als Kontrolle dienende dsRNA, deren einer Strang Sl zu einem ß-Galaktosidase-Gen (Accession Number in der Datenbank GenBank: U02451) komplementär ist:
S2 : 5'-GUGAAAUUAUCGAUGAGCGUG-3' (Sequenz Nr. 8) Sl: 3 '-GCCACUUUAAUAGCUACUCGCAC-5' (Sequenz Nr. 7)
Die RNA-Einzelstränge wurden mit einem RNA-Synthesizer (Typ Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlichen chemischen Verfahren synthetisiert. An- schließend erfolgte die Reinigung der rohen Syntheseprodukte mit Hilfe der HPLC . Als Säulen wurden NucleoPac PA-100, 9x250 mm der Fa. Dionex, verwendet. Als Niedersalz-Puffer diente 20 mM Tris, 10 mM NaCl0 , pH 6,8, 10% Acetonitril und als Hochsalz-Puffer 20 mM Tris, 400 mM NaC10 , pH 6,8, 10% Acetoni- tril. Der Fluß betrug 3 ml/Minute. Die Hybridisierung der Einzelstränge (je 10 μM) zum Doppelstrang erfolgte durch Er- hitzen des stöchiometrischen Gemischs der Ξinzelstränge auf 95 °C für 5 Minuten in 25 M Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl und anschließendes Abkühlen über 30 Minuten auf 37 °C .
32Dp210-Zellen wurden auf eine Dichte von 3,2 x 106 Zellen pro ml und MO7p210-Zellen auf eine Dichte von 5 x 10δ Zellen pro ml in Zellkulturmedium eingestellt. 800 μl dieser Zellsuspensionen wurden jeweils mit 800 nM dsRNA in einer 4 mm Elektroporationsküvette (PEQLAB - Biotechnologie GmbH, Carl- Thiersch-Str . 2b, D-91052 Erlangen, Deutschland) gemischt.
Nach einer 1-minütigen Inkubation wurden die Zellen mit Hilfe des Electroporators EasyJect (PEQLAB - Biotechnologie GmbH) unter Verwendung eines Einzelpulses (250 V, 1800 μF, keine Begrenzung des elektrischen Widerstands) elektroporiert . So- fort danach wurden die 32Dp210-Zellen in 20 ml Zellkulturmedium, supplementiert mit 1 ng/ml rekombinantem murine IL-3 ( "Recombinant Murine Interleukin-3 " , Bestell-Nr. P030248, STRATHMANN BIOTECH AG, Feodor-Lynen-Str . 5, 30625 Hannover) überführt. Mo7p210-Zellen wurden in 10 ml Zellkulturmedium mit 100 ng/ml hGM-CSF (Leucomax® 150, Novartis Pharma GmbH, 90327 Nürnberg, Deutschland) aufgenommen. Diese Behandlung wurde insgesamt vier mal alle 24 Stunden durchgeführt. Nach der letzten Elektroporation wurden die Zellen mehrmals gewaschen und in Zellkulturmedium ohne Wachstumsfaktor-Zusatz weiter kultiviert. Nicht mit dsRNA behandelte Zellen wurden zur Kontrolle ebenfalls einer Elektroporation unterzogen (Elektroporationskontrolle, EP in Fig. 3) .
Der in Fig. 1 gezeigte Western-Blot zeigt, dass die Behand- lung von 32Dp210-Zellen mit BAFl (Spur 2) im Gegensatz zur
Behandlung mit BAF2 (Spur 1) oder ohne dsRNA (Elektroporationskontrolle, Spur 3) in den Zellen zu einer Reduktion der Bcr-Abl-Protein Menge führt. Ähnliche Ergebnisse sind mit den Bcr-Abl-positiven humanen M07p210-Zellen erzielt worden. Die Menge des nicht mutierten zellulären Proteins c-Abl ist dagegen bei Behandlung mit BAF 1 unvermindert geblieben. Die vom Bcr-Abl-Protein induzierte Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-XL wird durch die Behandlung mit BAFl vermindert. Die vom Bcr-Abl-Protein herunter regulierte Expression des Zellzyclus-Inhibitors p27 wird durch die Behandlung mit BAFl verstärkt.
Nach der Behandlung der Zellen mit BAFl, BAF2 oder ohne dsRNA wurden 32Dp210-Zellen für 40 Stunden ohne Wachstumsfaktoren und mit STI571 in unterschiedlichen Dosierungen kultiviert. Die mittels MTT bestimmte Überlebensrate ist als Durchschnittswert ± Standardabweichung von 3 Versuchsansätzen ermittelt worden. Fig. 2 zeigt ein repräsentatives Experiment von insgesamt 3 unabhängigen Experimenten. Die daraus ersichtliche Überlebensrate von STI571-behandelten 32Dp210- Zellen zeigt, dass die Herunterregulation der Bcr-Abl-
Protein-Expression mittels BAFl (ausgefüllte Quadrate) eine deutlich gesteigerte Sensitivität der Zellen gegenüber STI571 bewirkt. Verglichen mit den mit BAF2 (ausgefüllte Dreiecke, Spitze oben) oder ohne dsRNA (ausgefüllte Dreiecke, Spitze unten) behandelten Zellen, für die jeweils ein ICso-Wert von etwa 0,33 μM STI571 ermittelt worden ist, zeigten die mit BAFl behandelten Zellen einen etwa 5-fach niedrigeren IC50- Wert von 0,064 μM STI571. Der IC50-Wert bezeichnet die Konzentration an STI571, bei der eine Überlebensrate von 50 % erreicht wird. Diese Wirkung wurde auch bei MO7p210-Zellen beobachtet .
Zur Untersuchung des Einflusses der RNA-Interferenz auf die durch STI571 bewirkte Apoptoserate sind MO7p210-Zellen wie beschrieben mit dsRNA behandelt worden. Danach wurde ihnen der Wachstumsfaktor GM-CSF entzogen und die Zellen wurden für 16 Stunden mit 0,05 μM STI571 behandelt. Die prozentuale Steigerung des Anteils apoptotischer an der Zahl gemessener M07p210-Zellen nach STI571-Behandlung gegenüber dem entspre- chenden Anteil bei nicht mit STI571 behandelten M07p210- Zellen ist in Fig. 3 und Fig. 4 dargestellt. Dabei kennzeich- net "EP" Zellen, welche zur Kontrolle ohne dsRNA der Elektroporation unterzogen worden sind und "BAFl" Zellen, welche mit der dsRNA BAFl behandelt worden sind. Die Inhibition der Bcr- Abl-Expression durch BAFl führte zu einer gesteigerten Apop- toseinduktion bereits bei einer sehr geringen STI571- Dosierung. Das zeigt sich auch bei dem in Fig. 4 dargestellten Experiment. Dabei kennzeichnen "GAL2", "BAF2" und "BAFl" jeweils die dsRNAs, mit denen die Zellen wie beschrieben behandelt worden sind. Nach Entzug von GM-CSF sind die Zellen ebenfalls für 16 Stunden mit 0,05 μM STI571 behandelt worden. Das Experiment zeigt darüber hinaus die hohe Spezifität der dsRNA BAFl. Die von BAFl nur in drei Nukleotidpaaren abweichende dsRNA BAF2 zeigt keine spezifische Wirkung.
Fig. 5 zeigt die mittels MTT ermittelte Überlebensrate von mit STI571 behandelten 32Dp210-Zellen (ausgefüllte Kreise) und 32Dp210-H396P-Zellen (offene Quadrate) in Abhängigkeit von der Konzentration an STI571. Die dabei ermittelten IC50- Werte lagen für 32Dp210-Zellen bei 0,3 μM und für 32Dp210- H396P-Zellen bei 1,4 μM STI571. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei Versuchsansätzen.
Fig. 6 zeigt die relative Überlebensrate von mit STI571 behandelten 32Dp210-H396P-Zellen nach Vorbehandlung mit BAFl (ausgefüllte Dreiecke) , BAF2 (ausgefüllte Kreise) und ohne dsRNA (offene Quadrate) . Für BAF2-behandelte Zellen wurde ein IC50-Wert von 1,27 μM und für ohne dsRNA behandelte Zellen von 1,56 μM STI571 ermittelt. Die Behandlung der Zellen mit BAFl bewirkte eine Herunterregulation des ICso-Wertes auf 0,44 μM STI571. Das zeigt, dass die Wirksamkeit von STI571 auch in Zellen mit einer verminderten Sensitivität gegenüber STI571 so weit erhöht werden kann, dass eine Behandlung bei einer für einen Menschen oder ein Tier vertretbaren Dosierung wirksam ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Inhibitors der Aktivität einer von einem durch eine Mutation ent- standenen ersten Gen kodierten Tyrosinkinase in einer mit dem Inhibitor behandelten Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des ersten Gens in der Zelle durch RNA-Interferenz gehemmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation eine Chromosomen-Aberration ist, bei welcher das erste Gen durch Fusion von mindestens zwei weiteren Genen, insbesondere bcr und abl, an mindestens einer Fu- sionsstelle entstanden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor STI571 ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Interferenz durch eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) bewirkt wird, welche einen ersten RNA-Strang Sl aufweist, welcher einen zu einem die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A des ersten Gens zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA in die Zelle eingeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich der einzelsträngige Über- hang am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl befindet.
9 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der komplementäre Bereich des RNA-Strangs Sl der dsRNA 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass der RNA-Strang Sl weniger als
30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der durch komplementäre Nu- kleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA durch mindestens eine weitere, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers gebildete, chemische Verknüpfung an einem Ende der dsRNA erhöht wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung zwischen dem 5 ' -Ende des RNA-Strangs Sl und dem 3 ' -Ende eines zweiten RNA-Strangs S2 der dsRNA gebildet wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA aus dem mit der Se- quenz Nr. 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100 %, über- einstimmenden RNA-Strang Sl und dem mit der Sequenz Nr. 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100 %, übereinstimmenden RNA-Strang S2 besteht.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Leukozyt, insbesondere eine myeloische Zelle, oder eine häematopoetische Stammzelle ist.
16. Medikament oder Kombination von Medikamenten zur Therapie einer mit einer Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen ersten Gen kodierten Tyrosinkinase einher gehenden Erkrankung, enthaltend mindestens einen Inhibitor der Aktivität der Tyrosinkinase, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin ein die Expression des er- sten Gens durch RNA-Interferenz hemmendes Agens enthalten ist.
17. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation eine Chromosomen-Aberration ist, bei welcher das erste Gen durch Fusion von mindestens zwei weiteren Genen, insbesondere bcr und abl, an mindestens einer Fusionsstelle entstanden ist.
18. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Er- krankung eine Chronische Myeloische Leukämie, eine Akute Lymphatische Leukämie oder eine Akute Myeloblastische Leukämie ist.
19. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor STI571 ist.
20. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) ist, wobei ein erster RNA-Strang Sl der dsRNA zu einem die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A des ersten Gens einen zumindest abschnittsweise komplementären Bereich auf- weist.
21. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle u fasst.
22. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2 , Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
23. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des RNA- Strangs Sl befindet.
24. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des RNA- Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
25. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der komplementäre Bereich des RNA-Strangs Sl der dsRNA 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist .
26. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der
RNA-Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist .
27. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA durch mindestens eine weitere, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers gebildete, chemische Verknüpfung an einem Ende der dsRNA erhöht wird.
28. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung zwischen dem 5 ' -Ende des RNA-Strangs Sl und dem 3 ' -Ende eines zweiten RNA-Strangs S2 der dsRNA gebildet ist.
29. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA aus dem mit der Sequenz Nr. 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100 %, übereinstimmenden RNA-Strang Sl und dem mit der Sequenz Nr. 2 gemäß dem anliegenden Sequenzproto- koll insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100 %, übereinstimmenden RNA-Strang S2 besteht.
30. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA darin in einer Lösung oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
31. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach einem der Ansprüche 16 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das
Medikament oder die Kombination von Medikamenten eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intra- peritonealen Injektion oder zur Injektion direkt in ein befallenes Knochenmark, geeignet ist.
32. Medikament oder Kombination von Medikamenten nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung die dsRNA in einer physiologisch verträglichen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einer phosphatgepufferten Salzlösung, enthält.
33. Verwendung eines Inhibitors der Aktivität einer von einem durch eine Mutation entstandenen ersten Gen kodierten Tyrosinkinase und eines die Expression des Gens durch RNA- Interferenz hemmenden Agens zur Herstellung eines Medikaments oder einer Kombination von Medikamenten zur Therapie einer Erkrankung, welche mit einer Aktivität der Ty- rosinkinase einher geht.
34. Verwendung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation eine Chromosomen-Aberration ist und das erste Gen ein durch Fusion aus mindestens zwei weiteren Genen, insbesondere bcr und abl, an mindestens einer Fusi- onssteile entstandenes Gen ist.
35. Verwendung nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Chronische Myeloische Leukämie, eine Akute Lymphatische Leukämie oder eine Akute Myeloblastische Leukämie ist.
36. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor STI571 ist.
37. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) ist, wobei ein erster RNA-Strang Sl der dsRNA zu einem die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A des ersten Gens einen zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
38. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle umfasst.
39. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
40. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl befindet.
41. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des RNA-Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass der komplementäre Bereich des RNA- Strangs Sl der dsRNA 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass der RNA-Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist.
44. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA durch mindestens eine weitere, durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers gebildete, chemische Verknüpfung an einem Ende der dsRNA erhöht wird.
45. Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung zwischen dem 5 ' -Ende des RNA-Strangs Sl und dem 3 ' -Ende eines zweiten RNA-Strangs S2 der dsRNA gebildet ist.
46. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA aus dem mit der Sequenz Nr. 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100 %, übereinstimmenden RNA-Strang Sl und dem mit der Sequenz Nr. 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll, insbesondere zu mindestens 90 %, vorzugsweise 100 %, übereinstimmenden RNA- Strang S2 besteht.
47. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA in einer Lösung oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
48. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament oder die Kombination von Medikamenten eine Zubereitung aufweist, die zur Inha- lation, oralen Aufnahme oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Injektion oder zur Injektion direkt in ein befallenes Knochenmark, geeignet ist .
49. Verwendung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung die dsRNA in einer physiologisch verträglichen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einer phosphatgepufferten Salzlösung, enthält.
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