ES2692383T3 - Composiciones y métodos para combatir plagas de insectos - Google Patents

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Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento comprende un ARN bicatenario, en donde el ARN bicatenario se dirige a una secuencia polinucleotídica diana de plaga vegetal coleóptera, en donde la secuencia polinucleotídica diana de plaga vegetal coleóptera comprende: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma; (b) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma; o (c) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma; en donde dicho ARN bicatenario tiene actividad insecticida contra una plaga vegetal coleóptera; preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleóptera es una plaga vegetal de Diabrotica.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y metodos para combatir plagas de insectos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a metodos de biologfa molecular y silenciamiento genico para combatir plagas.
REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO COMO UN ARCHIVO DE TEXTO MEDIANTE EFS-WEB
La copia oficial del listado de secuencias se presenta simultaneamente con la memoria descriptiva como un archivo de texto mediante EFS-Web, en conformidad con el codigo estandar americano para intercambio de informacion (ASCII), con un nombre de archivo de 390225SEQLIST.txt, una fecha de creacion del 25 de agosto de 2010 y un tamano de 306 Kb.
Antecedentes de la invencion
Las plagas de insectos son un problema grave en la agricultura. Destruyen millones de acres de cultivos basicos tales como el mafz, la soja, el guisante y el algodon. Anualmente, estas plagas provocan mas de 100 mil millones de dolares de dano de cultivos solamente en los Estados Unidos. En una pelea estacional continua, los granjeros tienen que aplicar miles de millones de galones de pesticidas sinteticos para combatir estas plagas. Otros metodos empleados en el pasado suministraron actividad insecticida mediante microorganismos o genes procedentes de microorganismos expresados en plantas transgenicas. Por ejemplo, se sabe que determinadas especies de microorganismos del genero Bacillus poseen actividad pesticida contra una amplia serie de plagas de insectos incluyendo Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera, y otras. De hecho, los pesticidas microbianos, particularmente los obtenidos de cepas de Bacillus, han desempenado un papel importante en la agricultura como alternativas al control de plagas qufmico. Los cientfficos agrfcolas han desarrollado plantas de cultivo con resistencia a insectos potenciada modificando por ingenierfa genetica plantas de cultivo para producir protefnas insecticidas de Bacillus. Por ejemplo, plantas de mafz y algodon modificadas por ingenierfa genetica para producir toxinas Cry (vease, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806) se usan ahora ampliamente en agricultura americana y han proporcionado al granjero una alternativa a metodos de control de insectos tradicionales. Sin embargo, estas protefnas insecticidas Bt solamente protegen plantas de una gama relativamente pequena de plagas. Por otra parte, estos modos de actividad insecticida proporcionaron diversos niveles de especificidad y, en algunos casos, provocaron consecuencias ambientales significativas. Por tanto, existe una necesidad inmediata de metodos alternativos para combatir plagas.
Breve sumario de la invencion
Se proporcionan metodos y composiciones que emplean un elemento de silenciamiento que, cuando es ingerido por una plaga, tal como una plaga vegetal coleoptera incluyendo una plaga vegetal de Diabrotica, es capaz de reducir la expresion de una secuencia diana en la plaga. En realizaciones especfficas, la reduccion de la expresion de la secuencia diana combate la plaga y por lo tanto los metodos y composiciones son capaces de limitar el dano a una planta. La presente invencion proporciona un polinucleotido diana como se expone en SEQ ID NO: 234 o fragmentos activos del mismo, en donde una reduccion de la expresion de una o mas de las secuencias en la plaga diana combate la plaga (es decir, tiene actividad insecticida). Se proporcionan ademas elementos de silenciamiento, que cuando son ingeridos por la plaga, reducen el nivel de expresion de uno o mas de los polinucleotidos diana. Tambien se proporcionan plantas, partes de plantas, celulas vegetales, bacterias y otras celulas hospedadoras que comprenden los elementos de silenciamiento o una variante activa o fragmento de los mismos.
En otra realizacion, se proporciona un metodo para combatir una plaga, tal como una plaga vegetal coleoptera o una plaga vegetal de Diabrotica. El metodo comprende alimentar una plaga con una composicion que comprende un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento, cuando es ingerido por la plaga, reduce el nivel de una secuencia diana en la plaga y combate de este modo la plaga. Se proporcionan ademas metodos para proteger una planta de una plaga. Dichos metodos comprenden introducir en la planta o parte de planta un elemento de silenciamiento de la invencion. Cuando la planta que expresa el elemento de silenciamiento es ingerida por la plaga, el nivel de la secuencia diana se reduce y se combate la plaga.
En consecuencia, la invencion proporciona:
[1] Un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento comprende un ARN bicatenario, en donde el ARN bicatenario se dirige a una secuencia polinucleotfdica diana de plaga vegetal coleoptera, en donde la secuencia polinucleotfdica diana de plaga vegetal coleoptera comprende:
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(a) la secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
(b) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma; o
(c) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 19 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
en donde dicho ARN bicatenario tiene actividad insecticida contra una plaga vegetal coleoptera; preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleoptera es una plaga vegetal de Diabrotica.
[2] Un casete de expresion que comprende el polinucleotido de [1] en donde:
(a) dicho polinucleotido esta unido operativamente a un promotor heterologo; o
(b) dicho polinucleotido se expresa como un ARN en horquilla, en donde el elemento de silenciamiento comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento y un tercer segmento, en donde:
(i) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al menos 95 % de complementariedad de secuencia con una secuencia diana expuesta en la SEQ ID NO: 234;
(ii) dicho segundo segmento comprende un bucle de suficiente longitud para permitir que el elemento de silenciamiento se transcriba como un ARN en horquilla; y
(iii) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al menos 85 % de complementariedad con el primer segmento; o
(c) esta flanqueado por un primer promotor convergente unido operativamente en un extremo del polinucleotido y un segundo promotor convergente unido operativamente en el extremo opuesto del polinucleotido, en donde el primer y el segundo promotores convergentes son capaces de conducir la expresion del polinucleotido.
[3] Una celula hospedadora que comprende un casete de expresion heterologa de [2].
[4] Una celula vegetal que tiene incorporado de forma estable en su genoma un polinucleotido heterologo segun [1]:
en donde la ingesta de dicho elemento de silenciamiento por una plaga vegetal coleoptera reduce el nivel de una secuencia diana en dicha plaga vegetal coleoptera y por lo tanto combate la plaga vegetal coleoptera, preferentemente en donde la plaga vegetal coleoptera es una plaga vegetal de Diabrotica.
[5] La celula vegetal de [4], en donde dicha celula vegetal comprende el casete de expresion de [2(c)] y/o en donde dicho elemento de silenciamiento comprende un ARN en horquilla;
preferentemente en donde dicho polinucleotido que codifica el elemento de silenciamiento comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento y un tercer segmento, en donde:
(i) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al de complementariedad de secuencia con una secuencia diana expuesta en la SEQ ID NO: 234;
(ii) dicho segundo segmento comprende un bucle de suficiente longitud para permitir que el silenciamiento se transcriba como un ARN en horquilla; y,
(iii) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al de complementariedad con el primer segmento.
[6] Una planta o parte de planta que comprende una celula vegetal de uno cualquiera de [4] o [5].
[7] Una semilla transgenica de la planta de [6] que contiene el casete de expresion de [2].
[8] Un metodo para combatir una plaga vegetal coleoptera que comprende alimentar una plaga vegetal coleoptera con una composicion que comprende un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento comprende un ARN bicatenario, en donde dicho elemento de silenciamiento, cuando es ingerido por dicha plaga vegetal coleoptera, reduce el nivel de una secuencia de plaga vegetal coleoptera diana y combate de este modo la plaga vegetal coleoptera, en donde dicha secuencia de plaga vegetal coleoptera diana comprende:
(a) un fragmento de al menos 19 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma; o,
(b) una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleoptera comprende una plaga vegetal de Diabrotica.
menos 95 % elemento de menos 85 %
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[9] Un ARN bicatenario que comprende una secuencia de nucleotidos complementaria de:
(a) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 234; o
(b) una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 234;
en donde dicho ARN bicatenario tiene actividad insecticida contra una plaga vegetal coleoptera, preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleoptera es una plaga vegetal de Diabrotica.
[10] Una composicion que comprende el ARN bicatenario de [9], que comprende ademas un vehfculo agrfcolamente aceptable.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra un ensayo de planta completa de crisomelido del mafz. Los datos demuestran que la expresion de la SEQ ID NO: 8 (clon idvlc.pk001.e9.f); la SEQ ID NO: 26 (clon idvlc.pk003.p13.f); la sEq ID NO: 17 (clon idvlc.pk003.f9.f); la SEQ ID NO: 28 (clon idvlc.pk004.d17.p); y la SEQ ID NO: 10 (clon idvlc.pk001.n1.f) como una horquilla en una planta de mafz produce una planta de mafz, que cuando es ingerida por el crisomelido del mafz, tiene actividad insecticida. CRWNIS se refiere a la puntuacion de lesion nodular del crisomelido del mafz.
La Figura 2 muestra un ensayo de planta completa de crisomelido del mafz. Los datos demuestran que la
expresion de la SEQ ID NO: 13 (clon idvlc.pk002.j17.f); la SEQ ID NO: 40 (clon idvlc.pk013.h1.f); la SEQ ID
nO: 72 (clon idvlc.pk017.d14.f); y la SEQ ID No: 73 (clon idvlc.pk017.e22.f) como una horquilla en una planta de mafz produce una planta de mafz, que cuando es ingerida por el crisomelido del mafz, tiene actividad insecticida. CRWNIS se refiere a la puntuacion de lesion nodular del crisomelido del mafz. PHP19288 es un plasmido de control que carece del elemento de silenciamiento.
Descripcion detallada de la invencion
Las presentes invenciones se describiran ahora mas completamente en lo sucesivo en el presente documento con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran algunas, pero no todas las realizaciones de las
invenciones. De hecho, estas invenciones pueden incorporarse de muchas formas diferentes y no deben
interpretarse como limitadas a las realizaciones expuestas en el presente documento; mas bien, estas realizaciones se proporcionan con el fin de que esta divulgacion satisfaga los requisitos legales aplicables. Numeros similares se refieren a elementos similares en todo el documento.
Muchas modificaciones y otras realizaciones de las invenciones expuestas en el presente documento se le ocurriran a una persona experta en la materia a la que pertenecen estas invenciones que tenga el beneficio de las ensenanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Aunque se emplean en el presente documento terminos especfficos, estos se usan unicamente en un sentido generico y descriptivo y no con fines limitativos.
I. Descripcion general
Frecuentemente, los metodos de descubrimiento de ARNi se basan en la evaluacion de clases conocidas de genes sensibles (factores de transcripcion, genes constitutivos, etc.). Por el contrario, el polinucleotido diana expuesto en el presente documento se identifico basandose solamente en exploraciones de alto rendimiento de todos los singulones y representativos de todos los grupos de genes de una biblioteca de ADNc de crisomelidos del mafz occidentales neonatos. Esta exploracion permitio el descubrimiento de muchas secuencias nuevas, muchas de las cuales tienen homologfa extremadamente baja o carecen de homologfa con secuencias conocidas. Este metodo proporciono la ventaja de no tener un sesgo incorporado para genes que esten con frecuencia altamente conservados entre diferentes taxones. Como resultado, se han identificado muchas dianas nuevas para ARNi asf como genes conocidos que no se ha mostrado previamente que sean sensibles al ARNi.
Por tanto, se proporcionan metodos y composiciones que emplean un elemento de silenciamiento que, cuando es ingerido por una plaga, tal como una plaga vegetal coleoptera o una plaga vegetal de Diabrotica, es capaz de reducir la expresion de una secuencia diana en la plaga. En realizaciones especfficas, la reduccion de la expresion de la secuencia diana combate la plaga y por lo tanto los metodos y composiciones son capaces de limitar el dano a una planta o parte de planta. La presente invencion proporciona un polinucleotido como se expone en la SEQ ID NO: 234 o fragmentos activos del mismo. Se proporcionan elementos de silenciamiento disenados a la vista de estos polinucleotidos diana que, cuando es ingerido por la plaga, reducen la expresion de una o mas de las secuencias diana y de este modo combaten la plaga (es decir, tienen actividad insecticida).
Como se usa en el presente documento, por "combatir una plaga" o "combate una plaga" se entiende cualquier efecto en una plaga que de como resultado una limitacion del dano que provoca la plaga. Combatir una plaga incluye, pero sin limitacion, destruir la plaga, inhibir el desarrollo de la plaga, alterar la fertilidad o el crecimiento de la
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plaga de tal manera que la plaga provoque menos dano a la planta, reducir el numero de descendientes producidos, producir plagas menos aptas, producir plagas mas susceptibles al ataque de depredadores, o disuadir a las plagas de comerse la planta.
La reduccion del nivel de expresion del polinucleotido diana o el polipeptido codificado por el mismo, en la plaga da como resultado la supresion, el control y/o la destruccion del organismo patogeno invasor. La reduccion del nivel de expresion de la secuencia diana de la plaga reducira los sfntomas de enfermedad resultantes de exposicion a patogenos en al menos aproximadamente 2 % a al menos aproximadamente 6 %, al menos aproximadamente 5 % a al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 10 % a al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 30 % a al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 % o al menos aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 % o mas. Por lo tanto, los metodos de la invencion pueden utilizarse para combatir plagas, particularmente, plaga vegetal coleoptera o una plaga vegetal de Diabrotica.
Se conocen habitualmente en la tecnica ensayos que miden el control de una plaga, asf como metodos para cuantificar la resistencia a enfermedad en plantas despues infeccion por patogenos. Vease, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.614.395. Dichas tecnicas incluyen, medicion a lo largo del tiempo, el diametro de lesion promedio, la biomasa del patogeno y el porcentaje general de tejidos vegetales deteriorados. Vease, por ejemplo, Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107-15111. Vease, tambien Baum et al. (2007) Nature Biotech 11:13221326 y el documento WO 2007/035650 que probaron tanto ensayos de alimentacion de planta completa como ensayos de alimentacion de rafz de la mafz. Vease, tambien los ejemplos a continuacion.
La invencion se refiere a composiciones y metodos para proteger plantas de una plaga vegetal, tal como plagas vegetales coleopteras o plagas vegetales de Diabrotica o inducir resistencia en una planta a una plaga vegetal, tal como plagas vegetales coleopteras o plagas vegetales de Diabrotica. Como se usa en el presente documento "plaga vegetal coleoptera" se usa para hacer referencia a cualquier miembro del orden de coleopteros.
Como se usa en el presente documento, la expresion "plaga vegetal de Diabrotica" se usa para hacer referencia a cualquier miembro del genero Diabrotica. En consecuencia, las composiciones y metodos tambien son utiles en la proteccion de plantas contra cualquier plaga vegetal de Diabrotica incluyendo, por ejemplo, Diabrotica adelpha; Diabrotica amecameca; Diabrotica balteata; Diabrotica barberi; Diabrotica biannularis; Diabrotica cristata; Diabrotica decempunctata; Diabrotica dissimilis; Diabrotica lemniscata; Diabrotica limitata (incluyendo, por ejemplo, Diabrotica limitata quindecimpuncata); Diabrotica longicornis; Diabrotica nummularis; Diabrotica porracea; Diabrotica scutellata; Diabrotica sexmaculata; Diabrotica speciosa (incluyendo, por ejemplo, Diabrotica speciosa speciosa); Diabrotica tibialis; Diabrotica undecimpunctata (incluyendo, por ejemplo, Diabrotica undecimpunctata duodecimnotata; Diabrotica undecimpunctata howardi (escarabajo manchado del pepino); Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata (escarabajo manchado del pepino occidental)); Diabrotica virgifera (incluyendo, por ejemplo, Diabrotica virgifera virgifera (crisomelido del mafz occidental) y Diabrotica virgifera zeae (crisomelido del mafz mejicano)); Diabrotica viridula; Diabrotica wartensis; Diabrotica sp. JJG335; Diabrotica sp. JJG336; Diabrotica sp. JJG341; Diabrotica sp. JJG356; Diabrotica sp. JJG362; y, Diabrotica sp. JJG365.
En realizaciones especfficas, la plaga vegetal de Diabrotica comprende D. virgifera virgifera, D. barberi, D. speciosa o D. undecimpunctata howardi.
II. Secuencias diana
Como se usa en el presente documento, una "secuencia diana" o un "polinucleotido diana" comprende cualquier secuencia en la plaga cuyo nivel de expresion se desee reducir. En realizaciones especfficas, reducir el nivel de la secuencia diana en la plaga combate de este modo la plaga. Por ejemplo, la secuencia diana puede ser esencial para el crecimiento y el desarrollo. Aunque la secuencia diana puede expresarse en cualquier tejido de la plaga, en divulgaciones especfficas, las secuencias diana de supresion en la plaga se expresan en celulas del tejido intestinal de la plaga, celulas en el intestino medio de la plaga y celulas que revisten la luz del intestino o el intestino medio. Dichas secuencias diana pueden estar implicadas en, por ejemplo, metabolismo, crecimiento o diferenciacion de las celulas intestinales. Los ejemplos no limitantes de secuencias diana de la invencion incluyen un polinucleotido expuesto en la SEQ ID NO: 234 o fragmentos del mismo. Como se ilustra en otra parte del presente documento, la reduccion del nivel de expresion de una o mas de estas secuencias diana en una plaga vegetal coleoptera o una plaga vegetal de Diabrotica combate la plaga.
III. Elementos de silenciamiento
Por "elemento de silenciamiento" se entiende un polinucleotido que cuando es ingerido por una plaga, es capaz de reducir o eliminar el nivel o la expresion de un polinucleotido diana o el polipeptido codificado por el mismo. El elemento de silenciamiento empleado puede reducir o eliminar el nivel de expresion de la secuencia diana influyendo en el nivel del transcrito de ARN diana o, como alternativa, influyendo en la traduccion y afectando de este modo al nivel del polipeptido codificado. Se desvelan en otra parte del presente documento metodos para ensayar con respecto a elementos de silenciamiento funcionales que son capaces de reducir o eliminar el nivel de una secuencia de interes. Un unico polinucleotido empleado en los metodos de la invencion puede comprender uno o mas
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elementos de silenciamiento para los mismos o diferentes polinucleotidos diana. El elemento de silenciamiento puede producirse in vivo (es decir, en una celula hospedadora tal como una planta o un microorganismo) o in vitro.
En divulgaciones especfficas, la secuencia diana no es endogena de la planta. En otras realizaciones, aunque el elemento de silenciamiento combate plagas, preferentemente el elemento de silenciamiento no tiene ningun efecto en la planta o parte de planta normal.
Como se analiza con mas detalle a continuacion, los elementos de silenciamiento pueden incluir, pero sin limitacion, un elemento de supresion con sentido, un elemento de supresion antisentido, un ARN bicatenario, un ARNip, un miARNa, un miARN o un elemento de supresion en horquilla. Los ejemplos no limitantes de elementos de silenciamiento que pueden emplearse para reducir la expresion de estas secuencias de plagas vegetales coleopteras diana o secuencias de plagas vegetales de Diabrotica comprenden fragmentos y variantes de la secuencia con sentido o antisentido o consiste en la secuencia con sentido o antisentido de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 234 o fragmento biologicamente activo de la misma. El elemento de silenciamiento puede comprender secuencias adicionales que efectuan provechosamente la transcripcion y/o la estabilidad de un transcrito resultante. Por ejemplo, los elementos de silenciamiento pueden comprender al menos un resto de timina en el extremo 3'. Esto puede ayudar en la estabilizacion. Por tanto, los elementos de silenciamiento pueden tener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas restos de timina en el extremo 3'. Como se analiza con mas detalle a continuacion, los elementos supresores potenciadores tambien pueden emplearse junto con los elementos de silenciamiento desvelados en el presente documento.
Se entiende que "reduce" o "reducir" el nivel de expresion de un polinucleotido o un polipeptido codificado por el mismo significa que, el nivel de polinucleotido o polipeptido de la secuencia diana es estadfsticamente menor que el nivel de polinucleotido o nivel de polipeptido de la misma secuencia diana en una plaga de control apropiada que no se ha expuesto (es decir, no ha ingerido) al elemento de silenciamiento. En divulgaciones particulares, la reduccion del nivel de polinucleotido y/o el nivel de polipeptido de la secuencia diana en una plaga segun la divulgacion da como resultado menos del 95 %, menos del 90 %, menos del 80 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 20 %, menos del 10 % o menos del 5 % del nivel de polinucleotido o el nivel del polipeptido codificado por el mismo, de la misma secuencia diana en una plaga de control apropiada. Se analizan en otra parte del presente documento metodos para ensayar con respecto al nivel del transcrito de ARN, el nivel del polipeptido codificado o la actividad del polinucleotido o polipeptido.
i. Elementos de supresion con sentido
Como se usa en el presente documento, un "elemento de supresion con sentido" comprende un polinucleotido disenado para expresar una molecula de ARN correspondiente a al menos una parte de un ARN mensajero diana en la orientacion "con sentido". La expresion de la molecula de ARN que comprende el elemento de supresion con sentido reduce o elimina el nivel del polinucleotido diana o el polipeptido codificado por el mismo. El polinucleotido que comprende el elemento de supresion con sentido puede corresponder a toda o parte de la secuencia del polinucleotido diana, toda o parte de la region no traducida 5' y/o 3' del polinucleotido diana, toda o parte de la secuencia codificante del polinucleotido diana, o toda o parte tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas del polinucleotido diana.
Tfpicamente, un elemento de supresion con sentido tiene identidad de secuencia sustancial con el polinucleotido diana, normalmente mas de aproximadamente 65 % de identidad de secuencia, mas de aproximadamente 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Vease, patentes de Estados Unidos n.° 5.283.184 y 5.034.323. El elemento de supresion con sentido puede ser de cualquier longitud siempre que permita la supresion de la secuencia diana. El elemento de supresion con sentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 15-25, 19-35, 19-50, 25-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800 nucleotidos o mas de los polinucleotidos diana expuestos en la SEQ ID NO: 234.
ii. Elementos de supresion antisentido
Como se usa en el presente documento, un "elemento de supresion antisentido" comprende un polinucleotido que esta disenado para expresar una molecula de ARN complementaria de todo o parte de un ARN mensajero diana. La expresion del elemento de supresion de ARN antisentido reduce o elimina el nivel del polinucleotido diana. El polinucleotido para uso en la supresion antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica el polinucleotido diana, todo o parte del complemento de la region no traducida 5' y/o 3' del polinucleotido diana, todo o parte del complemento de la secuencia codificante del polinucleotido diana, o toda o parte del complemento tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas del polinucleotido diana. Ademas, el elemento de supresion antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100 % identico al complemento de la secuencia diana) o parcialmente complementario (es decir, menos del 100 % identico al complemento de la secuencia diana) del polinucleotido diana. En divulgaciones especfficas, el elemento de supresion antisentido comprende al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de
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complementariedad de secuencia con el polinucleotido diana. Puede usarse supresion antisentido para inhibir la expresion de multiples protefnas en la misma planta. Vease, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 5.942.657. Asimismo, el elemento de supresion antisentido puede ser complementario de una parte del polinucleotido diana. En general, pueden usarse secuencias de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 450 nucleotidos o mas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 234. Se describen metodos para usar supresion antisentido para inhibir la expresion de genes endogenos en plantas, por ejemplo, en Liu et al (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.759.829 y 5.942.657.
iii. Elemento de supresion de ARN bicatenario
Un "elemento de silenciamiento de ARN bicatenario" o "ARNbc" comprende al menos un transcrito que es capaz de formar un ARNbc antes o despues de su ingesta por una plaga. Por tanto, un "elemento de silenciamiento de ARNbc" incluye un ARNbc, un transcrito o polirribonucleotido capaz de formar un ARNbc o mas de un transcrito o polirribonucleotido capaz de formar un ARNbc. "ARN bicatenario" o "ARNbc" se refiere a una estructura polirribonucleotfdica formada por una unica molecula de ARN autocomplementario o una estructura polirribonucleotfdica formada por la expresion de al menos dos cadenas de ARN distintas. La molecula o las moleculas de ARNbc empleadas en los metodos y composiciones de la invencion median en la reduccion de la expresion de una secuencia diana, por ejemplo, mediando en la interferencia de ARN "ARNi" o silenciamiento genico de una manera especffica de secuencia. En el contexto de la presente invencion, el ARNbc es capaz de reducir o eliminar el nivel o la expresion de un polinucleotido diana o el polipeptido codificado por el mismo en una plaga.
El ARNbc puede reducir o eliminar el nivel de expresion de la secuencia diana influyendo en el nivel del transcrito de ARN diana, influyendo en la traduccion y afectando de este modo al nivel del polipeptido codificado, o influyendo en la expresion al nivel pretranscripcional (es decir, mediante la modulacion de la estructura de cromatina, el patron de metilacion, etc., para alterar la expresion genica). Vease, por ejemplo, Verdel et al. (2004) Science 303:672-676; Pal- Bhadra et al. (2004) Science 303:669-672; Allshire (2002) Science 297:1818-1819; Volpe et al. (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; y Hall et al. (2002) Science 297:2232-2237. Se desvelan en otra parte del presente documento metodos para ensayar con respecto a ARNbc funcionales que son capaces de reducir o eliminar el nivel de una secuencia de interes. En consecuencia, como se usa en el presente documento, se entiende que el termino "ARNbc" abarca otros terminos usados para describir moleculas de acido nucleico que son capaces de mediar en la interferencia de ARN o el silenciamiento genico, incluyendo, por ejemplo, ARN de interferencia pequeno (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), microARN (miARN), ARN en horquilla, ArN en horquilla pequeno (ARNhp), ARN de silenciamiento genico postranscripcional (ARNsgpt) y otros.
En realizaciones especfficas, al menos una cadena de la region de duplex o bicatenaria del ARNbc comparte suficiente identidad de secuencia o complementariedad de secuencia con el polinucleotido diana para permitir que el ARNbc reduzca el nivel de expresion de la secuencia diana. Como se usa en el presente documento, la cadena que es complementaria del polinucleotido diana es la "cadena antisentido" y la cadena homologa del polinucleotido diana es la "cadena con sentido".
En otra realizacion, el ARNbc comprende un ARN en horquilla. Un ARN en horquilla comprende una molecula de ARN que es capaz de plegarse hacia atras sobre si mismo para formar una estructura bicatenaria. Pueden emplearse multiples estructuras como elementos en horquilla. En realizaciones especfficas, el elemento de supresion de ARNbc comprende un elemento en horquilla que comprende en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento y un tercer segmento, donde el primer y el tercer segmento comparten suficiente complementariedad para permitir que el ARN transcrito forme una estructura de tallo-bucle bicatenario.
El "segundo segmento" de la horquilla comprende un "bucle" o una "region de bucle". Estas expresiones se usan de forma sinonima en el presente documento y debe interpretarse de forma amplia que comprenden cualquier secuencia de nucleotidos que confiera suficiente flexibilidad para permitir que se produzca autoemparejamiento entre regiones complementarias de un polinucleotido (es decir, segmentos 1 y 3 que forman el tallo de la horquilla). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la region en bucle puede ser sustancialmente monocatenaria y actuar como un espaciador entre las regiones autocomplementarias del tallo-bucle en horquilla. En algunas realizaciones, la region en bucle puede comprender una secuencia de nucleotidos aleatoria o sin sentido y por lo tanto no comparten identidad de secuencia con un polinucleotido diana. En otras realizaciones, la region en bucle comprende una secuencia de ARN con sentido o antisentido o fragmento de la misma que comparte identidad con un polinucleotido diana. Vease, por ejemplo, la publicacion de patente internacional n.° WO 02/00904. La region en bucle puede optimizarse para que sea tan corto como sea posible proporcionando aun al mismo tiempo suficiente flexibilidad intramolecular para permitir la formacion de la region de tallo con bases emparejadas. En consecuencia, la secuencia en bucle es en general de menos de 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 10 nucleotidos o menos.
El "primer" y el "tercer" segmento de la molecula de ARN en horquilla comprenden el tallo con bases emparejadas de la estructura en horquilla. Los primer y tercer segmentos son repeticiones invertidas uno del otro y comparten suficiente complementariedad para permitir la formacion de la region de tallo con bases emparejadas. En realizaciones especfficas, los primer y tercer segmentos son completamente complementarios entre sf. Como
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alternativa, el primer y el tercer segmento pueden ser parcialmente complementarios entre si siempre que sean capaces de hibridar entre si para formar una region de tallo con bases emparejadas. La cantidad de complementariedad entre el primer y el tercer segmento puede calcularse como un porcentaje del segmento completo. Por tanto, el primer y el tercer segmento del ARN en horquilla comparten en general al menos 50 %, 60 %,
70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, hasta e incluyendo 100 % de
complementariedad.
El primer y el tercer segmento son de al menos aproximadamente 1000, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 25, 22, 20, 19, 18, 17, 16, 15 o 10 nucleotidos de longitud. En divulgaciones especfficas, la longitud del primer y/o el tercer segmento es de aproximadamente 10-100 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 nucleotidos, de aproximadamente 10 a
aproximadamente 50 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 35 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 19 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleotidos, de aproximadamente 19 a
aproximadamente 50 nucleotidos, de aproximadamente 50 nucleotidos a aproximadamente 100 nucleotidos, de aproximadamente 100 nucleotidos a aproximadamente 150 nucleotidos, de aproximadamente 100 nucleotidos a aproximadamente 300 nucleotidos, de aproximadamente 150 nucleotidos a aproximadamente 200 nucleotidos, de aproximadamente 200 nucleotidos a aproximadamente 250 nucleotidos, de aproximadamente 250 nucleotidos a aproximadamente 300 nucleotidos, de aproximadamente 300 nucleotidos a aproximadamente 350 nucleotidos, de aproximadamente 350 nucleotidos a aproximadamente 400 nucleotidos, de aproximadamente 400 nucleotidos a aproximadamente 500 nucleotidos, aproximadamente 600 nt, aproximadamente 700 nt, aproximadamente 800 nt, aproximadamente 900 nt, aproximadamente 1000 nt, aproximadamente 1100 nt, aproximadamente 1200 nt, 1300 nt, 1400 nt, 1500 nt, 1600 nt, 1700 nt, 1800 nt, 1900 nt, 2000 nt o mas. En otras divulgaciones, la longitud del primer y/o el tercer segmento comprende al menos 10-19 nucleotidos, 10-20 nucleotidos; 19-35 nucleotidos, 20-35 nucleotidos; 30-45 nucleotidos; 40-50 nucleotidos; 50-100 nucleotidos; 100-300 nucleotidos; aproximadamente 500-700 nucleotidos; aproximadamente 700-900 nucleotidos; aproximadamente 900-1100 nucleotidos; aproximadamente 1300-1500 nucleotidos; aproximadamente 1500-1700 nucleotidos; aproximadamente 1700-1900 nucleotidos; aproximadamente 1900-2100 nucleotidos; aproximadamente 2100-2300 nucleotidos; o aproximadamente 2300-2500 nucleotidos. Vease, por ejemplo, publicacion internacional n.° WO 0200904. En realizaciones especfficas, el primer y el tercer segmento comprende al menos 20 nucleotidos que tienen al menos 85 % de complementariedad con el primer segmento. En otras divulgaciones adicionales, el primer y el tercer segmentos que forman la estructura de tallo-bucle de la horquilla comprende regiones salientes 3' o 5' que tienen restos de nucleotidos no emparejados.
En divulgaciones especfficas, las secuencias usadas en el primer, el segundo y/o el tercer segmentos comprenden dominios que se han disenado para tener suficiente identidad de secuencia con un polinucleotido diana de interes y de este modo tienen la capacidad de reducir el nivel de expresion del polinucleotido diana. La especificidad de los transcritos de ARN inhibidor es conferida en general por estos dominios del elemento de silenciamiento. Por tanto, en algunas divulgaciones, el primer, segundo y/o tercer segmento del elemento de silenciamiento comprenden un dominio que tiene al menos 10, al menos 15, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 500, al menos 1000 o mas de 1000 nucleotidos que comparten suficiente identidad de secuencia con el polinucleotido diana para permitir una reduccion de los niveles de expresion del polinucleotido diana cuando se expresa en una celula apropiada. En otras divulgaciones, el dominio es de entre aproximadamente 15 y 50 nucleotidos, aproximadamente 19-35 nucleotidos, aproximadamente 20-35 nucleotidos, aproximadamente 25-50 nucleotidos, aproximadamente 19 a 75 nucleotidos, aproximadamente 20 a 75 nucleotidos, aproximadamente 40-90 nucleotidos, aproximadamente 15-100 nucleotidos, 10-100 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 35 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 19 nucleotidos, de aproximadamente 50 nucleotidos a aproximadamente 100 nucleotidos, de aproximadamente 100 nucleotidos a aproximadamente 150 nucleotidos, de aproximadamente 150 nucleotidos a aproximadamente 200 nucleotidos, de aproximadamente 200 nucleotidos a aproximadamente 250 nucleotidos, de aproximadamente 250 nucleotidos a aproximadamente 300 nucleotidos, de aproximadamente 300 nucleotidos a aproximadamente 350 nucleotidos, de aproximadamente 350 nucleotidos a aproximadamente 400 nucleotidos, de aproximadamente 400 nucleotidos a aproximadamente 500 nucleotidos o mas. En otras divulgaciones, la longitud del primer y/o el tercer segmento comprende al menos 10-20 nucleotidos, al menos 10-19 nucleotidos, 20-35 nucleotidos, 30-45 nucleotidos, 40-50 nucleotidos, 50-100 nucleotidos o aproximadamente 100-300 nucleotidos.
En divulgaciones especfficas, el dominio del primer, el segundo y/o el tercer segmento tiene 100 % de identidad de secuencia con el polinucleotido diana. En otras divulgaciones, el dominio del primer, el segundo y/o el tercer segmento que tiene homologfa con el polipeptido diana tienen al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas identidad de secuencia con una region del polinucleotido diana. Solo es necesario que la identidad de secuencia de los dominios del primer, el segundo y/o el tercer segmentos con el polinucleotido diana sea suficiente para reducir la expresion del polinucleotido diana de interes.
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Vease, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7, y publicacion de patente de los Estados Unidos n.° 20030175965. Se ha descrito un ensayo transitorio con respecto a la eficacia de construcciones de ARNhp para silenciar la expresion genica in vivo en Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140.
La cantidad de complementariedad compartida entre el primer, segundo y/o tercer segmento y el polinucleotido diana o la cantidad de complementariedad compartida entre el primer segmento y el tercer segmento (es decir, el tallo de la estructura en horquilla) puede variar dependiendo del organismo en el que se vaya a controlar la expresion genica. Algunos organismos o tipos celulares pueden requerir emparejamiento exacto o 100 % de identidad, mientras que otros organismos o tipos celulares pueden tolerar cierto desapareamiento. En algunas celulas, por ejemplo, un desapareamiento de un unico nucleotido en la secuencia de direccion anula la capacidad de suprimir la expresion genica. En estas celulas, los casetes de supresion de la divulgacion pueden usarse para dirigir la supresion de genes mutantes, por ejemplo, oncogenes cuyos transcritos comprenden mutaciones puntuales y por lo tanto pueden ser dianas especfficas usando los metodos y composiciones de la invencion sin alterar la expresion del alelo de tipo silvestre restante.
Puede usarse cualquier region del polinucleotido diana para disenar el dominio del elemento de silenciamiento que comparte suficiente identidad de secuencia para permitir la expresion del transcrito en horquilla para reducir el nivel del polinucleotido diana. Por ejemplo, el dominio puede disenarse para compartir la identidad de secuencia con la region no traducida 5' del polinucleotido o los polinucleotidos diana, la region no traducida 3' del polinucleotido o los polinucleotidos diana, regiones exonicas del polinucleotido o los polinucleotidos diana, regiones intronicas del polinucleotido o los polinucleotidos diana y cualquier combinacion de los mismos. En divulgaciones especfficas, un dominio del elemento de silenciamiento comparte suficiente homologfa con al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25 o 30 nucleotidos consecutivos de aproximadamente los nucleotidos 1-50, 25-75, 75-125, 50-100, 125-175, 175-225, 100-150, 150-200, 200-250, 225-275, 275-325, 250-300, 325-375, 375-425, 300-350, 350-400, 425-475, 400-450, 475-525, 450-500, 525-575, 575-625, 550-600, 625-675, 675-725, 600-650, 625-675, 675-725, 650-700, 725-825, 825-875, 750-800, 875-925, 925-975, 850-900, 925-975, 975-1025, 950-1000, 1000-1050, 10251075, 1075-1125, 1050-1100, 1125-1175, 1100-1200, 1175-1225, 1225-1275, 1200-1300, 1325-1375, 1375-1425, 1300-1400, 1425-1475, 1475-1525, 1400-1500, 1525-1575, 1575-1625, 1625-1675, 1675-1725, 1725-1775, 17751825, 1825-1875, 1875-1925, 1925-1975, 1975-2025, 2025-2075, 2075-2125, 2125-2175, 2175-2225, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 1900-2000 de la secuencia diana. En algunos casos para optimizar las secuencias de ARNip empleadas en la horquilla, el metodo de oligodesoxirribonucleotido sintetico/RNasa H puede usarse para determinar sitios en el ARNm diana que estan en una conformacion que es susceptible a silenciamiento de ArN. Vease, por ejemplo, Vickers et al. (2003) J. Biol. Chem 278:7108-7118 y Yang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9442-9447. Estos estudios indican que hay una correlacion significativa entre los sitios sensibles a RNasa H y sitios que promueve la degradacion de ARNm dirigida por ARNip eficaz.
El elemento de silenciamiento en horquilla tambien puede disenarse de modo que la secuencia con sentido o la secuencia antisentido no correspondan a un polinucleotido diana. En esta realizacion, la secuencia con sentido y antisentido flanquean una secuencia en bucle que comprende una secuencia de nucleotidos correspondiente a todo o parte del polinucleotido diana. Por tanto, es la region en bucle lo que determina la especificidad de la interferencia de ARN. Vease, por ejemplo, documento WO 02/00904.
Ademas, puede conseguirse silenciamiento genico transcripcional (TGS) mediante el uso de un elemento de supresion en horquilla donde la repeticion invertida de la horquilla comparte identidad de secuencia con la region promotora de un polinucleotido diana para silenciar. Vease, por ejemplo, Aufsatz et al. (2002) PNAS 99 (Supl. 4):16499-16506 y Mette et al. (2000) EMBO J 19(19):5194-5201.
En otras divulgaciones, el ARNbc puede comprender un ARN pequeno (ARNp). Los ARNp pueden comprender tanto microARN (miARN) como ARN de interferencia pequeno (ARNip) (Meister y Tuschl (2004) Nature 431:343-349 y Bonetta et al. (2004) Nature Methods 1:79-86). Los miARN son agentes reguladores que comprenden aproximadamente 19 ribonucleotidos que son altamente eficaces en la inhibicion de la expresion de polinucleotidos diana. Vease, por ejemplo Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263. Para interferencia de miARN, el elemento de silenciamiento puede disenarse para expresar una molecula de ARNbc que forma una estructura en horquilla que contiene una secuencia de 19 nucleotidos que es complementaria del polinucleotido diana de interes. El miARN puede prepararse de forma sintetica, o transcribirse como un ARN mas largo que se escinde posteriormente para producir el miARN activo. Especfficamente, el miARN puede comprender 19 nucleotidos de la secuencia que tiene homologfa con un polinucleotido diana en orientacion con sentido y 19 nucleotidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria de la secuencia con sentido.
Cuando se expresa un miARN, se reconoce que pueden transcribirse diversas formas de un miARN incluyendo, por ejemplo, el transcrito primario (denominado el "pri-miARN") que se procesa mediante diversas etapas nucleolfticas a un miARN precursor mas corto (denominado el "pre-miARN"); el pre-miARN; o el miARN final (maduro) esta presente en un duplex, denominandose las dos cadenas el miARN (la cadena que con el tiempo formara pares de bases con la diana) y miARN*. El pre-miARN es un sustrato para una forma de dicer que retira el duplex de
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miARN/miARN* del precursor, despues de lo cual, de forma similar a ARNip, el duplex puede captarse en el complejo de RISC. Se ha demostrado que los miARN pueden expresarse de forma transgenica y ser eficaces mediante la expresion de una forma precursora, en lugar de la forma primaria completa (Parizotto et al. (2004) Genes & Development 18:2237-2242 y Guo et al. (2005) Plant Cell 17:1376-1386).
Los metodos y composiciones de la invencion emplean elementos de silenciamiento que cuando se transcriben "forman" una molecula de ARNbc. En consecuencia, no es necesario que el polinucleotido heterologo que se expresa forme el ARNbc por si solo, pero puede interaccionar con otras secuencias en la celula vegetal o en el intestino de la plaga despues de la ingesta para permitir la formacion del ARNbc. Por ejemplo, un polinucleotido quimerico que puede silenciar de forma selectiva el polinucleotido diana puede generarse expresando una construccion quimerica que comprende la secuencia diana para un miARN o ARNip de una secuencia correspondiente para todo o parte del gen o los genes para silenciar. El ARNbc se "forma" cuando la diana para el miARN o ARNip interacciona con el miARN presente en la celula. El ARNbc resultante puede despues reducir el nivel de expresion del gen o los genes para silenciar. Vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de los Estados Unidos n.° 2007-0130653, titulada "Methods and Compositions for Gene Silencing". La construccion puede disenarse para tener una diana para un miARN endogeno o, como alternativa, puede emplearse una diana para un miARN heterologo y/o sintetico en la construccion. Si se emplea un miARN heterologo y/o sintetico, puede introducirse en la celula en la misma construccion de nucleotidos que el polinucleotido quimerico o en una construccion separada. Como se analiza en otra parte del presente documento, puede usarse cualquier metodo para introducir la construccion que comprende el miARN heterologo.
IV. Variantes y fragmentos
Por "fragmento" se entiende una parte del polinucleotido o una parte de la secuencia de aminoacidos y por lo tanto protefna codificada por la misma. Los fragmentos de un polinucleotido pueden codificar fragmentos de protefnas que conservan la actividad biologica de la protefna nativa. Como alternativa, no es necesario que los fragmentos de un polinucleotido que son utiles como un elemento de silenciamiento codifiquen protefnas de fragmentos que conserven actividad biologica. Por tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleotidos pueden variar desde al menos aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 19 nucleotidos, aproximadamente 20 nucleotidos, aproximadamente 22 nucleotidos, aproximadamente 50 nucleotidos, aproximadamente 75 nucleotidos, aproximadamente 100 nucleotidos, 200 nucleotidos, 300 nucleotidos, 400 nucleotidos, 500 nucleotidos, 600 nucleotidos, 700 nucleotidos y hasta el polinucleotido de longitud completa empleado en la divulgacion. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleotidos pueden variar de 1-50, 25-75, 75-125, 50-100, 125-175, 175-225, 100-150, 100-300, 150-200, 200-250, 225-275, 275-325, 250-300, 325-375, 375-425, 300-350, 350-400, 425-475, 400-450, 475-525, 450-500, 525-575, 575-625, 550-600, 625-675, 675-725, 600-650, 625-675, 675-725, 650-700, 725-825, 825-875, 750-800, 875-925, 925-975, 850-900, 925-975, 975-1025, 950-1000, 1000-1050, 10251075, 1075-1125, 1050-1100, 1125-1175, 1100-1200, 1175-1225, 1225-1275, 1200-1300, 1325-1375, 1375-1425, 1300-1400, 1425-1475, 1475-1525, 1400-1500, 1525-1575, 1575-1625, 1625-1675, 1675-1725, 1725-1775, 17751825, 1825-1875, 1875-1925, 1925-1975, 1975-2025, 2025-2075, 2075-2125, 2125-2175, 2175-2225, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 1900-2000 de la SEQ ID NO: 234. Se describen en otra parte del presente documento metodos para ensayar con respecto a la actividad de un elemento de silenciamiento deseado.
Se entiende que "variantes" significa secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleotidos, una variante comprende una supresion y/o adicion de uno o mas nucleotidos en uno o mas sitios internos en el polinucleotido nativo y/o una sustitucion de uno o mas nucleotidos en uno o mas sitios en el polinucleotido nativo. Una variante de un polinucleotido que es util como un elemento de silenciamiento conservara la capacidad de reducir la expresion del polinucleotido diana y, en algunas divulgaciones, combatir de este modo una plaga de interes. Como se usa en el presente documento, un polinucleotido o polipeptido "nativo" comprende una secuencia de nucleotidos o secuencia de aminoacidos de origen natural, respectivamente. Para los polinucleotidos, las variantes conservativas incluyen las secuencias que, debido a la degeneracion del codigo genetico, codifican la secuencia de aminoacidos de uno de los polipeptidos empleados en la divulgacion. Los polinucleotidos variantes incluyen tambien polinucleotidos obtenidos sinteticamente, tales como los generados, por ejemplo, usando mutagenesis dirigida, pero continuan conservando la actividad deseada. En general, las variantes de un polinucleotido concreto (es decir, un elemento de silenciamiento) tendran al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de identidad de secuencia con ese polinucleotido concreto segun lo determinado por los programas y parametros de alineacion de secuencia descritos en otra parte en el presente documento.
Se pueden evaluar tambien variantes de un polinucleotido concreto (es decir, el polinucleotido de referencia) mediante comparacion del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipeptido codificado por un polinucleotido variante y el polipeptido codificado por el polinucleotido de referencia. Puede calcularse el porcentaje de identidad entre dos polipeptidos cualesquiera utilizando programas y parametros de alineacion de secuencia descritos en otra parte en el presente documento. Cuando se evalua cualquier par dado de polinucleotidos empleados dado por comparacion del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipeptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipeptidos codificados es de al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
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Se usan las siguientes expresiones para describir las relaciones de secuencia entre dos o mas polinucleotidos o polipeptidos: (a) "secuencia de referenda", (b) "ventana de comparacion", (c) "identidad de secuencia", y, (d) "porcentaje de identidad de secuencia".
(a) Como se usa en el presente documento, "secuencia de referenda" es una secuencia definida usada como una base para comparacion de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especffica; por ejemplo, como un segmento de un ADNc o una secuencia genica de longitud completa, o el ADNc o la secuencia genica completa.
(b) Como se usa en el presente documento, "ventana de comparacion" hace referencia a un segmento contiguo y especffico de una secuencia polinucleotfdica, en donde la secuencia polinucleotfdica en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineacion optima de los dos polinucleotidos. En general, la ventana de comparacion es de al menos 20 nucleotidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o mas. Los expertos en la materia entienden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusion de huecos en la secuencia polinucleotfdica se introduce normalmente una penalizacion por hueco y se resta del numero de coincidencias.
A menos que se indique otra cosa, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en el presente documento se refieren al valor obtenido usando GAP Version 10 utilizando los siguientes parametros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleotidos utilizando una ponderacion de GAP de 50 y una ponderacion de la longitud de 3 y la matriz de puntuacion nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud de una secuencia de aminoacidos utilizando una ponderacion de GAP de 8 y una ponderacion de la longitud de 2 y la matriz de puntuacion BLOSUM62; o cualquiera de sus programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparacion de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestion, genera una alineacion que tiene emparejamientos de restos de nucleotidos o aminoacidos identicos y un porcentaje de identidad de secuencia identico en comparacion con la alineacion correspondiente generada por GAP Version 10.
(c) Como se usa en el presente documento, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias polinucleotfdicas o polipeptfdicas hacen referencia a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para maxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparacion especffica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a las protefnas se reconoce que las posiciones de restos que no son identicas difieren a menudo en sustituciones de aminoacidos conservativas, donde se sustituyen restos de aminoacidos por otros restos de aminoacidos con propiedades qufmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molecula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitucion. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Normalmente esto implica puntuar una sustitucion conservativa como un desapareamiento parcial mas que completo, aumentando por tanto el porcentaje de identidad de secuencia. Por tanto, por ejemplo, cuando se asigna a un aminoacido identico una puntuacion de 1 y se asigna a una sustitucion no conservativa una puntuacion de cero, se asigna a una sustitucion conservativa una puntuacion entre cero y 1. Se calcula la puntuacion de sustituciones conservativas, por ejemplo, como se implemento en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
(d) Como se usa en el presente documento, el "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera optima a lo largo de una ventana de comparacion, en donde la parte de la secuencia polinucleotfdica en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las cuales se encuentra la base de acido nucleico o el resto de aminoacido identicos en ambas secuencias para producir el numero de posiciones emparejadas, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
Se proporciona adicionalmente un metodo para identificar un elemento de silenciamiento de los polinucleotidos diana expuestos en las SEQ ID NO: 1-236. Dichos metodos comprenden obtener un fragmento candidato de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-236 que sea de suficiente longitud para actuar como un elemento de silenciamiento y reducir de este modo la expresion del polinucleotido diana y/o combatir una plaga deseada; expresar dicho fragmento de polinucleotido candidato en un casete de expresion apropiado para producir un elemento de silenciamiento candidato y determinar si dicho fragmento de polinucleotido candidato tiene la actividad de un elemento de silenciamiento y de este modo reducir la expresion del polinucleotido diana y/o combatir una plaga deseada. Se conocen metodos para identificar dichos fragmentos candidatos basandose en la ruta deseada para supresion. Por ejemplo, pueden emplearse diversos programas bioinformaticos para identificar la region de los polinucleotidos diana que podrfan aprovecharse para generar un elemento de silenciamiento. Vease, por ejemplo, Elbahir et al. (2001) Genes and Development 15:188-200, Schwartz et al. (2003) Cell 115:199-208, Khvorova et al. (2003) Cell 115:209-216. Vease tambien, ARNip en Whitehead (jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) que calcula las
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energfas de union para ARNip tanto con sentido como antisentido. Vease, tambien genscript.com/ssl- bin/app/rnai?op=known; Block-iT™ RNAi designer de Invitrogen y GenScript siRNA Construct Builder.
V. Construcciones de ADN
No se pretende que el uso del termino "polinucleotido" limite la presente invencion a polinucleotidos que comprenden ADN. Los expertos habituales en la materia reconoceran que los polinucleotidos pueden comprender ribonucleotidos y combinaciones de ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos. Dichos desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos incluyen tanto moleculas de origen natural como analogos sinteticos. Los polinucleotidos de la invencion tambien abarcan todas las formas de secuencias incluyendo, pero sin limitacion, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle, y similares.
El polinucleotido que codifica el elemento de silenciamiento o en divulgaciones especfficas empleado en los metodos y composiciones de la divulgacion puede proporcionarse en casetes de expresion para expresion en una planta o un organismo de interes. Se reconoce que pueden usarse multiples elementos de silenciamiento incluyendo multiples elementos de silenciamiento identicos, multiples elementos de silenciamiento que se dirigen a diferentes regiones de la secuencia diana o multiples elementos de silenciamiento de diferentes secuencias diana. En esta divulgacion, se reconoce que cada elemento de silenciamiento puede estar contenido en un casete individual o separado, construccion de ADN o vector. Como se analiza, se contempla cualquier medio para proporcionar el elemento de silenciamiento. Una planta o celula vegetal puede transformarse con un unico casete que comprende ADN que codifica uno o mas elementos de silenciamiento o pueden usarse casetes separados que comprenden cada elemento de silenciamiento para transformar una planta o celula vegetal o celula hospedadora. Analogamente, una planta transformada con un componente puede transformarse posteriormente con el segundo componente. Uno o mas elementos de silenciamiento tambien pueden ponerse juntos por cruce sexual. Es decir, una primera planta que comprende un componente se cruza con una segunda planta que comprende el segundo componente. Las plantas descendientes del cruce comprenderan ambos componentes.
El casete de expresion puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente con el polinucleotido de la invencion. Se entiende que "unido operativamente" significa un enlace funcional entre dos o mas elementos. Por ejemplo, una union operativa entre un polinucleotido de la invencion y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresion del polinucleotido de la invencion. Los elementos unidos operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usa para hacer referencia a la union de dos regiones codificantes de protefnas, por unido operativamente se entiende que las regiones codificantes estan en la misma fase de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un polinucleotido adicional para cotransformar en el organismo. Como alternativa, el polipeptido o los polipeptidos adicionales pueden proporcionarse en multiples casetes de expresion. Los casetes de expresion pueden estar provistos de una pluralidad de sitios de restriccion y/o sitios de recombinacion para que la insercion del polinucleotido este bajo la regulacion transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresion puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables.
El casete de expresion puede incluir en la direccion de transcripcion 5'-3', un region de inicio de la transcripcion y la traduccion (es decir, un promotor), un polinucleotido que comprende el elemento de silenciamiento empleado en los metodos y composiciones de la invencion y una region de terminacion de la transcripcion y la traduccion (es decir, region de terminacion) funcional en plantas. En otras divulgaciones, el ARN bicatenario se expresa a partir de un casete de supresion. Dicho casete puede comprender dos promotores convergentes que conducen la transcripcion de un elemento de silenciamiento unido operativamente. "Promotores convergentes" se refiere a promotores que se orientan en uno de los extremos del elemento de silenciamiento unido operativamente de modo que cada promotor conduzca la transcripcion del elemento de silenciamiento en direcciones opuestas, produciendo dos transcritos. En dichas realizaciones, los promotores convergentes permiten la transcripcion de la cadena con sentido y antisentido y por lo tanto permiten la formacion de un ARNbc.
Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripcion y regiones de terminacion de la traduccion) y/o los polinucleotidos empleados en la invencion pueden ser nativos/analogos de la celula hospedadora o entre si. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleotido empleado en la invencion pueden ser heterologos de la celula hospedadora o entre si. Como se usa en el presente documento, "heterologa" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina de una especie ajena o, si es de la misma especie, esta sustancialmente modificada con respecto a su forma nativa en su composicion y/o locus genomico por intervencion humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente con un polinucleotido heterologo es de una especie diferente de la especie de la que se obtuvo el polinucleotido o, si es de la misma especie o una analoga, uno o mas se modifican sustancialmente con respecto a su forma y/o locus genomico original, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleotido unido operativamente. Como se usa en el presente documento, un gen quimerico comprende una secuencia codificante unida operativamente con una region de inicio de la transcripcion que es heterologa de la secuencia codificante.
La region de terminacion puede ser nativa de la region de inicio de la transcripcion, puede ser nativa del polinucleotido unido operativamente que codifica el elemento de silenciamiento, puede ser nativa del hospedador
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vegetal o puede obtenerse de otra fuente (es decir, ajena o heterologa) para el promotor, el polinucleotido que comprende elemento de silenciamiento, el hospedador vegetal o cualquier combinacion de los mismos. Estan disponibles regiones de terminacion convenientes del plasmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminacion de octopina sintasa y nopalina sintasa. Vease tambien Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:78917903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.
Se sabe que modificaciones adicionales de secuencia potencian la expresion genica en un hospedador celular. Estas incluyen la eliminacion de secuencias que codifican senales de poliadenilacion falsas, senales de sitios de corte y empalme de exon-intron, repeticiones de tipo transposon y otras de dichas secuencias bien caracterizadas que pueden ser deletereas para la expresion genica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a niveles promedio para un hospedador celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la celula hospedadora. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas.
En la preparacion del casete de expresion, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientacion apropiada y, segun sea apropiado, en la fase de lectura apropiada. Para este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restriccion convenientes, retirada de ADN superfluo, retirada de sitios de restriccion, o similares. Para este fin, pueden estar implicadas mutagenesis in vitro, reparacion de cebadores, restriccion, hibridacion, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.
Pueden usarse varios promotores en la practica de la invencion. El polinucleotido que codifica el elemento de silenciamiento puede combinarse con promotores constitutivos, preferidos por tejidos u otros para expresion en plantas.
Dichos promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos desvelados en el documento WO 99/43838 y la patente de los Estados Unidos n.° 6.072.050; el promotor central de CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente de los Estados Unidos n.° 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.
Tambien se podrfa emplear un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible por patogeno. Dichos promotores incluyen los de protefnas relacionadas con la patogenesis (protefnas PR), que se inducen despues de infeccion por un patogeno; por ejemplo, protefnas PR, protefnas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Vease, por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Vease tambien el documento WO 99/43819.
Ademas, a medida que los patogenos encuentran entrada en plantas a traves de heridas o dano de insectos, puede usarse un promotor inducible por herida en las construcciones de la invencion. Dichos promotores inducibles por herida incluyen gen del inhibidor de proteinasa de la patata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 y wun2, Patente de los Estados Unidos n.° 5.428.148; win1 y win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen de MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150); y similares.
Pueden usarse promotores regulados por productos qufmicos para modular la expresion de un gen en una planta mediante la aplicacion de un regulador qufmico exogeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por productos qufmicos, donde la aplicacion del producto qufmico induce expresion genica, o un promotor reprimible por productos qufmicos, donde la aplicacion del producto genico reprime la expresion genica. Se conocen en la tecnica promotores inducibles por productos qufmicos e incluyen, pero sin limitacion, el promotor de In2-2 de mafz, que se activa mediante protectores herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor de GST de mafz, que se activa mediante compuestos electrofilos hidrofobos que se usan como herbicidas preemergentes, y el promotor de PR-1a del tabaco, que es activado por acido salicflico. Otros promotores regulados por productos qufmicos de interes incluyen promotores sensibles a esteroides (vease, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (vease, por ejemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 y las patentes de los Estados Unidos n.° 5.814.618 y 5.789.156).
Los promotores preferidos por tejidos pueden utilizarse para dirigir la expresion potenciada en un tejido vegetal particular. Los promotores preferidos por tejido incluyen Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al.
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(1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara- Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Dichos promotores pueden modificarse, si es necesario, para expresion debil.
Son conocidos en la tecnica promotores preferidos en hojas. Vease, por ejemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773- 778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; y Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
Se conocen promotores preferidos en rafces y pueden seleccionarse de los muchos disponibles de la bibliograffa o aislarse de novo de diversas especies compatibles. Vease, por ejemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207- 218 (gen de glutamina sintetasa especffico de rafz de soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de control especffico de rafz en el gen de GRP 1.8 de haba); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor especffico de rafz del gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica glutamina sintetasa (Gs) citosolica, que se expresa en rafces y nodulos de rafces de soja). Vease tambien Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, donde se describen dos promotores especfficos de rafz aislados de genes de hemoglobina de la fijadora del nitrogeno no leguminosa Parasponia andersonii y la no fijadora del nitrogeno no leguminosa relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se unieron con un gen indicador de p-glucuronidasa y se introdujeron tanto en la no leguminosa Nicotiana tabacum como en la leguminosa Lotus corniculatus, y en ambos casos se conservo la actividad promotora especffica de rafz. Leach y Aoyagi (1991) describen su analisis de los promotores de los genes inductores de la rafz rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (vease Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Concluyeron que los determinantes de ADN preferidos por tejido y potenciadores se disocian en esos promotores. Teeri et al. (1989) usaron la fusion genica con lacZ para mostrar que el gen de ADN-T de Agrobacterium que codifica octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la rafz y que el gen de TR2' es especffico de rafz en la planta intacta y es estimulado por heridas en el tejido de la hoja, una combinacion especialmente deseable de caracterfsticas para su uso con un gen insecticida o larvicida (vease EMBO J. 8(2):343-350). El gen de TR1', fusionado con nptII (neomicina fosfotransferasa II) mostro caracterfsticas similares. Los promotores preferidos en la rafz adicionales incluyen el promotor del gen de VfENOD- GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); y promotor de rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Veanse tambien las patentes de los Estados Unidos n.° 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179.
En una divulgacion el promotor expresado en plantas es un promotor especffico vascular tal como un promotor especffico de floema. Un promotor "especffico vascular", como se usa en el presente documento, es un promotor que se expresa al menos en celulas vasculares o un promotor que se expresa preferentemente en celulas vasculares. No es necesario que la expresion de un promotor especffico vascular sea exclusivamente en celulas vasculares, es posible la expresion en otros tipos celulares o tejidos. Un "promotor especffico de floema", como se usa en el presente documento, es un promotor expresable en plantas que se expresa al menos en celulas del floema o un promotor que se expresa preferentemente en celulas del floema.
No es necesario que la expresion de un promotor especffico del floema sea exclusivamente en celulas del floema, es posible la expresion en otros tipos celulares o tejidos, por ejemplo, tejido del xilema. En una divulgacion, un promotor especffico del floema es un promotor expresable en plantas al menos expresado en celulas del floema, en donde la expresion en celulas no del floema esta mas limitada (o ausente) en comparacion con la expresion en celulas del floema. Los ejemplos de promotores especfficos vasculares o especfficos del floema adecuados de acuerdo con esta divulgacion incluyen pero sin limitacion los promotores seleccionados del grupo que consiste en: los promotores SCSV3, SCSV4, SCSV5 y SCSV7 (Schunmann et al. (2003) Plant Functional Biology 30:453-60; el promotor del gen de rolC de Agrobacterium rhizogenes (Kiyokawa et al. (1994) Plant Physiology 104:801-02; Pandolfini et al. (2003) BioMedCentral (BMC) Biotechnology 3:7, (
www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7); Graham et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:729-35; Guivarc'h et al. (1996); Almon et al. (1997) Plant Physiol. 115:1599-607; el promotor del gen de rolA de Agrobacterium rhizogenes (Dehio et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:1199-210); el promotor del gen de ADN-T 5 de Agrobacterium tumefaciens (Korber et al. (1991) EMBO J. 10:3983-91); el promotor del gen de sacarosa sintasa RSs1 del arroz (Shi et al. (1994) J. Exp. Bot. 45:623-31); el promotor de CoYMV o badnavirus de moteado amarillo de la Commelina (Medberry et al. (1992) Plant Cell 4:185-92; Zhou et al. (1998) Chin. J. Biotechnol. 14:9-16); el promotor de CFDV o virus del deterioro foliar del coco (Rohde et al. (1994) Plant Mol. Biol. 27:623-28; Hehn y Rhode
(1998) J. Gen. Virol. 79:1495-99); el promotor del RTbV o virus baciliforme del tungro del arroz (Yin y Beachy (1995) Plant J. 7:969-80; Yin et al. (1997) Plant J. 12:1179-80); el gen de la glutamina sintasa del guisante GS3A (Edwards et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3459-63; Brears et al. (1991) Plant J. 1:235-44); los promotores inv CD111 y inv CD141 de los genes de la invertasa de la patata (Hedley et al. (2000) J. Exp. Botany 51:817-21); el promotor aislado de Arabidopsis que se ha mostrado que tiene expresion especffica del floema en tabaco en Kertbundit et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5212-16); la region promotora de VAHOX1 (Tornero et al. (1996) Plant J. 9:639-48); el promotor del gen de la invertasa de la pared celular del guisante (Zhang et al. (1996)
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Plant Physiol. 112:1111-17); el promotor de la protefna relacionada con la quitinasa del algodon endogena de la solicitud de la patente publicada de los Estados Unidos 20030106097, un promotor del gen de la invertasa acida de la zanahoria (Ramloch-Lorenz et al. (1993) The Plant J. 4:545-54); el promotor del gen del transportador del sulfato Sultr1; 3 (Yoshimoto et al. (2003) Plant Physiol. 131:1511-17); un promotor de un gen de la sacarosa sintasa (Nolte y Koch (1993) Plant Physiol. 101:899-905); y el promotor de un gen del transportador de la sacarosa del tabaco (Kuhn et al. (1997) Science 275-1298-1300).
Los promotores posibles tambien incluyen el promotor del cerezo negro para la prunasina hidrolasa (PH DL1.4 PRO) (patente de los Estados Unidos n.° 6.797.859), promotor de tiorredoxina H del pepino y el arroz (Fukuda A et al. (2005). Plant Cell Physiol. 46(11):1779-86), arroz (RSs1) (Shi, T. Wang et al. (1994). J. Exp. Bot. 45(274): 623-631) y promotores de sacarosa sintasa-1 del mafz (Yang., N-S. et al. (1990) PNAS 87:4144-4148), promotor PP2 de la calabaza (Guo, H. et al. (2004) Transgenic Research 13:559-566), promotor At SUC2 (Truernit, E. et al. (1995) Planta 196(3):564-70., At SaM-1 (S-adenosilmetionina sintetasa) (Mijnsbrugge KV. et al. (1996) Planr. Cell. Physiol. 37(8): 1108-1115), y el promotor del virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV) (Bhattacharyya-Pakrasi et al. (1993) Plant J. 4(1):71-79).
El casete de expresion tambien puede comprender un gen marcador seleccionable para la seleccion de celulas transformadas. Se utilizan genes marcadores seleccionables para la seleccion de celulas o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibioticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), asf como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinil, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Los marcadores seleccionables adicionales incluyen marcadores fenotfpicos tales como p-galactosidasa y protefnas fluorescentes tales como protefna verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 y Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), protefna cian fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42) y protefna amarilla fluorescente (PhiYFP™ de Evrogen, vease, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores seleccionables adicionales, vease en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, pags. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al.
(1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman
(1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) tesis doctoral, Universidad de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. No se entiende que la lista anterior de genes marcadores seleccionables sea limitante. Puede usarse cualquier gen marcador seleccionable.
VI. Composiciones que comprenden elementos de silenciamiento
Puede proporcionarse uno o mas de los polinucleotidos que comprenden el elemento de silenciamiento como una composicion externa tal como una pulverizacion o un polvo a la planta, parte de planta, semilla, una plaga o un area de cultivo. En otro ejemplo, una planta se transforma con una construccion de aDn o un casete de expresion para la expresion de al menos un elemento de silenciamiento. En una de las composiciones, el elemento de silenciamiento, cuando es ingerido por un insecto, puede reducir el nivel de una secuencia de plaga diana y combatir de este modo la plaga (es decir, una plaga vegetal coleoptera incluyendo una plaga vegetal de Diabrotica, tal como, D. virgifera virgifera, D. barberi o D. undecimpunctata howardi). Se reconoce que la composicion puede comprender una celula (tal como una celula vegetal o una celula bacteriana), en la que un polinucleotido que codifica el elemento de silenciamiento esta incorporado de forma estable en el genoma y esta unido operativamente con promotores activos en la celula. Tambien estan abarcadas composiciones que comprenden una mezcla de celulas, expresando algunas celulas al menos un elemento de silenciamiento. En otras divulgaciones, no estan contenidas en una celula composiciones que comprendan los elementos de silenciamiento. En dichas divulgaciones, la composicion puede aplicarse a un area habitada por una plaga. En una divulgacion, la composicion se aplica de forma externa a una planta (es decir, pulverizando un campo o area de cultivo) para proteger la planta de la plaga.
La composicion de la invencion se puede formular ademas como cebo. En esta realizacion, las composiciones comprenden una sustancia alimentaria o un atrayente que potencia el atractivo de la composicion para la plaga.
La composicion que comprende el elemento de silenciamiento puede formularse en un vehfculo agrfcolamente adecuado y/o ambientalmente aceptable. Dichos vehfculos pueden ser cualquier material que el animal, la planta o el ambiente para tratar puedan tolerar. Asimismo, el vehfculo debe ser tal que la composicion siga siendo eficaz para combatir una plaga. Los ejemplos de dichos vehfculos incluyen agua, solucion salina, solucion de Ringer, dextrosa u otras soluciones de azucar, solucion de Hank y otras soluciones salinas acuosas fisiologicamente equilibradas,
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tampon de fosfato, tampon de bicarbonato y tampon Tris. Ademas, la composicion puede incluir compuestos que aumentan la semivida de una composicion. Pueden encontrarse diversas formulaciones insecticidas en, por ejemplo, las publicaciones de los Estados Unidos 2008/0275115, 2008/0242174, 2008/0027143, 2005/0042245 y 2004/0127520.
Se reconoce que los polinucleotidos que comprenden secuencias que codifican el elemento de silenciamiento pueden usarse para transformar organismos para posibilitar la produccion por parte del organismo hospedador de estos componentes y la aplicacion posterior del organismo hospedador al ambiente de la plaga o las plagas diana. Dichos organismos hospedadores incluyen baculovirus, bacterias y similares. De esta manera, la combinacion de polinucleotidos que codifican el elemento de silenciamiento puede introducirse mediante un vector adecuado en un hospedador microbiano y dicho hospedador aplicarse al ambiente, o a plantas o animales.
El termino "introducido" en el contexto de insercion de un acido nucleico en una celula, significa "transfeccion" o "transformacion" o "transduccion" e incluye referencia a la incorporacion de un acido nucleico en una celula eucariota o procariota donde el acido nucleico pueda incorporarse de forma estable en el genoma de la celula (por ejemplo, cromosoma, plasmido, plastidio o ADN cromosomico), convertido en un replicon autonomo o expresado de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).
Pueden seleccionarse hospedadores microbianos que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o mas cultivos de interes. Estos microorganismos se seleccionan para ser capaces de competir con exito en el ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, posibilitar el mantenimiento y la expresion estable de las secuencias que codifican el elemento de silenciamiento y, convenientemente, posibilitar la proteccion mejorada de los componentes de la degradacion e inactivacion ambiental.
Dichos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de interes particular microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes, hongos, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Son de interes particular especies bacterianas de la fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir, y especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans.
Estan disponibles varios modos de introduccion del polinucleotido que comprende el elemento de silenciamiento en el hospedador microbiano en condiciones que permiten el mantenimiento y la expresion estable de dichas secuencias codificantes de nucleotidos. Por ejemplo, pueden construirse casetes de expresion que incluyen las construcciones de nucleotidos de interes unidas operativamente con las senales reguladoras de la transcripcion y la traduccion para expresion de las construcciones de nucleotidos y una secuencia de nucleotidos homologa de una secuencia en el organismo hospedador, mediante la cual se producira integracion, y/o un sistema de replicacion que sea funcional en el hospedador, mediante el cual se producira integracion o mantenimiento estable.
Las senales reguladoras de la transcripcion y la traduccion incluyen, pero sin limitacion, promotores, sitios de inicio de la transcripcion, operadores, activadores, potenciadores, otros elementos reguladores, sitios de union a ribosomas, un codon de inicio, senales de terminacion y similares. Vease, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos n.° 5.039.523 y 4.853.331; documento EPO 0480762A2; Sambrook et al. (2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plain-view, NY); Davis et al. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY); y las referencias citadas en los mismos.
Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen los procariotas y los eucariotas inferiores, tales como hongos. Los procariotas ilustrativos, tanto grampositivos como gramnegativos, incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotas estan hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levadura, tal como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y levadura Basidiomycetes, tal como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces y similares.
Las caracterfsticas de interes particular en la seleccion de una celula hospedadora para fines de la divulgacion incluyen facilidad de introduccion de la secuencia codificante en el hospedador, disponibilidad de sistemas de expresion, eficacia de expresion, estabilidad en el hospedador y la presencia de capacidades geneticas auxiliares. Las caracterfsticas de interes para uso como una microcapsula pesticida incluyen cualidades protectoras, tales como paredes celulares gruesas, pigmentacion y empaquetamiento intracelular o formacion de cuerpos de inclusion; afinidad foliar; ausencia de toxicidad para mamfferos; atractivo para la ingesta por plagas; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulacion y manipulacion, economfa, estabilidad de almacenamiento y
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similares.
Los organismos hospedadores de interes particular incluyen levadura, tal como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp., y Sporobolomyces spp., organismos del filoplano tales como Pseudomonas spp., Erwinia spp. y Flavobacterium spp., y otros de dichos organismos, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, y similares.
Las secuencias que codifican los elementos de silenciamiento abarcados por la invencion pueden introducirse en microorganismos que se multiplican en plantas (epffitos) para suministrar estos componentes a plagas diana potenciales. Los epffitos, por ejemplo, pueden ser bacterias grampositivas o gramnegativas.
El elemento de silenciamiento puede fermentarse en un hospedador bacteriano y las bacterias resultantes procesarse y usarse como una pulverizacion microbiana de la misma manera que las cepas de Bacillus thuringiensis se han usado como pulverizaciones insecticidas. Se puede usar cualquier microorganismo adecuado para este fin. Se ha usado Pseudomonas para expresar endotoxinas de Bacillus thuringiensis como protefnas encapsuladas y las celulas resultantes se han procesado y pulverizado como un insecticida Gaertner et al. (1993), en Advanced Engineered Pesticides, ed. L. Kim (Marcel Decker, Inc.).
Como alternativa, los componentes de la divulgacion se producen introduciendo genes heterologos en un hospedador celular. La expresion de las secuencias heterologas da como resultado, directa o indirectamente, la produccion intracelular del elemento de silenciamiento. Estas composiciones pueden despues formularse de acuerdo con tecnicas convencionales para aplicacion al ambiente que alberga una plaga diana, por ejemplo, suelo, agua y follaje de plantas. Vease, por ejemplo, documento EPA 0192319 y las referencias citadas en el mismo.
En la presente divulgacion, puede formularse un microorganismo transformado con un vehfculo aceptable en composiciones separadas o combinadas que son, por ejemplo, una suspension, una solucion, una emulsion, polvo para espolvoreo, un granulo dispersable, un polvo humectable y un concentrado emulsionable, un aerosol, un granulo impregnado, un adyuvante, una pasta para revestimiento y tambien encapsulaciones en, por ejemplo, sustancias polimericas.
Dichas composiciones desveladas anteriormente pueden obtenerse mediante la adicion de un agente tensioactivo, un vehfculo inerte, un conservante, un humectante, un estimulante de la alimentacion, un atrayente, un agente de encapsulacion, un aglutinante, un emulsionante, un colorante, un protector de UV, un tampon, un agente de flujo o fertilizantes, donantes de micronutrientes u otras preparaciones que influyan en el crecimiento de la planta. Uno mas productos agroqufmicos, incluyendo, pero sin limitacion, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaricidas, reguladores del crecimiento de la planta, asistentes de la cosecha y fertilizantes, pueden combinarse con vehfculos, tensioactivos o adyuvantes empleados habitualmente en la tecnica de la formulacion u otros componentes para facilitar la manipulacion del producto y la aplicacion para plagas diana particulares. Los vehfculos y adyuvantes adecuados pueden ser solidos o lfquidos y corresponden a las sustancias empleadas habitualmente en la tecnologfa de formulacion, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, adherentes, aglutinantes o fertilizantes. Los principios activos de la presente invencion (es decir, al menos un elemento de silenciamiento) se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse al area de cultivo, la planta o la semilla para tratar. Por ejemplo, las composiciones pueden aplicarse a grano en preparacion para o durante el almacenamiento en un contenedor de grano o silo, etc. Las composiciones pueden aplicarse de forma simultanea o sucesiva con otros compuestos. Los metodos para aplicar un principio activo o una composicion que contiene al menos un elemento de silenciamiento incluyen, pero sin limitacion, aplicacion foliar, revestimiento de semillas y aplicacion al suelo. El numero de aplicaciones y la tasa de aplicacion dependen de la intensidad de infestacion por la plaga correspondiente.
Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, pero sin limitacion, compuestos anionicos tales como un carboxilato de, por ejemplo, un metal; carboxilato de un acido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o diesteres de acido fosforico con etoxilatos de alcohol graso o sales de dichos esteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato sodico, octadecil sulfato sodico o cetil sulfato sodico; sulfatos de alcohol graso etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petroleo; sulfonatos de alquil arilo tales como sulfonatos de alquil-benceno o sulfonatos de alquilnaftaleno inferiores, por ejemplo, sulfonato de butil-naftaleno; sales de condensados de naftaleno sulfonado-formaldehfdo; sales de condensados de fenol sulfonado-formaldehfdo; sulfonatos mas complejos tales como los sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensacion sulfonado de acido oleico y N-metil taurina; o los sulfosuccinatos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato sodico o succinato de dioctilo. Los agentes no ionicos incluyen productos de condensacion de esteres de acidos grasos, alcoholes grasos, amidas de acidos grasos o fenoles sustituidos con alquilo graso o alquenilo con oxido de etileno, esteres grasos de eteres de alcohol polihfdrico, por ejemplo, esteres de acido graso de sorbitano, productos de condensacion de dichos esteres con oxido de etileno, por ejemplo, esteres de acido graso de polioxietilensorbitano, copolfmeros en bloque de oxido de etileno y oxido de propileno, glicoles acetilenicos tales como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, o glicoles acetilenicos etoxilados. Los ejemplos de un agente tensioactivo cationico incluyen, por ejemplo, una mono, di o poliamina alifatica tal como un acetato, naftenato u oleato; o amina que contiene oxfgeno tal como un oxido de amina de alquilamina de polioxietileno; una amina ligada a amida preparada mediante la condensacion de un acido
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carboxflico con una di o poliamina; o una sal de amonio cuaternario.
Los ejemplos de materiales inertes incluyen, pero sin limitacion, minerales inorganicos tales como caolina, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botanicos tales como corcho, mazorcas de mafz espolvoreadas, cascaras de cacahuetes, cascarillas de arroz y cascaras de nueces.
Las composiciones que comprenden el elemento de silenciamiento pueden estar en una forma adecuada para aplicacion directa o como un concentrado de composicion primaria que requiere dilucion con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicacion.
Las composiciones (incluyendo los microorganismos transformados) pueden aplicarse al ambiente de una plaga de insecto (tal como una plaga vegetal coleoptera o una plaga vegetal de Diabrotica) mediante, por ejemplo, pulverizacion, atomizacion, espolvoreado, dispersion, recubrimiento o vertido, introduccion en o sobre el suelo, introduccion en agua de irrigacion, mediante tratamiento de semillas o aplicacion general o espolvoreo en el momento cuando la plaga ha comenzado a aparecer o antes de la aparicion de plagas como una medida protectora. Por ejemplo, la composicion o las composiciones y/o el microorganismo o los microorganismos transformados pueden mezclarse con grano para proteger el grano durante el almacenamiento. Es en general importante obtener buen control de plagas en los estadios tempranos del crecimiento vegetal, ya que este es el momento cuando la planta puede danarse de forma mas grave. Las composiciones pueden contener convenientemente otro insecticida si se cree que esto es necesario. En una divulgacion, la composicion o las composiciones se aplican directamente al suelo, en un momento de plantacion, en forma granular de una composicion de un vehfculo y celulas muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado. Tambien se desvela una forma granular de una composicion que comprende un producto agroqufmico tal como, por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, en un vehfculo inerte y celulas muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado.
VII. Plantas, partes de plantas y metodos para introducir secuencias en plantas
En una realizacion, los metodos de la invencion implican introducir un polinucleotido en una planta. Se entiende que "introducir" significa presentar el polinucleotido a la planta de modo que la secuencia consiga acceder al interior de una celula de la planta. Los metodos de la invencion no dependen de un metodo particular para introducir una secuencia en una planta, solo que el polinucleotido o los polipeptidos consiguen acceder al interior de al menos una celula de la planta. Se conocen en la tecnica metodos para introducir polinucleotidos en plantas incluyendo, pero sin limitacion, metodos de transformacion estables, metodos de transformacion transitorios y metodos mediados por virus.
Se entiende que "transformacion estable" significa que la construccion de nucleotidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y puede ser heredado por la descendencia de la misma. Se entiende que "transformacion transitoria" significa que un polinucleotido se introduce en la planta y no se integra en el genoma de la planta o se introduce un polipeptido en una planta.
Los protocolos de transformacion asf como protocolos para introducir polipeptidos o secuencias polinucleotfdicas en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o celula vegetal, es decir, monocotiledonea o dicotiledonea, dirigida para transformacion. Los metodos adecuados para introducir polipeptidos y polinucleotidos en celulas vegetales incluyen microinyeccion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporacion (Riggs et al.
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformacion mediada por Agrobacterium (patente de los Estados Unidos n.° 5.563.055 y patente de los Estados Unidos n.° 5.981.840), transferencia genica directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleracion balfstica de partfculas (vease, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 4.945.050; Patente de los Estados Unidos n.° 5.879.918; Patente de los Estados Unidos n.° 5.886.244; y, 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformacion por Lecl (documento WO 00/28058). Vease tambien Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al.
(1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (mafz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (mafz); las patentes de los Estados Unidos n.° 5.240.855; 5.322.783; y, 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (mafz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (mafz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; patente de los Estados Unidos n.° 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (liliaceas); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), pags. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformacion mediada por fibras); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporacion); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (mafz mediante Agrobacterium tumefaciens).
En otras divulgaciones, el polinucleotido de la invencion puede introducirse en plantas poniendo en contacto plantas
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con un virus o acidos nucleicos vfricos. En general, dichos metodos implican incorporar una construccion de nucleotidos de la divulgacion en una molecula de ADN o ARN vfrico. Ademas, se reconoce que promotores de la divulgacion tambien abarcan promotores utilizados para transcripcion por ARN polimerasas vfricas. Se conocen en la tecnica metodos para introducir polinucleotidos en plantas y expresar una protefna codificada en los mismos, que implican moleculas de ADN o aRn vfricas. Vease, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n°. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 y Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221.
Se conocen en la tecnica metodos para la insercion dirigida de un polinucleotido en una localizacion especffica en el genoma vegetal. En una divulgacion, la insercion del polinucleotido en una localizacion genomica deseada se consigue usando un sistema de recombinacion especffico de sitio. Vease, por ejemplo, los documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 y WO99/25853. Brevemente, el polinucleotido de la invencion puede estar contenido en casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinacion no recombinogenicos. El casete de transferencia se introduce en una planta que tiene incorporado de forma estable en su genoma un sitio diana que esta flanqueado por dos sitios de recombinacion no recombinogenico que corresponden a los sitios del casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y el casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleotido de interes se integra de este modo en una posicion cromosomica especffica en el genoma vegetal.
Las celulas que se han transformado pueden cultivarse en plantas de acuerdo con modos convencionales. Vease, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden despues cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y la descendencia resultante que tiene expresion constitutiva de la caracterfstica fenotfpica deseada. Pueden cultivarse dos o mas generaciones para asegurar que la expresion de la caracterfstica fenotfpica deseada se mantenga de forma estable y se herede y despues se recolectan semillas para asegurar que se ha conseguido la expresion de la caracterfstica fenotfpica deseada. De esta manera, la presente invencion proporciona semillas transformadas (tambien denominadas "semillas transgenicas") que tienen un polinucleotido de la invencion, por ejemplo, un casete de expresion de la invencion, incorporado de forma estable en su genoma.
Como se usa en el presente documento, el termino planta incluye celulas vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido de celulas vegetales a partir de los que pueden regenerarse plantas, callos de plantas, agrupaciones de plantas y celulas vegetales que estan intactos en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, ovulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, vainas, tallos, rafces, puntas de rafces, anteras y similares. Se entiende que grano significa la semilla madura producida por cultivadores comerciales para fines distintos del cultivo o la reproduccion de las especies.
La presente invencion puede usarse para transformacion de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitacion, monocotiledoneas o dicotiledoneas. Los ejemplos de especies vegetales de interes incluyen, pero sin limitacion, mafz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente las especies de Brassica utiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo comun (Panicum miliaceum), panizo (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cartamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodon (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), cafe (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), pina (Ananas comosus), arboles cftricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), te (Camellia sinensis), platano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), cana de azucar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y confferas.
Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judfas verdes (Phaseolus vulgaris), alubias de lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del genero Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melon (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo.
Las confferas que pueden emplearse en la practica de la presente invencion incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino tea (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino torcido (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); tsuga de Alberta (Tsuga canadensis); pfcea de Sitka (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto blanco (Abies amabilis) y abeto de balsamo (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo del Pacffico (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones especfficas, las plantas de la presente invencion son plantas de cultivo (por ejemplo, mafz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodon, cartamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras realizaciones, las plantas de mafz y soja son optimas y en otras realizaciones mas las plantas de mafz son optimas.
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Otras plantas de interes incluyen plantas de cereales que proporcionan semillas de interes, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interes incluyen semillas de cereales, tales como mafz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodon, soja, cartamo, girasol, Brassica, maz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen judfas y guisantes. Las judfas incluyen guar, algarrobo, fenogreco, soja, alubias, frijol, judfa mung, alubia de lima, haba, lentejas, garbanzo, etc.
VIII. Metodos de uso
Los metodos de la invencion comprenden metodos para combatir una plaga (es decir, una plaga vegetal coleoptera, incluyendo una plaga vegetal de Diabrotica, tal como, D. virgifera virgifera, D. barberi o D. undecimpunctata howardi). El metodo comprende alimentar una plaga con una composicion que comprende un elemento de silenciamiento de la invencion, en donde dicho elemento de silenciamiento, cuando es ingerido por una plaga (es decir, una plaga vegetal coleoptera incluyendo una plaga vegetal de Diabrotica, tal como, D. virgifera virgifera, D. barberi o D. undecimpunctata howardi), reduce el nivel de un polinucleotido diana de la plaga y combate de este modo la plaga. La plaga puede alimentarse con el elemento de silenciamiento de una diversidad de maneras. Por ejemplo, en una realizacion, el polinucleotido que comprende el elemento de silenciamiento se introduce en una planta. A medida que la plaga vegetal coleoptera o plaga vegetal de Diabrotica se alimenta de la planta o parte de la misma que expresa estas secuencias, el elemento de silenciamiento se suministra a la plaga. Cuando el elemento de silenciamiento se suministra a la planta de esta manera, se reconoce que el elemento de silenciamiento puede expresarse de forma constitutiva o, como alternativa, se puede producir de una manera espedfica de estadio empleando los diversos promotores inducibles o preferidos por tejido o regulados por el desarrollo que se analizan en otra parte del presente documento. En divulgaciones espedficas, el elemento de silenciamiento se expresa en las rafces, el tronco o el tallo, la hoja incluyendo el pedicelo, el xilema y el floema, el fruto o tejido reproductivo, la seda, las flores y todas las partes de los mismos.
En otro metodo, una composicion que comprende al menos un elemento de silenciamiento se aplica a una planta. En dichas realizaciones, el elemento de silenciamiento puede formularse en un vehnculo agronomicamente adecuado y/o ambientalmente aceptable, que es, preferentemente, adecuado para su dispersion en campos. Ademas, el vefnculo puede incluir tambien compuestos que aumentan la semivida de la composicion. En divulgaciones espedficas, la composicion que comprende el elemento de silenciamiento se formula de tal manera que persista en el ambiente durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que sea suministrado a una plaga. En dichas divulgaciones, la composicion puede aplicarse a un area habitada por una plaga. En una divulgacion, la composicion se aplica de forma externa a una planta (es decir, pulverizando un campo) para proteger la planta de plagas.
En determinadas divulgaciones, las construcciones de la presente invencion pueden apilarse con cualquier combinacion de secuencias polinucleotfdicas de interes para crear plantas con un rasgo deseado. Un rasgo, como se usa en el presente documento, se refiere al fenotipo procedente de una secuencia particular o grupos de secuencias. Por ejemplo, los polinucleotidos de la presente invencion pueden apilarse con cualquier otro polinucleotido que codifique polipeptidos que tengan actividad pesticida y/o insecticida, tales como otras protemas toxicas de Bacillus thuringiensis (descritas en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita en la patente de los Estados Unidos n.° 5.981.722), y similares. Las combinaciones generadas tambien pueden incluir multiples copias de uno cualquiera de los polinucleotidos de interes. Los polinucleotidos de la presente invencion tambien pueden apilarse con cualquier otro gen o combinacion de genes para producir plantas con una diversidad de combinaciones de rasgos deseadas incluyendo, pero sin limitacion, rasgos deseables para alimentacion animal tales como altos genes oleosos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 6.232.529); aminoacidos equilibrados (por ejemplo, hordotioninas (patente de los Estados Unidos n.° 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; y 5.703.409); protemas de cebada altas en lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y documento WO 98/20122) y altas en metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidad aumentada (por ejemplo, protemas de almacenamiento modificadas (solicitud de los Estados Unidos n.° de serie 10/053.410, presentada el 7 de noviembre de 2001); y tiorredoxinas (solicitud de los Estados Unidos n.° de serie 10/005.429, presentada el 3 de diciembre de 2001)).
Los polinucleotidos de la presente invencion tambien pueden apilarse con rasgos deseables para resistencia a enfermedad o herbicidas (por ejemplo, genes de destoxificacion de fumonisina (patente de los Estados Unidos n.° 5.792.931); genes de avirulencia y resistencia a enfermedad (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; los inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS)); y rasgos deseables para procesamiento o procesar productos tales como altos oleosos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de acido graso desaturasa (patente de los Estados Unidos n.° 5.952.544; documento WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidon sintasas (SS), enzimas ramificadoras del almidon (SBE) y enzimas desramificadoras del almidon (SDBE)); y polfmeros o bioplasticos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 5.602.321; beta-cetotiolasa,
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polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresion de polihidroxialcanoatos (PHA)). Se podnan combinar tambien los polinucleotidos de la presente invencion con polinucleotidos que proporcionan rasgos agronomos tales como esterilidad masculina (por ejemplo, vease patente de los Estados Unidos n.° 5.583.210), fuerza del tallo, tiempo de floracion o rasgos de tecnologfa de transformacion tales como regulacion del ciclo celular o direccion genica (por ejemplo, documentos WO 99/61619, WO 00/17364 y WO 99/25821).
Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas por cualquier metodo incluyendo, pero sin limitacion, plantas cruzadas por cualquier metodologfa convencional o TopCross, o transformacion genetica. Si las secuencias se apilan transformando geneticamente las plantas, las secuencias polinucleotidicas de interes pueden combinarse en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgenica que comprende uno o mas rasgos deseados puede usarse como la diana para introducir rasgos adicionales mediante transformacion posterior. Los rasgos pueden introducirse simultaneamente en un protocolo de cotransformacion con los polinucleotidos de interes proporcionado por cualquier combinacion de casetes de transformacion. Por ejemplo, si se van a introducir dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformacion por separado (trans) o contenidas en el mismo casete de transformacion (cis). La expresion de las secuencias puede ser conducida por el mismo promotor o por diferentes promotores. En determinados casos, puede ser deseable introducir un casete de transformacion que suprimira la expresion del polinucleotido de interes. Este puede combinarse con cualquier combinacion de otros casetes de supresion o casetes de sobreexpresion para generar la combinacion deseada de rasgos en la planta. Se reconoce ademas que pueden apilarse secuencias polinucleotfdicas en una localizacion genomica deseada usando un sistema de recombinacion espedfico de sitio. Vease, por ejemplo, documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 y WO99/25853.
Se proporcionan ademas metodos y composiciones que permiten un aumento de ARNi producido a partir del elemento de silenciamiento. En dichas divulgaciones, los metodos y composiciones emplean un primer polinucleotido que comprende un elemento de silenciamiento para una secuencia de plaga diana unida operativamente con un promotor activo en una celula vegetal; y, un segundo polinucleotido que comprende un elemento potenciador supresor que comprende la secuencia de plaga diana o una variante activa o fragmento de la misma unida operativamente con un promotor activo en la celula vegetal. La expresion combinada del elemento de silenciamiento con elemento potenciador supresor conduce a una amplificacion aumentada del ARN inhibidor producido a partir del elemento de silenciamiento por encima de lo que puede conseguirse solamente con la expresion del elemento de silenciamiento por sf solo. Ademas de la amplificacion aumentada de la especie de ARNi espedfica en sf misma, los metodos y composiciones permiten ademas la produccion de una poblacion diversa de especies de ARNi que pueden potenciar la eficacia de la alteracion de la expresion genica diana. Por tanto, cuando el elemento potenciador supresor se expresa en una celula vegetal en combinacion con el elemento de silenciamiento, los metodos y la composicion pueden permitir la produccion sistemica de ARNi por toda la planta; la produccion de cantidades mayores de ARNi que lo que se observana solamente con la construccion del elemento de silenciamiento por sf solo; y, la carga mejorada de ARNi en el floema de la planta, proporcionando de este modo mejor control de insectos que se alimentan del floema mediante un enfoque de ARNi. Por tanto, los diversos metodos y composiciones proporcionan metodos mejorados para el suministro de ARN inhibidor al organismo diana. Vease, por ejemplo, la solicitud de los Estados Unidos n.° 12/351.093, titulada "Compositions and Methods for the Suppression of Target Polynucleotides'", presentada el 9 de enero de 2009.
Como se usa en el presente documento, un "elemento potenciador supresor" comprende un polinucleotido que comprende la secuencia diana para suprimir o un fragmento activo o variante del mismo. Se reconoce que no es necesario que el elemento potenciador supresor sea identico a la secuencia diana, sino que mas bien, el elemento potenciador supresor puede comprender una variante de la secuencia diana, siempre que el elemento potenciador supresor tenga suficiente identidad de secuencia con la secuencia diana para permitir un nivel aumentado del ARNi producido por el elemento de silenciamiento por encima del que puede conseguirse solamente con la expresion del elemento de silenciamiento. De manera similar, el elemento potenciador supresor puede comprender un fragmento de la secuencia diana, en donde el fragmento es de suficiente longitud para permitir un nivel aumentado del ARNi producido por el elemento de silenciamiento por encima del que puede conseguirse solamente con la expresion del elemento de silenciamiento. Por tanto, en divulgaciones espedficas, el elemento potenciador supresor comprende un polinucleotido expuesto en SEQ ID NO: 1-236 o uno de sus variantes o fragmentos activos.
Se reconoce que pueden emplearse multiples elementos potenciadores supresores de la misma secuencia diana o de diferentes secuencias diana, o de diferentes regiones de la misma secuencia diana. Por ejemplo, los elementos potenciadores supresores empleados pueden comprender fragmentos de la secuencia diana procedente de una region diferente de la secuencia diana (es decir, de la 3'UTR, secuencia codificante, intron y/o 5'UTR). Ademas, el elemento potenciador supresor puede estar contenido en un casete de expresion, como se describe en otra parte en el presente documento, y en divulgaciones espedficas, el elemento potenciador supresor esta en el mismo vector o construccion de ADN o en uno diferente como el elemento de silenciamiento. El elemento potenciador supresor puede estar unido operativamente a un promotor como se desvela en el presente documento. Se reconoce que el elemento potenciador supresor puede expresarse de forma constitutiva o, como alternativa, se puede producir de una manera espedfica de estadio empleando los diversos promotores inducibles o preferidos por tejido o regulados por el desarrollo que se analizan en otra parte del presente documento.
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En divulgaciones especfficas, empleando tanto un elemento de silenciamiento como el elemento potenciador supresor la produccion sistemica de ARNi se produce por toda la planta completa. En divulgaciones adicionales, la planta o partes de planta tienen una carga mejorada de ARNi en el floema de la planta que se observarfa con la expresion de la construccion del elemento de silenciamiento solo y, de este modo, proporcionan mejor control de insectos que se alimentan del floema mediante un enfoque de ARNi. En divulgaciones especfficas, las plantas, partes de planta y celulas vegetales pueden caracterizarse adicionalmente por permitir la produccion de una diversidad de especies de ARNi que pueden potenciar la eficacia de la alteracion de la expresion genica diana.
En divulgaciones especfficas, la expresion combinada del elemento de silenciamiento y el elemento potenciador supresor aumenta la concentracion del ARN inhibidor en la celula vegetal, planta, parte de planta, tejido vegetal o floema por encima del nivel que se consigue cuando el elemento de silenciamiento se expresa solo.
Como se usa en el presente documento, un "nivel aumentado de ARN inhibidor" comprende cualquier aumento estadfsticamente significativo en el nivel de ARNi producido en una planta que tiene la expresion combinada en comparacion con una planta de control apropiada. Por ejemplo, un aumento en el nivel de ARNi en la planta, la parte de planta o la celula vegetal puede comprender al menos un aumento de aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 1 %-5 %, aproximadamente un 5 % -10 %, aproximadamente un 10 %-20 %, aproximadamente un 20 %-30 %, aproximadamente un 30 %-40 %, aproximadamente un 40 %-50 %, aproximadamente un 50 %-60 %, aproximadamente 60-70 %, aproximadamente 70 %-80 %, aproximadamente un 80 %-90 %, aproximadamente un 90 %-100 % o mayor en el nivel de ARNi en la planta, parte de planta, celula vegetal o floema en comparacion con un control apropiado. En otras divulgaciones, el aumento en el nivel de ARNi en la planta, parte de planta, celula vegetal o floema puede comprender al menos un aumento de aproximadamente 1 vez, aproximadamente 1 vez-5 veces, aproximadamente 5 veces-10 veces, aproximadamente 10 veces-20 veces, aproximadamente 20 veces-30 veces, aproximadamente 30 veces-40 veces, aproximadamente 40 veces-50 veces, aproximadamente 50 veces-60 veces, aproximadamente 60 veces-70 veces, aproximadamente 70 veces-80 veces, aproximadamente 80 veces-90 veces, aproximadamente 90 veces-100 veces o mayor en el nivel de ARNi en la planta, parte de planta, celula vegetal o floema en comparacion con un control apropiado. Se analizan en otra parte en el presente documento metodos para ensayar con respecto a un aumento en el nivel de ARNi.
Los siguientes ejemplos se presentan como ilustracion y no como limitacion.
SECCION EXPERIMENTAL
Ejemplo 1: Metodo de exploracion de ARNbc in vitro
Se produjo una biblioteca de ADNc a partir de larvas de crisomelido del mafz occidental neonatas por metodos convencionales. Un clon de ADNc seleccionado que contiene un marcador de secuencia se amplifica en una PCR usando cebadores universales para la cadena principal del plasmido y que flanquean el inserto de EST. Los cebadores universales tambien contienen sitios de ARN polimerasa T7. Se usa 1 pl de la reaccion de PCR como el molde para una reaccion de transcripcion in vitro (IVT) para producir ARN bicatenarios largos. Despues de la digestion enzimatica y la retirada del molde de ADN y aRn monocatenario, los productos de reaccion de IVT se incorporan en dieta artificial de insectos como se describe posteriormente.
Bioensayos de insectos
Se anaden 2,5 pl de la reaccion de IVT a un pocillo dado de una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Se anaden 25 pl de dieta del crisomelido del mafz occidental a la muestra y se agitan en un agitador orbital para mezclar la muestra y la dieta. Una vez que la dieta se ha solidificado, se anaden al pocillo crisomelidos neonatos. Se anade a cada pocillo un promedio de 5 neonatos. Despues de infestarse la placa, la placa se precinta con mylar y se perfora un unico orificio en el mylar sobre cada pocillo para permitir el intercambio de aire. Se producen 4 pocillos repetidos para cada muestra. El ensayo se puntua con respecto a actividad 7 dfas despues de la infestacion. Las posibles puntuaciones son muerto, gravemente atrofiado (con poco o ningun crecimiento pero vivo), atrofiado (crecimiento hasta segunda fase pero no equivalente a los controles) o sin actividad. Las muestras que demostraron mortalidad o atrofia grave se pasaron a confirmacion. Se realizaron ensayos primarios y ensayos de confirmacion con el crisomelido del mafz meridional.
Despues de la confirmacion, se realizo un ensayo de respuesta a dosis sencillo con crisomelidos del mafz tanto meridional con occidental. Se produjeron muestras para ensayos de respuesta a dosis de la misma manera con la siguiente modificacion; las muestras se purificaron adicionalmente usando purificacion en columna antes del tratamiento enzimatico. Las muestras tambien se normalizaron hasta 0,5 pg/pl y todas las muestras se evaluaron mediante electroforesis en gel. Se realizaron ensayos de respuesta a dosis con las siguientes tasas; 50, 25, 12, 6, 3 y 1,5 ppm.
Ejemplo 2. Secuencias que tienen actividad insecticida
Se exponen posteriormente secuencias de ADN que codifican ARN bicatenarios que se ha mostrado que tienen
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actividad insecticida contra crisomelidos del mafz usando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Se exponen posteriormente ejemplos no limitantes de polinucleotidos diana en la Tabla 1.
TABLA 1
SEQ ID NO: 1 >iwm2c.pk005.e1.fis1
SEQ ID NO: 2 >iwm2c.pk004.b13.fis1
SEQ ID NO: 3 >iwm2s.pk003.o11.fis1
SEQ ID NO: 4 >iwm2c.pk002.e24.fis1
SEQ ID NO: 5 >iwm2c.pk002.e24.fis1
SEQ ID NO: 6 >iwm2c.pk011.n17.fis1
SEQ ID NO: 7 >idv1c.pk001.d14.f.fis1
SEQ ID NO: 8 >idv1c.pk001.e9.f.fis1
SEQ ID NO: 9 >idv1c.pk001.m5.f.fis1
SEQ ID NO: 10 >idv1c.pk001.n1.ffis1
SEQ ID NO: 11 >idv1c.pk002.c5.f.fis1
SEQ ID NO: 12 >idvlc.pk002.f20.ffis1
SEQ ID NO: 13 >idv1c.pk002.j17.f.fis1
SEQ ID NO: 14 >idv1c.pk002.n13.f.fis1
SEQ ID NO: 15 >idv1c.pk003.d6.f.fis1
SEQ ID NO: 16 >idv1c.pk003.f8.ffis1
SEQ ID NO: 17 >idv1c.pk003.f9.ffis1
SEQ ID NO: 18 >idv1c.pk003j4.f.fis1
SEQ ID NO: 19 >idv1c.pk003.j6.ffis1
SEQ ID NO: 20 >idv1c.pk003.j20.f.fis1
SEQ ID NO: 21
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SEQ ID NO: 112 >idv1c.pk024.e1.f
SEQ ID NO: 113 >idv1c.pk024.e24.f
SEQ ID NO: 114 >idv1c.pk024.k17.f
SEQ ID NO: 115 >idv1c.pk024.m13.f
SEQ ID NO: 116 >idv1c.pk024.n1.f
SEQ ID NO: 117 >idv1c.pk024.o3.f
SEQ ID NO: 118 >idv1c.pk025.a4.f
SEQ ID NO: 119 >idv1c.pk025.c5.f
SEQ ID NO: 120 >idv1c.pk025.c23.f
SEQ ID NO: 121 >idv1c.pk025.d18.f
SEQ ID NO: 122 >idv1c.pk025.d20.f
SEQ ID NO: 123 >idv1c.pk025.f24.f
SEQ ID NO: 124 >idv1c.pk025.j20.f
SEQ ID NO: 125 >idv1c.pk025.l10.f
SEQ ID NO: 126 >idv1c.pk026.a16.f
SEQ ID NO: 127 >idv1c.pk026.b23.f
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SEQ ID NO: 133 >idv1c.pk026.j18.f
SEQ ID NO: 134 >idv1c.pk026.k13.f
SEQ ID NO: 135 >idv1c.pk027.b21.f
SEQ ID NO: 136 >idv1c.pk027.c7.f
SEQ ID NO: 137 >idv1c.pk027.k4.f
SEQ ID NO: 138 >idv1c.pk027.p21.f
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SEQ ID NO: 142 >idv1c.pk028.i16.f
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SEQ ID NO: 145 >idv1c.pk029.a17.f
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SEQ ID NO: 155 >idv1c.pk030.19.f
SEQ ID NO: 156 >idv1c.pk030.m22.f
SEQ ID NO: 157 >idv1c.pk030.o7.f
SEQ ID NO: 158 >idv1c.pk031.a11.f
SEQ ID NO: 159 >idv1c.pk031.e16.f
SEQ ID NO: 160 >idv1c.pk031.g2.f
SEQ ID NO: 161 >idv1c.pk031.g22.f
SEQ ID NO: 162 >idv1c.pk031.i13.f
SEQ ID NO: 163 >idv1c.pk031.m3.f
SEQ ID NO: 164 >idv1c.pk032.b4.f
SEQ ID NO: 165 >idv1c.pk032.e16.f
SEQ ID NO: 166 >idv1c.pk032.f14.f
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SEQ ID NO: 168 >idv1c.pk033.a15.f
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SEQ ID NO: 170 >idv1c.pk033.m3.f
SEQ ID NO: 171 >idv1c.pk033.n10.f
SEQ ID NO: 172 >idv1c.pk033.n18.f
SEQ ID NO: 173 >idv1c.pk034.e8.f
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SEQ ID NO: 176 >idv1c.pk035.g1.f
SEQ ID NO: 177 >idv1c.pk035.h19.f
SEQ ID NO: 178 >idv1c.pk035.j4.f
SEQ ID NO: 179 >idv1c.pk035.m1.f
SEQ ID NO: 180 >idv1c.pk035.o13.f
SEQ ID NO: 181 >idv1c.pk036.a14.f
SEQ ID NO: 182 >idv1c.pk036.e18.f
SEQ ID NO: 183 >idv1c.pk036.f4.f
SEQ ID NO: 184 >idv1c.pk036.f9.f
SEQ ID NO: 185 >idv1c.pk036.i17.f
SEQ ID NO: 186 >idv1c.pk036.i20.f
SEQ ID NO: 187 >idv1c.pk036.k23.f
SEQ ID NO: 188 >idv1c.pk034.k22.f
SEQ ID NO: 189 >idv1c.pk002.c7.f
SEQ ID NO: 190 >idv1c.pk002.f18.f
SEQ ID NO: 191 >idv1c.pk002.i23.f
SEQ ID NO: 192 >idv1c.pk002.j24.f
SEQ ID NO: 193 >idv1c.pk002.m16.f
SEQ ID NO: 194 >idv1c.pk002.n13.f
SEQ ID NO: 195 >idv1c.pk024.c7.f
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SEQ ID NO: 198 >idv1c.pk025.f3.f
SEQ ID NO: 199 >idv1c.pk025.i8.f
SEQ ID NO: 200 >idv1c.pk025.117.f
SEQ ID NO: 201 >idv1c.pk025.o24.f
SEQ ID NO: 202 >idv1c.pk025.p9.f
SEQ ID NO: 203 >idv1c.pk026.f20.f
SEQ ID NO: 204 >idv1c.pk026.p8.f
SEQ ID NO: 205 >idv1c.pk026.p22.f
SEQ ID NO: 206 >idv1c.pk027.a14.f
SEQ ID NO: 207 >idv1c.pk027.g7.f
SEQ ID NO: 208 >idv1c.pk027.k23.f
SEQ ID NO: 209 >idv1c.pk028.b17.f
SEQ ID NO: 210 >idv1c.pk028.f11.f
SEQ ID NO: 211 >idv1c.pk029.c3.f
SEQ ID NO: 212 >idv1c.pk029.f5.f
SEQ ID NO: 213 >idv1c.pk029.j4.f
SEQ ID NO: 214 >idv1c.pk030.b23.f
SEQ ID NO: 215 >idv1c.pk030.f9.f
SEQ ID NO: 216 >idv1c.pk030.g11.f
SEQ ID NO: 217 >idv1c.pk031.c20.f
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SEQ ID NO: 220 >idv1c.pk031.j6.f
SEQ ID NO: 221 >idv1c.pk031.p16.f
SEQ ID NO: 222 >idv1c.pk032.a16.f
SEQ ID NO: 223 >idv1c.pk032.f11.f
SEQ ID NO: 224 >idv1c.pk032.i21.f
SEQ ID NO: 225 >idv1c.pk032.n18.f
SEQ ID NO: 226 >idv1c.pk032.p5.f
SEQ ID NO: 227 >idv1c.pk033.d24.f
SEQ ID NO: 228 >idv1c.pk033.j21.f
SEQ ID NO: 229 >idv1c.pk033.o9.f
SEQ ID NO: 230 >idv1c.pk033.p15.f
SEQ ID NO: 231 >idv1c.pk033.p16.f
SEQ ID NO: 232 >idv1c.pk034.i2.f
SEQ ID NO: 233 >idv1c.pk034.j6.f
SEQ ID NO: 234 >idv1c.pk035.i17.f
SEQ ID NO: 235 >idv1c.pk035.k18.f
SEQ ID NO: 236 >idv1c.pk036.i19.f
SEQ ID NO: 237
Construccion que expresa SEQ ID NO: 8 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 8 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO: 238
Construccion que expresa SEQ ID NO: 26 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 26 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 26.
SEQ ID NO: 239
Construccion que expresa SEQ ID NO: 17 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor
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UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 17 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 17.
SEQ ID NO: 240
Construccion que expresa SEQ ID NO: 28 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 28 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 28.
SEQ ID NO: 241
Construccion que expresa SEQ ID NO: 28 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 28 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 28.
SEQ ID NO: 242
Construccion que expresa SEQ ID NO: 13 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 13 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 13.
SEQ ID NO: 243
Construccion que expresa SEQ ID NO: 40 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 40 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 40.
SEQ ID NO: 244
Construccion que expresa SEQ ID NO: 72 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 72 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 72.
SEQ ID NO: 245
Construccion que expresa SEQ ID NO: 73 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 73 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 73
SEQ ID NO: 246
Construccion que expresa SEQ ID NO: 15 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 15 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 15.
SEQ ID NO: 247
Construccion que expresa SEQ ID NO: 18 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 18 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 18.
SEQ ID NO: 248
Construccion que expresa nt 1-380 de la SEQ ID NO: 45 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con nt 1-380 de la SEQ ID NO: 45 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de nt 1-380 de la SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 249
Construccion que expresa nt 1-675 de la SEQ ID NO: 37 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con nt 1-675 de la SEQ ID NO: 37 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de nt 1-675 de la SEQ ID NO: 37.
SEQ ID NO: 250
Construccion que expresa SEQ ID NO: 29 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con SEQ ID NO: 29 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de la SEQ ID NO: 29.
SEQ ID NO: 251
Construccion que expresa nt 1-266 de la SEQ ID NO: 50 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con nt 1-266 de la SEQ ID NO: 50 unido operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de 1-266 de la SEQ ID NO: 50.
SEQ ID NO: 252
Construccion que expresa nt 16-585 de la SEQ ID NO: 47 como un ARN en horquilla. La construccion comprende: promotor UBI1ZM 5'UTR y 1er intron unido operativamente con nt 16-585 de la SEQ ID NO: 47 unido
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operativamente con el intron ADH1 unido operativamente con el complemento de nt 16-585 de la SEQ ID NO: 47.
Ejemplo 3. Transformacion de mafz
Se bombardean embriones de mafz inmaduros de plantas donantes de invernadero con un plasmido que contiene el elemento de silenciamiento de la invencion unido operativamente con un promotor especffico de tejido, selectivo de tejido o constitutivo y el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. En una divulgacion, las construcciones expresaran un ARN bicatenario largo de la secuencia diana expuesta en la tabla 1. Dicha construccion puede unirse con el promotor dMMB. Como alternativa, el gen marcador seleccionable se proporciona en un plasmido separado. Se realiza transformacion de la siguiente manera. A continuacion se presentan recetas de medios.
Preparacion de tejido diana
Las mazorcas se descascarillan y se esterilizan en superficie en lejfa Clorox 30 % mas detergente Micro 0,5 % durante 20 minutos y se aclaran dos veces con agua esteril. Los embriones inmaduros se escinden y se colocan en el embrion con el eje hacia abajo (escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y despues se alinean en la zona diana de 2,5 cm en preparacion para el bombardeo.
Se prepara un vector plasmfdico que comprende el elemento de silenciamiento de interes unido operativamente al promotor especffico de tejido, selectivo de tejido o constitutivo. Este ADN plasmfdico mas el ADN plasmfdico que contiene un marcador seleccionable PAT se precipita en sedimento de wolframio de 1,1 pm (diametro promedio) usando un procedimiento de precipitacion de CaCl2 de la siguiente manera: 100 pl de partfculas de wolframio preparadas en agua; 10 pl (1 pg) de ADN en tampon de Tris EDTA (1 pg de ADN total); 100 pl de CaCh 2,5 M; y 10 pl de espermidina 0,1 M.
Cada reactivo se anade secuencialmente a la suspension de partfculas de wolframio, mantenida al mismo tiempo en el vortex multitubo. La mezcla final se somete a ultrasonidos brevemente y se permite que se incube con agitacion vorticial constante durante 10 minutos. Despues del periodo de precipitacion, los tubos se centrifugan brevemente, se retira el lfquido, se lavan con 500 ml de etanol al 100 % y se centrifugan durante 30 segundos. De nuevo se retira el lfquido, y se anaden 105 pl de etanol al 100 % al sedimento de partfculas de wolframio final. Para bombardeo con pistola de partfculas, las partfculas de wolframio/ADN se someten a ultrasonidos brevemente y se aplican puntualmente 10 pl en el centro de cada macrovehfculo y se permite que se sequen durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.
Las placas de muestras se bombardean al nivel n.° 4 en una pistola de partfculas. Todas las muestras reciben un unico disparo a 68,93 MPA (650 PSI), con un total de diez alfcuotas tomadas de cada tubo de partfculas preparadas/ADN.
Despues del bombardeo, los embriones se mantienen en medio 560Y durante 2 dfas, despues se transfieren a medio de seleccion 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos y se subcultivan cada 2 semanas. Despues de aproximadamente 10 semanas de seleccion, se transfieren clones de callos resistentes a seleccion a medio 288J para iniciar la regeneracion de la planta. Despues de la maduracion embrion somatico (2-4 semanas), se transfieren embriones somaticos bien desarrollados a medio para germinacion y se transfieren a la sala de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 dfas mas tarde, se transfieren plantulas en desarrollo a medio sin hormonas 272V en tubos durante 7-10 dfas hasta que las plantulas esten bien establecidas. Las plantas se transfieren despues a insertos en bandejas (equivalentes a maceta de 6,35 cm (2,5 pulgadas)) que contienen tierra para maceta y se cultivan durante 1 semana en una camara de cultivo, se cultivaron posteriormente durante 1-2 semanas adicionales en el invernadero, despues se transfirieron a 600 macetas clasicas (6,06 l (1,6 galones)) y se cultivaron hasta su madurez.
Las plantas se supervisaron y se puntuaron con respecto al marcador apropiado, tal como el control de una plaga vegetal coleoptera, tal como una plaga vegetal de Diabrotica y tienen actividad insecticida. Por ejemplo, se alimentan larvas de crisomelido del mafz occidental con rafces de planta R0 (WCR, Diabrotica virgifera). Las rafces de mafz transgenico se traspasaran en placas de Petri con medio MSOD que contiene antibioticos y glifosato para seleccion in vitro. Se infestaron dos larvas de WCR por rafz en cada placa con un pincel de punta fina. Las placas se precintaron con Parafilm para evitar que las larvas se escaparan. Los ensayos se colocaron en un incubador Percival de 60 % de HR, a 27 °C con oscuridad incompleta. Se supervisan la contaminacion y la calidad larvaria. Despues de seis dfas alimentandose con tejido de rafz, las larvas se transfieren a dieta de WCR en una placa de 96 pocillos. Se permite que las larvas se alimenten con la dieta durante ocho dfas haciendo el ensayo completo de catorce dfas de duracion. Se registran la masa larvaria y la supervivencia para analisis. Se realiza un analisis de ANOVA de una via y un ensayo de Dunnett sobre los datos de masa larvaria para buscar significacion estadfstica en comparacion con un control negativo no transformado. Se mide la atrofia de larvas de WCR despues de alimentacion en dos acontecimientos y se compara con el crecimiento de larvas alimentadas con plantas de control negativo.
En otros ensayos, se plantan plantas de mafz transgenicas (R0) generadas en macetas de 25,40 cm (10 pulgadas)
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que contienen tierra Metromix despues de alcanzar un tamano apropiado. Cuando las plantas alcanzan el estadio de crecimiento V4, se infestan aproximadamente 1000 huevos de crisomelido del mafz occidental (WCR, Diabrotica virgifera) en la zona de la rafz. Se infesta mafz no transgenico del mismo genotipo en un estadio de crecimiento similar para actuar como un control negativo. Se preincuban huevos de modo que se produzca eclosion en un periodo de 24 horas desde la infestacion. Se permite que las larvas se alimenten de los sistemas de rafz durante 3 semanas. Las plantas se retiran de la tierra y se lavan de modo que las rafces puedan evaluarse con respecto a alimentacion larvaria. El dano de la rafz se valora usando una Escala de Lesion Nodular (NIS) para puntuar el nivel de dano donde un 0 indica ausencia de dano, un 1 indica que un nodulo de las rafces se recorta hasta 3,81 cm (1,5 pulgadas), un 2 indica que se recortan 2 nodulos, mientras un 3 indica que se recortan 3 nodulos. Debido a que las plantas que se usan para evaluacion estan directamente fuera del cultivo tisular despues de la transformacion y debido a que los acontecimientos de transformacion son unicos, solamente se evalua una unica planta por acontecimiento en este momento. Las plantas en el ensayo que presentan senales o smtomas de alimentacion larvaria indican que se obtiene una infestacion exitosa. Las rafces de plantas de control negativo tienen danos de moderados a graves mientras que las rafces de las plantas transgenicas proporcionan control sustancial de la alimentacion larvaria, con aproximadamente 0,2 o menos en la Escala de Lesion Nodular.
El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SlGMA-1511), 0,5 mg/l de HCl de tiamina, 120,0 g/l de sacarosa, 1,0 mg/12,4-D, y 2,88 g/l de L-prolina (llevada hasta volumen con D-I H2O despues del ajuste hasta pH 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite (anadido despues de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (anadido despues de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente). El medio de seleccion (560R) comprende 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de HCl de tiamina, 30,0 g/l de sacarosa y 2,0 g/l de 2,4-D (llevada hasta volumen con D-I H2O despues del ajuste hasta pH 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite (anadido despues de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y
3.0 mg/l de bialaphos (anadido despues de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).
El medio de regeneracion de plantas (288J) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solucion de reserva de vitaminas MS (0,100 g de acido nicotmico, 0,02 g/l de HCl de tiamina, 0,10 g/l de HCl de piridoxina y 0,40 g/l de glicina llevada hasta volumen con D-I H2O pulido) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mioinositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1,0 ml/l de acido absdsico 0,1 mM (llevado hasta volumen con D-I H2O pulido despues de ajustar hasta pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (anadido despues de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 1,0 mg/l de acido indoleacetico y 3,0 mg/l de bialaphos (anadido despues de esterilizar el medio y enfriar hasta 60 °C). El medio sin hormonas, (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074),
5.0 ml/l de solucion de reserva de vitaminas MS (0,100 g/l de acido nicotmico, 0,02 g/l de HCl de tiamina, 0,10 g/l de HCl de piridoxina y 0,40 g/l de glicina llevada hasta volumen con D-I H2O pulido), 0,1 g/l de mioinositol y 40,0 g/l de sacarosa llevada hasta volumen con D-I H2O pulido despues de ajustar el pH hasta 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (anadido despues de llevar hasta volumen con D-I H2O pulido), esterilizado y enfriado hasta 60 °C.
Ejemplo 4. Transformacion de mafz mediada por Agrobacterium
Para transformacion de mafz mediada por Agrobacterium con un elemento de silenciamiento de la invencion, se emplea el metodo de Zhao (patente de los Estados Unidos n.° 5.981.840 y publicacion de patente de PCT WO98/32326). Dicha construccion puede, por ejemplo, expresar un ARN bicatenario largo de la secuencia diana expuesta en la tabla 1. Dicha construccion puede unirse con el promotor dMMB. Brevemente, se afslan embriones inmaduros del mafz y los embriones se ponen en contacto con una suspension de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir el polinucleotido que comprende el elemento de silenciamiento a al menos una celula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infeccion). En esta etapa los embriones inmaduros se sumergen en una suspension de Agrobacterium para el inicio de la inoculacion. Los embriones se cocultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cocultivo). Los embriones inmaduros se cultivan en medio solido despues de la etapa de infeccion. Despues de este periodo de cocultivo se contempla una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiotico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adicion de un agente selectivo para transformantes vegetales (etapa 3: etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivan en medio solido con antibiotico, pero sin un agente de seleccion, para eliminacion de Agrobacterium y para una fase de reposo para las celulas infectadas. A continuacion, se cultivan embriones inoculados en medio que contiene un agente selectivo y se recupera callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de seleccion). Los embriones inmaduros se cultivan en medio solido con un agente selectivo que da como resultado el crecimiento selectivo de celulas transformadas. El callo se regenera despues en plantas (etapa 5: la etapa de regeneracion) y se cultivan callos que han crecido en medio selectivo en medio solido para regenerar las plantas. Pueden realizarse ensayos con respecto a actividad insecticida como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo, 5.
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Ejemplo 5: Transformacion de embrion de soja
Condiciones de cultivo
Se mantienen cultivos en suspension embriogenicos de soja (cv. Jack) en 35 ml de medio liquido SB196 (vease recetas posteriormente) en agitador rotatorio, 150 rpm, a 26 °C con luces fluorescentes de blanco frfo en fotoperiodo de 16:8 h dfa/noche a una intensidad de luz de 60-85 pE/m2/s. Los cultivos se subcultivan cada 7 dfas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de liquido nuevo SB196 (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 dfas).
Se transforman cultivos de suspension embriogenicos de soja con los plasmidos y fragmentos de ADN descritos en los ejemplos anteriores por el metodo de bombardeo con pistola de particulas (Klein et al. (1987) Nature, 327:70).
Inicio de cultivo en suspension embriogenico de soja
Los cultivos de soja se inician dos veces cada mes con 5-7 dfas entre cada inicio.
Se seleccionan vainas con semillas inmaduras de plantas de soja disponibles 45-55 dfas despues de plantar, se retiran de sus cascaras y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soja se esterilizan agitandolas durante 15 minutos en una solucion de Clorox 5 % con 1 gota de jabon Ivory (95 ml de agua destilada esterilizada por autoclave mas 5 ml de Clorox y 1 gota de jabon). Mezclar bien. Las semillas se aclaran usando 2 frascos de 1 litro de agua destilada esteril y las de menos de 4 mm se colocan en portaobjetos de microscopio individuales. El extremo pequeno de la semilla se corta y los cotiledones se separan por presion del tegumento. Los cotiledones se transfieren a placas que contienen medio SB1 (25-30 cotiledones por placa). Las placas se envuelven con cinta de fibra y se almacenan durante 8 semanas. Despues de este tiempo los embriones secundarios se cortan y se colocan en medio liquido SB196 durante 7 dfas.
Preparacion de ADN para bombardeo
Se usan un plasmido intacto o un fragmento plasmfdico de ADN que contiene los genes de interes y el gen marcador seleccionable para bombardeo. El ADN plasmfdico para bombardeo se prepara de forma rutinaria y se purifica usando el metodo descrito en la Gufa de Protocolos y Aplicaciones de Promega™, segunda edicion (pagina 106). Se obtienen fragmentos de los plasmidos que portan el elemento de silenciamiento de interes mediante aislamiento en gel de plasmidos de doble digestion. En cada caso, se digieren 100 pg de ADN plasmfdico en 0,5 ml de la mezcla de enzimas especffica que es apropiada para el plasmido de interes. Los fragmentos de ADN resultantes se separan por electroforesis en gel en agarosa SeaPlaque GTG 1 % (BioWhitaker Molecular Applications) y los fragmentos de ADN que contienen elemento de silenciamiento de interes se cortan del gel de agarosa. El aDn se purifica de la agarosa usando la enzima de digestion GELasa siguiendo el protocolo del fabricante.
Se anade una alfcuota de 50 pl de agua destilada esteril que contiene 3 mg de particulas de oro (3 mg de oro) a 5 pl de una solucion de ADN 1 pg/pl (plasmido intacto o fragmento de ADN preparado como se ha descrito anteriormente), 50 pl de CaCh 2,5 M y 20 pl de espermidina 0,1 M. La mezcla se agita durante 3 min en el nivel 3 de un agitador vorticial y se centrifuga durante 10 s en una microcentrffuga de sobremesa. Despues de un lavado con 400 pl de etanol 100 % el sedimento se suspende por ultrasonidos en 40 pl de etanol 100 %. Se distribuyen cinco pl de suspension de ADN a cada disco volador del disco del instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alfcuota de 5 pl contiene aproximadamente 0,375 mg de oro por bombardeo (es decir por disco).
Preparacion del tejido y bombardeo con ADN
Se colocan aproximadamente 150-200 mg de cultivos en suspension embrionarios de 7 dfas de edad en una placa de petri de 60 x 15 mm esteril, vacfa, y la placa se cubre con una malla de plastico. Es tejido se bombardea con 1 o 2 disparos por placa con presion de ruptura de membrana ajustada a 7,58 MPa (1100 PSI) y la camara se evacua a un vacfo de 91,43-94,82 kPa (27-28 pulgadas de mercurio). El tejido se coloca a aproximadamente 8,89 cm (3,5 pulgadas) de la pantalla de retencion/parada.
Seleccion de embriones transformados
Los embriones transformados se seleccionaron usando higromicina (cuando se uso el gen de la higromicina fosfotransferasa, HPT, como el marcador seleccionable) o clorsulfuron (cuando se uso el gen de la acetolactato sintasa, ALS, como el marcador seleccionable).
Seleccion de higromicina (HPT)
Despues del bombardeo, el tejido se coloca en medio SB196 nuevo y se cultiva como se ha descrito anteriormente. Seis dfas despues del bombardeo, el SB196 se intercambia con SB196 nuevo que contiene un agente de seleccion
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de 30 mg/l de higromicina. El medio de seleccion se renueva semanalmente. De cuatro a seis semanas despues de la seleccion, puede observarse tejido verde, transformado, que crece de grupos embriogenicos necroticos, no transformados. Se retira tejido verde, aislado, y se inocula en placas multipocillo para generar nuevos cultivos en suspension embriogenicos transformados, propagados clonalmente.
Seleccidn de clorsulfuron (ALS)
Despues del bombardeo, el tejido se divide entre 2 matraces con medio SB196 nuevo y se cultiva como se ha descrito anteriormente. De seis a siete dfas despues del bombardeo, el SB196 se intercambia con SB196 nuevo que contiene agente de seleccion de 100 ng/l de clorsulfuron. El medio de seleccion se renueva semanalmente. De cuatro a seis semanas despues de la seleccion, puede observarse tejido verde, transformado, que crece de grupos embriogenicos necroticos, no transformados. Se retira tejido verde, aislado, y se inocula en placas multipocillo que contienen SB196 para generar nuevos cultivos en suspension embriogenicos transformados, propagados clonalmente.
Regeneracion de embriones somaticos de soja en plantas
Para obtener plantas completas de cultivos en suspension embriogenicos, el tejido debe regenerarse.
Maduracion del embrion
Los embriones se cultivan durante 4-6 semanas a 26 °C en SB196 bajo bombillas fluorescentes de blanco frfo (Phillips blanco frfo Econowatt F40/CW/RS/EW) y Agro (Phillips F40 Agro) (40 vatios) en un fotoperiodo de 16:8 h con intensidad de luz de 90-120 uE/m2s. Despues de este tiempo los grupos de embriones se retiran a un medio de agar solido, SB166, durante 1-2 semanas. Despues los grupos se subcultivan al medio SB103 durante 3 semanas. Durante este periodo, los embriones individuales pueden retirarse de los grupos y explorarse con respecto al marcador apropiado o la capacidad de la planta, cuando se le inyectan los elementos de silenciamiento, para combatir la plaga vegetal coleoptera o la plaga vegetal de Diabrotica.
Desecacion y germinacion de embriones
Se desecan embriones individuales madurados colocandolos en una placa de petri vacfa, pequena (35 x 10 mm) durante aproximadamente 4-7 dfas. Las placas se precintan con cinta de fibra (creando una camara de humedad pequena). Los embriones desecados se plantan en medio SB71-4 donde se dejaron germinar en las mismas condiciones de cultivo descritas anteriormente. Las plantulas germinadas se retiran del medio de germinacion y se aclaran exhaustivamente con agua y despues se plantan en RediEarth en una bandeja de paquetes de 24 celdas, cubierta con una cupula de plastico transparente. Despues de 2 semanas la cupula se retira y las plantas se fortalecen durante una semana mas. Si las plantulas parecen resistentes se trasplantan a una maceta de 25,40 cm (10 pulgadas) de Redi-Earth con hasta 3 plantulas por maceta.
Recetas de medios
Medio de proliferacion lfquido SB 196 - FN Lite (por litro) -

MS FeEDTA - Reserva 1 100x 10 ml

Sulfato de MS - Reserva 2 100x 10 ml

Haluros de FN Lite - Reserva 3 100x 10 ml

FN Lite P,B,Mo - Reserva 4 100x 10 ml
Vitaminas B5 (1 ml/l) 1,0 ml
2,4-D (concentracion final 10 mg/l) 1,0 ml
KNO3 2,83 g
(NH4)2SO4 0,463 g
Asparagina 1,0 g
Sacaros (1 %) 10 g
pH 5,8
Soluciones de reserva FN Lite
Reserva
n.°____________________________
1 MS Fe EDTA Reserva 100x
Na2 EDTA* FeSO4-7H2O
1000 ml 500 ml
3,724 g 1,862 g
2,784 g 1,392 g
5
10
15
20
25
30
Reserva
n.°
2
3
4
1000 ml
500 ml
* Anadir primero, disolver en frasco oscuro agitando al mismo tiempo
Sulfato de MS Reserva 100x
MgSO4-7H2O
37,0 g 18,5 g
MnSO4-H2O
1,69 g 0,845 g
ZnSO4-7H2O
0,86 g 0,43 g
CuSO4-5H2O
0,0025 g 0,00125 g
5 de FN Lite Reserva 100x
CaCl2 - 2H2O
30,0 g 15,0 g
KI
0,083 g 0,0715 g
CoCl2 - 6H2O
0,0025 g 0,00125 g
\l Lite P,B,Mo Reserva 100x
KH2PO4
18,5 g 9,25 g
H3BO3
0,62 g 0,31 g
Na2MoO4 - 2H2O
0,025 g 0,0125 g
El medio solido SB1 (por litro) comprende: 1 pkg. Sales de MS (Gibco/ BRL - Cat n.° 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 Reserva 1000X; 31,5 g de sacarosa; 2 ml de 2,4-D (concentracion final 20mg/l); pH 5,7; y, 8 g de agar TC.
El medio solido SB 166 (por litro) comprende: 1 pkg. Sales de MS (Gibco/ BRL - Cat n.° 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 Reserva 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de hexahidrato de MgCl2; 5 g de carbono activado; pH 5,7; y, 2 g de gelrite.
El medio solido SB 103 (por litro) comprende: 1 pkg. Sales de MS (Gibco/ BRL - Cat n.° 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 Reserva 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de hexahidrato de MgCl2; pH 5,7; y, 2 g de gelrite.
El medio solido SB 71-4 (por litro) comprende: 1 frasco de sales B5 de Gamborg con sacarosa (Gibco/BRL - Cat n.° 21153-036); pH 5,7; y, 5 g de agar TC.
Se obtiene reserva de 2,4-D prefabricada de Phytotech cat n.° D 295 - la concentracion es de 1 mg/ml.
La reserva de vitaminas B5 (por cada 100 ml) que se almacena en alfcuotas a -20C comprende: 10 g de mio-inositol; 100 mg de acido nicotfnico; 100 mg de HCl de piridoxina; y, 1 g de tiamina. Si la solucion no se disuelve lo suficientemente rapido, aplicar un bajo nivel de calor mediante la placa caliente de agitacion. La reserva de clorsulfuron comprende 1 mg/ml en hidroxido de amonio 0,01 N.
Ejemplo 6. Expresion de elementos de silenciamiento en mafz
Los elementos de silenciamiento expuestos en las SEQ ID NO: 8, 26, 17, 28 y 10 se expresaron en una planta de mafz como horquillas y la planta se ensayo con respecto a actividad insecticida contra crisomelidos del mafz. Las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 8, 26, 17, 28 y 10 se modificaron tecnicamente para expresar como una horquilla. Las construcciones comprendieron los siguientes componentes: el promotor de ubiquitina del mafz/5'UTR/1er intron unido operativamente SEQ ID NO: 8, 26, 17, 28 o 10: intron de ADH1: complemento de las SEQ ID NO: 8, 26, 17, 28 y 10. Los plasmidos PHP41121, PHP41134, PHP41127, PHP41130, PHP41118 se generaron como se resumen posteriormente en la Tabla 2.
Tabla 2.
SEQ ID NO del elemento de silenciamiento
SEQ ID NO de la construccion con promotor y elemento de silenciamiento Nombre del clon del elemento de silenciamiento Homologfa de secuencia del elemento de silenciamiento Nombre del plasmido
8
237 idv1lc.pk001.e9.f Protefna ribosomica s10E PHP41121
26
238 idvlc.ph003.p13.f Protefna ribosomica PHP41134
17
239 idvlc.pk003.f9.f proteinasa de 27 kD PHP41127
28
240 idv1c.pk004.d17.f Tribolium PHP41130
10
241 idvlc.pk001.n1.f Sin aciertos PHP41118
5
10
15
20
25
30
35
Las plantas de mafz se transformaron con plasmidos PHP41121, PHP41134, PHP41127, PHP41130, PHP41118 y plantas que expresan los elementos de silenciamiento indicados en la Tabla 2 se trasplantaron de placas 272V a bandejas de invernadero que contienen una mezcla de plantacion Fafard Superfine. Aproximadamente de 10 a 14 dfas despues del trasplante, las plantas (ahora en el estadio de crecimiento V2-V3) se trasplantaron en macetas de arboles que contienen una mezcla de plantacion Fafard Superfine. A los 14 dfas despues de la fecha de envfo al invernadero, las plantas se infestaron con 100 huevos de crisomelidos del mafz occidental (WCRW)/planta. Para conjuntos posteriores, se realizo una segunda infestacion de 100 huevos de WCRW/planta 14 dfas despues de la primera infestacion y la puntuacion fue a los 14 dfas despues de la segunda infestacion. 21 dfas despues de la infestacion, las plantas se puntuaron usando CRWNIS. Las plantas con una puntuacion de 0,5 se trasplantan a macetas grandes que contienen SB300 para semillas. Como se muestra en la Figura 1, cada una de las SEQ ID NO: 8, 26, 17, 28 y 10 tuvieron actividad insecticida.
Ejemplo 7 Bioensayos de insectos
2,5 pl de una reaccion de transcripcion in-vitro que sintetizo una de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 107-236 se anadieron a un pocillo dado de una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Se anadieron 25 pl de dieta del crisomelido del mafz occidental fundida de baja fusion a la muestra y se agitan en un agitador orbital para mezclar la muestra y la dieta. Una vez que la dieta se hubo solidificado, se anadieron al pocillo crisomelidos neonatos. Se anadio a cada pocillo un promedio de 5 neonatos. Despues de infestarse la placa, la placa se precinto con mylar y se perforo un unico orificio en el mylar sobre cada pocillo para permitir el intercambio de aire. Se produjeron 4 pocillos repetidos para cada muestra. El ensayo se puntuo con respecto a actividad 7 dfas despues de la infestacion. La Tabla 3 proporciona datos de bioensayos insecticidas que emplean el crisomelido del mafz meridional. Las posibles puntuaciones son muerto (D), gravemente atrofiado (SS; (poco o ningun crecimiento pero vivo), atrofiado (S; crecimiento hasta segunda fase pero no equivalente a los controles), contaminado (c) o sin actividad.
Despues de la confirmacion, se realizo un ensayo de respuesta a dosis sencillo con crisomelidos del mafz tanto meridional con occidental. Vease, Tablas 4 y 5 posteriores. Se produjeron muestras para ensayos de respuesta a dosis de la misma manera con la siguiente modificacion: las muestras se purificaron adicionalmente usando purificacion en columna antes del tratamiento enzimatico. Las muestras tambien se normalizaron hasta 0,5 pg/pl y todas las muestras se evaluaron mediante electroforesis en gel. Se realizaron ensayos de respuesta a dosis con las siguientes tasas: en bruto, diluciones de 0,5, 0,25, 0,0125 ppm y 0,125 (equivalente a 51, 25, 12,5 y 6 ppm).
Tabla 3. Datos de bioensayo insecticida contra crisomelido del mafz Nombre del clon
idv1c.pk001.o20.f
S S S S S
idv1c.pk002.a20.f
S S S S S
idv1c.pk002.c7.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk002.c15.f
S S S S S
idv1c.pk002.f18.f
SS SS S SS SS
idv1c.pk002.i21f
S S S S S
idv1c.pk002.i23.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk002.j24.f
SS SS SS SS SS
idvlc.pk002.m16.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk002.n13.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk024.b23.f
S S S S S
idv1c.pk024.c7.f
SS SS D SS SS
idv1c.pk024.e1.f
S S S S S
idv1c.pk024.e24.f
S S S S S
idv1 c.pk024.j 15.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk024.k17.f
S S S S S
idv1c.pk024.m13.f
S S S S S
idv1c.pk024.n1.f
S S S S S
idv1c.pk024.o3.f
S S S S S
idv1c.pk025.a4.f
S S S S S
idv1c.pk025.b17.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk025.c5.f
S S S S S
idv1c.pk025.c23.f
S SS S S S
dv1c.pk025.d18.f
S S S S S
dv1c.pk025.d20.f
S S S S S
dv1c.pk025.f3.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk025.f24.f
S S S S S
dv1c.pk025.i8.f
SS SS SS S SS
dv1c.pk025.j20.f
S S S S S
dv1c.pk025.l10.f
S S S S S
dv1c.pk025.l 17.f
SS S SS SS SS
dv1c.pk025.o24.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk025.p9.f
SS SS S SS SS
dv1c.pk026.a16.f
S S S S S
dv1c.pk026.b23.f
S S S S S
dv1c.pk026.d22.f
S S S S S
dv1c.pk026.e6.f
S S S S S
dv1c.pk026.f20.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk026.g12.f
S S S S S
dv1c.pk026.h15.f
S S S S S
dv1c.pk026.i12.f
S S S S S
dv1c.pk026.j18.f
S S S S S
dv1c.pk026.k13.f
S S S S S
dv1c.pk026.p8.f
SS SS S S SS
dv1c.pk026.p22.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk027.a14.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk027.b21.f
S S S S S
dv1c.pk027.c7.f
S S S S S
dv1c.pk027.g7.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk027.k4.f
S S S S S
dv1c.pk027.k23.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk027.p21.f
S S S S S
dv1c.pk028.b7.f
S S S S S
dv1c.pk028.b17.f
S SS SS S SS
dv1c.pk028.c22.f
S S S S S
dv1c.pk028.f11.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk028.h6.f
S S S S S
dv1c.pk028.i16f
S S S S S
dv1c.pk028.m11.f
S S S S S
dv1c.pk028.o18.f
S S S S S
dv1c.pk029.a17.f
S S S S S
dv1c.pk029.c3f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk029.d16.f
S S S S S
dv1c.pk029.f5.f
SS SS SS S SS
dv1c.pk029.i22.f
S S S S S
dv1c.pk029j4f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk029.j20.f
S S S S S
dv1c.pk029.k11.f
S S S S S
dv1c.pk029.l22.f
S S S S S
dv1c.pk030.b23.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk030.e10.f
S S S S S
dv1c.pk030.e21.f
S S S S S
dv1c.pk030.f9.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk030.g11.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk030.h13.f
S S S S S
dv1c.pk030.h23.f
S S S S S
dv1c.pk030.l9.f
S S S S S
dv1c.pk030.m22.f
S S S S S
dv1c.pk030.o7.f
S S S S S
dv1c.pk031.a11.f
S S S S S
dv1c.pk031.c20.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk031.d1.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk031.e16.f
S S S S S
dv1c.pk031.g2.f
S S S S S
dv1c.pk031.g22.f
S S S S S
dv1c.pk031.i13.f
S S S S S
dv1c.pk031.j1.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk031.j6.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk031.m3.f
S S S S S
dv1c.pk031.p16.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk032.a16.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk032.b4.f
S S S S S
dv1c.pk032.e16.f
S S S S S
dv1c.pk032.f11.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk032.f14.f
S S S S S
dv1c.pk032.i21.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk032.m9.f
S S S S S
dv1c.pk032.n18.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk032.p5.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk033.a15.f
S S S S S
dv1c.pk033.b14.f
S S S S S
dv1c.pk033.d24.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk033.j21.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk033.m3.f
S S S S S
dv1c.pk033.n10.f
S S S S S
dv1c.pk033.n18.f
S S S S S
dv1c.pk033.o9.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk033.p15.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk033.p16.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk034.e8.f
S S S S S
dv1c.pk034.i2.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk034.j6.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk034.p24.f
S S S S S
dv1c.pk035.f21.f
S S S S S
dv1c.pk035.g1.f
S S S S S
dv1c.pk035.h19.f
S S S S S
dv1c.pk035.i17.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk035.j4.f
S S S S S
dv1c.pk035.k18.f
SS SS SS SS SS
dv1c.pk035.m1.f
S S S S S
dv1c.pk035.o13.f
S S S S S
dv1c.pk036.a14.f
S S S S S
dv1c.pk036.e18.f
S S S S S
dv1c.pk036.f4.f
S S S S S
dv1c.pk036.f9.f
S S S S S
dv1c.pk036.i17.f
S S S S S
idv1c.pk036.i19.f
SS SS SS SS SS
idv1c.pk036.i20.f
S S S S S
idv1c.pk036.k23.f
S S S S S
*las columnas en la Tabla 3 representan los pocillos repetidos 1, 2, 3 y 4 y el promedio._____________________________________________________

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento comprende un ARN bicatenario, en donde el ARN bicatenario se dirige a una secuencia polinucleotfdica diana de plaga vegetal coleoptera, en donde la secuencia polinucleotfdica diana de plaga vegetal coleoptera comprende:
    (a) la secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
    (b) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma; o
    (c) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 19 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
    en donde dicho ARN bicatenario tiene actividad insecticida contra una plaga vegetal coleoptera; preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleoptera es una plaga vegetal de Diabrotica.
  2. 2. Un casete de expresion que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 1 en donde:
    (a) dicho polinucleotido esta unido operativamente a un promotor heterologo; o
    (b) dicho polinucleotido se expresa como un ARN en horquilla, en donde el elemento de silenciamiento comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento y un tercer segmento, en donde:
    (i) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al menos 95 % de complementariedad de secuencia con una secuencia diana expuesta en la SEQ ID NO: 234;
    (ii) dicho segundo segmento comprende un bucle de suficiente longitud para permitir que el elemento de silenciamiento se transcriba como un ARN en horquilla; y
    (iii) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al menos 85 % de complementariedad con el primer segmento; o
    (c) esta flanqueado por un primer promotor convergente unido operativamente en un extremo del polinucleotido y un segundo promotor convergente unido operativamente en el extremo opuesto del polinucleotido, en donde el primer y el segundo promotores convergentes son capaces de conducir la expresion del polinucleotido.
  3. 3. Una celula hospedadora que comprende un casete de expresion heterologa de la reivindicacion 2.
  4. 4. Una celula vegetal que tiene incorporado de forma estable en su genoma un polinucleotido heterologo segun la reivindicacion 1:
    en donde la ingesta de dicho elemento de silenciamiento por una plaga vegetal coleoptera reduce el nivel de una secuencia diana en dicha plaga vegetal coleoptera y por lo tanto combate la plaga vegetal coleoptera, preferentemente en donde la plaga vegetal coleoptera es una plaga vegetal de Diabrotica.
  5. 5. La celula vegetal de la reivindicacion 4, en donde dicha celula vegetal comprende el casete de expresion de la reivindicacion 2(c) y/o en donde dicho elemento de silenciamiento comprende un ARN en horquilla; preferentemente en donde dicho polinucleotido que codifica el elemento de silenciamiento comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento y un tercer segmento, en donde:
    (i) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al menos 95 % de complementariedad de secuencia con una secuencia diana expuesta en la SEQ ID NO: 234;
    (ii) dicho segundo segmento comprende un bucle de suficiente longitud para permitir que el elemento de silenciamiento se transcriba como un ARN en horquilla; y,
    (iii) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al menos 85 % de complementariedad con el primer segmento.
  6. 6. Una planta o parte de planta que comprende una celula vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5.
  7. 7. Una semilla transgenica de la planta de la reivindicacion 6 que contiene el casete de expresion de la reivindicacion 2.
  8. 8. Un metodo para combatir una plaga vegetal coleoptera que comprende alimentar una plaga vegetal coleoptera con una composicion que comprende un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento comprende un ARN bicatenario, en donde dicho elemento de silenciamiento, cuando es ingerido por dicha plaga vegetal coleoptera, reduce el nivel de una secuencia de plaga vegetal coleoptera diana y combate de este modo la plaga vegetal coleoptera, en donde dicha secuencia de plaga vegetal coleoptera diana comprende:
    (a) un fragmento de al menos 19 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    misma; o,
    (b) una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
    preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleoptera comprende una plaga vegetal de Diabrotica.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8 en donde dicha plaga vegetal de Diabrotica comprende D. virgifera virgifera, D. speciosa, D. barberi, o D. undecimpunctata howardi.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 8 o 9, en donde dicha composicion comprende una planta o parte de planta que tiene incorporado de forma estable en su genoma un polinucleotido que codifica dicho elemento de silenciamiento.
  11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde dicho elemento de silenciamiento comprende:
    (a) un polinucleotido que comprende la secuencia con sentido o antisentido de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
    (b) un polinucleotido que comprende la secuencia con sentido o antisentido de una secuencia que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma;
    (c) un polinucleotido que comprende la secuencia con sentido o antisentido de una secuencia que tiene al menos 130 nucleotidos contiguos de la SEQ ID NO: 234 o un complemento de la misma.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde dicho elemento de silenciamiento comprende un ARN en horquilla, preferentemente en donde dicho polinucleotido que comprende el elemento de silenciamiento comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento y un tercer segmento, en donde:
    (i) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al complementariedad de secuencia con el polinucleotido diana;
    (ii) dicho segundo segmento comprende un bucle de suficiente longitud para permitir que silenciamiento se transcriba como un ARN en horquilla; y,
    (iii) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 19 nucleotidos que tienen al complementariedad con el primer segmento.
  13. 13. La celula vegetal de la reivindicacion 4 o 5, o el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde dicho polinucleotido esta unido operativamente a un promotor heterologo.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 10 u 11 en donde dicho elemento de silenciamiento esta flanqueado por un primer promotor convergente unido operativamente en un extremo del polinucleotido y un segundo promotor convergente unido operativamente en el extremo opuesto del polinucleotido, en donde el primer y el segundo promotores convergentes son capaces de conducir la expresion del elemento de silenciamiento.
  15. 15. La celula vegetal de la reivindicacion 4 o 5; o el metodo de la reivindicacion 10, en donde:
    (a) dicha celula vegetal es de una monocotiledonea o dicha planta es una monocotiledonea, preferentemente en donde dicha monocotiledonea es mafz, cebada, mijo, trigo o arroz, o
    (b) dicha celula vegetal es de una dicotiledonea o dicha planta es una dicotiledonea, preferentemente en donde dicha planta es soja, colza, alfalfa, girasol, cartamo, tabaco, Arabidopsis o algodon.
  16. 16. Un ARN bicatenario que comprende una secuencia de nucleotidos complementaria de:
    (a) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 234; o
    (b) una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 234;
    en donde dicho ARN bicatenario tiene actividad insecticida contra una plaga vegetal coleoptera, preferentemente en donde dicha plaga vegetal coleoptera es una plaga vegetal de Diabrotica.
  17. 17. El ARN bicatenario de la reivindicacion 16, en donde el ARN bicatenario comprende un ARN en horquilla.
  18. 18. El ARN bicatenario de la reivindicacion 16, en donde el ARN bicatenario se expresa en una planta, parte de planta o celula vegetal.
  19. 19. El ARN bicatenario de la reivindicacion 16, en donde el ARN bicatenario se expresa en un microorganismo.
    menos 95 % de el elemento de menos 85 % de
  20. 20. Una composicion que comprende el ARN bicatenario de la reivindicacion 16, que comprende ademas un vehfculo agrfcolamente aceptable.
    174
    Figura I
    Ensayo de TO de los primeros candidates de ARNi en germinoplasma SFX
    imagen1
    Filas ausentes
    440
    M__________________
    Construction
    Gen IS." tic* . r iHonlccjmicnlos Piioridad Agrupamiento Media
    Control
    6 A 2,16
    PHP41121
    SEQ fD NO: 8 PROTEINA RIBOSOMICA S10E " 1 17 AB 1
    PHP41134
    SEQ ID NO: 26 PROTEINA RIBOSOMICA 7 29 B 0,89
    PHP41127
    SEQ ID NO: 17 PROTEIN ASA DE 27 kD 22 • 44 B 0,81
    PHP41130 '
    SEOIDNO: 28 Tipo nucleoplasmina 4 12 B 0,75
    PHP411 IS
    SEO ID NO; 10 SIN COINCIDENCIAS 8 26 B 0,72
    Construccion
    CRWN1S
    o ro
    O on cn K) Cn co
    imagen2
    Figura 2
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