CH689455A5 - Procédé et composition pour la régulation du développement végétal. - Google Patents

Description

  
 



  La structure et les séquences de codage génétique d'une famille de protéines de développement dans les plantes ont une homologie avec les protéines QM de mammifères et les gènes codant ces protéines. Des molécules recombinantes, comprenant des régions de codage QM de plantes et des promoteurs appropriés, sont utilisées pour produire une plante transformée ayant un développement altéré. Le développement altéré cause la stérilité des mâles. 



  L'expression de la plupart, voire de tous, les gènes de plantes peut être considérée comme étant en relation d'une certaine manière avec le développement des plantes. De nombreuses classes de gènes sont connues qui répondent à des signaux de développement impliqués dans la différenciation des cellules, la formation des tissus et des organes, ou la régulation de la croissance des plantes. Il y a plusieurs exemples bien caractérisés: des gènes qui sont régulés par la lumière (tels que les familles de gènes rbcs et cab), ou par des hormones, et des gênes qui sont spécifiquement exprimés dans les anthères, les racines, les graines ou les feuilles, ou dans les types spécifiques de cellules dans ces tissus (voir par exemple Edwards et al., 1990, et Kuhlmeier et al., 1987).

   On connaît d'autres types de gènes pour réguler l'expression d'autres types encore de gènes, tels que le "Opaque2", régulateur du maïs qui code un activateur de transcription régulant l'expression des gènes 22 kd de zéine (Schmidt et al., 1992, Ueda et al., 1992), et les gènes C1 et R dans le maïs qui codent des activateurs de transcription régulant l'expression de A1 et BZ1 (Klein et  al., 1989). Un nouveau domaine de recherches a trait à l'identification et à l'isolement de gènes de plantes que l'on pense être en relation avec la régulation de processus cellulaires fondamentaux, tels que la division des cellules, en raison de leur homologie avec les gènes des animaux et des systèmes de levure. Voir Jacobs, 1992 pour une revue. Un exemple d'un tel gène est l'homologue du gène cdc2 des levures qui a été cloné à partir du maïs (Colosanti et al., 1991).

   Dans le futur, on peut être sûr d'identifier d'autres gènes dans les plantes qui contrôlent d'autres processus fondamentaux cellulaires ou de développement. 



  Chez les mammifères, des protéines du développement ont été impliquées dans des divisions anormales de cellules, telles que celles qui caractérisent l'état malin. Par exemple la tumeur de Wilms - qui est une tumeur du rein chez les enfants - qui se produit dans les cellules de blastone embryonnaires et survient aussi bien sous forme sporadique que sous forme héréditaire. Trois groupes on rapporté le clonage de deux gènes distincts qui sont associés avec la tumeur de Wilms. Le premier - WT1 - code une protéine de doigt de zinc appartenant à la famille des gènes de réponse de croissance précoce (EGR) et se trouve au locus lip13 chez l'être humain, qui est souvent supprimé dans les cellules tumorigènes (Call et al., 1990, Gessler et al., 1990).

   Le second gène, nommé "QM", a été cloné par Dowdy et al., 1991, en utilisant une hybridation soustractive utilisant des ADNc et ARN dérivés, respectivement, de micro-cellules hybrides tumorigènes et non-tumorigènes de Wilms. On a montré que ce gène est exprimé au niveau ARN dans presque tous les tissus normaux examinés chez la souris, mais manquait dans les lignées de cellules tumorigènes de Wilms. 



  La protéine codée par le gène QM a une taille de 25 kD et est très basique avec un pI d'environ 11,0. Dowdy a également démontré que le QM est un membre d'une famille de gènes chez un grand nombre de mammifères, en particulier les primates. Van den Ouweland et al. (1992) ont cloné le gène  QM à partir d'une bibliothèque de chromosome Xqter* humain et montré que ce gène était similaire à 100% au gène QM précédemment cloné. L'expression du gène QM a été démontrée chez la souris (Dowdy et al., 1991). Les informations et le gène cloné dans le poulet, avec des données de van den Ouweland et al., suggèrent que ce gène est conservé dans un large domaine phylogénétique. 



  On a postulé que le QM peut être impliqué dans la conservation de phénotypes non-tumorigènes (Dowdy et al., 1991). Des expériences récentes suggèrent que le QM peut agir comme régulateur négatif de l'activateur transcriptionnel Jun en entrant en compétition avec d'autres protéines (Fos) qui se lient au Jun ce qui conduit à supposer que le manque de protéines QM mène à une croissance de cellules non-régulée et finalement à la formation de tumeurs (Monteclaro et al., 1993). Ces résultats ne suggéraient pas qu'un gène QM puisse exister dans les plantes, pour lesquelles il n'y a pas de phénotypes comparables à ceux associés avec le gène QM chez les animaux. 



  La découverte de gènes qui changent le développement des plantes peut être utile pour développer des méthodes génétiques entraînant une stérilité mâle parce que d'autres méthodes couramment appliquées - telles que la suppression des aigrettes, la stérilité cytoplasmique mâle et l'auto-incompatibilité - présentent de sérieux inconvénients. Les plantes mâles stériles sont utiles pour la production de semences hybrides. 



  La production de semences hybrides pour la vente commerciale est une industrie importante. Des plantes obtenues à partir de semences hybrides tirent avantage des effets hétérotiques du croisement de deux lignées de multiplication génétiquement distinctes. Les performances agronomiques de cette descendance sont meilleures que celles des deux parents, notamment en ce qui concerne la vigueur, le rendement et l'uniformité. Les meilleures performances des variétés de graines hybrides, en comparaison avec les variétés à pollinisation ouverte, rendent les graines  hybrides plus intéressantes à planter pour les fermiers, ce qui se traduit par un prix de vente maximum. 



  Afin de produire des semences hybrides non contaminées par auto-fécondation, il est nécessaire d'utiliser des méthodes de contrôle de la pollinisation, afin d'obtenir une pollinisation croisée et non une auto-pollinisation. Les mécanismes de contrôle de la pollinisation peuvent être mécaniques, chimiques ou génétiques. 



  Une méthode mécanique de production de semences hybrides peut être utilisées si les variétés de plantes en question ont des fleurs mâles et femelles séparées ou des plants mâles et femelles distincts. Un plant de maïs par exemple présente des fleurs mâles produisant du pollen dans une inflorescence au sommet de la plante et des fleurs femelles à la naissance des feuilles le long de la tige. Le croisement est assuré en détruisant mécaniquement les aigrettes du parent femelle pour éviter l'auto-pollinisation. Bien que la suppression des aigrettes soit couramment utilisée pour la production de semence hybride, ce processus ne demande pas seulement beaucoup de travail, mais il est également onéreux, car il entraîne une perte de rendement. 



  Pourtant la plupart des plantes de culture intéressante ont des organes mâles et femelles situés dans la même fleur, de sorte que l'émasculation n'est pas une opération simple. Il est possible d'enlever à la main les organes formant le pollen avant que le pollen ne se détache, mais cette forme de production de semence hybride demande énormément de travail et, de ce fait, est très onéreuse. Les semences ne sont produites de cette manière que si la valeur et la quantité de graines récoltées méritent cet effort. 



  Une seconde méthode générale de production de semence hybride consiste à utiliser des composés chimiques qui tuent ou bloquent la formation de pollen viable. Ces composés chimiques, nommés gamétocides, sont utilisés pour provoquer une stérilité mâle transitoire. La production commerciale de semences hybrides utilisant des gamétocides  est limitée par le prix et la disponibilité des produits chimiques et par la fiabilité et la durée d'action des applications. Ces composés chimiques ne sont pas efficaces pour des récoltes ayant une longue période de floraison car de nouvelles fleurs se formeraient qui ne seraient pas traitées. Un autre problème est que les applications répétées de composes chimiques sont impraticables en raison de leur coût. 



  De nombreux systèmes de production de semences hybrides pour les récoltes de plein champ sont basés sur des méthodes génétiques de contrôle de la pollinisation. Les plantes qui sont utilisées comme femelles ou bien n'arrivent pas à produire du pollen ou à le distribuer, ou bien elles produisent un pollen qui est biochimiquement incapable de produire une auto-fertilisation. Des plantes qui sont biochimiquement incapables de s'auto-polliniser sont dites auto-incompatibles (SI = "self-incompatible"). Des difficultés liées à l'utilisation d'un système d'auto-incompatibilité comprennent (i) la disponibilité et la propagation de lignées femelles auto-incompatibles et (ii) la stabilité de l'auto-incompatibilité.

   Dans quelques cas, l'auto-incompatibilité peut être palliée chimiquement, ou les boutons immatures peuvent être pollinisés à la main avant le déclenchement du mécanisme biochimique qui bloque le pollen. Malheureusement, les systèmes auto-incompatibles qui peuvent être désactivés sont souvent très vulnérables aux conditions climatiques provoquant des contraintes qui empêchent ou diminuent l'efficacité du blocage biochimique d'auto-pollinisation. 



  Il est d'un intérêt plus large pour la production commerciale de semences d'utiliser des systèmes de mécanismes génétiques fondés sur le contrôle de la pollinisation qui entraînent une stérilité mâle. Ces systèmes sont de deux types généraux: 
 
   a) la stérilité mâle génétiquo-nucléaire, résultant du défaut de formation de pollen en raison d'un ou plusieurs gènes nucléaires, et 
   b) la stérilité mâle génétiquo-cytoplasmique, appelée communément stérilité mâle cytoplasmique ou CMS ("cytoplasmic male sterility"), dans laquelle la formation du pollen est bloquée ou inhibée à cause d'un défaut dans l'organelle cytoplasmique, qui est généralement une mitochondrie. 
 



  La stérilité génétiquo-nucléaire peut être soit dominante, soit récessive. Une stérilité dominante ne peut être utilisée pour la formation de semences hybrides que si la propagation de lignées femelles est possible, par exemple par propagation clonale in vitro. Une stérilité récessive ne pourrait être utilisée que si l'on peut facilement différencier les plantes stériles et fertiles. L'utilité commerciale des système de stérilité génétiques est toutefois limitée par le coût de la propagation clonale et du marquage des rangées femelles de plant auto-fertiles. 



  Bien qu'il existe des rapports de schémas d'hybridation impliquant l'utilisation de CMS, de nombreux problèmes limitent sa valeur commerciale. Dans ces systèmes, une mutation spécifique dans la mitochondre localisée dans le cytoplasme peut, dans l'environnement nucléaire approprie, amener a un défaut de formation de pollen mature. Dans certains exemples, l'environnement nucléaire peut compenser la mutation cytoplasmique et la formation normale du pollen a lieu. La caractéristique nucléaire qui autorise une formation de pollen dans les plantes avec des mithocondries CMS est appelée restauration et elle est la propriété de "gènes restaurateurs" spécifiques.

   Généralement l'utilisation de CMS pour une production commerciale de semences entraîne l'utilisation de trois lignées de reproduction, la lignée stérile en mâle (parent femelle), une lignée de maintien qui est isogénique avec la lignée stérile en mâle mais comporte des mitochondries totalement fonctionnelles, et la lignée de parent mâle. 



  La lignée de parent mâle peut porter les gênes restaurateurs spécifiques, désignés habituellement "lignée restauratrice", qui confère la fertilité aux semences hybrides. Pour des récoltes comme les récoltes de légumes pour lesquelles la récupération de semence à partir de l'hybride est sans importance, on pourra utiliser un système CMS sans restauration. Pour des récoltes dans lesquelles le fruit ou la graine de l'hybride est le produit commercial, la fertilité de la semence hybride doit être restaurée par des gènes restaurateurs spécifiques dans le parent mâle ou bien l'hybride stérile en mâle doit être pollinisé. La pollinisation des hybrides non-restaurateurs peut être effectuée en introduisant dans les hybrides un faible pourcentage de plants fertiles en mâles pour effectuer la pollinisation.

   Dans la plupart des espèces, le trait CMS est hérité par la lignée femelle (parce que tous les organelles cytoplasmiques sont héritées seulement de la cellule de l'oeuf) ce qui peut restreindre l'utilisation du système. 



  Bien que des systèmes CMS soient déjà mentionnés ils comportent des limitations qui les excluent comme solution à la production de plants mâles stériles. Par exemple un type particulier de CMS dans le maïs (cytoplasme-T) confère une sensiblité à l'infection par des champignons microscopiques particuliers. Bien qu'ils soient encore utilisés dans un grand nombre de récoltes, les systèmes CMS ont une tendance à se décomposer au bout d'une période d'utilisation prolongée. Généralement la stérilité mâle est inférieure à 100%. 



  Une recherche des procédés altérant le développement des plantes, par exemple pour produire des plantes stériles mâles, a révélé une famille de protéines de développement dans les plantes qui convient particulièrement bien. Les méthodes et les compositions selon la présente invention fournisssent une nouvelle base nucléaire de manipulation de la fertilité mâle. 


 Exposé
 de l'invention 
 



  La présente invention concerne un procédé et une composition altérant le développement des plantes. Le procédé en question utilise des constructions génétiques comportant des gènes QM isolés à partir des plantes. 



  On a trouvé de manière inattendue un gène QM dans les plantes. Le gène QM a été décrit chez les mammifères en relation avec des tumeurs, ce gène étant exprimé dans les cellules normales mais non exprimé dans les cellules tumorales. On peut s'attendre à ce que le gène soit régulé vers le bas dans les tumeurs, par exemple dans la tumeur de Wilms chez l'être humain. On ne s'attendrait pas à ce qu'un gène en relation avec l'oncogénèse chez les mammifères ait un homologue dans les plantes, car des anomalies de développement comparables ne se présentent pas. Il est connu que des tumeurs se développent dans certaines espèces de plantes, mais celles-ci sont spécifiquement causées par des infections dues à des agents exogènes tels que l'Agrobacterium ou d'autres pathogènes.

   Pourtant on a isolé un polynucléotide du génome du maïs qui, de manière inattendue, a révélé une homologie avec la séquence de nucléotides d'un gène QM de mammifère. on se référera par la suite à ce polynucléotide du maïs comme "QMm". Un gène QM a également été cloné dans le tabac (QMt). 



  La protéine codée par le polynucléotide du maïs est une protéine de développement. Les protéines de développement comportent des protéines qui s'expriment au cours du développement en réponse à un signal régulateur tel qu'une hormone, et des protéines qui régulent les étapes de développement. Le gène QM dans les plantes est donc utile dans le contexte du contrôle du développement, par exemple, le développement du pollen. Une interférence avec le développement du pollen produit une plante mâle stérile. Les protéines de développement se reconnaissent à leur aptitude à modifier le résultat de la structure ou de la fonction de développement normale. 



  Un ADNc préparé à partir d'un polynucléotide QMm consiste essentiellement 800 à 950 nucléotides comportant un cadre de lecture ouvert (ORF "open reading frame") et des régions latérales. L'ADNc comparable du mammifère est généralement inférieur à 800 nucléotides. Le seul cadre de lecture ouvert dans l'ADNc du maïs code un polypeptide d'environ 220 amino-acides. Dans d'autres espèces, un cadre de lecture ouvert d'un ADNc QM isolé chez l'humain code une famille de protéines QM d'environ 214 amino-acides. En général une famille QM de gènes végétaux (QMp) code une protéine caractérisée par une séquence primaire d'environ 200-250 amino-acides, et a des propriétés décrites ici. 



  Plus spécifiquement, des gènes de la famille QM codent une famille de protéines qui est caractérisée par la présence de trois régions conservées dans la séquence d'amino-acide des protéines faisant partie de la famille. Dans une protéine QM du maïs, la première région conservée comporte les 10 premiers amino-acides positionnés à partir de l'extrémité amino; la seconde région conservée comporte la séquence d'amino-acide à partir des résidus 51 à 60, et forme une région amphothère en spirale dans la protéine QM; la troisième région conservée est localisée aux résidus 98-135. Ces trois régions conservées montrent un degré élevé d'homologie avec les régions correspondantes qui sont caractéristiques de leurs contreparties chez le mammifère.

   Un "degré élevé d'homologie" est défini ici pour signifier qu'au moins 80% des amino-acides dans les positions correspondantes - comme défini en référence à l'extrémité amino de la séquence - sont identiques. 



  L'homologie d'ensemble d'une séquence d'aminoacide QM d'une plante, par rapport à une séquence correspondante chez le mammifère, est généralement d'au moins 50% (Les différences entre les plantes et les mammifères ont lieu dans la région comprise approximativement entre le résidu 135 (par rapport à l'extrémité N-terminale) et l'extrémité C-terminale de la protéine. 



  Les séquences de nucléotides à partir de l'extrémité N qui code la région conservée dans le gène QM du maïs sont localisées approximativement aux positions 30-100, 210-250 et 330-400. Des sondes d'hybridation préparés à partir de ces régions pourront hybridiser les séquences QM comparables de mammifère dans des conditions très strictes. Des sondes d'oligonucléotides préparées à partir de la région conservée sont utiles pour détecter de nouveaux gènes QM dans des plantes dans des conditions moins strictes, par exemple en utilisant 50% de formamide, 5X SSC (0,75 M NaCl) à 37 DEG C. Les régions de codage de la séquence du maïs montrent approximativement 64% d'homologie d'ensemble avec la séquence QM humaine. 



  En raison du flottement dans la troisième position de chaque codon dans la séquence de nucléotide, une protéine fonctionnellement similaire peut être codée avec un pourcentage global de divergence pouvant s'élever jusqu'à 36% entre les régions codantes nucléotides. Dans les mêmes espèces, on peut s'attendre à ce qu'une séquence codant au moins les trois régions conservées code une protéine équivalente au point de vue fonctionnel. Ceci n'est pas nécessairement vrai dans les comparaisons inter-espèces, où la fonction de la protéine est interdépendante de chemins biochimiques caractéristiques de l'espèce. Mais aussi bien les protéines QM des plantes que celles des mammifères ont des effets majeurs sur les processus de développement. 



  Au moins deux polynucléotides QM et même un nombre de six polynucléotides peuvent être distingués par analyse "Northern blot" de ces préparations de maïs. Une variante donnée à titre d'illustration d'un polynucléotide codant une protéine QM pour le maïs est représentée à la fig. 1. La séquence d'amino-acide correspondant à la fig. 1 est montrée à la fig. 2. Des amorces d'oligonucléotides développées à partir de cette séquence sont utilisés pour amplifier l'ADN dans le cadre de lecture ouvert. Des amorces d'oligonucléotides sont utilisées pour amplifier l'ADN dans le cadre de lecture ouvert selon la revendication  2, lesdites amorces présentant les séquences de nucléotides: 



   
 - gauche: 5 min -ATGGGCAGAAGGCCTGCTAGATGC
 - droite: 5 min -CAACGGCATCGAGGAAAGCCTTCC 



  Les amorces utiles dans la détection de l'homologue du tabac comprennent les séquences:
 



  - GCGAGATCTAAACCATGGGCAGAAGGCC et
 - GCGAAGCGGCCGCTTAAGCAACGGCATCGAGGAAAGCC 



  Des oligonucléotides de PCR ("Polymerase chain réaction") ont été utilisés pour amplifier le gène QM du tabac à partir de tabacs génériques (sp. xantni), au moyen de polymérase Taq (Perkin, Elmer), à une température d'hybridation de 55 DEG C, et le produit amplifié a été digéré par BgIII et NotI, soumis à l'électrophorèse sur 0,8 LMA et sous-cloné en "Bluescript SK+", puis séquencé. 



  Une protéine de maïs QM isolée et purifiée a un poids molédulaire estimé d'environ 25 kD et un PI d'environ 11,0. Une protéine déduite de la séquence d'ADNc sera exempte d'autres protéines lorsqu'on la prépare synthétiquement par des méthodes recombinantes. Des protéines QM isolées et purifiées et leurs fragments épitopiques sont utiles pour la préparation d'anticorps. Ces anticorps, à leur tour, sont utiles pour diagnostiquer des problèmes de développement et d'analyses des cheminements de développements dans les plantes. La localisation et le niveau de l'expression de la protéine OM sont utiles pour déterminer comment modifier le développement. Par exemple, les anticorps suscités contre la protéine QM servent à déterminer si et quand la protéine est induite dans des cellules ou des tissus spécifiques de la plante.

   Cette information est utile pour développer des méthodes interférant avec les cheminements de développement, ou bien amplifiant ces cheminements, y compris ceux relatifs au développement du pollen. De telles informations sont utiles pour développer des plantes supérieures, ou des plantes mâles stériles par exemple. 



  Des protéines QM isolées et purifiées dans des plantes sont également utiles pour analyser des interactions protéine-protéine. Dans ce but, on a développé des sondes de protéines marquées. Une protéine de fusion, comportant la protéine QM, est préparée dans E. Coli, par exemple, isolée, marquée et utilisée pour détecter les interactions entre protéines au cours du développement. Voir Smith Johnson, 1988, et Ron & Dressler, 1992. 



  Une molécule d'ADN recombinante est préparée, comportant le gène QM dans le sens direct, (c'est-à-dire une orientation dans laquelle l'ARNm normal est transcrit et est utilisé comme calibre pour traduire la protéine normale du gène QM) et un promoteur apte à réguler la transcription dudit ADN dans une cellule de plante. La molécule d'ADN recombinante peut également coder le gène QM dans l'orientation inverse. Une telle molécule contient le gène QM cloné dans la direction inverse telle que le brin négatif ou non codant soit transcrit. Aucun produit de gène QM n'est traduit, mais on obtient un ARN constituant un produit de transcription complémentaire de l'ARNm du QM, inhibant la traduction de l'ARNm propre du QM des plantes, ce qui diminue la quantité de protéine QM produite. 



  Le promoteur dans la construction peut être un promoteur spécifique de cellules ou de tissus, de sorte que le gène soit exprime en cellules ou tissus spécifiques. Par exemple, dans une méthode de production d'un plan mâle stérile, on préférera un promoteur spécifique d'anthère ou un promoteur spécifique de tapétale. Les promoteurs TA39, conformes à la présente invention, constituent un promoteur approprié. Des tissus d'anthères et des cellules de tapétales sont des exemples d'un tissu ou cellule qui est très important dans le développement du pollen. Un tissu d'anthère comporte des cellules de support et des microspores de développement et exclut le pollen mature. Une construction de gène QM peut permettre d'altérer le développement aussi bien si elle est orientée dans le sens direct que si elle est orientée dans le sens inverse.

   S'il  existe des gènes ou des processus dans des tissus d'anthères qui sont ou peuvent être réglés par QM, une construction QM orientée dans le sens direct pourrait affecter le développement en altérant le déroulement chronologique de régulation par QM ou affecter le développement par sur-expression de la protéine QM. De manière correspondante, si les QM ou tous les gènes susceptibles d'être régulés par QM, sont essentiels pour le développement normal de l'anthère, l'expression d'une construction QM inverse pourrait affecter le développement en interférant avec l'expression du QM normal. 



  Le promoteur dans la construction peut être un promoteur inductible, de sorte que l'expression de la molécule dans un sens direct ou dans le sens inverse, dans la construction, peut être contrôlée en l'exposant à l'inducteur. A titre d'exemple d'un tel inducteur on peut citer une hormone de plante utilisée pour contrôler un promoteur sensible aux hormones. Une séquence partielle d'un promoteur QM isolé à partir du maïs est représentée à la fig. 3. 



  Il est particulièrement utile d'altérer le développement pour produire une plante mâle stérile. Une méthode de production d'une plante mâle stérile consiste à transformer une cellule de plante avec une molécule recombinante comportant le gène orienté dans le sens direct pour la protéine QM de la plante, ou une molécule orientée dans le sens inverse par rapport au gène QM. On choisit un promoteur approprié selon la stratégie de contrôle du développement. Par exemple, une stratégie est de surexprimer le gène QM de manière sélective dans un tissu d'anthère en utilisant un promoteur spécifique d'anthère. Pour produire une plante mâle stérile, la cellule transformée serait régénérée dans une plante, selon les méthodes conventionnelles. 



  Une plante transgénique contenant la construction à gène QM peut être régénérée à partir d'une culture transformée avec la même construction, pour autant que  l'espèce de plante concernée soit susceptible de se régénérer. Le terme "culture", dans ce contexte, couvre un aggrégat de cellules, un callus, ou leurs dérivés susceptibles d'être cultivés. 



  Une plante est régénérée à partir d'une cellule ou d'une culture transformée, ou à partir d'un explant, par des méthodes décrites ici qui sont connues de l'homme du métier. Les méthodes varient selon l'espèce de plante. La semence est obtenue de la plante régénérée ou d'un croisement entre la plante régénérée et une plante idoine de la même espèce, en utilisant des méthodes de sélection connues de l'homme du métier. 



  Des plantes mâles stériles de tabac ont été produites en régénérant des plantes à partir d'explants de feuilles de tabac transformés par un gène QMm orienté dans le sens direct ou par une construction de QMm orientée dans le sens inverse. Une explication plausible en est que l'expression du gène exogène QMm interrompt l'équilibre de développement normal de la fertilité mâle du tabac. 


 Description sommaire des dessins 
 



  Les dessins annexés, qui sont inclus dans les pièces de la demande et en constituent une partie, illustrent des formes d'exécution de l'invention qui sont actuellement considérées comme préférentielles. Pris avec la description générale qui précède et avec la description détaillée qui va suivre des formes préférentielles, les dessins détaillés ci-dessous contribuent à expliquer les principes de l'invention: 
 
   fig. 1: Séquence de nucléotides et séquence codée d'amino-acide du clone 10-15 de l'ADNc qui code l'homologue QM du maïs. 
   fig. 2: Analyse de la correspondance de l'amino-acide de l'homologue QM du maïs (séquence  supérieure) par rapport à la séquence de l'amino-acide du QM humain. 
   fig. 3: Séquence partielle de nucléotides d'un promoteur QM provenant du maïs. 
   fig. 4: Carte schématique du plasmide nommé pPHI3621, comportant un gène QMm de sens direct. 
   fig. 5:

   Carte schématique du plasmide nommé pPHI3622, comportant un gène "antisense" QMm. 
   fig. 6: Carte schématique du plasmide nommé pPHI1285, un plasmide à empêchement sélectible pour le tabac. 
   fig. 7: Carte schématique du plasmide nommé pPHI4722, comportant un gène humain "antisense". 
   fig. 8: Carte schématique du plasmide nommé pPHI4723, comportant un gène humain de sens direct. 
   fig. 9: Carte schématique du plasmide nommé pPHI4719. 
   fig. 10: Carte schématique du plasmide nommé pPHI4720. 
   fig. 11: Carte schématique du plasmide nommé pPHI687. 
   fig. 12: Carte schématique du plasmide nommé pPHI610. 
   fig. 13: Carte schématique du plasmide nommé pPHI460 comportant un gène uidA. 
   fig. 14: Carte schématique du plasmide nommé pPHI1952 comportant un gène uidA. 
   fig. 15: Carte schématique du plasmide nommé pPHI2125 comportant un gène uidA. 
   fig. 16:

   Carte schématique du plasmide nommé pPHI1527 comportant un gène luciferase. 
   fig. 17: Carte schématique du plasmide nommé pPHI3620 comportant un gène QMm de sens direct. 
   fig. 18: Carte schématique du plasmide nommé pPHI1493 comportant un gène GUS. 
   fig. 19: Carte schématique du plasmide nommé pPHI4745 (TA39 (14B1)) comportant un gène de sens direct. 
   fig. 20: Carte schématique du plasmide nommé L62 (TA39 (14B1)) comportant un gène "antisense" de QMm. 
   fig. 21: Carte schématique du plasmide nommé pPHI4855 (TA39 (8B3)) comportant un gène GUS. 
   fig. 22: Carte schématique du plasmide nommé L59 (TA39 (8B3)) comportant un gène QM de sens direct. 
   fig. 23: Carte schématique du plasmide nommé L61 (TA39 (8B3)) comportant un gène "antisense" de QMm. 
   fig. 24: Séquence de nucléotides du promoteur TA39 (8B3). 
   fig. 25: 

   Séquence de nucléotides du promoteur TA39 (14B1). 
 


 Meilleure manière de réaliser l'invention 
 



  La présente invention concerne un procédé et une composition permettant d'altérer le développement des plantes. L'invention concerne également un gène de plante homologue à un gène exprimé de manière constitutive chez l'humain, dont on pense qu'il joue un rôle dans la conservation de l'état non-tumorigène, et dont on a montré l'absence dans les lignées de cellules tumorigènes de Wilms. Ce gène qui est présent comme famille de gènes chez les humains et les rongeurs a été relevé dans plusieurs espèces différentes de mammifères. 



  Selon la présente invention, on a cloné un gène a partir du maïs et du tabac, gène qui code une protéine ayant un degré d'homologie élevé avec la protéine QM humaine (environ 67%). Le gène du maïs code un polypeptide ayant une taille de 25 kD dont les résidus basiques constituent 22% de la protéine. Ce gène est exprimé dans tous les tissus de maïs examinés par analyse "Northern blot" et est un membre de la famille de gène de la plante. 



  La présente invention concerne également une méthode de production de plantes mâles stériles et de semence hybride, des matériaux génétiques employés pour donner la caractéristique de stérilité mâle, et des produits  nouveaux obtenus par la méthode, à savoir des plantes transformées génétiquement portant le caractère génétique de stérilité masculine, des plantes stériles mâles et la semence hybride produite par pollinisation desdites plantes avec du pollen provenant de plantes mâles fertiles. 



  La fig. 1 représente la séquence de nucléotides et la séquence d'amino-acide dérivée d'un clone nommé 10-15. Le clone ADNc avait une longueur de 936 nucléotides et contenait un cadre ouvert de lecture unique codant un polypeptide de 25.138 daltons. Ce polypeptide est très basique, présente un pI calculé de 11,0, les résidus basiques étant distribués dans toute la protéine. Dans la recherche d'homologie avec d'autres gènes caractérisés précédemment, la séquence d'amino-acide codée par le clone 10-15 a été utilisée pour surveiller la banque de données GenBank avec un programme TFASTA du "Genetic Computer Group" (GCG, Devereux et al., 1984). Cette analyse donna un score de 716 avec le gène QM humain. Lorsque l'on compare la séquence d'amino-acide codée par le clone 10-15 avec la séquence d'amino-acide du gène humain (fig. 2), on remarque plusieurs régions qui sont intéressantes.

   Tout d'abord, le degré important de conservation de la région amino-terminale, où les 10 premiers résidus d'amino-acide sont conservés. La seconde région qui est encore conservée dans les deux protéines est située entre les résidus 51 et 61 et forme une hélice que l'on peut supposer amphothère. Une troisième région conservée se trouve dans la région 98-135. 



  En se référant à l'ensemble des trois régions conservées, la présence d'un tronçon à 59 résidus d'aminoacide hautement conservé implique une fonction conservée dans ces régions de la protéine. La région carboxyterminale est faiblement conservée et semble ne pas être aussi importante dans la fonction de la protéine. L'analyse par Northern blot de l'ARN isolé des tissus de feuilles et de racines de jeunes plants de blé levés à partir d'un semis de sept jours montre que l'ADNc du clone 10-15 est exprimé  dans les deux, les racines et les feuilles présentant grossièrement le même niveau d'expression. Dans d'autres analyses par Northern blot, on a détermine que ce géne était exprimé dans les anthères et les amorces d'épis. 



  L'analyse par Southern blot montre que l'homologue du maïs fait partie d'une petite famille d'environ 4 à 6 membres dans le maïs. 



  Les exemples suivants illustrent des méthodes de mise en Öuvre de l'invention. La portée de l'invention n'est pas limitée aux formes illustrées par ces représentations. 


 Exemple 1
 Interférence avec le développement normal de plantes de tabac par transformation avec le gène QMm 
 



  On fait germer des graines de tabac (cv xanthi) dans des conditions stériles. Après environ 7 à 10 jours à la lumière et à 28 DEG C, on enlève de manière aseptique les cotylédons et les premières feuilles et on les coupe en quartiers (coupes carrées d'environ 1 à 2 mm de côté) que l'on place sur des disques en papier filtre stérile saturé avec un milieu contenant 0,25M de sorbitol. on laisse les disques incuber toute une nuit dans l'obscurité à 28 DEG C. Le lendemain, on bombarde les morceaux de tissus au moyen d'un appareil biolistique pour transformer les cellules avec un mélange à parts égales de:
 - la construction QMm (construction "sense" pPHI3621 de la fig. 4 ou "antisense" pPHI3622 de la   fig. 5) et
 - un plasmide contenant le marqueur choisi (gène BAR). On applique au total 0,1  mu g d'ADN au cours de cinq bombardements. 



  Après ces bombardements, on remet le tissu dans l'obscurité à 28 DEG C pour incubation. Après 48 heures, les tissus bombardés sont transférés dans un milieu de sélection (BASTA) et placés sous des lumières à 28 DEG C. Après environ 2 semaines, de petites colonies ont commencé à apparaître et  elles ont continué à se former pendant environ 1 semaine. Les morceaux de feuilles ont alors été transférés dans un milieu de régénération permettant aux feuilles et au plantons de se former. Après la formation des plantes, les jeunes plantons ont été transférés dans un milieu d'enracinement pour permettre la formation de racines. Après 1 à 2 semaines, les plants furent transférés en serre pour plantation. 



  La construction dans "sense" pPHI3621 de la fig. 4 n'a pas donné autant de colonies que celle des témoins (contenant seulement le marqueur sélectif). En fait, plusieurs colonies se formèrent mais moururent par la suite. Celles qui subsistèrent croissaient beaucoup plus lentement que les témoins. La plupart des callus survivant engendrés par les colonies ne donnèrent pas de plantes. La plupart de ceux qui pourtant produisirent des plantes le firent à partir d'une partie spécifique du callus montrant un secteur revertant (perte du plasmide). Les plantes en résultant étaient négatives pour le gène du maïs par analyse par PCR. Des observations des callus montrent qu'ils avaient des difficultés à former ou organiser un méristème pour produire une plante. On a trouvé une plante positive pour le plasmide et qui a cependant produit une plante.

   Cette plante a toutefois eu une croissance très lente et n'avait pas formé de racines lors de son transfert dans la serre. Elle poussa très lentement dans la serre pendant une certaine période (d'environ 1 mois), puis elle crût normalement et parut normale. La plante a fleuri et a fourni des graines de manière similaires aux plantes normales. 



  Les callus obtenus à partir des tissus bombardés par le pPHI3622 "antisense" (fig. 5) ont montré des caractéristiques de croissance totalement différentes. Dans plusieurs cas, les callus crurent beaucoup plus vite et produisirent une abondance de croissance végétale. Ces callus produisirent des plantes à une vitesse presque normale. Les plantons transférés dans un milieu de  régénération et d'enracinement produisirent des racines plus rapidement que les plantes témoins. Les plantes résultantes parurent normales et elles fleurirent et donnèrent des graines de manière normale. Les semences produites ont germé normalement et les plantes sont apparues normales. 



  Ces résultats suggèrent que le gène QM joue un rôle dans le développement. Dans un tabac transformé, selon toute apparence, sa présence évite ou empêche la formation de méristème. Lorsqu'ils sont présents, les gènes QM peuvent "fixer" une cellule à un stade spécifique de développement. Après que le gène soit activé, la cellule ne se différencie plus. La sur-expression du gène dans les callus du tabac empêche la formation de méristème pour générer des plantes. La surexpression peut être létale pour des concentrations élevées. 



  Les cellules de plantes avec des constructions comportant des molécules "antisense" purent dans certains cas croître plus vite. Une interprétation de ces résultats est que la molécule "antisense" permet de stopper l'action du gène QM du tabac et permet que la différentiation survienne plus facilement et produise un feuillage abondant sur le callus. L'expérience fut répétée 3 fois et les mêmes observations furent sensiblement faites à chaque expérience. Ces résultats concordent avec l'observation que le QM peut fonctionner comme molécule repressive. Voir Monteclaro et al., 1993. 


 Exemple 2: 
 Démonstration de l'expression du gène spécifique de microspore par hybridation in situ 
 



  Cet exemple illustre une méthode montrant qu'un ADN isolé comporte un gène qui montre une expression spécifique de microspore. En particulier, les résultats démontrent que l'expression des ARNm liés à un clone ADNc particulier du tabac est localisée aux microspores des anthères de tabac. Les termes "spécifique de microspore"  tels qu'utilisés ici concernent l'expression du gène dans toute cellule ou dans tout tissu important pour le développement du pollen. Les anthères et le tapétum sont des exemples de tels cellules ou tissus. 



  Un clone ADNc spécifique d'anthère du tabac, nommé TA39 a été obtenu du Dr. Robert B. Goldberg du Département de biologie de l'Université de Californie, Los Angeles, Californie. Le clone a été utilisé pour retrouver le promoteur TA39 à utiliser avec le gène QM (voir exemple 3). Cet ADNc est un hybride de l'ARNm des anthères de tabac mais pas de l'ARNm du pistil, des pétales, des feuilles ou de la tige (Koltunow et al., 1990). L'ADNc a une longueur de 490 bases, y compris une queue poly A+ de 42 bases. Cet ADNc donne deux hybrides transcrits de 550 et 680 bases dans l'analyse par Northern blot des ARN isolés à partir des anthères. Les analyses par taches d'ARN ont montré que les transcrits de TA39 s'accumulent et décroissent avec la même séquence temporelle que cinq autres transcripts spécifiques d'anthères, qui sont tous localisés dans le tapetum (Koltunow et al., 1990). 



  Des anthères de "nicotinia tobacum" (cv Ky17) ont été recueillis au stade de tétrade et manipulés selon les techniques cytologiques standards (Berlyn et al., 1976). Des anthères ont été déshydratés dans du butanol-t et noyés dans de la paraffine, puis tranchés en morceaux de 8  mu m d'épaisseur et fixés sur des plaques. Des fragments d'ADN du clone TA39 et un autre clone ADNc (LA2 : un ARMn spécifique de l'épiderme) furent excisés de plasmides, purifiés par électrophorèse sur gel et marqués par traduction nick avec de la biotine-14-dATP, en utilisant le "BioNick Labeling System" (BRL) selon les instructions du fabricant. L'hybridation in situ des morceaux des anthères fixés avec des sondes de biotine marquée a été effectuée et mesurée en utilisant le système de détection d'ADN de BRL.

   Dans ce système, la streptavidine relie la sonde ADN biotinylisée et une phosphatase alcaline biotinylisée, ce qui occasionne la précipitation de nitro bleu tétrazolium  dans des cellules dans lesquelles la sonde s'hybride avec les acides nucléiques cibles. 



  L'examen de ces analyses par hybridation in situ a montré que les locules de l'anthère des specimens testés contenait des microspores à l'état tétrade. Dans les morceaux d'anthères testés avec l'ADN TA39, seulement les tétrades accumulaient la teinture de tetrazolium. Par contraste, des morceaux d'anthères testés avec une sonde d'ADN (LA2) accumulaient la teinture dans la couche de l'épiderme. Ce contrôle spécifique de tissus démontre que la précipitation de teinture observée dans les microspores des morceaux d'anthères testés par l'ADN TA39 n'est pas due à une rétention non spécifique de l'ADN ou aux composants du système de détection par les microspores. 


 Exemple 3 
 Isolation des clones génomiques T39 comportant des séquences homologues au 
 microspore ARNm spécifique; promoteurs T39 
 



  Cet exemple fournit des méthodes d'isolation des clones d'ADN génomiques comportant des séquences homologues à tout ANRm spécifique de microspore pour lequel une sonde d'acide nucléique existe. Le déroulement décrit est utile pour isoler des séquences régulatrices des microspores spécifiques de toute espèce de plante qui présente un ARNm spécifique de microspore qui soit homologue à une telle sonde existante. 



  Un clone I'ADNc spécifique de l'anthère du tabac, le TA39, a été obtenu par le Dr. Robert Goldberg de l'UCLA. TA39 s'hybride avec l'ARNm à partir d'anthères selon un déroulement chronologique similaire à celui rencontré dans plusieurs produits de transcription spécifiques du tapétum (Kultunow et al., 1990). 



  Des hybridations in situ ont montré que le TA39 est présent à des bas niveaux dans des microspores et un tissus de liaison durant l'étape -1 à +1, puis à des niveaux  plus élevés dans le tapétum au cours des étapes 1 à 6 (Goldberg et al., 1993). 



  Une bibliothèque de génomes de plantes sélectionnées, par exemple une bibliothèque disponible sur le marché de fragments d'ADN de N.tabacum, var. NK326 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, catalogue FL1070D), partiellement digérée par MboI et clonée dans le plasmide EMBL-3, a été passée au crible pour des clones homologues au clone TA39 de l'ADNc. Des méthodes d'hybridation standards ont été utilisées, telles que celles décrites dans Sambrook et al., 1989. Des clones candidats furent purifiés par trois ou davantage cycles de prolèvement des plaques, replacage et essai avec un insert d'ADNc TA39 jusqu'à ce que des plaques réellement hybrides soient soit purifiées soit reconnues comme n'étant pas présentes. 



  Deux familles pouvant être distinguées de clones d'ADN du génome du tabac en relation avec le clone d'ADNc T39 ont été identifiées, chacune étant représentée par deux clones se recouvrant dans chaque famille. Un clone de chaque famille a été sélectionné en vue d'être caractérisé en détail, à savoir les clones nommés 8B3 de la fig. 24 et 14B1 de la fig. 25. La région d'homologie avec le TA39, dans chacun de ces clones génomiques, de même que les régions immédiatement au-dessus et au-dessous de ces régions d'homologie, furent cartographiées par analyse par clivage par l'ensyme de restriction et l'hybridation d'ADN. 



  Ces séquences de codage et les régions de régulation présumées associées 51 furent isolées en tant que sous-clones, puis encore subclonées. Ainsi, des séries de suppression de chacun des clones génomiques furent produites en utilisant exoIII et des nucléases de lentille fournies en kit par Stratagène. Les séries de suppressions furent séquentiellement effectuées par la méthode d'interruption de chaine dideoxy de Sanger, dans un séquenceur d'ADN automatisé (Applied Biosystems 373A) à la "Nucleic Acids Facility" de l'Université d'Etat de l'Iowa. L'insert d'ADNc du TA39, fut également séquencé à titre de comparaison. 



  Dans la région d'homologie avec l'ADNc du TA39 d'un ARNm, spécifique de microspore, le clone génomique 8B3 est en complète homologie avec TA39 alors que la partie comparable du clone génomique 14B1 présente une homologie d'environ 90% avec le TA39. 



  Les points de départ de transcription des clones génomiques 14B1 et 8B3 furent déterminés cartographiquement par des essais d'extension par amorces comme étant localisés en un nucléotide unique, placé 83 bases en amont du site de départ de traduction suppose. Un bloc TATA parfait apparait à 31 paires de base en amont du point de départ cartographié de transcription de chaque clone et un important cadre de lecture ouvert de 110 amino-acides se retrouve intact en aval du point de départ de transcription dans les deux clones (c'est-à-dire à la position "+83" relative au site d'initiation de transcription).

   Les deux clones présentent un site de reconnaissance au polyadenylation, 29 pb et 38 pn en aval d'un codon d'arrêt de traduction dans les clones 14B1 et 3B3 respectivement. 


 Exemple 4 
 Isolation d'un segment d'ADN comportant une séquence de régulation 
 génétique spécifique de microspore 
 



  De nouveaux clones d'ADNc utilisables comme sondes peuvent être identifiés par criblage des clones pour hybridation avec une sonde d'oligonucléotide comportant une partie d'une séquence de TA39, suivie par la détermination de la séquence d'un clone hybridisant pour déterminer le pourcentage d'identité de sa séquence complète avec celle du clone TA30 de l'ADNc. Dans ce but, des conditions d'hybridation strictes sont préférentielles. Bien qu'une hybridation stricte puisse être réalisée dans les buts de la présente invention selon selon des conditions connues dans ce domaine (par exemple, voir J.

   Sambrook, 1989), une série particulière de conditions d'hybridation strictes qui a été utilisée pour isoler les séquences de contrôles données à titre d'exemple comporte le fait d'accorder environ 12  heures pour la réaction d'hybridation initiale, conduite à environ 65 DEG C dans une solution 6 x SSP, 0,1% SDS, suivie par lavage à environ 65 DEG C avec une solution 1 x SSC, 0,1% SDS et par un lavage à la température ambiante avec une solution 0,2 x SSC, 0,1% SDS. 



  Pour les clones d'ADNc ayant seulement une homologie partielle avec le clone TA39, tel qu'un clone d'ADNc isolé d'une plante autre que le tabac, on peut déterminer si l'ARNm dont le nouvel ADNc dérive est un ARNm de microspore spécifique par des analyses temporelles, et plus précisément par des analyses spatiales de l'expression de cet ARNm dans les tissus des fleurs mâles. Voir par exemple les méthodes analytiques dans Kultonow et al., (1990), Domon et al., (1990), qui décrivent des ADNc spécifiques d'anthères du tournesol (helianthus annuus); Roberts et al., (1991), qui décrit un ARNm de Brassica napus, dont il est indiqué qu'il est spécifiquement exprimé dans des microspores en cours de développement; Scott et al.

   (1991), qui décrit des bibliothèques d'ADNc obtenues à partir d'anthères en cours de développement, comportant l'isolation aussi bien des clones d'ADNc spécifique du tapétum que des clones d'ADNc spécifiques de microspore; et Albani et al. (1990), qui décrit une famille de gènes spécifiques de pollen du Brassica napus, qui est activé au cours du développement initial du microspore. 



  La forme particulière de la sonde pour un ARNm spécifique du microspore relativement au clone TA39 englobe toute forme de polynucléotide, une molécule d'ADN ou d'ARN, à simple ou double brin, ayant les propriétés physiques nécessaires pour s'hybrider avec une molécule d'ADN codant avec la séquence d'amino-acide encodée par TA39. Les besoins généraux de sondes d'acides nucléique effectives, y compris la dimension, la composition de base et la teneur en homologie, sont bien connus et décrits dans l'art antérieur. Voir par exemple J. Sambrook et al. (1989). Pourtant une sonde préférentielle - particulièrement lorsque l'on recherche des segments d'ADN ayant des séquences de  nucléotides qui ne soient pas identiques aux séquences de la sonde - est une sonde comportant la séquence entière d'au moins l'un des brins de l'ADNc dérivé d'un ARNm spécifique de microspore.

   Une telle sonde de longueur entière permet de mieux détecter une molécule d'ADN partiellement homologue que ne le ferait une sonde comportant seulement une partie d'une séquence dérivée d'ARNm. Ainsi, toute partie d'une séquence ARNm donnée pourrait être moins conservée dans des gènes spécifiques de microspores que d'autres parties de la séquence d'ARNm, que ces gènes apparentés proviennent de la même espèce de plantes dont l'ARNm dérive ou d'autres espèces. 



  La méthode pour isoler un segment d'ADN comportant une séquence de régulation génétique spécifique de microspore comporte en outre une opération pour isoler un ou plusieurs fragments d'ADN végétal génomique qui s'hybrident avec la sonde d'acide nucléique mentionnée ci-dessus dans des conditions standard d'hybridation stricte. Ces fragments peuvent être obtenus à partir des mêmes espèces de plantes que celles donnant naissance à l'ARNm de la sonde, ou à partir d'autres espèces d'angiospermes. Des plantes particulières qui conviennent pour pratiquer cette méthode d'isolation des séquences de régulation génétique spécifiques de microspore selon l'invention comportent des monocotylédones, particulièrement des céréales telles que le maïs, et des dicotylédones, par exemple la Canola et le tournesol. 



  Des fragments d'ADN que l'on désire examiner pour leurs séquences de régulation génétique spécifique de microspores sont préparés par clonage dans un vecteur convenant pour un telle sélection de grands fragments d'ADN génomiques comportant des cadres de lecture ouverts et des séquences régulatrices associées. Par exemple, la préparation et le criblage par hybridation des bibliothèques d'ADN génomiques de plantes peuvent être réalisés dans ce but comme décrit par exemple dans: Albany et al., 1991, qui décrit des gènes provenant du Brassica napus; Brown et al., 1990, qui traite de gènes de l'oenothera organesis; Guerrero et al., 1990, et Hamilton et al., 1989, qui décrivent des  gènes de maïs; ou bien Twell et al., 1989, qui décrit un gène spécifique d'anthère de la tomate.

   En alternative, on peut obtenir et cribles une bibliothèque de clones d'ADN génomique végétal disponible sur le marché. 



  La séquence nucléotide de tout fragment isolé d'un ADN génomique végétal qui s'hybride avec une sonde selon la présente invention est établie par des méthodes standard de détermination de séquence d'ADN. Cette séquence est ensuite examinée pour déterminer si elle comporte un premier segment d'ADN qui s'hybride avec la sonde sur une séquence du premier segment qui code au moins une extrémité 51 d'un cadre de lecture ouvert complet. Cette extrémité 51 d'un cadre de lecture ouvert est identifiée par un codon dinitiation de traduction, suivi par une séquence qui contient un cadre de lecture ouvert et s'hybride avec la sonde de cette méthode. 



  Un fragment d'ADN génomique convenable pour isoler des séquences de régulation spécifiques de microspore comporte encore un second segment d'ADN qui contient une séquence adjacente à la extrémité 5 min  du cadre de lecture ouvert complet qui s'hybride avec la sonde. Dans ce contexte, une séquence qui est "adjacente à la extrémité 5 min  du cadre de lecture ouvert complet" comporte toute partie d'une séquence qui soit en amont de ce cadre de lecture ouvert, dans un fragment d'ADN génomique selon la présente invention.

   En général, les séquences de régulation qui commandent l'expression d'un cadre de lecture ouvert adjacent peuvent être situées dans les quelques cent paires de base de ce cadre de lecture ouvert; pourtant, dans certains cas, certains éléments de commande qui sont adjacents à un cadre de lecture ouvert peuvent être localisés jusqu'à une distance de plusieurs kilobases du cadre de lecture. De toute façon, en vertu du fait qu'elles sont adjacentes aux séquences spécifique de microspore apparentées à l'ARNm d'un fragment d'ADN génomique selon l'invention, les séquences du second segment d'un tel fragment d'ADN génomique constituent des séquences de régulation présumées spécifiques de microspore. 



  La méthode pour isoler un segment d'ADN comportant des séquences de régulation spécifiques de microspore comporte en outre une étape pour tester un segment sur deux d'ADN d'un fragment d'ADN génomique, pour l'induction de l'expression spécifique de microspore d'une séquence d'ADN qui soit opérativement liée au second fragment d'ADN. En testant ainsi les fragments contenant des séquences présumées de régulation spécifiques de microspore, on peut identifier des segments d'ADN comportant des séquences fonctionnelles de régulation génétique spécifique de microspore qui conviennent pour réaliser par génie génétique la régulation spécifique de microspore de séquences hétérogènes dans des plantes transgéniques selon la présente invention. 



  L'opération d'essai des séquences de régulation spécifiques de microspores présumées est réalisée en mesurant l'expression d'une séquence "reporter" approprié, qui est liée de manière opérative aux séquences présumées de régulation spécifique de microspores dans des microspores et d'autres tissus végétaux.

   L'exigence générale à laquelle doit satisfaire cette séquence de "reporter" est que le niveau de l'expression de cette séquence puisse être aisément déterminé dans les microspores et les tissus dérivés (par exemple le pollen), aussi bien que dans d'autres tissus (par exemple le feuillage) où les séquences de régulation spécifiques de microspore ne devraient pas induire l'expression d'une séquence "reporter" reliée de manière opérative. 


 Exemple 5 
 Essais de l'expression spécifique de microspore d'un gène hétérogène lié opérativement aux 
 séquences de régulation supposées de clones d'ADN génomiques 
 



  Cet exemple illustre l'utilisation de régions de régulation spécifiques de microspore à partir de clones d'ADN génomiques pour fournir une régulation spécifique de microspore de l'expression d'un gène reporter hétérogène dans la détermination de l'expression d'un gène transitoire. 



  Les promoteurs supposés de 8B3 (fig. 24) et de 14B1 (fig. 25) ont tous deux été fusionnés avec un cadre de lecture ouvert d'un gène reporter (uidA) encodant de beta-glucuronidase (GUS), suivi par la région 3 min  non traduite du gène de protéinase II (pinII) de la pomme de terre. Dans une version, comportant une "fusion de traduction", chaque promoteur a été cloné dès le début des séquences amont disponibles pour le départ de la traduction au nucléotide +83. Dans une autre variante appelée "fusion transcriptionnelle", chaque promoteur a été cloné à partir du début des séquences amont disponibles pour se trouver juste au-delà du début de la traduction sur le nucléotide +4. Les dernières constructions contenaient le leader non traduit du virus de la mosaïque du tabac (omega') entre le promoteur et les séquences uidA.

   Des fusions de gène de traduction analogues à celles contenant le gène reporter GUS ont également été construites pour un autre modèle, la région codant la luciferase de la luciole. 



  Les fusions de gène uidA ont été testées lors d'essais d'expression transitoire sur le tabac (cv Petite Havana) au stade de 3-4 tranches d'anthères bombardées par un canon à particules avec de l'ADN précipité sur des microbilles de tungstène de 1,8  mu m. Voir par exemple Twell et al., 1989. Chaque coup contenait 0,5  mu g d'ADN. Des taches bleu foncé ont été observées sur des tranches d'anthères et dans des microspores séparés, montrant que l'expression transitoire du gène GUS était survenue dans les microspores. La source des taches qui ont été observées dans certaines occasions sur la surface des anthères n'a pas pu être distinguée pour savoir si elles provenaient des cellules d'anthères ou de microspores parasites.

   Pourtant dans des test additionnels avec des microspores isolés et des feuilles, l'expression transitoire a été confirmée pour les fusions de gène uidA et luciférase dans des microspores. Des essais des constructions luciferases dans des morceaux de feuilles ont montré que l'on a observé l'activité d'aucun gène des séquences de régulation spécifique de microspore dans les feuilles,  en utilisant les test les plus sensibles dont on dispose (détection de luminescence catalysée par luciférase). 


 Exemple 6 
 Préparation de constructions génétiques pour l'expression spécifique de microspores de gènes 
 pour la lutte contre les insectes ou la stérilité mâle. 
 



  Cet exemple illustre les méthodes de génie génétique pour produire des constructions fournissant une expression de gène spécifique de microspore de gènes hétérogènes, tels que les gènes qui agissent sur le contrôle des insectes ou la stérilité mâle, dans les plantes transgéniques. 



  Pour fournir des constructions d'expression spécifique de microspores des gènes encodant les protéines désirées, par exemple, un gène déterminé de contrôle des insectes ou gène de stérilité mâle, un segment d'ADN comportant des séquences régulatoires spécifiques de microspores de la présente invention est relié de manière opéative à un gène hétérogène, et à des séquences 31 non-traduites, selon les besoins, pour donner la commande de traduction ou transcription appropriée pour le gène hétérogène choisi. Les séquences régulatoires sont fusionnées avec les séquences du gène hétérogène, par exemple, en modifiant le début du cadre de lecture ouvert du gène hétérogène pour inclure un site de clivage de l'enzyme de restriction.

   De manière avantageuse, ce site de clivage est un site NcoI ou un autre site compatible pour la liaison avec un site NcoI, car les séquences de tels sites comportent un codon de départ de traduction ATG. 

 

  Plusieurs génotypes ont été utilisés dans cet exemple où des transformations du "xanthi tobacco" ont été effectuées au dixième jour de la germination. 



  Les constructions sont décrites comme suit: 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb><SEP>PHI3621<SEP>(fig. 4)<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(fig. 6)<SEP>(QM, maïs "sense" + BAR)
<tb><CEL AL=L>pPHI3622<SEP>(fig. 5)<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(fig. 6)<SEP>(QM, maïs antisense + BAR)  
<tb><SEP>pPHI4722<SEP>(fig. 7)<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(fig. 6)<SEP>(QM, humain sense + BAR)
<tb><CEL AL=L>pPHI4723<SEP>(fig. 8)<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(fig. 6)<SEP>(QM, humain sense + BAR)
<tb><CEL CB=2 AL=L>pPHI365<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(GUS + BAR)
<tb><SEP>pPHI1285<SEP>(BAR) 
<tb></TABLE> 



  Pour obtenir la transformation, un bombardement par canon de particules a été utilisé, un canon à hélium GE et des disques de rupture de 650PSI. Un bombardement a été exécuté par échantillon, avec un total de 0,1  mu g. 



  Le tabac a été germé et observé in vitro dans un milieu 272 pendant 10 à 14 jours avant les étapes suivantes. Un jour avant l'expérience, des cotyledons et des premières feuilles ont été coupés en moitiés et placées sur des filtres stériles contenant 1,5 ml d'un milieu 530 + 0,25 M de sorbitol. L'incubation a été effectuée à 28 DEG C dans l'obscurité. Les feuilles furent coupées dans un milieu liquide pour éviter leur dessèchement. Quatre morceaux de feuille par plaque ont été cultivées et 5 plaque ont été préparées pour transformation au QM, et trois plaques ont été préparées pour transformation de contrôle. 



  Après le bombardement, tous les échantillons ont été maintenus sur les filtres originaux pendant deux jours avant d'être transférés dans un milieu de sélection. 



  Après 48 heures, le tissu a été transféré dans un milieu 526+Basta (52611), en laissant le tissu des feuilles sur les filtres. La formation de colonie est généralement survenue 2 à 3 semaines après le bombardement. 



  Après 4 semaines, les colonies et cotyledons ont été transférés dans un milieu 528S. Des plantons des colonies transformées ont été découpés des callus de base et transférés dans un milieu 272N pour que la formation de racines se produise. Lorsque les racines ont été bien établies, les plants ont été transférés en serre pour grandir. 


 Les résultats ont été les suivants: 
 



  126 colonies ont été obtenues à partir des traitements d'ADN de cette étude. L'analyse par PCR a été réalisée sur un total de 50 colonies en échantillonnant  aléatoirement 12 de chacun des traitements d'ADN. Les résultats de cette analyses sont montrés ci-dessous: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Head Col 1: Traitement d'ADN 
<tb>Head Col 2: % PCR 
<tb>Head Col 3: % récupération 
 de plant
<tb><SEP>pPHI3621/pPHI1285<SEP>90%<SEP>14,3%
<tb><SEP>pPHI3622/pPHI1285<SEP>62,5%<CEL AL=L>20%
<tb><SEP>pPHI4722/pPHI1285<SEP>66,7%<SEP>16,6%
<tb><SEP>pPHI4723/pPHI1285<SEP>75%<CEL AL=L>28,6%
<tb><SEP>pPHI265/pPHI1285<SEP>100%<SEP>100% 
<tb></TABLE> 



  Des différences de taux de croissance ont été observées six semaines après le bombardement. L'observation la plus intéressante a été que les colonies obtenues à partir des transformations avec pPHI3621/pPHI1285 et pPHI3622/pPHI1285 montraient une décroissance de colonie, spécialement avec le traitement au pPHI3622/pPHI1285. Aucune différence de croissance notable pour les autres transformations comparées aux colonies de contrôle pPHI1265/pPHI1285. 


 Exemple 7 
 Transformation du BMS stable pour évaluer l'effet et l'expression du gène QM, dans les orientations "sense" et "antisense" et dans le système de gène inductible GPR/GRE 
 



  Le génotype utilisé était le BMS P-38 dans des suspensions de maïs. Les constructions ADN étaient: 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb><SEP>pPHI4719<SEP>(fig. 9)<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(fig. 6)<SEP>(35S-QM sense + 35S-BAR) 
<tb><CEL AL=L>pPHI4720<SEP>(fig. 9)<SEP>+<SEP>pPHI1285<SEP>(fig. 6)<SEP>(35S-QM antis. + 35S-BAR) 
<tb></TABLE> 



  On a utilisé un bombardement par canon à particules (un canon à hélium GE, et des disques éclatés 650PSI). Un seul bombardement par échantillon. 



  Un jour après la sous-culture, le liquide a été enlevé sous vide des cellules et deux grammes de cette matière a été re-suspendue dans 25 ml d'un milieu contenant 237 + 0,25 M de sorbitol. Les cellules ont été incubées à 28 DEG C sur un appareil à vibrations pendant 2 à 4 heures. 



  0,5 ml de cellules ont été plaquées sur une double couche de filtres de Whatman humidifié par un milieu 237 + 0.25 M de sorbitol. La densité de la cellule par plaque était d'environ 50 mg. 



  Six échantillons ont été réalisé pour chaque traitement d'ADN, y compris 2 échantillons de contrôle non bombardés. 



  Après le bombardement, des filtres avec les cellules ont été transférés en milieu 115 et remis dans l'obscurité à 28 DEG C pendant 48 heures. 



  Les cellules ont été transférées dans un milieu 306E de sélection après 48 heures en arrachant les cellules du filtre, en les remettant en suspension dans 2 ml d'un milieu 237, et en les plaquant dans    1 ml par plaque de chaque échantillon. 



  L'obtention de la colonie a été surveillée continuellement. Lorsque l'on identifiait une colonie, elle était séparé des autres pour maintenir son identité. 



  Des essais d'induction pouvaient être faits après que les analyses du PCR confirment la présence des gènes dans les colonies transgéniques. 



  Alors que l'obtention de colonies est survenu à partir de toutes les transformations dans cet exemple, la majorité provenait du traitement de contrôle du pPHI1285 positif. Les données concernant la formation des colonies sont montrées ci-dessous, la lettre N* indiquant le nombre d'échantillons bombardés par traitement d'ADN: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Head Col 1: Traitement d'ADN 
<tb>Head Col 2: N* 
<tb>Head Col 3: colonies formées
<tb><SEP>pPHI4719/pPHI1285<SEP>9<SEP>3
<tb><SEP>pPHI4720/pPHI1285<CEL AL=L>11<CEL AL=L>4
<tb><SEP>pPHI1285<SEP>11<SEP>44 
<tb></TABLE> 



  Les deux constructions 35S "sense" et "antisense" pour le gène QM étaient toxiques pour la formation de colonies BMS. 


 Exemple 8 
 Utilisation pour la transformation d'un promoteur spécifique du tapetum du maïs 
 
 



  Protocoles expérimentaux
 Répétitions 1, 2 et 5
 



  But: Formation de colonies transgéniques, de plantes et de progéniture du maïs résistant au Basta/Bialaphos et expression du GUS amené par le promoteur SGB6g1 spécifique du tapetum. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb><SEP>Génotype:
<tb><SEP>-<SEP>54-68-5<SEP>B1-1<SEP>(Répétition 1) ou
<tb><SEP>-<CEL AL=L>54-68-5<SEP>161 F3<SEP>(Répétition 2)
<tb><SEP>-<SEP>54-68-5<SEP>161 F4<SEP>(Répétition 5) 
<tb></TABLE> 



  Milieu: suspension dans un milieu liquide 237 pour le maïs
 - 115, milieu de maintenance du callus, pour le maïs
 - 115E, milieu de sélection du callus contenant 5 mg/l de Basta
 - 115B, milieu de sélection du callus contenant 3 mg/l de Bialophos 



  Traitement des tissus:
 - tamisage des cellules avec des mailles de 710  mu m, un jour après la sous-culture
 - resuspension dans 237 + 3% PEG à densité de plaque 50 g/ml 
 - incubation une noit dans 3% PEG
 - cellules des plaques; 0,5 ml/plaque sur filtres de verre 934-AH avec filtre Shatman mouillé par 1 ml d'un milieu 237 + 3% PEG 
 - transfert des cellules sur filtre de verre vers un milieu 115 après bombardement 



  Bombardement par canon de particules:
 - Canon à hélium DuPont (répétitions 1 et 5)
 - Disques de rupture 650 PSI (Répétitions 1 et 5)
 - Canon DuPont PDS-100 (Répétition 2)
 - Plaques d'arrêt 0.230'', macroprojectiles d'acétyle (Rép. 2)
 - Un bombardement par échantillon (Répétitions 1 et 5)
 - Deux bombardements par échantillon (Répétion 2)
 - Protocoles d'ADN modifié au tungstène Pionner, spécifique à chaque canon 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb><SEP>ADN:
<tb><SEP>pPHI687<SEP>(fig. 11)<SEP>+<SEP>pPHI610<SEP>(fig. 12)
<tb><CEL AL=L>pPHI460<SEP>(fig. 13)<SEP>+<SEP>pPHI610<SEP>(fig. 12)
<tb><SEP>pPHI1952<SEP>(fig. 14)<CEL AL=L>+<SEP>pPHI610<SEP>(fig. 12)
<tb><SEP>pPHi2125<SEP>(fig. 15)<SEP>+<SEP>pPHI610<SEP>(fig. 12) 
<tb></TABLE> 



  Traitement après bombardement:
 - Recherche de l'expression du gène R 24-48 heures après le bombardement
 - Transfert des échantillons vers 115E (répétition 1) 48 heures après le bombardement. Transfert des échantillons vers 115B (répétitions 2 et 5) 7 jours après le bombardement
 - Transfert des cellules hors des filtres 2 semaines après le transfert vers la sélection
 - Essais du PCR des colonies pour le gène "reporter" avant régénération de la plante
 - Conservation des échantillons à 28 DEG C dans l'obscurité 


 Répétition 1 
 



  Les essais de PCR ont été réalisés sur 16 colonies indépendantes provenant de sélection sur 5 mg/l de Basta. Une colonie, plaque #9 1CZ, pPHI610 + pPHI2125 était positive au PCR pour GUS/pPHI2125). Toutes les colonies étaient des phénotypes du Type I, pourtant l'échantillon de contrôle  positif non sélectionné était également devenu un phénotype de Type I. Ce phénotype tend à être commun dans la lignée 54-68-5 B1-1. Après 12 semaines sur 5 mg/l de milieu de sélection Basta, toutes les colonies négatives de PCR ont été écartées ainsi que tous les tissus restant non-embryogéniques. La colonie 2 de l'échantillon #9 de la plaque 1 était transférée vers 288E (Milieu régénérant + 5 mg/l Basta). Huit colonies restaient à tester au PCR pour relever la présence du gène GUS.

   De ces huit colonies, trois ont été positives par PCR pour le GUS, aussi bien à partir de la fusion de traduction (pPHI2125) que de la fusion transcriptionnelle (pPHI1952). 


 Répétition 5 
 



  Des essais de PCR ont été effectués sur neuf colonies indépendantes provenant de sélection sur    3 mg/l de Bialaphos. Toutes les colonies étaient positives à la PCR pour le gène GUS, indiquant la présence soit de pPHI2125 ou de pPHI1952. Les contrôles de gènes utilisés dans cette expérience (pPHI460) ont donné 9 transformants stables, qui tous ont des régions qui se colorent en bleu lors d'une détermination cytochimique de GUS. La croissance était beaucoup plus rapide dans les gènes de contrôle que dans les produits transgéniques obtenus à partir des constructions SGB6gl:GUS. 



  Après 12 semaines sous une pression de sélection, seules les colonies embryogéniques grandissant rapidement ont été gardées, tout autre matière étant écartée. Des colonies à résultat de PCR positif ont été transférées en milieu de régénération pour la récupération de plantes. Des essais enzymatiques Basta ont été réalisés sur une partie des colonies. Les résultats obtenus n'indiquent pas un degré élevé de de produits transgéniques montrant une réelle résistance au Basta.

   Il ressort de travaux antérieurs et d'autres expériences de chercheurs concernant cet essai qu'une mesure de transformation plus fiable consiste à déterminer si la morphologie des cellules de colonies recueillies est bien ressemblante à celle des échantillons de contrôle non choisis, et de comparer le taux de croissance des colonies recueillies. 


 Exemple 9
 Construction de plasmides contenant le gène QM du maïs 
 



  Un plasmide pPHI3621 (fig. 4) qui exprime le gène QM dans l'orientation directe ou "sense" a été construit en utilisant pPHI1527 comme l'un des parents. pPHI1527 (fig. 16) contient comme élément de base le plasmide pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985) qui contient les sites de restriction nécessaires pour le clonage et le gène de résistance à l'ampicilline comme marqueur sélectif. Il contient également le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et des séquences de renforcement (Gardner et al., 1981), des séquences du leader de virus de la mosaïque du tabac O min  (Gallie et al., 1987), le gène "reporter" de luciferase de la luciole (Ow et al., 1986) et les séquences terminales de transcription du PinII (Hynheung et al., 1989). 



  Le second parent du pPHI3621 était le pPHI3620, qui contenait le gène QM du mais dans le "calque" KS (fig. 17). pPHI3621 a été formé par digestion de pPHI3620 et de pPHI1527 avec NcoI et KpnI et isolement du tronçon inséré par pPHI3620 et du plus grand tronçon de plasmide par pPHI1527 sur des gels d'agarose à bas point de fusion (LMP). Cette stratégie a remplacé le gène luciférase avec le gène QM du maïs. Les tronçons ont été associés et suturés pour former pPHI3621. 



  pPHI3622 (fig. 5), qui exprime l'orientation inverse du gène QM du maïs, a également été construit en utilisant pPHI1527 et pPHI3620 comme parents, mais par digestion des deux avec SalI et SacI. Le tronçon inséré du pPHI3620 et le plus grand tronçon du plasmide provenant du pPHI1527 ont été isolés à partir de gels d'agarose LMP; les fragments ont été associés et liés. De nouveau, cette procédure remplacait le gène de luciferase par le gène QM du maïs dans une orientation "antisense". 



  Les vecteurs d'expression spécifiques des tissus furent construit de la même manière, sauf que le promoteur  constitutif CaMV était remplacé par les promoteurs spécifiques 14B1 et 8B3 des anthères TA39 (Carnaat et al., 1991). pPHI1493 (fig. 18) contenant le promoteur 14B1 était digéré avec NcoI et NsiI, comme l'était pPHI3621 (le parent 2). Le petit tronçon d'insertion provenant de pPHI3621 et le plus grand tronçon de plasmide ont été isolés par électrophorèse sur gel d'agarose LMP, et associés et liés. Ceci a permis d'obtenir le pPHO4745 (fig. 19), qui contenait le gène QM du maïs dans l'orientation directe avec le promoteur 14B1. La construction du QM du maïs inverse a été faite par digestion de pPHI4745 avec SmaI et NsiL, et digestion de pPHI3622 avec SalI (qui fut introduit avec un fragment de Klenow) et NsiI.

   Le plus grand tronçon de plasmide provenant du pPHI4745 et le tronçon inséré provenant du pPHI3622 ont été isolés par gel LMP, refroidis et liés. Ceci donna le plasmide L6 (TA39 14B1) (fig. 20). 



  Les vecteurs d'expression contenant le promoteur spécifique d'anthère 8B3 furent construits par digestion de pPHI4855 (fig. 21) avec BamHI et NotI. pPHI4855 contenait toutes les séquences décrites précédemment, avec les séquences additionnelles codant le gène  beta -glucuronidase. L'autre parent pPHI4745 était également digéré avec BamII et NotI. Le grand tronçon de plasmide provenant de pPHI4856 et le tronçon inséré provenant de pPHI4745 ont été purifiées de l'agarose LMP, associées et liées. Le plasmide L59 (fig. 22) en résultant contenait le gène QM du maïs dans l'orientation directe amenée par le promoteur 8B3 spécifique d'anthère. La construction d'orientation "antisense" était obtenue par digestion de pPHI4855 avec SmaI et NsiI et de pPHI3622 avec SalI (rempli ensuite avec fragment de Klenow) et NsiI.

   Le grand tronçon de plasmide provenant du pPHI4855 et le tronçon inséré provenant du pPHI3622 ont été isolés par un gel d'agarose LMP, associés et liés. Ceci donna l'orientation de gène "antisense" L61 (fig. 23) du gène QM du maïs, sous le contrôle du promoteur 8B3. 


 Exemple 10 
 Production de plants mâles de tabac stériles par transformation avec un gène QM, "sense" et "antisense" 
 



  Des explants de feuilles de tabac ont été co-bombardés par 35S::BAR (pPHI1285) et l'un des plasmides suivants: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>L59:<SEP>TA39(8B3):QM
<tb><SEP>L61:<SEP>TA39(8B3):QM<SEP>"antisense"
<tb><SEP>L62:<CEL AL=L>TA39(14B1):QM<SEP>"antisense"
<tb><SEP>4745:<SEP>TA39(14B1):QM 
<tb></TABLE> 



  Un canon biolistique à hélium BioRad (Dupont) était utilisé pour bombarder les explants de feuilles de tabac. Le gène BAR était utilisé comme marqueur sélectionnable pour déterminer quelles cellules recevaient les plasmides. 



  Un promoteur d'anthère du tabac (TA39) était utilisé dans les quatre plasmides. C'est un promoteur spécifique du tapetum. "8B3" et "14B1" étaient isolés de TA39. 



  Le plasmide L59 (fig. 22) est identique au plasmide L61 (fig. 23), sauf que le plasmide L59 contenait un gène QM du mais de sens direct et que le plasmide L61 contenait un gène "antisense" au gène QM du maïs. 



  Le plasmide L62 (fig. 20) est identique au gène du pPHI4745, sauf que le plasmide pPHI4745 comportait un gène du maïs QM de sens direct et le plasmide L62 un gène "antisense" au gène QM du maïs. 



  Une découpe de feuille a été effectuée dans les parties de l'explant qui montraient l'inclusion du gène BAR. La réaction en chaîne par polymerase (Perkin-Elmer), bien connue de l'homme du métier, était utilisée pour amplifier le gène QM du maïs incorporé dans les cellules du tabac. 



  Des cellules PCR+ furent sélectionnées des callus résistant au bialophos et utilisées pour régénérer les plants de tabac (voir exemple 1). 



  La fertilité des plants régénérés a été déterminée en vérifiant la couche de pollen; et l'aptitude à  l'auto-fertilisation. Dans tous les cas de plants de mâles stériles montrés ci-dessous, ces deux critères ont été remplis. Comme on peut le voir, des plants mâles stérilesproviennent des cellules transformées par L62 et des cellules transformées par pPHI4745. Aucun plant de tabac n'a été produit à partir des cellules transformées par 159, et seulement deux plants ont été produits à partir de cellules transformées par L61. C'est un défaut expérimental due à une basse fréquence de bombardements utiles qui peut expliquer le manque de plants mâles fertiles associés avec ces deux plasmides. 



  Des plants de tabac mâles stériles ont été associés avec la présence à la fois du gène QM du maïs et du gène "antisense" QM du maïs. Une explication semblable est qu'un équilibre d'expression de gène QM est nécessaire pour un développement normal. Dans les levures l'équilibre en QM se révèle nécessaire pour un développement normal. 



  En présence du gène QM du maïs, de trop nombreuses expression QM peuvent survenir, un produit d'expression du gène du maïs peut être un mutant disruptif dans une cellule de tabac, ou le gène QM du maïs peut être exprimé à un instant inapproprié du développement 



  Le gène QM inverse du maïs produit peut se lier au gène QM du tabac, l'arrêtant à un instant crucial du développement. 



  L'analyse des séquences de nucléotides des gènes QM du tabac et du maïs suggère qu'une homologie peut être suffisante pour que le produit "antisense" concernant un gène puisse également se lier à l'autre. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Head Col 1 to 3 AL=L: Fertilité de plants régénérés à partir de callus résistants 
 au bialophos 
<tb>Head Col 1: Plasmide 
<tb>Head Col 2: Nb total de plants 
<tb>Head Col 3: Nb de plants 
 mâles stériles
<tb><SEP>L61<SEP>2<SEP>0
<tb><SEP>L62<SEP>9<SEP>3
<tb><SEP>pPHI4745 <SEP>12<SEP>6 
<tb></TABLE> 


 Matériels et méthodes 
 


 Utilisation de gènes QM d'orientation directe ou "sense" 
 



  Le segment de nucléotide du gène QM isolé du maïs ou d'autres sources de plantes est fusionné à son extrémité amont (5 min ) à un promoteur qui permet l'expression du brin "sense" dans une cellule de plante d'une cible particulière et il est fusionné à son extrémité aval (3 min ) à une terminaison de transcription convenable et des signaux de polyadénylation connus pour fonctionner dans cette cellule. Des promoteurs préférés incluent ceux qui sont connus pour diriger l'expression dans la cellule cible désirée, qui possède les promoteurs "constitutifs" tels que 35S du CaMV et le promoteur du gène d'ubiquitine qui sont connus pour diriger l'expression dans une grande variété de types de cellules végétales. 35S est apte à diriger l'expression aussi bien dans des plantes monocotylégones telles que le maïs que dans des plantes dicotylédones telles que le tabac et la canola.

   Toutefois le promoteur d'ubiquitine pour le tabac est de préférence dérivé d'une source dicotylédone. Le promoteur d'ubiquitine à utiliser dans des monocotylédones telles que le maïs est dérivé de préférence d'une source monocotylédone. D'autres promoteurs utiles comportent ceux qui sont connus pour être inductibles dans des conditions spécifiques, par exemple en réponse à des traitements chimiques particulier, comme par un herbicide. 



  Des signaux de terminaison polyadénylation comportent ceux qui sont connus pour fonctionner dans la cellule cible intéressante. On préfère les signaux des gènes tels que pin11 (inhibiteur de protéinase II de la pomme de terre) ou des gènes T-ADN tels que OCS ou NOS, qui sont connus pour fonctionner dans une large variété de types de cellules végétales, y compris celles des dicotylédones et des monocotylédones comme le maïs. Lorsque la cellule cible provient d'une plante monocotylédone comme le maïs, on préfère, sans que cela soit nécessaire, qu'un intron d'un  gêne de monocotylédone soit inséré entre le promoteur et le gène QM. Des exemples seraient un intron (comme l'intron 1 ou 6) du gène Adh1 du maïs. 



  Dans une forme de mise en Öuvre indiquée à titre d'illustration, le segment de nucléotides du gène QM est fusionné à son extrémité (5 min ) amont à un promoteur qui est connu pour être spécifique ou pour montrer une préférence marquée pour l'expression dans un tissu ou une cellule qui est critique pour le développement du pollen. L'anthère est un exemple d'un tel tissu. Une cellule tapétale ou un microspore en développement est un exemple de cellule appropriée. Le segment est fusionné à son extrémité aval (3 min ) à une extrémité de transcription convenable et des signaux de polyadénylation également connus pour fonctionner dans cette cellule.

   Des promoteurs préférentiels seraient SGB6 pour le maïs et TA39 (du tabac) et le promoteur Bp4A du clone L4 (obtenue à partir de B.napus, WO 90/08 828) pour des dicotylédoness. 


 Utilisation de gènes QM d'orientation inverse ou "antisense" 
 



  La forme "antisense" du gène QM est fusionnée à son extrémité amont (51) à un promoteur qui amène l'expression dans une cellule végétale cible particulière et est fusionné à son extrémité aval (3 min ) à une terminaison de transcription convenable et à des signaux de polyadénylation également connus pour fonctionner dans cette cellule. Dans ce cas, une forme d'exécution de cellule de cible est une cellule dans laquelle le gène QM ou un gène très homologue au gène OM est connu pour être exprimé pour que l'orientation inverse travaille effectivement. Les promoteurs préférés comportent ceux qui sont connus pour diriger l'expression dans la cellule cible désirée, les candidats convenables incluant les promoteurs "constitutifs" tels que 35S du CaMV et le promoteur du gène d'ubiquitine, qui sont connus pour diriger l'expression dans une grande variété de types de cellules végétales.

   On s'attend à ce que le 35S  s'exprime à la fois dans les monocotylédones comme le maïs et les dicotylédones comme le tabac et la canola. Pourtant, le promoteur d'ubiquitine pour le tabac est choisi de préférence à partir d'une source dicotylédone, et le promoteur d'ubiquitine à utiliser pour des monocotylédones comme le maïs provient de préférence d'une source monocotylédone. D'autres promoteurs préférés comportent ceux qui sont connus pour être inductibles dans des conditions spécifiques, comme en réponse à un traitement chimique particulier, par exemple par un herbicide. De préférence la construction "antisense" comporte le gène QM entier ou au moins plusieurs centaines de nucléotides de l'extrémité 5 min  du gène. 



  Le tronçon de nucléotides de la forme "antisense" du gène QM est fusionné à son extrémité amont (5 min ) à un promoteur qui est connu pour être spécifique ou pour montrer une préférence marquée pour l'expression d'un tissu ou d'une cellule critique pour le développement du pollen. Un exemple d'un tel tissu convenable est l'anthère. Un exemple d'une cellule convenable est une cellule tapétale ou un microspore en développement. Le segment est fusionné à son extrémité aval (3 min ) à une terminaison de transcription convenable et des signaux de polyadénylation également connus pour fonctionner dans la cellule ou le tissu. La cellule cible est une cellule dans laquelle le gène QM ou tout gène hautement homologue au gène QM est connu pour diriger l'expression de telle manière que l'"antisense" fonctionne efficacement. 


 Méthodes de transformation 
 



  Les méthodes de transformation pour les dicotylédones incluent plusieurs méthodes différentes connues pour fournir l'ADN. De préférence on utilise un bombardement des explants de feuille avec des particules. D'autres méthodes incluent la transmission de 11agrobacterium aux explants; la culture d'agrobacterium des protoplastes; l'électroporation, la prise de PEG ou la  fourniture directe d'autres ADN dans des protoplastes ou autres. Une méthode préférée pour des monocotylédones comme le maïs est l'introduction d'ADN dans les cellules traitées par bombardement, mais d'autres méthodes telles que l'électroporation peuvent aussi être utilisées. 



  Des cellules d'une plante sont transformées selon une manière de procéder conventionnelle avec la séquence étrangère d'ADN de l'invention. Si la plante à transformer est susceptible d'être infectée par l'agrobacterium, il est préférable d'utiliser un vecteur contenant la séquence d'ADN étrangère, qui est un plasmide-Ti désarmé. La transformation peut être réalisée en utilisant d'autres procédures décrites, par exemple dans EP 0 116 718 et EP 0 270 822. Des plasmides-Ti vecteurs préférentiels contiennent la séquence d'ADN étrangère entre les séquences de bordure, ou au moins localisées en amont de la séquence latérale de droite.

   D'autres types de vecteurs peuvent être utilisés pour transformer la cellule végétale, utilisant des procédure tel que le transfert direct de gène (voir par exemple RP 0 237 356, PCT publication WO/85/01 856 et EP 0 275 069); la transformation de protoplastes in vitro est décrite par exemple dans US 4 684 611; la transformation par un virus d'une plante est enseigné dans EO 0 067 533 et US 4 407 956 par exemple; et la transformation par liposome dans US 4 536 475, parmi d'autres. 



  Si la plante à transformer est le maïs, des méthodes de transformation récemment développées sont utiles, telles les méthodes décrites pour certaines lignées de maïs par Fromm et al., 1990 et Gordon-Kamm et al., 1990. 



  Si la plante à transformer est le riz, des méthodes de transformation récemment développées peuvent être adoptées, comme les méthodes décrites pour certaines lignées de riz par Shimamoto et al., 1990, Datta et al., 1990, Christou et al., 1991 et Lee et al., 1991. 



  Si la plante à transformer est le blé, une méthode analogue à celles décrites ci-dessus pour le maïs ou le riz peut être utilisée. De préférence pour la transformation d'une plante monocotylédoneylédone, particulièrement une céréale  telle que le riz, le maïs ou le blé, on utilise une méthode de transfert direct d'ADN, comme une méthode de transformation ou d'électroporation biolistique. En utilisant une telle méthode de transfert direct, il vaut mieux diminuer l'ADN transféré pour que seule la séquence d'ADN de cette invention - le gène QM du maïs et les régions de régulation associés - soite intrégré dans le génome de la plante.

   Sous cet aspect, lorsqu'une séquence d'ADN selon l'invention est construite et multipliée dans un plasmide d'un organisme hâte bactérien, il est préférable qu'avant de transformer un plant avec la séquence ADN, les séquences de plasmides qui sont nécessaires pour la propagation de l'organisme bactérien hôte, par exemple à l'origine de la réplication, on sépare un gène de résistance contre un antibiotique servant pour la sélection de l'organisme hôte, ou tout gène semblable, des parties du plasmide qui contiennent la séquence étrangère d'ADN. 



  Mode opératoire "Tungstène/ADN" pour le canon à hélium DuPont (méthode de transformation par bombardement de particules biolistiques)
 



  - Peser 60 mg de particules de tungstène 1,8  mu m: mettre dans un tube centrifuge de 15 ml
 - Ajouter 2 ml de HNO3 0-1M: traiter aux ultrasons sur glace pendant 20 minutes
 - Retirer HNO3: Ajouter 1 ml d'eau stérile déionisée et transférer l'échantillon dans un tube de Sarstedt de 2 ml. Traiter brièvement aux ultrasons.
 - Centrifuger les particules en granulés
 - Retirer H2O: Ajouter 1 ml EtOH 100% - vibrer aux ultrasons brièvement
 - Centrifuger les particules en granulés
 - Retirer H2O: Ajouter 1 ml EtOH 100% - vibrer aux ultrasons brièvement
 - Centrifuger les particules en granulés 
 - Retirer EtOH: Ajouter 1 ml d'eau stérile déionisée.

   Vibrer aux ultrasons.
 - Introduire à la pipette 250  mu l de suspension dans des tubes de 4,2 ml
 - Ajouter 750  mu l d'eau stérile déionisée à chaque tube
 - Congeler l'échantillon de tungstène entre les utilisations
 - Introduire à la pipette 50  mu l de suspension tungstène/eau dans un tube de 1,5 ml (d'abord vibrer aux ultrasons)
 - Ajouter 10  mu g d'ADN Mélanger
 - Ajouter 50  mu l de CaCl2 2,5 M Mélanger
 - Ajouter 20  mu l de spermidine 0,1 M Mélanger
 - Vibrer brièvement aux ultrasons. Centrifuger 10 secondes à 10 000 tours/min
 - Prélever la fraction surnageante. Ajouter 250  mu l EtOH 100%. Vibrer rapidement aux ultrasons.
 - Centrifuger durant 10 secondes à 10 000 t/m
 - Retirer le supernatant. 

   Ajouter 60  mu l EtOH 100% 


 Mode opératoire pour la transformation du maïs en vue de l'obtention de plantes transgéniques stables 
 
 
 
   1er jour: Les cellules sont placées dans un milieu liquide et tamisées (à 710  mu m). On prend 100-    200 mg de cellules sur un filtre en fibres de verre sur une surface de 3,5 cm. Les cellules sont transférées dans le milieu et incubées toute une nuit.
 8e jour: Le filtre et les cellules sont enlevés du milieu, séchés et bombardés. Filtre et cellules sont replacés dans le milieu.
 5e jour: Les cellules sur le filtre sont transférées dans des milieux de sélection (3 mg bialophos).
 12e jour: Les cellules sur le filtre sont transférées dans de milieux de sélection frais.
 19e jour: Les cellules sont retirés du filtre et dispersées dans 5 ml d'un milieu de sélection contenant 8,6% d'agarose sca à faible point de fusion.

   Les cellules et le milieu sont dispersés sur la surface de deux  plaques de 100 mm x 15 mm contenant 20 ml d'un milieu solidifié "gel-rite".
 40e jour: Les transformés espérés sont prélevés de la plaque.
 61e jour: On examine les plaques afin de déceler la présence éventuelle de nouvelles colonies. 
 


 Analyse d'ARN 
 



  L'ARN cellulaire complet a été préparé à partir de semences B73, sept jours après la plantation selon le protocole de Chomczynski et Sachi (1987). La séquence Poly (A) + ARN a été purifiée à partir de l'homogénat de feuilles en utilisant le "PolyAtract 100" (système Promega). Les analyses par Northern blot ont été exécutées comme décrit précédemment (Thomas, 1980). 


 Caractérisation des régions latérales 
 



  La cartographie par extension d'amorce des extrémités 51 de l'ARN a été effectuée selon la méthode de McKnight (1982). Les oligonucléotides utilisés pour les réactions d'extension de l'amorcée étaient des homologues 5 min  et marqués 32-mères et 44-mères de l'ADNc TA39 du dernier nucléotide du codon de départ jusqu'aux nucléotides 31, et à partir des nucléotides 79 et 122 en aval du codon de départ, respectivement. L'ARN a été isolé à partir des anthères du tabac en utilisant la méthode au guinidinum isotiocyanate de Chomcynski et Sacchi (1987) et purifiés en utilisant une colonne d'oligo dT. 


 Plasmides 
 



  La mutagénèse dirigée sur site (Su et El-Gewely, 1988) a été utilisée pour créer soit un site Ncol au codon de départ avec l'oligonucléotide 5 min  CTAATTCCACCATGGCTTTTCTTGC3 min ou un site PstI placé 5 bases en aval du point de départ supposé de la transcription avec  l'oligonucléotide
 5 min  GTTTATGTTTTCGTATCTGCAGCTTGAAAAGATATTATATC3 min . 



  Pour les constructions de uidA "reporter", les régions adjacentes ont été fusionnées au site du Ncol au cadre de lecture uidA avec un signal de traitement de transcription 3 min  à partir du gène inhibiteur de protéase de la pomme de terre (Pl-II), ou fusionnés au site PstI vers le leader TMV non traduit  OMEGA  min  du cadre de lecture uidA et PI-II. Les constructions du "reporter" uidA avec  OMEGA  min  ont été insérées dans le vecteur binaire Ti pALLTKRep. pALLTKRcp diffère de pBI101.1 (Jefferson, 1987) en ce que c'est le promoteur CaMC 35S qui entraîne le marqueur sélectable NPTII au lieu du promoteur nopaline synthase. Le plasmide pLAT52-7 qui contient le promoteur spécifique du pollen des tomates et le gène reporteur uidA a été aimablement fourni par le Dr. Sheila McCormick du USDA-ARS Plant Gene Expression Center, Albany, Ca. 



  Les plasmides lcf "reporter" ont été créés en fusionnant les régions latérales 5 min  du LAT52 ou les clones génomiques TA39 au site Ncol du gène luciférase de la luciole avec PI-II 3 min . 


 Documents Cités 
 



  Les références citées ci-dessous sont considérées comme incorporées dans la description dans la mesure où elles complètent, expliquent, donnent un arrière-plan ou enseignent la méthodologie, les techniques et les compositions décrites ici. 



  Albani et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15:605-622. 



  Berlyn et al., 1976, "Botanical Microtechnique and Cytochemistry" The Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ch. 3, 4, and 5. 



  Brown et al., 1990, Plant Cell 2:263-274. 



  Call et al., 1990, "Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus" Cell 60:509-520. 



  Chomczynski et al., 1987, "Single-step method of RNA lsolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction." Anal. Biochem. 162:156-159. 



  Chomczynski, P. and Sacchi, N., 1987. Single step method for RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 162, 156-159. 



  Christou et al., 1991, "Production of transgenic rice (Oryza Sativa L.) plants from agronomically important indica and Japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos" Bio/Technology 9:957. 



  Colasanti, J. et al., 1991, "Isolation and characterization of cDNA clones encoding a functional P34odc2 homologue from Zea mays," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3377-3381. 



  Gessler et al., 1990, "Homozygous deletion in Wilms' tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping." Nature, 343:774-778. 



  Goldberg, R.B., Beals, T.P. and Sanders, P.M., 1993. Anther development: basic principles and practical applications. Plant Cell 5:1217-1229. 



  Gordon-Kamm et al., 1990, "Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants," The Plant Cell 2:603-618. 



  Guerrero et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224:161-168. 



  Hamilton, et al., 1989, Sex. plant Reprod. 2:208-212. 



  Hynheung, A., Mitra, A., Choi, H.K., Costa, M.A., An, K., Thornburg, R.W. and Ryan, C.A., 1989, "Functional analysis of the 3 min  control region of the potato woundinducible proteinase inhibitor II gene." Plant Cell 1:115-122. 



  Jacobs, 1992 "Control of the cell cycle. Dev. Biol. 153:1-15. 



  Klein et al., 1989, "Regulation of anthocyanin biosynthetic genes introduced Into intact maize tissues by microprojectiles." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6681-6685. 



  Koltunow et al., 1990, "Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development." Plant Cell 2:1201-1224. 



  KuhImeier et al., 1987, "Regulation of gene expression in higher plants." Ann Rev. Plant Physiol. 38:221-257. 



  Lee et al., 1991, "Efficient transformation and regeneration of rice small cell groups," PNAS 88:6389-6393. 



  McKnight, S., 1982. CeIl 31:355-366. 



  Monteclaro et al., 1993, "A jun-binding protein related to a putative tumor suppressor," PNAS 90:6726-6730. 



  Ow, D., Wood, K.V., DeLuca, M., de Wet, J.R., Helinski, D.R., and Howell, S.H., 1986, "Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants." Science 234:856-859. 



  Roberts, N., et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17:295-299. 



  Ron & Dressler, 1992, "pGSTog-A versatile bacterial expression plasmid for enzymatic labeling of recombinant proteins." BioTech 13:866-69. 



  Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning". Cold Spring Harbor Laboratory Press. 



  Schmidt et al., 1992, "Opaque2 is a transcriptional activator that recognizes a specific target site in 22, Kd zein genes." Plant Cell 4:689-700. 



  Scott, R., et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17:195-207. 



  Shimamoto et al., 1990, "Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts." Nature 338:274. 



  Smith & Johnson 1988, "Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione s-transferase." Gene 67:31-40. 



  Thomas et al., 1980, "Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitro-cellulose." Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77:5201-5205. 



  Twell et al., 1989, "Transient expression of chimeric genes delivered into pollen by microprojectile bombardment." Plant Physiol., 91:1270-1274. 



  Ueda et al., 1992, "Mutations of the 22- and 27-kd zein promoters affect transactivation by the Opaque2 protein." Plant Cell 4:701-709. 



  van den Ouweland et al., 1992, "Identification and characterization of a new gene in the human Xq28 region." Human Mol. Genet., 1:269-273. 



  Walden, R. and Schell, J., 1990, "Techniques in plant molecular biology-progress and problems." Eur. J. Biochem. 192:563-576. 



  Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing J., 1985, "Improved M13 cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors." Gene 33:103-119.
 
 EP 0 116 718
 FP 0 270 822
 EP 0 237 356
 EP 0 275 069
 EP 0 067 553
 WO/85/01 856
 WO/90/08 828
 U.S. patent No. 4 407 956
 U.S. patent No. 4 536 475
 U.S. patent No. 4 604 611 



  Datta et al., 1990, "GeneticaIly engineered fertile Indica-rice recovered from protoplasts," Bio/Technology 8:736. 



  Devereux et al., 1984, "A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX." Nucleic Acids Res. 12:387-395. 



  Domon et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15:643-646. 



  *Dowdy et al., 1991, "The isolation and characterization of a novel cDNA demonstrating an altered in RNA level in nontumorgenic Wilms' microcell hybrid cells." Nucleic Acids Res. 19:5763-5769. 



  Edwards et al., 1990, "Cell-specific gene expression in plants." Ann. Rev. Genet 24:275-303. 



  Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833. 



  Gallie, D.R., Slex, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C. and Wilson, T.M.A.. 1987, "The 5 min  leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo." Nucleic Acids Res. 8:3257-3273. 



  Gardner, R.C., Howarth, A.J., Hahn, P., Brown-Luedi, M., Shepherd, R.J. and Messing, J.C., 1981, "The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing." Nucleic Acids Res. 9:2871-2888 



  Garnaat, CW. and Huffman, G., 1991, "Isolation and transient assay of tobacco anther specific promoters." Abstracts: The International socie <SDO NM=Drawings> 
EMI57.1
 
EMI58.1
 
EMI59.1
 
EMI60.1
 
EMI61.1
 
EMI62.1
 
EMI63.1
 
EMI64.1
 
EMI65.1
 
EMI66.1
 
EMI67.1
 
EMI68.1
 
EMI69.1
 
EMI70.1
 
EMI71.1
 
EMI72.1
 
EMI73.1
 
EMI74.1
 
EMI75.1
 
EMI76.1
 
EMI77.1
 
EMI78.1
 
EMI79.1
 
EMI80.1
 
EMI81.1
 
EMI82.1
 
EMI83.1
 
EMI84.1
 
EMI85.1
 
EMI86.1