BR112012004462B1 - Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método para controlar uma praga de plantas do tipo coleoptera e método para obtenção de uma planta - Google Patents

Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método para controlar uma praga de plantas do tipo coleoptera e método para obtenção de uma planta Download PDF

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Abstract

POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA CONTROLAR UMA PRAGA DE PLANTAS DO TIPO COLEOPTERA E MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA. São apresentados métodos e composições que empregam um elemento silenciador que, quando ingerido por uma praga, como uma praga de planta do tipo Coleoptera ou Diabrotica, diminuiu a expressão de uma sequência-alvo na praga. Em modalidades específicas, a diminuição na expressão da sequência-alvo controla a praga e, assim, os métodos e composições são capazes de limitar os danos a uma planta. A presente invenção apresenta vários polinucleotídeos-alvo descritos em qualquer uma das SEO IDO n°: 1 a 263, ou variantes ativas e fragmentos das mesmas, sendo que uma diminuição na expressão de uma ou mais das sequências na praga-alvo controla a praga (isto é, tem atividade inseticida). São apresentados, adicionalmente, elementos silenciadores que, quando ingeridos pela praga, diminuem o teor do polipeptídeo-alvo e assim controlam a praga. Em uma modalidade específica, a praga é D. virgifera virgifera, D. barberi, D. speciosa ou D. undecimpunctata howardi. São apresentadas, também, plantas, partes de planta, bactérias e outras células hospedeiras compreendendo os elementos silenciadores ou uma variante ativa, ou fragmento da mesma, da presente invenção.

Description

Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se, de modo geral, a métodos de biologia molecular e silenciamento de genes para controlar pragas.
Antecedentes da Invenção
[0002] Pragas de insetos são um problema sério na agricultura. Elas destroem milhões de acres de colheitas comerciais como milho, soja, ervilha e algodão. Anualmente, estas pragas causam mais de 100 bilhões de dólares em prejuízos a safras apenas nos EUA. Em uma contínua batalha sazonal, os fazendeiros precisam aplicar bilhões de galões de pesticidas sintéticos para combater essas pragas. Outros métodos usados no passado resultaram em atividade inseticida por microorganismos, ou por genes derivados de microorganismos expressos em plantas transgênicas. Por exemplo, sabe-se que certas espécies de microorganismos do gênero Bacillus apresentam atividade pesticida contra uma ampla gama de pragas de insetos, inclusive Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e outros. De fato, os pesticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, desempenharam um importante papel na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas. Os cientistas agrícolas desenvolveram plantas para culturas comerciais com resistência otimizada a insetos, mediante a engenharia genética das ditas plantas para produção de proteínas inseticidas oriundas de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão geneticamente elaboradas para produzir toxinas Cry (consulte, por exemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806) são agora amplamente usadas na agricultura norte- americana e têm oferecido aos agricultores uma alternativa aos métodos tradicionais de controle de insetos. Entretanto, essas proteínas Bt inseticidas só protegem as plantas contra uma variedade relativamente restrita de pragas. Além disso, esses modos de atividade inseticida apresentam níveis variáveis de especificidade e, em alguns casos, causaram consequências ambientais significativas. Portanto, há uma necessidade imediata por métodos alternativos para controlar pragas.
Breve Sumário da Invenção
[0003] São apresentados métodos e composições que empregam um elemento silenciador que, quando ingerido por uma praga, como praga de plantas do tipo Coleoptera inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, é capaz de diminuir a expressão de uam sequência-alvo na dita praga. Em modalidades específicas, a diminuição na expressão da sequência-alvo controla a praga e, desse modo, os métodos e composições são capazes de limitar os danos a uma planta. A presente invenção apresenta vários polinucleotídeos-alvo conforme expostos nas SEQ ID n°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102 , 1 03, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 2 32, 233, 234, 235, 236 , ou variantes ativas ou fragmentos das mesmas, sendo que uma diminuição na expressão de uma ou mais das sequências na praga-alvo controla a dita praga (isto é, tem atividade inseticida). São apresentados, adicionalmente, elementos silenciadores que, quando ingeridos pela praga, diminuem o nível de expressão de um ou mais dos polinucleotídeos-alvo. São apresentadas, também, plantas, partes de planta, células de planta, bactérias e outras células hospedeiras compreendendo os elementos silenciadores ou uma variante ativa, ou fragmento da mesma, da presente invenção.
[0004] Em outra modalidade, é apresentado um método para controlar uma praga, como uma praga de plantas do tipo Coleoptera ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica. O método compreende alimentar uma praga com uma composição que compreende um elemento silenciador, sendo que o dito elemento silenciador, quando ingerido pela praga, reduz o teor de uma sequência-alvo na mesma, controlando assim a dita praga. São apresentados, adicionalmente, métodos para proteger uma planta contra uma praga. Esses métodos compreendem introduzir na planta ou na parte de planta um elemento silenciador da invenção. Quando a planta expressando o elemento silenciador é ingerida pela praga, o teor da sequência-alvo é diminuído e a praga é controlada.
Breve Descrição dos Desenhos
[0005] A Figura 1 mostra um teste para verme da raiz do milho com a planta inteira. Os dados demonstram que a expressão da SEQ ID n°: 8 (clone idvlc.pk001.e9.f); SEQ ID n°: 26 (clone idvlc.pk003.p13.f); SEQ ID n°: 17 (clone idvlc.pk003.f9.f); SEQ ID n°: 28 (clone idvlc.pk004.d17.p); e SEQ ID n°: 10 (clone idvlc.pk001.n1.f) como hairpin em uma planta de milho produz uma planta de milho que, quando ingerida por verme da raiz do milho, tem atividade inseticida. PLNVRM refere-se à pontuação para lesão nodal por verme da raiz do milho.
[0006] A Figura 2 mostra um teste para verme da raiz do milho com a planta inteira. Os dados demonstram que a expressão da SEQ ID n°: 13 (clone idv1c.pk002.j17.f); SEQ ID n°: 40 (clone idv1c.pk013.h1.f); SEQ ID n°: 72 (clone idv1c.pk017.d14.f); e SEQ ID n°: 73 (clone idv1c.pk017.e22.f) como hairpin em uma planta de milho produz uma planta de milho que, quando ingerida pelo verme da raiz do milho, tem atividade inseticida. PLNVRM refere-se à pontuação para lesão nodal por verme da raiz do milho. PHP19288 é um plasmídeo de controle desprovido do elemento silenciador.
Descrição Detalhada da Invenção
[0007] A presente invenção será agora descrita mais completamente com relação aos desenhos em anexo, nos quais algumas, mas não todas, as modalidades da invenção são mostradas. De fato, a invenção pode ser concretizada em muitas formas diferentes e não deve ser considerada como estando restrita às modalidades aqui descritas; ao contrário, estas modalidades são fornecidas para que esta descrição satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Números iguais referem-se a elementos iguais em todo este documento.
[0008] Muitas modificações e outras modalidades da invenção aqui descritas virão à mente de um versado na técnica à qual estas invenções pertencem tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições supracitadas e desenhos associados. Portanto, deve ser compreendido que a invenção não deve ser limitada às modalidades específicas apresentadas e que as modificações e outras modalidades são destinadas a serem incluídas dentro do escopo das reivindicações em anexo. Embora termos específicos sejam empregados na presente invenção, eles são usados apenas em um sentido genérico e descritivo e não para fins de limitação.
I. Visão geral
[0009] Frequentemente, métodos para descoberta de RNAi dependem da avaliação de classes conhecidas de genes sensíveis (fatores de transcrição, genes de manutenção, etc.). Em contraste, o polinucleotídeo-alvo aqui apresentado foi identificado somente com base em triagens de alta velocidade de todos os singletons e representantes de todos os grupos de genes de uma biblioteca de cDNA de vermes da raiz do milho ocidental recém-nascidos. Essa triagem permitiu a descoberta de muitas sequências inovadoras, muitas das quais têm homologia extremamente baixa ou mesmo nula com as sequências conhecidas. Esse método proporciona vantagem de não se ter um viés embutido em genes aque são, com frequência, altamente conservados de um taxa a outro. Como resultado, foram identificados muitos alvos inovadores para RNAi, bem como genes conhecidos anteriormente não mostrados como sensíveis a RNAi.
[0010] Assim, são apresentados métodos e composições que empregam um elemento silenciador que, quando ingerido por uma praga, como uma praga de plantas do tipo Coleoptera ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica, são capazes de diminuir a expressão de uma sequência-alvo na dita praga. Em modalidades específicas, a diminuição na expressão da sequência-alvo controla a praga e, desse modo, os métodos e composições são capazes de limitar os danos a uma planta ou parte de planta. A presente invenção apresenta polinucleotídeos-alvo conforme apresentados nas SEQ ID n°: 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 ou 236, ou variantes ativas e fragmentos das mesmas inclusive, por exemplo, nucleotídeos de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45; nucleotídeos de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50; SEQ ID n°: 50; nucleotídeos de 1 a 675 da SEQ ID n°: 37; e nucleotídeos de 1 a 132 da SEQ ID n°: 40. São apresentados elementos silenciadores projetados em vista desses polinucleotídeos-alvo que, quando ingeridos pela praga, diminuem a expressão de uma ou mais das sequências-alvo e, assim, controla a praga (isto é, tem atividade inseticida).
[0011] Para uso na presente invenção, os termos “controlar uma praga” ou “controla uma praga” referem-se a qualquer efeito sobre uma praga que resulte na limitação aos danos causados pela dita praga. Controlar uma praga inclui, mas não se limita a, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou o crescimento da praga de tal maneira que esta cause menos danos à planta, diminuir o número de descendentes produzido, produzir pragas menos aptas, produr pragas mais suscetíveis ao ataque por predadores, ou impedir que as pragas comam a planta.
[0012] Reduzir o nível de expressão, na praga, do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo, resulta na supressão, no controle e/ou no extermínio do organismo patogênico invasor. A redução do nível de expressão da sequência-alvo da praga reduzirá os sintomas da doença resultante do ataque pelo patógeno em pelo menos cerca de 2% a pelo menos cerca de 6%, de pelo menos cerca de 5% a cerca de 50%, de pelo menos cerca de 10% a cerca de 60%, de pelo menos cerca de 30% a cerca de 70%, de pelo menos cerca de 40% a cerca de 80%, ou de pelo menos cerca de 50% a cerca de 90% ou mais. Assim, os métodos da invenção podem ser usados para controlar pragas, particularmente uma praga de plantas do tipo Coleoptera ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica.
[0013] Os testes que medem o controle de uma praga são de conhecimento comum no estado da técnica, tal como o são métodos para quantificar a resistência a doenças em plantas em seguida à infecção por patógeno. Consulte, por exemplo, a patente US n° 5.614.395, aqui incorporada a título de referência. Essas técnicas incluem medição ao longo do tempo, diâmetro médio da lesão, a biomassa do patógeno e a porcentagem geral de tecidos vegetais afetados. Consulte, por exemplo, Thomma et al. (1998), Plant Biology 95:15107-15111, aqui incorporado a título de referência. Consulte, também, Baum et al. (2007), Nature Biotech 11:1322-1326, e WO 2007/035650, que provou tanto testes de alimentação com a planta inteira como testes de alimentação com raiz de milho. Ambas as referências estão aqui incorporadas, a título de referência, em sua totalidade. Consulte, também, os exemplos abaixo.
[0014] A invenção se refere a composições e métodos para proteção de plantas contra uma praga de plantas, como pragas de plantas do tipo Coleoptera ou Diabrotica, ou para indução de resistência em uma planta contra uma praga de plantas, como pragas de plantas do tipo Coleoptera ou Diabrotica. Para uso na presente invenção, o termo “praga de plantas do tipo Coleoptera” é usado para referir-se a qualquer membro da ordem Coleoptera.
[0015] Para uso na presente invenção, o termo “praga de plantas do tipo Diabrotica” é usado para referir-se a qualquer membro do gênero Diabrotica. Consequentemente, as composições e métodos são úteis também na proteção de plantas contra qualquer praga de plantas do tipo Diabrotica inclusive, por exemplo, Diabrotica adelpha; Diabrotica amecameca; Diabrotica balteata; Diabrotica barberi; Diabrotica biannularis; Diabrotica cristata; Diabrotica decempunctata; Diabrotica dissimilis; Diabrotica lemniscata; Diabrotica limitata (inclusive, por exemplo, Diabrotica limitata quindecimpunctata); Diabrotica longicornis; Diabrotica nummularis; Diabrotica porracea; Diabrotica scutellata; Diabrotica sexmaculata; Diabrotica speciosa (inclusive, por exemplo, Diabrotica speciosa speciosa); Diabrotica tibialis; Diabrotica undecimpunctata (inclusive, por exemplo, Diabrotica undecimpunctata duodecimnotata; Diabrotica undecimpunctata howardi (besouro manchado do pepino); Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata (besouro manchado ocidental do pepino)); Diabrotica virgifera (inclusive, por exemplo, Diabrotica virgifera virgifera (verme da raiz do milho ocidental) e Diabrotica virgifera zeae (verme da raiz do milho mexicano)); Diabrotica viridula; Diabrotica wartensis; Diabrotica sp. JJG335; Diabrotica sp. JJG336; Diabrotica sp. JJG341; Diabrotica sp. JJG356; Diabrotica sp. JJG362 e Diabrotica sp. JJG365.
[0016] Em modalidades específicas, a praga de plantas do tipo Diabrotica compreende D. virgifera virgifera, D. barberi, D. speciosa ou D. undecimpunctata howardi.
II. Sequências-alvo
[0017] Para uso na presente invenção, uma “sequência-alvo” ou um “polinucleotídeo-alvo” compreende qualquer sequência, na praga, da qual se deseja reduzir o nível de expressão. Em modalidades específicas, diminuir o teor da sequência-alvo na praga controla a dita praga. Por exemplo, a sequência-alvo pode ser essencial para crescimento e desenvolvimento. Embora a sequência-alvo possa ser expressa em qualquer tecido da praga, em modalidades específicas as sequências-alvo para supressão na praga são expressas em células do tecido intestinal da praga, células no intestino médio da praga, e células que revestem o lúmen do intestino ou o intestino médio. Essas sequências-alvo podem estar envolvidas, por exemplo, no metabolismo, na proliferação ou na diferenciação de células do intestino. Alguns exemplos não-limitadores de sequências-alvo da invenção incluem um polinucleotídeo apresentado na SEQ I D n°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 , 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 , 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 , 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 , 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 , 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 , 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 ou 236 , ou suas variantes e fragmentos incluindo, por exemplo, nucleotídeos de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45; nucleotídeos de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50; SEQ ID n°: 50; nucleotídeos de 1 a 675 da SEQ ID n°: 37; e nucleotídeos de 1 a 132 da SEQ ID n°: 40. Conforme exemplificado em outra parte do presente documento, diminuir o nível de expressão de uma ou mais dessas sequências-alvo em uma praga de plantas do tipo Coleoptera ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica controla a praga.
III. Elementos silenciadores
[0018] O termo “elemento silenciador” se refere a um polinucleotídeo que, quando ingerido por uma praga, é capaz de reduzir ou eliminar o nível ou a expressão de um polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo. O elemento silenciador usado pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência-alvo, influenciando o teor do transcrito de RNA-alvo ou, alternativamente, influenciando a tradução e, assim, afetando o teor do polipeptídeo codificado. Os métodos para teste quanto a elementos silenciadores funcionais que são capazes de reduzir ou eliminar o teor de uma sequência de interesse são apresentados em outra parte do presente documento. Um único polinucleotídeo usado nos métodos da invenção pode compreender um ou mais elementos silenciadores para polinucleotídeos-alvo iguais ou diferentes. O elemento silenciador pode ser produzido in vivo (isto é, em uma célula hospedeira como uma planta ou um microorganismo) ou in vitro.
[0019] Em modalidades específicas, a sequência-alvo não é endógena à planta. Em outras modalidades, embora o elemento silenciador controle as pragas, de preferência o elemento silenciador não tem qualquer efeito sobre a planta ou parte de planta normal.
[0020] Conforme discutido com mais detalhes abaixo, os elementos silenciadores podem incluir, mas não se limitam a, um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de filamento duplo, um siRNA, um amiRNA, um miRNA, ou um elemento de supressão do tipo hairpin. Alguns exemplos não-limitadores de elementos silenciadores que podem ser empregados para diminuir a expressão dessas sequências- alvo de praga de plantas do tipo Coleoptera ou de praga de plantas do tipo Diabrotica compreendem fragmentos e variantes da sequência senso ou antissenso, ou consiste na sequência senso ou antissenso da sequência apresentada na SEQ ID n°: 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 , 101, 102, 103, 104 , 105, 106 107, 108 , 109, 110, 111, 112 , 113, 114, 115, 116 , 117, 118 119, 120 , 121, 122, 123, 124 , 125, 126, 127, 128 , 129, 130 131, 132 , 133, 134, 135, 136 , 137, 138, 139, 140 , 141, 142 143, 144 , 145, 146, 147, 148 , 149, 150, 151, 152 , 153, 154 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 , 231, 232 , 233, 234 , 235, 236 ou uma variante biologicamente ativa, ou fragmento da me sma, incluindo, por exemplo, nucleotídeos de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45; nucleotídeos de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50; SEQ ID n°: 50; nucleotídeos de 1 a 675 da SEQ ID n° : 37 e nucleotídeos de 1 a 132 da SEQ ID n°: 40. O elemento silenciador pode compreender, adicionalmente, sequências adicionais que afetam vantajosamente a transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Por exemplo, os elementos silenciadores podem compreender pelo menos um resíduo de timina na extremidade 3'. Isso pode auxiliar na estabilização. Assim, os elementos silenciadores podem ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de timina na extremidade 3'. Conforme discutido com mais detalhes abaixo, os elementos amplificadores e supressores podem também se usados em conjunto com os elementos silenciadores apresentados na presente invenção.
[0021] O termo “reduz” ou “redução” do nível de expressão de um polinucleotídeo ou de um polipeptídeo codificado pelo mesmo destina-se a significar que o teor do polinucleotídeo ou polipeptídeo da sequência-alvo é estatisticamente mais baixo que o teor de polinucleotídeo ou polipeptídeo da mesma sequência-alvo em uma praga de controle adequada, que não foi exposta ao elemento silenciador (isto é, não o ingeriu). Em modalidades específicas da invenção, a redução do teor de polinucleotídeo e/ou do teor de polipeptídeo da sequência-alvo em uma praga de acordo com a presente invenção resulta em menos que 95%, menos que 90%, menos que 80%, menos que 70%, menos que 60%, menos que 50%, menos que 40%, menos que 30%, menos que 20%, menos que 10%, ou menos que 5% do teor de polinucleotídeo, ou do teor do polipeptídeo codificado pelo mesmo, da mesma sequência-alvo em um controle adequado para pragas. Os métodos para testar quanto ao teor do transcrito de RNA, o teor do polipeptídeo codificado, ou a atividade do polinucleotídeo ou polipeptídeo são discutidos em outra parte do presente documento.
I. Elementos de supressão senso
[0022] Para uso na presente invenção, um “elemento de supressão senso” compreende um polinucleotídeo projetado para expressar uma molécula de RNA correspondente a pelo menos uma parte de um RNA mensageiro-alvo na orientação “senso”. A expressão da molécula de RNA que compreende o elemento de supressão senso reduz ou elimina o teor do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo. O polinucleotídeo que compreende o elemento de supressão senso pode corresponder ao todo ou parte da sequência do polinucleotídeo-alvo, ao todo ou parte da região não-traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo- alvo, ao todo ou parte da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, ou ao todo ou parte tanto da sequência de codificação como das regiões não-traduzidas do polinucleotídeo- alvo.
[0023] Tipicamente, um elemento de supressão senso tem uma identidade de sequência substancial com o polinucleotídeo- alvo, tipicamente mais que cerca de 65% de identidade de sequência, mais que cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Consulte as patentes US n° 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas a título de referência. O elemento de supressão senso pode ter qualquer comprimento, desde que permita a supressão da sequência-alvo. O elemento de supressão senso pode ter, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 nucleotídeos, ou mais longo, que os polinucleotídeos-alvo apresentados em qualquer das SEQ ID n°: de 1 a 106. Em outras modalidades, o elemento de supressão senso pode ser, por exemplo, cerca de 15 a 25, 19 a 35, 19 a 50, 25 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 350, 350 a 400, 450 a 500, 500 a 550, 550 a 600, 600 a 650, 650 a 700, 700 a 750, 750 a 800, 800 a 850, 850 a 900, 900 a 950, 950 a 1.000, 1.000 a 1.050, 1.050 a 1.100, 1.100 a 1.200, 1.200 a 1.300, 1.300 a 1.400, 1.400 a 1.500, 1.500 a 1.600, 1.600 a 1.700, ou 1.700 a 1.800 nucleotídeos, ou mais longo, que os polinucleotídeos-alvo apresentado em qualquer of SEQ ID n°: 1 a 236.
II. Elementos de supressão antissenso
[0024] Para uso na presente invenção, um “elemento de supressão antissenso” compreende um polinucleotídeo que é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar ao todo ou parte de um RNA mensageiro-alvo. A expressão do elemento de supressão de RNA antissenso reduz ou elimina o teor do polinucleotídeo-alvo. O polinucleotídeo para uso na supressão antissenso pode corresponder ao todo ou parte do complemento da sequência codificadora do polinucleotídeo-alvo, ao todo ou parte do complemento da região não-traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo-alvo, do todo ou parte do complemento da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, ou todo ou parte do complemento tanto da sequência de codificação como das regiões não-traduzidas do polinucleotídeo-alvo. Além disso, o elemento de supressão antissenso pode ser totalmente complementar (isto é, ser 100% idêntico ao complemento da sequência-alvo) ou parcialmente complementar (isto é, ser menos que 100% idêntico ao complemento da sequência-alvo)no polinucleotídeo-alvo. Em modalidades específicas, o elemento de supressão antissenso compreende pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade de sequência com o polinucleotídeo-alvo. A supressão anti-senso pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Consulte, por exemplo, a patente US n° 5.942.657. Além disso, o elemento de supressão antissenso pode ser complementar a uma porção do polinucleotídeo-alvo. De modo geral, pode-se usar as sequências de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400 ou 450 nucleotídeos, ou maiores, da sequência apresentada em qualquer das SEQ ID n°: 1 a 236. Os métodos para uso de supressão antissenso a fim de inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu et al (2002), Plant Physiol. 129:1732-1743, e nas patentes US n° 5.759.829 e 5.942.657, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência.
III. Elemento de supressão de RNA de filamento duplo
[0025] Um “elemento silenciador de RNA de filamento duplo” ou “dsRNA” compreende pelo menos um transcrito que é capaz de formar um dsRNA antes ou depois da ingestão por uma praga. Desse modo, um “elemento silenciador de dsRNA” inclui um dsRNA, um transcrito ou polirribonucleotídeo capaz de formar um dsRNA, ou mais de um transcrito ou polirribonucleotídeo capaz de formar um dsRNA. O termo “RNA de filamento duplo” ou “dsRNA” refere-se a uma estrutura de polirribonucleotídeo formada por uma única molécula de RNA auto-complementar, ou uma estrutura de polirribonucleotídeo formada pela expressão de pelo menos dois filamentos de RNA distintos. As uma ou mais moléculas de dsRNA empregadas noa métodos e composições da invenção mediam a redução da expressão de uma sequência-alvo, por exemplo pela mediação da interferência por RNA, “RNAi”, ou por silenciamento de genes de maneira específica para uma sequência. No contexto da presente invenção, o dsRNA é capaz de reduzir ou eliminar o nível de expressão de um polinucleotídeo-alvo, ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo, em uma praga.
[0026] O dsRNA pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência-alvo mediante influência no nível do transcrito de RNA-alvo, influência na tradução de modo a afetar o nível do polipeptídeo codificado, ou influência na expressão no nível pré-transcricional (isto é, pela modulação da estrutura de cromatina, do padrão de metilação, etc., para alterar a expressão gênica). Consulte, por exemplo, Verdel et al. (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra et al. (2004) Science 303:669-672; Allshire (2002) Science 297:1818-1819; Volpe et al. (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; e Hall et al. (2002) Science 297:2232-2237. Os métodos para teste quanto a dsRNA funcional que é capaz de reduzir ou eliminar o teor de uma sequência de interesse são apresentados em outra parte do presente documento. Consequentemente, para uso na presente invenção o termo “dsRNA” se destina a abranger outros termos usados para descrever as moléculas de ácido nucléico que são capazes de mediação na interferência por RNA ou no silenciamento de genes inclusive, por exemplo, RNA de interferência curto (siRNA), RNA de filamento duplo (dsRNA), micro-RNA (miRNA), hairpin RNA, hairpin RNA curto (shRNA), RNA silenciador de genes pós- transcricional (ptgsRNA) e outros.
[0027] Em modalidades específicas, pelo menos um filamento da região duplex ou de filamento duplo do dsRNA compartilha identidade de sequência ou complementaridade de sequência suficiente com o polinucleotídeo-alvo para permitir que o dsRNA reduza o nível de expressão da sequência-alvo. Para uso na presente invenção, o filamento que é complementar ao polinucleotídeo-alvo é o “filamento antissenso”, e o filamento homólogo ao polinucleotídeo-alvo é o “filamento senso”.
[0028] Em outra modalidade, o dsRNA compreende um hairpin RNA. Um hairpin RNA compreende uma molécula de RNA que é capaz de dobrar-se sobre si mesma para formar uma estrutura de filamento duplo. Múltiplas estruturas podem ser usadas como elementos hairpin. Em modalidades específicas, o elemento de supressão do dsRNA compreende um elemento hairpin que compreende, na seguinte ordem, um primeiro segmento, um segundo segmento, e um terceiro segmento, sendo que o primeiro e o terceiro segmentos compartilham suficiente complementaridade para permitir que o RNA transcrito forme um estrutura haste-laço de filamento duplo.
[0029] O “segundo segmento” do hairpin compreende um “laço” ou uma “região de laço”. Esses termos são usados como sinônimos na presente invenção, e devem ser interpretados amplamente para compreender qualquer sequência de nucleotídeo que confira flexibilidade suficiente para permitir a ocorrência de auto-pareamento entre regiões complementares de um polinucleotídeo (isto é, segmentos 1 e 3 que formam a haste do hairpin). Por exemplo, em algumas modalidades a região de laço pode ser substancialmente de filamento único, e agir como um espaçador entre as regiões auto-complementares da estrutura haste-laço do hairpin. Em algumas modalidades, a região de laço pode compreender uma sequência de nucleotídeo aleatória ou sem sentido e, portanto, compartilhar a identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo. Em outras modalidades, a região de laço compreende uma sequência de RNA senso ou antissenso, ou fragmento da mesma, que compartilha a identidade com uum polinucleotídeo-alvo. Consulte, por exemplo, a publicação de patente internacional n° WO 02/00904, aqui incorporada a título de referência. Em modalidades específicas, a região de laço pode ser otimizada para ser tão curta quanto possível, ao mesmo tempo em que ainda proporciona suficiente flexibilidade intramolecular para permitir a formação da região de haste pareada por base. Consequentemente, a sequência de laço é geralmente menor que 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 10 nucleotídeos, ou menos.
[0030] O “primeiro” e o “terceiro” segmentos da molécula de hairpin RNA compreendem a haste pareada por base da estrutura do hairpin. O primeiro e o terceiro segmentos são repetições invertidas um do outro, e compartilham suficiente complementaridade para permitir a formação da região de haste pareada por base. Em modalidades específicas, o primeiro e o terceiro segmentos são totalmente complementares um ao outro. Alternativamente, o primeiro e o terceiro segmentos podem ser parcialmente complementares um ao outro, contanto que sejam capazes de se hibridizarem um com o outro para formar uma região de haste pareada por base. A quantidade de complementaridade entre o primeiro e o terceiro segmentos pode ser calculada com uma porcentagem do segmento como um todo. Portanto, o primeiro e o terceiro segmentos do hairpin RNA geralmente compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, até 100%, inclusive, de complementaridade.
[0031] O primeiro e o terceiro segmentos têm um comprimento de pelo menos cerca de 1.000, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 25, 22, 20, 19, 18, 17, 16, 15 ou 10 nucleotídeos. Em modalidades específicas, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmentos é de cerca de 10 a 100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 19 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos , cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos a cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeo a cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 700 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 900 nucleotídeos, cerca de 1 .000 nucleotídeos, cerca de 1 .100 nucleotídeos, cerca de 1 .200 nucleotídeos, 1.300 nucleotídeos, 1.400 nucleotídeos, 1.500 nucleotídeos, 1.600 nucleotídeos, 1.700 nucleotídeos, 1.800 nucleotídeos, 1.900 nucleotídeos, 2.000 nucleotídeos ou mais longo. Em outras modalidades, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmentos compreende pelo menos de 10 a 19 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeos; 19 a 35 nucleotídeos, 20 a 35 nucleotídeos; 30 a 45 nucleotídeos; 40 a 50 nucleotídeos; 50 a 100 nucleotídeos; 100 a 300 nucleotídeos; cerca de 500 a 700 nucleotídeos; cerca de 700 a 900 nucleotídeos; cerca de 900 a 1.100 nucleotídeos; cerca de 1.300 a 1.500 nucleotídeos; cerca de 1.500 a 1.700 nucleotídeos; cerca de 1.700 a 1.900 nucleotídeos; cerca de 1.900 a 2.100 nucleotídeos; cerca de 2.100 a 2.300 nucleotídeos; ou cerca de 2.300 a 2.500 nucleotídeos. Consulte, por exemplo, a publicação internacional n° WO 0200904. Em alguns exemplos não-limitadores, a primeira haste do hairpin compreende nucleotídeos de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45; nucleotídeos de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50; nucleotídeos de 1 a 675 da SEQ ID n°: 37; ou nucleotídeos de 1 a 132 da SEQ ID n°: 40, ou variantes ativas e fragmentos das mesmas. Em modalidades específicas, o primeiro e o terceiro segmentos compreendem pelo menos 20 nucleotídeos tendo pelo menos 85% de complementaridade com o primeiro segmento. Em ainda outras modalidades, o primeiro e o terceiro segmentos que formam a estrutura haste-laço do hairpin compreendem 3' ou 5' regiões protuberantes com resíduos de nucleotídeo não-pareados.
[0032] Em modalidades específicas, as sequências usadas no primeiro, no segundo e/ou no terceiro segmentos compreendem domínios que são projetados para terem identidade de sequência suficiente com um polinucleotídeo-alvo de interesse e, assim, têm a capacidade de diminuir o nível de expressão do polinucleotídeo-alvo. A especificidade das transcrições de RNA inibitório é, portanto, geralmente conferida por esses domínios do elemento silenciador. Portanto, em algumas modalidades da invenção, o primeiro, segundo e/ou terceiro segmentos do elemento silenciador compreendem um domínio tendo pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1.000, ou mais de 1.000 nucleotídeos que compartilham identidade de sequência suficiente com o polinucleotídeo-alvo, para permitir uma diminuição nos níveis de expressão do polinucleotídeo-alvo quando expressos em uma célula adequada. Em outras modalidades, o domínio tem entre cerca de 15 a 50 nucleotídeos, cerca de 19 a 35 nucleotides, cerca de 20 a 35 nucleotídeos, cerca de 25 a 50 nucleotídeos, cerca de 19 a 75 nucleotídeos, cerca de 20 a 75 nucleotídeos, cerca de 40 a 90 nucleotídeos, cerca de 15 a 100 nucleotídeos, de 10 a 1 00 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos , cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos , cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos , cerca de 10 a cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos a cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 500 nucleotídeos, ou mais. Em outras modalidades, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmentos compreende pelo menos de 10 a 20 nucleotídeos, pelo menos de 10 a 19 nucleotídeos, 20 a 35 nucleotídeos, 30 a 45 nucleotídeos, 40 a 50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotídeos, ou cerca de 100 a 300 nucleotídeos.
[0033] Em modalidades específicas, o domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos tem 100% de identidade de sequência com o polinucleotídeo-alvo. Em outras modalidades, o domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos tendo homologia com o polipeptídeo-alvo têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, ou mais, com uma região do polinucleotídeo-alvo. A identidade de sequência dos domínios do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos com o polinucleotídeo-alvo só precisa ser suficiente para diminuir a expressão do polinucleotídeo-alvo de interesse. Consulte, por exemplo, Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7, e publicação de patente US n° 20030175965, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência. Um teste transitório quanto à eficiência dos constructos de hpRNA para silenciar a expressão gênica in vivo foi descrito por Panstruga et al. (2003), Mol. Biol. Rep. 30:135-140, aqui incorporado a título de referência.
[0034] A quantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro, o segundo e/ou o terceiro segmentos e o polinucleotídeo-alvo, ou a quantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro segmento e o terceiro segmento (isto é, a haste da estrutura de hairpin) pode variar dependendo do organismo em que a expressão gênica será controlada. Alguns organismos ou tipos de célula podem requerer pareamento exato ou 100% de identidade, enquanto outros organismos ou tipos de célula podem tolerar alguns erros de pareamento. Em algumas células, por exemplo, um único erro de pareamento do nucleotídeo com a sequência-alvo suspende a capacidade de suprimir a expressão gênica. Nessas células, os cassetes de supressão da invenção podem ser usados para se ter como alvo a supressão de genes mutantes, por exemplo oncogenes cujas transcrições compreendem mutações pontuais e, portanto, podem ser especificamente visados com o uso dos métodos e composições da invenção, sem alterar a expressão do alelo de tipo selvagem restante.
[0035] Qualquer região do polinucleotídeo-alvo pode ser usada para designar o domínio do elemento silenciador que compartilha identidade de sequência suficiente para permitir a expressão da transcrição do hairpin de modo a diminuir o nível do polinucleotídeo-alvo. Por exemplo, o domínio pode ser projetado para compartilhar identidade de sequência com a região não-traduzida 5' dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, com a região não-traduzida 3' dos um ou mais polinucleotídeos- alvo, regiões exônicas dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, regiões intrônicas dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, e qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, um domínio do elemento silenciador compartilha suficiente homologia com pelo menos cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25 ou 30 nucleotídeos consecutivos, de cerca dos nucleotídeos 1 a 50, 25 a 75, 75 a 125, 50 a 100, 125 a 175, 175 a 225, 100 a 150, 150 a 200 a 200 a 250, 225 a 275, 275 a 325, 250 a 300, 325 a 375, 375 a 425, 300 a 350, 350 a 400, 425 a 475, 400 a 450, 475 a 525, 450 a 500, 525 a 575, 575 a 625, 550 a 600, 625 a 675, 675 a 725, 600 a 650, 625 a 675, 675 a 725, 650 a 700, 725 a 825, 825 a 875, 750 a 800, 875 a 925, 925 a 975, 850 a 900, 925 a 975, 975 a 1.025, 950 a 1.000, 1.000 a 1.050, 1.025 a 1.075, 1.075 a 1.125, 1.050 a 1.100, 1.125 a 1.175, 1.100 a 1.200, 1.175 a 1.225, 1.225 a 1.275, 1.200 a 1.300, 1.325 a 1.375, 1.375 a 1.425, 1.300 a 1.400, 1.425 a 1.475, 1.475 a 1.525, 1.400 a 1.500, 1.525 a 1.575, 1.575 a 1.625, 1.625 a 1.675, 1.675 a 1.725, 1.725 a 1.775, 1.775 a 1.825, 1.825 a 1.875, 1.875 a 1.925, 1.925 a 1.975, 1.975 a 2.025, 2.025 a 2.075, 2.075 a 2.125, 2.125 a 2.175, 2.175 a 2.225, 1.500 a 1.600, 1.600 a 1.700, 1.700 a 1.800, 1.800 a 1.900, 1.900 a 2.000 da sequência-alvo. Em alguns casos, para otimizar as sequências siRNA empregadas no hairpin, o método de oligodesoxirribonucleotídeo sintético/RNAse H pode ser usado para determinar sítios no mRNA-alvo que estão em uma conformação que é suscetível ao silenciamento por RNA. Consulte, por exemplo, Vickers et al. (2003) J. Biol. Chem 278:7108-7118, e Yang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9442-9447, aqui incorporados a título de referência. Esses estudos indicam que há uma correlação significativa entre os sítios sensíveis a RNase-H e os sítios que promovem uma degradação eficaz do mRNA dirigida por siRNA.
[0036] O elemento silenciador de hairpin pode, também, ser projetado de modo que a sequência senso ou a sequência antissenso não corresponda a um polinucleotídeo-alvo. Nessa modalidade, as sequências senso e antissenso ladeiam uma sequência de laço que compreende uma sequência de nucleotídeo correspondente ao todo ou parte do polinucleotídeo-alvo. Dessa forma, é a região de laço que determina a especificidade da interferência por RNA. Consulte, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporado a título de referência.
[0037] Além disso, o silenciamento de genes transcricional (TGS) pode ser realizado mediante o uso de um elemento de supressão de hairpin, no qual a repetição invertida do hairpin compartilha a identidade de sequência com a região promotora de um polinucleotídeo-alvo a ser silenciado. Consulte, por exemplo, Aufsatz et al. (2002) PNAS 99 (Suppl. 4):16499-16506, e Mette et al. (2000) EMBO J 19(19):5194-5201.
[0038] Em outras modalidades, o dsRNA pode compreender um RNA pequeno (sRNA). Os sRNAs podem compreender tanto micro RNA (miRNA) como RNA de interferência curto (siRNA) (Meister e Tuschl (2004) Nature 431:343-349, e Bonetta et al. (2004) Nature Methods 1:79-86). Os miRNAs são agentes regulatórios compreendendo cerca de 19 ribonucleotídeos que são altamente eficientes para inibir a expressão dos polinucleotídeos-alvo. Consulte, por exemplo Javier et al. (2003) Nature 425: 257 263, aqui incorporado a título de referência. Para interferência por miRNA, o elemento silenciador pode ser projetado de modo a expressar uma molécula de dsRNA que forma uma estrutura de hairpin contendo uma sequência de 19 nucleotídeos que é complementar ao polinucleotídeo-alvo de interesse. O miRNA pode ser sinteticamente produzido, ou transcrito como um RNA mais longo que é subsequentemente clivado para produzir o miRNA ativo. Especificamente, o miRNA pode compreender 19 nucleotídeos da sequência que tem homologia com um polinucleotídeo-alvo na orientação senso, e 19 nucleotídeos de uma sequência antissenso correspondente que é complementar à sequência senso.
[0039] Ao expressar um miRNA, é reconhecido que várias formas de um miRNA podem ser transcritas inclusive, por exemplo, a transcrição primária (denominada “pri-miRNA”) que é processada através de várias etapas nucleolíticas até um miRNA precursor mais curto (denominado “pre-miRNA”), sendo que o pre- miRNA ou o miRNA final (maduro) está presente como duplex, sendo os dois filamentos chamados de miRNA (o filamento que eventualmente fará pares de bases com o alvo) e miRNA*. O pre- miRNA é um substrato para uma forma de cortador que remove o duplex miRNA/miRNA* do precursor, após o que, de maneira similar aos siRNAs, o duplex pode ser tomado para dentro do complexo RISC. Foi demonstrado que os miRNAs podem ser expressos transgenicamente e ser eficazes através da expressão de uma forma precursora, em vez da totalidade da forma primária (Parizotto et al. (2004) Genes & Development 18:2237-2242, e Guo et al. (2005) Plant Cell 17:1376-1386).
[0040] Os métodos e composições da invenção empregam elementos silenciadores que, quando transcritos, “formam” uma molécula de dsRNA. Consequentemente, o polinucleotídeo heterólogo sendo expresso não precisa formar o dsRNA por si só, mas pode interagir com outras sequências na célula vegetal ou nos intestinos da praga, após a ingestão, para permitir a formação do dsRNA. Por exemplo, um polinucleotídeo quimérico que podem silenciar seletivamente o polinucleotídeo-alvo pode ser gerado mediiante a expressão de um constructo quimérico compreendendo a sequência-alvo de um miRNA ou siRNA para uma sequência correspondente ao todo ou parte dos um ou mais genes a serem silenciados. Nessa modalidade, o dsRNA é “formado” quando o alvo do miRNA ou siRNA interage com o miRNA presente na célula. O dsRNA resultante pode, então, reduzir o nível de expressão dos um ou mais genes a serem silenciados. Consulte, por exemplo, a publicação de pedido US 2007-0130653, intitulada “Methods and Compositions for Gene Silencing”, aqui incorporada a título de referência. O constructo pode ser projetado para ter um alvo para um miRNA endógeno ou, alternativamente, um alvo para um miRNA heterólogo e/ou sintético pode ser usado no constructo. Se for usado um miRNA heterólogo e/ou sintético, o mesmo pode ser introduzido na célula no mesmo constructo de nucleotídeo que o polinucleotídeo quimérico, ou em um constructo separado. Conforme discutido em outra parte do presente documento, qualquer método pode ser usado para introduzir o constructo compreendendo o miRNA heterólogo.
IV. Variantes e fragmentos
[0041] O termo “fragmento” se destina a definir uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácidos e, portanto, a proteína codificada pelo mesmo. Os fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nativa. Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo que são úteis como um elemento silenciador não precisam codificar fragmentos de proteína que retenham atividade biológica. Assim, fragmentos de uma sequência de nucleotídeo podem estar na faixa de pelo menos cerca de 10, cerca de 15, cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 22 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 700 nucleotídeos e até o polinucleotídeo de comprimento completo empregado na invenção. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeo podem estar na faixa de 1-50, 25-75, 75-125, 50-100, 125-175, 175-225, 100-150, 100-300, 150-200, 200-250, 225-275, 275-325, 250-300, 325-375, 375-425, 300-350, 350-400, 425-475, 400-450, 475-525, 450-500, 525-575, 575-625, 550-600, 625-675, 675-725, 600-650, 625-675, 675-725, 650-700, 725-825, 825-875, 750-800, 875-925, 925-975, 850-900, 925-975, 975-1.025, 950-1.000, 1.000-1.050, 1.025-1.075, 1.075-1.125, 1.050-1.100, 1.125-1.175, 1.100-1.200, 1.175-1.225, 1.225-1.275, 1.200-1.300, 1.325-1.375, 1.375-1.425, 1.300-1.400, 1.425-1.475, 1.475-1.525, 1.400-1.500, 1.525-1.575, 1.575-1.625, 1.625-1.675, 1.675-1.725, 1.725-1.775, 1.775-1.825, 1.825-1.875, 1.875-1.925, 1.925-1.975, 1.975-2.025, 2.025-2.075, 2.075-2.125, 2.125-2.175, 2.175-2.225, 1.500-1.600, 1.600-1.700, 1.700-1.800, 1.800-1.900, 1.900-2.000 de qualquer uma das SEQ ID n°: 1 a 236. Os métodos para testar quanto à atividade de um elemento silenciador desejado são descritos em outra parte do presente documento.
[0042] O termo “variantes” se destina a significar sequências substancialmente similares. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou uma adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios interno dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Uma variante de um polinucleotídeo que é útil como elemento silenciador reterá a capacidade para reduzir a expressão do polinucleotídeo-alvo e, em algumas modalidades, controlar assim uma praga de interesse. Para uso na presente invenção, um polinucleotídeo ou polipeptídeo “nativo” compreende uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácidos de ocorrência natural, respectivamente. Para polinucleotídeos, as variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degeneração do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos empregados na presente invenção. Os polinucleotídeos variantes incluem, também, polinucleotídeos sinteticamente derivados, como aqueles gerados, por exemplo mediante o uso de mutagênese sítio- dirigida, mas continuam a reter a atividade desejada. Em geral, variantes de um polinucleotídeo particular da invenção (i.e., a silencing element) terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade de sequência com aquele polinucleotídeo específico, conforme determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outra parte do presente documento.
[0043] As variantes de um polinucleotídeo específico da invenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) também podem ser avaliadas por comparação do percentual de identidade de sequência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. O percentual de identidade de sequência entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculado com o uso dos programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro local no presente documento. Quando qualquer par de polinucleotídeos empregados na invenção é avaliado por comparação do percentual de identidade de sequência compartilhado pelos dois polipeptídeos que eles codificam, o percentual de identidade de sequência entre os dois polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência ou mais.
[0044] Os termos apresentados a seguir são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos: (a) “sequência de referência”, (b) “janela de comparação”, (c) “identidade de sequência” e (d) “porcentagem de identidade de sequência”. (a) Para uso na presente invenção, “sequência de referência” é uma sequência definida usada como uma base para a comparação entre as sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA ou sequência de genes de comprimento completo, ou o cDNA ou sequência de genes completa. (b) Para uso na presente invenção, “janela de comparação” faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeo, sendo que a sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento ótimo dos dois polinucleotídeos. Em geral, a janela de comparação tem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e, opcionalmente, pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os versados na técnica compreendem que para evitar uma alta similaridade com uma sequência de referência, devido à inclusão de buracos na sequência de polinucleotídeo, um buraco com função de penalidade e introduzido e é subtraído do número de igualdades.
[0045] Exceto onde especificado em contrário, os valores para identidade/similaridade de sequência aqui fornecidos referem-se ao valor obtido com o uso do programa GAP, Versão 10, usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeo com o uso de Peso GAP de 50 e Comprimento - Peso de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácido com o uso do Peso GAP de 8 e Comprimento - Peso de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente aos mesmos. O termo “programa equivalente” refere-se a qualquer programa para comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem pareamentos de resíduos de nucleotídeo ou aminoácido idênticos e um percentual de identidade de sequência idêntico em comparação ao alinhamento correspondente gerado pelo programa GAP Version 10. (c) Para uso na presente invenção, “identidade de sequência” ou “identidade” no contexto de duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com relação a proteínas, reconhece-se que posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácido conservativas, quando os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou capacidade hidrofóbica) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado para cima para compensar a natureza conservativa da substituição. Diz-se que sequências que diferem em tais substituições conservativas possuem “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Isto envolve tipicamente pontuar uma substituição conservativa como um pareamento errado parcial ao invés de total aumentando, assim, a porcentagem de identidade de sequência. Portanto, por exemplo, quando é dado a um aminoácido idêntico a pontuação 1 e a uma substituição não conservativa é dada a pontuação zero, a uma substituição conservativa é dada uma pontuação entre zero e 1. A pontuação das substituições conservativas é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, U.S.). (d) Para uso na presente invenção, “porcentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais ocorre uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idênticos em ambas as sequências para gerar o número de posições pareadas, dividindo-se o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade de sequência.
[0046] Adicionalmente, é apresentado um método para identificação de um elemento silenciador a partir dos polinucleotídeos-alvo apresentados nas SEQ ID n°: 1 a 236. Esses métodos compreendem obter um fragmento candidato de qualquer uma das SEQ ID n°: 1 a 236, o qual tenha um comprimento suficiente para agir como um elemento silenciador e, assim, reduzir a expressão do polinucleotídeo-alvo, e/ou controlar uma praga de interesse; expressar o dito fragmento de polinucleotídeo candidato em um cassete de expressão adequado para produzir um elemento silenciador candidato, e determinar se o dito fragmento de polinucleotídeo candidato tem a atividade de um elemento silenciador e pode, assim, reduzir a expressão do polinucleotídeo-alvo e/ou controlar uma praga de interesse. Os métodos para identificação desses fragmentos candidatos com base na rota desejada para supressão são conhecidos. Por exemplo, vários programas de bioinformática podem ser empregados para identificar a região dos polinucleotídeos-alvo que poderia ser explorada para gerar um elemento silenciador. Consulte, por exemplo, Elbahir et al. (2001) Genes and Development 15:188-200, Schwartz et al. (2003) Cell 115:199-208, Khvorova et al. (2003) Cell 115:209216. Consulte, também, siRNA em Whitehead (jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/), que calculata as energias de ligação para siRNAs senso e antissenso. Consulte, também, genscript.com/ssl-bin/app/rnai?op=known; o utilitário para projeto de RNAi Block-iT™, da Invitrogen, bem como o GenScript siRNA Construct Builder.
V. Constructos de DNA
[0047] O uso do termo “polinucleotídeo” não se destina a limitar a presente invenção a polinucleotídeos compreendendo DNA. Os versados na técnica compreenderão que os polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem moléculas de ocorrência natural e análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de sequências incluindo, mas não se limitando a formas em fita simples, formas em dupla fita, hairpin (grampo), estruturas do tipo haste-e-alça e similares.
[0048] O polinucleotídeo que codifica o elemento silenciador ou, em modalidades específicas, é empregado nos métodos e composições da invenção, pode ser obtido em cassetes de expressão para expressão em uma planta ou organismo de interesse. É fato reconhecido que podem ser usados múltiplos elementos silenciadores, inclusive múltiplos elementos silenciadores idênticos, múltiplos elementos silenciadores que têm como alvo regiões diferentes da sequência-alvo, ou múltiplos elementos silenciadores oriundos de diferentes sequências-alvo. Nessa modalidade, é reconhecido que cada elemento silenciador pode estar contido em um cassete único ou separado, um constructo de DNA ou um vetor. Conforme discutido, qualquer meio para obtenção do elemento silenciador está contemplado. Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada com um único cassete que compreende DNA codificando um ou mais elementos silenciadores, ou cassetes separados compreendendo cada elemento silenciador podem ser usados para transformar uma planta, célula vegetal ou célula hospedeira. De modo semelhante, uma planta transformada com um componente pode ser subsequentemente transformada com o segundo componente. Um ou mais elementos silenciadores podem também ser reunidos por meio de cruzamento sexual. Ou seja, uma primeira planta que compreende um componente é cruzada com uma segunda planta que compreende o segundo componente. As plantas da progênie desse cruzamento compreenderão ambos os componentes.
[0049] O cassete de expressão pode incluir sequências reguladoras 5' e 3' funcionalmente ligadas ao polinucleotídeo da invenção. O termo “funcionalmente ligado” destina-se a significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação funcional entre um polinucleotídeo da invenção e uma sequência reguladora (isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo da invenção. Os elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não-contíguos. Quando usado com relação à união de duas regiões codificantes de proteína, o termo operacionalmente ligado significa que as regiões codificantes estão na mesma fase de leitura. O cassete pode, adicionalmente, conter pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, os polipeptídeos adicionais podem ser obtidos em múltiplos cassetes de expressão. Os cassetes de expressão podem ser dotados de uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeo destinado a ficar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias. O cassete de expressão pode conter ainda genes marcadores selecionáveis.
[0050] O cassete de expressão pode incluir, na direção 5' a 3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (isto é, um promotor), um polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador empregado nos métodos e composições da invenção, e uma região de terminação transcricional e traducional (isto é, região de terminação) funcional em plantas. Em outra modalidade, o RNA de filamento duplo é expresso a partir de um cassete de supressão. Esse tipo de cassete pode compreender dois promotores convergentes que conduzem a transcrição de um elemento silenciador funcionalmente ligado. O termo “promotores convergentes” refere-se a promotores que estão orientados em cada terminal do elemento silenciador funcionalmente ligado, de modo que cada promotor conduza a transcrição do elemento silenciador em direções opostas, resultando em duas transcrições. Nessas modalidades, os promotores convergentes permitem a transcrição dos filamentos senso e antissenso e, desse modo, permitem a formação de um dsRNA.
[0051] As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais, e regiões de terminação traducional) e/ou os polinucleotídeos empregados na invenção podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou um ao outro. Alternativamente, as regiões regulatórias e/ou o polinucleotídeo empregado na invenção podem ser heterólogos à célula hospedeira ou um ao outro. Para uso na presente invenção, “heterólogo”, com relação a uma sequência, é uma sequência que se origina de uma espécie estranha, ou, caso seja da mesma espécie, é substancialmente modificada com relação a sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana intencional. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie a partir da qual o polinucleotídeo se originou, ou, caso seja de espécie igual /análoga, um ou ambos são substancialmente modificados com relação a sua forma original e/ou lócus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado. Para uso na presente invenção, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de início de transcrição que é heteróloga à sequência codificante.
[0052] A região de terminação pode ser nativa à região de iniciação transcricional, pode ser nativa ao polinucleotídeo funcionalmente ligado que codifica o elemento silenciador, pode ser nativa à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga) ao promotor, ao polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador, à planta hospedeira, ou qualquer combinação dos mesmos. Regiões de terminação adequadas estão disponíveis a partir do plasmídio Ti de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consulte, também, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:78917903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.
[0053] Modificações de sequência adicionais para melhorar a expressão gênica em um hospedeiro celular são conhecidas. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais espúrios de poliadenilação, sinais de sítio de emenda éxon- íntron, repetições similares a transpóson e outras sequências bem caracterizadas como essas, que podem ser prejudiciais à expressão gênica. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis medidos para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas secundárias de mRNA em forma de grampo previstas.
[0054] Ao preparar o cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme for adequado, na fase de leitura adequada. Para isso, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para isto, mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, re- substituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.
[0055] Inúmeros promotores podem ser usados na prática da invenção. O polinucleotídeo que codifica o elemento silenciador pode ser combinado com promotores constitutivos, preferenciais para tecido ou outros, para expressão em plantas.
[0056] Esses promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos apresentados em WO 99/43838 e na patente US n° 6.072.050; o promotor de núcleo CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente US n° 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles apresentados nas patentes US n° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.
[0057] Um promotor induzível, por exemplo um promotor induzível por patógeno, também poderia ser empregado. Esses promotores incluem aqueles provenientes de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidos após a infecção por um patógeno; por exemplo proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consulte, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Consulte, também, WO 99/43819, aqui incorporado a título de referência.
[0058] Adicionalmente, à medida que os patógenos entram dentro de plantas através de feridas ou danos causados por insetos, um promotor induzível por ferida pode ser usado nas construções da invenção. Esses promotores induzíveis por ferimento incluem o gene inibidor de proteinase da batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 e wun2, patente US n° 5.428.148; win1 e win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150) e similares, aqui incorporados a título de referência.
[0059] Promotores reguláveis quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível quimicamente, em que a aplicação da substância química induz a expressão gênica, ou um promotor reprimível quimicamente, em que a aplicação da substância química reprime a expressão gênica. Promotores induzíveis quimicamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, promotor In2-2 no milho, que é ativado por herbicidas protetores de plantas (safener) compostos por benzenosulfonamida, o promotor GST no milho, que é ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores responsivos a esteróides (consulte, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticóide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 88, páginas 10421 a 10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. volume 14, número 2, páginas 247 a 257) e os promotores induzíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina (consulte, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. volume 227, páginas 229 a 237, e patentes US n° 5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporados por referência.
[0060] Os promotores preferenciais para tecido podem ser usados para se obter uma expressão otimizada em um tecido vegetal específico. Os promotores preferenciais para tecido incluem aqueles apresentados em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586- 9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para uma expressão fraca.
[0061] Promotores preferenciais de folha são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357- 67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
[0062] Promotores preferenciais de raiz são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos exemplos disponíveis na literatura ou isolados “de novo” a partir de várias espécies compatíveis. Consulte, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene da glutamina sintetase específico para raiz do feijão soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico para raiz no gene GRP 1.8 gene do feijão comum); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico para raiz do gene de manopina sintase (MAS) da Agrobacterium tumefaciens); e Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone cDNA de comprimento completo que codifica a glutamina sintetase citossólica (GS), que é expressa em raízes e nódulos de raiz de feijão soja). Consulte também Bogusz et al. (1990) Plant Cell, volume 2, número 7, páginas 633 a 641, em que são descritos dois promotores específicos de raiz isolados a partir de gene de hemoglobina da não-leguminosa Parasponia andersonii fixadora de nitrogênio e da não- leguminosa Trema tomentosa relacionada. Os promotores desses genes foram ligados a um gene-repórter β-glucuronidase e introduzidos dentro da não-leguminosa Nicotiana tabacum e da leguminosa Lotus corniculatus, e em ambos os exemplos a atividade do promotor específico de raiz foram preservados. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raiz rolC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (consulte Plant Science (Limerick), volume 79, número 1, páginas 69 a 76). Eles concluíram que o reforçador (enhancer) e os determinantes do DNA com preferência por tecido são dissociados naqueles promotores. Teeri et al. (1989) usaram a fusão genética a lacZ para mostrar que o gene do T-DNA de Agrobacterium que codifica a octopina sintetase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz, e que o gene TR2' é específico para raiz na planta intacta e estimulado por ferimentos no tecido foliar, uma combinação de características especialmente desejável para uso com um gene inseticida ou larvicida (consulte EMBO J. O gene TR1' fundido ao gene da nptII (neomicina fosfotransferase II) mostrou características similares. Os promotores preferenciais de raiz adicionais incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); e o promotor de rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Consulte também as patentes US n° 5.837.876, 5.750.386, 5.633.363, 5.459.252, 5.401.836, 5.110.732 e 5.023.179.
[0063] Em uma modalidade da presente invenção, o promotor expresso por planta é um promotor vascular-específico, como um promotor específico para floema. Um promotor “vascular- específico”, para uso na presente invenção, é um promotor que é pelo menos expresso em células vasculares, ou um promotor que é preferencialmente expresso em células vasculares. A expressão de um promotor vascular-específico não precisa ocorrer exclusivamente em células vasculares, sendo possível a expressão em outros tipos de células ou tecidos. Um “promotor específico para floema” é, para uso na presente invenção, um promotor que pode ser expresso em plantas e que é pelo menos expresso em células de floema, ou um promotor que é preferencialmente expresso em células de floema.
[0064] A expressão de um promotor específico para floema não precisa ocorrer exclusivamente em células de floema, sendo possível a expressão em outros tipos de células ou tecidos, por exemplo o tecido de xilema. Em uma modalidade da presente invenção, um promotor específico para floema é um promotor que pode ser expresso em plantas, sendo pelo menos expresso em células de floema, e sendo que a expressão em células não- pertencentes ao floema é mais limitada (ou ausente) em comparação à expressão em células de floema. Exemplos de promotores adequados vascular-específicos ou específicos para floema, de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a, promotores selecionados do grupo consistindo em: promotores SCSV3, SCSV4, SCSV5 e SCSV7 (Schunmann et al. (2003) Plant Functional Biology 30:453-60; promotor do gene rolC de Agrobacterium rhizogenes (Kiyokawa et al. (1994) Plant Physiology 104:801-02; Pandolfini et al. (2003) BioMedCentral (BMC) Biotechnology 3:7, (www.biomedcentral.com/1472- 6750/3/7); Graham et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:729-35; Guivarc'h et al. (1996); Almon et al. (1997) Plant Physiol. 115:1599-607; promotor do gene rolA de Agrobacterium rhizogenes (Dehio et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:1199-210); promotor do gene 5 de T-DNA da Agrobacterium tumefaciens (Korber et al. (1991) EMBO J. 10:3983-91); promotor do gene RSs1 de sacarose sintase do arroz (Shi et al. (1994) J. Exp. Bot. 45:623-31); o promotor de badnavírus CoYMV ou Commelina de mancha amarela (Medberry et al. (1992) Plant Cell 4:185-92; Zhou et al. (1998) Chin. J. Biotechnol. 14:9-16); promotor do vírus CFDV ou vírus da podridão foliar do coqueiro (Rohde et al. (1994) Plant Mol. Biol. 27:623-28; Hehn e Rhode (1998) J. Gen. Virol. 79:1495-99); promotor do vírus RTBV ou Tungro baciliforme do arroz (Yin e Beachy (1995) Plant J. 7:969-80; Yin et al. (1997) Plant J. 12:1179-80); gene GS3A glutamina sintase da ervilha (Edwards et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3459-63; Brears et al. (1991) Plant J. 1:235-44); promotores inv CD111 e inv CD141 dos genes de invertase da batata (Hedley et al. (2000) J. Exp. Botany 51:817-21); promotor isolado da Arabidopsis cuja expressão específica para floema em tabaco foi provada por Kertbundit et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5212-16); região promotora VAHOX1 (Tornero et al. (1996) Plant J. 9:639-48); promotor do gene para invertase da parede celular da ervilha (Zhang et al. (1996) Plant Physiol. 112:1111-17); promotor da proteína endógena do algodão relacionada à quitinase, do pedido de patente publicado US 20030106097, promotor do gene de ácido invertase da cenoura (Ramloch-Lorenz et al. (1993) The Plant J. 4:545-54); promotor do gene de transportador de sulfato Sultr1; 3 (Yoshimoto et al. (2003) Plant Physiol. 131:151117); promotor de um gene dee sacarose sintase (Nolte e Koch (1993) Plant Physiol. 101:899-905); e o promotor de um gene de transportador de sacarose do tabaco (Kuhn et al. (1997) Science 275-1298-1300).
[0065] Os possíveis promotores incluem, também, o promotor de cereja negra para prunasina hidrolase (PH DL1.4 PRO) (patente US n° 6.797.859), promotor de tiorredoxina H de pepino e arroz (Fukuda A et al. (2005). Plant Cell Physiol. 46(11):1779-86), promotores da sacarose sintase-1 de arroz (RSs1) (Shi, T. Wang et al. (1994). J. Exp. Bot. 45(274): 623 631) e de milho (Yang., N-S. et al. (1990) PNAS 87:4144-4148), promotor PP2 de abóbora (Guo, H. et al. (2004) Transgenic Research 13:559-566), promotor At SUC2 (Truernit, E. et al. (1995) Planta 196(3):564-70., At SAM-1 (S-adenosil metionina sintetase) (Mijnsbrugge KV. et al. (1996) Planr. Cell. Physiol. 37(8): 1108-1115), e o promotor do vírus Tungro bacilliform do arroz (RTBV) (Bhattacharyya-Pakrasi et al. (1993) Plant J. 4(1):71-79).
[0066] O cassete de expressão também pode compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam para resistência a antibióticos, como aqueles que codificam para a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenóxiacetato (2,4-D). Os marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos como β-galactosidase e proteínas fluorescentes como proteína verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42), e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ disponível junto à Evrogen, consulte Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores selecionáveis adicionais, consulte, de modo geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Essas descrições estão aqui incorporadas a título de referência. A lista de genes marcadores selecionáveis acima não se destina a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.
VI. Composições compreendendo elementos silenciadores
[0067] Um ou mais dos polinucleotídeos compreendendo o elemento silenciador podem ser obtidos como uma composição externa, como uma aspersão ou pó aplicado à planta, à parte de planta, à semente, a uma praga, ou a um área de cultivo. Em outro exemplo, uma planta é transformada com um constructo de DNA ou cassete de expressão para expressar pelo menos um elemento silenciador. Em qualquer das composições, o elemento silenciador, quando ingerido por um inseto, pode reduzir o teor de um sequência da praga-alvo e, assim, controlar a praga (isto é, uma praga de plantas do tipo Coleoptera, inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, como D. virgifera virgifera, D. barberi ou D. undecimpunctata howardi). É fato reconhecido que a composição pode compreender uma célula (como uma célula vegetal ou uma célula bacteriana), em que um polinucleotídeo codificando o elemento silenciador é incorporado de maneira estável ao genoma, e funcionalmente ligado a promotores ativos na dita célula. Também estão abrangidas as composições compreendendo uma mistura de células, sendo que algumas células expressam pelo menos um elemento silenciador. Em outras modalidades, as composições compreendendo os elementos silenciadores não estão contidas em uma célula. Nessas modalidades, a composição pode ser aplicada a uma área habitada por uma praga. Em uma modalidade, a composição é aplicada externamente a uma planta (isto é, mediante aspersão de um campo ou área de cultivo) para proteger a planta contra a praga.
[0068] A composição da invenção pode ser adicionalmente formulada sob a forma de isca. Nessa modalidade, as composições compreendem uma substância alimentícia ou um atrativo que acentua a atratividade da composição para a praga.
[0069] A composição compreendendo o elemento silenciador pode ser formulada em um carreador agriculturalmente adequado e/ou ambientalmente aceitável. Esses carreadores podem consistir em qualquer material que o animal, planta ou ambiente a ser tratada possa tolerar. Além disso, o carreador precisa ser tal que a composição permaneça eficaz no controle da praga. Os exemplos desse tipo de carreador incluem água, solução salina, solução de Ringer, dextrose ou outras soluções de açúcar, solução de Hank e outras soluções salinas aquosas fisiologicamente balanceadas, tampão de fosfato, tampão de bicarbonato e tampão Tris. Além disso, a composição pode incluir compostos que aumentam a meia-vida de uma composição. As várias formulações inseticidas podem também se encontradas, por exemplo, nas publicações US 2008/0275115, 2008/0242174, 2008/0027143, 2005/0042245 e 2004/0127520, cada uma das quais está aqui incorporada, a título de referência.
[0070] É fato reconhecido que os polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam o elemento silenciador podem ser usados para transformar organismos, de modo a se obter a produção desses componentes pelos organismos hospedeiros, com a subsequente aplicação do organismo hospedeiro ao ambiente das uma ou mais pragas-alvo. Esses organismos hospedeiros incluir baculovírus, bactérias e similares. Desse modo, as combinações de polinucleotídeos que codificam o elemento silenciador podem ser introduzidas, por meio de um vetor adequado, em um hospedeiro microbiano, sendo o dito hospedeiro aplicado ao ambiente, ou às plantas ou animais.
[0071] O termo “introduzido”, no contexto de inserir um ácido nucléico em uma célula, significa “transfecção”, “transformação” ou “transdução”, e inclui referência à incorporação de um ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica, sendo que o ácido nucléico pode ser incorporado de maneira estável ao genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), ser convertido em um réplicon autônomo, ou ser expresso de maneira transitória (por exemplo, mRNA transfectado).
[0072] Podem ser selecionados os hospedeiros microbianos que são conhecidos por ocupar a “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de um ou mais cultivos de interesse. Esses microorganismos são selecionados de modo a serem capazes de, no ambiente específico, competir com sucesso contra os microorganismos de tipo selvagem, proporcionar manutenção e expressão estável das sequências que codificam o elemento silenciador e, desejavelmente, proporcionar proteção otimizada dos componentes contra degradação e inativação ambiental.
[0073] Esses microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. São de particular interesse os microorganismos como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes, fungos, particularmente leveduras, como Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. São de particular interesse as espécies bacterianas da fitosfera, como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli and Azotobacter vinlandir, and phytosphere yeast species such as Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans.
[0074] Inúmeros formas estão disponíveis para introdução do polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador no hospedeiro microbiano sob condições que permitam a manutenção e a expressão estáveis dessas sequências codificadoras de nucleotídeo. Por exemplo, podem ser construídos cassetes de expressão que incluem os constructos de nucleotídeo de interesse, funcionalmente ligados aos sinais regulatórios transcricional e traducional para expressão dos constructos de nucleotídeo, e uma sequência de nucleotídeo homóloga a uma sequência no organismo hospedeiro, de modo que ocorra integração, e/ou um sistema de replicação que é funcionais no hospedeiro, de modo que ocorra integração ou manutenção estável.
[0075] Os sinais regulatórios transcricionais e traducionais incluem, mas não se limitam a, promotores, sítios de iniciação transcricional, operadores, ativadores, intensificadores, outros elementos reguladores, sítios de ligação ribossômica, um códon de iniciação, sinais de terminação e similares. Consulte, por exemplo, as patentes US n° 5.039.523 e 4.853.331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edição; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, EUA); Davis et al. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EUA); e as referências ali citadas.
[0076] As células hospedeiras adequadas incluem os procariotos e os eucariotos inferiores, como os fungos. Os procariotos ilustrativos, tanto gram-negativos como gram- positivos, incluem Enterobacteriaceae, como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae como Rhizobium; Spirillaceae como Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae. Entre os eucariotos estão os fungos, como Phycomycetes e Ascomycetes, os quais incluem leveduras, como Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e leveduras de Basidiomycetes, como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces e similares.
[0077] As características de interesse específico na seleção de uma célula hospedeira para os propósitos da invenção incluem facilidade de introdução da sequência de codificação no hospedeiro, disponibilidade dos sistemas de expressão, eficiência da expressão, estabilidade no hospedeiro e a presença de capacidades genéticas auxiliares. As características de interesse para uso como microcápsula de pesticida incluem qualidades protetoras, como paredes celulares espessas, pigmentação e empacotamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade com folhas; ausência de toxicidade a mamíferos; atratividade a pragas para ingestão e similares. Outras considerações incluir facilidade de formulação e manuseio, economia, estabilidade em armazenagem e similares.
[0078] Os organismos hospedeiros de particular interesse incluem levedura, como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. e Sporobolomyces spp., organismos filoplanos como Pseudomonas spp., Erwinia spp. e Flavobacterium spp., e outros organismos desse tipo, inclusive Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis e similares.
[0079] As sequências que codificam os elementos silenciadores abrangidos pela invenção podem ser introduzidos nos microorganismos que se multiplicam em plantas (epífitas) para liberar esses componentes a possíveis pragas-alvo. As epífitas, por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas ou gram-negativas.
[0080] O elemento silenciador pode ser fermentado em um hospedeiro bacteriano, e as bactérias resultantes são processadas e usadas como uma aspersão microbiana da mesma maneira que cepas de Bacillus thuringiensis foram usadas como aspersões inseticidas. Qualquer microorganismo adequado pode ser usado para esse propósito. As pseudomonas têm sido usadas para expressar endotoxinas de Bacillus thuringiensis sob a forma de proteínas encapsuladas, sendo as células resultantes processadas e aspergidas como um inseticida (Gaertner et al. (1993), Advanced Engineered Pesticides, Editor L. Kim (Marcel Decker, Inc.).
[0081] Alternativamente, os componentes da invenção são produzidos mediante a introdução de genes heterólogos em um hospedeiro celular. A expressão das sequências heterólogas resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular do elemento silenciador. Essas composições podem, então, ser formuladas de acordo com as técnicas convencionais para aplicação aos ambiente que abrigam uma praga-alvo, por exemplo o solo, a água e a folhagem de plantas. Consulte, por exemplo, EPA 0192319, e as referências ali citadas.
[0082] Na presente invenção, um microorganismo transformado pode ser formulado com um carreador aceitável em composições separadas ou combinadas que consistem, por exemplo, em uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó para polvilhamento, um grânulo dispersível, um pó molhável e um concentrado emulsificável, um aerossol, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma pasta aplicável como revestimento, e também encapsulações em, por exemplo, substâncias poliméricas.
[0083] Essas composições apresentadas acima podem ser obtidas mediante a adição de um agente ativo de superfície, um veículo inerte, um conservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente de encapsulação, um aglutinante, um emulsificante, um corante, um protetor contra UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores de micronutrientes, ou outras preparações que influenciem o crescimento vegetal. Um ou mais produtos agroquímicos incluindo, mas não se limitando a, herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores do crescimento vegetal, auxiliares de colheita e fertilizantes, podem ser combinados com carreadores, tensoativos ou adjuvantes costumeiramente empregados na técnica de formulação, ou outros componentes para facilitar o manuseio e a aplicação do produto para pragas-alvo específicas. Os carreadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos, e correspondem às substâncias ordinariamente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. Os ingredientes ativos da presente invenção (isto é, pelo menos um elemento silenciador) são normalmente aplicados sob a forma de composições e podem ser aplicados à área de plantio, à planta ou a semente a ser tratada. Por exemplo, as composições podem ser aplicadas ao grão em preparação para o armazenamento, ou durante o mesmo, em um recipiente ou silo para grãos, etc. As composições podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Os métodos para aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição que contém pelo menos um elemento silenciador incluem, mas não se limitam a, aplicação foliar, revestimento de semente e aplicação ao solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.
[0084] Os agentes ativos de superfície adequados incluem, mas não se limitam a, compostos aniônicos como un carboxilato de, por exemplo, um metal; carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; um sarcosinato de N-acila; mono ou diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais desses ésteres; sulfatos de álcool graxo como dodecil sulfato de sódio, octadecil sulfato de sódio, ou cetil sulfato de sódio; sulfatos de álcool graxo etoxilado; sulfatos de alquil fenol etoxilado; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquil arila como alquil-benzeno sulfonatos ou alquil naftaleno sulfonatos inferiores, por exemplo butil- naftaleno sulfonato; sais de condensados de naftaleno- formaldeído sulfonatado; sais de condensados de fenol- formaldeído sulfonatado; sulfonatos mais complexos como os sulfonatos de amida, por exemplo o produto da condensação sulfonatada de ácido oléico e N-metil taurina; ou os sulfosuccinatos de dialquila, por exemplo o sulfonato de sódio ou succinato de dioctila. Os agentes não-iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácido graxo, alcoóis graxos, amidas de ácido graxo, ou fenóis substituídos com alquila ou alquenila graxa com óxido de etileno, ésteres graxos de éteres de álcool poliídrico, por exemplo ésteres de ácido graxo de sorbitano, produtos de condensação de ésteres com óxido de etileno, por exemplo ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbitano, copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos como 2,4,7,9- tetraetil-5-decin-4,7-diol, ou glicóis acetilênicos etoxilados. Os exemplos de um agente ativo de superfície catiônico incluem, por exemplo, uma mono, di ou poliamina alifática, como um acetato, naftenato ou oleato; ou uma amina contendo oxigênio, como um óxido de amina de polióxi etileno alquilamina; uma amina ligada a preparada mediante a condensação de um ácido carboxílico com uma di ou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.
[0085] Os exemplos de materiais inertes incluem, mas não se limitam a, minerais inorgânicos como caulim, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos ou materiais botânicos como cortiça, sabugos de milho pulverizados, cascas de amendoim, cascas de arroz e cascas de noz.
[0086] As composições compreendendo o elemento silenciador podem estar em uma forma adequada para aplicação direta, ou sob a forma de um concentrado de composição primária que exige diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação.
[0087] As composições (incluindo os microorganismos transformados) podem ser aplicadas ao ambiente de uma praga de insetos (como uma praga de plantas do tipo Coleoptera ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica), por exemplo mediante aspersão, atomização, polvilhamento, espalhamento, revestimento ou derramamento, introdução no solo ou sobre o mesmo, introdução na água de irrigação, mediante tratamento das sementes ou aplicação ou polvilhamento geral no momento em que a praga começar a aparecer, ou antes do aparecimento das pragas, como medida protetora. Por exemplo, as composições e/ou os microorganismos transformados podem ser misturados com os grãos para proteger os mesmos durante o armazenamento. É geralmente importante obter um bom controle de pragas nos estágios iniciais do crescimento vegetal, já que esse é o momento em que a planta pode ser mais gravemente danificada. As composições podem convenientemente conter um outro inseticida se isso for considerado necessário. Em uma modalidade da invenção, as uma ou mais composições são aplicadas diretamente ao solo, no momento do plantio, sob a forma granular de uma composição com um carreador e células mortas de uma cepa de Bacillus, ou o microorganismo transformado da invenção. Uma outra modalidade consiste em uma forma granular de uma composição compreendendo um produto agroquímico, como um herbicida, um inseticida ou um fertilizante, em um veículo inerte com células mortas de uma cepa de Bacillus, ou o microorganismo transformado da invenção.
VII. Plantas, partes de plantas e métodos para introdução de sequências em plantas
[0088] Em uma modalidade, os métodos da invenção envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. O termo “introduzir” significa apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo, de tal forma que a sequência tenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus.
[0089] O termo “transformação estável” significa que o constructo de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra ao genoma da dita planta e é capaz de ser herdado pela progênie da mesma. O termo “transformação transitória” significa que um polinucleotídeo é introduzido em uma planta e não se integra ao genoma da mesma, ou que um polipeptídeo é introduzido em uma planta.
[0090] Os protocolos de transformação e os protocolos para introduzir sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para a transformação. Os métodos adequados para introdução de polipeptídeos e polinucleotídeos em células vegetais incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (patente US n° 5.563.055 e patente US n° 5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partícula balística (consulte, por exemplo, as patentes US n° 4.945.050, US n° 5.879.918, US n° 5.886.244 e 5.932.782; Tomes et al. (1995), Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Editor Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim, Alemanha); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação por Lec1 (WO 00/28058). Consulte, também, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); patentes US n° 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres, Reino Unido) 311:763-764; patente US n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Editor Chapman et al. (Longman, New York, EUA), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255, e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens), todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência.
[0091] Em outras modalidades, o polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido em plantas por colocar as plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, estes métodos envolvem a incorporação de um construto de nucleotídeo da invenção em uma molécula de DNA ou RNA viral. Adicionalmente, é reconhecido que os promotores da invenção também incluem promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada por eles envolvendo moléculas de DNA ou RNA virais, são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n° 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta et al. (1996), Molecular Biotechnology 5:209-221; aqui incorporados a título de referência.
[0092] Métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em um local específico no genoma da planta são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é obtida usando um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, por exemplo, os documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, que estão aqui incorporados, a título de referência. Resumidamente, o polinucleotídeo da invenção pode estar contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não-recombinogênicos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem um sítio alvo incorporado de maneira estável no seu genoma que é flanqueado por dois sítios de recombinação não-recombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao sítio alvo. O polinucleotídeo de interesse é, portanto, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.
[0093] As células que foram transformadas podem ser cultivadas para se tornar plantas de acordo com maneiras convencionais. Consulte, por exemplo, McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas, sejam polinizadas com a mesma linhagem transformada ou com linhagens diferentes, e a progênie resultante que tem expressão constitutiva da característica fenotípica pode ser identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de maneira estável e herdada e, então, as sementes são coletadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Desta forma, a presente invenção fornece sementes transformadas (também chamadas de “sementes transgênicas”) que têm um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de maneira estável no seu genoma.
[0094] Para uso na presente invenção, o termo planta incluem células vegetais, protoplastos de plantas, culturas tecido de células vegetais a partir das quais se pode regenerar plantas, calos de planta, nódulos de planta e células vegetais que estão intactas em plantas ou partes de plantas como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutas, grãos, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras e similares. Grão pretende significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos exceto cultivo ou reprodução de espécies. A progênie, variantes, e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídos dentro do escopo da invenção, desde que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.
[0095] A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, mas não se limitam a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, painço pérola (Pennisetum glaucum), painço proso (Panicum miliaceum), painço rabo de raposa (Setaria italica), painço de dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvore de citrus (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais, e coníferas.
[0096] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagem (Phaseolus vulgaris), feijão-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cucumis como o pepino (C. sativus), melão de polpa amarela (C. cantalupensis), e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortência (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso silvestre (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsetia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.
[0097] As coníferas que podem ser usadas na prática da presente invenção incluem, por exemplo, pinheiros como pinheiro teda (Pinus taeda), pinheiro americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro da praia (Pinus contorta) e pinheiro-de-monterey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); abeto canadense (Tsuga canadensis); abeto branco (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros como abeto prateado (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros como cedro vermelho (Thuja plicata) e cedro-do-alasca (Chamaecyparis nootkatensis). Em modalidades específicas, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, feijão soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabaco, etc.). Em outras modalidades, plantas de milho e feijão soja são ótimas e, ainda em outras modalidades, as plantas de milho são ótimas.
[0098] Outras plantas de interesse incluem plantas de cereais que fornecem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de cereais, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. Plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, feijão soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão soja, feijões de jardim, feijão-caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.
VIII. Métodos de Uso
[0099] Os métodos da invenção compreendem métodos para controlar uma praga (isto é, uma praga de plantas do tipo Coleoptera, inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, como D. virgifera virgifera, D. barberi ou D. undecimpunctata howardi). o método compreende alimentar uma praga com uma composição que compreende um elemento silenciador da invenção, sendo que o dito elemento silenciador, quando ingerido por uma praga (isto é, uma praga de plantas do tipo Coleoptera, inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, como D. virgifera virgifera, D. barberi ou D. undecimpunctata howardi), reduz o teor de um polinucleotídeo-alvo da praga e, assim, controla a mesma. A praga pode ser alimentada com o elemento silenciador de diversas maneiras. Em uma modalidade, por exemplo, o polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador é introduzido em uma planta. Conforme a praga de plantas do tipo Coleoptera ou a praga de plantas do tipo Diabrotica se alimenta da planta ou de parte da mesma que expressa essas sequências, o elemento silenciador é fornecido à praga. Quando o elemento silenciador é aplicado à planta dessa maneira, é fato reconhecido que o elemento silenciador pode ser expresso constitutiva ou alternativamente, podendo ser produzido de maneira específica quanto a estágio, mediante o uso de vários promotores induzíveis ou preferenciais para tecido, ou regulados por desenvolvimento, os quais são discutidos em outra parte do presente documento. Em modalidades específicas, o elemento silenciador é expresso nas raízes, no caule ou na haste, nas folhas inclusive nos pecíolos, xilema e floema, fruta ou tecido reprodutivo, estigma, flores e todas as partes da mesma, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0100] Em outro método, uma composição compreendendo pelo menos um elemento silenciador da invenção é aplicado à planta. Nessas modalidades, o elemento silenciador pode ser formulado em um carreador agronomicamente adequado e/ou ambientalmente aceitável que é, de preferência, adequado para dispersão em campo. Além disso, o carreador pode também incluir compostos que aumentam a meia-vida da composição. Em modalidades específicas, a composição compreendendo o elemento silenciador é formulada de tal modo que persiste no ambiente por um período de tempo suficiente para permitir que seja aplicada a uma praga. Nessas modalidades, a composição pode ser aplicada a uma área habitada por uma praga. Em uma modalidade, a composição é aplicado externamente a uma planta (isto é, mediante aspersão de um campo) para proteger a planta contra pragas.
[0101] Em certas modalidades, os constructos da presente invenção podem ser empilhados com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeo de interesse, de modo a criar plantas com uma característica desejada. Uma característica, conforme usado na presente invenção, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos com atividade pesticida e/ou inseticida, como outras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas patentes US n° 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita na patente US n° 5.981.722), e similares. As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de características desejadas incluindo, mas não se limitando a, características desejáveis para ração animal, como genes para alto teor de óleo (por exemplo, patente US n° 6.232.529); teor balanceado de aminoácidos (por exemplo, hordotionina (patentes US n° 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.409); cevada com alto teor de lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; e Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (pedido com n° serial US 10/053.410, depositado em 7 de novembro de 2001); e tiorredoxinas (pedido com n° serial US 10/005.429, depositado em 3 de dezembro de 2001)) estando as descrições desses documentos aqui incorporadas a título de referência.
[0102] Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser empilhados com características desejáveis para resistência a doenças ou herbicidas (por exemplo, genes para desintoxicação de fumonisina (patente US n° 5.792.931); genes de avirulência e resistência a doenças (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levam à resistência a herbicidas, como as mutações S4 e/ou Hra; inibidores de glutamina sintase como fosfinotricina ou Basta (por exemplo, o gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS)); e características desejáveis para o processamento ou os produtos do processo, como alto teor de óleo (por exemplo, patente US n° 6.232.529); óleos modificados (por exemplo, genes de ácido graxo dessaturase (patente US n° 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintases (SS), enzimas ramificadoras de amido (SBE) e enzimas desramificadoras de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, patente US n° 5.602.321; beta-cetotiolase, poliidróxi butirato sintase, e aceto acetil-CoA redutase (Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão de poliidróxi alcanoatos (PHAs)), estando as descrições desses documentos aqui incorporadas a título de referência. Pode-se, também, combinar os polinucleotídeos variantes da presente invenção com polinucleotídeos que oferecem características agronômicas como esterilidade do macho (por exemplo, consulte a patente US n° 5.583.210), características de resistência do caule, tempo de floração ou tecnologia de transformação, como regulação do ciclo celular ou gene targeting (por exemplo, WO 99/61619; WO 00/17364 e WO 99/25821), estando as descrições desses documentos aqui incorporadas a título de referência.
[0103] Essas combinações piramidizadas pode ser criadas por qualquer método incluindo, mas não se limitando a, plantas com cruzamento de raças por qualquer metodologia convencional ou TopCross, ou transformação genética. Caso as sequências sejam piramidizadas por transformação genética das plantas, as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica que compreende uma ou mais características desejadas pode ser usada como alvo para introduzir características adicionais por transformação subsequente. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado por qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de características na planta. É reconhecido ainda que as sequências de polinucleotídeo podem ser piramidizadas em um local genômico desejado com o uso de um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, por exemplo, os documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, que estão aqui incorporados, a título de referência.
[0104] São adicionalmente apresentados métodos e composições que permitem um aumento no RNAi produzido a partir do elemento silenciador. Nessas modalidades, os métodos e composições empregam um primeiro polinucleotídeo compreendendo um elemento silenciador para uma sequência de praga-alvo funcionalmente ligado a um promotor ativo na célula vegetal, e um segundo polinucleotídeo compreendendo um elemento supressor amplificador que compreende a sequência da praga-alvo ou uma variante ativa, ou fragmento da mesma, funcionalmente ligado a um promotor ativo na célula vegetal. A expressão combinada do elemento silenciador com elemento amplificador supressor leva a uma amplificação aumentada do RNA inibitório produzido a partir do elemento silenciador, acima do que pode ser obtido apenas com a expressão do elemento silenciador por si só. Em adição à amplificação aumentada da espécie da própria RNAi específica, os métodos e composições permitem, adicionalmente, a produção de uma população diversa de espécies de RNAi que podem acentuar a efetividade da expressão do gene-alvo disruptor. Como tal, quando o elemento amplificador supressor é expresso em uma célula vegetal em combinação com o elemento silenciador, os métodos e a composição podem permitir a produção sistêmica de RNAi por toda a planta; sendo a produção em maiores quantidades de RNAi do que seria observado apenas com o constructo de elemento silenciador por si só; e sendo que o carregamento otimizado de RNAi no floema da planta proporciona, assim, um melhor controle de insetos que se alimentam do floema, por meio de uma abordagem de RNAi. Portanto, os vários métodos e composições oferecem métodos otimizados para a aplicação de RNA inibitório ao organismo-alvo. Consulte, por exemplo, pedido U.S. n° 12/351.093, intitulado “Compositions and Methods for the Suppression of Target Polynucleotides”, depositado em 9 de janeiro de 2009, e aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.
[0105] Para uso na presente invenção, um “elemento amplificador de supressor” compreende um polinucleotídeo compreendendo a sequência-alvo a ser suprimido, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo. É fato reconhecido que o elemento amplificador de supressor não precisa ser idêntico à sequência- alvo, mas sim o elemento amplificador de supressor pode compreender uma variante da sequência-alvo, contanto que o elemento amplificador de supressor tenha identidade de sequência suficiente com a sequência-alvo parar permitir um teor aumentado do RNAi produzido pelo elemento silenciador acima do que seria obtido apenas com a expressão do elemento silenciador. De maneira similar, o elemento amplificador de supressor pode compreender um fragmento da sequência-alvo, sendo que o fragmento tem comprimento suficiente para permitir um teor aumentado de RNAi produzido pelo elemento silenciador, acima do que seria obtido somente com a expressão do elemento silenciador. Assim, em modalidades específicas, o elemento amplificador de supressor compreende um polinucleotídeo apresentado na SEQ. ID N° 1 a 236, ou uma variante ativa ou fragmento da mesma.
[0106] É fato reconhecido que podem ser usados múltiplos elementos amplificadores de supressor obtido da mesma sequência- alvo ou de diferentes sequências-alvo, ou de regiões diferentes da mesma sequência-alvo. Por exemplo, os elementos amplificadores de supressor empregados podem compreender fragmentos da sequência-alvo derivados de diferentes regiões da sequência-alvo (isto é, de 3'UTR, sequência de codificação, íntron e/ou 5'UTR). Adicionalmente, o elemento amplificador de supressor pode ser contido em um cassete de expressão, conforme descrito em outra parte do presente documento e, em modalidades específicas, o elemento amplificador de supressor está em um vetor ou constructo de DNA que pode ou não ser o mesmo do elemento silenciador. O elemento amplificador de supressor pode estar funcionalmente ligado a um promotor, conforme apresentado na presente invenção. É fato reconhecido que o elemento amplificador de supressor pode ser expresso constitutiva ou alternativamente, podendo ser produzido de maneira específica quanto a estágio, mediante o uso de vários promotores induzíveis ou preferenciais para tecido, ou regulados por desenvolvimento, os quais são discutidos em outra parte do presente documento.
[0107] Em modalidades específicas, quando se usa tanto de um elemento silenciador como de um elemento amplificador de supressor, a produção sistêmica de RNAi ocorre por toda a planta. Em modalidades adicionais, a planta ou as partes da planta da invenção têm um carregamento aprimorado de RNAi no floema da planta, em comparação ao que seria observado com a expressão do constructo de elemento silenciador por si só e, assim, proporciona um melhor controle contra insetos que se alimentam do floema, por meio de uma abordagem de RNAi. Em modalidades específicas, as plantas, partes de planta e células vegetais da invenção podem adicionalmente ser caracterizadas como permitindo a produção de uma diversidade de espécies de RNAi que podem acentuar a efetividade da expressão do gene-alvo disruptor.
[0108] Em modalidades específicas, a expressão combinada do elemento silenciador e do elemento amplificador de supressor aumenta a concentração do RNA inibitório na célula vegetal, na planta, na parte de planta, no tecido da planta ou no floema, acima do teor que seria obtido quando o elemento silenciador é expresso por si só.
[0109] Para uso na presente invenção, o termo “teor aumentado de RNA inibitório” compreende qualquer aumento estatisticamente significativo no teor de RNAi produzido em uma planta que tem a expressão combinada, em comparação a uma planta de controle adequada. Por exemplo, um aumento no teor de RNAi na planta, na parte de planta ou na célula vegetal pode compreender pelo menos cerca de 1%, cerca de 1% a 5%, cerca de 5% a 10%, cerca de 10% a 20%, cerca de 20% a 30%, cerca de 30% a 40%, cerca de 40% a 50%, cerca de 50% a 60%, cerca de 60 a 70%, cerca de 70% a 80%, cerca de 80% a 90%, cerca de 90% a 100% ou mais de aumento no teor de RNAi presente na planta, na parte de planta, na célula vegetal ou no floema, em comparação a um controle adequado. Em outras modalidades, o aumento no teor de RNAi na planta, na parte de planta, na célula vegetal ou no floema pode compreender um aumento de pelo menos cerca de 1 vez, de cerca de 1 vez a 5 vezes, de cerca de 5 vezes a 10 vezes, de cerca de 10 vezes a 20 vezes, de cerca de 20 vezes a 30 vezes, de cerca de 30 vezes a 40 vezes, de cerca de 40 vezes a 50 vezes, de cerca de 50 vezes a 60 vezes, de cerca de 60 vezes a 70 vezes, de cerca de 70 vezes a 80 vezes, de cerca de 80 vezes a 90 vezes, de cerca de 90 vezes a 100 vezes, ou mais, no teor de RNAi na planta, na parte de planta, na célula vegetal ou no floema, em comparação a um controle adequado. Os métodos para testar quanto a um aumento no teor de RNAi são discutidos em outra parte do presente documento.
[0110] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração mas sem que isto constitua uma limitação.
Experimental Exemplo 1: Método para triagem de transcrição in vitro de dsRNA
[0111] Uma biblioteca de cDNA foi produzida a partir de larvas recém-nascidas de verme da raiz do milho ocidental, por meio de métodos-padrão. Um clone de cDNA selecionado, contendo uma etiqueta de sequência expressa, é amplificado por PCR com o uso de primers universais para a cadeia principal do plasmídeo e flanqueando o elemento de inserção EST. Os primers universais também contêm sítios T7 de RNA polimerase. Usou-se 1 ul da reação de PCR como gabarito para uma reação de transcrição in vitro (IVT) para produzir RNAs de filamento duplo longos. Em seguida à digestão enzimática e remoção do gabarito de DNA e RNA de filamento único, os produtos de reação IVT são incorporados à dieta artificial para inseto, conforme descrito abaixo.
Bioensaios com inseto
[0112] São adicionados 2,5 ul da reação IVT são adicionados a uma dada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Adicionou-se à amostra 25 ul de dieta lentamente derretida para verme da raiz do milho ocidental, submetendo-se à agitação em um agitador orbital para misturar a amostra e a dieta. Uma vez solidificada a dieta, vermes de raiz recém- nascidos foram adicionados à cavidade. Uma média de 5 recém- nascidos foram adicionados a cada cavidade. Após a infestação da placa, esta foi lacrada com Mylar e um único orifício foi perfurado no Mylar sobre cada cavidade, para permitir a troca de ar. Foram produzidas 4 réplicas de cavidade para cada amostra. O teste foi classificado quanto à atividade 7 dias após a infestação. As pontuações possíveis são: morto, gravemente atrofiado (pouco ou nenhum crescimento, porém vivo), atrofiado (crescimento até o segundo ínstar, porém não equivalente aos controles), ou nenhuma atividade. As amostras demonstrando a mortalidade ou a atrofia grave froram avançados até a confirmação. Os testes principais e de confirmação foram realizados com o verme da raiz do milho do sul.
[0113] Em seguida à confirmação, um teste simples de resposta à dosagem foi realizado com os vermes da raiz do milho tanto ocidental como do sul. As amostras para testes de resposta à dosagem foram produzidos da mesma maneira, com a seguinte modificação: as amostras foram adicionalmente purificadas com o uso de purificação em coluna, antes do tratamento enzimático. As amostras foram, também, normalizadas para 0,5 ug/ul, e todas as amostras foram avaliadas por eletroforese em gel. Testes de resposta à dosagem foram realizados com as seguintes concentrações: 50, 25, 12, 6, 3 e 1,5 ppm.
Exemplo 2. Sequências que têm atividade inseticida
[0114] As sequências de DNA que codificam RNAs de filamento duplo que demonstraram ter atividade inseticida contra vermes da raiz do milho com o uso de o teste descrito no Exemplo 1 são apresentados abaixo. Alguns exemplos não-limitadores de polinucleotídeos-alvo são apresentados abaixo, na Tabela 1. Tabela 1 SEQ ID n°: 1 >iwm2c.pk005.e1.fis1 SEQ ID n°: 2 >iwm2c.pk004.b13.fis1 SEQ ID n°: 3 >iwm2s.pk003.o11.fis1 SEQ ID n°: 4 >iwm2c.pk002.e24.fis1 SEQ ID n°: 5 >iwm2c.pk002.e24.fis1 SEQ ID n°: 6 >iwm2c.pk011.n17.fis1 SEQ ID n°: 7 >idv1c.pk001.d14.f.fis1 SEQ ID n°: 8 >idv1c.pk001.e9.f.fis1 SEQ ID n°: 9 >idv1c.pk001.m5.f.fis1 SEQ ID n°: 10 >idv1c.pk001.n1.f.fis1 SEQ ID n°: 11 >idv1c.pk002.c5.f.fis1 SEQ ID n°: 12 >idv1c.pk002.f20.f.fis1 SEQ ID n°: 13 >idv1c.pk002.j17.f.fis1 SEQ ID n°: 14 >idv1c.pk002.n13.f.fis1 SEQ ID n°: 15 >idv1c.pk003.d6.f.fis1 SEQ ID n°: 16 >idv1c.pk003.f8.f.fis1 SEQ ID n°: 17 >idv1c.pk003.f9.f.fis1 SEQ ID n°: 18 >idv1c.pk003.j4.f.fis1 SEQ ID n°: 19 >idv1c.pk003.j6.f.fis1 SEQ ID n°: 20 >idv1c.pk003.j20.f.fis1 SEQ ID n°: 21 >idv1c.pk003.l1.f.fis1 SEQ ID n°: 22 >idv1c.pk003.m1.f.fis1 SEQ ID n°: 23 >idv1c.pk003.m10.f.fis1 SEQ ID n°: 24 >idv1c.pk003.o13.f.fis1 SEQ ID n°: 25 >idv1c.pk003.o22.f.fis1 SEQ ID n°: 26 >idv1c.pk003.p13.f.fis1 SEQ ID n°: 27 >idv1c.pk004.b12.f.fis1 SEQ ID n°: 28 >idv1c.pk004.d17.f.fis1 SEQ ID n°: 29 >idv1c.pk004.f20.f.fis1 SEQ ID n°: 30 >idv1c.pk004.k5.f.fis1 SEQ ID n°: 31 >idv1c.pk004.l15.f.fis1 SEQ ID n°: 32 >idv1c.pk004.n6.f.fis1 SEQ ID n°: 33 >idv1c.pk004.o4.f.fis1 SEQ ID n°: 34 >idv1c.pk004.o9.f.fis1 SEQ ID n°: 35 >idv1c.pk004.p1.f.fis1 SEQ ID n°: 36 >idv1c.pk013.a15.f.fis1 SEQ ID n°: 37 >idv1c.pk013.b11.f.fis1 SEQ ID n°: 38 >idv1c.pk013.c21.f.fis1 SEQ ID n°: 39 >idv1c.pk013.d22.f.fis1 SEQ ID n°: 40 >idv1c.pk013.h1.f.fis1 SEQ ID n°: 41 >idv1c.pk013.h14.f.fis1 SEQ ID n°: 42 >idv1c.pk013.k1.f.fis1 SEQ ID n°: 43 >idv1c.pk014.a19.f.fis1 SEQ ID n°: 44 >idv1c.pk014.b9.f.fis1 SEQ ID n°: 45 >idv1c.pk014.b17.f.fis1 SEQ ID n°: 46 >idv1c.pk014.c14.f.fis1 SEQ ID n°: 47 >idv1c.pk014.d11.f.fis1 SEQ ID n°: 48 >idv1c.pk014.f3.f.fis1 SEQ ID n°: 49 >idv1c.pk014.j2.f.fis1 SEQ ID n°: 50 >idv1c.pk014.k23.f.fis1 SEQ ID n°: 51 >idv1c.pk014.m5.f.fis1 SEQ ID n°: 52 >idv1c.pk014.m13.f.fis1 SEQ ID n°: 53 >idv1c.pk014.n16.f.fis1 SEQ ID n°: 54 >idv1c.pk014.n23.f.fis1 SEQ ID n°: 55 >idv1c.pk014.o1.f.fis1 SEQ ID n°: 56 >idv1c.pk015.a16.f.fis1 SEQ ID n°: 57 >idv1c.pk015.b8.f.fis1 SEQ ID n°: 58 >idv1c.pk015.g10.f.fis1 SEQ ID n°: 59 >idv1c.pk015.l13.f.fis1 SEQ ID n°: 60 >idv1c.pk015.n19.f.fis1 SEQ ID n°: 61 >idv1c.pk015.p2.f.fis1 SEQ ID n°: 62 >idv1c.pk016.a9.f.fis1 SEQ ID n°: 63 >idv1c.pk016.f12.f.fis1 SEQ ID n°: 64 >idv1c.pk016.f21.f.fis1 SEQ ID n°: 65 >idv1c.pk016.h15.f.fis1 SEQ ID n°: 66 >idv1c.pk016.h19.f.fis1 SEQ ID n°: 67 >idv1c.pk016.j12.f.fis1 SEQ ID n°: 68 >idv1c.pk016.j15.f.fis1 SEQ ID n°: 69 >idv1c.pk016.k9.f.fis1 SEQ ID n°: 70 >idv1c.pk016.p18.f.fis1 SEQ ID n°: 71 >idv1c.pk017.c3.f.fis1 SEQ ID n°: 72 >idv1c.pk017.d14.f.fis1 SEQ ID n°: 73 >idv1c.pk017.e22.f.fis1 SEQ ID n°: 74 >idv1c.pk017.f1.f.fis1 SEQ ID n°: 75 >idv1c.pk017.h14.f.fis1 SEQ ID n°: 76 >idv1c.pk017.n19.f.fis1 SEQ ID n°: 77 >idv1c.pk017.p2.f.fis1 SEQ ID n°: 78 >idv1c.pk018.a5.f.fis1 SEQ ID n°: 79 >idv1c.pk018.c11.f.fis1 SEQ ID n°: 80 >idv1c.pk018.d5.f.fis1 SEQ ID n°: 81 >idv1c.pk018.d14.f.fis1 SEQ ID n°: 82 >idv1c.pk018.e10.f.fis1 A SEQ ID n°: 83 >idv1c.pk018.e20.f.fis1 SEQ ID n°: 84 >idv1c.pk018.f19.f.fis1 SEQ ID n°: 85 >idv1c.pk018.f22.f.fis1 SEQ ID n°: 86 >idv1c.pk018.g20.f.fis1 SEQ ID n°: 87 >idv1c.pk018.h21.f.fis1 SEQ ID n°: 88 >idv1c.pk018.m5.f.fis1 SEQ ID n°: 89 >idv1c.pk019.c4.f.fis1 SEQ ID n°: 90 >idv1c.pk019.i5.f.fis1 SEQ ID n°: 91 >idv1c.pk019.k3.f.fis1 SEQ ID n°: 92 >idv1c.pk019.l7.f.fis1 SEQ ID n°: 93 >idv1c.pk020.a8.f.fis1 SEQ ID n°: 94 >idv1c.pk020.b11.f.fis1 SEQ ID n°: 95 >idv1c.pk020.g17.f.fis1 SEQ ID n°: 96 >idv1c.pk020.i7.f.fis1 SEQ ID n°: 97 >idv1c.pk020.i24.f.fis1 SEQ ID n°: 98 >idv1c.pk020.k19.f.fis1 SEQ ID n°: 99 >idv1c.pk020.l3.f.fis1 SEQ ID n°: 100 >idv1c.pk020.p23.f.fis1 SEQ ID n°: 101 >idv1c.pk021.c21.f.fis1 SEQ ID n°: 102 >idv1c.pk021.d22.f.fis1 SEQ ID n°: 103 >idv1c.pk021.g16.f.fis1 SEQ ID n°: 104 >idv1c.pk021.h12.f.fis1 SEQ ID n°: 105 >idv1c.pk021.m20.f.fis1 SEQ ID n°: 106 >idv1c.pk004.j11.f.fis1 SEQ ID n°: 107 >idv1c.pk001.o20.f SEQ ID n°: 108 >idv1c.pk002.a20.f SEQ ID n°: 109 >idv1c.pk002.c15.f SEQ ID n°: 110 >idv1c.pk002.i21.f SEQ ID n°: 111 >idv1c.pk024.b23.f SEQ ID n°: 112 >idv1c.pk024.e1.f SEQ ID n°: 113 >idv1c.pk024.e24.f SEQ ID n°: 114 >idv1c.pk024.k17.f SEQ ID n°: 115 >idv1c.pk024.m13.f SEQ ID n°: 116 >idv1c.pk024.n1.f SEQ ID n°: 117 >idv1c.pk024.o3.f SEQ ID n°: 118 >idv1c.pk025.a4.f SEQ ID n°: 119 >idv1c.pk025.c5.f SEQ ID n°: 120 >idv1c.pk025.c23.f SEQ ID n°: 121 >idv1c.pk025.d18.f SEQ ID n°: 122 >idv1c.pk025.d20.f SEQ ID n°: 123 >idv1c.pk025.f24.f SEQ ID n°: 124 >idv1c.pk025.j20.f SEQ ID n°: 125 >idv1c.pk025.l10.f SEQ ID n°: 126 >idv1c.pk026.a16.f SEQ ID n°: 127 >idv1c.pk026.b23.f SEQ ID n°: 128 >idv1c.pk026.d22.f SEQ ID n°: 129 >idv1c.pk026.e6.f SEQ ID n°: 130 >idv1c.pk026.g12.f SEQ ID n°: 131 >idv1c.pk026.h15.f SEQ ID n°: 132 >idv1c.pk026.i12.f SEQ ID n°: 133 >idv1c.pk026.j18.f SEQ ID n°: 134 >idv1c.pk026.k13.f SEQ ID n°: 135 >idv1c.pk027.b21.f SEQ ID n°: 136 >idv1c.pk027.c7.f SEQ ID n°: 137 >idv1c.pk027.k4.f SEQ ID n°: 138 >idv1c.pk027.p21.f SEQ ID n°: 139 >idv1c.pk028.b7.f SEQ ID n°: 140 >idv1c.pk028.c22.f SEQ ID n°: 141 >idv1c.pk028.h6.f SEQ ID n°: 142 >idv1c.pk028.i16.f SEQ ID n°: 143 >idv1c.pk028.m11.f SEQ ID n°: 144 >idv1c.pk028.o18.f SEQ ID n°: 145 >idv1c.pk029.a17.f SEQ ID n°: 146 >idv1c.pk029.d16.f SEQ ID n°: 147 >idv1c.pk029.i22.f SEQ ID n°: 148 >idv1c.pk029.j20.f SEQ ID n°: 149 >idv1c.pk029.k11.f SEQ ID n°: 150 >idv1c.pk029.l22.f SEQ ID n°: 151 >idv1c.pk030.e10.f SEQ ID n°: 152 >idv1c.pk030.e21.f C SEQ ID n°: 153 >idv1c.pk030.h13.f SEQ ID n°: 154 >idv1c.pk030.h23.f SEQ ID n°: 155 >idv1c.pk030.l9.f SEQ ID n°: 156 >idv1c.pk030.m22.f SEQ ID n°: 157 >idv1c.pk030.o7.f SEQ ID n°: 158 >idv1c.pk031.a11.f SEQ ID n°: 159 >idv1c.pk031.e16.f SEQ ID n°: 160 >idv1c.pk031.g2.f SEQ ID n°: 161 >idv1c.pk031.g22.f SEQ ID n°: 162 >idv1c.pk031.i13.f SEQ ID n°: 163 >idv1c.pk031.m3.f SEQ ID n°: 164 >idv1c.pk032.b4.f SEQ ID n°: 165 >idv1c.pk032.e16.f SEQ ID n°: 166 >idv1c.pk032.f14.f SEQ ID n°: 167 >idv1c.pk032.m9.f SEQ ID n°: 168 >idv1c.pk033.a15.f SEQ ID n°: 169 >idv1c.pk033.b14.f SEQ ID n°: 170 >idv1c.pk033.m3.f SEQ ID n°: 171 >idv1c.pk033.n10.f SEQ ID n°: 172 >idv1c.pk033.n18.f SEQ ID n°: 173 >idv1c.pk034.e8.f SEQ ID n°: 174 >idv1c.pk034.p24.f SEQ ID n°: 175 >idv1c.pk035.f21.f SEQ ID n°: 176 >idv1c.pk035.g1.f SEQ ID n°: 177 >idv1c.pk035.h19.f SEQ ID n°: 178 >idv1c.pk035.j4.f SEQ ID n°: 179 >idv1c.pk035.m1.f SEQ ID n°: 180 >idv1c.pk035.o13.f SEQ ID n°: 181 >idv1c.pk036.a14.f SEQ ID n°: 182 >idv1c.pk036.e18.f SEQ ID n°: 183 >idv1c.pk036.f4.f SEQ ID n°: 184 >idv1c.pk036.f9.f SEQ ID n°: 185 >idv1c.pk036.i17.f SEQ ID n°: 186 >idv1c.pk036.i20.f SEQ ID n°: 187 >idv1c.pk036.k23.f SEQ ID n°: 188 >idv1c.pk034.k22.f SEQ ID n°: 189 >idv1c.pk002.c7.f SEQ ID n°: 190 >idv1c.pk002.f18.f SEQ ID n°: 191 >idv1c.pk002.i23.f SEQ ID n°: 192 >idv1c.pk002.j24.f SEQ ID n°: 193 >idv1c.pk002.m16.f SEQ ID n°: 194 >idv1c.pk002.n13.f SEQ ID n°: 195 >idv1c.pk024.c7.f SEQ ID n°: 196 >idv1c.pk024.j15.f SEQ ID n°: 197 >idv1c.pk025.b17.f SEQ ID n°: 198 >idv1c.pk025.f3.f SEQ ID n°: 199 >idv1c.pk025.i8.f SEQ ID n°: 200 >idv1c.pk025.l17.f SEQ ID n°: 201 >idv1c.pk025.o24.f SEQ ID n°: 202 >idv1c.pk025.p9.f SEQ ID n°: 203 >idv1c.pk026.f20.f SEQ ID n°: 204 >idv1c.pk026.p8.f SEQ ID n°: 205 >idv1c.pk026.p22.f SEQ ID n°: 206 >idv1c.pk027.a14.f SEQ ID n°: 207 >idv1c.pk027.g7.f SEQ ID n°: 208 >idv1c.pk027.k23.f SEQ ID n°: 209 >idv1c.pk028.b17.f SEQ ID n°: 210 >idv1c.pk028.f11.f SEQ ID n°: 211 >idv1c.pk029.c3.f SEQ ID n°: 212 >idv1c.pk029.f5.f SEQ ID n°: 213 >idv1c.pk029.j4.f SEQ ID n°: 214 >idv1c.pk030.b23.f SEQ ID n°: 215 >idv1c.pk030.f9.f SEQ ID n°: 216 >idv1c.pk030.g11.f SEQ ID n°: 217 >idv1c.pk031.c20.f SEQ ID n°: 218 >idv1c.pk031.d1.f SEQ ID n°: 219 >idv1c.pk031.j1.f SEQ ID n°: 220 >idv1c.pk031.j6.f SEQ ID n°: 221 >idv1c.pk031.p16.f SEQ ID n°: 222 >idv1c.pk032.a16.f SEQ ID n°: 223 >idv1c.pk032.f11.f SEQ ID n°: 224 >idv1c.pk032.i21.f SEQ ID n°: 225 >idv1c.pk032.n18.f SEQ ID n°: 226 >idv1c.pk032.p5.f SEQ ID n°: 227 >idv1c.pk033.d24.f SEQ ID n°: 228 >idv1c.pk033.j21.f SEQ ID n°: 229 >idv1c.pk033.o9.f SEQ ID n°: 230 >idv1c.pk033.p15.f SEQ ID n°: 231 >idv1c.pk033.p16.f SEQ ID n°: 232 >idv1c.pk034.i2.f SEQ ID n°: 233 >idv1c.pk034.j6.f SEQ ID n°: 234 >idv1c.pk035.i17.f SEQ ID n°: 235 >idv1c.pk035.k18.f SEQ ID n°: 236 >idv1c.pk036.i19.f SEQ ID n°: 237 Constructo expressando SEQ ID n°: 8 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 8, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 8. SEQ ID n°: 238 Constructo expressando SEQ ID n°: 26 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 26, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 26. SEQ ID n°: 239 Constructo expressando SEQ ID n°: 17 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 17, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 17. SEQ ID n°: 240 Constructo expressando SEQ ID n°: 28 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 28, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 28. SEQ ID n°: 241 Constructo expressando SEQ ID n°: 28 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 28, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 28. SEQ ID n°: 242 Constructo expressando SEQ ID n°: 13 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 13, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 13. SEQ ID n°: 243 Constructo expressando SEQ ID n°: 40 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 40, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 40. SEQ ID n°: 244 Constructo expressando SEQ ID n°: 72 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 72, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 72. SEQ ID n°: 245 Constructo expressando SEQ ID n°: 73 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1° íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 73, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 73 SEQ ID n°: 246 Constructo expressando SEQ ID n°: 15 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 15, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 15. SEQ ID n°: 247 Constructo expressando SEQ ID n°: 18 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 18, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 18. SEQ ID n°: 248 Constructo expressando nucleotídeo de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1° íntron funcionalmente ligado ao nucleotídeo de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45, funcionalmente ligado ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento de nucleotídeo de 1 a 380 da SEQ ID n°: 45. SEQ ID n°: 249 Constructo expressando nucleotídeo de 1 a 675 da SEQ ID n°: 37 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1° íntron funcionalmente ligado ao nucleotídeo de 1 a 675 da SEQ ID n°: 37, funcionalmente ligado ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento de nucleotídeo de 1 a 675 da SEQ ID n°: 37. SEQ ID n°: 250 Constructo expressando SEQ ID n°: 29 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1°. íntron funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 29, funcionalmente ligada ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento da SEQ ID n°: 29. SEQ ID n°: 251 Constructo expressando nucleotídeo de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1° íntron funcionalmente ligado ao nucleotídeo de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50, funcionalmente ligado ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento de nucleotídeo de 1 a 266 da SEQ ID n°: 50. SEQ ID n°: 252 Constructo expressando nucleotídeo de 16 a 585 da SEQ ID n°: 47 como um hairpin RNA. O constructo compreende: promotor UBI1ZM de 5’UTR e 1° íntron funcionalmente ligado ao nucleotídeo de 16 a 585 da SEQ ID n°: 47, funcionalmente ligado ao íntron ADH1 funcionalmente ligado ao complemento de nucleotídeo de 16 a 585 da SEQ ID n°: 47.
Exemplo 3. Transformação do milho
[0115] Os embriões de milho imaturos de plantas doadoras da estufa são bombardeados com um plasmídeo contendo o elemento silenciador da invenção, funcionalmente ligado a um promotor específico para tecido, seletivo para tecido, ou constitutivo, e o gene marcador selecionável PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicida Bialaphos. Em uma modalidade, os constructos expressarão um RNA de filamento duplo longo da sequência-alvo apresentada na Tabela 1. Esse tipo de constructo pode ser ligado ao promotor dMMB. Alternativamente, o gene do marcador selecionável é colocado em um plasmídeo separado. A transformação é feita como descrito a seguir. As fórmulas dos meios são fornecidas abaixo.
Preparação de tecido alvo
[0116] As espigas são descascadas e têm a superfície esterilizada em alvejante Clorox a 30% mais 0,5% de detergente Micro durante 20 minutos, sendo então enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são cortados e colocados com o eixo do embrião para baixo (lado do escutelo para cima), 25 embriões por placa, em meio 560Y durante 4 horas e, então, alinhados dentro da zona alvo de 2,5 cm em preparação para o bombardeio.
[0117] É produzido um vetor de plasmídeo compreendendo o elemento silenciador de interesse funcionalmente ligado a ao promotor específico para tecido, seletivo para tecido ou constitutivo. Esse DNA do plasmídeo mais o DNA do plasmídeo contendo um marcador selecionável PAT é precipitado sobre péletes de tungsténio de 1,1 μm (diâmetro médio) com o uso de um procedimento de precipitação por CaCl2 da seguinte forma: 100 μl de partículas de tungstênio preparadas em água; 10 μl (1 μg) de DNA em tampão de Tris EDTA (1 μg total de DNA); 100 μl de CaCl2 a 2,5 M; e 10 μl de espermidina a 0,1 M.
[0118] Cada reagente é adicionado sequencialmente à suspensão de partículas de tungstênio mantida no vórtex para vários tubos. A mistura final é submetida a breve sonicação e deixada em incubação sob agitação constante durante 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido é removido, lavado com 500 ml de etanol 100%, e centrifugados durante 30 segundos. Novamente o líquido é removido, e 105 μl de etanol 100% é adicionado ao pélete de partícula de tungstênio. Para o bombardeio com arma de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são sonicadas rapidamente e 10 μl são colocados sobre o centro de cada macrocarreador e deixados secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeio.
[0119] As placas de amostra são bombardeadas em nível n° 4 com uma pistola de partículas. Todas as amostras recebem um único disparo a 4,5 MPa (650 PSI), com um total de dez alíquotas tomadas de cada tubo de partículas/DNA preparados.
[0120] Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y durante 2 dias, então transferidos para um meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos, e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calos resistentes por seleção são transferidos para o meio 288J para iniciar a regeneração das plantas. Após maturação do embrião somático (2 a 4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio para germinação e são transferidos para a sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7 a 10 dias mais tarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para o meio 272V sem hormônio em tubos durante 7 a 10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são, então, transferidas para elementos de inserção em vasos planos (equivalentes a vasos com 6,4 cm (2,5")) contendo solo de plantio, e cultivadas durante 1 semana em uma câmara de crescimento, subsequentemente cultivadas por 1 a 2 semanas adicionais na estufa e, então, transferidos para vasos Classic 600 (6,1 L (1,6 galão)) e cultivados até a maturidade.
[0121] As plantas são monitoradas e pontuadas quanto ao marcador adequado, como o controle de uma praga de plantas do tipo Coleoptera, como uma praga de plantas do tipo Diabrotica, e têm atividade inseticida. Por exemplo, as raízes da planta R0 são fornecidas como alimento a larvas de verme da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera). As raízes de milho transgênico são colocadas em placas de Petri com meio MSOD contendo antibióticos e glifosato para seleção in vitro. Cada raiz é infestada com duas larvas de WCR em cada placa, com um pincel de ponta fina. As placas são lacradas com Parafilm para impedir que as larvas escapem. Os testes são colocados a 27°C, 60% de umidade relativa em uma incubadora Percival com escuridão incompleta. A contaminação e a qualidade das larvas são monitoradas. Após seis dias de alimentação com tecidos de raiz, as larvas são transferidas para a dieta de WCR em uma placa de 96 cavidades. As larvas são deixadas alimentar-se com a dieta durante oito dias, o que torna o teste completo em um período de 14 dias. A massa larval e a sobrevivência são registradas para análise. Uma análise ANOVA Oneway e um teste de Dunnett são realizados com os dados sobre a massa larval, buscando por importância estatística em comparação a um controle negativo não- transformado. A atrofia das larvas WCR é medida após a alimentação em dois eventos, e comparada ao crescimento de larvas alimentadas com plantas de controle negativo.
[0122] Em outros testes, plantas de milho transgênicas (R0) geradas são plantadas em vasos de 25,4 cm (10 polegadas) contendo solo Metromix, após atingirem um tamanho adequado. Quando as plantas atingem o estágio de crescimento V4, sua zona da raiz é infestada com aproximadamente 1.000 ovos de verme da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera). Plantas de milho não-transgênico do mesmo genótipo são infestadas em um estágio de crescimento similar para servir como controle negativo. Os ovos são pré-incubados, portanto a eclosão ocorre 24 horas após a infestação. As larvas são deixadas alimentar-se dos sistemas de raiz durante 3 semanas. As plantas são removidas do solo e lavadas, de modo que as raízes possam ser avaliadas quanto à alimentação larval. Os danos às raízes são classificados com o uso de uma Escala de Lesão Nodal (ELN) para pontuação do nível de danos, onde 0 indica nenhum dano, 1 indica que um nó das raízes está reduzido a algo em torno de 3,8 cm (1,5 polegadas), 2 indica que 2 nós estão reduzidos, e 3 indica que 3 nós estão reduzidos. Como as plantas sendo usadas para avaliação vieram diretamente de cultura de tecidos após a transformação, e como os eventos de transformação são únicos, somente uma planta é avaliada por evento, nesse momento. As plantas no teste que apresentam sinais ou sintomas de alimentação larval indicam que se obteve uma infestação bem-sucedida. As raízes das plantas de controle negativo estão entre moderada e gravemente danificadas, enquanto as raízes das plantas transgênicas apresentam um controle substancial da alimentação larval, com cerca de 0,2 ou menos na Escala de Lesão Nodal.
[0123] O meio para bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas de Eriksson (1.000X, SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 120,0 g/l de sacarose, 1,0 mg/l de 2,4-D, e 2,88 g/l de L-prolina (levado ao volume desejado com H2O DI seguida do ajuste para pH 5,8 com KOH); 2,0 g/l de Gelrite (adicionado após levar ao volume desejado com H2O DI); e 8,5 mg/l de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e resfriamento até a temperatura ambiente). O meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas de Eriksson (1.000X, SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarose e 2,0 mg/l de 2,4-D (levado ao volume desejado com H2O DI em seguida ao ajuste para pH 5,8 com KOH); 3,0 g/l de Gelrite (adicionado após levar ao volume desejado com H2O DI); e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3,0 mg/l de bialafos (ambos adicionados após esterilização do meio e resfriamento até a temperatura ambiente).
[0124] O meio para regeneração de planta (288J) compreende 4,3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solução estoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl e 0,40 g/l de glicina (levado ao volume desejado com H2O DI refinada) (Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarose e 1,0 ml/l de ácido abcísico a 0,1 mM (levado ao volume desejado com H2O DI refinada, após ajuste até pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (adicionado após levar ao volume com H2O DI); e 1,0 mg/l de ácido indol acético e 3,0 mg/l de bialafos (adicionado após esterilização e resfriamento do meio até 60°C). O meio isento de hormônio (272V) compreende 4,3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solução estoque de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl e 0,40 g/l de glicina (levado ao volume desejado com H2O DI refinada), 0,1 g/l de mio-inositol e 40,0 g/l de sacarose (levado ao volume desejado com H2O DI refinada, após ajustar o pH para 5,6); e 6 g/l de Bacto-ágar (adicionada após levar ao volume desejado com H2O DI refinada), esterilizado e resfriado até 60°C.
Exemplo 4. Transformação de milho mediada por Agrobacterium
[0125] Para a transformação de milho mediada por Agrobacterium com um elemento silenciador da invenção, é empregado o método de Zhao (patente US n° 5.981.840 e publicação de patente PCT WO98/32326, cujo conteúdo está aqui incorporado, a título de referência). Esse tipo de constructo pode, por exemplo, expressar um RNA de filamento duplo longo da sequência-alvo apresentada na Tabela 1. Esse tipo de constructo pode ser ligado ao promotor dMMB. Em resumo, embriões imaturos são isolados a partir do milho, e colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferir o polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador a pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após este período de co-cultivo, uma etapa de “repouso” opcional é contemplada. Nesta etapa de repouso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico que sabidamente inibe o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para os transformantes de planta (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos são cultivados sobre meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. A seguir, os embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente seletivo e o calo transformado em crescimento é recuperado (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos são cultivados sobre meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo das células transformadas. O calo é então regenerado até o estado de planta (etapa 5: a etapa de regeneração), e os calos crescidos em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar as plantas. Testes quanto à atividade inseticida podem ser realizados conforme descrito acima, no Exemplo, 5.
Exemplo 5: Transformação de Embriões de Feijão-Soja Condições da cultura
[0126] Culturas embriogênicas de feijão soja em suspensão (cv. Jack) são mantidas em 35 ml de meio líquido SB196 (consulte as receitas abaixo) em um agitador giratório a 150 rpm e 26°C, com luzes fluorescentes brancas frias em um fotoperíodo de 16:8 h de dia/noite, com intensidade de luz de 60 a 85 μE/m2/s. As culturas são subcultivadas a cada 7 dias até duas semanas pela inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido SB196 (o intervalo de subcultura preferencial é a cada 7 dias).
[0127] Culturas embrionárias de feijão soja em suspensão são transformadas com os plasmídios e os fragmentos de DNA descritos nos exemplos acima, pelo método de bombardeio com pistola de partículas (Klein, et al., (1987) Nature 327:70).
Início de culturas embrionárias de soja em suspensão
[0128] As culturas de soja são iniciadas duas vezes por mês com 5 a 7 dias entre cada início.
[0129] Vagens com sementes imaturas de plantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após o plantio são selecionadas, removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas mediante agitação durante 15 minutos em uma solução de Clorox a 5% com 1 gota de sabão Ivory (95 ml de água destilada autoclavada mais 5 ml de Clorox e 1 gota de sabão). Misture bem. As sementes são enxaguadas com o uso de 2 frascos de 1 litro de água destilada estéril e aquelas com menos de 4 mm são colocadas em lâminas de microscópio individuais. As extremidades pequenas da semente são cortadas e os cotilédones são pressionados para fora do revestimento das sementes. Os cotilédones são transferidos para placas contendo meio SB1 (25 a 30 cotilédones por placa). As placas são envoltas com fita de fibra e armazenadas durante 8 semanas. Após este tempo, os embriões secundários são cortados e colocados em meio líquido SB196 durante 7 dias.
Preparação de DNA para bombardeio
[0130] Um plasmídio intacto ou um fragmento de plasmídio de DNA contendo os genes de interesse e o gene marcador selecionável são usados para o bombardeio. O DNA plasmidial para o bombardeio é preparado rotineiramente e purificado com o uso do método descrito no documento Promega™ Protocols and Applications Guide, Segunda Edição (página 106). Os fragmentos dos plasmídeos transportando o elemento silenciador de interesse são obtidos por isolamento em gel de plasmídios duplamente digeridos. Em cada caso, 100 ug de DNA plasmidial são digeridos em 0,5 ml da mistura de enzimas específica que é adequada para o plasmídio de interesse. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese em gel em agarose SeaPlaque GTG a 1% (BioWhitaker Molecular Applications) e os fragmentos de DNA contendo o elemento silenciador de interesse são cortados do gel de agarose. O DNA é purificado a partir da agarose com o uso da enzima de digestão GELase de acordo com o protocolo do fabricante.
[0131] Uma alíquota de 50 μl de água destilada estéril contendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) é adicionada a 5 μl de uma solução de 1 μg/μl de DNA (de plasmídio intacto ou de fragmento de DNA preparado conforme descrito acima), 50 μl de CaCl2 a 2,5 M e 20 μl de espermidina a 0,1 M. A mistura é agitada por 3 min no nível 3 de um agitador do tipo vórtex e centrifugada durante 10 segundos em uma microcentrífuga de bancada. Após uma lavagem com 400 μl de etanol 100% o pélete é suspenso por sonicação em 40 μl de etanol 100%. Cinco μl da suspensão de DNA são dispensados a cada disco de lançamento do disco do instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μl contém aproximadamente 0,375 mg de ouro por bombardeio (isto é, por disco).
Preparação de tecidos e bombardeio com DNA
[0132] Aproximadamente 150 a 200 mg de culturas embrionárias em suspensão com 7 dias de idade são colocados em uma placa de petri de 60 x 15 mm vazia e estéril e a placa é coberta com uma tela plástica. O tecido é bombardeado com 1 ou 2 disparos por placa, com pressão de ruptura de membrana ajustada para 7,58 MPa (1.100 PSI), sendo a câmara esvaziada até se obter um vácuo de 91 a 95 kPa (27 a 28 polegadas de mercúrio). O tecido é colocado a cerca de 8,9 cm (3,5 polegadas) da tela de retenção/bloqueio.
Seleção de embriões transformados
[0133] Os embriões transformados foram selecionados usando higromicina (quando o gene de higromicina fosfotransferase, HPT, foi usado como o marcador selecionável) ou clorossulfurona (quando o gene de acetolactato sintase, ALS, foi usado como o marcador selecionável).
Seleção por higromicina (HPT)
[0134] Após o bombardeio, o tecido é colocado em meio SB196 fresco e cultivado conforme descrito acima. Seis dias após o bombardeio, o meio SB196 é trocado por meio SB196 fresco contendo um agente de seleção de 30 mg/L de higromicina. O meio de seleção é renovado semanalmente. Quatro a seis semanas após o seleção, um tecido verde transformado pode ser observado crescendo a partir de grupos embrionários necróticos não-transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado em placas de poços para gerar novas culturas embrionárias em suspensão transformadas e clonalmente propagadas.
Seleção por clorossulfurona (ALS)
[0135] Após o bombardeio, o tecido é dividido entre 2 frascos com meio SB196 fresco e cultivado conforme descrito acima. Seis a sete dias após o bombardeio, o meio SB196 é trocado por meio SB196 fresco contendo um agente de seleção de 100 ng/ml de clorsulfuron. O meio de seleção é renovado semanalmente. Quatro a seis semanas após o seleção, um tecido verde transformado pode ser observado crescendo a partir de grupos embrionários necróticos não-transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado em placas de poços contendo SB196 para gerar novas culturas embrionárias em suspensão transformadas e clonalmente propagadas.
Regeneração de embriões somáticos de soja em plantas
[0136] De modo a obter plantas inteiras a partir das culturas embrionárias em suspensão, o tecido deve ser regenerado.
Maturação dos embriões
[0137] Os embriões são cultivados durante 4 a 6 semanas a 26°C em SB196 sob lâmpadas fluorescentes frias brancas (Econowatt branca fria F40/CW/RS/EW da Phillips) e Agro (Phillips F40 Agro) (40 Watts) em um fotoperíodo de 16:8 h com intensidade de luz de 90 a 120 uE/m2s. Após este tempo, os grupos de embriões são removidos para um meio de ágar sólido, SB166, durante 1 a 2 semanas. Os grupos são, então, subcultivados em meio SB103 durante 3 semanas. Durante esse período, embriões individuais podem ser removidos dos aglomerados e submetidos a triagem quanto ao marcador adequado ou a capacidade da planta para, quando injetada com os elementos silenciadores, controlar a praga de plantas do tipo Coleoptera ou a praga de plantas do tipo Diabrotica.
Dessecação e germinação dos embriões
[0138] Os embriões individuais maturados são dessecados por colocação em uma placa de petri pequena (35 x 10 mm) vazia durante aproximadamente 4 a 7 dias. As placas são vedadas com fita de fibra (criando uma câmara com pouca umidade). Os embriões dessecados são plantados em meio SB71-4 onde são deixados germinar sob as mesmas condições de cultura descritas acima. As plântulas germinadas são removidas do meio de germinação e enxaguadas vigorosamente com água e então plantadas em Redi-Earth em uma bandeja de 24 células coberta com uma redoma de plástico transparente. Após 2 semanas, a redoma é removida e as plantas são fortalecidas por mais uma semana. Se as plântulas estiverem robustas elas são transplantadas para um pote de 25,4 cm (10") de Redi-Earth com até 3 plântulas por pote.
[0139] O meio sólido SB1 compreende (por litro): 1 pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. n° 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 em solução estoque a 1.000X; 31,5 g de sacarose; 2 ml de 2,4-D (20 mg/L na concentração final); pH 5,7; e 8 g de ágar TC.
[0140] O meio sólido SB 166 compreende (por litro): 1 pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. n° 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 em solução de estoque a 1.000X; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2 hexaidrato; 5 g de carvão vegetal ativado; pH 5,7; e 2 g de Gelrite.
[0141] O meio sólido SB 103 compreende (por litro): 1 pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. n° 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 em solução de estoque a 1.000X; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2 hexaidrato; pH 5,7; e 2 g de Gelrite.
[0142] O meio sólido SB 71-4 compreende (por litro): 1 garrafa de sais B5 de Gamborg com sacarose (Gibco/BRL - Cat. n° 21153-036); pH 5,7; e 5 g de ágar TC.
[0143] A solução estoque de 2,4-D é obtida pré-fabricada junto à Phytotech n° de catálogo D 295 - a concentração é de 1 mg/ml.
[0144] A solução estoque de vitaminas B5 que é armazenada em alíquotas a -20°C compreende (por 100 ml): 10 g de mio- inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; e 1 g de tiamina. Se a solução não dissolver suficientemente rápido, aplicar um baixo nível de calor através da placa de agitação quente. A solução estoque de clorossulfurona compreende 1 mg/ml em 0,01 N de hidróxido de amônio
Exemplo 6. Expressão de elementos silenciadores no milho
[0145] Os elementos silenciadores apresentados nas SEQ ID n°: 8, 26, 17, 28 e 10 foram expressos em uma planta de milho como hairpins, e a planta foi testada quanto à atividade inseticida contra verme da raiz do milho. As sequências apresentadas nas SEQ ID n°: 8, 26, 17, 28 e 10 foram modificadas para serem expressas como um hairpin. Os constructos compreendiam os seguintes componentes: o promotor de ubiquitina do milho/5’UTR/1° íntron, funcionalmente ligado à SEQ ID n°: 8, 26, 17, 28 ou 10:: íntron ADH1:: complemento da SEQ ID n°: 8, 26, 17, 28 e 10. Os plasmídeos PHP41121, PHP41134, PHP41127, PHP41130 e PHP41118 foram gerados conforme resumido abaixo, na Tabela 2. Tabela 2.
[0146] As plantas de milho foram transformadas com os plasmídeos PHP41121, PHP41134, PHP41127, PHP41130 e PHP41118, e as plantas expressando os elementos silenciadores denotados na Tabela 2 foram transplantadas de placas 272V para vasos planos de estufa contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. Aproximadamente 10 a 14 dias após o transplante, as plantas (agora no estágio de crescimento V2-V3) foram transplantadas a vasos para árvore contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. Quatorze dias após a data de envio à estufa, as plantas foram infestadas com 100 ovos de vermes da raiz do milho ocidental (VRMO)/planta. Para conjuntos posteriores, uma segunda infestação de 100 ovos de VRMO/planta foi realizada 14 dias após a primeira infestação, e a pontuação ocorreu 14 dias após a segunda infestação. Vinte e um dias após a infestação, as plantas foram pontuadas usando-se a PLNVRM. As plantas com uma pontuação de < 0,5 foram transplantadas para vasos grandes contendo SB300 para sementes. Conforme mostrado na Figura 1, cada uma das SEQ ID n°: 8, 26, 17, 28 e 10 tinha atividade inseticida.
Exemplo 7 - Bioensaios com insetos
[0147] Adicionou-se 2,5 ul de uma reação de transcrição in vitro que sintetizou uma das sequências apresentadas na SEQ ID n°: 107-236 a uma cavidade de uma placa de microtitulação com 96 cavidades. Adicionou-se à amostra 25 ul de dieta lentamente derretida para verme da raiz do milho ocidental, submetendo-se à agitação em um agitador orbital para misturar a amostra e a dieta. Uma vez solidificada a dieta, vermes de raiz recém- nascidos foram adicionados à cavidade. Uma média de 5 recém- nascidos foram adicionados a cada cavidade. Após a infestação da placa, esta foi lacrada com Mylar e um único orifício foi perfurado no Mylar sobre cada cavidade, para permitir a troca de ar. Foram produzidas 4 réplicas de cavidade para cada amostra. O teste foi classificado quanto à atividade 7 dias após a infestação. A Tabela 3 apresenta dados do bioensaio para inseticida com o uso do verme da raiz do milho do sul. As pontuações possíveis são: morto (M), gravemente atrofiado (GA, pouco ou nenhum crescimento, porém vivo), atrofiado (A, crescimento até o segundo ínstar, porém não equivalente aos controles), contaminado (c), ou nenhuma atividade.
[0148] Em seguida à confirmação, um teste simples de resposta à dosagem foi realizado com os vermes da raiz do milho tanto ocidental como do sul. Consulte as Tabelas 4 e 5, abaixo. As amostras para testes de resposta à dosagem foram produzidos da mesma maneira descrita acima, com a seguinte modificação: as amostras foram adicionalmente purificadas com o uso de purificação em coluna, antes do tratamento enzimático. As amostras foram, também, normalizadas para 0,5 ug/ul, e todas as amostras foram avaliadas por eletroforese em gel. Os testes de resposta à dosagem foram realizados com as seguintes concentrações: bruto, 0,5, 0,25, 0,0125 ppm e diluições a 0,125 (equivalente a 51, 25, 12,5 e 6 ppm). Tabela 3. Dados do bioensaio para inseticida contra verme da raiz do milho do sul *as colunas na Tabela 3 representam as cavidades de réplica 1, 2, 3 e 4, bem como a média. Tabela 4 - Bioensaios de insetos contra vermes da raiz do milho ocidental e do sul. Tabela 5 - Bioensaios de insetos contra vermes da raiz do milho ocidental e do sul.
Exemplo 8. Expressão de elementos silenciadores no milho
[0149] Os elementos silenciadores apresentados nas SEQ ID n°: 13, 40, 72 e 73 foram expressos em uma planta de milho como hairpins e as plantas foram testadas quanto à atividade inseticida contra vermes da raiz do milho. As sequências apresentadas nas SEQ ID n°: 13, 40, 72 e 73 foram modificadas para serem expressas como um hairpin. Os constructos compreendiam os seguintes componentes: o promotor de ubiquitina do milho/5’UTR/1° íntron funcionalmente ligado a um dentre SEQ ID n°: 13, 40, 72 e 73 :: o íntron ADH1:: complemento do número de SEQ ID correspondente. Os plasmídeos PHP41136, PHP41567, PHP41992, PHP42000 foram gerados conforme resumido abaixo, na Tabela 6. PHP19288 era um plasmídeo de controle desprovido de um elemento silenciador. Tabela 6.
[0150] As plantas de milho foram transformadas com os plasmídeos PHP41136, PHP41567, PHP41992, PHP42000 e PHP19288 (controle desprovido de elemento silenciador) e as plantas expressando os elementos silenciadores denotados na Tabela 6 foram transplantadas de placas 272V para vasos planos de estufa contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. As plantas foram infestadas (100 ovos por planta) 14 dias após a data de envio à estufa, e uma segunda infestação (150 ovos por planta) foi realizada após outros 14 dias. A pontuação para atividade inseticida foi feita 14 dias mais tarde (28 dias após a primeira infestação). Cada uma das SEQ ID n°: 13, 40, 72 e 73 apresentou atividade inseticida neste teste.
[0151] Conforme mostrado na Figura 2, uma eficácia significativa foi demonstrada com os constructos PHP41136, PHP41567, PHP41992 e PHP42000. Não foi observada nenhuma diferença significativa entre PHP41136 e o controle positivo de PHP. A Tabela 7 apresenta um sumário dos dados mostrados na Figura 2. Tabela 7. O erro-padrão usa uma estimativa agrupada da variância de erro
Exemplo 9 - Bioensaios com insetos
[0152] Adicionou-se 2,5 ul de uma reação de transcrição in vitro que sintetizou uma das sequências apresentadas na SEQ ID n°: 13, 40, 72 e 73 a uma cavidade de uma placa de microtitulação com 96 cavidades. Adicionou-se à amostra 25 ul de dieta lentamente derretida para verme da raiz do milho ocidental, submetendo-se à agitação em um agitador orbital para misturar a amostra e a dieta. Uma vez solidificada a dieta, vermes de raiz recém-nascidos foram adicionados à cavidade. Uma média de 5 recém-nascidos foram adicionados a cada cavidade. Após a infestação da placa, esta foi lacrada com Mylar e um único orifício foi perfurado no Mylar sobre cada cavidade, para permitir a troca de ar. Foram produzidas 4 réplicas de cavidade para cada amostra. O teste foi classificado quanto à atividade 7 dias após a infestação. Testes de resposta à dosagem foram realizados com as seguintes concentrações: 50, 25, 12,5, 6,5, 3,2 e 1,5 ppm. A Tabela 8 apresenta dados do bioensaio para inseticida com o uso do verme da raiz do milho do sul. As pontuações possíveis são: morto (M), gravemente atrofiado (GA, pouco ou nenhum crescimento, porém vivo), atrofiado (A, crescimento até o segundo ínstar, porém não equivalente aos controles), contaminado (c), ou nenhuma atividade. Tabela 8 - Comparação entre atividade de T0 e resultados de teste de dsRNA
Exemplo 10. Expressão de elementos silenciadores no milho
[0153] Os elementos silenciadores apresentados nos vários números de SEQ ID denotados na Tabela 9 foram expressos em uma planta de milho (através dos métodosFASTcorn de triagem em alta velocidade) como hairpins, e as várias plantas foram testadas quanto à atividade inseticida contra vermes da raiz do milho. As sequências apresentadas nos números de SEQ ID denotados na Tabela 9 foram modificadas para serem expressas como um hairpin. Os constructos compreendiam os seguintes componentes: o promotor de ubiquitina do milho/5’UTR/1° íntron funcionalmente ligado ao número de SEQ ID apresentado na Tabela 9:: íntron ADH1:: complemento do número de SEQ ID apresentado na Tabela 9. Os vários plasmídeos tendo esses constructos de expressão silenciadores foram gerados conforme resumido abaixo na Tabela 9. Tabela 9.
[0154] As plantas de milho foram transformadas com plasmídeos PHP e as plantas expressando os elementos silenciadores denotados na Tabela 9 foram transplantadas de placas 272V para vasos planos de estufa contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. Aproximadamente 10 a 14 dias após o transplante, as plantas (agora no estágio de crescimento V2-V3) foram transplantadas a vasos para árvore contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. Quatorze dias após a data de envio à estufa, as plantas foram infestadas com 100 ovos de vermes da raiz do milho ocidental (VRMO)/planta. Para conjuntos posteriores, uma segunda infestação de 100 ovos de VRMO/planta foi realizada 14 dias após a primeira infestação, e a pontuação ocorreu 14 dias após a segunda infestação. Vinte e um dias após a infestação, as plantas foram pontuadas usando-se a PLNVRM. As plantas com uma pontuação de < 0,5 foram transplantadas para vasos grandes contendo SB300 para sementes. “Aprovado”, conforme denotado na Tabela 9, consiste em uma pontuação de lesão nodal de 0,2 a 0. “Aprovado com reservas”, conforme denotado na Tabela 9, consiste em uma pontuação de >0,2 a 0,75 que serviu como dado de corte para o avanço de um evento. “Porcentagem de rtPCR”, conforme denotado na Tabela 9, é a porcentagem dos 20 eventos com expressão demonstratada do hairpin, conforme determinado por rtPCR. “Porcentagem de ativos de rtPCR”, conforme denotado na Tabela 9, é a porcentagem de resultados positivos para rtPCR que também passaram no teste de PLNVRM. Portanto, esse último número poderia ser 100%, mesmo que somente 10 de 20 eventos fossem positivos para rtPCR, se todos os 10 também passarem no teste de PLNVRM. A “atividade no teste dieta” resume os dados anteriormente apresentados na presente invenção, denotando atividade atrofiada (A) ou gravemente atrofiada (GA) quando o hairpin foi misturado à dieta para VRM e fornecido diretamente aos insetos.
[0155] O artigo “um” e “uma” são usados na presente invenção para referir-se a um ou mais de um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos.
[0156] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados, a título de referência, na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
[0157] Embora a invenção anteriormente mencionada tenha sido descrita em detalhes consideráveis por meio de ilustração e exemplos para os propósitos de clareza de entendimento, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (15)

1. Polinucleotídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um construto de expressão, sendo que o construto de expressão compreende um promotor heterólogo funcionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma elemento silenciador, em que o elemento silenciador tem como alvo uma região tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 234 ou o complemento total da mesma na direção 3’-5’; sendo que o dito elemento silenciador tem atividade inseticida contra uma praga de plantas do tipo Coleoptera.
2. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita praga de plantas do tipo Coleoptera é uma praga de plantas do tipo Diabrotica.
3. Cassete de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo é flanqueado por um primeiro promotor convergente funcionalmente ligado a um terminal do polinucleotídeo e um segundo promotor convergente funcionalmente ligado ao terminal oposto do polinucleotídeo, sendo que o primeiro e o segundo promotores convergentes são capazes de conduzir a expressão do polinucleotídeo.
5. Método para obtenção de uma planta, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a) transformar uma célula de planta, a qual tem incorporada de maneira estável em seu genoma, um polinucleotídeo heterólogo que compreende um elemento silenciador, sendo que o dito elemento silenciador tem como alvo uma região tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 234 ou o complemento total da mesma na direção 3’-5’; sendo que o dito elemento silenciador, quando ingerido por uma praga de plantas do tipo Coleoptera, reduz o teor de uma sequência-alvo na dita praga de plantas do tipo Coleoptera e, assim, controla a praga de plantas do tipo Coleoptera. b) cultivar a dita célula de planta sob condições de crescimento vegetal; e c) regenerar uma planta a partir da dita célula de planta.
6. Método para controlar uma praga de plantas do tipo Coleoptera, CARACTERIZADO pelo fato de compreender alimentar uma praga de plantas do tipo Coleoptera com uma composição que compreende um elemento silenciador, em que a região alvo do elemento silenciador consiste da sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 234 ou do complemento total da mesma na direção 3’-5’, sendo que, o referido elemento silenciador, quando ingerido pela dita praga de plantas do tipo Coleoptera, reduz o nível de uma sequência-alvo da praga de plantas do tipo Coleoptera e, assim, controla a dita praga de plantas do tipo Coleoptera, sendo que a dita sequência-alvo da praga de plantas do tipo Coleoptera compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 234.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita praga de plantas do tipo Coleoptera compreende uma praga de plantas do tipo Diabrotica.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita praga de plantas do tipo Diabrotica compreende D. virgifera virgifera, D. speciosa, D. barberi ou D. undecimpunctata howardi.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita composição compreende uma planta ou parte de planta, conforme definida na reivindicação 5.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito elemento silenciador compreende um RNA de filamento duplo.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito elemento silenciador compreende um hairpin RNA.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta é uma monocotiledônea.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita monocotiledônea consiste em milho, cevada, milheto, trigo ou arroz.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta é uma dicotiledônea.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta consiste em soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, Arabidopsis ou algodão.
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