HUT73336A - Methods and compositions for controlling plant development - Google Patents

Description

A találmány tárgyát QM-fehérjéket kódoló nukleinsav-molekulák képezik, valamint eljárások növények egyedfejlődésének befolyásolására a nukleinsav molekulák alkalmazásával. A növényi egyedfejlődésben szerepet játszó fehérjék egy családjának szerkezete és genetikai kódolószekvenciái homológiát mutatnak az emlőseredetü QM-fehérjékkel és a fehérjéket kódoló génekkel.

A találmány tárgyát közelebbről olyan rekombináns molekulák képezik, melyek növényi eredetű QM-kódoló régiókat, valamint alkalmas szabályozó régiókat tartalmaznak, valamint eljárások növények egyedfejlődésének befolyásolására, valamint megváltoztatott egyedfejlődéssel bíró transzformált növények előállítására, a találmány szerinti rekombináns molekulák alkalmazásával. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti nukleinsavmolekulákkal transzformált transzgenikus növények is.

A találmány szerinti megoldás alkalmas új, előnyös sajátságokkal bíró haszonnövények genetikai manipuláció útján történő előállítására.

A találmány szerinti eljárással megváltoztatott egyedfejlődésű növények például hímsterilekké válnak.

A legtöbb növényi gén - ha nem az összes - expressziója feltételezhetően valamilyen módon kapcsolatban áll a növény egyedfejlődésével. A géAktaszámunk: 82535-1045/PÁ • · ·· ·«· *« • · · * ·

-2nek sok osztályáról közismert, hogy reagálnak egyedfejlődési szignálokra, melyeknek szerepük van a sejtek differenciálódásában, a szövetek és szervek kialakulásában vagy a növény növekedésének szabályozásában. A szakirodalomban találhatunk példákat ilyen jól jellemzett géncsaládokra: fény által szabályozott gének (például az rbcS és cab géncsaládok), hormonok által szabályozott gének, valamint olyan gének, melyek specifikusan apportokokban, a gyökerekben, a magokban vagy levelekben, vagy az ilyen szövetek bizonyos sejttípusaiban expresszálódnak. E témakörben összefoglaló munkákat közöltek például Edwards és mtsai. (1990), valamint Kuhlmeier és mtsai. (1987). Ismeretesek olyan gének is, melyek más gének expresszióját szabályozzák, ilyen például a kukoricában található Opaque2 szabályozógén, amely egy transzkripciós aktivátor fehérjét kódol, amely a 22 kD molekulatömegű zein-fehérjék génjeinek expresszióját szabályozza [Schmidt és mtsai.: (1992); Ueda és mtsai.: (1992)], valamint a kukorica Cl és R-génjei, melyek az Al- és BZl-gének expresszióját szabályozó transzkripciós aktivátor fehérjéket kódolnak [Kiéin és mtsai.: (1989)]. Egy új kutatási területet jelent az olyan növényi gének azonosítása és izolálása, melyekről állati és élesztőgénekkel való homológiájuk alapján feltételezik, hogy olyan alapvető sejtfolyamatok szabályozásában játszanak szerepet, mint példáid a sejtosztódás. Ebben a tárgykörben Jacobs (1992) közölt összefoglaló munkát. Egy ilyen gén például az élesztő cdc2-génjének homológja, melyet kukoricából klónoztak meg [Colasanti és mtsai.: (1991)]. A jövőben bizonyos, hogy azonosítani fognak további olyan növényi géneket, melyek egyéb alapvető sejtfolyamatokat vagy egyedfejlődési folyamatokat szabályoznak.

-3Emlösök esetén az egyedfejlődést szabályozó fehérjék szerepet játszanak az olyan abnormális sejtosztódási folyamatokban, melyek például a malignus elváltozásokat jellemzik. A Wilms-tumor például, egy gyermekkorban előforduló vesetumor, az embrionális blasztóma-sejtekben keletkezik és előfordul mind helyi jelleggel, mind pedig örökletes formában. Három kutatócsoport közzétette, hogy megklónoztak két egymástól független, Wilms-tumorral asszociált gént. Ezek közül az első, a WTl-jelü, egy cinkujj-fehérjét (zinc finger protein) kódol, amely a korai növekedési válasz (early growth response, EGR) géncsalád tagja, és emberekben a 1 lpl3lókuszba térképeződik, amely lókusz tumorogén sejtekben gyakran deletálva van [Call és mtsai.: (1990); Gessler és mtsai.: (1990)]. A második gént, melyet QM-génnek neveztek el, Dowdy és mtsai. klónozták meg (1991), tumorogén és nem tumorogén Wilms-mikrosejt-hibridsejtekből izolált cDSN és RNS alkalmazásával végrehajtott kivonásos hibridizáció útján. Erről a génről kimutatták, hogy RNS-szinten csaknem valamennyi vizsgált normális egérszövetben expresszálódik, de a Wilms-féle tumorogén sejtvonalakban nem.

A QM-gén által kódol fehérje 25 kD molekulatömegű, és rendkívül bázisos, pl-értéke közelítőleg 11,0. Dowdy azt is kimutatta, hogy a QM-gén egy bizonyos géncsalád tagja, egy egész sor emlős, különösen a főemlősök esetén, van den Oweland és mtsai. (1992) megklónozták a QM-gént, egy Xqter kromoszóma könyvtárból, és kimutatták, hogy a klónozott gén 100 %ig hasonló volt a korábban klónozott QM-génnel. A QM-gén expresszióját egerekben hajtották végre [Dowdy és mtsai.: (1991)]. Amennyiben összevetjük a csirkékből klónozott hasonló génről rendelkezésre álló információkat

-4van den Oweland és mtsai. adataival, arra következtethetünk, hogy ez a gén egy meglehetősen nagy filogenetikus csoportban konzervált.

Megállapították, hogy a QM-gén szerepet játszhat a nem tumoros fenotípus fenntartásában [Dowdy és mtsai.: (1991)]. A legújabb kísérletek azt sugallják, hogy a QM-gén a Jun elnevezésű transzkripciós aktivátor negatív regulátoraként működik, oly módon, hogy egyéb fehérjékkel versenyez (például a Fos fehérjével), melyek képesek a Jun-aktivátorhoz kötődni, és ezekből a feltételezésekből azt a következtetést vonták le, hogy a QMfehérje hiánya szabályozatlan sejtnövekedéshez vezet, és végül tumorkeletkezést okoz [Monteclaro és mtsai.: (1993)]. Ezekből az eredményekből nem következik, hogy a QM-gén esetleg növényekben is megtalálható, mivel nem ismeretesek az állatokban a QM-gén rendellenességei által előidézett fenotípusokhoz hasonló növényi fenotípusok.

A növények egyedfejlődését befolyásoló gének felfedezése hasznos lehet olyan genetikai eljárások kifejlesztése szempontjából, melyek segítségével hímsterilitást állíthatunk elő, mivel a jelenleg alkalmazott eljárások, mint például a címerezés, a citoplazmatikus hímsterilitás kialakítása, valamint az öninkompatibilitás létrehozása komoly hátrányokkal járnak. A hímsteril növények alkalmasak hibridmagok előállítására.

Hibridmagok kereskedelmi méretben történő termelése rendkívül fontos iparág. A hibridmagokból kikelt növények hasznosítják a két egymástól genetikailag távolálló szülő vonal kereszteződéséből származó heterotikus hatásokat. Az ilyen leszármazottak agronómiái sajátságai mindkét szülői vonal sajátságainál kedvezőbbek, elsősorban az életképesség, a hozam és az egységesség szempontjából. Mivel a hibridmagváltozatok elő-5nyös sajátságai a nyílt beporzással előállított változatokkal szemben a hibridmagokat a földművelők számára vonzóbbá teszik, a hibridmagok a piacon magasabb áron értékesíthetők.

Annak érdekében, hogy képesek legyünk olyan hibridmagokat előállítani, melyek nincsenek szennyezve önbeporzás útján keletkezett magokkal, be kell vezetnünk bizonyos beporzásellenőrzési eljárásokat, melyek biztosítják, hogy önbeporzás ne történjen, hanem csak keresztbeporzás. A beporzást szabályozó eljárás lehet mechanikus, kémiai vagy genetikus.

Mechanikai eljárást hibridmagok előállítására akkor alkalmazhatunk, ha a kérdéses növényfaj egymástól térben elkülönülő hímnemű és nőnemű virágokat hoz, vagy külön hímnemű és nőnemű növények tartoznak a fajhoz. A kukorica például a virágport termelő virágait a növény csúcsán elhelyezkedő virágzatban hozza, hímnemű virágait pedig a szár mentén, a levelek hónaljában. A keresztbeporzást oly módon biztosítják, hogy a hímnemű virágzatot mechanikusan eltávolítják (címerezés) a nőneművé alakított szülőről, és ily módon megakadályozzák az önbeporzást. Bár a címerezés jelenleg is alkalmazott hibridmag előállítási eljárás, ez a megoldás nem csak sok munkával jár, hanem költséges is, mivel mindenképpen csökkent kitermelést eredményez.

A legtöbb fontos termesztett növény esetén azonban, a működőképes hímnemű és nőnemű szaporítószervek egyazon virágon belül találhatók, tehát a hímtelenítés nem egyszerű feladat. Lehetőség van a virágport termelő szervek kézzel történő eltávolítására, a virágpor kiszabadulása előtt, azonban az ilyen hibridmag előállítási eljárás rendkívül munkaigényes, és ezért drága. Csak abban az esetben termelnek hibridmagokat ilyen eljárással, ha a

-6kapott magok értéke és mennyisége garantálja a ráfordított munka megtérülését.

A második általánosan alkalmazott hibridmag előállítási eljárás során úgy járnak el, hogy a pollen keletkezését vegyszerekkel lehetetlenné teszik vagy gátolják. Ezek a gametocidoknak nevezett vegyszerek átmeneti hímsterilitást idéznek elő. A kereskedelmi méretekben történő hibridmag előállítási eljárások során a gametocidok alkalmazásának határt szab az ilyen vegyszerek drágasága és nehezen hozzáférhető volta, valamint a vegyszerek hatásának hossza és megbízhatósága. Az ilyen vegyszerek nem hatékonyak a termesztett növények hosszú virágzási periódusaiban, mivel ez alatt újabb és újabb virágok nőnek, melyekre a megelőzően adagolt vegyszer már nem fejti ki hatását. Problémát jelent az is, hogy az ilyen vegyszerek ismételt alkalmazása nem praktikus, a megemelkedett költségek miatt.

Sok kereskedelmi méretben alkalmazott hibridmagtermelő rendszer a különböző termesztett növények esetén genetikai eljárást alkalmaz a beporzás szabályozására. Az ilyen rendszerekben alkalmazott hímnövények vagy nem termelnek virágport, vagy nem szabadul ki belőlük a virágpor, vagy pedig olyan virágport termelnek, mely biokémiailag képtelen önbeporzást megvalósítani. Azokat a növényeket, melyek biokémiailag képtelenek önbeporzást megvalósítani ön-inkompatibilisnek (self inkompatible, Sí) nevezzük. Az ön-inkompatibilitáson alapuló rendszerek nehézségei a következők: i) az ön-inkompatibilis hímnemű leszármazási vonalak hozzáférhetősége és fenntartása nehézkes, és ii) az ön-inkompatibilitás stabilitása kérdéses. Bizonyos esetekben az ön-inkompatibilitás kémiailag legyőzhető, vagy az éretlen virágokat kézzel be lehet porozni, mielőtt még a virágpor működését

-Ί meggátoló biokémiai mechanizmus aktiválódna. Sajnos a deaktiváláson alapuló ön-inkompatibilis rendszerek gyakran nagyon érzékenyek a klimatikus stresszekre, melyek gátolják vagy csökkentik az önbeporzás biokémiai blokkolásának hatékonyságát.

A kereskedelmi méretű vetőmagtermelés vonatkozásában nagyobb érdeklődésre tartanak számot azok az eljárások, melyekben a beporzásszabályozást hímsterilitást okozó genetikai mechanizmusok látják el. Az ilyen rendszereket két általános típusba sorolhatjuk: a) nukleáris gén által okozott sterilitás, melynek esetén egy vagy több sejtmagban található gén okozza a virágportermelődés működésképtelenségét, és b) citolazmatikus gének által okozott sterilitás, melyet általában citoplazmatikus hímsterilitásnak vagy CMS-nek (cytoplasmic male sterility) neveznek, amely rendszerben a virágpor képződését valamely citoplazmatikus organellumban - általában a mitokondriunban - fellépő defektus gátolja vagy blokkolja.

A nukleáris gének okozta sterilitás öröklődhet domináns és recesszív módon is. A domináns sterilitást csak abban az esetben használhatjuk hibridmagok előállítására, ha a nőnemű vonal fenntartása lehetséges például in vitro klónozásos szaporítással. A recesszív sterilitást csak abban az esetben alkalmazhatjuk, ha a steril és termékeny növényeket könnyen meg lehet egymástól különböztetni. A gének által okozott sterilitáson alapuló rendszerek kereskedelmi hasznosíthatóságát azonban korlátozza a klónozásos szaporítás drágasága, valamint az öntermékeny növények nőnemű sorainak rúzsozása.

-8Bár közöltek olyan hibridizációs rendszereket, melyek CMSalkalmazására épülnek, sok olyan probléma felmerül, melyek korlátozzák az ilyen rendszerek kereskedelmi hasznosságát. Az ilyen rendszerekben a citoplazmatikusan elhelyezkedő mitokondriumban egy specifikus mutáció -megfelelő sejtmagháttér esetén - képes a természetes virágporképzödés meggátlódásához vezetni. Bizonyos esetekben a sejtmagháttér kompenzálni képes a citoplazmatikus mutációt, és normális pollenképződés következik be. Azt a sejtmagi sajátságot, amely lehetővé teszi, hogy CMSmitokondriumokkal bíró növényekben virágpor keletkezzék, restaurációnak nevezzük, és specifikus restaurátorgének idézik elő. Általánosságban elmondhatjuk, hogy amennyiben a CMS-rendszert kereskedelmi méretű magtermelésre kívánjuk használni, három tenyészvonalat kell fenntartanunk, a hímsteril vonalat (nőnemű szülő), egy fenntartó vonalat, amelyik a hímsteril vonallal izogenikus, de teljesen működőképes mitokondriumokat tartalmaz, valamint a hím szülői vonalat.

A hímnemű szülői vonal hordozhatja a specifikus restaurátor géneket, és általában restaurátor vonalnak nevezik, ez a vonal biztosítja a hibridmag termékenységét. Olyan termesztett növények esetén, mint például az olyan zöldségek, melyek esetén a hibrid növényből nem fontos magokat visszanyerni, a CMS-rendszert alkalmazhatjuk restauráció nélkül is. Az olyan termesztett növények esetén, melyekben a hibrid gyümölcse vagy magja a kereskedelmi termék, a hibridmag termékenységét a hímnemü szülőben található specifikus restaurátor gének alkalmazásával helyre kell állítani, vagy a hímsteril hibridet be kell porozni. A nem restaurált hibridek beporzását úgy valósíthatjuk meg, hogy a hibridekkel együtt kis százalékban

-9hímtermékeny növényeket is használunk a beporzás érdekében. A legtöbb faj esetén a CMS-sajátság anyai ágon öröklődik (mivel valamennyi citoplazmatikus organellum kizárólag a petesejtböl származóan öröklődik), ami csökkentheti ennek a rendszernek az alkalmazhatóságát.

Bár CMS-rendszereket leírtak, olyan hátrányokkal rendelkeznek, melyek megakadályozzák hogy alkalmazásuk megoldást jelentsen a hímsteril növények termelésének vonatkozásában. Például egy bizonyos kukoricában előforduló CMS-típus (T-citoplazma) a növényt érzékennyé teszi egy bizonyos gombával történő fertőzésre. Bár a CMS-rendszert számos termesztett növény esetében alkalmazzák, huzamosabb használat esetén ez a rendszer gyakran működésképtelenné válik. Általánosságban elmondhatjuk hogy ebben a rendszerben a hímsterilitás kevesebb, mint 100 %-os.

A növények egyedfejlődésének megváltoztatása terén folytatott kutatásaink, például a hímsteril növények előállítása terén végzett kutatásaink során feltártunk egy rendkívül hasznos növényi egyedfejlődési fehérjecsaládot, a QM-családot. A találmány tárgyát képező eljárások és készítmények lehetővé teszik, hogy a hímtermékenységet a sejtmagi eredetű gének szintjén manipuláljuk.

A találmány tárgyát növényi egyedfejlődés megváltoztatására alkalmas eljárások és készítmények képezik. A találmány szerinti eljárásokban olyan genetikai konstrukciókat alkalmazunk, melyek növényekből izolált QM-géneket tartalmaznak.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a QM-gének növényekben is megtalálhatók. A QM-géneket mindeddig csak emlősökben írták le, daganatokkal összefug• ·

-10gésben, és kimutatták róluk, hogy normális sejtekben expresszálódnak, de tumorsejtekben nem. A QM-gén tumorok esetén valószínűleg alulszabályozódik, például az emberi Wilms-tumor esetén. Nem várható, hogy egy emlősök onkogenézisében szerepet játszó gén homológja növényekben is megtalálható legyen, mivel növényekben az állati tumorokhoz hasonló egyedfejlődési rendellenesség nem található. Ismeretes ugyan, hogy bizonyos növényfajokban előfordulnak tumorok, ezeket azonban specifikusan exogén ágensekkel történő fertőződés okozza, például Agrobacteriummal vagy egyéb patogénekkel történő fertőződés. Ennek ellenére a kukoricagenomból egy olyan polinukleotidot izoláltunk, mely váratlanul homológiát mutatott az emlős eredetű QM-génnel. Ezt a kukoricából származó polinukleotidot a leírásban QM_m-génnek fogjuk nevezni. Megklónoztunk egy QM-gént dohányból is (QM_T).

A kukoricaeredetű polinukleotid által kódolt fehérje egy egyedfejlődésben szerepet játszó fehérje (egyedfejlődési fehérje). Az egyedfejlődési fehérjék olyan fehérjék, melyek az egyedfejlődés során olyan szabályozószignálok hatására expresszálódnak, mint például a hormonok, valamint olyan fehérjék, melyek egyedfejlődésben szerepet játszó reakcióutakat szabályoznak. A növényekben található QM-gének éppen ezért alkalmasak az egyedfejlődés szabályozására, például a virágpor kifejlődésének szabályozására. A virágpor kifejlődésében bekövetkező rendellenességek hímsteril növények kialakulásához vezetnek. Az egyedfejlődési fehérjéket arról lehet felismerni, hogy képesek megváltoztatni a normális egyedfejlődés szerkezetét vagy működését.

- 11 A QM_m polinukleotidból előállított cDNS lényegében 800-950 nukleotidból áll, és egy nyílt leolvasási fázist (ORF), valamint szegélyező régiókat tartalmaz. Az ennek a génnek megfelelő emlőseredetű cDNS általában kevesebb, mint 800 nukleotid hosszúságú. A kukoricaeredetű cDNSben található egyetlen nyílt leolvasási fázis által kódolt polipeptid közelítőleg 220 aminosav hosszúságú. Más fajok esetén, például az emberekből izolált QM cDNS-ben, a nyílt leolvasási fázis kb. 214 aminosavhosszúságú QM fehérjecsaládot kódol. Általánosságban elmondhatjuk, hogy a növényi eredetű QM-géncsalád (QM_P) olyan fehérjét kódol, amely 200-250 aminosav hosszúságú primer szekvenciával jellemezhető, és az alábbiakban feltárt sajátságokkal rendelkezik.

Közelebbről a QM-géncsalád olyan fehérjecsaládot kódol, melyek a család tagjainak aminosav sorrendjében jelenlévő három konzervált régióval jellemezhetők. Egy kukoricaeredetű QM-fehérjében az első konzervált régió a fehérje aminoterminális végén található tíz aminosavat tartalmazza, a második konzervált régió az 50-60. aminosavakat tartalmazza, és ez a régió a QM-fehérjén belül amfipatikus hélixet alkot; a harmadik konzervált régió pedig a 98-135. aminosavak között található. Ez a három konzervált régió nagy mértékű homológiát mutat a megfelelő emlős eredetű fehérjék hasonló régióival. A leírásban használt értelemben a nagymértékű homológia kifejezés azt jelenti, hogy a megfelelő pozíciókban elhelyezkedő aminosavak legalább 80 %-ban homológok egymással, a szekvencia N-terminális vége vonatkozásában pedig azonosak.

A növényi QM-aminosavszekvenciák emlős eredetű megfelelőikkel teljes hosszúságukban általában legalább 50 % homológiát mutatnak. A nő-

- 12vényékből és emlősökből származó fehérjék közötti különbség elsősorban az N-terminálistól számított 135. aminosawal kezdődő és a C-terminálisig tartó régióban jelentős.

A kukorica QM-génben a konzervált régiókat kódoló szakaszok az Nterminális aminosavat kódoló nukleotidtól számítva közelítőleg a következő nukleotid pozíciókban találhatók: 30-100., 210-250. és 330-400. Az ezekből a régiókból készített hibridizációs próbák képesek hibridizálódni a megfelelő emlős eredetű QM-szekvenciákkal, sztringens hibridizációs körülmények között. A konzervált régiók szekvenciája alapján előállított oligonukleotid hibridizációs próbák alkalmasak új QM-gének kimutatására növényekben, kevéssé sztringens hibridizációs körülmények között, például 50 % formamid, 5xSSC-puffer (0,75 mól/1 NaCl) alkalmazásával, 37 °C-on. A szekvenciák teljes hosszát tekintve a kukoricaeredetű szekvencia kódoló régiója 64 %-os homológiát mutat a humán QM-szekvenciával.

A kódonok 3. pozíciójában történő lötyögés következtében elképzelhető, hogy egy, a teljes kódoló régióban 36 % divergenciát mutató szekvencia egy másik szekvenciához funkcionálisan hasonló fehérjét kódoljon. Egy fajon belül, amennyiben egy szekvencia egy másik szekvenciához viszonyítva három hasonló konzervált régiót kódol, feltételezhető, hogy a szekvencia funkcionálisan ekvivalens fehérjét kódol. Amennyiben különböző fajokhoz tartozó szekvenciákat hasonlítunk össze, ez nem feltétlenül igaz, mivel a fehérjék funkciója a fajokra jellemző biokémiai reakcióutakkal áll összefüggésben. Mindazáltal kijelenthetjük, hogy mind a növényi, mind pedig az emlős eredetű QM-fehérjék döntő befolyást gyakorolnak egyedfejlődési folyamatokra.

- 13 Kukoricapreparátumokon készített Northem-blot analízis kísérletekkel hat - de minden esetben legalább kettő - megkülönböztethető QMpolinukleotidot mutattunk ki. A találmány egy jellemző megvalósítási módját jelentő, kukorica-QM-fehérjét kódoló polinukleotidot mutatunk be az 1. ábrán. Az 1. ábrán látható nukleotidszekvenciának megfelelő aminosavsorrendet a 2. ábrán mutatjuk be. A bemutatott szekvencia alapján tervezett láncindító oligonukleotidokat használtuk fel a nyílt leolvasási fázis DNSének amplifikálására. A 2. igénypont szerinti nyílt leolvasási fázis DNS-ét láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk, a láncindítók szekvenciája a következő volt: baloldali: 5'-ATGGGCAGAA GGCCTGCTAGATGC; jobboldali: 5'-CAACGGCATCGAGGAAAGC CTTCC. A dohányban található homológ gén kimutatására alkalmas láncindító oligonukleotidok szekvenciája többek között a következő lehet: GCGAGATCTAAACCATGGGCAGAAGGCC, valamint GCGAAGCG GCCGCTTAAGCAACGGCATCGAGGAAAGCC. A dohány QM-gén dohánynemzetségből (sp. x (int ni) történő izolálásához PCR-oligonukleotidokat alkalmaztunk, valamint Taq-polimerázt (Perkin-Elmer), 55 °C-os hibridizációs hőmérséklet alkalmazásával, majd az amplifikált terméket BglII- és Notl-enzimekkel emésztettük, majd az emésztett fragmenst 0,8 %-os alacsony olvadáspontú agarózban elektroforetizáltuk, majd Bluescript-SK⁺vektorba szubklónoztuk, és azután megszekvenáltuk.

Egy izolált és tisztított növényi eredetű kukorica-QM-fehérje becsült molekulatömege 25 kD, pl-értéke pedig megközelítőleg 11,0. Amennyiben a cDNS-szekvenciából kikövetkeztetett szekvenciájú fehérjét rekombináns eljárások alkalmazásával szintetikusan állítjuk elő, a preparátum egyéb fe- 14hérj éktől mentes lesz. Az izolált és tisztított QM-fehérjék, valamint epitódjellegű fragmenseik alkalmasak ellenanyagok előállítására. Ezek az ellenanyagok pedig alkalmasak egyedfejlődési problémák diagnózisára, valamint növényi egyedfejlődési reakcióutak tanulmányozására. A QM-fehérje expressziójának helye és mértéke alkalmas arra, hogy meghatározzuk, hogy hogyan lehet megváltoztatni az egyedfejlődést. A QM-fehérjék ellen termeltetett ellenanyagok például alkalmasak arra, hogy meghatározzuk, hogy a fehérje a növény bizonyos sejtjeiben vagy szöveteiben termelődik-e. Az így szerzett információ alkalmas arra, hogy olyan eljárásokat fejlesszünk ki, melyek segítségével bizonyos egyedfejlődési reakcióutakat - beleértve a pollen kifejlődésével kapcsolatos reakcióutakat is - gátoljunk vagy fokozzunk. A szerzett információ arra is alkalmas, hogy például különleges sajátságokkal rendelkező, vagy hímsteril növényeket állítsunk elő.

Az izolált és tisztított QM-fehérjék alkalmasak a növényekben lejátszódó fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozására is. Ezekre a célokra jelzett fehérjepróbákat fejlesztünk ki. Előállíthatunk például egy QMfehérjét tartalmazó fúziós fehérjét E. co/z-sejtekben, ezt izolálhatjuk, megjelölhetjük, és felhasználhatjuk az egyedfejlődés során létrejövő fehérjefehérje kölcsönhatások tanulmányozására. Lásd például Smith és Johnson (1988), és Ron és Dressler (1992) közleményeit.

Előállíthatunk olyan rekombináns DNS-molekulát, amelyik a QMgént szensz-orientációban tartalmazza (azaz olyan orientációban, hogy a génről normális mRNS íródik át, és az ilyen molekulát templátként használhatjuk normális QM-fehérje transzlációjához), valamint tartalmaz egy olyan promótert, amely képes az említett DNS-transzkripcióját valamely növényi • ·

- 15 sejtben szabályozni. Előállíthatunk olyan rekombináns DNS-molekulát is, amelyik a QM-gént antiszensz orientációban tartalmazza. Ez a molekula a QM-gént ellentétes irányban klónozva tartalmazza, oly módon, hogy róla a mínusz vagy nem-kódoló szál íródjék át. Az ilyen molekuláról QMgéntermék nem transzlálódik, keletkezik viszont egy, a QM-mRNS-sel komplementer RNS-molekula, amelyik gátolja a növények saját QMmRNS-ének transzlációját, és ily módon csökkenti a termelődött QMfehérje mennyiségét.

Az említett konstrukcióban alkalmazott promóter lehet sejt vagy szövetspecifikus promoter, és ily módon a gén specifikus sejtekben vagy szövetekben fog expresszálódni. Például hímsteril növények előállítása esetén előnyösen portokspecifikus vagy tapetális promótert alkalmazunk. A találmány tárgyát képező TA39-promóterek alkalmasak promóterek. A portokszöveti és tapetális sejtek olyan szövetek és sejtek példái, melyek a virágpor kifejlődése szempontjából döntő fontosságúak. A portokszövet tartalmaz támasztósejteket és fejlődő mikrospórákat, és kilöki az érett virágport. A QM-génkonstrukció hatásos lehet a virágpor kifejlődésében, akár szensz akár antiszensz orientációban expresszálódik. Amennyiben a portokszövetben találhatók olyan gének és folyamatok, melyeket a QM-fehérje szabályoz vagy szabályozhat, a szensz orientációjú QM-konstrukció oly módon befolyásolhatja az egyedfejlődést, hogy megváltoztatja a QM-fehérje útján történő szabályozás időzítését, vagy megváltoztathatja az egyedfejlődési folyamatokat a QM-fehérje túltermelése folytán. Az elmondottak értelmében, amennyiben a QM-fehérje, vagy a QM-fehérje által szabályozott gének bármelyike a normális portokfejlődéshez esszenciális, az antiszensz őrien- 16tációjú QM-konstrukció expressziója oly módon változtathatja meg az egyedfejlődési folyamatokat, hogy gátolja a normális QM-expressziót.

A konstrukcióban alkalmazhatunk indukálható promótert is, és ily módon a konstrukcióban található szensz vagy antiszensz molekula expresszióját indukálószer alkalmazásával szabályozhatjuk. Ilyen indukálószerek lehetnek például a hormonszenzitív promóterek szabályozására használt növényi hormonok. Egy kukoricából izolált QM-promóter részleges szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. Az egyedfejlődési folyamatok befolyásolása különösen hasznos hímsteril növények előállítása vonatkozásában. Egy hímsteril növények előállítását célzó eljárás szerint úgy járhatunk el, hogy egy növényi sejtet olyan rekombináns molekulával transzformálunk, amely a növényi eredetű QM-fehérje génjét szensz orientációban tartalmazza, vagy pedig egy QM-gént célzó antiszensz molekulát tartalmaz. Az alkalmas promótert az egyedfejlődési folyamatok általunk választott szabályozási stratégiájának függvényében választjuk meg. Amennyiben például stratégiánk a QM-gén túltermeltetése portokszövetben, portokspecifikus promótert alkalmazunk. Hímsteril növényt oly módon állíthatunk elő, hogy a transzformált sejtet növénnyé regeneráljuk, hagyományos eljárások alkalmazásával.

Amennyiben egy adott növényfaj vonatkozásában rendelkezésünkre áll megfelelő regenerációs eljárás, lehetőség van a QM-génkonstrukciót tartalmazó transzgenikus növények azonos génkonstrukciót tartalmazó sejttenyészetből történő regenerálására. A leírás vonatkozásában a sejttenyészet kifejezés sejtaggregátumot, kalluszt, vagy ezek származékait jelenti, melyek tenyésztésre alkalmasak.

• «

- 17Növényeket regenerálhatunk transzformált sejtekből sejttenyészetekből vagy explantumokból, a leírásban feltárt és szakember számára közismert eljárások alkalmazásával. A regenerálási eljárások növényi fajonként változóak. A regenerált növényből vagy a regenerált növény és egy azonos fajhoz tartozó alkalmas növény keresztezése útján előállított utódból szakember számára ismert eljárások alkalmazásával magokat nyerhetünk.

Előállítunk hímsteril dohánynövényeket olyan dohánylevél explantumokból, melyeket akár szensz, akár antiszensz orientációjú QM_m-konstrukciókkal transzformáltunk. Ezeket az eredményeket valószínűleg azzal lehet magyarázni, hogy az exokén QM_m-gén expressziója felborította a dohány normális hím termékenységéhez szükséges egyedfejlődési egyensúlyt.

A leíráshoz csatolt ábrák, melyek minden tekintetben a leírás részét képezik, a találmány jelenleg előnyösnek tartott megvalósítási módjait ábrázolják. Az eddigiekben megadott általános leírással és a találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módjainak alábbiakban történő részletes kifejtésével együtt az alább részletezett ábrák a találmány szerinti megoldás alapelveit ismertetik.

Az 1. ábrán a 10-15-jelű cDNS-klón nukleotid szekvenciáját és az abból kikövetkeztetett aminosavsorrendet láthatjuk, amely kukoricaeredetű QM-homológot kódol.

A 2. ábrán aminosavsorrend összevető analízist láthatunk a kukoricaeredetű QM-homológ (felső szekvencia) és a humán QM-fehérje aminosavsorrendje között.

- 18Α 3. ábrán a kukoricából származó QM-promóter részleges nukleotidszekvenciáját láthatjuk.

A 4. ábra a pPHI3621-jelü plazmid térképe, mely plazmid tartalmaz egy szensz orientációjú QM_m-gént.

Az 5. ábrán a pPHI3622-jelű plazmid térképét láthatjuk, mely plazmid tartalmaz egy antiszensz orientációjú QM_m-gént.

A 6. ábrán a pPHI1285-jelű plazmid térképét láthatjuk, amely egy dohányban alkalmazható, szelektálható, BAR-gént tartalmazó plazmid.

A 7. ábrán a pPHI4722-elnevezésű plazmid térképét láthatjuk, amely antiszensz humán gént tartalmaz.

A 8. ábrán a pPHI4723-jelü plazmid térképét láthatjuk, amely szensz orientációjú humán gént tartalmaz.

A 9. ábrán a pPHI4719-jelű plazmid térképét láthatjuk.

A 10. ábrán a pPHI4720-jelű plazmid térképét láthatjuk.

All. ábrán a pPHI687-jelű plazmid térképét láthatjuk.

A 12. ábrán a pPHI610-jelű plazmid térképét láthatjuk.

A 13. ábrán a pPH460-jelű plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy uidA-gént.

A 14. ábrán a pPHI1952-jelű plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy uidA-gént.

A 15. ábrán a pPHI2525-jelű plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy uidA-gént.

A 16. ábrán a pPHI1527-jelű plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy luciferáz gént.

- 19Α 17. ábrán a pPHI3620-jelü plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy szensz orientációjú QM-gént.

A 18. ábrán a pPHI1493-jelü plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy GUS-gént.

A 19. ábrán a pPHI4745-jelű [TA39 (14B1)] plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy szensz orientációjú gént.

A 20. ábrán az L62-jelű [TA39(14B1)J plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy antiszensz orientációjú QM_m-gént.

A 21. ábrán a pPHI4855-jelü [TA39(8B3)] plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy GUS-gént.

A 22. ábrán az L59-jelű [TA39(8B3)J plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy szensz orientációjú QM_m-gént.

A 23. ábrán az L61-jelű [TA39(8B3)J plazmid térképét láthatjuk, amely tartalmaz egy antiszensz orientációjú QM_m-gént.

A 24. ábrán a TA39(8B3)-promóter nukleotidszekvenciáját láthatjuk.

A 25. ábrán a TA39(14Bl)-promóter nukleotidszekvenciáját láthatjuk.

A találmány tárgyát eljárások és készítmények képezik, az egyedfejlődési folyamatok megváltoztatására növényekben. Szintén a találmány tárgyát képezi egy konstitutívan expresszálódó humán gén növényi eredetű homológja, mely humán génről feltételezik, hogy szerepet játszik a nemtumoros állapot fenntartásában, és amelyről kimutatták, hogy Wilmstumoros sejvonalakból hiányzik. Ezt a gént - amely emberekben és rágcsálókban egy géncsalád formájában van jelen - számos különböző emlösforrásból kimutatták. A találmány szerinti megoldás kidolgozásakor kukoricá• «· *·· ··

-20ból és dohányból megklónoztunk egy gént, amely olyan fehérjét kódol, mely nagy mértékben homológ a humán QM-fehérjével (közelítőleg 67 %-ban). A kukoricából származó gén egy 25 kD molekulatömegű polipeptidet kódol, amelyben a bázisos oldalláncú aminósavak a fehérje összes aminosavának 22 %-át teszik ki. Ez a gén valamennyi Northem-blot analízissel vizsgált kukoricaszövetben kifejeződik, és egy növényi géncsalád tagja.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás hímsteril növények és hibridmagok előállítására. A találmány tárgyát képezik továbbá a hímsteril sajátság kialakításához használt genetikai anyagok, valamint a találmány szerinti eljárással előállított termékek, közelebbről hímsteril sajátságot hordozó genetikailag transzformált növények, hímsteril növények és olyan hibrid magok, melyeket az ilyen hímsteril növényeknek hímtermékeny növényekből származó virágporral történő beporzása útján állítunk elő.

Az 1. ábrán a 10-15-jelű klón nukleinsav szekvenciáját, valamint az abból kikövetkeztetett aminosavsorrendet látjuk. A cDNS-klón hosszúsága 936 nukleotid volt, és egyetlen nyílt leolvasási fázist tartalmazott, amely egy 25138 dalion molekulatömegű polipeptidet kódol. Ez a polipeptid rendkívül bázisos és számított pl-értéke 11,0, a bázisos oldalláncú aminósavak a fehérje teljes hosszában elszórva találhatók. Korábban jellemzett génekkel oly módon kerestünk homológiát, hogy a 10-15-jelű klón által kódolt aminosavszekvenciát a TFASTA számítógépes program alkalmazásával [Genetic Computer Group (GCG, Devereux és mtsai., 1984)] alkalmazásával összevetettük a GenBank adatbázisban található szekvenciákkal. Ez az analízis a humán QM-gén vonatkozásában 716-os értéket adott. Amennyiben a 10-15-jelű klón által klónolt aminosavsorrendet egymás alá illesztjük a ♦ · ··

-21 humán gén aminosavsorrendjével (2. ábra), néhány érdekes régiót figyelhetünk meg. Az első feltűnő tény az aminoterminális régiók nagymértékű konzerváltsága, ahol az első 10 aminosav konzervált. A második régió, amelyik szintén konzervált a két fehérjében, az 50. és 61. aminosavak között található, és ez a régió feltehetőleg amfipatikus hélixet képez. Található a fehérjékben egy harmadik konzervált régió is, a 98. és 135. aminosavak között.

A három erősen konzervált régió megléte alapján feltételezhetjük, hogy az összesen 59 aminosav hosszúságú erősen konzervált aminosavakat tartalmazó régiók arra utalnak, hogy ezeken a régiókon belül a fehérjék funkciója is azonos. A karboxiterminális régió kevéssé konzervált, és feltételezhető, hogy a fehérjék funkciója szempontjából nem olyan jelentős. Hétnapos kukorica magoncok levél- és gyökérszöveteiből izolált RNS-en végrehajtott Northem-blot analízissel kimutattuk, hogy a 10-15-jelű kiónban található cDSN mindkét szövetben expresszálódik, és az expresszió szintje közel azonos a gyökérben és a levelekben. További Northem-blot analízissel megállapítottuk, hogy ez a gén expresszálódik a portokokban és az oldalhajtásokban is. Southem-blot analízissel kimutattuk, hogy a kukoricából származó homológ egy kisméretű géncsalád tagja, mely családnak a kukoricában összesen kb. 4-6 tagja van.

Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk részletesebben ismertetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

·· ·

1. példa

A dohánynövénvek normális egyedfejlődésének megzavarása QM_m-génnel végzett transzformáció útján

Dohánymagokat (cv. xanthí) steril körülmények között csíráztattunk. 7-10 napos fényben 28 °C-on végzett inkubáció után a szikleveleket és az első leveleket steril körülmények között eltávolítottuk és négy részre vágtuk őket (kb. 1-2 mm-es négyzet alakú darabokra) és a darabkákat steril szűrőpapírra helyeztük, melyet előzőleg 0,25 mól/1 szorbitolt tartalmazó táptalajjal telítettünk. Ezután a szűrőpapírokat 28 °C-on sötétben inkubáltuk egy éjszakán át. A következő reggel a szövetdarabkákat Holisztikus berendezés alkalmazásával bombáztuk, és ily módon a QM-konstrukciókat (pPHI3621: szensz konstrukció, 4. ábra, vagy pPHI3622: antiszensz konstrukció, 5. ábra), és egy szelektálható markergént (BAR-gén) hordozó plazmidot egyenlő arányban tartalmazó eleggyel transzformáltuk a sejteket. Öt bombázás alkalmával összesen 0,1 pg DNS-t juttattunk be.

A bombázást követően a szövetet sötétben tovább inkubáltuk 28 °Con. 48 órával a bombázást követően a szövetdarabkákat szelekciós táptalajra (BASTA) helyeztük, majd fényben 28 °C-on inkubáltuk őket. Kb. 2 hét elteltével kis kolóniák kezdtek megjelenni, és kb. egy héten keresztül újabb kolóniák jelentek meg. A levéldarabkákat ezután regenerációs táptalajra helyeztük át, amely lehetővé tette, hogy levelek és csíranövények alakuljanak ki. A csíranövények kialakulása után a fiatal csíranövényeket gyökereztető táptalajra helyeztük, hogy lehetővé váljék a gyökérképződés. Kb. 1-2 hét elteltével a növényeket elültettük és üvegházba helyeztük.

-23A pPHI3621-plazmidban (4. ábra) található szensz konstrukcióval végrehajtott transzformáció nem eredményezett olyan sok kolóniát, mint a kizárólag kontrollplazmiddal végzett transzformáció (amely kizárólag a szelektálható markert tartalmazta). Valójában sok kolónia alakult ki, melyek a későbbiekben elpusztultak. Azok a kolóniák, melyek életben maradtak, sokkal lassabban növekedtek, mint a kontroll növények. A kolóniákból kialakult legtöbb túlélő kalluszból nem keletkeztek növények. A legtöbb olyan kallusz esetén, amelyből növény keletkezett, megfigyelhető volt, hogy a növény a kallusznak egy elkülöníthető részéből keletkezett, ami arra utal, hogy ez egy revertáns szektor volt (olyan sejteket tartalmazott, melyekből elveszett a plazmid). PCR-analízissel kimutattuk, hogy a keletkezett növények nem tartalmazták a kukorica-eredetű gént. A kalluszok megfigyelése útján megállapítottuk, hogy azok nem voltak képesek merisztémát képezni vagy szervezni, amiből növény keletkezhetett volna. Találtunk egy olyan növényt, amelyik annak ellenére, hogy tartalmazta a kérdéses plazmidot, életképesnek bizonyult. Mindazáltal ez a növény rendkívül lassan növekedett, és nem hozott gyökereket az üvegházba történő kiültetés időpontjáig. Az üvegházban rendkívül lassan növekedett egy bizonyos ideig (körülbelül egy hónapon keresztül), azután viszont normális sebességgel kezdett növekedni és normális megjelenésű volt. Ez a növény kivirágzott és magot is hozott a normális növényekhez hasonló módon, mindazáltal a benne keletkezett magok abnormális kinézetűek voltak, és csíráztatási vizsgálat során kiderült, hogy több, mint két hétre van szükségük a kicsírázáshoz, ez az idő normális magok esetén 4-6 nap.

-24Az antiszensz konstrukcióval (pPHI3622, 5. ábra) bombázott szövetekből kifejlődött kalluszok teljesen eltérő növekedési sajátságokat mutattak. Több esetben az ilyen kalluszok jelentősen nagyobb sebességgel növekedtek, és nagymértékű vegetatív növekedést mutattak. Ezekből a kalluszokból közel normális arányban keletkeztek növények. Ezek a növények a kontrolinövényekhez viszonyítva gyorsabban regenerálódtak és gyorsabban hoztak gyökereket a gyökereztető táptalajon. A keletkezett növények megjelenése normális volt, kivirágoztak és normális módon magot hoztak. A keletkezett magok normálisan csíráztak, és a növények megjelenése is normális volt.

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a QM-gén szerepet játszik az egyedfejlődésben. A transzformált dohánynövényben a QM-gén jelenléte nagy valószínűséggel gátolja a merisztéma-kialakulást. A QM-gének, amennyiben expresszálódnak, lehetséges, hogy fixálják a sejteket egy bizonyos egyedfejlődési stádiumban. Amennyiben a QM-gén bekapcsolódik, a sejt a továbbiakban nem fog differenciálódni. A gén túltermelődése dohánykalluszokban meggátolta a merisztéma-kialakulást, és így a növények kialakulását. Nagyobb koncentráció esetén a túltermelődés feltehetőleg halálos lehet.

Az antiszensz molekulákat hordozó konstrukciókat tartalmazó növényi sejtek képesek voltak növekedni, néhány esetben a kontrollsejteknél gyorsabban. Ezeket az eredményeket úgy lehet értelmezni, hogy az antiszensz molekula leállította a dohány saját QM-géntermékének hatását, és ily módon lehetővé vált, hogy a differenciálódás kömiyebben következzék be és a kalluszon levelek sokasága keletkezzék. A fent ismertetett kísérletet háromszor megismételtük és valamennyi kísérlet során lényegében hasonló

V

-25 megfigyeléseket tettünk. A megfigyelt eredmények értelmezhetők úgy, hogy a QM-fehérje talán represszormolekulaként működik (lásd: Monteclaro és mtsai.: (1993)].

2. példa

A mikrospóra-specifikus génexpresszió kimutatása in situ hibridizációval

Az alábbi példában egy olyan eljárást ismertetünk, melynek alkalmazásával kimutatható, hogy egy izolált DNS-molekula tartalmaz-e olyan gént, amely mikrospóra specifikusan expresszálódik. Közelebbről, az alábbiakban bemutatott eredmények azt demonstrálják, hogy egy bizonyos dohány eredetű cDNS-klónról átíródó mRNS-ek expressziója a dohány portokok mikrospóráiba lokalizálható. A leírás szerinti értelemben a mikrospóraspecifikus kifejezés bármely sejtben vagy szövetben történő génexpressziót jelöl, amely a virágpor kifejlődése szempontjából létfontosságú. Az ilyen sejtek és szövetek példáiként megemlíthetjük a portokokat és a tapetumot.

A TA39-jelű portokspecifíkus dohány cDNS-klónt dr. Róbert B. Goldbergtől kaptuk (Department of Biology, University of Califomia, Los Angeles, Kalifornia). Ezt a kiónt arra használtuk, hogy kinyerjük belőle a TA39-promótert, melyet a QM-génnel kívántunk használni (lásd 3. példa). Ez a cDNS képes hibridizálódni a dohány portokokból izolált mRNS-hez, de nem hibridizálódik a termőből, sziromból, levélből vagy szárból izolált mRNS-írakcióval [Koltuhow és mtsai. (1990)]. A cDNS 490 bázishosszúságú is tartalmaz egy 42 bázishosszúságú poli-A-farkat. Ez a cDNS portokokból izolált RNS-en végrehajtott Northem-blot kísérletben egy 550 bázisos és egy 680 bázisos transzkriptumhoz hibridizálódik. RNS dot-blot ki-26sérletekkel kimutattuk, hogy a TA39-el hibridizálódó transzkriptumok azonos időbeli mintázat szerint halmozódnak fel és csökken a mennyiségük, mint 5 másik portokspecifikus transzkriptumé, melyek közül mindegyik a tapétumba lokalizálható [Koltunow és mtsai. (1990)].

Nicotinia. tabacumból (cv KylT) portokokat gyűjtöttünk be a tetrád fázisban, és a portokokat szokásos citológiai eljárások alkalmazásával kezeltük [Berlyn és mtsai. (1976)]. A portokokat t-butanolban dehidratáltuk, parafinba ágyaztuk őket, majd 8 pm vastagságú metszeteket készítettünk belőlük, és tárgylemezre rögzítettük őket. A TA39-jelű és egyéb cDNSklónokból (LA2: egy epidermisz-specifikus mRNS klón) izolált plazmidokból kihasítottuk a megfelelő DNS-fragmenseket, gélelektroforézis alkalmazásával megtisztítottuk őket, majd a BioNick Labeling System (BRL) reagenskészlet alkalmazásával a fragmenseket biotin-14-dATP felhasználásával nick-transzlációs eljárással megjelöltük a fragmenseket, a gyártó előírásának megfelelően. Ezután a fixált portok metszeteken in situ hibridizációt hajtottunk végre, a biotinnal jelölt hibridizációs próbák alkalmazásával, és a detektálást a BRL-által forgalmazott DNA Detection System reagenskészlet alkalmazásával végeztük. Ez a reagenskészlet úgy működik, hogy a biotiniált DNS-próbához sztreptavidint kötünk, majd biotiniált alkalikus foszfatázt, és a kimutatási reakció eredménye az lesz, hogy azokban a sejtekben, ahol a hibridizációs próba hibridizálódik a célpont szekvenciához, nitroblue tetrazolium csapódik ki.

Az in situ hibridizációs analízis eredményeinek vizsgálatával megállapítottuk, hogy a vizsgált mintákban a portokok rekeszei tetrád állapotú mikrospórákat tartalmaztak. A TA39-DNS-sel hibridizált portokmetszetek-27 ben a tetrazólium festék kizárólag a tetrátokban halmozódott fel. Ezzel szemben azon metszetek esetén, melyeket a kontroll-DNS-sel (LA2) hibridizáltunk, a festék az epidermikus rétegben halmozódott fel. Ezzel a szövetspecifikus kontrollal azt mutattuk ki, hogy a TA39-DNS-sel hibridizált portokmetszetek esetén a mikrospórákban tapasztalt festékkicsapódás nem annak a következménye, hogy a mikrospórák esetleg aspecifíkusan visszatartanák a jelzett DNS-t vagy a kimutatáshoz használt reagenskészlet valamely komponensét.

3. példa

Mikrospóra-specifikus mRNS-hez homológ szekvenciákat tartalmazó T38 genomi kiónok izolálása, T39-promóterek

Ebben a példában egy olyan eljárást ismertetünk, ami lehetővé teszi bármely olyan mikrospóra-specifikus mRNS-sel homológ szekvenciákat tartalmazó genomi DNS-klónok izolálását, mely mRNS-sel hibridizálódó nukleinsavpróba rendelkezésünkre áll. Az alábbiakban ismertetett eljárás alkalmas arra, hogy bármely növényi fajból mikrospóra-specifikus szabályozó szekvenciákat izoláljunk, abban az esetben, ha rendelkezésünkre áll olyan hibridizációs próba, amely homológ az illető faj egy mikrospóra-specifikus mRNS-ével.

A dohányból izolált portokspecifikus cDNS-klónt, a TA39-klónt Dr. Róbert Goldberg-től kaptuk (UCLA). A TA39-DNS azonos időbeli mintázat szerint hibridizálódik a portokokból izolált mRNS-frakcióhoz, mint néhány más tapétumspecifikus transzkriptum [Kultunow és mtsai. (1990)].

-28In situ hibridizációs kísérletekkel kimutattuk, hogy a TA39-el hibridizálódó szekvenciák kis mennyiségben jelen vannak a mikrospórákban és a kötőszövetben a -1-től +l-ig terjedő fázisokban, majd nagyobb mennyiségben jelennek meg a tapétumban, az 1. fázistól kezdődően egészen a 6. fázisig [Goldberg és mtsai. (1993)].

Egy kiválasztott növény genomi könyvtárát - például a kereskedelmi forgalomban beszerezhető N. tabacum var. NK326 (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, Califomia, katalógusszám: FL1070D) változatból izolált DNS-fragmensekből részleges Mbol emésztéssel és EMBL-3 plazmidba történő klónozással előállított könyvtárat - átvizsgáltunk olyan klónokból izolált DNS-sel, melyek homológiát mutattak a TA39-cDNS-klónnal. Szokásos hibridizációs eljárásokat alkalmaztunk, melyek leírása megtalálható például Sambrook és mtsai. (1989) kézikönyvében. A szűrővizsgálat során pozitívnak mutatkozó kiónokat három ciklusban tisztítottuk, oly módon, hogy fölvettük a plakkokat, újraszélesztettük őket, majd az így kapott kiónokat a TA39-cDNS ínszertjével ismét hibridizációnak vetettük alá, és az eljárást addig ismételtük, míg vagy egyöntetűen hibridizálódó vagy egyöntetűen nem-hibridizálódó kiónokat kaptunk.

Az ismertetett eljárással a TA39-cDNS-klónnal rokon két egymástól megkülönböztethető dohány DNS-klóncsaládot azonosítottunk, és mindkét családot két-két átfedőklón reprezentálta. Mindkét családból kiválasztottunk egy-egy kiónt részletes jellemzés céljára, ezeket a kiónokat 8B3- (24. ábra) és 14B1-kiónnak (25. ábra) neveztük el. Ezekben a genomi kiónokban a TA39-el homológ régiókat, valamint az ezektől közvetlenül 5'- és 3'-29irányban elhelyezkedő régiókat restrikciós enzimek alkalmazásával és DNShibridizációval feltérképeztük.

Ezeket a kódoló szekvenciákat és a hozzájuk kapcsolódó 5'-végi feltételezett szabályozó régiókat szubklónok formájában izoláltuk, majd szekvenálás céljából tovább szubklónoztuk őket. Tehát mindegyik genomi kiónból átfedő deléciósorozatot készítettünk exoIII és mung bean nukleáz alkalmazásával, mely enzimeket a Stratagene cégtől szereztünk be, reagenskészlet formájában. Az átfedő deléciósorozatot a Sanger-féle didezoxi-láncterminációs eljárás alkalmazásával szekvenáltuk meg, automatikus DNS-szekvenátorban (Applied Biosystems 373A) az Iowai Állami Egyetem Nucleid Acids Facility intézetében. Összehasonlítás céljából a TA39-cDNS inszertjét is megszekvenáltuk. Abban a régióban, amelyben a TA39-cDNS homológ egy mikrospóra-specifikus mRNS-sel, a 8B3-jelű genomi klón tökéletesen homológnak bizonyult a TA39-DNS-sel, míg a 14B1 megfelelő régiója körülbelül 90 %-ban bizonyult homológnak a TA39DNS-sel.

A 14B1- és 8B3-jelű genomi kiónok esetében a transzkripciós startpontot láncindító oligonukleotid meghosszabbításos kísérlettel térképeztük fel és a transzkripciós startpontja mindkét klón esetében ugyanarra a nukleotidra térképeződött, amely a feltételezett transzlációs starthelytől 5'irányban 83 bázispámyira volt található.

Mindkét klón esetében a feltérképezett transzkripciós starthelytől 31 bázispámyira 5'-irányban egy-egy tökéletes TATA-boxot találtunk, valamint találtunk egy-egy teljes, 110 aminosavat kódoló fő nyílt leolvasási fázist, a transzkripciós starthelytől 3'-irányban, mind a két klón esetén (azaz a nyílt

-30leolvasási fázisok a transzkripciós iniciációs helyhez viszonyítva a +83. pozícióban kezdődtek). Mindkét kiónban találtunk poliadenilációs szignált, sorrendben 29 és 37 bázispámyira 3'-irányban a transzlációs stop-kódontól, a 14B1- és 8B3-klón esetén.

4. példa

Egy mikrospóra-specifíkus genetikai szabálvozószekvencíát tartalmazó DNS-szegmens izolálása

Azonosíthatunk további hibridizációs próbaként alkalmazható cDSNklónokat oly módon, hogy a kiónokat a TA39-szekvencia egy részletét tartalmazó oligonukleotid hibridizációs próbával hibridizáljuk, majd a hibridizálódó kiónokat megszekvenáljuk, hogy meghatározzuk hogy a klón teljes szekvenciájának mekkora része azonos a TA39-jelü cDNS-klón szekvenciájával. Ebből a célból előnyösen sztringens hibridizációs körülményeket alkalmazunk. Bár a találmány szerinti megoldás vonatkozásában sztringens hibridizációs körülményeket a szakirodalomból ismert számos módon teremthetünk, például: J. Sambrook (1989), megadjuk egy bizonyos sztringens hibridizáció körülményeit, melyet a példák szerinti szabályozó szekvenciák izolálásakor alkalmaztunk: a kezdeti hibridizációs reakciót körülbelül 12 óráig végeztük, körülbelül 65 °C-on, 6x SSP-pufferben, amely 0,1 % SDS-t is tartalmazott, majd körülbelül 65 °C-on 0,1 % SDS-t tartalmazó egyszer SSC-oldattal mosást végeztünk, majd szobahőmérsékleten végzett mosás következett, 0,1 % SDS-t tartalmazó 0,2x SSC-oldattal.

Azon cDNS-klónok esetében, melyek a TA39-klónnal csak részben homológok, például a nem dohányból izolált cDNS-klónok esetében oly

-31 módon dönthető el, hogy az az mRNS, amelyből az illető cDNS-klón származik mikrospóra-specifikus-e vagy sem, hogy időben - vagy pontosabb módon térben - vizsgáljuk az adott mRNS hímnemű virágszövetekben történő expresszióját. Ilyen eljárások leírását megtalálhatjuk például a Kultonow és mtsai. (1990), valamint Domon és mtsai. (1990) által megadott analitikai módszerek között, melyek napraforgóból (Hehanthus annuus) származó portokspecifikus cDNS-klónokat írnak le; vagy Róbert és mtsai. (1991) közleményében, amely olyan Brassica napus mRNS-t ír le, mely a közlemény szerint specifikusan fejlődő mikrospórákban expresszálódik; vagy Scott és mtsai. (1991) közleményében, mely közleményben megtalálhatjuk fejlődő portokokból előállított cDNS-könyvtárak leírását, valamint tapétumspecifíkus és mikrospóra-specifíkus cDSN-klónok izolálásának módját; valamint Albani és mtsai. (1990) közleményében, amely a Brassica napus-bói származó virágpor-specifikus géncsaládot ír le, amely a korai mikrospóra fejlődési fázisban aktiválódik.

A TA39-klón által kódolt mikrospóra-specifikus mRNS-sel hibridizálódni képes próba lehet bármilyen polinukleotid, DNS- vagy RNS-molekula, egy- vagy kétszálú nukleinsavmolekula, melynek fizikai sajátságai lehetővé teszik, hogy olyan DNS-molekulához hibridizálódjon, amely a TA39-klón által kódolt aminosavszekvenciát kódolja. Azok az általános követelmények, melyeket egy hatékony nukleinsav hibridizációs próba teljesítenie kell - beleértve a méretet, a bázisösszetételt és a homológia mértékét - szakember számára jól ismertek. Lásd például J. Sambrook és mtsai. (1989) kézikönyvét. Mindazáltal, amennyiben olyan DNS-t kívánunk izolálni, melynek szekvenciája nem azonos a hibridizációs próba szekvenciájával, előnyösen

-32·· ·· ·· ·· • · · · · « • · · ··· ·· • · · · olyan hibridizációs próbát alkalmazunk, amely egy mikrospóra-specifikus mRNS-ből származó cDNS-molekula legalább egyik szálát teljes hosszában tartalmazza. Az ilyen teljes hosszúságú hibridizációs próbának jobb esélye van valamely homológ DNS-molekula kimutatására, mint az olyan hibridizációs próbának, amely csak az mRNS-ből származó szekvencia egy részletét tartalmazza. Ez azért van így, mert egy adott mRNS-szekvencia bármely részlete lehet kevésbé konzervált az adott mikrospóra-specifikus génben, mint az mRNS-szekvencia egyéb részei, akkor is, ha a keresett gének azonos növényfajból származnak, mint a rendelkezésre álló mRNS-szekvencia, és akkor is, ha más fajokból.

A mikrospóra-specifikus genetikai szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS-szegmens izolálását célzó eljárás tartalmaz továbbá egy olyan lépést, mely szerint izoláljuk a növény genomi DNS-ének egy vagy több olyan fragmensét, amely hibridizálódik a fent leírt nukleinsav hibridizációs próbával a sztringens hibridizáció szokásos körülményei között. Izolálhatunk ilyen fragmenseket ugyanabból a növényfajból, melyből az az mRNS származik, melynek alapján a hibridizációs próbát előállítottuk, de izolálhatunk ilyen fragmenseket egyéb zárvatermő fajokból is. A találmány szerinti mikrospóra-specifikus genetikai szabályozószekvenciák izolálására alkalmas eljárás vonatkozásában alkalmas növények például mind az egyszikűek, különösen a gabonafélék, például a kukorica, mind pedig a kétszikűek, például a canola és a napraforgó.

A feltételezhetően mikrospóra-specifikus szabályozószekvenciákat tartalmazó vizsgálandó DNS-fragmenseket tipikusan olyan vektorban történő klónozással állítjuk elő, melyek alkalmasak olyan nagyméretű genomi

-33DNS-fragmensek szűrővizsgálatára, melyek tartalmaznak nyílt leolvasási fázisokat és velük kapcsolatban álló szabályozószekvenciákat. Növényi genomi DN-könyvtárak előállítására és hibridizációs átvizsgálására vonatkozó eljárásokat találhatunk például a következő közleményekben: Albani és mtsai. (1991), mely közlemény Brassica napus géneket ír le; Brown és mtsai. (1990), mely közlemény Oenothera organesis géneket ír le; Guerrero és mtsai. (1990), valamint Hamilton és mtsai. (1990), mely közlemények kukoricagéneket írnak le; valamint Twell és mtsai. (1989), mely közlemény paradicsomból izolált portokspecifikus géneket ír le. Eljárhatunk úgy is, hogy kereskedelmi forgalomban beszerezhető növényi genomi cDNSklónokat tartalmazó könyvtárat szerzünk be és azt szűrő vizsgálatnak vetjük alá.

A találmány szerinti hibridizációs próbákkal hibridizálódó növényi genomi DNS-fragmensek nukleotid szekvenciáját szokásos DNSszekvenálási eljárásokkal határozhatjuk meg. Az így meghatározott szekvenciákat azután megvizsgáljuk abból a szempontból, hogy tartalmaznak-e olyan DNS-szegmenst, amely képes hibridizálódni. A hibridizációs próbával, annak egy olyan szekvenciarészlete mentén, amely legalább egy teljes nyílt leolvasási fázis 5'-végét kódolja. A nyílt leolvasási fázisnak ezt az 5'végét egy transzlációs startkódon jelzi, amelyet egy nyílt leolvasási fázist tartalmazó szekvenciarészlet követ, amely képes hibridizálódni a találmány szerinti hibridizációs próbával.

A mikrospóra-specifikus szabályozószekvenciák izolálására alkalmas genomi DNS-fragmens tartalmaz továbbá egy második DNS-szegmenst, amely tartalmaz egy olyan szekvenciát, amely szomszédos a teljes nyílt leol-

-34vasási fázis 5'-végével, és amely szekvencia képes a próbával hibridizálódni. Ebben a szövegösszefüggésben a teljes nyílt leolvasási fázis 5'-végével szomszédos szekvencia kifejezés valamely szekvencia bármekkora részletét jelenti, amely a találmány szerinti genomi DNS-ffagmensen található nyílt leolvasási fázistól 5'-irányban helyezkedik el. Általában azok a szabályozó szekvenciák, melyek egy velük szomszédos nyílt leolvasási fázis expresszióját szabályozzák, elhelyezkedhetnek az adott nyílt leolvasási fázistól néhányszáz bázispáron belül, azonban bizonyos esetekben, bizonyos szabályozó elemek, melyek szomszédosak egy nyílt leolvasási fázissal, az adott leolvasási fázistól néhány kilobázisnyi távolságban is elhelyezkedhetnek. Mindenesetre a találmány szerinti genomi DNS-fragmens által kódolt mikrospóra-specifikus mRNS-eredetű szekvenciákkal szomszédos szekvenciák vonatkozásában az ilyen genomi DNS-fragmensen található második szegmens szekvenciái feltételezhetően mikrospóra-specifikus szabályozó szekvenciákat tartalmaznak.

A mikrospóra-specifikus szabályozó szekvenciákat tartalmazó DNSszegmens izolálására szolgáló eljárás tartalmaz továbbá egy lépést, amelyben a genomi DNS-fragmens valamennyi második DNS-szegmensét ellenőrizzük, hogy képes-e valamely funkcionálisan hozzákapcsolt DNSszekvencia mikrospóra-specifikus expresszióját indukálni. Ez az említett lépés, amelyben a feltehetően mikrospóra-specifikus szabályozó szekvenciákat tartalmazó szegmenseket ellenőrizzük, a működőképes mikrospóraspecifikus genetikai szabályozó szekvenciákat tartalmazó DNS-szegmensek azonosítását szolgálja, mely szegmensek alkalmasak a találmány szerinti • ·

-35transzgenikus növényekben heterológ szekvenciák mikrospóra-specifíkus szabályozással történő genetikai manipuláció útján való ellátására.

A feltételezhetően mikrospóra-specifíkus szabályozó szekvenciák tesztelése oly módon történik, hogy egy alkalmas “riporter”-szekvenciát funkcionálisan hozzákapcsolunk a feltételezhetően mikrospóra-specifíkus szabályozó szekvenciához, és vizsgáljuk a riportergén expresszióját mikrospórákban és egyéb szövetekben. Az alkalmas riporterszekvenciával szemben az az általános követelmény, hogy a szekvencia expressziója könnyen kimutatható legyen a mikrospórákban, vagy származékos szövetekben (például virágpor-szövetekben), csakúgy mint egyéb szövetekben (például levelekben), ahol a mikrospóra-specifíkus szabályozó szekvenciák nem szabad, hogy indukálják a funkcionálisan hozzájuk kapcsolt riportszekvencia expresszióját.

5. példa

A genomi cDNS-klónok feltételezett szabályozó szekvenciáihoz funkcionálisan kapcsolt heterológ gének mikrospóra specifikus expresszióiának tesztelése

Ez a példa a genomi cDNS-klónok mikrospóra-specifíkus szabályozó régióinak alkalmazását mutatja be heterológ riportergének mikrospóraspecifíkus szabályozására, tranziens génexpressziós vizsgálati eljárásban.

A 8B3-jelű (24. ábra) és a 14Bl-jelű (25. ábra) feltételezett promótereket egyenként egy riportergénnel (uidA) fuzionáltattunk, amely a béta-glükoronidázt (GUS) kódolta, mely riportergént a konstrukciókban a paradicsomból származó proteináz-II (pinll) génjének 3'-végi nem ···

-36transzlálódó régiója követte. Az egyik konstrukcióban, amelyik transzlációs fúziót tartalmazott, mindkét promótert úgy klónoztuk, hogy a konstrukcióba bekerült a hozzáférhető szekvencia legelső nukleotidjától a transzlációs startnukleotidig (+83) terjedő szekvenciarészlet. Egy másik konstrukcióban, amelyet transzkripciós fúziónak neveztünk el, a promótereket a hozzáférhető legelső 5'-irányú nukleotidtól kezdődően a transzkripció startpontját pontosan megelőző szekvenciákig klónoztuk (+4. nukleotid). Az utóbbi konstrukciók tartalmazták a dohánymozaik vírus (ómega') nem-transzlálódó szignálszekvenciáját is, a promoter és az uidAszekvenciák között. Előállítottunk olyan transzlációs génfuziókat is, melyek hasonlóak voltak a GUS-riportergénnek létrehozott fúziókhoz, azzal az eltéréssel, hogy egy másik modell-gént, a szentjánosbogár luciferáz génjének kódoló szekvenciáját alkalmaztuk.

Az uidA géníúziós konstrukciókat tranziens expressziós rendszerben vizsgáltuk, 3-4. fázisú dohány (v. Petite Havanci) portokszeleteken, melyeket 1,8 pm átmérőjű volfrám-részecskékkel bombáztunk, részecskeágyú alkalmazásával, mely részecskékre előzőleg DNS-t csaptunk ki. Lásd például: Twell és mtsai. (1989) közleményét. Minden egyes lövés 0,5 pg DNS-t tartalmazott. A portokszeleteken és a mikrospórákon egyenként sötétkék foltokat figyeltünk meg, ami arra utalt, hogy a mikrospórákban lejátszódott a GUS-gén tranziens expressziója. Nem tudtuk megállapítani, hogy azok a foltok, melyeket alkalmanként a portokok felszínén figyeltünk meg, portoksejtektől származtak-e, vagy esetleg szétszóródott mikrospóráktól. Mindazáltal további tesztekben kimutattuk, hogy amennyiben izolált mikrospórákat és leveleket vizsgáltunk, a tranziens expressziót az uidA és

-37luciferáz génfúziók esetében a mikrospórákban lehetett megfigyelni. A luciferáz gént konstrukciókkal végrehajtott tranziens vizsgálati eljárásokkal kimutattuk, hogy levéldarabkákban a mikrospóra-specifikus szabályozó szekvenciák nem idéztek elő génexpressziót, mivel expresszió még a legérzékenyebb hozzáférhető detekciós rendszer alkalmazásával sem volt kimutatható (luciferáz által katalizált lumineszcens detekciós rendszer).

6. példa

Rovarellenes hatású vagy hímsterilitást okozó gének mikrospóra-specifikus expressziói át lehetővé tévő genetikai konstrukciók előállítása

Ebben a példában olyan génsebészeti eljárásokat mutatunk be, melyek alkalmasak olyan konstrukciók előállítására, melyek heterológ gének mikrospóra-specifikus expresszióját teszik lehetővé, például olyan génekét, melyek rovarellenes hatásúak, vagy hímsterilitást idéznek elő, transzgenikus növényekben.

Abból a célból, hogy kívánt gének mikrospóra-specifikus expresszióját lehetővé tévő konstrukciókat állítsunk elő - kívánt gén lehet például valamely kiválasztott rovarellenes hatású gén vagy hímsterilitást előidéző gén - úgy járunk el, hogy valamely találmány szerinti mikrospóraspecifikus szabályozó szekvenciát tartalmazó génszegmenst funkcionálisan egy heterológ génhez kapcsolunk, valamint szükség esetén 3'-végi nemtranszlálódó szekvenciákhoz, és ily módon a kiválasztott heterológ gén vonatkozásában alkalmas transzlációs és transzkripciós szabályozást biztosítunk. A szabályozó szekvenciákat a heterológ génszekvenciákhoz fuzionáltatjuk, például oly módon, hogy módosítjuk a heterológ gént kódoló nyílt

-38leolvasási fázis kezdetét úgy, hogy az tartalmazza egy restrikciós enzim hasítóhelyét. Előnyösen ez a hasítóhely egy Ncol-hely, vagy valamely más olyan hasítóhely, amely ligálás szempontjából kompatibilis az Ncol-hellyel, mivel az ilyen hasítóhelyek tartalmaznak egy ATG-transzlációs start-kódont.

A jelen példában bemutatott kísérletben, ahol 10 napos csírázási állapotban xanthi dohány transzformánsokat állítottunk elő, számos különböző genotípust használtunk.

Az alkalmazott genotípusok következők voltak:

- pPHI3621 (4. ábra) + pPHI1285 (6. ábra) [QM, kukorica szensz + BAR]

- pPHI3622 (5. ábra) + pPHI1285 (6. ábra) [QM, kukorica antiszensz +

BAR]

- pPHI4722 (7. ábra) + pPHI1285 (6. ábra) [QM, humán szensz + BAR]

- pPHI4723 (8. ábra) + pPHI1285 (6. ábra) [QM, humán szensz + BAR]

- pPHI1265 + pPHI1285 [GUS + BAR]

-pPHI1285 [BAR],

A transzformációt részecskeágyús bombázással valósítottuk meg, GE hélium ágyú és 650PSI megszakítólemezek alkalmazásával. Mintánként egy bombázást hajtottunk végre, összesen 0,1 pg DNS-t bejuttatva. Dohánynövényeket csíráztattunk, és a megfigyeléseket in vitro végeztük, 272-jelű táptalajon, 10-14 nappal a következő lépéseket megelőzően. Egy nappal a kísérlet kezdete előtt a szikleveleket és az első leveleket félbevágtuk, és steril szűrőpapírokra helyeztük, melyek 1,5 ml 530-jelű táptalajt és 0,25 mól/1 szorbitolt tartalmaztak. Ezután a levéldarabkákat egy éjszakán át 28 °C-on sötétben inkubáltuk. A levéldarabokat folyékony táptalajban felaprítottuk, a kiszáradás megelőzése céljából. Tenyésztőtálcánként 8 levélda-39• · · ·· ··· *ν ··· ·· ··’ *·* * · rabkát tenyésztettünk, és QM-transzformációkként 5 tálcát készítettünk, kontroll transzformációkként pedig 3-3 tálcát.

A bombázást követően valamennyi mintát az eredeti szűrőpapírokon tartottunk két napon keresztül, mielőtt a darabkákat szelekciós táptalajra vittük volna át.

óra elteltével a növényi szövetet 526+Basta-táptalajra (526H) vittük át, a levélszövetet a szűrőpapírokon hagyva. A kolóniák regenerálódása általában a bombázást követő 2-3. héten történt meg.

hét elteltével a szíkleveleket/kolóniákat 528S-táptalajra vittük át. A transzformált kolóniákból keletkezett növénykéket az alapkalluszról levágtuk, és 272M-táptalajra vittük át, gyökereztetés céljából. Amikor a gyökerek kialakultak, a növényeket érlelés céljából üvegházba telepítettük.

A következő eredményeket kaptuk:

A kísérletben a DNS-kezeléseket követően összesen 126 kolóniát kaptunk. PCR-analízist összesen 50 kolónián végeztünk, oly módon, hogy minden egyes DNS-kezelés eredményeként kapott kolóniák közül 12-12-t kiválasztottunk. A vizsgálat eredményeit az alábbi táblázatban foglaltuk öszsze:

DNS-kezelés	PCR-százalék	Növényregenerálódás (%)
pPHI3621/pPHI1285	90%	14,3 %
pPHI3622/pPHI1285	62,5 %	20%
pPHI4722/pPHI1285	66,7 %	16,6 %
pPHI4723/pPHI1285	75%	28,6 %
pPHI1265/pPHI1285	100 %	100%.

-40A bombázást követően hat héten keresztül figyeltük a növekedési sebességben észlelhető különbségeket. A legfigyelemreméltóbb megfigyelésünk az volt, hogy a pPHI3621/pPHI1285 és pPHI3622/pPHI1285 transzformációk eredményeként kapott kolóniák esetében a kialakult kolóniák pusztulását figyeltük meg, különösen a pPHI3622/pPHI1285 kezelés esetén. A többi transzformáció eredményeként kapott kolóniák esetében a kontroll - pPHI265/pPHI1285 - kolóniákhoz képest nem figyeltünk meg különbséget és növekedési sebességben.

7. példa

Stabil BMS-transzformáció végrehajtása, a QM-gén szensz- és antiszensz orientációban, valamint a GRP/GRE indukálható génrendszerben történő expressziói a hatásának kiértékelése céljából

A kísérletben alkalmazott genotípus BMS-P-38 volt, kukoricaszuszpenzióban. Az alkalmazott DNS-konstrukciók a következők voltak:

pPHI4719 (9. ábra) + pPHI1285 (6. ábra) [35S-QM szensz + 35S-BAR] pPHI4721 (10. ábra) + pPHI1285 (6. ábra) [35S-QM antiszensz + 35SBAR],

Részecskeágyú-bombázást alkalmaztunk (GE-hélium ágyú, és 650PSI megszakító lemezek alkalmazásával). Mintánként egy bombázást hajtottunk végre.

Egy nap tenyésztést követően a folyadékot vákuummal eltávolítottuk a sejtekről, és 2 gramm sejtet 20 ml 0,25 mól/1 szorbitolt tartalmazó 237-41 táptalajban felszuszpendáltunk. A sejteket ezután 28 °C-on rázógépben inkubáltuk, 2-4 órán keresztül.

Ezután 0,5 ml sejtszuszpenziót 1,5 ml 0,25 mól/1 szorbitolt tartalmazó 237-táptalajjal megnedvesített két rétegben elhelyezett Whatman szűrőpapírra szélesztettünk. Egy szűrőpapírra kb. 50 pg sejt jutott.

Minden DNS-kezelés után 6 mintát vizsgáltunk, valamint két nem bombázott kontrollmintát. A bombázást követően a sejteket tartalmazó szűrőpapírokat 115-táptalajra vittük át, majd 48 órán keresztül 28 °C-on sötétben tartottuk őket.

A sejteket ezután 306E-szelekciós táptalajra vittük át, a 48 óra elteltével, oly módon, hogy a sejteket lekapartuk a szűrőpapírról, és felszuszpendáltuk őket 2 ml 237-táptalajban, és minden mintából 1 ml-t tenyésztőlemezekre szélesztettünk. Ezután figyeltük a kolóniák regenerálódását. Amennyiben azonosítottunk egy kolóniát, azt a többiektől elválasztottuk, hogy egyedi kiónokat kapjunk.

Az indukciós vizsgálatokat abban az esetben végeztük, ha a PCRanalízis igazolta, hogy a bejuttatott gének jelen vannak a transzgenikus kolóniákban.

Bár a példa szerinti kísérletben valamennyi transzformáció nyomán kaptunk regenerálódó kiónokat, a legtöbb regenerálódó kolónia a pPHI1285 DNS-sel végrehajtott pozitív kontrollkísérletböl származott. A klónregenerációs adatokat a következő táblázatban foglaltuk össze:

-43A szövetek kezelése:

- sejtek átszűrése 710 pm-es pórusátmérőjű szűrőn a szubkultúrát egy nappal követően

- sejtek felszuszpendálása 3 % PEG-et tartalmazó 237-táptalajban 50 mg/ml szélesztési sűrűség

- sejtek inkubálása 3 % PEG-ben egy éjszakán át

- sejtek szélesztése, 0,5 ml/tenyésztőtálca 934-AH-jelű üvegszűrőre, melyet 1 ml 3 % PEG-et tartalmazó 237-táptalajjal nedvesítünk meg

- sejtek átvitele 115-táptalajba üvegszűrőn, a bombázást követően

Bombázás részecskeágyúval:

- DuPont-típusú héliumágyú (1. és 5. ismétlés) 650 PSI megszakítóleme- zek (1. és 5. ismétlés) DuPont 1000 ágyú (2. ismétlés)

- 0,230 megállítólemezek, acetil makrolövedékek (2. ismétlés)

- mintánként egy bombázás (1. és 5. ismétlés)

- mintánként két bombázás (2. ismétlés)

- úttörő volfrám módosított DNS-jegyzökönyvek, minden ágyúra más.

DNS:

- pPHI687 (11. ábra) + pPHI610 (12. ábra)

- pPHI460 (13. ábra) + pPHI610 (12. ábra)

- pPHI1952 (14. ábra) + pPHI610 (12. ábra)

- pPHI2125 (15. ábra) + pPHI610 (12. ábra)

-44Kezelés/vizsgálati eljárás a bombázást követően:

- bombázás után 24-48 órával R-gén expresszió vizsgálata

- minták átvitele 115E-táptalajra (1. ismétlés) 48 órával a bombázást követően.

- minták átvitele 115B-táptalajra (2. és 5. ismétlés) 7 nappal a bombázást követően

- sejtek átvitele a szűrőkről két héttel a szelekciós táptalajba történő áthelyezést követően

- kiónonként PCR-eljárás, a riportergén kimutatása céljából, a növények regenerálása előtt

- a minták inkubálása sötétben 28 °C-on

1. ismétlés'.

A PCR-eljárasokat 16 független kolónián hajtottuk végre, melyeket 5 mg/1 Basta-tartalmú szelekciós táptalajon regeneráltunk. Egy olyan kiónt találtunk - a 9. tenyésztőtálcán az 1 CZ-jelű klón - melyek pPHI610 + pPHI2125 DNS-sel transzformáltunk, és a GUS-génre PCR pozitívnak bizonyult (pPHI2125). Valamennyi klón I-fenotípusú volt, azonban a nemszelektált pozitív kontroll is I-fenotípusúvá vált. Ez a fenotípus elég általános az 54-68-5-Bl-l-jelü leszármazási vonalban. 12 hét szelekció után, 5 mg/1 Bastát tartalmazó táptalajon valamennyi PCR negatív klón eldobtuk, a nem embriogén-szövetekkel együtt. Az első tenyésztőlemezről vett 9. mintából származó 2. kiónt átvittük 288E-táptalajra (regeneráló táptalaj + 5 mg/1 Basta). Ezután 8 olyan klón maradt, melyet PCR-vizsgálatnak vetettünk alá, a GUS-gén jelenlétének kimutatása céljából. A nyolc kiónból három bizo-45 nyúlt a GUS-génre PCR-pozitívnak, és ezek vagy a transzlációs fúziót (pPHI2125) vagy pedig a transzkripciós fúziót (pPHI1952) tartalmazták.

5. ismétlés

A PCR-vizsgálatokat kilenc független kolónián hajtottuk végre, melyeket 3 ml/1 Bialaphos-t tartalmazó táptalajon szelektáltunk. Valamennyi regenerált klón a GUS-gén vonatkozásában PCR-pozitívnak bizonyult, ami arra utalt, hogy a kiónokban vagy a pPHI2125- vagy a pPHI 1952-plazmid jelen volt.

Ebben a kísérletben használt génkontrollok (pPHI460) kilenc stabil transzformánst eredményeztek, melyek mindegyikében találhatók voltak olyan területek, melyek a GUS-citokémiai vizsgálatban kéken festödtek. A génkotrollok sokkal gyorsabban növekedtek, mint a transzgenikus növények, melyeket az SGB6gl:GUS konstrukciókkal történő transzformálás után regeneráltunk.

hét szelekció után csak a gyorsan növekedő embriógén kolóniákat tartottuk meg, minden egyéb anyagot eldobtunk. A PCR-vizsgálatban pozitívnak bizonyuló kiónokat növények regenerálása céljából regeneráló táptalajra vittük át. A Basta-enzim alkalmazásával végzett vizsgálati eljárásokat a kolóniák egy részletén hajtottuk végre. A kapott eredmények nem utaltak arra, hogy a transzgenikus növények nagy arányban mutattak volna Bastával szemben aktív rezisztenciát. Előző munkáink és egyéb kutatók tapasztalatai alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy ennél a vizsgálati eljárásnál megbízhatóbb, ha a transzformáció megtörténtét inkább a regenerált kolóniák sejtjeinek morfológiája alapján határozzuk meg, összehasonlít-46va azt a nem-szelektált kontrollok sejtjeinek morfológiájával, és összehasonlítjuk a regenerált kolóniák növekedésének sebességét a kontrollokéval.

9. példa

A kukorica QM-géni ét tartalmazó plazmidok előállítása

A pPHI3621-plazmidot (4. ábra), amely a QM-gént szenszorienációban expresszálja, a pPHI1527-plazinidból kiindulva állítottuk elő. A pPHI1527-plazmid (16. ábra) gerincként a pUC18-plazmidot tartalmazza [Yanisch-Perron és mtsai.: (1985)], amely tartalmazza a klónozáshoz szükséges restrikciós hasítóhelyeket, valamint szelekciós markerként az ampicillin rezisztencia gént. Tartalmazza továbbá a karfiolmozaik-vírus (CaMV) 35S-promóterét és enhanszer szekvenciáit [Gardner és mtsai.: (1981)], a dohánymozaik vírus szignálszekvenciáját [0' Gallie és mtsai.: (1987)], a szentjánosbogár luciferáz riportergént [Ow és mtsai.: (1986)], valamint a Pinll transzkripciós terminátorszekvenciákat [Hynheung és mtsai.: (1989)].

A pPHI3621-plazmid másik szülői plazmidja a pPHI3620 volt, amely tartalmazza a pBluesscript-KS-plazmidba inszertált kukorica QMgént (17. ábra). A pPHI3621-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy mind a ρΡΗΊ3620, mind pedig a pPHI1527-plazmidot megemésztettük Ncol- és Kpl-enzimekkel, majd alacsony olvadáspontú (LMP) agarózgélből izoláltuk a pPHI3620-plazmid inszertcsíkját, valamint a pPHI1527 nagyobb méretű plazmid csíkját. Ezzel az eljárással a luciferáz gént a kukorica QM-génre cseréltük. Az izolált DNS-csíkokat összekevertük, és pPHI3621-plazmiddá ligáltuk.

« ·

-47A pPHI3622-plazmidot (5. ábra), amely a kukorica QM-gént antiszensz orientációban expresszálja, szintén a pPHI1527- és pPHI3620plazmidokból kiindulva állítottuk elő, azzal az eltéréssel azonban, hogy Sallés Sacl-enzimekkel emésztettük a plazmidokat. A pPHI3620-plazmid inszert csíkját és a pPHI1527-plazmid nagyobb méretű plazmidcsíkját LPMagarózgélből izoláltuk, az izolált fragmenseket összekevertük, majd ligáiást hajtottunk végre. A végrehajtott eljárással ebben az esetben is kicseréltük a luciferáz gént a kukorica QM-génjével, de most antiszensz orientációban.

A szövetspecifikus expressziós vektorokat hasonló módon állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a CaMV konstitutív promótert kicseréltük a TA39-portokspecifikus promóterekre, a 14Bl-re és a 8B3-ra [Gamaat és mtsai.: (1991)]. A 14B1-promótert tartalmazó pPHI1493-plazmidot (18. ábra) megemésztettük Ncol- és Nsil-enzimekkel, csakúgy, mint a pPHI3621plazmidot (2. szülői plazmid). A pPHI3621-plazmid kis inszertcsíkját és a nagyobb plazmidcsíkot izoláltuk LMP-agarózgélelektroforézis alkalmával, majd a fragmenseket összekevertük és ligáltuk. így kaptuk meg a pPHI4745-plazmidot (19. ábra), amely tartalmazza a kukorica QM-gént szensz orientációban, valamint a 14B1-promótert. Az antiszensz orientációjú kukorica QM-konstrukciót úgy állítottuk elő, hogy a pPHI4745-plazmidot Smal- és Nsil-enzimekkel emésztettük, és a pPHI3622-plazmidot Sallenzimmel emésztettük (majd a ragadós véget Klenow-fragmens alkalmazásával feltöltöttük), majd a plazmidot Nsil-enzimmel is emésztettük. A pPHI4745-plazmid nagy plazmidcsíkját és a pPHI3622-plazmid inszert csíkját LMP-gélből izoláltuk, fragmenseket összekevertük és ligáltuk. Ily módon állítottuk elő az L62-plazmidot (TA39 14B1; 20. ábra).

-48A 8B3-jelű portokspecifikus promótert tartalmazó expressziós vektorokat úgy állítottuk elő, hogy a pPHI4855-plazmidot (21. ábra) megemésztettük BamHI- és Notl-enzimekkel. A pPHI4855-plazmid tartalmazza valamennyi fent ismertetett szekvenciarészletet és azokon felül még egy béta-glükuronidáz gént kódoló szekvenciarészletet is [Walden és Schell (1990)]. A másik szülői plazmidot a pPHI4745-jelűt szintén megemésztettük BamHI- és Notl-enzimekkel. A pPHI4855-plazmid nagyméretű plazmidcsíkját és a pPHI4745-plazmid inszertcsíkját LMP-agarózból izoláltuk, a fragmenseket összekevertük és ligáltuk. Az így előállított L59-plazmid (22. ábra) szensz-orientációban tartalmazza a kukorica QM-gént, a portokspecifikus 8B3-promóter szabályozása alatt. Az antiszensz konstrukciót úgy állítottuk elő, hogy a pPHI4855-plazmidot megemésztettük Smal- és Nsilenzimekkel, a pPHI3622-plazmidot pedig Sáli (a ragadós véget Klenowfragmens alkalmazásával feltöltöttük) és Nsil-enzimekkel. A pPHI4855plazmid nagy méretű plazmidcsíkját és a pPHI3622-plazmid inszert csíkját LMP-agarózgélből izoláltuk, a fragmenseket összekevertük és ligáltuk. Ily módon állítottuk elő az L61-plazmidot (23. ábra), amely a kukorica QMgénét a 8B3-promóter szabályozása alatt antiszensz orientációban tartalmazza.

10. példa

Hímsteril dohánynövények előállítása szensz és antiszensz orientációjú QMgén konstrukciókkal történő transzformáció útján

Dohánylevél explantumokat együtt bombáztunk a 35S::BARkonstrukcióval (pPHI1285) és az alább felsorolt plazmidok közül eggyel:

L59:	TA39(8B3):QM
L61:	TA39(8B3):antiszensz QM
L62:	TA39(14Bl):antiszensz QM
4745:	TA39(14B1):QM.

A dohánylevél explantumok bombázásához BioRad által forgalmazott hélium biolisztikus ágyút (DuPont) alkalmaztunk. Szelektálható markerként a BAR-gént alkalmaztuk, ily módon állapítottuk meg hogy melyik levéldarabkába jutott plazmid. Mind a négy plazmidban dohányban működő portokspecifikus promótert alkalmaztunk (TA39). Ez egy tapétumspecifikus promóter. A 8B3- és 14Bl-promóterek TA39izolátumok.

Az L59-plazmid (22. ábra) azonos az L61-plazmiddal (23. ábra), azzal a különbséggel, hogy az L59-plazmid a kukorica QM-gént szensz orientációban, az L61-plazmid pedig antiszensz orientációban tartalmazza.

Az L62-plazmid (20. ábra) azonos a pPHI4745-plazmiddal, azzal a különbséggel, hogy a pPHI4745-plazmid a kukorica QM-gént szensz orientációban tartalmazza, az L62-plazmid pedig antiszensz orientációban.

A levélexplantumokból készített metszeteken kimutatható volt a BAR-gén beépülése. A dohány sejtekbe beépült kukorica QM-gén amplifikálására a szakember által jól ismert polimeráz láncreakciót (PerkinElmer) alkalmaztuk.

A Bialaphos-rezisztens kalluszból PCR-pozitív sejteket szelektáltunk, és ezekből dohánynövényeket regeneráltunk (lásd 1. példa).

-50A regenerált növények termekenyseget úgy nataroztuk meg, nogy ellenőriztük 1) a virágpor termelődését, és 2) az önmegtermékenyítő képességet. Az alább bemutatott hímsteril növények esetében minden esetben mindkét kritérium teljesült. Amint az az alábbiakban látható, hímsteril növények az L62- és pPHI4745-plazmidokkal transzformált sejtekből keletkeztek. Nem kaptunk regenerált dohánynövényeket az L59-plazmiddal transzformált sejtekből és csak két növényt tudtunk regenerálni az L61-plazmiddal transzformált sejtekből. Elképzelhető, hogy a kisszámú sikeres bombázásból adódó kísérleti hiba magyarázza, hogy az említett két plazmiddal végzett transzformáció után miért nem sikerült hímsteril növényeket regenerálni.

A kukorica QM-gén jelenléte mind szensz, mind pedig antiszensz orientációban hímsteril dohánynövények keletkezéséhez vezetett. Ennek a megfigyelésnek az a valószínű magyarázata, hogy a normális egyedfejlődéshez szükséges, hogy a QM-gén expressziójának mértéke bizonyos határok között mozogjon. Élesztősejtekben megfigyelték, hogy a QM-expresszió egyensúlya a normális fejlődéshez létfontosságú.

Amennyiben a dohánynövényekben jelen van a kukorica eredetű QM-gén, lehetséges, hogy túl nagy mennyiségű QM-fehérjetermék keletkezik, az is lehet, hogy a kukoricagén expressziós terméke a dohánysejtekben káros mutációt jelent, de lehetséges az is, hogy a kukorica QM-gén a dohánynövényekben az egyedfejlődés egy nem megfelelő időpontjában expresszálódik. Az antiszensz kukorica QM-géntermék feltehetőleg kötődik a dohány QM-génliez, és ily módon annak expresszióját az egyedfejlődés valamely létfontosságú fázisában meggátolja.

-51 A dohány- és kukoricanövények QM-génjeinek nukleotidszekvencia összehasonlítása alapján arra következtethetünk, hogy a homológia elég nagy közöttük ahhoz, hogy amennyiben az egyik gén antiszensz orientációban expresszálódik, a keletkezett RNS-termék a másik gén termékéhez képes legyen hozzákötödni.

A Bialophos rezísztens kalluszból regenerált növények termékenysége

Plazmid Regenerált növények száma Hímsteril L59-nö vények száma

L61

L62 pPHI4745 12

Anyagok és módszerek

A QM-gén alkalmazása szensz-orientácíóban

A kukoricából vagy más növényi forrásból izolált QM-gént tartalmazó nukleotid fragmenst 5'-végénél fogva fuzionáltatjuk egy olyan promóterhez, ami lehetővé teszi a szensz szál expresszióját egy kiválasztott növényi célsejtben, 3'-végét pedig alkalmas transzkripciós terminátorszekvenciálioz és poliadenilációs szignálokhoz fuzionáltatjuk, melyekről ismeretes, hogy a kiválasztott sejtben működőképesek. Előnyösen olyan promótert alkalmazunk, melyekről ismeretes, hogy a kiválasztott célsejtben képesek az expressziót szabályozni, ilyen promóterek például az konstitutív promóterek, mind például a CaMV 35S promótere, valamint a ubiquitin-gén promótere, amiről ismeretes, hogy számos különböző növényi

-52sejttípusban képes expressziót szabályozni. A 35S-promóter valószínűleg képes mind egyszikűekben - például kukoricában - mind pedig kétszikűekben - például dohányban és cűno/ű-ban expressziót vezérelni. Mindazáltal dohányban való alkalmazás céljára előnyös a ubiquitin-promótert kétszikű forrásból izolálni. Egyszikűekben, például kukoricában történő használatra a ubiquitin-promótert előnyösen egyszikű forrásból izoláljuk. Egyéb alkalmas promóterek többek között azok a promóterek, melyekről ismeretes, hogy bizonyos meghatározott körülmények között indukálhatok, például bizonyos kémiai kezelés hatására, amely kezelés történhet például valamely herbiciddel.

Terminátor/poliadenilációs szignálszekvenciaként alkalmazhatunk például olyan szekvenciákat, melyekről ismeretes, hogy a célsejtben működőképesek. Előnyösen alkalmazhatók például a Pinll-t (a paradicsom II. proteináz inhibitora) származó szignálok, vagy az olyan T-DNS-ekből származó szignálok, mint például az ÖCS- vagy a NOS-gén, melyekről ismeretes, hogy egy egész sor különböző növényi sejttípusban működőképesek, többek között kétszikű és egyszikű növények sejtjeiben, például kukoricasejtekben. Amennyiben a célsejt egyszikű sejt, például kukoricasejt, előnyös, bár nem szükséges, ha egy egyszikű génből származó intront beinszertálunk a promóter és a QM-gén közé. Alkalmazható intronok például a kukorica Adhl-génjének intronjai (például 1. és 6. intron).

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a QM-gént tartalmazó nukleotid fragmenst 5'-végénél fogva olyan promóterhez fuzionáltatjuk, melyről ismeretes, hogy specifikus, vagy erős preferenciát mutat, valamely virágpor kifejlődése szempontjából kritikus szövet vagy sejt iránya« ·· • · · ·· • · · * β · • · · «· ·· ·

-53ban. Ilyen szövet például a portok-szövet. Alkalmas sejtek például a tapétum-sejtek, vagy a fejlődő mikrospóra-sejtek. A fragmenst 3'-végénél fogva alkalmas transzkripciós terminátorhoz és poliadenilációs szignálokhoz fuzionáltatjuk, melyekről szintén ismeretes, hogy az adott sejtben működőképesek. Kukorica esetén előnyös promóter lehet például az SGB6promóter, valamint a TA39-promóter (dohányeredetű), valamint az L4klónból származó BP4A-promóter (B. napusból származik, WO 90/08838), kétsziküekben történő alkalmazás esetén.

A OM-gén alkalmazása antiszensz orientációban

A QM-gén antiszensz orientációjú formáját 5'-végénél fogva íúzionáltatjuk egy olyan promóterrel, amely képes a gén expresszióját a kiválasztott célsejtben szabályozni, a gén 3'-végét pedig alkalmas transzkripciós terminátor és poliadenilációs szignálszekvenciákhoz fuzionáltatjuk, melyekről szintén ismeretes, hogy a kiválasztott sejtben működőképesek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint olyan célsejtet választunk, amelyben a QM-gén vagy valamely QM-génnel nagy mértékben homológ gén expresszálódik, és ily módon az antiszensz gén effektíven fejtheti ki hatását. Előnyösen olyan promótert alkalmazunk, amelyről ismeretes, hogy a kiválasztott célsejtben képes expressziót szabályozni, alkahnas promóterek például a konstitutív promóterek, mint például a CaMV-35S-promótere, valamint a ubiquitin-gén promótere, melyekről ismeretes, hogy számos sejttípusban képesek expressziót szabályozni. A 35S-promóterről feltételezhető, hogy képes expressziót szabályozni mind egyszikűekben, például kukoricában, mind pedig kétsziküekben, például dohányban és canola-ban. Mindazáltal amennyiben a ubiquitin-promótert dohányban kívánjuk felhasználni ·· * ·· “ · 1 • · · · 4 ··· • * * » ·

-54előnyösen kétszikű forrásból izolálunk ubiquitin-promótert, amennyiben pedig a ubiquitint egysziküekben, például kukoricában kívánjuk felhasználni, előnyösen egyszikű forrásból izoláljuk az alkalmas promótert. A találmány szerinti megoldás szempontjából további előnyös promóterek azok, melyekről ismeretes, hogy bizonyos körülmények között indukálhatok, például kémiai kezelések hatására, például herbicidekkel történő kezelésre. Az antiszensz konstrukció előnyösen tartalmazza a teljes QM-gént, vagy legalább a gén 5'-végétől számítva néhányszáz nukleotidot.

A QM-gén antiszensz formáját tartalmazó nukleotid fragmenst 5'végénél fogva fuzionáltatjuk egy olyan promóterrel, amelyről ismeretes, hogy specifikusan vagy nagy preferenciával képes expressziót szabályozni olyan szövetekben, vagy sejtekben, melyek a virágpor kifejlődése szempontjából kritikusak. Alkalmas szövet példájaként megemlítjük a portokszövetet. Alkalmas sejtek például a tapétum-sejtek, vagy a fejlődő mikrospóra-sejtek. A gént tartalmazó DNS-fragmenst 3'-végénél fogva alkalmas transzkripciós terminátor és poliadenilációs szignálszekvenciákhoz fuzionáltatjuk, melyekről szintén ismeretes, hogy a kiválasztott sejtekben vagy szövetekben működőképesek. A kiválasztott célsejt olyan sejt, melyben a QM-gén vagy valamely QM-génnel nagy mértékben homológ gén expresszálódik és ezért az antiszensz gén effektíven képes hatását kifejteni. Transzformációs eljárások

Kétszikűek esetén számos közismert transzformációs eljárást alkalmazhatunk DNS bejuttatásának céljából. Előnyösen levélexplantumokat biolisztikusan részecskékkel bombázunk. Egyéb alkalmas módszer például az Agrobacterium által közvetített DNS-bejuttatás explantumokba;

* ·

- 55 protoplasztok együtt tenyésztése Agrobacteriumoi&af az elektroporáció; a PEG-közvetítette DNS-felvétel; valamint egyéb DNS-bejuttatási módszerek protoplasztokba és hasonlókba. Egyszikűek, például kukorica esetén előnyös DNS-bejuttatási módszer a kezelni kívánt sejtek bombázása, de egyéb eljárást is alkalmazhatunk, például elektroporációt.

Valamely növény sejtjeit a találmány szerinti idegen DNSszekvenciával valamely hagyományos eljárás szerint transzformáljuk. Amennyiben a transzformálni kívánt növény érzékeny Agrobacterium fertőzésre, előnyösen olyan idegen DNS-t tartalmazó vektort alkalmazunk, mely egy veszélytelenített Ti-plazmid. A transzformációt végrehajthatjuk például az EP-0 116 718 és EP-0 270 822 számú európai szabadalmi leírásokban megadottak szerint. Az előnyös Ti-plazmidvektorok az idegen DNSszekvenciát a határolószekvenciák között tartalmazzák, de legalábbis az idegen szekvencia a jobboldali határolószekvenciától 5'-irányban helyezkedik el. Más típusú vektorokat is alkalmazhatunk növényi sejtek transzformálására, géntranszfer létrehozására alkalmas eljárások felhasználásával (lásd például: EP-0 237 356, WO/85/01856 számú PCT-közzétételi irat, EP0 275 069); alkalmazhatunk in vitro protoplaszt transzformációt is, ahogy az például le van írva a 4 684 611 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, vagy vírusközvetítette transzformációt, mely eljárásról kitanítást találhatunk az EP-0 067 553 számú európai szabadalmi leírásban és a 4 407 956 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban; vagy alkalmazhatunk liposzóma közvetítette transzformációt is, például a 4 536 475 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltártak szerint, de alkalmazhatunk egyéb eljárásokat is.

- 56Amennyiben kukoricát kívánunk transzformálni, alkalmazhatunk újabban kifejlesztett transzformációs eljárásokat is, mint például a bizonyos kukorica leszánnazási vonalak esetén Fromm és mtsai. (1990), valamint Gordon-Kamm és mtsai. (1990) által leírt eljárásokat.

Amennyiben rizst kívánunk transzformálni, szintén alkalmazhatunk újonnan kifejlesztett transzformációs eljárásokat, például a bizonyos rizs leszármazási vonalak esetén Shimamoto és mtsai. (1990), Datta és mtsai. (1990), Christou és mtsai. (1990), valamint Lee és mtsai. (1991) által leírt eljárásokat.

Amennyiben a transzformálni kívánt növény búza, alkalmazhatunk a kukorica és rizs esetén leírt eljárásokkal analóg eljárásokat. Egyszikű növények transzformálása esetén különösen gabonafélék, mint például rizs, kukorica vagy búza előnyösen közvetlen DNS-bejuttatási eljárást alkalmazunk, például a biolisztikus transzformációt, vagy az elektroporációt. Amennyiben közvetlen DNS-bejuttatási eljárást alkalmazunk, előnyös a bejuttatandó DNS hosszát minimalizálni, oly mértékben, hogy a növény genomjába lényegében csak a találmány szerinti szekvenciák épüljenek be, azaz a kukoricából izolált QM-gén, és a hozzá tartozó szabályozó régiók. Az elmondottak értelmében, amennyiben a találmány szerinti DNSszekvenciát valamely plazmidban állítjuk elő, és valamely bakteriális gazdasejtben szaporítjuk, előnyösen a kiválasztott növény transzformálása előtt a plazmid eredetű szekvenciákat, melyek lehetővé teszik a plazmid fennmaradását a bakteriális gazdasejtben, például a replikációs origót, az antibiotikum rezisztencia gént, amely a gazdasejtben a szelekciót segíti elő, és hasonlókat

-57elválasztjuk a plazmidnak attól a részétől, amely a bejuttatni kívánt idegen DNS-szekvenciát tartalmazza.

Volfrám/DNS-előírt DuPont-típusú héliumágyúra (biolisztikus részecskebombázásos transzformációs eljárás) mg tömegű, 1,8 pm átmérőjű volfrámrészecskék: a részecskéket 15 ml-es centrifugacsőbe helyezzük.

A centrifugacsöhöz 2 ml 0,1 mól/l-es HNO₃-at adunk: 20 perc szonikálás jégen.

A HN0₃ eltávolítása: hozzáadunk 1 ml steril ioncserélt vizet, és a mintát egy 2 ml-es Sarstedt-csőbe visszük át. Rövid szonikálás.

A részecskéket centrifugálással kiülepítjük.

A vizet eltávolítjuk: a részecskékhez 1 ml 100 %-os EtOH-t adunk, rövid szonikálás.

A részecskéket centrifugálással kiülepítjük.

Az EtOH-t eltávolítjuk: a részecskékhez 1 ml 100 % EtOH-t adunk, rövid szonikálás.

A részecskéket centrifugálással kiülepítjük.

Az EtOH-t eltávolítjuk. A részecskékhez 1 ml steril ioncserélt vizet adunk. Szonikálás db 2 ml-es csőbe 250-250 μΐ szuszpenziót titettázunk.

Minden csőbe 750 μΐ steril ioncserélt vizet adunk. A volfrám-mintát a felhasználások között megfagyasztjuk.

μΐ volffám/HoO szuszpenziót 1,5 ml-es csőbe pipettázunk (először szonikálunk).

Hozzáadunk 10 pg DNS-t, keverés.

-58Hozzáadunk 50 μΐ 2,5 mól/1 CaCh, keverés.

Hozzáadunk 20 μΐ 0,1 mól/1 spermidint, keverés.

Rövid szonikálás. Centrifugálás 10 percig, 10 ezer ford/perc-cel.

A felülúszót eltávolítjuk.

A csőbe 250 μΐ 100 %-os EtOH-t pipettázunk. Röviden szonikálunk.

másodpercig 10 ezer ford/perc-vel centrifugálunk.

A felülúszót eltávolítjuk. Hozzáadunk 60 μΐ 10 %-os EtOH-t.

Kukorica transzformálási előírat, stabil transzgenikus növények regenerálása céljából

1. nap: A sejteket folyékony táptalajba helyezzük és leszűrjük (710 pm-es pórusméretű szűrön). 100-200 mg sejtet 5,5 cm átmérőjű üvegszűrőn összegyűjtünk, a sejtek kb. 3,5 cm átmérőjű területen helyezkedjenek el. A sejteket ezután táptalajra visszük át és egy éjszakán át inkubáljuk.

8. nap: A szűrőt és a sejteket eltávolítjuk a táptalajról, megszárítjuk őket és bombázásnak vetjük alá. Ezután a szűrőt és a sejteket visszahelyezzük a táptalajra.

5. nap: A szűrőkön lévő sejteket szelekciós táptalajra visszük át (3 mg Bialaphos).

12.nap: A szűrön lévő sejteket friss szelekciós táptalajra visszük át.

19,nap: A sejteket lekaparjuk a szűrőről és 5 ml szelekciós táptalajban felszuszpendáljuk őket, amely 8,6 % alacsony olvadáspontú tengeri agarózt is tartalmaz. A sejteket és a táptalajt ezután 200 ml szilárd gel-rite táptalajt tartalmazó 100 mm x 15 mm-es tenyésztőtálcák felszínére öntjük.

-5940.nap: A feltételezett transzformánsokat a tenyésztőtálcáról felszedjük. 61.nap: Megvizsgáljuk, hogy keletkeztek-e a tenyésztőtálcákon új kolóniák.

RNS-analízis:

A B73-magoncokból az elültetést követő 7. napon teljes cellurális RNS-t izoláltunk, Chomczynski és Sacchi (1987) eljárása szerint. A poly(A)⁺-RNS-t levél homogenizátumokból izoláltuk, a PolyAtract 1000 reagenskészlet alkalmazásával (Promega). A Northem-blot eljárásokat a korábbiakban leírtak szerint hajtottuk végre [Thomas (1980)].

A szegélyező régiók jellemzése

Az RNS-5'-vég-térképezést láncindító oligonukleotid meghosszabbításos módszer alkalmazásával végeztük, McKnight (1982) eljárása szerint. A láncindító oligonukleotid meghosszabbítási reakciókban 5'-végükön jelölt 32-tagú és 44-tagú oligonukleotidokat használtunk, melyek homológok voltak a TA39-cDNS-sel, sorrendben a startkódontól 3'-irányban a 31. nukleotidig, valamint a 79. nukleotidtól a 122. nukleotidig terjedő szekvenciarészletekkel. Az RNS-t dohányportokokból izoláltuk, Chomcynski és Sacchi (1987) eljárása szerint, a guanídium izotiocianátos eljárás alkalmazásával, és az izolált RNS-t oligo-dT-oszlopon tisztítottuk. Plazmidok

A szükséges restrikciós hasítóhelyeket helyspecifikus mutációs eljárással [Su és El-Gewely (1988)] alakítottuk ki, a startkódon környékén az Ncol helyett a 5'-CTAATTCCACCATGGCTTTTCTTGC-3' szekvenciájú oligonukleotid alkalmazásával, a PstI helyett pedig öt bázissal a feltételezett transzkripciós starthelytől 3'-irányban a 5'-GTTTATGTTTTCGT

-60ATCTGCAGCTTGAAAAGATATTATATC-3' szekvenciájú oligonukleotid alkalmazásával alakítottuk ki.

Az uidA-riportergént tartalamazó konstrukciók esetén az 5'-végi szegélyező régiókat az Ncol-hasítóhely felhasználásával fuzionáltattuk az uidA nyitott leolvasási fázissal, amely tartalmazott 3'-végi transzkriptummérési szignálszekvenciát, amely a paradicsom proteáz inhibitor génjéből származott (PI-II), vagy pedig a Pstl-hasítóhely felhasználásával fuzionáltattuk a TMV nem-transzlálódó szignálszekvenciájával (Ω') az uidA nyílt leolvasási fázist és a PI-II transzkriptum érési szignált. Az Ω'-vel fúzionáltatott uidA riporterkonstrukciókat a pALLTKRep-jelű bináris Tivektorba inszertáltuk. A pALLTKRep-plazmid abban különbözik a pBHOl.l-plazmidtól [Jefferson (1987)], hogy az NPTII szelekciós markergén transzkripcióját a nopalin szintáz promóter helyett a CaMC-35Spromóter szabályozza. A pLAT52-7-plazmidot, amely tartalmazza a paradicsomból izolált virágpor-specifikus promótert, és az uidA riportergént, dr. Sheila McComick-tól kaptuk ajándékba (ÜSDA-ARS Plánt Gene Expression Center, Albany, CA).

Az lcf-riporterplazmidot úgy állítottuk elő, hogy a LAT52- vagy a TA39-genomi kiónok 5'-végi szegélyező régióit az Ncol-hely felhasználásával fuzionáltattuk a 3'-végén PI-II-vel ellátott szentjánosbogár luciferáz génnel.

-61 IDÉZETT KÖZLEMÉNYEK

Az alábbiakban felsorolt közlemények teljes terjedelmükben a technika állásához tartozó kitanítás részét képezik, olyan mértékben, amennyiben kiegészítik, magyarázzák, vagy feltárják a leírásban szereplő eljárások, technikák és készítmények műszaki hátterét.

Albani et al. , 1990, Plánt Mól. Bioi. 15:605-622.

Berlyn et al. , 1976, Botanical Microtechnique and

Cytochemistry. The lova State University Press, Ames, Iowa, Ch. 3, 4, and 5.

Brown et al., 1990, Plánt Cell 2:263-274.

Call et al., 1990, Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the humán chromosome 11 Wilms' tumor locus. Cell 60:509-520.

Chomczynski et al., 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.

Chomcynski, P. and Sacchi, N., 1987. Single step method fór RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 162, 156-159.

Christou et al. , 1991, Production of transgenic rice (Oryza Satíva L.) plants from agronomically important indica and Japonica varieties via electric discharge partiele acceleration of exogenous DNA intő immature zygotic embryos Bio/Technology 9:957.

Colasanti, J. et al., 1991, Isolation and characterization of cDNA clones encoding a functional p34cdc2 homologue from Zea mays, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3377-3381.

-62Datta et al. , 1990, Genetically engineered fertile Indica-rice recovered front protoplasts, Bio/Technology 8:736.

Devereux et al., 1984, A conprehensivo set of sequence analysis programs fór the VAX. Nucleic Acids Rés. 12:387-395.

Domon et al., 1990, Plánt Hol. Bioi. 15:643-646.

Dowdy et al. , 1991, The ísolation and characterization of a növel cDNA demonstrating an altered in RNA level in nontumorgenic wilms’ microcell hybrid cells. Nucleic Acids Kés. 19:5763-5769.

Edwards et al. , 1990, Cell-specific gene expression in plants. Ann. Kev. Génét 24: 275-303.

Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833.

Gallie, D.R., Slex, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C. and Wilson, T.M.A. , 1987, The 5' leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivő. Nucleic Acids Rés. 8:3257-3273.

Gardner, R.C., Howarth, A.J., Hahn, P., Brown-Luedi, Μ., Shepherd, R.J. and Messing, J.C., 1981, The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing. Nucleic Acids Rés. 9:2871-2888

Garnaat, CW. and Huffman, G., 1991, ísolation and transient assay of tobacco anther specific promoters. Abstracts: The International Society fór Plánt Molecular Biology. Tucson,.AZ, Oct. 1991.

Gessler et al . , 1990, Homozygous deletion in Wilms' tumours of a zinc-finger gene identified by chromosone jumping. Natúré, 343:774-778.

Goldberg, R.B., Beals, T.P. and Sanders, P.M., 1993. Anther development: basic principles and practical applications. Plánt Cell 5:1217-1229.

Gordon-Kamm et al., 1990, Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants, The Plánt Cell 2:603-618.

Guerrero et al ., 1990, Hol. Gén. Génét. 224:161-168.

Hamilton, et al., 1989, Sex. Plánt Repród. 2:208-212.

Hynheung, A., Mitra, A., Choi, H.K., Costa, M.A., An, Κ. , Thornburg, R.W. and Ryan, C.A., 1989, Functional analysis of the 3' control region of the potato woundinducible proteinase inhibitor II gene. Plánt Cell 1:115-122.

Jacobs, 1992 Control of the cell cycle. Dev. Bioi. 153:1-15.

Kiéin et al ., 1989, Regulation of anthocyanin biosynthetic genes introduced intő intact inaize tissues by microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6681-6685.

Koltunow et al., 1990, Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development. Plánt Cell 2:1201-1224.

Kuhlmeier et al. , 1987, Regulation of gene expression in higher plants.’’ Ann Rév. Plánt Physiol. 38:221-257.

-64Lee et al. , 1991, Efficient transformation and regeneration of rice small cell groups,’' PNAS 88: 63896393 .

McKnight, S., 1982. Cell 31:355-366.

Monteclaro et al., 1993, A jun-binding protein related to a putative tumor suppressor, PNAS 90:6726-6730.

Ow, D., Wood, K.V., DeLuca, Μ. , de Wet, J.R., Helinski, D.R., and Howell, S.H., 1986, Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plánt cells and transgenic plants. Science 234:856-859.

Roberts, N. , et al., 1991, Plánt Hol. Bioi. 17:295-299.

Ron & Dressler, 1992, pGSTog-A versatile bacterial expression plasmid fór enzymatic labeling of recombinant proteins.” BioTech 13: 866-69.

Sambrook et al., 1989, ”Molecular Cloning”. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Schmidt et al., 1992, 0paque2 is a transcriptional activator that recognizes a specific target site in 22kd zein genes.” Plánt Cell 4:689-700.

Scott, R., et al., 1991, Plánt Hol. Bioi. 17:195-207.

Shimamoto et al., 1990, Fertile transgenic rice plants regenerated írom transformed protoplasts,” Natúré 338: 274 .

Smith & Johnson 1988, Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione s-transferase. Gene 67:31-40.

-65Thomas et al., 1980, Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitro-cellulose. Proc. Na ti. Acad. Sci. USA., 77:5201- 5205.

Twell et al., 1989, Transient expression of chimeric genes delivered intő pollen by microprojectile bombardment, Plánt Phyeiol., 91:1270-1274.

Ueda et al., 1992, Mutations of the 22- and 27-kd zein prorooters affect transactivarion by the Opaque2 protein. Plánt Cell 4:701-709.

van den Ouweland et al., 1992, Identification and characterization of a neu gene in the humán Xq28 region.’’ Humán Mól. Génét., 1:269-273.

Walden, R. and Schell, J. , 1990, Techniques in plánt molecular biology-progress and problems. Eur. J. Biochem. 192:563-576.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing J., 1985, Improved M13 cloning vectors and hőst strains: Nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119.

EP	0	116	718
EP	0	270	822
EP	0	237	356
EP	0	275	069
EP	0	067	553

WO/85/01856
WO/90/08828
U.S. patent	No.	4,407,956
U.S. patent	NO.	4,536,475
U.S. patent	No.	4,684,611

Claims (22)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. cDNS, azzal jellemezve, hogy szekvenciája megegyezik az 1. ábrával látható szekvenciával.
2. 2. Fehérje, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti cDNS által van kódolva, és hogy egy első konzervált régiója magába foglalja a fehéije aminoterminális végétől kezdődő első tíz aminosavat, egy második konzervált régiója magába foglalja a kb. 51-60. aminosavakat, és ez a régió amfipatikus hélix szerkezetű, és egy harmadik konzervált régiója magába foglalja a 98-135. aminosavakat.
3. 3. A 2. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy szekvenciája megegyezik a 2. ábrán bemutatott szekvenciával.
4. 4. Rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1. igénypont szerinti cDNS-t, valamint egy promótert, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva a cDNS-hez, és képes a cDNS transzkripcióját azon növényi sejtekben szabályozni, melyekben a promóter aktív.
5. 5. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy promóterként szövetspecifíkus promótert tartalmaz.
6. 6. A 4. igénypont szerinti rekombináns DSN-molekula, azzal jellemezve, hogy promóterként sejtspecifikus promótert tartalmaz.
7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy promóterként virágportermelődésben létfontosságú szövetben vagy sejtben aktív promótert tartalmaz.

   • 4
8. 8. A 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy portokszövetben aktív promótert tartalmaz.
9. 9. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-mokekula, azzal jellemezve, hogy sejtspecifikus promóterként tapétumsejtben aktív promótert tartalmaz.
10. 10. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a cDNS túltermelődését előidéző promótert tartalmaz.
11. 11. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy promóterként indukálható promótert tartalmaz.
12. 12. Izolált DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a róla keletkező RNS-transzkriptum komplementer azzal a transzknptummal, amely az 1. igénypont szerinti cDNS-ről keletkezik.
13. 13. Eljárás hímsteril növény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növényi sejtet olyan rekombináns molekulával transzformálunk, amely tartalmaz egy izolált polinukleotid molekulát, amely egyedfejlődésben szerepet játszó fehérjét kódol, mely fehérje az emlőseredetű QM-fehérjében található konzervált régiókkal homológ konzervált régiókat tartalmaz, és amely izolált polinukleotid molekula erősen sztringens körülmények között képes hibridizálódni QM-fehérjét kódoló emlős eredetű polinukleotid molekulákkal, és kevéssé sztringens körülmények között képes hibridizálódni QM-fehérjét kódoló kukorica eredetű polinukleotid molekulákkal, és a transzformált növényi sejtből növényt regenerálunk.
14. 14. Eljárás növények normális egyedfejlődésének megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy egy növényi sejtet olyan rekombináns molekulával transzformálunk, amely tartalmaz egy izolált polinukleotid molekulát, amely egyedfejlődésben szerepet játszó fehérjét kódol, mely fehérje az emlőseredetű QM-fehérjében található konzervált régiókkal homológ konzervált régiókat tartalmaz, és amely izolált polinukleotid molekula erősen sztringens körülmények között képes hibridizálódni QM-fehérjét kódoló emlős eredetű polinukleotid molekulákkal, és kevéssé sztringens körülmények között képes hibridizálódni QM-fehérjét kódoló kukorica eredetű polinukleotid molekulákkal, és a transzformált növényi sejtből növényt regenerálunk.
15. 15. Transzgenikus növény, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy rekombináns molekulát, amely tartalmaz egy izolált polinukleotid molekulát, amely egyedfejlődésben szerepet játszó fehérjét kódol, mely fehérje az emlőseredetű QM-fehérjében található konzervált régiókkal homológ konzervált régiókat tartalmaz, és amely izolált polinukleotid molekula erősen sztringens körülmények között képes hibridizálódni QM-fehérjét kódoló emlős eredetű polinukleotid molekulákkal, és kevéssé sztringens körülmények között képes hibridizálódni QM-fehérjét kódoló kukorica eredetű polinukleotid molekulákkal.
16. 16. Promóter, azzal jellemezve, hogy szekvenciája megegyezik a 3. ábrán látható szekvenciával.
17. 17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet kukorica eredetű QM-gént tartalmazó rekombináns molekulával transzformáljuk.

    ί * ·
18. 18. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet az 1. igénypont szerinti cDNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns molekulával transzformáljuk.
19. 19. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet a 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11. vagy 12. igénypont szerinti DNSmolekulát tartalmazó rekombináns molekulával transzformáljuk.
20. 20. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet a 4. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmazó rekombináns molekulával transzformáljuk.
21. 21. A 13. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtként kukorica növényből származó sejttől eltérő sejtet traszformálunk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtként dohánysejtet transzformálunk.