UA123491C2 - РОСЛИНА, СТІЙКА ДО КВІЗАЛОФОП-р-ЕТИЛУ, ТА СПОСІБ ЇЇ ОДЕРЖАННЯ - Google Patents

Abstract

Винахід стосується рослини пшениці, яка містить нуклеїнову кислоту ацетил-КоА карбоксилази, що надає стійкості до інгібування гербіцидом квізалофоп-р-етилу в дозах вказаного гербіциду, в яких він звичайно інгібує ріст рослини пшениці, де вказана нуклеїнова кислота, яка надає стійкості до інгібування вказаним гербіцидом, включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок ацетил-КоА карбоксилази, причому вказаний білок включає амінокислотне заміщення Ala2004Val, коли як порівняння наводиться послідовність ацетил-КоА карбоксилази Alopecurus myosuroides. Винахід також стосується способу підвищення продуктивності рослини пшениці, що має стійкість до гербіциду квізалофоп-р-етилу; способу отримання рослини пшениці, стійкої до гербіциду квізалофоп-р-етилу; способу ідентифікації рослини пшениці, яка є стійкою до гербіциду квізаолофоп-р-етилу; рослини з модифікованою АКК полінуклеотидною послідовністю; виділеного полінуклеотиду; конструкту нуклеїнової кислоти, який включає в себе виділений полінуклеотид; експресійної касети, що включає ДНК-конструкт; клітину-хазяїна, що містить стабільно введений в її геном щонайменше один ДНК-конструкт; трансгенної рослини, що містить стабільно введений в її геном ДНК-конструкт та виділеного поліпептиду з АКК активністю.

Description

що містить стабільно введений в її геном ДНК-конструкт та виділеного поліпептиду з АКК активністю.

Опис

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка вимагає пріоритет за Попередньою Заявкою на Патент США Мо 61/438294, заявленою 1 лютого 2011 року, і Попередньою Заявкою на Патент США Мо 61/553830, заявленою 31 жовтня 2011 року, кожна з яких у всій повноті включена в даний опис як посилання.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД

Даний винахід стосується композицій і способів отримання рослин сільськогосподарських культур, стійких до гербіцидів. Зокрема, даний винахід надає рослини пшениці, а також рослинні тканини і насіння пшениці, яке містить модифіковані гени і білки ацетил-КоА карбоксилази (АКК) і є стійкими до інгібування гербіцидами, які звичайно інгібують активність білка АКК (АКК гербіциди).

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Пшеницю вирощують у всьому світі, і вона є найбільш широко адаптованою зерновою сільськогосподарською культурою. Звичайно рослини пшениці використовуються в різних харчових продуктах, таких як хліб, печиво, торти, крекери і локшина. Як правило, пшеницю твердих сортів подрібнюють в борошно, що використовується для хлібної продукції, а пшеницю м'яких сортів подрібнюють в борошно, що використовується для випічки і крекерів. Пшеничний крохмаль використовується в харчовій і паперовій промисловості, як крохмаль для прання і в інших продуктах.

Основною небезпекою для комерційного виробництва пшениці є конкуренція бур'янів, яка приводить до зниження урожаю і отримання зерна низької якості. Хоч для знищення бур'янів може використовуватися культивація грунту, грунт оброблених полів дуже вразливий до вітрової і водної ерозії. Завдяки легкості застосування і ефективності гербіцидна обробка є переважним способом контролю бур'янової рослинності. Гербіциди також дозволяють боротися з бур'яновою рослинністю в системах землеробства із застосуванням зниженої підготовки грунту до посіву або прямого висіву, які розроблені для збереження високих рівнів залишків на поверхні грунту для запобігання його ерозії. Найбільш серйозну конкуренцію пшениці серед бур'янової рослинності створюють трав'янисті бур'яни споріднених пшениці видів, такі як вівсюг і

Зо колениця, і важко розробити ефективну стратегію хімічного контролю для цих проблемних видів бур'янової рослинності, споріднених сільськогосподарській культурі, оскільки культура також чутлива до гербіциду. Один з підходів до розв'язання цієї проблеми включає розробку сортів, стійких до гербіцидів. У такій системі гербіцид застосовується "по культурі" для боротьби із бур'яновою рослинністю без збитку для стійких до гербіциду рослин культури.

Вироблення стійкості рослин до гербіцидів надає значні виробничі і економічні переваги; і по суті застосування гербіцидів для боротьби з бур'яновою рослинністю в культурах стало майже загальноприйнятою практикою. Однак застосування таких гербіцидів може також викликати загибель або зниження росту цільових рослин сільськогосподарських культур, приводячи до того, що час і спосіб застосування гербіцидів стають критичними або, в деяких випадках, нездійсненними.

Особливий інтерес для фермерів представляє застосування гербіцидів з більш високою активністю, широким спектром дії і швидким розкладанням в грунті. Рослини, рослинні тканини і насіння з стійкістю до цих сполук забезпечили б привабливе рішення, що дозволяє застосовувати гербіциди для контролю росту бур'янової рослинності без ризику пошкодження сільськогосподарської культури. Одним таким класом гербіцидів широкого спектру дії є сполуки, які інгібують активність ензиму ацетил-СоА-карбоксилази (АКК) в рослині. Такі гербіциди належать до хімічних класів арилоксифеноксипропіонатів (ЕОР) і циклогександіонів (О1ІМ).

Однак пшениця, наприклад, чутлива до багатьох гербіцидів, що інгібують АКК, цільовими видами яких є однодольна (злакова) трав'яниста рослинність, що робить застосування цих гербіцидів для контролю бур'янової рослинності в пшениці практично неможливим.

Внаслідок важливості пшениці як сільськогосподарської культури в світовому масштабі, існує потреба в гібридах пшениці, стійких до гербіцидів, що інгібують АКК, що забезпечить більший урожай при застосуванні цих гербіцидів для контролю злакової бур'янової рослинності.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід надає композиції і способи отримання рослин пшениці, стійких до гербіцидів.

Зокрема, даний винахід надає рослини, сорти, лінії і гібриди пшениці, а також рослинні тканини і насіння пшениці, які містять гени і білки зміненої ацетил-КоА карбоксилази (АКК), стійкої до інгібування гербіцидами, які звичайно інгібують активність білка АКК.

Пшениця, яка є сільськогосподарською культурою, чутлива до багатьох гербіцидів, що 60 інгібують АКК, цільовими видами яких є однодольні або злакові види бур'янової рослинності.

Однак, як описано в даному винаході, створений генотип пшениці, який виявляється стійкість до гербіцидів, що інгібують АКК. Генетичний аналіз ідентифікував генетичні відмінності в зародковій плазмі мутантної пшениці, які приводять до фенотипу стійкості до АКК гербіцидів.

В одному варіанті здійснення даний винахід надає одну або декілька рослин пшениці, зародкова плазма яких несе мутацію, що приводить до стійкості рослини до АКК гербіцидів.

Крім того, в подальших варіантах здійснення даний винахід стосується нащадків (наприклад,

Е1, Е2, ЕЗ і т. д.) гібридів вказаних рослин, де зародкова плазма у вказаних нащадках має таку ж мутацію, як і в батьківській рослині. Отже, варіанти здійснення даного винаходу надають сорти/гібриди пшениці, чия зародкова плазма містить мутацію, яка визначає, що фенотипом рослин є стійкість до АКК гербіцидів. У деяких варіантах здійснення вказані нащадки (наприклад, Е1, Е2, ЕЗ і т. д.) є результатом схрещування між елітними лініями пшениці, в яких щонайменше одна лінія містить в зародковій плазмі мутацію, що приводить до стійкості до АКК гербіцидів.

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає рослину пшениці, де зародкова плазма вказаної рослини пшениці надає стійкості до інгібування одним або декількома гербіцидами, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, в дозах, при яких вказані один або декілька гербіцидів звичайно інгібують ріст рослини пшениці. У деяких варіантах здійснення винаходу вказаний один або декілька гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, є представниками хімічних класів арилоксифеноксипропіонатів (ЕОР) і циклогександіонів (ІМ). У деяких варіантах здійснення винаходу зародкова плазма вказаної рослини пшениці, яка надає стійкості до інгібування одним або декількома гербіцидами, що впливають на ацетил-КоА карбоксилу, включає в себе одну або декілька мутацій в гені ацетил-КоА карбоксилази, як виявлено в АЕ28-А, АЕБ26-В або АЕ10-О, (АТСС МоМо ).

В іншому варіанті здійснення даний винахід надає спосіб контролю бур'янової рослинності поблизу рослини пшениці або сукупності рослин пшениці, який включає надавання одного або декількох гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу; нанесення вказаних одного або декількох гербіцидів, що діють на ацетил-КоА карбоксилазу, на поле з рослиною пшениці або сукупністю рослин пшениці таким чином, що застосування вказаних одного або декількох гербіцидів не чинить несприятливої дії на ріст бур'янової рослинності, а на ріст вказаної

Зо рослини пшениці або сукупність рослин пшениці несприятливої дії не чинить. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані один або декілька гербіцидів, що впливають на ацетил-

КоА карбоксилазу, є представниками хімічних класів арилоксифеноксипропіонатів (ЕОР) і циклогександіонів (СІМ). У деяких варіантах здійснення винаходу вказана рослина пшениці або сукупність рослин пшениці включає одну або декілька мутацій в гені ацетил-КоА карбоксилази, як виявлено в АЕ28-А, АЕБ26-В і/або АЕ10-О, (АТС МоМо ).

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає гібрид, лінію або сорт пшениці, де вказаний гібрид, лінія або сорт пшениці містять зародкову плазму, що включає в себе одну або декілька мутацій в гені ацетил-КоА карбоксилази, так що вказаним гібриду, лінії або сорту надається стійкість до одного або декількох гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані гібрид, лінія або сорт створені за допомогою інтрогресії зародкової плазми пшениці, яка включає вказані одну або декілька мутацій для надавання стійкості до одного або декількох гербіцидів, що впливають на ацетил-

КоА карбоксилазу. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані гібрид, лінія або сорт пшениці створені за допомогою введення гетерологічного гену, що включає в себе одну або декілька мутацій для надавання стійкості до одного або декількох гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу.

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає спосіб отримання гібриду, лінії або сортів пшениці, стійкого до одного або декількох гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, що включає ідентифікування зародкової плазми, що надає вказану стійкість до гербіциду, де вказана стійка до гербіциду зародкова плазма отримана з стійкої до гербіциду рослини пшениці, і введення вказаної зародкової плазми в елітний гібрид, елітну лінію або елітний сорт рослини пшениці. У деяких варіантах здійснення винаходу вказане введення вказаної зародкової плазми у вказаний елітний гібрид, рослинну лінію або елітний сорт рослини пшениці проводиться шляхом інтрогресії. У деяких варіантах здійснення винаходу вказане введення вказаної зародкової плазми у вказані елітний гібрид рослини пшениці, елітну лінію або елітний сорт пшениці проводиться шляхом введення гетерологічного гену.

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає гібрид, лінію або сорт пшениці, де зародкова плазма вказаних гібриду, лінії або сортів має надану стійкість до одного або декількох гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА-карбоксилазу, і стійкість до одного або бо декількох сполук з однієї або декількох груп гербіцидів, які не є інгібіторами ацетил-КоА-

карбоксилази.

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає спосіб ідентифікації рослинних ліній пшениці, стійких до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, який включає отримання зразка нуклеїнової кислоти з рослини пшениці, надавання ампліфікаційних праймерів для ампліфікації ділянки геному рослини пшениці, що відповідає гену ацетил-КоА карбоксилази, присутньому у вказаному зразку нуклеїнової кислоти, застосування вказаних ампліфікаційних праймерів до вказаного зразка нуклеїнової кислоти таким чином, що відбувається ампліфікація вказаної ділянки вказаного гену ацетил-КоА карбоксилази, і ідентифікацію рослин пшениці, стійких до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, на основі наявності у вказаному зразку нуклеїнової кислоти однієї або декількох мутацій, які надають стійкість до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу.

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає насіння пшениці, де вказана зародкова плазма вказаного насіння включає мутантний ген ацетил-КоА карбоксилази так, що вказана мутація надає стійкості до інгібування гербіцидами, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу. У деяких варіантах здійснення винаходу зародкова плазма вказаного насіння пшениці включає мутантний ген ацетил-КоА карбоксилази, як виявлена в АЕ28-А, АЕ26-В і/або

АгР10-О, (АТСС МоМо ). У деяких варіантах здійснення даний винахід надає рослини пшениці, вирощені з вказаного насіння і інших частин вказаних рослин пшениці, вирощеного з вказаного насіння. У деяких варіантах здійснення винаходу мутантний ген ацетил-КоА карбоксилази є функціональним фрагментом гену, як виявлений в АЕ28-А, АЕ26-В і/або АЕ10-О, (АТСС МоМо ), так що фрагмент гену кодує фрагмент білка, який є достатнім, щоб надати рослинам пшениці стійкість до інгібування гербіцидами, що впливає на ацетил-КоА карбоксилазу. У деяких варіантах здійснення даний винахід надає рослини пшениці, вирощені з вказаного насіння і інших частин вказаних рослин пшениці, вирощених з вказаного насіння.

У деяких варіантах здійснення даний винахід надає очищені і виділені з пшениці послідовності нуклеїнових кислот, які кодують ацетил-КоА-карбоксилазу. Згідно з винаходом, послідовності дикого типу, що кодують ацетил-КоА-карбоксилазу, були ідентифікованіз В, ОЇ А геномів (5ЕО ІЮ МОЗ: 1, 2 і 3, відповідно). Далі, були ідентифіковані мутації кожного геному, які забезпечують стійкість до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА-карбоксилазу, 5ЕО ІЮ МОБ: 4, 5 і 6, відповідно. Мутація представляє перехід від Аіа до Ма! в амінокислотному положенні 2004 (на який вказують стандартні посилання китника мишачохвостикового 9і|199600899|етЬБ|АМ408429.11 ії 9|1199600901|етр|АМ408430.1 послідовності ІЮ МО: 13, 14 151 16, див. також фігуру 9) для кожного геному, А геному (ЗЕО ІО МО: 8); В геному (ЗЕО ІО МО: 10),

О геному (ЗЕБО ІЮО МО: 12). Винахід також включає амінокислоти, кодовані даними послідовностями, включаючи 5ЕО ІЮ МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12, консервативно модифіковані варіанти і фрагменти, які зберігають АКК активність, а також мутанти, які забезпечують стійкість до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА-карбоксилазу.

Таким чином, композиції згідно з даним винаходом включають ізольований поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка включає (а) амінокислотну послідовність, в тому числі 5ЕО ІЮ МО: 7, 9 або 11 їі 5ЕБЕО ІО МОБ 8, 10 або 12, і (Б) амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 95, 95 95 або 99 95 послідовності зЗЕО

ІО МО: 7, 9, 11 або 5ЕО ІЮО МОБ: 8, 10 або 12, де вказаний поліпептид має АКК активність або надає стійкості до гербіциду, що впливає на ацетил-КоА-карбоксилазу.

Винахід також включає рослину пшениці, яка містить гетерологічну нуклеотидну послідовність яка щонайменше на 7095 гомологічна, щонайменше на 8095 гомологічна, щонайменше на 85 95 гомологічна, щонайменше на 90 95 гомологічна, щонайменше на 95 95 гомологічна, щонайменше на 9795 гомологічна або щонайменше на 9995 гомологічна послідовності ацетил-КоА-карбоксилази ЗЕО ІО МО: І, 2, 3, 4, 5, або 6 або як виявлено в АЕ28-А,

АР26 В і/або АБ10-0О (АТС МоМо ). У деяких варіантах здійснення винаходу

БО послідовність ацетил-КоА-карбоксилази кодує або включає в себе одне або декілька амінокислотних заміщень, наприклад АІа2004Маї, як виявлено в 5ЕО ІЮО МО: 8, , ЯК виявлено в ЗЕО ІЮО МО: 10, або ,як виявлено в ЗЕО ІЮ МО: 12.

В одному варіанті здійснення даний винахід додатково надає гібридні рослини пшениці, які мають всі фізіологічні і морфологічні характеристики вказаної рослини пшениці, вирощеної з вказаного насіння пшениці. У додаткових варіантах здійснення даний винахід надає культури тканин і регенеровані культури тканин, які походять з вказаного насіння пшениці або вказаної частини рослини пшениці, які включають мутацію у вказаному гені ацетил-КоА-карбоксилази, як виявлено в АЕ28-А, АЕ26 В і/або АЕ10-О (АТО Мов. ).

У ще одному варіанті здійснення даний винахід надає спосіб отримання насіння пшениці, що бо включає в себе схрещування рослини, що містить мутантну форму гену ацетил-КоА карбоксилази, яка виявлена в АЕ28-А, АЕ26 В і/або АЕ10-ЮО (АТСС Мов. ), з самими собою або з другою рослиною пшениці і збирання вказаного насіння, отриманого внаслідок вказаного схрещування. У деяких варіантах здійснення винаходу способи отримання вказаного насіння пшениці включають в себе посадку насіння батьківської насіннєвої лінії пшениці, де вказана батьківська насіннєва лінія містить зародкову плазму, яка надає стійкості до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, з батьківською лінією запилювача пшениці, де вказана зародкова плазма вказаних запилювача і/або насіннєвої лінії містить зародкову плазму, що надає стійкості до гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, спільне вирощування вказаних батьківського насіння і запилювальних рослин пшениці, що дозволяє вказаним батьківським насіннєвим рослинам запилюватися вказаними батьківськими рослинами-запилювачами, і збирання насіння, що є результатом вказаного запилення.

У ще одному варіанті здійснення винахід забезпечує для генетично модифікованих рослин пшениці введення гетерологічного нуклиотидного конструкта, що включає в себе 5ЕО ІЮ МО5: 1,2, 3, 4, 5 або 6, функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями, такими як експресійні касети, конструкти інгібування, рослини, рослинні клітини і насіння. Генетично модифіковані рослини, рослинні клітини і насіння згідно з даним винаходом можуть виявляти зміни фенотипу, такі як модульована АКК або рівні вмісту мутантної АКК.

Надані способи зниження або усунення активності АКК поліпептиду в рослині, що включають введення в рослину вибраного полінуклеотиду. У специфічних способах наданий полінуклеотид знижує рівень вмісту АКК в рослині.

Надані також способи підвищення рівня мутантного АКК ополіпептиду в рослині конститутивно або в специфічно регульовані проміжки часу і тканини, що включають введення в рослину вибраного полінуклеотиду з прийнятними регуляторними елементами. У специфічних способах експресія мутантного АКК полінуклеотиду поліпшує стійкість рослини до АКК гербіцидів.

ОПИС ФІГУР

Фігура 1 являє собою фотографію першої виявленої рослини, стійкої до дії гербіциду. Дана рослина вижила після двох застосувань гербіциду клітодиму в летальних дозах.

Фігура 2 являє собою фотографію М3З рослин, вирощених з двох М2 батьків. Рослини були двічі послідовно оброблені хізалофопом в летальних дозах. Рослини зліва вижили після двох застосувань гербіциду. Рослини праворуч загинули після одного застосування.

Фігура З являє собою фотографію дослідження залежності "доза-ефект", що показує підвищену стійкість відібраних мутантних рослин до гербіциду хізалофопу в М3 поколінні в порівнянні з немутагенними рослинами озимої пшениці сорту Наїспег. У 1, З ї 4 колонках представлені рослини, відібрані для отримання підвищеної стійкості до гербіцидів; в колонці 2 представлена немутагенізована озима пшениця сорту Наїспег.

На фігурі 4 представлені послідовності АКК генів з А, В їі О геномів і мутантного АКК гену

АР28-А, мутантного АКК гену АР26-В і мутантного АКК гену АБ26-О.

Фігура 5 являє собою графік, що описує візуальні пошкодження М3 мутантів, отриманих від

Ма і відібраних з використанням хізалофопу. Значення нижче горизонтальної лінії відрізняються від значення, отриманого для немутагенної контрольної рослини сорту Хетчера і представленого лівим прямокутником.

Фігура 6 являє собою графік, що описує результати випробувань мутагенних рослин для визначення залежності "доза-ефект" з використанням хізалофопу в порівнянні зі значеннями для немутагенного контролю сорту Хетчера, представленого лівим прямокутником, з Ма2- відібраним М3 рослинами.

Фігура 7 являє собою графік, що показує порівняння АКК послідовностей дикого типу і мутантних АКК послідовностей в геномах пшениці А, В ї ОЮ, що включають знову відкритий несинонімічний однонуклеотидний поліморфізм (5іпдіеє песіеоїідеп роїутогрпізт-5МР) в кожній мутантній послідовності.

Фігура 8 являє собою графік порівняння стійкості ензиму АКК до зростаючих концентрацій хізалофопу.

Фігура 9 показує вирівнювання послідовностей згідно з винаходом відносно довідкової послідовності китника мишачохвостикового і між собою.

ВИЗНАЧЕННЯ

Для забезпечення чіткого і послідовного розуміння опису і формули винаходу, включаючи розділ, відведений для таких термінів, надані наступні визначення. Одиниці, префікси і символи можуть бути позначені відповідно до їх 5І прийнятої форми. Якщо не вказане інше, нуклеїнові кислоти, записані зліва направо в напрямі від 5' до 3"; амінокислотні послідовності записані бо зліва направо в напрямі від аміногрупи до карбоксильної групи, відповідно. Інтервали числових значень включають значення, що визначають діапазон, і включають кожне ціле число в межах певного інтервалу значень. Амінокислоти можуть позначатися в описі або трьома відомими буквеними символами або однією буквою, як рекомендовано Комісією з біохімічної номенклатури ІШРАС-ІШВ. Нуклеотиди, аналогічно, можуть позначатися їх загальноприйнятими однобуквеними кодами. Якщо інше не передбачене, терміни програмних забезпечень, а також електротехніки і електронікию, що використовуються в даному описі, являють собою терміни, визначені в Те Мем/ ІЕЕЕ 5(апаага Ріснпопагу ої ЕІесігісаІЇ апа ЕІесігопіс5 Тепт5 (5 еайоп, 1993). Терміни, визначені нижче, більш детально визначені посиланням на специфікацію загалом.

Термін "консервативно модифіковані варіанти" стосується послідовностей амінокислот і нуклеїнових кислот. Що стосується конкретних послідовностей нуклеїнових кислот, термін "консервативно модифіковані варіанти" стосується тих нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або стабільно модифіковані варіанти амінокислотних послідовностей. Внаслідок виродженості генетичного коду велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодує будь- який білок. Наприклад, кодони СА, СС, СО і ЗСИО кодують амінокислоту аланін. Таким чином, на кожній позиції, де аланін визначений кодоном, цей кодон може бути замінений будь- яким з відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіації нуклеїнових кислот є "мовчазними (безсимптомними) варіаціями" і являють собою один з видів консервативно модифікованих варіацій. У даному описі кожна послідовність нуклеїнових кислот, яка кодує поліпептид, також за допомогою посилання на генетичний код описує кожну можливу мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти. Фахівцеві буде зрозуміло, що кожний кодон в нуклеїновій кислоті (за винятком АОС, який звичайно являє собою тільки кодон метіоніну, і бо, який звичайно являє собою тільки кодон триптофану) може бути модифікований для отримання функціонально ідентичної молекули. Відповідно, кожна мовчазна варіація нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид згідно з даним винаходом, є прихованою в кожній описаній поліпептидній послідовності і охоплюється областю даного винаходу.

Що стосується амінокислотних послідовностей, фахівцеві даної галузі техніки буде зрозуміло, що окремі заміщення, делеції або додавання в послідовність нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, яка змінює, додає або видаляє єдину амінокислоту або невеликий процент амінокислот в кодованій послідовності, являє собою "консервативно модифіковані варіанти", де альтерація приводить до заміщення амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таким чином, може бути змінене будь-яке число амінокислотних залишків, вибране з групи, яка включає цілі числа від 1 до 15. Відповідно, може бути виконано, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 7 або 10 альтерацій. Консервативно модифіковані варіанти звичайно забезпечують аналогічну біологічну активність, як і немодифікована поліпептидна послідовність, з якої вони отримані. Таблиці консервативних заміщень, що забезпечують отримання функціонально подібних амінокислот, добре відомі в даній галузі техніки.

Нижче представлені шість груп, кожна з яких містить амінокислоти, які являють собою консервативні заміщення один одного: 1) аланін (А), серин (5), треонін (Т); 2) аспарагінова кислота (0), глютамінова кислота (Е); 3) аспарагін (М), глютамін (0); 4) аргінін (К), лізин (К); 5) ізолейцин (І), лейцин (І), метіонін (М), валін (М); 6) фенілаланін (Р), тирозин (У), триптофан (М).

Див. також Стеідпіоп (1984) Ргоїеіп5 М.Н. Егеетап апа Сотрапу. Посилання на будь-яку послідовність в даному описі повинне інтерпретуватися як послідовність, що включає консервативно модифіковані варіанти.

Термін "кодуюча" або "кодована" по відношенню до вказаної нуклеїнової кислоти означає включення інформації для трансляції у вказаний білок. Нуклеїнова кислота, що кодує білок, може включати послідовності (наприклад, інтрони), що не транслюються, всередині областей нуклеїнової кислоти, що транслюються, або може не містити таких проміжних послідовностей, що не транслюються (наприклад, як в КДНК). Інформація, за допомогою якої кодується білок, визначається за допомогою використання кодонів. Звичайно амінокислотна послідовність кодується нуклеїновою кислотою з використанням "універсального" генетичного коду. Однак варіанти "універсального коду", такі як присутні в деяких мітохондріях рослин, тварин і грибів, бактеріях Мусоріаєта саргісоїшт або війчастих Масгописієи5, можуть використовуватися при експресуванні нуклеїнової кислоти.

Коли нуклеїнова кислота отримана або змінена синтетично, можна отримати перевагу бо відомих кодонових переваг передбачуваного хазяїна, куди повинна експресуватися нуклеїнова кислота. Наприклад, незважаючи на те, що послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом можуть експресуватися як в однодольні, так і в дводольні рослини, послідовності можуть модифікуватися для обліку специфічних переваг кодону і переваг вмісту оС однодольних або дводольних, оскільки, як було показано, ці переваги відрізняються (Митау апа а!. Асіа5 Нев. 17:47 7-498 (1989)).

Термін "гетерологічна", що використовується в даному описі відносно нуклеїнової кислоти, означає нуклеїнову кислоту, яка походить з чужорідних видів або, якщо з таких же видів, істотно модифікована відносно своєї природної форми в композиції і/або геномному локусі навмисним втручанням людини. Наприклад, промотор, функціонально зв'язаний з гетерологічним структурним геном, походить з видів, що відрізняються від тих, з яких був отриманий вказаний структурний ген, або, якщо походить з того ж виду, один з них або обидва істотно модифіковані відносно вихідної форми. Гетерологічний білок може походити з чужорідних видів або, якщо походить з того ж виду, істотно модифікований відносно вихідної форми за допомогою навмисного втручання людини.

Термін "клітина-хазяїн" означає клітину, яка містить вектор і підтримує реплікацію і/або експресію вектора. Клітини-хазяїни можуть являти собою прокаріотичні клітини, такі як Е. соїї, або еукаріотичні клітини, такі як клітини дріжджів, комах, амфібій або ссавців. Переважно, клітини-хазяїни являють собою клітини однодольних або дводольних рослин. Особливо переважної клітиною-хазяїном однодольної рослини є клітина-хазяїн кукурудзи.

Термін "введена" в контексті вставки нуклеїнової кислоти в клітину означає "трансфекцію", "грансформацію" або "трансдукцію" і стосується впровадження нуклеїнової кислоти в еукаріотичні або прокаріотичні клітини, де нуклеїнова кислота може бути впроваджена в геном клітини (наприклад, хромосому, плазміду, пластиду або мітохондріальну ДНК), перетворена в автономний реплікон або тимчасово експресована (наприклад, трансфікована мРНК).

Термін "виділений (ізольований)" стосується матеріалу, такого як нуклеїнова кислота або білок, який: (1) головним чином або по суті вільний від компонентів, які звичайно супроводжують його або взаємодіють з ним і виявлені в його природному навколишньому середовицщі.

Виділений матеріал необов'язково містить матеріал, не виявлений з ним в його природному навколишньому середовищі; або (2) якщо матеріал знаходиться в своєму природному

Зо навколишньому середовищі і був синтетично (не природним чином) змінений навмисним втручанням людини в композицію і/або вміщений в місцеположення в клітині (наприклад, геном або субклітинну органелу), яке не є рідним для матеріалу, знайденого в цьому середовищі.

Альтерація для отримання синтетичного матеріалу може проводитися з матеріалом в його природному стані або після видалення з його природного стану. Наприклад, існуюча в природі нуклеїнова кислота стає виділеною нуклеїновою кислотою, якщо вона змінена або транскрибована з ДНК, яка була змінена за допомогою втручання людини, виконаного всередині клітини, з якої вона походить (див., наприклад, Сотроипа5 апа Меїпод5 їТог Зйе рігестїєа Миладепезів іп ЕиКагуоіїс Се, Ктіес, Патент США Мо 5565350; Іп Мімо НотоІодои5 зедцепсе Тагдеїіпд іп ЕиКагуоііс СеїІ5; 2апіпуд еї аі. РСТ/О593/03868). Аналогічно, нуклеїнова кислота, що існує в природі (наприклад, промотор), стає виділеною, якщо вона введена за допомогою засобів, що не існують в природі, в локус геному, який не є рідним для даної нуклеїнової кислоти. Нуклеїнові кислоти, які є "виділеними", як визначено в описі, також називаються "гетерологічними" нуклеїновими кислотами.

Термін "нуклеїнова кислота", що використовується в даному описі, стосується дезоксирибонуклеотидного або рибонуклеотидного полімеру в одноланцюжковій або дволанцюжковій формі і, якщо не вказане інше, включає відомі аналоги, що мають, по суті, природу нуклеотидів в тому, що вони гібридизуються до одноланцюжкових нуклеїнових кислот способом, аналогічним способу гібридизації природних нуклеотидів (наприклад, пептидних нуклеїнових кислот).

Термін "бібліотека нуклеїнових кислот" означає колекцію молекул виділених ДНК або кДНК, які включають і по суті представляють повну транскрибовану фракцію геному вказаного організму. Способи конструювання типових бібліотек нуклеїнових кислот, таких як геномні бібліотеки і бібліотеки кКДНК, описані в стандартних посиланнях по молекулярній біології, таких

Вегдег апа Кіттеї!, Сьіціде То Моїіесшіаг Сіопіпд Тесппідоез, Меїйодв5 іп Епгутоіоду, Мої. 152,

Асадетіс Ргев5, Іпс., Зап Оієдо, Саїї. (Вегдег); затьгоок еї аї., МоІесшіаг Сіопіпд-А І арогаюгу

Мапаиаї, 2па єд., Мої. 1-3 (1989); Сицтепі Ргоїосоїв іп МоїІесшціаг Віоіоду, Р. М. А!йзибеї еї аї, Едв.,

Ситепі Ргоїосої5, а фоіпі мепіиге реїм'ееп сСгеепе Рибії5піпуд Авзосіасевз, Іпс. апа допп Уміеу 5 зЗопв, Іпс. (1994).

Термін "функціонально (оперативно, операбельно) зв'язаний", коли використовується в бо даному описі, стосується функціонального зв'язку між промотором і другою послідовністю, де послідовність промотора ініціює і опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Звичайно термін "функціонально зв'язаний" означає, що послідовності зв'язаних нуклеїнових кислот є суміжними і, коли необхідно з'єднати дві області, що кодують білок, суміжними і в одній рамці зчитування.

Якщо не вказане інше, термін "АКК нуклеїнова кислота" означає нуклеїнову кислоту, що містить полінуклеотид (АКК полінуклеотид"), що кодує АКК поліпептид з АКК активністю, і включає в себе всі консервативно модифіковані варіанти, гомологи, паралоги і т. п. Термін "АКК генів" означає ген згідно з даним винаходом і стосується гетерологічної геномної форми АКК полінуклеотиду повної довжини.

Термін "рослина", коли використовується в даному описі, може стосуватися цілих рослин, частин або органів рослин (наприклад, листя, стебел, коріння і т. д.), рослинних клітин, насіння рослин і їх потомства. Термін "рослинна клітина", коли використовується в даному описі, додатково включає, але без обмеження, клітини, отримані з насіння, суспензійних культур, ембріонів, меристематичних областей, калусної тканини, листя, коріння, пагонів, гаметофітів, спорофітів, пилки і мікроспор або виявлені у вказаних тканинах. Потрібно також розуміти, що термін "рослинні клітини" включає модифіковані клітини, такі як протопласти, отримані з вищезазначених тканин. Клас рослин, які можуть бути використані в способах згідно з винаходом, як правило, є такими ж широкими, як і клас вищих рослин, що піддаються методикам трансформації, включаючи як однодольні, так і дводольні рослини. Особливо переважні рослини включають кукурудзу, сою, соняшник, сорго, канолу, пшеницю, люцерну, бавовник, рис, ячмінь і просо.

Термін "полінуклеотид", коли використовується в даному описі, стосується полідезоксирибонуклеотиду, полірибонуклеотиду або їх аналогів, які мають по суті природу натурального рибонуклеотиду, в який вони гібридизуються в жорстких умовах гібридизації до по суті такої ж нуклеотидної послідовності, як і природні нуклеотиди, і/або дають можливість здійснювати трансляцію в ту ж амінокислоту(и), що і нуклеотид(и), що існує(ють) в природі.

Полінуклеотид може являти собою послідовність повної довжини або послідовність природного або гетерологічного структурного або регуляторного гену. Якщо не вказане інше, термін стосується специфічної послідовності, а також її комплементарної послідовності. Таким чином,

Зо в даному описі мається на увазі, що термін "полінуклеотиди" включає ДНК або РНК з кістяками макромолекул, модифікованими для стабільності або по інших причинах. Крім того, термін "полінуклеотиди", коли використовується в даному описі, включає ДНК або РНК, що містять незвичайні основи, такі як, наприклад, інозин, або модифіковані основи, такі як, наприклад, тритильовані основи, названі в даному описі тільки як два приклади, є полінуклеотидами, коли даний термін використовується в описі. Потрібно розуміти, що велика кількість різноманітних модифікацій зроблена в ДНК і РНК, які служать безлічі корисних цілей, відомих фахівцям в даній галузі техніки. Термін "полінуклеотид", коли використовується в даному описі, включає такі хімічно, ферментативно або метаболічно модифіковані форми полінуклеотидів, а також хімічні форми характеристичних ДНК і РНК вірусів і клітин, в тому числі, серед інших, простих і складних клітин.

Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовуються в даному описі взаємозамінно для позначення полімеру з амінокислотних залишків. Терміни стосуються амінокислотних полімерів, в яких один або декілька амінокислотних залишків являє собою штучний хімічний аналог відповідної існуючої в природі амінокислоти, а також існуючим в природі амінокислотним полімерам. Основна природа таких аналогів природних амінокислот така, що білок, в який вони вводяться, стає специфічно реакційноздатним по відношенню до антитіл, виявлених до такого ж білка, але що походить виключно з існуючих в природі амінокислот. Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок' також охоплюють модифікації включаючи, але без обмеження, глікозилювання, приєднання ліпіду, сульфатування, гамма-карбоксилювання залишків глютамінової кислоти, гідроксилювання і АДФ-рибозилювання. Потрібно розуміти, як добре відомо і як указано вище, що поліпептиди не є повністю лінійними. Наприклад, поліпептиди можуть бути розгалуженими в результаті убіквітинування, і вони можуть бути кільцевими з розгалуженнями або без, які звичайно є результатом посттрансляційних подій, включаючи подію природної переробки і події, викликані маніпуляцією, що проводиться людиною, яка не зустрічається в природі. Циклічні, розгалужені і розгалужені циклічні поліпептиди можуть бути синтезовані за допомогою нетрансляційного природного процесу, а також повністю синтетичними способами. Крім того, даний винахід передбачає застосування метіонін-вмісних і тих, що не містять метіоніну, амінокінцевих варіантів білка згідно з даним винаходом.

Термін "промотор", коли використовується в даному описі, стосується області ДНК, яка бо розташована вище за початок транскрипції і бере участь в розпізнаванні і зв'язуванні РНК-

полімерази і інших білків для ініціації транскрипції. Термін "рослинний промотор" означає промотор, здатний ініціювати транскрипцію в рослинних клітинах, незалежно від того чи є рослинна клітина джерелом його походження чи ні. Приклади рослинних промоторів включають, але без обмеження, промотори, отримані з рослин, рослинних вірусів і бактерій, які містять гени, експресовані в клітинах рослин, таких як Адгорасієегішт і Кпі2орішт. Приклади промоторів під контролем розвитку (ипадег демеІортепі сопігої) включають промотори, які переважно ініціюють транскрипцію в певних тканинах, таких як листя, коріння або насіння. Такі промотори називають "канино переважними". Промотори, які ініціюють транскрипцію тільки в певній тканині, називають "тканино специфічними". Промотор специфічного "типу клітин" насамперед стимулює експресію в клітинах певного типу, в одному або декількох органах, наприклад судинних клітинах в корінні або листі. "Індуцибельний" промотор або "промотор, що репресується" являє собою промотор, який знаходиться під контролем навколишнього середовища. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію за рахунок індуцибельних промоторів включають анаеробні умови або присутність світла.

Тканиноспецифічні промотори, тканепереважні промотори, промотори специфічних типів клітин і індуцибельні промотори складають клас "не конститутивних" промоторів. "Конститутивний" промотор являє собою промотор, який є активним в будь-яких умовах навколишнього середовища.

Термін "рекомбінантний" або "генетично модифікований", що використовується в даному описі, стосується клітини або вектора, які були змінені шляхом введення гетерологічної нуклеїнової кислоти, або клітини, отриманої з модифікованої таким чином клітини. Отже, рекомбінантні або генетично модифіковані клітини, наприклад, експресують гени, які не виявлені в ідентичній формі всередині природної (нерекомбінантної) форми клітини, або експресують природні гени, які інакше неправильно експресовані, недостатньо експресовані (ипдег-ехрге5зедй) або взагалі не експресовані внаслідок навмисного втручання людини. Термін "рекомбінантний" або "генетично модифікований", коли використовується в даному описі, не охоплює альтерацію клітини або вектора внаслідок природних подій (таких як, наприклад, природна мутація, природна трансформація/трансдукція/транспозиція), тобто подій, які відбуваються без навмисного втручання людини.

Зо Термін "експресійна касета", коли використовується в даному описі, означає конструкт нуклеїнової кислоти, генерований рекомбінантно або синтетично, з серією специфічних елементів нуклеїнових кислот, які забезпечують транскрипцію конкретної нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна. Рекомбінантна експресійна касета може бути включена в плазміду, хромосому, мітохондріальну ДНК, пластидну ДНК, вірус або фрагмент нуклеїнової кислоти. Звичайно частина рекомбінантної експресійної касети вектора експресії включає, крім інших послідовностей, нуклеїнову кислоту, що підлягає транскрибуванню, і промотор.

Терміни "залишок", "амінокислотний залишок" або "амінокислота" використовуються в даному описі взаємозамінно і стосуються амінокислоти, яка включена в білок, поліпептид або пептид (загальне визначення: "білок". Амінокислота може являти собою існуючу в природі амінокислоту і, якщо не обмежено іншим чином, може охоплювати неприродні аналоги природних амінокислот, які можуть функціонувати таким же чином, як і природні амінокислоти.

Термін "селективно гібридизується" означає гібридизацію в жорстких умовах послідовності нуклеїнової кислоти з вказаною цільовою амінокислотною послідовністю в більшій мірі, яку можна визначити (наприклад, щонайменше в 2 рази в порівнянні з фонової гібридизацією), ніж її гібридизація з нецільовими амінокислотними послідовностями, і по суті до виключення нецільових нуклеїнових кислот. Послідовності, що селективно гібридизуються, звичайно мають щонайменше приблизно 80 95 ідентичність, переважно 90 95 ідентичність і найбільш переважно 100 95 ідентичність послідовності (тобто комплементарні) по відношенню одна до одної.

Термін "жорсткі (суворі) умови" або "жорсткі умови гібридизації" стосується умов, при яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю в більшому ступені, що визначається, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в два рази більшого ступеня в порівнянні з фоновою гібридизацією). Жорсткі умови залежать від нуклеотидної послідовності і різні в різних умовах. За допомогою контролю жорсткості умов гібридизації і/або промивання можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які на 100 95 комплементарні зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, жорсткість умов можна регулювати таким чином, щоб допустити деяке неспівпадіння послідовностей для виявлення більш низьких ступенів схожості (гетерологічне зондування). Звичайно зонд складає менш ніж приблизно 1000 нуклеотидів в довжину, необов'язково менше за 500 нуклеотидів в довжину.

Звичайно жорсткими умовами будуть умови, при яких концентрація солі становить менше бо приблизно 1,5 М іонів натрію, як правило, концентрація іонів натрію (або інших солей) складає приблизно від 0,01 до 1,0 М при значенні рН від 7,0 до 8,3 і температурі щонайменше приблизно 30 С для коротких зондів (наприклад, що містять від 10 до приблизно 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 С для довгих зондів (наприклад, що містять більше 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть бути також досягнуті при додаванні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Типові приклади умов низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином, що містить від 30 до 35 95 формаміду, 1М Масі, 1 95 505 (додецилсульфат натрію) при 37 "С з промиванням розчином від ЇХ до 2Х 5522 (20х550-3,0 М Масі/0),3 М тринатрійцитрат) при температурі від 50 до 55 "С. Ілюстративні приклади умов помірної жорсткості включають гібридизацію в розчині, що містить 40 до 45 95 формаміду, 1М Масі, 1 95

ЗО5, при 37 "С і промивання розчином від 0,5 Х до 1Х 55Х г при температурі від 55 до 50 ес.

Типові приклади умов високої жорсткості включають гібридизацію в розчині, що містить 50 95 формаміду, 1М Масі, 1 95 505 при 37 С і промивання розчином 0,1 Х 55Х при температурі від 60 до 65 "С протягом 20 хвилин.

Специфічність, як правило, є функцією післягібридизаційного промивання, причому критичними факторами є іонна сила і температура кінцевого промивального розчину. Для ДНК-

ДНК гібридів Тт може бути апроксимована з рівняння МеїпКоїй і Умайі, Апаї. Віоспет, 138:267- 284 (1984). Тяи-81,5 7С-16,6 (09 М)0,41 (95052)-0,61 (95 форм.)-500/л, де М являє собою молярність одновалентних катіонів, 9003С представляє процент нуклеотидів гуанозину і цитозину в ДНК, 95 форм. представляє процент формаміду в розчині для гібридизації, і Ї являє собою довжину гібриду в парах основ. Тт являє собою температуру (при визначених іонній силі і рН), при якій 50 95 комплементарно цільової послідовності гібридизується із зондом, що ідеально підходить. Ття знижується приблизно на 1 "С на кожний 1 95 невідповідності; таким чином, Тт гібридизації і/"або промивання може регулюватися для гібридизації з послідовностями потрібної ідентичності. Наприклад, якщо метою є послідовності 90 95 ідентичності, Тт може бути знижена на 10 "С. Як правило, жорсткі умови вибираються таким чином, щоб бути приблизно на 5 "С нижче за температуру плавлення (Т) конкретної послідовності і її комплементу при певній іонній силі і певному значенні рН. Проте, суворо жорсткі умови можуть використовуватися для гібридизації і/або промивання при температурі на 1, 2, 3, 4, 5 або 6 "С нижче за температуру плавлення (Тт); помірно суворі умови можуть використовуватися для гібридизації і/або

Зо промивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 "С нижче за температуру плавлення (Тт); умови низької жорсткості можуть використовуватися для гібридизації і/або промивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20"С нижче за температуру плавлення (Тт).

Використовуючи рівняння, гібридизацію і композицію промивного розчину, а також потрібну Тт, фахівцеві будуть зрозумілі варіації жорсткості гібридизації і/або розчину для промивання, які по суті описані вище. Якщо бажаний ступінь невідповідності приводить до Тт нижче за 457 (водний розчин) або 32 "С (формамідний розчин), переважно збільшити концентрацію 555 так, щоб можна було використати більш високі температури. Докладне керівництво по гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в публікації Ті)ї5зеп, І арогаїогу Тесппіднез іп Віоспетівгу апа

Моїесшіаг Віоіоду-Нубргіаігайоп м/йй Мисієїс Асідв Ргобевз, Рап І, Спарієг 2, А!йвибеї, еї аї, Едв.,

Стеепе Рибіїєпіпу апа М/ПІеу-Іпсегзсіепсе, Мем! ХогКк (1995). Звичайно, умовами високої жорсткості промивання є 2 х 15 хв. в 0,5 Х 555, що містить 0,1 95 505, при 65 76.

Термін "трансгенна рослина" або "генетично модифікована рослина", коли використовується в даному описі, стосується рослини, яка містить в своєму геномі гетерологічний полінуклеотид.

Звичайно гетерологічний полінуклеотид стабільно інтегрований в геном таким чином, що полінуклеотид передається в подальші покоління. Гетерологічний полінуклеотид може бути інтегрований в геном окремо або як частина експресійної касети. Терміни "трансгенна(ий, є)" або "генетично модифікована(ий, е)", що використовуються в даному описі, стосується будь- якої клітини, клітинної лінії, калусу, тканини, частини рослини або рослини, генотип яких був змінений присутністю гетерологічної нуклеїнової кислоти, в тому числі трансгенним, спочатку зміненим таким чином, а також створеним статевим схрещуванням або безстатевим розмноженням з вихідних трансгенних. Термін "трансгенний" або "генетично модифікований", що використовується в даному описі, не включає зміну геному (хромосомну або позахромосомну) звичайними методами селекції рослин або природними подіями, такими як випадкове перехресне запилення, нерекомбінантна вірусна інфекція, нерекомбінантна бактерійна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація.

Термін "вектор", що використовується в даному описі, означає нуклеїнову кислоту, що використовується в трансфекції клітини-хазяїна, в яку може бути вставлений полінуклеотид.

Вектори часто є репліконами. Вектори експресії дозволяють здійснити транскрипцію нуклеїнової кислоти, вставленої в нього. 60 Для опису взаємозв'язку між послідовностями двох або декількох нуклеїнових кислот або полінуклеотидів використовуються наступні терміни: (а) "порівняльна (еталонна) послідовність", (Б) "вікно порівняння", (с) "їдентичність послідовностей", (4) "процент ідентичності послідовностей" і (е) "істотна ідентичність".

Термін "порівняльна (еталонна) послідовність", що використовується в даному описі, означає певну послідовність, що використовується як основа для порівняння послідовностей.

Порівняльна послідовність може являти собою частину вказаної послідовності або всю вказану послідовність; наприклад, сегмент повнорозмірної КДНК або генної послідовності або повну

КДНК або генну послідовність.

Термін "вікно порівняння", що використовується в даному описі, означає сегмент полінуклеотидної послідовності сполучених і точно визначених нуклеотидів, де полінуклеотидну послідовність можна порівняти з еталонною послідовністю і де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може включати додатки або делеції (тобто пропуски) в порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додатків або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Звичайно вікно порівняння являє собою щонайменше 20 суміжних нуклеотидів в довжину і необов'язково може являти собою 30, 40, 50, 100 нуклеотидів або більше. Фахівцям в даній галузі зрозуміло, що для уникнення високої схожості з егалонною послідовністю за рахунок включення пропусків в полінуклеотидну послідовність звичайно вводиться штраф (дар репаку) пропусків, який віднімають з кількості збігів.

Методи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі техніки.

Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може проводитися з використанням алгоритму локальної гомологічності Сміта і Уотермана (див. Зтійй апа УМагегтап, Адм. Аррі. май. 2:482 (1981)); за допомогою алгоритму гомологічного вирівнювання Нідлемана і Уансша (див. Меєедіетап апа УУйп5с, 9. Мої. Віої. 48:443 (1970)); методу дослідження схожості Пірсона і

Ліпмана (див. Реагзоп апа Гіртап, Ргос. Май. Асай. Зсі. 85:2444 (1988)); за допомогою комп'ютерної реалізації цих алгоритмів, включаючи, але без обмеження: СІ ОЗТАЇ іп Ше

РС/Сепе ргодгат Бу Іпіеїїдепеїїс5, Мошпіаійп Міему, Сай; САР, ВЕ5ТРІТ, ВІ А5Т, ЕАЗТА, апа

ТЕАБТА іп Ше М/івсопвзіп Сепеїйсз бБоПймаге РасКаде, Сепеїйсз Сотршиіег Стор (202), 575 зсіепсе Ог., Мадізоп, Мі5., ОБА; програма СІ О5ТАГ. детально описана: Ніддіп5 апа зЗпагр, Сепе 73:237-244 (1988); Ніддіпв апа 5Нагр, САВІО5 5: 151-153 (1989); Согреї, єї аї., Мисівіс Асій5

Зо Везеагсі 16: 10881-90 (1988); Ниапо, еї аі. Сотршиїег Арріїсайоп5 іп Ше Віозсієпсе5 8: 155-65 (1992); Реагзоп, вї аїЇ. Метод іп МоїІесшціаг Віооду 24:307-331 (1994). Група програм ВІ А5Т, які можуть застосовуватися для дослідження бази даних по ідентичності, включає наступні програми: ВГАЗБТМ для дослідження нуклеотидних послідовностей, що вивчаються відносно нуклеотидних послідовностей бази даних; ВІАБТХ для дослідження нуклеотидних послідовностей, що вивчаються відносно білкових послідовностей бази даних; ВГА5ТР для дослідження білюових послідовностей, що вивчаються відносно білкових послідовностей бази даних; ТВІАБТМ для дослідження білкових послідовностей, що вивчаються, відносно нуклеотидних послідовностей бази даних; і ТВІАБТХ для дослідження нуклеотидних послідовностей, що вивчаються, відносно нуклеотидних послідовностей бази даних (див.,

Ситепі РгоїосоЇїв іп МоїІеєсшіаг Віоіоду, Спарієг 19, А!йвибеї, єї аї, Еа5., Сстеепе Рибіїєпіпуд апа

УМ еу-Іпіег5сієпсе, Мем ХоїК (1995)).

Якщо не вказане інше, показники ідентичності/схожості послідовностей, наведені в даному описі, стосуються величини, отриманої за допомогою пакету програм ВІАБТ 2.0 з використанням параметрів за умовчанням (див. Айв5спи! еї аї, Мисівїс Асід5 Кев. 25:3389-3402 (1997)). Програмне забезпечення для проведення ВІАБ5БТ аналізів є загальнодоступним, наприклад, через Національний центр біотехнологічної інформації (Майопа! Сепіег ог

Віотесппооду-Іптогтайоп) /(м/млу. порі. піт.пій.дом/). Цей алгоритм включає, насамперед, виявлення пар послідовностей з високою оцінкою (Н5Р) шляхом ідентифікації коротких слів довжини УМ в послідовності, що досліджується, які співпадають або задовольняють деякі позитивно оцінені порогові значення Т при вирівнюванні зі словом тієї ж довжини в послідовності з бази даних. Т називають пороговою оцінкою близького "слова" (Айбсейпиці еї аї, зирга). Ці вихідні вибірки близького "слова" використовуються як затравка для ініціації пошуку, призначеного для знаходження більш довгих НОР, що включають їх. Потім вибірки "слова" довшають в обох напрямах вздовж кожної послідовності доти, поки може збільшуватися кумулятивний (накопичувальний) бал. Кумулятивні бали для нуклеотидних послідовностей обчислюють з використанням параметрів М (призовий бал за пару залишків, що співпадають; завжди 20) і М (штрафний бал за залишки, що не співпадають; завжди «0). В амінокислотних послідовностях для обчислення кумулятивного балу використовують матрицю балів.

Подовження вибірки "слова" в кожному напрямі припиняється в тому випадку, якщо бо кумулятивний бал при порівняльному аналізі знижується на величину Х від свого максимального досягнутого значення; якщо кумулятивний бал знижується до нуля або нижче внаслідок накопичення одного або декількох негативних балів при порівняльному аналізі залишків; або якщо досягається кінець якої-небудь послідовності. Параметри алгоритму ВІ А5Т:

М, Т ї Х -визначають чутливість і швидкість порівняльного аналізу. У програмі ВІ А5ТМ (для нуклеотидних послідовностей) як параметри, що задаються за умовчанням, використовуються довжина "слова" (М/), що дорівнює 11, очікування (Е), що дорівнює 10, граничне значення 100,

М-5, М--4, при цьому проводиться порівняння обох ланцюжків. Для амінокислотних послідовностей в програмі ВГАБТР використовуються як параметри, що задаються за умовчанням, довжина "слова" (М/), що дорівнює 3, очікування (Е), що дорівнює 10, і матриця балів В ОЗИМБб2 (див. Непікоїйї і Непікой, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 89: 10915 (1989)).

Крім обчислення процента ідентичності послідовностей алгоритм ВІ А5ЗТ також проводить статистичних аналіз подібності двох послідовностей (див., наприклад, е.9., Кагіїп 4 АкКесПиЇ,

Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 90:5873-5787 (1993)). Одним з критеріїв подібності, наданих ВІ АЗТ алгоритмом, є найменша сумарна імовірність (Р(М)), яка показує імовірність, з якою збіг між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями може статися випадково.

ВГАБТ дослідження передбачають, що білки можуть бути змодельовані як випадкові послідовності. Однак безліч реальних білків містить області невипадкових послідовностей, які можуть бути гомополімерними ділянками, повтореннями з коротким періодом або областями, збагаченими однією або декількома амінокислотами. Такі області низької складності можуть вирівнюватися між незв'язаними білками, навіть якщо інші ділянки білка абсолютно не схожі.

Ряд програм, що фільтрують низьку складність, можуть використовуватися для зменшення таких вирівнювань низької складності. Наприклад, фільтри низької складності ЗЕС (Умосїеп апа

Еєдетеп, Сотриї. Спет., 17: 149-163 (1993)) ії ХМО (Сіамегіє апа 5іаге5з, Сотриї. Спет., 17: 191-201 (1993)) можуть використовуватися окремо або в комбінації.

Термін "ідентичність послідовностей" або "ідентичність", коли використовується в даному описі відносно двох нуклеїнових кислот або поліпептидів, стосується залишків двох послідовностей, які є однаковими при вирівнюванні для максимальної відповідності в заданому вікні порівняння. Коли процент ідентичності послідовностей використовується по відношенню до білка, признається, що положення залишків, які не є ідентичними, часто відрізняються

Зо консервативними амінокислотними заміщеннями, де амінокислотні залишки заміщені на інші амінокислотні залишки зі схожими хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю) і, отже, не змінюють функціональних властивостей молекули. Коли послідовності відрізняються такими консервативними заміщеннями, процент ідентичності послідовності може бути скоректований у бік підвищення для корекції консервативної природи заміщення. Вважається, що послідовності, які відрізняються такими консервативними заміщеннями, мають "схожість послідовностей" або "схожість". Засоби для такого коректування добре відомі фахівцям даної галузі техніки. Звичайно, це включає в себе оцінку консервативного заміщення як часткового, а не повного помилкового спарювання, що підвищує процент ідентичності послідовностей. Таким чином, наприклад, якщо ідентичній амінокислоті дається оцінка 1, а неконсервативному заміщенню дана оцінка, що дорівнює нулю, консервативне заміщення має оцінку між нулем і 1. Бальна оцінка консервативних заміщень обчислюється, наприклад, відповідно до алгоритму Мейєрса і Міллера (Меуєг5 апа мМіШег,

Сотриїег Арріїс. ВіоїЇ. сі. 4: 11-17 (1988)) як це реалізовано в програмі РС/ЗЕМЕ (Іпіеїїдепеїісв, Мошпіаїп Міему, Саїїї, ОБА).

Термін "процент ідентичності послідовностей", коли використовується в даному описі, означає, що дане значення визначене шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може містити додатки або делеції (тобто пропуски) в порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додатків або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Процент розраховується шляхом визначення числа положень, в яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або ідентичний залишок амінокислоти зустрічається в обох послідовностях, для отримання числа положень, що співпадають, поділу числа положень, що співпадають, на загальне число положень у вікні порівняння і множення результату на 100 для отримання процента ідентичності послідовностей.

Терміни "сорт" і "культивар", коли використовуються в даному описі, стосуються рослин, які визначені експресією характеристик, отриманих з даного генотипу або комбінації генотипів, відрізняються від будь-якої іншої групи рослин ступенем вираженості щонайменше однієї з характеристик і розглядаються як ціле з точки зору придатності для розмноження незмінними.

Термін "гібрид", коли використовується в даному описі, стосується нащадка або потомства 60 генетично різних рослин-батьків або стоку, виробленого в результаті контрольованого перехресного запилення на відміну від негібридного насіння, виробленого в результаті природного запилення.

Термін "потомство", коли використовується в даному описі, стосується поколінь рослини, в яких походження покоління може бути прослідковане зворотно до вказаної рослини. Термін "потомство рослини, стійкої до гербіциду", коли використовується в даному описі, стосується потомства вказаної рослини, стійкої до гербіцидів, а також будь-якого мутантного, рекомбінантного або генно-інженерного похідного такої рослини того ж виду або різних видів, де характеристикаци) стійкості до гербіцидів вихідної рослини, стійкої до гербіциду, була передана рослині-нащадку.

Термін "рослинна тканина", коли використовується в даному описі, включає диференційовані і недиференційовані тканини рослин, включаючи ті, які присутні в корінні, пагонах, листі, пилку, насінні і пухлинах, а також клітини в культурі (наприклад, одиничні клітини, протопласти, ембріони, калуси і т. д-. Рослинна тканина може бути в рослинах, в органній культурі, тканинній культурі або в клітинній культурі.

Термін "частина рослини", коли використовується в даному описі, стосується структурної частини рослини або рослинної тканини, наприклад пилку, яйцеклітини, тканини, шкірки, насіння і клітини. У деяких варіантах здійснення даного винаходу трансгенні рослини є рослинами сільськогосподарських культур. Терміни "сільськогосподарська культура" і "рослина сільськогосподарської культури", коли використовуються в даному описі, використовуються в самому широкому значенні. Терміни включають, але без обмеження, будь-який вид рослин, їстівний для людей або що використовується як корм для тварин, риби або морських тварин, споживаних людьми, що використовується для огляду людьми або будь-яку рослину, що використовується в промисловості, в торгівлі або в освіті.

Термін "елітна зародкова плазма", коли використовується в даному описі відносно рослин, стосується спадкового матеріалу з доведеною спадковою перевагою.

Термін "елітна рослина", коли використовується в даному описі, стосується будь-якої рослини, яка була отримана виведенням і селекцією для найкращої агрономічної продуктивності.

Термін "ознака", коли використовується в даному описі, стосується характеристики

Зо організму, яку можна виміряти і/або спостерігати. Наприклад, даний винахід описує рослини, які стійкі до ЕОР і СІМ гербіцидів.

Терміни "маркер", "ДНК маркер" і "молекулярний маркер", коли використовуються в даному описі відносно "селектованого маркера", стосуються фізіологічної або морфологічної ознаки, яка може бути визначений як маркер для його власної селекції або для селекції інших ознак, близько зв'язаних з маркером. Наприклад, таким маркером міг би бути ген або ознака, асоційований з стійкістю до гербіцидів, що включає, але без обмеження, типові повтори з простою структурою (5ітріє зедиепсе гереаЇ-5З5К), однонуклеотидний поліморфізм (зіпдіе писієоїіде роїутогрпізт-5МР), генетичні вставки і/або делеції і т. п.

Терміни "інтрогресувати", "інтрогресування" і "Інтрогресія", коли використовуються в даному описі, стосуються традиційних (тобто класичних) методик селекції запиленням для вставки чужорідного генетичного матеріалу в лінію виробників. Наприклад, даний винахід надає рослини сільськогосподарської культури пшениці, інтрогресовані мутантним АКК геном стійкості до гербіциду шляхом схрещування двох генерацій рослин.

Термін "дикий тип", коли використовується в даному описі по відношенню до гену, стосується функціонального гену, який є спільним для популяції рослин. Функціональний ген дикого типу - це ген, який найчастіше спостерігається в популяції і, таким чином, довільно визначає "нормальну" форму гену або форму гену "дикого типу".

Терміни "мутант" або "функціональний мутант", коли використовуються в даному описі по відношенню до гену або генного продукту, стосуються, відповідно, гену або продукту гену, які демонструють зміни в послідовності і/або в функціональних властивостях (наприклад, змінені характеристики) в порівнянні з геном або продуктом гену дикого типу. Таким чином, терміни "модифікована" або "мутантна", коли використовуються по відношенню до нуклеотидної послідовності, стосуються послідовності нуклеїнової кислоти, яка відрізняється на один або декілька нуклеотидів від іншої, звичайно спорідненої послідовності нуклеїнової кислоти, а термін "функціональний мутант", коли використовується по відношенню до поліпептиду, що кодується вказаною "модифікованою" або "мутантною" нуклеїновою кислотою, стосується білка або поліпептиду, який зберігає активність. У даному винаході мутантний АКК білок або "функціональний мутант" являє собою АКК генів, який зберігає свою природну активність для створення необхідних амінокислот. Крім того, термін "модифікована" нуклеотидна послідовність бо інтерпретується як послідовність на основі виродженого генетичного коду, як відомо фахівцям в даній галузі. Наприклад, генетичний код є виродженим, оскільки існують приклади, в яких різні кодони точно визначають одну і ту ж амінокислоту; також існують приклади, коли в генетичному коді деякі амінокислоти можуть кодуватися більш ніж одним кодоном кожна. Передбачається, що даний винахід може охоплювати таку виродженість (наприклад, коли гібрид пшениці включає АКК генів, який гомологічний щонайменше на 70 95, гомологічний щонайменше на 80 96, гомологічний щонайменше на 85 95, гомологічний щонайменше на 90 95, гомологічний щонайменше на 95 95, гомологічний щонайменше на 97 95 і гомологічний щонайменше на 99 96 послідовності нуклеотидів 5ЕО ІЮ МО:1, 2, 3, 4, 5 або 6, або який виявлений, наприклад, в АЕ28-

А, АБР26-В і/або АЕ10-О, (АТС Мов. ), як виявлено, наприклад, в зародковій плазмі пшениці.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Ацетил-КоОА карбоксилаза (АКК) є біотинілюованим ензимом, який каталізує карбоксилювання ацетил-КоА для отримання малоніл-КоА. Це карбоксилювання є двоступеневою, оборотною реакцією, що включає в себе АТфФф-залежне карбоксилювання біотинової групи на карбоксильному домені-переноснику за допомогою біотин-карбоксилазної активності і подальше перенесення карбоксильної групи з біотину на ацетил-КоА за допомогою карбоксил-трансферазної активності (Мікоїаи еї аї., 2003, Агоп. Віосепт. Віорпувз. 414:211-22). В рослинах ацетил-КоА карбоксилаза є не тільки ключовим ензимом для біосинтезу жирних кислот, процесу, що йде в хлоропластах і мітохондріях, але і грає важливу роль в утворенні довголанцюгових жирних кислот і флавоноїдів, а також в малонілюванні, що протікає в цитоплазмі. Існує дві ізоформи АКК, і АКК хлоропластів відповідальна більш ніж за 80 95 загальної активності АКК (Негрегі еї аї., 1996, Віоспет. У. 318:997-1006).

Арилоксифеноксипропіонати (ЕОР) і циклогександіони (ОІМ) представляють два класи хімічних речовин, які, як відомо, селективно інгібують хлоропластну форму АКК в травах (Кепаіїпа еї аї., 1990, У. Адіісє. Роса Спет. 38: 1282-1287).

Насіння варієтету пшениці зазнавало впливу хімічного мутагену етанметилсульфонату (етап теїНуізиМопаїе-ЕМ5), висаджувалося і оцінювалося на стійкість до АКК гербіцидів. Один з генотипів, АЕ28-А, (ЗЕО ІО МО: 4) експресував високі рівні стійкості до кожного з перевірених гербіцидів. Крім того, в даному винаході було показано, що схрещування АЕ28-А, АЕБ26-В і/або

Зо АРЕ10-О з елітними батьківськими лініями приводить до отримання множини гарного насіння і стійкості до АКК гербіцидів у потомства рослин.

По суті, один варіант здійснення даного винаходу надає зародкову плазму рослини, яка містить змінені гени і білки АКК. У деяких варіантах здійснення даний винахід надає застосування АКК гербіцидів на полях гібридних рослин для зменшення кількості однодольної бур'янової рослинності, присутньої на вказаному полі культури, де вказана зародкова плазма вказаного гібриду включає змінений ензим АКК, який надає стійкості до АКК гербіцидів, а вказані бур'яни є чутливими до АКК гербіцидів. Переважні рослини сільськогосподарських культур включають пшеницю, рис і ячмінь або інші однодольні зернові рослини з аналогічною мутацією.

В одному варіанті здійснення даний винахід надає рослину з стійкістю до інгібування АКК гербіцидами, окремо або в поєднанні з іншими ознаками стійкості, наприклад резистентність до комахи - вогнівки Спо рагпейПив5 (Сігп)азпапкКаг еї аї., 2005, Ріапі СеїЇ Кер. 24:513-522, дана публікація включена в даний опис у всій повноті). У деяких варіантах здійснення винаходу, наприклад, гібрид пшениці, зародкова плазма якого містить синтетичний ген сгу!Ї Ас з ВасіШив5

Іигіпдіепві5 (ВО, інтрогресується в лінію пшениці, зародкова плазма якої надає стійкості до АКК гербіцидів. Також включення в один і той же гібрид стійкості до АКК гербіцидів і стійкості до комах досягається з допомогою трансгенезу. Фахівцеві даної галузі техніки будуть зрозумілі різні методики, описані в даному винаході, які застосовні для введення двох або декількох характерних ознак стійкості в одну і ту ж рослину.

В одному варіанті здійснення даний винахід надає стійкості до АКК гербіцидів в рослинах,

БО що містять, наприклад, АКК зародкову плазму, позначену АЕ28-А, АЕ26-В і/або АЕ10-0, (АТОС

Мо5. ), введену в елітні сорти шляхом розмноження і відбору, тим самим забезпечуючи створення стійких до гербіцидів рослин, які будуть витримувати застосування гербіцидів, що інгібують АКК, для контролю росту бур'янової рослинності. Введення цієї ознаки стійкості до гербіцидів у вказані вище рослини дозволяє застосовувати ці гербіциди для контролю однодольних бур'янів, які ростуть в присутності даних сільськогосподарських культур. У деяких варіантах здійснення винаходу введення зародкової плазми з стійкістю до АКК гербіцидів в елітні лінії являє собою інтрогресію або класичні способи селекції. У деяких варіантах здійснення винаходу введення гену стійкості до АКК гербіцидів в елітні лінії являє собою трансгенез гетерологічного гену з експресією або конструкторами інгібування. У деяких бо варіантах здійснення винахід надає рослину, переважно рослину пшениці, у якої, щонайменше,

один предок містить ген стійкості до АКК гербіцидів із зародкової плазми АЕ28-А, депонованої під інвнентарним номером АТСС Мо . У деяких варіантах здійснення ген стійкості до АКК гербіцидів включає послідовність нуклеїнової кислоти, якої гомологічна щонайменше на 7095, гомологічна щонайменше на 8095, гомологічна щонайменше на 8595, гомологічна щонайменше на 90 95, гомологічна щонайменше на 95 95, гомологічна щонайменше на 97 95 і гомологічна щонайменше на 9995 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 4, або ген стійкості до АКК гербіцидів, виявлений в АБ28-А, депонованій під інвентарним номером АТСС

Мо . У деяких варіантах здійснення ген стійкості до АКК гербіцидів гомологічний щонайменше на 70 95, гомологічний щонайменше на 80 95, гомологічний щонайменше на 85 965, гомологічний щонайменше на 9095, гомологічний щонайменше на 9595, гомологічний щонайменше на 97 95 або гомологічний щонайменше на 99 95 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 4 або гену стійкості до АКК гербіцидів, виявленому в АЕ28-А, депонованій під інвентарним номером

АТСС Мо ; який включає амінокислотне заміщення АІа2о004Маї!.

У деяких варіантах здійснення зародкова плазма, стійка до АКК гербіцидів, інтрогресована в елітну лінію рослини з використанням класичних способів селекції. Приклади класичних способів селекції пшениці, ячменю, рису і інших однодольних зернових рослин можуть бути знайдені, наприклад, в публікації 5іерег апа РоейпІтап, 2006, Вгеедіпд Ріє Стор, Би Еайоп,

ВіаскиеїЇ Рибіїзпіпо, зміст якої введений в даний опис у всій повноті.

В одному варіанті здійснення винаходу, зародкова плазма з стійкістю до АКК гербіцидів інтрогресована в рослину, переважно рослину пшениці, що використовується для споживання в їжу людиною. У деяких варіантах здійснення винаходу зародкова плазма з стійкістю до АКК гербіцидів інтрогресована в рослини пшениці, що використовуються для корму худоби (наприклад, для домашніх птахів, великої рогатої худоби, свиней, овець і т. д.-). У деяких варіантах здійснення винаходу зародкова плазма, стійка до АКК гербіцидів, інтрогресована в рослини пшениці, що використовуються в промислових процесах, таких як виробництво етанолу. В одному варіанті здійснення винаходу ген стійкості до АКК гербіцидів введений в геном рослини шляхом трансгенезу за допомогою векторів і методів, відомих в даній галузі техніки.

У деяких варіантах здійснення даний винахід надає стійку до АКК гербіцидів зародкову

Зо плазму частин рослин пшениці лінії АЕ28-А, депонованої під інвентарним номером АТСС Мо , де вказана частина рослини пшениці являє собою одну або декілька частин рослини, вибрану з пилку, яйцеклітини, тканини, плоду, насіння і клітини. В одному варіанті здійснення даний винахід надає гібриди покоління Е1, зародкова плазма яких містить ген стійкості до АКК гербіцидів, як описана в даному винаході. У деяких варіантах здійснення винаходу Е1-гібриди є результатом схрещування двох елітних ліній пшениці, з яких щонайменше одна містить ген стійкості до АКК гербіцидів, як описана в даному винаході.

В одному варіанті здійснення даний винахід надає способи контролю бур'янової рослинності на полях з сукупністю культурних рослин. У деяких варіантах здійснення даного винаходу контроль бур'янової рослинності включає застосування АКК гербіциду по вказаній сукупності рослин таким чином, що ріст бур'янової рослинності інгібується, а ріст культурних рослин не зазнає несприятливого впливу. У деяких варіантах здійснення винаходу АКК гербіцид, що застосовується, належить до сімейства гербіцидів класу арилоксифеноксипропіонатів (БОР), включаючи, але без обмеження, клодинафоп-пропаргіл, цигалофоп-бутил, диклофоп-метил, феноксапроп-п-етил, флуазифоп-р-бутил, галоксифоп-етоксіетил, галоксифоп-етотил, галоксифоп-В-метил, пропахізафоп, хізалофоп-р-етил і хізало-Р-рефурил. У деяких варіантах здійснення винаходу АКК гербіцид, що застосовується, належить до сімейства гербіцидів класу циклогександіонів (ІМ), включаючи, але без обмеження, алоксидим, бутроксидим, клефоксидим, клетодим, циклоксидим, профоксидим, сетоксидим, тепралоксидим («і тралкоксидим. У деяких варіантах здійснення винаходу АКК гербіцид, що застосовується, включає комбінацію АКК гербіцидів хімічних сполук класів ЕОР і ріІМ, як описується в даному винаході. Однак застосування згідно з даним винаходом не обмежується АКК гербіцидами, що використовуються, і фахівцеві даної галузі техніки буде зрозуміло, що в будь-який момент часу можуть бути відкриті нові АКК гербіциди, які інгібують ензим АКК.

В одному варіанті здійснення даний винахід надає рослину (наприклад, Е1, Е2, ЕЗ, Е4 і т. д.), зародкова плазма якого надає стійкості до АКК гербіцидів і стійкості до одного або декількох додаткових гербіцидів, що належать до однієї або декількох різних груп гербіцидів. Наприклад, додаткові групи гербіцидів, що використовуються для інгібування росту бур'янової рослинності, включають, але без обмеження, інгібітори синтезу ліпідів (наприклад, арилоксифеноксипропіонати, циклогександіони (сусіопехаподеїйопев), бензофурани, 60 хлорзаміщені карбонові кислоти, фосфордитіоати, тіокарбамати), інгібітори фотосинтезу фотосистеми ЇЇ (наприклад, фенілкарбамати, піридазинони, триазиньі, триазинони, триазолінони, урацили, аміди, сечовини, бензотіадіазинони, нітрили, фенілпіридини), інгібітори фотосинтезу фотосистеми І (наприклад, біпіридиліуми), інгібітори протопорфіриногеноксидази (наприклад, дифенілефіри, М-фенілфталіміди, оксадіазоли, оксизолідиндіони, фенілпіразоли, піримідиндіони, тіадіазоли), інгібітори біосинтезу каротиноїдів (наприклад, піридазинони, піридинкарбоксаміди, ізоксазолідинони, триазоли), інгібітори 4- гідроксифенілпіруватдіоксигенази (наприклад, калістемони, ізоксазоли, піразоли, трикетони), інгібітори ЕПШП синтази (наприклад, гліцини), інгібітори глутамінсинтази (наприклад, фосфінові кислоти), інгібітори дигідроптероатсинтази (наприклад, карбамати), інгібітори збирання мікротрубочок (наприклад, бензаміди, бензойні кислоти, динітроаніліни, фосфороамідати, піридини), інгібітори клітинного поділу (наприклад, ацетаміди, хлороацетаміди, оксіацетаміди), інгібітори синтезу клітинної стінки (наприклад, нітрили, триазолкарбоксаміди) і інгібітори транспорту ауксину (наприклад, фталамати, семікарбазони). У деяких варіантах здійснення даний винахід надає Е1 гібриди елітних ліній рослин, які включають стійкість до одного або декількох АКК гербіцидів окремо або в поєднанні з стійкістю до гербіцидів з однієї або декількох з вказаних груп гербіцидів.

В одному варіанті здійснення даний винахід надає застосування гетерологічної нуклеотидної послідовності, що включає 5ЕО ІЮ МОБ: 1, 2, 3, 4, 5 або 6, що кодує АКК білок дикого типу або мутантний АКК білок (5ЕО ІЮО МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12) для забезпечення вибраної агрономічної ознаки стійкості до АКК гербіцидів. В одному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність включає мутантний АКК ген, виявлений в зародковій плазмі, позначеній як АЕ28-А, АР26-В і/або АЕ10-О і депонованій під інвентарними номерами АТОС

Мо - У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеотидна послідовність є гомологічною щонайменше на 7095, гомологічною щонайменше на 8095, гомологічною щонайменше на 85 95, гомологічною щонайменше на 90 95, гомологічною щонайменше на 95 95, гомологічною щонайменше на 97 95, гомологічною щонайменше на 99 95 послідовності ЗЕО ІЮ

МО: 1, ЗЕО ІЮО МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 6. У деяких варіантах здійснення винаходу АКК нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з промоторною послідовністю і утворює частину експресії або конструкту інгібування, і в деяких варіантах здійснення винаходу АКК нуклеотидна послідовність є гомологічною щонайменше на 70 956, гомологічною щонайменше на 80 95, гомологічною щонайменше на 85 95, гомологічною щонайменше на 90 95, гомологічною щонайменше на 95 95, гомологічною щонайменше на 97 95, гомологічною щонайменше на 99 95 до гену, стійкого до АКК гербіцидів, як виявлено в АЕ28-А,

АР26-В і/або АЕ10-О і/або 5ЕО ІЮО МО: 6, що включає амінокислотне заміщення АїЇа 2004 Маї в А,

В або О геномі.

Класичне розмноження пшениці

Польові культури були виведені класичним способом на основі підходів, в яких використовувалися переваги методу(ів) запилення рослин. Рослина вважається "самозапилювальною", якщо пилок з однієї квітки може бути перенесений на цю ж або іншу квітку цієї ж рослини, в той час як "перехреснозапилювальними" вважаються рослини, у яких для того, щоб запилення могло статися, пилок повинен бути перенесений з квітки іншої рослини. Рослини, які самозапилювалися і відбиралися протягом багатьох поколінь, стають гомозиготними по більшості, якщо не по всіх генних локусах, продукуючи таким чином однорідну популяцію істинного "племінного" потомства. Схрещування двох гомозиготних рослин різного походження або двох різних гомозиготних ліній буде давати однорідну популяцію гібридних рослин, які, більш ніж ймовірно, будуть гомозиготними у великій кількості генних локусів.

Схрещування двох рослин, кожна з яких є гетерозиготною по ряду генних локусів, буде давати покоління гібридних рослин, які генетично різні і не є однорідними.

Рослини пшениці є самозапилювальними рослинами, але їх також можна розводити перехресним запиленням. Розробка гібридів пшениці вимагає розробки батьків-запилювачів (відновників родючості) і насіннєвих інбредних батьків за допомогою системи чоловічої стерильності - відновлення фертильності, схрещування насіннєвих батьків і батьків- запилювачів, а також оцінки результатів схрещування. Гібриди пшениці також можуть бути розроблені з використанням агентів хімічної гібридизації, які застосовуються для забезпечення чоловічої стерильності жіночого родителя гібриду. Програми чистопородного розведення об'єднують бажані ознаки; в даній заявці бажаною ознакою є стійкість рослини до АКК гербіцидів. Ця ознака вміщується в пул розведення, що складається з однієї або декількох ліній, так що нові інбредні лінії створюються шляхом схрещування і подальшим відбором рослин з бажаною ознакою, подальшими додатковими схрещуваннями і т. д. Нові інбредні особні бо схрещуються з іншими інбредними лініями (наприклад, з елітними рослинними лініями, як описано в даному описі).

Селекційне розведення починається зі схрещування двох генотипів, таких як АБ28-А, АБ26-

В і/або АР10-0, і елітної лінії пшениці. Якщо два вихідні батьки не забезпечують всі необхідні характеристики, то в селекційну популяцію можуть бути включені і інші джерела. Наприклад, якщо бажаний гібрид, стійкий до АКК гербіцидів і гербіцидів іншої групи, як описано у винаході, то можуть схрещуватися рослини з цими ознаками з використанням класичних методів селекції.

У методі селекції вищі рослини є самозапилювальними і відбираються в подальших поколіннях.

У подальших поколіннях гетерозиготний стан дає шлях до однорідних ліній гомозиготних рослин як результат самозапилення і селекції. Як правило, в методі селекції на практиці отримують п'ять або більше поколінь самозапилення і селекцію (наприклад, 51, 52, 53, 54, 551 т. д.).

Зворотне схрещування використовується для поліпшення рослинної лінії. Зворотне схрещування переносить специфічну бажану ознаку з одного джерела в інше, яке потребує даної ознаки. Це досягається, наприклад, схрещуванням донора (наприклад, АЕ28-А) з елітною інбредною лінією (наприклад, з елітною лінією). Потомство цього схрещування потім схрещується зворотно (тобто проводиться зворотне схрещування) з елітною інбредною лінією з подальшим відбором в потомстві, що вийшло по бажаній ознаці (наприклад, стійкість до АКК гербіцидів). Після п'яти або більшої кількості поколінь зворотного схрещування з відбором по бажаній ознаці потомство стає типово гетерозиготним по локусу, що контролює бажаний фенотип, але буде схожим на елітного батька за іншими генетичними ознаками. Останнє зворотне схрещування звичайно проводиться з самою рослиною для створення чистого селекційного ("племінного") потомства для передачі гену.

У програмах розведення гібридів пшениці, що використовуються в даний час, розробляються нові батьківські лінії для отримання насіннєвих батьківських ліній або ліній батьків-запилювачів в залежності від того, чи містять вони гени відновлення фертильності; насіннєві батьківські лінії не мають генів відновлення фертильності, мають чоловічу стерильність в певних цитоплазмах (також відомі як рослини "А" лінії) і мають чоловічу фертильність в інших цитоплазмах (також відомі як рослини "В" лінії), тоді як лінії батьків- запилювачів не мають чоловічої стерильності і містять гени відновлення фертильності (також відомі як рослини "К" лінії). Насіннєві батьківські лінії звичайно створюються так, щоб вони мали

Зо цитоплазматичну чоловічу стерильність і щоб пильовики в цих рослинах були або мінімального розміру, або були відсутні взагалі і, отже, було потрібне перехресне запилення. Насіннєві батьківські лінії будуть виробляти тільки насіння, і цитоплазма переноситься тільки через яйцеклітину. Пилок для перехресного запилення надається лініями батьків-запилювачів, які містять гени, необхідні для повного відновлення фертильності в гібридах Е1, і схрещування об'єднує цих батьків з насіннєвим батьком, що має чоловічу стерильність для отримання високоврожайного простого гібриду з хорошою якістю зерна.

Звичайно така система цитоплазматичної стерильності/відновлення фертильності використовується для отримання гібридного насіння шляхом висадження блоків грядок з рослинами з чоловічою стерильністю (насіннєвими батьками) і блоків грядок з рослинами відновниками фертильності (батьками-запилювачами), так щоб рослини насіннєвих батьків запилювалися за допомогою вітру пилком з рослини батька-запилювача. Цей процес дає потужний простий гібрид, який збирається і вирощується споживачем. Рослини насіннєвих батьків, що мають чоловічу стерильність можуть бути також створені за допомогою генетичної селекції в певній популяції рецесивних ядерних генів чоловічої стерильності, однак цитоплазматична система чоловічої стерильності-відновлення фертильності є основною системою, що використовується при виведенні гібриду пшениці, хоч широко використовується і хімічно індукована чоловіча стерильність. Слепер і Поєльман (див. Зіерег апа Роепітап, 2006,

Вгеедіпо Рієій Стгор5, Рійп Еа., Віаску"еїї Рибріїєпіпу) представили хороший огляд сучасних методик по селекції рослин пшениці, і дана публікація включена в даний опис у всій повноті у вигляді посилання.

Даний винахід не обмежується перерахованими лініями пшениці, і кваліфікованому фахівцеві даної галузі техніки буде зрозуміло, що будь-яка елітна лінія пшениці в рівній мірі підходить для композицій і способів, описаних в даному описі.

ТРАНСГЕНЕЗ РОСЛИН

Композиції згідно з даним винаходом включають послідовності для нуклеотидних послідовностей пшениці, які були ідентифіковані як АКК кодуючі послідовності і які залучені до реакції рослин на дію АКК гербіцидів. Зокрема, даний винахід надає молекули виділених нуклеїнових кислот, що включають нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, показані в 5ЕО ІЮО МО: 5, 6, 7, 8 і 9. Надані також поліпептиди, що містять 60 амінокислотну послідовність, кодовану молекулою нуклеїнової кислоти, описаною в даному винаході, наприклад нуклеотидними послідовностями, показаними ЗЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 5 або 6.

Композиції згідно з даним винаходом можуть застосовуватися в різних способах, за допомогою яких білкові продукти можуть експресуватися в культурні рослини для функціонування як стійкі до гербіцидів білки. Така експресія приводить до альтерації або модулювання рівня, тканини або тривалості експресії для досягнення поліпшеної стійкості до

АКК гербіцидів. Композиції згідно з даним винаходом можуть експресуватися в ті ж види, з яких походить ацетил-КоА карбоксилаза, або, альтернативно, можуть експресуватися в будь-яку рослину, що представляє інтерес. У даному способі кодуюча послідовність для АКК може використовуватися в комбінації з промотором, який вводиться в культурну рослину. В одному варіанті здійснення винаходу може застосовуватися конститутивний промотор високого рівня експресії, що повинно приводити до високих рівнів експресії АКК. В інших варіантах здійснення винаходу кодуюча послідовність може оперативно зв'язуватися з тканиноспецифічним промотором для ініціювання експресії в рослинній тканині, яка, як відомо, має чутливість до АКК гербіцидів, такій як листя. Аналогічно може застосовуватися маніпуляція таймінгу експресії.

Наприклад, за допомогою розумного вибору промотора експресія може бути підвищена на ранній стадії росту рослини, коли рослина повинна бути чутлива до гербіцидної обробки.

У конкретних варіантах здійснення винаходу способи підвищення стійкості до дії гербіциду в рослині включають стабільне трансформування рослини з допомогою ДНК конструкта, що включає нуклеотидну послідовність згідно з винаходом, функціонально зв'язану з промотором, який стимулюють експресію в рослині.

Надані також трансформовані рослини, рослинні клітини, рослинні тканини і насіння.

Способи згідно з даним винаходом можуть застосовуватися з іншими способами, доступними в даній галузі техніки для поліпшення інших ознак в рослині. Зрозуміло, що такі інші нуклеотидні послідовності можуть застосовуватися для підвищення смислової і антисмислової орієнтації в залежності від бажаного результату.

Саме така надекспресія мутантних нуклеотидних послідовностей АКК (ЗЕО ІЮ МО: 4, 5 і/або б) була б переважним способом застосування мутантних нуклеотидних послідовностей. Різні переваги і недоліки застосування різних промоторів для стимулювання такої надекспресії добре відомі фахівцеві даної галузі техніки. Однак, наприклад, конститутивний промотор міг би

Зо стимулювати експресію, але більш ідеальним промотором був би промотор цільової тканини, такої як листя.

Послідовності згідно з даним винаходом, як більш детально обговорено нижче, включають кодуючі послідовності, антисмислові послідовності і їх фрагменти і варіанти. Експресія послідовностей згідно з даним винаходом може застосовуватися для модулювання або регулювання експресії відповідних АКК білків. Даний винахід включає виділені або по суті очищені композиції нуклеїнових кислот або білків.

Фрагменти і варіанти розкритих нуклеотидних послідовностей і білків, кодованих з їх допомогою, включені в галузь даного винаходу. Термін "фрагмент" означає частину нуклеотидної послідовності або частину амінокислотної послідовності і, отже, білка, що кодується з її допомогою. Фрагменти нуклеотидної послідовності можуть кодувати фрагменти білка, які зберігають біологічну активність природного білка, отже мають АКК-подібну активність і, таким чином, впливають на чутливість до гербіцидів. Альтернативно, фрагменти нуклеотидної послідовності, які можуть застосовуватися як зонди гібридизації, звичайно не кодують фрагменти білків, що зберігають біологічну активність. Таким чином, фрагменти нуклеотидної послідовності можуть містити від щонайменше приблизно 20 нуклеотидів, від приблизно 50 нуклеотидів, від приблизно 100 нуклеотидів і до нуклеотидної послідовності повної довжини, що кодує білки згідно з даним винаходом.

Фрагмент АКК нуклеотидної послідовності, який кодує біологічно активну частину АКК білка згідно з винаходом, буде кодувати від щонайменше 15, 25, 30, 50, 100, 150 або 250 зв'язаних амінокислот до повної кількості амінокислот, присутньої в білці повної довжини згідно з даним винаходом.

Нуклеотидні послідовності згідно з винаходом можуть застосовуватися для виділення відповідних послідовностей з інших організмів, зокрема з інших рослин, точніше з інших однодольних рослин. У цьому випадку способи, такі як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), гібридизація і т. п., можуть застосовуватися для ідентифікації таких послідовностей на основі їх гомології з послідовностями, що знаходяться в цих організмах. Послідовності, виділені на основі ідентичності таких послідовностей до повних АКК послідовностей, представлених в них, або до їх фрагментів, включені в об'єм даного винаходу. Такі послідовності включають послідовності, які є ортологами розкритих послідовностей. Термін "ортолог" означає гени, які отримані із бо звичайних анцестральних генів і які виявлені в інших видах як результат видоутворення. Гени,

виявлені в інших видах, вважаються ортологами, коли їх нуклеотидні послідовності і/або послідовності білків, що кодуються, виявляють по суті ідентичність, як визначено в даному описі. Функції ортологів часто є висококонсервативними серед видів.

У ПЛР підході олігонуклеотидні праймери можуть бути розроблені для застосування в ПЛР реакції для ампліфікації ДНК послідовностей з КДНК або геномних ДНК, витягнутих з будь-якої рослини, що представляє інтерес. Способи розробки ПЛР праймерів і ПЛР клонування добре відомі в даній галузі техніки і розкриті, наприклад, ЗатьгоокК (див. також Іппіз еї аї, еа5. (1990)

РСК РгоїосоІ5: А Сзціде о МещШтоаз апа Арріїсайоп5 (Асадетіс Ргеб55, Мем/ МогК); Іппіб5 апа

Сеапа, ед5. (1995) РСВ 5ігаієдієз (Асадетіс Ргевз5, Мем Мо); Іппіз апа СеМапа, едв. (1999)

РОСА Мейїйод5 Мапиаї! (Асадетіс Рге55, Мем Могк)). Відомі способи ПЛР включають, але без обмеження, способи, що використовують спарені праймери, вкладені праймери, єдині специфічні праймери, дегенеративні праймери, ген-специфічні праймери, вектор-специфічні праймери, частково помилково спарені праймери (рагііану-тізтаїснеа ргітегв) і т. п.

У методиках гібридизації вся відома нуклеотидна послідовність або її частина використовується як зонд, який селективно гібридизується з іншими відповідними нуклеотидними послідовностями, присутніми в популяції клонованих геномних ДНК фрагментів або кКДНК фрагментах (наприклад, геномних або кДНК бібліотеках). Зонди гібридизації можуть являти собою геномні ДНК фрагменти, кКДНК фрагменти, РНК фрагменти або інші олігонуклеотиди, і можуть бути помічені групою, що виявляється, такою як ЗР, або будь-яким іншим маркером, що виявляється. Таким чином, наприклад, зонди гібридизації можуть бути отримані за допомогою синтетичних полінуклеотидів, що вводять мітку на основі АКК послідовностей згідно з винаходом. Способи отримання зондів для гібридизації і конструкції

КДНК і геномних бібліотек загалом добре відомі в даній галузі техніки і описані в Хатьгоок.

Біологічна активність АКК поліпептидів (тобто, вплив на АКК гербіцидна відповідь) може бути оцінена способом, відомим в даній галузі техніки і описаним в даному винаході.

Послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом можуть бути експресовані в клітині-хазяїні, такій як клітини бактерій, дріжджів, комах, ссавців і, переважно, рослин.

Передбачається, що фахівцям в цій галузі техніки добре відомі численні системи експресії, доступні для експресії нуклеїнової кислоти, що кодує білок згідно з даним винаходом. Не буде

Зо зроблено ніяких спроб детально описати різні способи, відомі для експресії білків в прокаріотах і еукаріотах.

Послідовності згідно з даним винаходом надані в експресійних касетах або ДНК конструктах для експресії в рослинах, що представляють інтерес. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, призначений для спільної трансформації в організм.

Альтернативно, додатковий) ген(и) може(жуть) бути наданий) на касетах множинної експресії.

Така касета експресії надана з безліччю сайтів рестрикції для вставки АКК послідовності з транскрипційною регуляцією регуляторними областями. Касета експресії може додатково містити селектовані маркерні гени.

Експресійна касета може включати в 5-3 напрямку транскрипції область ініціювання транскрипції (тобто промотор), область ініціювання трансляції, полінуклеотид згідно з винаходом, область завершення трансляції і, необов'язково область завершення транскрипції в організмі-хазяїні. Регуляторні області (тобто промотори, області регулювання транскрипції і області термінації трансляції) і/або полінуклеотид згідно з винаходом можуть бути природними/аналогічними клітині-хазяїну або один одному. Альтернативно, регуляторні області іабо полінуклеотид згідно з винаходом можуть бути гетерологічними клітині-хазяїну або один одному.

Хоч може бути переважно експресувати послідовності з використанням гетерологічних промоторів, можуть використовуватися і природні промоторні послідовності. Такі конструкти повинні змінювати рівні експресії АКК в клітині-хазяїні (тобто рослині або рослинній клітині).

Таким чином, фенотип клітини-хазяїна (тобто рослини або рослинної клітини) змінюється.

Область термінації може бути "рідною" області ініціювання транскрипції, може бути "рідною" оперативно зв'язаній ДНК послідовності, що представляє інтерес, або може походити з іншого джерела. Традиційні області термінації доступні з Ті-плазміди А. іштегасієп5, таких як області термінації октопінсинтази і нопалінсинтази. Див. також сиегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. СЗепеї. 262: 141-144; Ргоцагтої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп єї а). (1991) Сепев5 Юеєум. 5: 141-149;

Модеп есеї а!. (1990) Ріапі Сеї! 2: 1261-1272; Мипгоє сеї а. (1990) Сепе 91: 151-158; ВаїІаз вї аї. (1989) Мисієїс Асіа5 Нев. 17:7891-7903; апа довні єї а. (1987) Мисівєїс Асіа Не. 15:9627-9639.

Коли прийнятно, ген(и) може(жуть) оптимізуватися для підвищеної експресії в трансформованій рослині. Тобто, гени можуть синтезуватися з використанням рослина- 60 переважних кодонів для поліпшеної експресії. Вказані способи доступні в даній галузі техніки для синтезування рослина-переважних генів. Див., наприклад Патенти США МоМо 5380831 і 5436391 і Мигтау еї а. (1989) Мисіевїс Асіаб5 Кев. 17:477-498, зміст яких введений в даний опис у всій повноті у вигляді посилання.

Додаткові модифікації послідовностей, як відомо, посилюють експресію гену в клітинному хазяїні. Вони включають елімінацію послідовностей, що кодують помилкові сигнали поліаденілювання, сигнали сайтів сплайсингу екзон-інтрон, транспозон-подібні повтори, і інших подібних добре відомих послідовностей, які можуть бути шкідливими для експресії генів. (5-С зміст послідовності може бути доведений до рівнів, середніх для даного клітинного хазяїна, які розраховані для відомих генів, експресованих в клітині-хазяїні. Коли це можливо, послідовність модифікується, щоб уникнути передбачених повторних структур мРНК у вигляді петлі ("шпильки").

Касети експресії можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності в конструкті експресійної касети. Такі лідерні послідовності можуть діяти, посилюючи трансляцію. Лідери трансляції відомі в даній галузі і включають пікорнавірусні лідерні послідовності, наприклад ЕМСМ лідер (енцефаломіокардит 5'-некодуюча область) (ЕіІгоу-єїеїп єї аІ. (1989) РМАБ5 ОБА 86:6126-6130); потівірусні лідерні послідовності, наприклад ТЕМ лідерна послідовність (послідовність вірусу гравіювання тютюну - Тобассо Еїсп Мігив) (АїйїбБоп еї аіЇ. (1986) Мігоюду 154:9-20); і людський білок, що зв'язує важкий ланцюг імуноглобулінів (ВіР), (Масе)ак еї аї. (1991) Маїиге 353:90-94); лідерна послідовність мРНК білка оболонки, що не транслюється, вірусу мозаїки люцерни (АММ

АМА 4) (об Іїпу еї аї. (1987) Маїште 325:622-625); лідерна послідовність вірусу тютюнової мозаїки (ТММ (Саїйе еї аї. (1989) іп МоїІесшаг Віоіоду ої КА, ей. Сесп (Гіз5, Мем МогК), рр. 237- 256); лідерна послідовність вірусу хлоротичної плямистості кукурудзи (МСМУ) (Готтеї! еї аї. (1991) Мігоіїоду 81: 382-385). Див. також ОеїПа-Сіорра єї аї. (1987) Ріапі РНузіої. 84:965-968.

Можуть використовуватися і інші відомі способи підвищення транскрипції.

При підготовці екпресійної касети можна маніпулювати різними фрагментами ДНК таким чином, щоб забезпечити послідовності ДНК в належній орієнтації і, коли це підходить, в належній рамці зчитування. З цією метою можуть використовуватися адаптери або лінкери для об'єднання фрагментів ДНК, або можуть залучатися інші маніпуляції для забезпечення зручних сайтів рестрикції, видалення непотрібної ДНК, видалення сайтів рестрикції або т. п. Для цього

Зо можуть використовуватися іп міго мутагенез, репарація праймерів, рестрикція, відновлення заміщень, наприклад можуть задіятися транзиції і трансверсії.

Звичайно експресійні касети будуть включати селектований маркерний ген для селекції трансформованих клітин. Селектовані маркерні гени використовуються для відбору трансформованих клітин або тканин. Гени-маркери включають гени, що кодують стійкість до антибіотиків, такі як гени, що кодують неоміцинфосфотрансферазу І (МЕС) і гігроміцинфосфотрансферазу (НРТ), а також гени, що надають стійкості до гербіцидних сполук, таких як глюфосинат, гліфосат, амоній, бромоксиніл, імідазолінони і 2,4-дихлорофеноксіацетат (2,4-О0). Див. Маітапіоп (1992) Си. Оріп. Віотесп. 3:506-511; СпгізюрнНег!зоп еї аї. (1992) Ргос.

Май. Асад. сі. ОБА 89:6314-6318; Мао єї а!. (1992) Сеї! 71: 63-72; Вегпікоїї (1992) Мої. Місгобіо!. 6:2419-2422; Ваткієу єї аї. (1980) іп Те Орегоп, рр. 177-220; Ни еї аї. (1987) Сеї! 48:555-566;

Вгомлп вї а). (1987) Сеї! 49:603-612; Рідде єї а!. (1988) Сеї! 52:713-722; ОєизснНіє єї а!. (1989) Ргос.

Май. Асад. Асі. ОБА 86:5400-5404; ЕРиеєгві еї а). (1989) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 86:2549-2553;

Реизсеніе еї аї. (1990) бсіепсе 248:480-483; Совзвзеп (1993) РИ.О. Тнезів, Опімегейу ої Неїдеїбега;

АВвіпез єї аї. (1993) Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА 90: 1917-1921; І аром/ еї а). (1990) Мої. Се. Віої. 10:3343-3356; 7атргенйі єї аї. (1992) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 89:3952-3956; Ваїтп еї а)ї. (1991)

Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 88:5072-5076; Мурогзкі єї аї. (1991) Мисівіс Асідз Вез. 19:4647-4653;

Ніїепапа-м/ізвтап (1989) Торіс5 Мої. 5ігис. Віої. 10: 143-162; Оедепкоїбр еї а!. (1991) Апіїтісгоб.

Адепів Спетоїйег. 35: 1591-1595; КієїнзсНпіаї еї аї. (1988) Віоспетівігу 27: 1094-1104; Вопіп (1993) РИ.О. Тневів, Опімегейу ої НеїдеІрегу; Сов5еп єї аї. (1992) Ргос. Май). Асад. осі. ОБА 89:5547-5551; Оїїма еї аї. (1992) Апійтістор. Адепів Спетоїпег. 36:913-919; Ніамка єї аї. (1985)

Напаросок ої Ехрегітепіа! Ріпаптасоїіоду, Мої. 78 (Зрііпдег/-Мепад, Вепіп); СІ! еї а). (1988) Маїшйге 334:721-724; і МО Публікація Мо 02/36782. Зміст вказаних публікацій включений в даний опис у вигляді посилання.

Наведений вище список вибираних маркерних генів не є обмеженням. Будь-який селектований маркерний ген може використовуватися згідно з даним винаходом.

Ряд промоторів може використовуватися при практичному застосуванні даного винаходу.

Промотори можуть вибиратися виходячи з бажаного результату. Тобто нуклеїнові кислоти можуть об'єднуватися з конститутивними, тканинопереважними або іншими промоторами для експресії в клітині-хазяїні, що представляє інтерес. Такі конститутивні промотори включають, бо наприклад, коровий промотор Кзуп/7 (УМО 99/48338 і Патент США Мо 6072050); коровий промотор 355 Саму (саеї! еї а. (1985) Маїиге 313:810-812); промотор актину рису (МеЕіІгоу еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:163-171); промотор убіквітину (Спгіхстепзеп еї аї. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12:619- 632 і Спгібїепзеп еї аї. (1992) Ріапі Мої. ВіоїІ. 18:675-689); промотор РЕМИ (Гаві еї аї. (1991)

ТАиеог. Аррі. Сепеї. 81:581-588); промотор МАЗ (МейМеп еї аІ. (1984) ЕМВО 3. 3:2723-2730); промотор АЇЗ (Патент США Мо 5659026) і т. п. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, промотори, описані, в патентах США 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463 і 5608142.

Ї так само, як експресія АКК поліпептидів згідно з даним винаходом може бути націлена на конкретні рослинні тканини або типи клітин через використання відповідних промоторів, вона також може бути направлена на різні місцеположення всередині клітини за допомогою націлювальної інформації або "націлювальних міток". На відміну від промотору, який діє на рівні транскрипції, така націлювальна інформація є частиною продукту вихідної трансляції. В залежності від способу інфекції патогену або метаболічної функції тканини або клітинного типу, місцеположення білка в різних компартментах клітини може зробити його білош ефективним проти даного патогену або зробити його таким, що приносить менші перешкоди функції клітини.

Наприклад, можна отримати білок, що передує сигнальному пептиду, який направляє трансляцію продукту в ендоплазматичний ретикулум шляхом включення в конструкт (тобто експресійну касету) послідовностей, що кодують сигнальний пептид (такі послідовності можуть також називатися "сигнальними послідовностями"). Сигнальна послідовність, що використовується, може являти собою, наприклад, послідовність, пов'язану з геном, що кодує поліпептид, або вона може бути взята з іншого гену.

Існує велика кількість сигнальних пептидів, які описані в літературі, і вони значною мірою є взаємозамінними (Каїкпе! М., Спгізрееі5 М.9У. (2000) Ргоївіп зопіпд апа мебзісіє їгайіс. Іп В.

Виснапап, МУ. Стиівбвет, В. Щдопевз, ейв5., Віоспетівігу апа Моїіесшціаг Віоіоду ої Ріапів. Атегісап зЗосієїу ої Ріапі Рпузіоіодіві5, ВНоскКміПє, Ма., рр. 160-201, зміст вказаної публікації введений в даний опис у вигляді посилання). Додавання сигнального пептиду буде приводити до трансляційного продукту, що поступає в ендоплазматичний ретикулюм (в процесі чого сигнальний пептид сам видаляється з поліпептиду), але кінцеве внутрішньоклітинне місцеположення білка залежить і від інших чинників, якими можна маніпулювати для отримання

Зо місцеположення, найбільш прийнятного для патогену і клітинного типу. Шлях "за умовчанням", тобто шлях, прийнятий поліпептидами, якщо не включені ніякі інші націлювальні мітки, приводить до секреції поліпептиду через клітинну мембрану (Каїкпе! і Спгізрееї, зирга) в апопласт. Апопласт являє собою область поза системою плазматичної мембрани і включає в себе клітинні стінки, міжклітинні простори і судини ксилеми, що створюють безперервну проникну систему, через яку можуть рухатися вода і розчинені речовини.

Метод трансформації/трансфекції не є критичним для даного винаходу; різні методи трансформації або трансфекції доступні в даний час. По мірі появи нових методів для перетворення культур або інших клітин-хазяїнів ці нові методи також можуть застосовуватися.

Таким чином, широкий спектр методів був розроблений для вставки послідовності ДНК в геном клітини-хазяїна з метою отримання транскрипції і/або трансляції послідовності для впливу на фенотипічні зміни в організмі. Таким чином, може застосовуватися будь-який метод, який забезпечує ефективну трансформацію/трансфекцію.

Протоколи трансформації, а також протоколи введення нуклеотидних послідовностей в рослинах можуть змінюватися в залежності від виду рослин, тобто однодольних або дводольних, або рослинних клітин, що підлягають трансформації. Прийнятні способи введення нуклеотидних послідовностей в рослинні клітини і подальшої вставки в геном рослини включають мікроін'єкції (Сто55улау еї аї. (1986) Віоїесппіднев5 4:320-334), електропорації (Кіддв еї а!І. (1986) Ргос. Маї). Асад. осі. ОБА 83:5602-5606), агробактеріальну трансформацію (Томпзепа еї аІ,, Патент США Мо 5563055, 2пао еї аІ.,, Патент США Мо 5981840), пряме перенесення гену (Раз2Кому5Кі єї аі. (1984) ЕМВО 3. 3:2717-2722), і "балістичне" прискорення частинок (див., наприклад, Запіога еї а. Патент США Мо 4945050; Тотез еї аї!. (1995) "Сігтесї ОМА Ттапвтег іпіо

Іптїасі Ріапі Сеїїє міа Місгоргоіесійє Вотрагатепі", іп Ріапі СеїЇ, Тізвиє, апа Огдап Сийиге:

Ейпдатепіа! Меїпосдз, са. Сатьрогу апа РНйїрев (Зргіпдег-Мепаяа, Вепіп); МеСабре еї аї. (1988)

ВіоїесппоЇоду 6:923-926). Див. також Уеїіззіпдег еї а!. (1988) Апп. Кеум. Сепеї. 22:421-477; Заптога еї а. (1987) Рапісціайїе 5сієпсе апа Тесппоіоду 5:27-37 (опіоп); СНгівіои еї а)ї. (1988) Ріапі РНузіо!. 87:671-674 (зоубеап); МеСаре єї а. (1988) Віо/Гесппоіоду 6:923-926 (зоуреєап); Ріпег апа

МеМиїеп (1991) Іп міо СеїЇ Оєм. Віої. 27Р: 175-182 (зоубеап); 5іпоп еї а. (1998) Тнеог. Аррі.

Сепеї. 96:319-324 (воуреап); баца еї аї!. (1990) Віотесппоіоду 8:736-740 (пісе); Ківїіп єї а!. (1988)

Ргос. Май. Асад. осі. ОБА 85:4305-4309 (таїіеє); Ківїп єї аІ. (1988) Віоїесппоіоду 6:559-563 60 (таіге); Тоте5, Патент США Мо 5240855; Виїзіпуд еї аі. Патенти США МоМо 5322783 і 5324646;

КіІвїп сеї аї. (1988) Ріапі Рпузіо!. 91: 440-444 (таіге); Еготт еї аї. (1990) Віоїесппоіоду 8:833-839 (таїге); Носукааз-Мап 5іодієгеп еї аї!. (1984) Майшге (І опаоп) 311: 763-764; Вутерієвг еї а!. (1987)

Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 84:5345-5349 (І Масеає); Оє МУеї єї аЇ. (1985) іп Тне Ехрегітепіа)!

Мапіршіайоп ої Омціе Тіб5це5, ва. Спартап еї аї. (Гопдтап, Мем мок), рр. 197-209 (роїІеп);

Каеррієг єї аї. (1990) Ріапі СеїЇ Верогів 9:415-418; Каеррієг єї аї. (1992) ТНнеог. Аррі. Сепеї. 84:560-566 (улпівзКег-тедіаїед ігапетоптаїййоп); О'Наїйніп еї аї. (1992) Ріапі СеїЇ 4: 1495-1505 (єІесігорогаїоп); Гі еї а. (1993) Ріапі Сеї! ВРерогів 12:250-255; Співи апа Рога (1995) Аппаї!5 ої

Воїапу 75:407-413 (гісе); Ов5іода єї а). (1996) Маїште Віоїесппоіоду 14:745-750 (таї;е міа

АдгоБрасієгішт їшптегасіепв); які введені в даний опис у вигляді посилань.

З клітин, які були трансформовані, можуть бути вирощені рослини згідно з звичайними способами. Див., наприклад, МеоСоптіск еї а. (1986) Ріапі СеїЇ Керогіб5 5:81-84. Ці рослини можна вирощувати і запилювати такою ж трансформованою лінією або іншими лініями і ідентифікувати гібриди з конститутивною експресією потрібної фенотипічної ознаки. Два або більше поколінь можуть бути вирощені для гарантії того, що конститутивна експресія потрібної фенотипічної ознаки стабільно підтримується і успадковується, а потім збирають насіння для забезпечення конститутивної експресії потрібної фенотипічної ознаки. Фахівцеві буде зрозуміло, що після того, як рекомбінантна експресійна касета стабільно введена в трансгенні рослини і підтверджено, що є діючою, вона може вводитися в інші рослини шляхом статевого схрещування (зехца! сго55іпд). Будь-яка методика з числа стандартних методик може бути використана в залежності від виду, що підлягає схрещуванню.

У культурах, що вегетативно розмножуються, зрілі трансгенні рослини можна розмножувати живцями або методами культури тканин для отримання безлічі ідентичних рослин. Проводять відбір бажаних трансгенних рослин і нові сорти отримують і розмножують вегетативно для комерційного застосування. У культурах, що розмножуються насінням, зрілі трансгенні рослини можуть бути піддані самосхрещуванню для отримання гомозиготних інбредних рослин.

Інбредна рослина виробляє насіння, що містить наново введену гетерологічну нуклеїнову кислоту. Це насіння можна вирощувати для отримання рослин, які будуть відтворювати вибраний фенотип.

Частини, отримані з регенерованої рослини, такі як квіти, насіння, листя, гілки, плоди і т. п.,

Зо включені у винахід при умові, що ці частини включають клітини, що містять виділену нуклеїнову кислоту згідно з даним винаходом. Потомство і варіанти, а також мутанти регенерованих рослин також включені в об'єм даного винаходу, при умові, що ці частини включають введені послідовності нуклеїнових кислот.

Переважний варіант здійснення даного винаходу являє собою трансгенну рослину, яка є гомозиготною для доданої гетерологічної нуклеїнової кислоти; тобто трансгенна рослина, яка містить дві додані послідовності нуклеїнових кислот, один ген в тому ж локусі на кожній хромосомі з пари хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути отримана шляхом статевого схрещування (самозапилення) гетерозиготної трансгенної рослини, яка містить єдину додану гетерологічну нуклеїнову кислоту, вирощуванням деяких з отриманого насіння і аналізом рослин, отриманих для зміненої експресії полінуклеотиду згідно з даним винаходом відносно контрольної рослини (тобто, природної, нетрансгенної рослини). Зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенною рослиною також розглядаються.

Даний винахід може застосовуватися для трансформації рослин будь-яких видів, включаючи, але без обмеження, однодольні і дводольні рослини. Приклади рослин, що представляють інтерес, включають, але без обмеження, наступні: кукурудза (7еа Маубх), капустові рослини (Вгабззіса 5р.) (наприклад, В. пари5, В. гара, В. |псеа), особливо ті, які застосовуються як джерела рослинної олії, люцерна (Медісадо зЗаїїма), рис (Огула Заїїма), жито (Зесаіе Сегеаїє), сорго (Зогоапит бБісоїог, зЗогапит миЇдаге), просо (наприклад, пеннісетум сизий (Реппізеїшт діаийсит), просо посівне (Рапісцт піййасешцйт), мишій італійський (Зеїагіа йаїса), токуса або коракан (ЕІеибзіпе согасапа)), соняшник (НеїЇїапіпи5 Аппии5), сафлор красильний (Саппативзх (псіогіиє), пшениця м'яка (Тгйісцт аевзіїмит), соя культурна (Сіусіпе тах), тютюн звичайний (Місоїйапа їарасит), картопля (Зоїапит Тирегозит), арахіс (Агаспі5 ПпПуродаеа), бавовник (сСо55урішт Баградепзе, сСо55урішйт Нігєшит), батат або солодка картопля (Іротоєа раїас5), маніок (Мапіпої езсшепіа), кава (СопПеа 5рр.), кокос горіхоносний (Сосо5 писітега), ананас чубатий (Апапаз сото5зив5), цитрусові дерева (Сіїги5 5рр.), какао (ТПпеобгота сасао), чай (Сатеї|а в5іпепві5), банан (Миза 5рр.), авокадо або персея американська (Регхеа атегісапа), інжир або фікус карійський (Ріси5 савіса), гуава або псидіум гуйява (Рзіаішт диа)зама), магніфера індійська (манго) (Мапоїтега іпаіса), олива європейська (ОїІєа еигораєа), папайя (Сагіса рарауа), бо кешю (анакардіум західний) (Апасагдішт оссідепіаіє), макадамія (Масадатіа іпедкгігоїа),

мигдаль (Ргипи5 атудаа!ц5), цукровий буряк (Веїа миїдагіх), цукрова тростина (Засспагит з5рр.), овес (Амепа 5аїїма), ячмінь (Ногдешт мцідаге), овочеві культури, декоративні рослини і дерева хвойних порід.

Овочеві культури включають томати (І усорегзісоп ЕзсшШепіит), салат (наприклад, І асіиса займа), квасолю звичайну (Рпазеоїи5 миїЇдагіз), квасолю лимську (Рпазеоїи5 Ійптепвів), горох (Гашуги5 5рр.), і представників роду Сиситів, такі як огірок звичайний (С. заїйми5), диня звичайна (канталуп) (С. сапіаІшрепвів) і диня столова (С. теї!о). Декоративні рослини включають чагарник рододендрон (КПпододепагоп 5рр.), гортензію великоквіткову (МасгорпуїПа Ппуагапдеа), гібіскус китайський (Нібізси5 гозазапепвів), троянди (Коза 5РР.), тюльпани (Тиїїра 5рр.), нарциси (Магсіззи5 5рр.), петунію гібридну (Рейшпіа Ппубгіда), гвоздику садову (Оіапіпих5 сагуорпуїнв5), молочай найпрекрасніший або пуансетію найпрекраснішу (Ешрпогріа риЇспегтіта) і хризантему (Спгузапіпетит). Хвойні дерева, які можуть використовуватися в практиці даного винаходу, включають, наприклад, сосни, такі як сосна ладанна (Ріпиз (аєда), сосна Елліона (Ріпизв еїПіоїйї), сосна жовта (Ріпиз ропаегоза), сосна скручена (Ріпи5 сопіога) і сосна промениста (Ріпи5 гадіада); псевдотсугу Мензіса (Рзхецдоїзида тепліеєві), тсугу канадську (Т5/ида сападепвів); ялину канадську (Рісеа діаиса); секвою вічнозелену (або червоне дерево) (Зедиоіа зетрегмігеп5); ялиці справжні, такі як ялиця миловидна (Абіез атабіїв) і ялиця бальзамічна (Абієз5 раізатеа); і туї і кипариси, такі як туя складчаста (Тпціа ріїсага) і кипарис нутканський (Спатаесурагів пооїКаїепзії). Переважно, рослини згідно з сучасним являють собою рослини сільськогосподарських культур (наприклад, кукурудзу, люцерну, соняшник, капусту, сою, бавовник, соняшник, арахіс, сорго, пшеницю, ячмінь, рис, просо, тютюн і т. д.).

Прокаріотичні клітини можуть бути використані як хазяїни для експресії. Прокаріоти найчастіше представлені різними штамами кишкової палички Е.соїї, однак можуть також використовуватися і інші мікробні штами. Прокаріотичні контрольні послідовності, що звичайно використовуються, які визначені в даному описі для включення промоторів ініціації транскрипції, необов'язково з оператором, нарівні з рибосомними зв'язувальними послідовностями включають такі промотори, що звичайно використовуються, як бета-лактамазні (пеніциліназа) і лактозні (ас) промоторні системи (Спапдо еї аї. (1977) Маїшге 198: 1056), триптофанові (ігр) промоторні системи (сСоедавеї еї аї. (1980) Мисівїс Асіах Ке5. 8:4057), а також лямбда-похідний

Зо РІ. промотор і М-генний рибосомний сайт зв'язування (Зпітаїаке і інш. (1981) Маїшге 292:128).

Приклади маркерів селекції для Е.соїї, включають, наприклад, гени, що задають стійкість до ампіциліну, тетрацикліну або хлорамфеніколу.

Вектор вибирають таким чином, щоб дозволити здійснити введення у відповідну клітину- хазяїна. Бактерійні вектори, як правило, походять з плазміди або фагу. Прийнятні бактерійні клітини інфікують частинками фагового вектора або трансфікують голою ДНК фагового вектора.

Якщо використовується плазмідний вектор, бактерійні клітини трансфікуют ДНК плазмідного вектора. Системи експресії для експресії білка згідно з даним винаходом доступні при використанні Васійи5 5р. і заітопеїІа (Раїма єї аІ. (1983) Сепе 22:229-235 апа Мозбраснп е6ї аї. (1983) Маїшге 302:543-545).

Різноманітність еукаріотичних систем експресії, таких як дріжджі, клітинні лінії комах, клітини рослин і ссавців, відомі фахівцям даної галузі. Як стисло пояснено нижче, полінуклеотид згідно з даним винаходом може експресуватися в цих еукаріотичних системах. У деяких варіантах здійснення даного винаходу трансформовані/трансфіковані клітини рослин, як обговорюється нижче, використовуються як система експресії для отримання білків згідно з даним винаходом.

Такі протимікробні білюи можуть використовуватися для будь-якого застосування, включаючи покриття поверхонь цільових мікробів. У цьому випадку цільові мікроби включають людські патогени або мікроорганізми.

Синтез гетерологічних нуклеотидних послідовностей в дріжджах добре відомий. Публікація: зЗпептап, Р., еї аї. (1982) Меїподз іп МУеазі Сепеїїс5, Соїд Зрііпад Нагбог І арогаїогу - є добре відомою роботою, в якій описуються різні методи, які можуть використовуватися для отримання білка в дріжджах. Двома видами дріжджів, що широко використовуються для виробництва еукаріотичних білків, є Засспаготусев сегемівзіає і Ріспіа Равіогіх. Вектори, штами і методики експресії в Засспаготусев і Ріспіа відомі в даній галузі і доступні з комерційних джерел (наприклад, Іпмійгодеп). Прийнятні вектори, як правило, містять послідовності контролю експресії, такі як промотори, включаючи 3-фосфогліцераткінази або спиртову оксидазу, а також джерело (точку початку) реплікації, послідовності термінації і т. п., як це потрібно.

Білок згідно з даним винаходом відразу після експресування може бути виділений з дріжджів шляхом лізису клітин і застосуванням стандартних методів виділення білка в лізатах.

Моніторинг процесу очищення здійснюється за допомогою методик Вестерн-блот-аналізу бо (М/еєтет Біо), радіоїмуноаналізу або інших стандартних методів імуноаналізу.

Нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом можуть також застосовуватися в смисловій орієнтації для пригнічення експресії ендогенних генів в рослинах. Методи пригнічення генної експресії в рослинах з використанням нуклеотидних послідовностей в смисловій орієнтації добре відомі в даній галузі техніки. Методи звичайно включають трансформацію рослин з допомогою ДНК конструкту, що включає промотор, який стимулює експресію в рослині і оперативно зв'язаний щонайменше з частиною нуклеотидної послідовності, яка відповідає транскрипту ендогенного гену. Звичайно така нуклеотидна послідовність має по суті ідентичність до послідовності транскрипту ендогенного гену, переважно більше ніж приблизно 65 95 ідентичність послідовності, більш переважно більше ніж приблизно 85 95 ідентичність послідовності, найбільш переважно більш ніж приблизно 95 95 ідентичність послідовності. Див.

Патенти США МоМо 5283184 і 5034323, які введені в даний опис у вигляді посилання.

Даний винахід також стосується способу модуляції (тобто збільшення або зменшення) концентрації або композиції поліпептидів згідно з даним винаходом в рослині або її частині.

Збільшення або зменшення концентрації і/або зміна композиції поліпептидів в рослині може впливати на модуляцію. Наприклад, збільшення частки поліпептидів згідно з винаходом відносно природних поліпептидів може впливати на модуляцію. Цей спосіб включає введення полінуклеотиду згідно з даним винаходом в рослинну клітину з рекомбінантною експресійною касетою, як описано вище, для отримання трансформованих рослинних клітин, вирощування трансформованої рослинної клітини при відповідних умовах росту і індукцію або пригнічення експресії полінуклеотиду згідно з даним винаходом в рослині протягом часу, достатнього для модуляції концентрації і/або композиції поліпептидів в частині рослини або рослинного.

Підвищення активності і/або рівня АКК поліпептиду

Надані способи підвищення активності і/або рівня мутантних АКК поліпептидів для підвищення стійкості до АКК гербіцидів. Підвищення рівня і/або активності АКК мутантного поліпептиду може бути досягнуте за допомогою надавання рослині АКК поліпептиду.

Поліпептид може бути наданий шляхом введення мутантного АКК поліпептиду в рослину, введення в рослину нуклеотидної послідовності, що кодує мутантний АКК поліпептид, або, альтернативно, шляхом зміни геномного локусу, що кодує АКК поліпептид згідно з винаходом.

Як обговорювалося в даному винаході, в даній галузі техніки відома велика кількість

Зо способів надавання поліпептиду в рослину, включаючи, але без обмеження, пряме введення поліпептиду в рослину, введення в рослину (тимчасово або стабільно) полінуклеотидного конструкту, що кодує поліпептид, що має підвищену АКК активність. Визнано також, що в способах згідно з даним винаходом може використовуватися полінуклеотид, який не здатний направляти в трансформованій рослині експресію білка або РНК. Таким чином, рівень і/або активність АКК мутантного поліпептиду можуть бути підвищені видозміною гену, що кодує мутантний АКК поліпептид або його промотор. Див., наприклад, Кітіес, Патент США Мо 5565350; 2гапіпд еї ам. РСТ/О593/03868. Отже, надані мутагенізовані рослини, які несуть мутації в АКК генах, де мутації підвищують експресію мутантного АКК гену АКК або підвищують активність поліпептиду, що кодується.

Зниження активності і/або рівня АКК поліпептиду

Надані також способи зниження або усунення активності АКК поліпептиду трансформацією рослинної клітини за допомогою експресійної касети, яка експресує полінуклеотид, що інгібує експресію АСС. Полінуклеотид може інгібувати експресію АКК напряму, шляхом запобігання транскрипції або трансляції месенджерної РНК АКК синтази, або опосередковано, кодуванням поліпептиду, яким інгібує транскрипцію або трансляцію АКК гену, що кодує АКК поліпептид.

Способи інгібування або усунення експресії гену в рослині добре відомі в даній галузі техніки, і в даному винаході для інгібування експресії АКК поліпептиду може використовуватися будь-який такий спосіб. Для зменшення або усунення активності поліпептиду АКК синтази може використовуватися безліч способів. Крім того, декілька способів можуть використовуватися для зниження активності єдиного АКК поліпептиду. 1. Способи на основі полінуклеотиду:

У деяких варіантах здійснення даного винаходу рослина трансформується експресійною касетою, здатною експресувати полінуклеотид, який інгібує експресію поліпептиду АКК синтази згідно з винаходом. Термін "експресія", коли використовується в даному описі, стосується біосинтезу генного продукту, включаючи транскрипцію і/або трансляцію вказаного генного продукту. Наприклад, для цілей даного винаходу експресійна касета, здатна експресувати полінуклеотид, який інгібує експресію щонайменше одного поліпептиду АКК синтази, являє собою експресійну касету, здатну продукувати молекулу РНК, яка інгібує транскрипцію і/або трансляцію щонайменше одного поліпептиду АКК синтази згідно з даним винаходом. Термін бо "експресія" або "продукування" білка або поліпептиду з молекули ДНК стосується транскрипції і трансляції кодуючої послідовності для отримання білка або поліпептиду, тоді як термін "експресія" або "продукування" білка або поліпептиду з молекули РНК стосується трансляції

РНК кодуючої послідовності для продукування білка або поліпептиду.

Приклади полінуклеотидів, які інгібують експресію поліпептиду АКК синтази включають смислову супресію/косупресію, де експресійна касета призначена для експресії молекули РНК, що відповідає всій або частині месенжерної РНК, що кодує АКК синтазний поліпептид в "смисловій" орієнтації, і через експресію молекули РНК може приводити до зниження експресії природного гену; антисмислову супресію, де експресійна касета призначена для експресії молекули РНК, комплементарної до всієї або частини РНК, що кодує АКК синтазний поліпептид і через експресію антисмислової РНК молекули може приводити до зниження експресії природного гену; інтерференцію дволанцюжкової РНК, де молекула смислової РНК, подібна описаній вище для співсупресії і антисмисловій молекулі РНК, яка повністю або частково комплементарна молекулі смислової РНК, експресована в тій же самій клітині, що приводить до інгібування експресії відповідної ендогенної месенжерної мРНК, "шпилькову" РНК інтерференцію і інтрон-вмісну "шпилькову" РНК-інтерференцію, де експресійна касета призначена для експресії молекули РНК, яка самогібридизується для утворення структури шпильки, яка включає область одноланцюжкової петлі і стовбур спареної основи; малу інтерферуючу РНК або мікро РНК, де експресійна касета призначена для експресії молекули

РНК, яка змодельована по ендогенному гену тіРНК. 2. Інгібування експресії гену на основі поліпептиду

В одному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид кодує білок "цинковий палець", який зв'язується з геном, що кодує АКК поліпептид, приводячи до зниження експресії гену. Методи відбору ділянок для націлення за допомогою білка "цинковий палець" були описані, наприклад, в Патенті США Мо 6453242, а методи застосування білків "цинковий палець" для інгібування експресії генів в рослинах описані, наприклад, в Патентній публікації США Мо 2003/0037355, де вказані патенти включені в даний опис у вигляді посилання. 3. Інгібування активності білка на основі поліпептиду

У деяких варіантах здійснення винаходу полінуклеотид кодує антитіло, яке зв'язується щонайменше з однією АКК і знижує активність поліпептиду АКК синтази. Експресія антитіл в

Зо рослинних клітинах і інгібування молекулярних шляхів за допомогою експресії і зв'язування антитіл з білками в рослинних клітинах добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, публікацію Сопгай апа боппеууаїд, (2003) Маїцге Віоїесп. 21: 35-36, яка включена в даний опис у вигляді посилання. 4. Розрив гену

У деяких варіантах здійснення даного винаходу активність поліпептиду АКК синтази знижена або усунена шляхом розриву гену, що кодує поліпептид АКК синтази. Ген, що кодує поліпептид

АКК синтази, може бути зруйнований будь-яким способом, відомим в даній галузі. Наприклад, в одному варіанті здійснення винаходу ген зруйнований за допомогою мічення транспозону. В іншому варіанті здійснення винаходу ген зруйнований за допомогою мутагенезу рослин з використанням випадкового або направленого мутагенезу і відбором рослин, що мають знижену

АКК активність.

У деяких варіантах здійснення винаходу послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом можуть бути зібрані з будь-якою комбінацією полінуклеотидних послідовностей, що представляють інтерес для створення рослин бажаного фенотипу. Наприклад, полінуклеотиди згідно з даним винаходом можуть бути укладені з будь-якими іншими полінуклеотидами згідно з даним винаходом (5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 4, 5 або 6) або з іншими генами, залученими до стійкості до гербіцидів. Комбінації, що генеруються, також можуть включати безліч копій будь-якого одного з полінуклеотидів, що представляють інтерес. Полінуклеотиди згідно з даним винаходом також можуть бути укладені з будь-яким іншим геном або будь-якою комбінацією генів для отримання рослин з безліччю різних комбінацій бажаних ознак, включаючи, але без обмеження, ознаки, бажані для годування тварин, таких як високий вміст олійних генів (наприклад, Патент

США Мо 6232529); збалансований вміст амінокислот (наприклад, гордотіонінів (патенти США

МоМо 5990389; 5885801; 5885802 і 5703409)); ячмінь з високим вмістом лізину (ММІПШатвгоп еї аї. (1987) Єик. У. Віоспет. 165:99-106; ії УМО 98/20122), а також високометіонінові білки (Редегзеп еї а!. (1986) У. Віої. Спет. 261:6279; КінНага евї а!. (1988) Сепе 71:359; Мизитига еї аї. (1989) Ріапі

Мої. Віої. 12:123))) підвищена перетравлюваність (наприклад, модифіковані білки, що накопичуються (тодійеа 5іогаде ргоїеіп5) (Заявка на Патенті США Сер. Мо 10/053410, заявлена 7 листопада 2001 року)); і тіоредоксини (Заявка на Патент США Сер. Мо 10/005429, заявлена З грудня 2001); де зміст представлених вище публікацій включений в даний опис у вигляді (516) посилання.

Полінуклеотиди згідно з даним винаходом також можуть бути укладені з ознаками, бажаними для стійкості до комах, захворювань або гербіцидів (наприклад, токсичні для комах білки Васійи5 Тпигіпдіеп5і5 (патенти США МоМо 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881;

Сеїзег еї а! (1986) Сепе 48: 109); лектини (Мап бБатиіте еї аї. (1994) Ріапі Мої. Віої. 24:825); гени детоксикації фумонізину (Патенти США Мо 5792931); гени авірулентності і стійкості до хвороб (Чопез єї а)ї. (1994) бсіепсе 266:789; Мапінп еї а!. (1993) Зсієпсе 262: 1432; Міпагіпоз єї аї. (1994)

Сеїї 78: 1089); ацетолактатсинтазні (А! 5) мутанти, які приводять до стійкості до гербіцидів, такі як 54 і/або Нга мутації; інгібітори глутамінсинтази, такі як фосфінотрицин або Баста (наприклад, раг депе) і стійкість до гліфосату (ЕРБР5 гену і САТ генів)), і ознаки, бажані для технологічних або продуктів, що виробляються, такі як високий вміст масла (патент США Мо 6232529); модифіковані масла (наприклад, гени десатурази жирних кислот (патент США Мо 5952544; МО 94/11516)), модифікований крохмаль (наприклад, АОРО-пірофосфорилаза (АГФ), крохмальсинтаза (55), розгалужувальні ферменти крохмалю (5ВЕ) і дерозгалужувальні ферменти крохмалю (ЗОВЕ)), а також полімери або біопластики (Патенти США Мо 5602321); бета-кетотіолаза, полігідроксибутиратсинтаза і ацетоацетил-КоА-редуктаза (Зспибрегі еї аї. (1988) 9. Васіегіої. 170:5837-5847), які сприяють експресії поліоксіалканоатів (ПГА)), де зміст вказаних публікацій включений в даний опис у вигляді посилання. Можна також об'єднати полінуклеотиди згідно з даним винаходом з полінуклеотидами, що забезпечують агрономічні ознаки, такі як чоловіча стерильність (див. Патент США Мо 5583210), сильне стебло, час цвітіння або ознаки зміни технологічних властивостей, такі як регуляція клітинного циклу або цілеспрямована зміна генів (див. М/О 99/61619, УМО 00/17364, УМО 99/25821), де зміст вказаних публікацій включений в даний опис за допомогою посилання.

Ці укладені комбінації можуть бути створені будь-яким способом, включаючи, але без обмеження, полінуклеотидні послідовності, що представляють інтерес, які можуть бути об'єднані в будь-який час і в будь-якому порядку. Наприклад, трансгенна рослина, що включає одну або декілька бажаних ознак, може бути використана як мішень для введення додаткових ознак подальшою трансформацією. Ознаки можуть вводитися одночасно відповідно до протоколу спільної трансформації з полінуклеотидами, що представляють інтерес, наданими будь-якою комбінацією касет трансформації. Наприклад, якщо будуть введені дві послідовності,

Зо ці дві послідовності можуть міститися в окремих касетах трансформації (транс) або міститися в одній касеті трансформації (цис). Експресія послідовностей може стимулюватися одним і тим же промотором або різними промоторами. У деяких випадках може бути бажано ввести касету трансформації, яка буде пригнічувати експресію полінуклеотиду, що представляє інтерес. Вона може об'єднуватися з будь-якою комбінацією інших касет супресії або касет надекспресії для генерації бажаної комбінації ознак в рослині.

Даний винахід надає спосіб генотипування рослини, який включає полінуклеотид згідно з даним винаходом. Генотипування забезпечує засоби розпізнавання відмінностей гомологів хромосомних пар і може використовуватися для розрізнення сегрегантів в популяції рослин.

Способи молекулярних маркерів можуть використовуватися для філогенетичних досліджень, що характеризують генетичний взаємозв'язок варіантів сортів сільськогосподарських культур, ідентифікації схрещувань або соматичних гібридів, локалізацію хромосомних сегментів, що впливають на моногенні ознаки, засновані на картах клонування, і вивчення спадковості кількісних ознак. Див., наприклад, Ріапі МоїІесшціаг Віоіоду: А Гарогагу Мапиаї, Спарієег 7, Сіагк,

Е9., Зргіпдег!-Мепіад, Вегіїп (1997). Методи молекулярних маркерів див., загалом, в публікації Те

ОМА Кемоїшіоп Бу Апагем/ Н. Раїегзоп 1996 (Спаріег 2) іп: сСепоте Марріпа іп ріапів (Еа., Апагем/

Н. Раїегзоп) Бу Асадетіс Ргез5/В.а. І апаз Сотрапу, А!йзійп, Тех., рр. 7-21.

У конкретному способі генотипування в даному винаході може використовуватися будь-яка кількість аналітичних методів молекулярних маркерів, таких як, але без обмеження, методи поліморфізму довжин рестриктних фрагментів (ПДРФ). ПДРФ є результатом алельних відмінностей між фрагментами рестриктних ДНК, які є результатом мінливості нуклеотидних послідовностей. Як добре відомо фахівцям даної галузі техніки, ПДРФ звичайно виявляються за допомогою екстракції геномної ДНК і розщеплення ферментом рестрикції. Фрагменти, що звичайно утворюються, розділяють за розміром і гібридизують із зондом; переважні зонди єдиної копії (зіпдіє сору ргоре). Виявляють рестриктні фрагменти з гомологічних хромосом.

Відмінності в розмірі фрагментів алелів представляють ПДРФ. Таким чином, даний винахід додатково надає засоби для подальшої сегрегації гену або нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, а також хромосомних послідовностей, генетично зв'язаного з цими генами або нуклеїнових кислот з використанням таких методів, як ПДРфФ-аналіз. Розміри зв'язаних хромосомних послідовностей знаходяться в межах 50 сантиморган (СМ), часто в межах 40 або 60 30 СМ, переважно в межах 20 або 10 сМ, більш переважно в межах 5, 3, 2 або 1 сМ гену згідно з даним винаходом.

У даному винаході зонди нуклеїнових кислот, що використовуються для картування молекулярних маркерів рослинних ядерних геномів, гібридизуються в умовах селективної гібридизації з геном, що кодує полінуклеотид згідно з даним винаходом. У переважних варіантах здійснення винаходу зонди вибрані з полінуклеотидів згідно з даним винаходом. Звичайно ці зонди являють собою кКДНК-зонди або геномні клони, оброблені рестриктними ферментами (наприклад, Р5Т І). Довжина зонду звичайно складає щонайменше 15 гетероциклічних основ нуклеїнової кислоти в довжину, більш переважно щонайменше 20, 25, 30, 35, 40 або 50 гетероциклічних основ нуклеїнової кислоти в довжину. Однак звичайно зонди складають менш ніж приблизно 1 кілобазу в довжину. Переважно, зонди являють собою зонди однієї копії, які гібризируються з унікальним локусом в гаплоїдному хромосомному комплементі. Деякі типові приклади рестриктних ферментів, що використовуються в ПДРФ картуванні, являють собою

ЕсоКІ, ЕсокКМ і 55ТІ. Термін "фермент рестрикції, рестриктний фермент", коли використовується в даному описі, стосується композиції, яка розпізнає і, сама по собі або в поєднанні з іншою композицією, розщеплює в певному місці нуклеотидну послідовність.

Спосіб виявлення ПДРФ включає наступні стадії: (а) розщеплення геномної ДНК рослини за допомогою ферменту рестрикції, (Б) гібридизація зонда нуклеїнової кислоти в умовах селективної гібридизації з послідовністю полінуклеотиду згідно з даним винаходом геномної

ДНК, (с) виявлення ПДРФ. Можна отримати і інші методи диференціації поліморфних (алельних) варіантів полінуклеотидів згідно з даним винаходом, використовуючи методи молекулярних маркерів, добре відомі фахівцям даної галузі, включаючи такі методи, як: 1) одноланцюжковий конформаційний аналіз (55(ХА), 2) метод денатуруючого градієнтного гель- електрофорезу (ОСОБ), 3) аналізи захисту від РНКази, 4) метод алель-специфічних олігонуклеотидів (АБО); 5) використання білків, які розпізнають нуклеотидні неспівпадіння, таких як білок Е. соїї, тш5; 6) метод алель-специфічної ПЛР. Інші підходи, засновані на виявленні невідповідності між двома комплементарними ланцюгами ДНК, включають фіксовано денатуруючий гель-електрофорез (СОСЕ), гетеродуплексний аналіз (НА) і хімічне розщеплення помилкового спарювання (СМС). Таким чином, даний винахід також стосується способу генотипування, який включає стадії контактування зразка в жорстких умовах гібридизації, що приблизно містить полінуклеотид згідно з даним винаходом, із зондом нуклеїнової кислоти.

Звичайно, зразок являє собою рослинний зразок, переважно зразок, що приблизно містить полінуклеотид кукурудзи згідно з даним винаходом (наприклад, ген, мРНК). Зонд нуклеїнової кислоти селективно гібридизується в жорстких умовах з підпослідовністю полінуклеотиду згідно з даним винаходом, що містить поліморфний маркер. Селективна гібридизація зонду нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеїнової кислоти поліморфного маркера приводить до отримання гібридизаційного комплексу. Виявлення гібридизаційного комплексу вказує на присутність цього поліморфного маркера в зразку. У переважних варіантах здійснення винаходу зонд нуклеїнової кислоти включає полінуклеотид згідно з даним винаходом.

Крім того, визнано, що в способах згідно з винаходом може використовуватися нуклеотидний конструкт, який здатний викликати в трансформованій рослині експресію щонайменше одного білюка або щонайменше однієї РНК, такої як, наприклад, антисмислова

РНК, яка є комплементарною щонайменше частині мРНК. Звичайно такий нуклеотидний конструкт складається з послідовності, що кодує білок або РНК, функціонально зв'язануз5 |і 3" транскрипцинальними регуляторними областями. Крім того, також визнано, що в способах згідно з винаходом може використовуватися нуклеотидний конструкт, який не здатний стимулювати в трансформованій рослині експресію білка або РНК.

Визнано також, що способи згідно з даним винаходом не залежать від введення повного нуклеотидного конструкта в геном, якщо рослина або її клітина не змінюється внаслідок введення нуклеотидного конструкта в клітину. В одному варіанті здійснення винаходу геном може бути змінений після введення нуклеотидного конструкта в клітину. Наприклад, нуклеотидний конструкт або будь-яка його частина може вводитися в геном рослини. Зміни в геномі згідно з даним винаходом включають, але без обмеження, додавання, делеції і заміни нуклеотидів в геномі. Хоч способи згідно з даним винаходом не залежать від додатків, делецій або заміщень будь-якого конкретного числа нуклеотидів, визнається, що такі додатки, делеції або заміщення включають щонайменше один нуклеотид.

Далі для демонстрації і додаткової ілюстрації деяких переважних варіантів здійснення винаходу і його аспектів представлені приклади, які не повинні розглядатися як обмеження об'єму даного винаходу.

ПРИКЛАДИ

60 Приклад 1

Пшениця (Ттйісцт аевіїмит І..), стійка до інгібітору ферменту ацетил-КоА карбоксилази, для застосування в системі обробки сільськогосподарських культур, стійких до гербіцидів

Озиму пшеницю (Тгйісцт аебвіїмит /.), стійку до гербіцидів класу інгібіторів ферменту ацетил-КоА карбоксилази (АКК), отримують за допомогою наступного способу:

Насіння озимої пшениці сорту Наїспег піддають впливу потужного хімічного мутагену (нетрансгенний метод), етанметилсульфонату (ЕМ5), в дозі 0,75 95 протягом 2,5 годин.

Отримане насіння позначають як М1, а кожне подальше покоління насіння буде позначатися з послідовним збільшенням цифри після М. Це приводить до частоти мутацій в геномі пшениці приблизно 1 мутація на 96 тисяч нуклеотидів (тн) (розраховується в М2-поколінні). Цю пшеницю висівають в лютому і урожай збирають в липні. Отримане М2 насіння висаджують в полі у вересні при загальній чисельності популяції 2,5 млн. рослин.

У травні наступного року поле розділяють на дві частини: одну частину обробляють летальною дозою хізалофопу (71 мільйон рослин), а іншу частину обробляють летальною дозою клетодиму (1,5 мільйони рослин). Хізалофоп і клетодим є високоефективними інгібіторами АКК (інгібітори синтезу ліпідів). Частину поля, оброблену хізалофопом, обробляють у другий раз в червні. У липні з поля збирають 46 колосків, що вижили, оброблених хізалофопом, і 167 колосків, що вижили, оброблених клетодимом.

Одночасно невелику частину насіння М2 вирощують в теплиці з січня по квітень. Приблизно 75000 і 175000 рослин відбирають після обробки летальними дозами хізалофопу і клетодиму, відповідно. Після застосування невелику частину рослин, що вижили після обробки клетодимом (7 рослин), які, як виявилося, є більш здоровими, ніж інші, відбирають у другий раз. Це перший документально підтверджений показник поліпшеної стійкості до гербіцидів в отриманій мутантній популяції (фігура 1), травень. У загальній складності з цих рослин збирають 26 рослин, що вижили після обробки хізалофопом, і 42 рослини, що вижили після обробки клетодимом.

МЗ3 покоління збирають з поля в теплиці (серпень-жовтень) і відбирають для обробки хізалофопом і клетодимом з двома послідовними смертельними дозами гербіцидів (фігура 2).

Деякі рослини виявляють високу здатність до виживання в порівнянні з іншими мутантними рослинами і немутагенізованим контролем. Починають деякі попередні характеристичні

Зо дослідження по вивченню різних мутацій. На фігурі З показані деякі МЗ рослини, стійкі до АСС- гербіцидів, в порівнянні з немутагенізованим контролем.

Ці скринінги забезпечують чіткий доказ того, що рослини пшениці набули стійкості до АКК гербіцидів, яка є успадкованою і функціональною.

Приклад 2

Пшениця (Ттйісит аевіїмит І..), стійка до інгібітору ферменту ацетил-КоА карбоксилази, для застосування в системі обробки сільськогосподарських культур, стійких до гербіцидів

Озиму пшеницю (Тгйісцт аевіїмит І.) з стійкістю до гербіцидів класу інгібіторів ферменту ацетил-КоА карбоксилази (АСС), характеризують за допомогою наступних методів:

Рослини, що виявляють підвищену толерантність до гербіциду хізалофопу, піддають скринінгу декількома методами для ідентифікації і характеристики причини такого підвищення стійкості. Рослини обстежують на наявність візуальних пошкоджень, відмінностей стійкості до хізалофопу загалом, перехресну стійкість до інших гербіцидів, і оцінюють генотипічно і ферментативно.

Візуальна оцінка. 18 стійких до хізалофопу рослин з приросту обробляють хізалофопом в дозі 21,05 г аі/га, доза вибрана на основі попередніх досліджень. Рослини оцінюють через 28 днів після обробки (САТ) на наявність видимих пошкоджень хізалофопом по шкалі від 0 до 100 95, де 0 означає відсутність пошкоджень і 100 означає повне всихання рослини. Майже всі рослини, оцінені в даному дослідженні, виявляються більш стійкими до хізалофопу, ніж рослини немутантної пшениці сорту Наїснег (фігура 5).

Отримані рослини містять декілька повністю загиблих рослин, за винятком однієї рослини, яка не відрізнялася від фону.

Доза-ефект. Дослідження залежності "доза-ефект" проводять з використанням хізалафопу в дозах з 11, 23, 46, 92, і 184 г/м. Через сім днів після обробки верхні частини рослин зрізають вище самого молодого надземного пагона. Біномінальну оцінку виживання рослин проводять через 28 днів після обробки. Виявляють відмінності в чутливості рослини в цілому до зростаючих доз хізалофопу. І Ово знаходиться в інтервалі від 10 г аї га" (для необроблених) до 76 г аї га" (фігура 6). Співвідношення стійких і чутливих рослин для даного експерименту знаходиться в інтервалі від 1,6 до 7,5 з розрахунку на співвідношення рослин, що вижили/загинули. бо Перехресна стійкість. Дослідження перехресної стійкості проводять з використанням гербіцидів, що впливають на ацетил-КоА карбоксилазу, в дозах, звичайно летальних для пшениці. Клетодим, сетоксидим і флуазифоп використовують в дозах 65, 264, і 361 г аї на га з обробкою клетодимом в поєднанні з хізалофопом в дозі 10,5 г аї на га. Через сім днів після обробки верхні частини рослин зрізають вище самого молодого надземного пагона. Біноміальну оцінку виживання рослин проводять через 28 днів після обробки. Стійкість хізалофопних мутантів до клетодиму і сетоксидиму є низькою (таблиця 1). Наявність будь-якої перехресної стійкості надає докази того, що об'єднання декількох гомологічних стійких до АКК гербіцидів генів в одній рослині може привести до додаткової стійкості до гербіцидів. На цій стадії тільки третина від всієї АКК в рослині буде містити мутації і показувати стійкість до інгібіторів АКК, якщо мутація заснована на цільовому сайті.

Секвенування ДНК. ДНК збирають з 26 хізалофоп-стійких фенотипів. Розробляють геном- специфічні праймери для ампліфікації послідовностей з А, В і О анцестральних геномів пшениці. Отримані послідовності порівнюють з раніше клонованою немутантною послідовністю пшениці для визначення наявності нуклеотидних заміщень. При порівнянні послідовностей з немутантного сорту Наїспег з мутантним фенотипом три несинонімічні мутації виявляють в АКК карбоксилтрансферазному домені, всі в положенні 2004 в системі амінокислотної нумерації

АІоресиги5 туозигоїде5. Ця мутація в А геномі виявлена у восьми зразках, в В геномі в дев'яти зразках, а в О геномі в дев'яти зразках. Немає зразків з більш ніж однією з цих 5М5. Мутація являє собою заміщення С на Т, що приводить до заміни аланіну на валін в амінокислотній послідовності (фігура 7). Кожне нове покоління має більш високу здатність до виживання, ніж вихідне покоління, що містить один з цього поліморфізму. Виходячи з хроматографічної картини вважають, що більшість цих 5М5 також є гомозиготними.

Отримання характеристик ферменту АКК. Ферментний аналіз іп мійго проводять для дослідження АССази в поєднанні з хізалофопом безпосередньо для визначення наявності мутації АССази, яка знижує здатність гербіцидів інгібувать активність АССази. В аналіз разом з необробленим контролем включені чотири концентрації хізалофопу: 0,1, 1, 10 ї 100 мкМ.

Експеримент включає в себе чотири зразки, які включають по одному представнику від трьох виявлених мутацій і не мутагенізовану пшеницю. Немутагенізована озима пшениця сорту

Наїснег виявляє велику чутливість до хізалофопу, ніж мутантне покоління (фігура 8). Рослини з

Зо В ї ЮО геномними нуклеотидними заміщеннями показують більш високі рівні стійкості до хізалофопу при 10 мкМ, ніж фон, а рослини з А і ЮО геномними нуклеотидними заміщеннями виявили більшу, ніж фон, стійкість до хізалофопу в концентрації 100 мкМ, при І. 5О (с0-0,05) 14,5 і 21,6, відповідно. Розраховане при рівні Іг5, значення стійких до сприйнятливих для геному А дорівнює 4,57, для геному В дорівнює 3,57 і для геному О дорівнює 10,86.

На основі цих експериментів встановлено, що основним фактором рослини, стійкої до хізалофопу, є наявність нуклеотидного заміщення С на Т в положенні 2004.

Таблиця 1

Виживання мутанту, стійкого до хізалофопу, після застосування інших АКК гербіцидів

Мо Мо о о о Зо (0) (0) (0) (0) (0) 1 10 0 (0) (0) 2 0 (0) (0) (0)

З (0) (0) (0) (0) 4 0 (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0) б (0) (0) (0) (0) 7 0 (0) (0) (0) 8 25 (0) (0) (0) 9 17 0 (0) (0) (0) (0) (0) (0) 11 0 8 (0) (0) 12 17 8 (0) (0) 13 (0) (0) (0) (0) 14 0 (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0) 16 (0) (0) (0) (0) 17 0 (0) (0) (0)

І 50-16

Всі публікації і патенти, згадані в даній заявці, включені в даний опис у вигляді посилання.

Різні модифікації і зміни описаних способів і композицій по винаходу будуть очевидними для 5 фахівців даної галузі техніки без виділення їх об'єму і суті даного винаходу. Хоч винахід був описаний в зв'язку з конкретними переважними варіантами здійснення, потрібно розуміти, що винахід не повинен бути обмеженим такими конкретними варіантами його здійснення. Дійсно, мається на увазі, що різні модифікації описаних способів здійснення винаходу, які є очевидними для фахівців у відповідних галузях техніки, знаходяться в об'ємі представленої нижче формули 10 винаходу.

ЗБЕРІГАННЯ

Насіння сортів пшениці АБ28, АБ26, А10, описаних в даному винаході, зберігаються і зберігалися в Університет штату Колорадо, (РІ. Соїйп5, Соїогадо 80523) аж до дати подачі цієї заявки на патент і всіх попередніх заявок на патенти, вказаної в посиланнях і введеної в даний 15 опис. Доступ до цього депозиту буде наданий на час розгляду заяви Комісаром по патентах і товарних знаках і особами, визначеними комісаром як що мають право по запиту. Після визнання будь-яких пунктів формули винаходу заявник(и) надасть(дуть) громадськості без обмежень депозит в розмірі не менше за 2500 насіння кожного сорту або лінії в Американській колекції типових культур (АТСС), КоскміШе, Магуїапа, 20 852. Насіння, депоноване в АТСС, буде взяте з того ж депозиту, що міститься в Університеті штату Колорадо, який вказаний вище. Крім того, заявник(и) буде(уть) задовольняти всі вимоги 37 СЕК з 1,801-1,809, включаючи надавання вказівки життєздатності зразка, коли зроблений депозит. Цей запас вищезазначених сортів пшениці буде міститися в АТСС, який є державним депозитарієм, протягом 30 років або 5 років після останнього запиту, або протягом терміну дії патенту, яким би тривалим він ні був, і буде замінений, якщо протягом цього періоду насіння стане нежиттєздатним. Заявник не буде накладати ніяких обмежень на доступність депозитного матеріалу з АТСС, однак заявник не має право відмовитися від будь-яких обмежень, встановлених законом про передачу біологічного матеріалу або його транспортування для комерційних цілей.

ПЕРЕЛІК. БОСЛІДОВНОСТЕЙ «1Ра» боіскадо Жбеав Каяватсії кбсвааєіст, їпс

Оті, Міспаві каїзу, ЗсОКЕ йевска, РНіІТїр

Уаїйв2, Зістохів «120з ОРЕОСЛИНИ, СТІЙКІ ЛО ГЕРВИЦИЛІВ, ЯКІ ВПЛИВАЮТЬ НА АПЕТИЛ-КаВ.

ХАРБОКСИЛАЗУ

«1305 11-0465 РОЗНАХОВОЇ ків» битв, «її» жо11-02-01 «Ов 51/53, «іі» Ох 1-10-3Х «ід» 15 «1702 Патент верефїн 3.5 «й» «Фк» 1155 «гі ДНК «2132 Ткаіптіснш аввбічцЕ «3055 1 зЧчедскзЧає чдабсчарся сдосачсост чаасдтадах ЄБсвасасаї ссасовровос що зЗаазавуаєс асустьсясах бадсасстся чстасвусос асазуаєася зспозаєває ї25 чассавасев чосесассає спаєвскакс Ззсзасдсвазчч ззчазчоУсе зазокооао 180 засагасаєу чаачсчеєучс сассозссаас дсссвесста успуссбасуа зпосвчазаєске АХ зсустовасак гоугсассая асузаєсаєє сузаєвчуазч сабасостас хосавсссдас 303 асасдоєдса Евсасезчезс бдассаесос зЕбасесєва скчедеЕсісС єдссуєдавес 366 чсацетЕскбЯ4 ЧесуцачвацЕ бЕвсзцсвес сасаесусаяє спЧусуссос саздаветату 425 дсезуасазасо часах сса бепазсачео хсачакєцасс гспвачтзкяв асстаякаєах Що кхзазцеузцс спаческавтях бестоссаво ахтоасаадас сетпскостат сСаспававтся, ЗАЗ пЕдчапссвс стзчаседасо сеспчєстас атосссоуаза аспсвкаєда песо Я о ее чЧесассачія ссавксдаєта саздосазучЧа звасбочітчо ччадсавасе сзасаавчаєх І васестесза азасаскоса аазасзчцєв звагозУєаЯа Ссвововсазч вчссаваснии 7-2 лоаавасоастс сачсосочезх сасацссасз часасвзосвцча сеасуаєстев чессасссве 785 цевцаєсссга Шесачессїда сСсссасспау саапопавкс сссусасвод Зсавесосоє 240 «ХЕсСсвовЕУ свуссаєстаа часадесусаз деваасУустьао асктсазосся сзЗавзчаста 09 зшоптаисца сСсстбдогав стадавоваче Сотссстчуес чЧасевачача сосессова зва плчазссстсс ваасгочабо засвакваєе падласстка сзавсзгасвза сестер 1029

Зо

ШЕдкакака Єссссаводе бусасвоста себудачоєу сстодчассяє зассцвсаде КОКО задасазаєс садаксосає гдадеєстає сдетзазадув скосааатає свабдстссе пло чаассксна з - Мпа «Вій 2 хі ТЕ кое» ДЕ «ей» Тсієїснт аевсі Уч «00 а авсЕсцчсЕЕс сосавеуЧчає сусстсассвг Ксссассссї Чавсочеаяаочх Зссазсасає 20 кпасскцеас авзовадасс якос тає сзосусЕооЄ зчебагзусус асаачЗаєаєа щ-О дсссЯакває уоспааасса досубоєсає сдаесссавск пбазудавою аосаеосцеє Іво ацчсакусво сасагасасе чааозсопссоє пасерсоадче сосогасесся зучсетасєта ай доздасаске асуескасає сбаєчасссу йасазоссЯЕс дозасвздсао сатассстоє зва сбедчастозос абасочедса Сксадвоатає поассадсосе всабссєва сля ко З садсстіпаас вадоссссся зссузчазяо остасваскосос сасасусоває соч цоває 220 сваазтлаєст цесасазася ЧіогІЧЕсоса сстуасазкЄ ссачатчасо Бест ї85й вессвагаса сесазасзас сснасоабас босбоссазеу аббосгчдбає стосеостат 5340 пасадвАсЄсЕ соудддаєсссас созасачасс сустасесає ассссідавача зквсасеста вод

Кссксзсясв дссвассачсо дсасідаєча спеуссзазчоз заазсзуєкЗо адоадеаєо ЗО сЧчасзаацає зок соко ачасаєєсстов зучасодасо зазвсвасад тассадево 720 адсчавЕасст пчасспдассс саассазпче батвоскоазкч чачасасада скабсзаєоса тва чеЕсайсосо дссзчасстаз пусеаоасесоаг Ексссабова саЯбстчевос сессасоаста 840 зсазусстоц пессосядаєу сачегастава часвосорач псзахтассяо певесавссс зо точвапдассв соссочсптса песетостав создаззазас бвеспогоуеа опсавазазча зав їссБЕсксва поаавссско ачоасочоес взвовавсзок зазчаавосстсв доавсасасая їх ксазестдес гешкасятя сссбсавцас сдозсаваесв суледчачаоч спжочесає това заксцакєзас зацаєваасс саззаксосає созабЕстсав сссдабадув сбосаазаох 1149 сазочсссо азвоссосавчу ттТ87. «вій З «іх 19 сеїй» ДЕК «РІЗ» ТЕікісци аеветгуУюТ «адм З чав зесседаасеві зазапслссу засобах ссацовсавсї Кажсетчасод 55 авпавдасса баостесЗсаєк зстасєсестеЯ скаглосеса саалатуєва сопаз'чзаєа 128 чЗсЗавассаф чсзвусєтаєс здасескзсвч кудозаазса зуасзааеста аусосочваа Уві зсаєасасуз звадсясодсс ваесоссвзося себажесвад засссасуафз дадасавскта 40 заестасакс кКосуасвяде суцассоєсо деагалпуасс асесоскоуск сбассткоуцев Зпа -асчагрусає асвоасараск ддассадосса стаксовазс сузуєтесою чебепаяаєя АБО зЧестесеча ссуудавеєт сасаедеєссс асаєусачєє зодеучосос вавасєсвцо 12 счасаавосе бага сссає ссдасацеь сацасчассх савабуєаєу бесвнабатах зо счдазчіачек своссвідс сскоссваса бсчскодасе сссвсескаєс асазааєсте За судасссасє суасацдасов зБсосатесв ксоссдачав стасвбавуяи ссссдкоугває Ой есаксвсосца састочавсуве зуссавузла вас дачсвсоєує засавзазава во чЕскЕсосоча дасаєстта давбудоасса здбсадіває сасбудсада чодававкса т2а паздчозЕсос часччасчств асацесчедо вувсасачає такуакочсля сссвоссссу 780 ссдаєссазчу сезасеєувЕ ссссаєчадс аск всс соосасіоазч гавчессоце 880

Ебосачвесс асосаєсааз асадсссаву саасчосЗоВ ссвбспасоах Чавасаєває з2о спссаексає ссссодєсвас счдасауцєє Сесскоадкоо деваачадає ссссесуває 356 чаасссссса зоссбчахсва асаавсоссо взоаасоссвЧа сасвбасває свасстсее 14020 скчсасасає ссесзаозусв чсадасогас діссаводуєс ссчзоссУєа асхзатадов. 1085 здасавассс ачЕссуваєт Чазессевасч ссцададцчас сусазвадо; 1123 «иї0д» 4 «вії 18Я «Із ДНК киїЯх тдкійтсшв аевеічцт «ах 4 заспавцевза заєвогасєк сасопесаЧає дабосавстла судсводєсок Фавст ца

ЕєЕсадевсвє єКкакКоєдаєк зЗайзопаадчасо звгсотовсає падйсасояо зпЕвЕаЯеЯе їх зсзацдасчса чекеовтавх зобаааатевя Фа зав хзагоосает чебчоуавя 18о доаздасладеіс вачцсстадач азсагасаєсу дадзсуссос савтцдосачи псосвсгсса ва

Чоуессасса зцачасасті асчсссвеає скасоассаз абадасеяєсє довасвучад збо сасасстсчє Ссуассьаос абсвсзасзсв сасачсавас бдассачрсс асгасостад Зо соседччешлос Кассстоваєс авоасссскоо зоссзвзааої згасвоасксс пасаєчевоє кВ кепдсуассе сазааєсаєа чодасавасо чзБсоскаксса ссбдасвуєЕ бсазсаковосе ло ясзавоаччУ Ззксбвасаєа сгоаусіучс ссевчссаваяї посксссвас абсзчезаве чо сесерестас сасаваакст скдавсосво бепасвдасс сутвосасає зсссстовоав Ов вказахєсабоа косесукцся досаєвачеу Ясзводавца садссвазад саакадекає Ява ччачозічс сдасазвяцас ЗУусЕссакТо адасастода аовзагоччсз азуєсавзват ї2а сезссадсову зосоззаєсо здадучаккс сдовооогУує сасеоскоєо заоасазаза тя стаєцчаєсуса чсссакосоє чеєдаєссяу досадоєсда сеЕсСосасовоа сдакокуква я птсасостоЯ дсаацсесод СеБссадате садсбаєкавм засазесстова чусазкчовай 95 азсстсвааваесч пазвоачаєта ссіссуєскса состідссава ссодачадлис ссбскаухю БО чдсзазоавуа кесхеессува Ччаавуссскс ачусстозаєе засавесуюк: Чапааєтька аз завсакеасав гсадестдсс СЕсаЯсасаєа бсссовацоаО сосадацева собучачаоу сно сікодассяї даєкцатасо задаєваасс свсчасссаяє совоссстеає досдазЧчадуа 5149 ссосавайуд гваєдктссо давосссвач очсбсаатсдв дасассад ГЕ «фо 5 «еїї» 194 «2122 ДНЕ «иї3» тТгісісит аезбіин «аа 5 чесасбавосао асдавогаза Зсессасссс счсасстаФає чосствасов совсадесе БУ чаасосусас КСЕсадкасає стаксоЯасє даауаасасс ведстоасає бадсасокою до зЕЕзЕазоссо асаачасгуса зссїпасвав адсчаваєта собоуссас с9астстаєє 180 зсададавос азуасоччсс зучсосЧову васасасаєа давубостас бавсдссасї аж

Чессаєсста даоссівсда судздасаєст асосстасає ссуєодастут зоддвссуєх 300 дазасаводва сатассвсує єечасссооєс збассоросса Бабачечбас гоадсояоасоє зво асБасссраа сбодаксогоа гадсссбдаво азасесссве зосаччазає ссаєсаЧевее ко свсакосзас бЧадсодссс сгаваєсаєд ссуасавасу зсосеоєссв Єстаасацье 4

Кеазпакцаєс сзбсавучсзк акссаасвза сбоалуєуле ссачсваєоє згесбпссвас 45 астаусасас скесеостає Едсааватев Ссудасосає судасацаєс сасецостає 590 апссссуача асасасдсда ссесссосуєє посассвуту чсасссаєта задссавузу й завасчЗокча дЗпесакохо сЧасвзазасє аз еецвоЗЯ заасахусолва. відасцачея ТЕЗУ заскенасєто срастаоасва зассатаскс спдчазезчассо сспссзасо габазесвУха тай чазчасасада срабозсуса здоссатсоссї оссолавосяд осасстсда босссаєдау за тдасстЯесс срсдечссоу дсавзаєстдяа ЕсбсевпавєЕ садспаєсва дасазчсосад 00 зевактдчевцча ассксвасся сЯавочаюти ссістченсв Шсстбссва соасвчада ЗЕ кестесваЯка дЧесазачаза ссхскссоваа сдазаєсссте аддскожаве засваєрасе 1по чзвзчазесета чазсахвсаза ЄсзасссдЯос Єктокакаса сесссвзасає гасазавих Тао сасдуааачЯя «соч сся зассзасасс аачаєаваєс сзчлабсцдсак саазтесьа ї1щ45 заБбазсацача ссусавачад свабоосогс Зазостсаву сцсхчастуа часа 134 кої 6 «різ 84 епщах ДНК ешіЯи ТЕХ піс ВеввіУв «ВО» б сазазтавав псобіоскссое сечову ЧЕсСсЧасчає зусацсостя азецсазсе ко севасасатс єнЕстрасьд задзадасся сасксусасс аусустоссту свасачсдев 170 свацакосач сскшасвава усбдаластаяй зп свЕе дактссоєтя свудуаасові ін зчаєсзасасса часусаздацча зсасасасчо авзбуєсєссось вгсдссвеєд соувскекац з45 зчссгакзуач чадасаєска суссьасаво гасавско аддзетусЯ зеаасаудасе зо їчостатуза уадасаксса суссбасате суса чча адчаскчєсч дезсадатан Зоо атассЕтостї єчасеєддса сасадтусає бсадсобась дасевдссся сбавсставе БІВ ксаЧЕсЕшсЕ доестезвааса адосгеседо ссодпавуку сасадесоссс асабасаечис 295 чачлососс зазассасод ссасзазсояч собор стає себасазссю сазаєчвосї 350 тдазоашесив сссавсачак сзазасоЗаїх садстагуює сссоуссвава ссазсаоасе а трЕсвобасі асававісокЄ соаЧасссасо бЗвововсоо дрсдеєбаса кессгдвдав во пвсасоїзак ссосусдсву ссаксвчкаЯ саскчЧасстає вадссаададча засадесача оо чзаечесзічесс дасзавцаса сера дасаксесай ччакпазеча айїсачьгах 20 їастоостаза здоедазассет зЗазозасссс соспшасасе асаздссусоє заасасадає то такцзвеочсяаоа стсзусссіа ссаакєссасо ксазсєкчає бессасЧачс дасебудеесє яд еакассзЯа саватссадяе свсачаєтс вдегассавЯ асадодсаза саасаскача з05 ссксваєссяс ззачоассас состчсесаєт соссостаас сезазаааєї сстсса9оа ЗВ чсавачацав сеесссуазу деасоскесз сопстуодеса зсзабеаевса взовасстово І025 ласагвозає садссоасої спорактатаї сСсосазвузоє чдседаеазстасє асп ово соусу о аскзчасасса зчатаваєсс вувісцосасс дадекосаєт себдадцеодоає 11415 тпевавааос авіа ссосЯ вавссксазчЗ збсдаставу алоє хів «ий т «211. 875 «вії» ват «135 Ткхкрасии вевкімит «а005 7 чаї біу Тер рес Азродвв Зі Бет бко біз Вк біб пе Зі тую 116 1 5 15 15

Тут без Тк Піб біз Азр Нія Аїа Ака 1іе бек Тр бегоуа! Іїво дів

2а 25 за

Ні ув Меє Зіп Пес Аво Аза осі б1і5 їл1є Ах Тор чаї Ії Авр о бехт 35 Я 5 чаї уаї сСіу цув бід дйяр о б1у на бі Хар бій Авп о 11 Ні сІіу Заг о о бо

Аїва Аїа ї115 Аїз Хек А)іа Ту бек Ак Аа тТух сі) бі тв о Рре так

Се то 75 зо зей тТвЕ впе хуаї ТвЕ 0іу вхЯ Тис Маї біу 12 піУу Аза тує Бем Ата

ЗВ з5 дкч Би бі 118 Аку Сув їі біб аку ТК Авробій веб ІЗ5е Ті Се) ї05 119 тТБЕ б1у Рре Бет Аза Без о АВпобуз Сей їей СБУ ка біз Уві Тук 5-х вів ї20 125

Законів о Меї ій цез сту сіу Рхб руб Кіз Мес Аза Тк бяп Зіу ву їз 135 140

Уві Нів Без тп: а» Беж Ав о Авзробдем спі) сбіу Уві Бек Авй Тіш пе) 145 150 155 15)

Аха тТко Без Зек ТУЄ Уві рхо Аіа Ави т13іє піу 0519 Ро дей ха 118 1655 їт6 їла їх був Бех Бїеа дЕо Ро рхо АвБр одЕЧ Ро хаї Віа тух ті ро бі 180 185 155 деп тах Сує АвроБео Аку Аза Аза її1є Зак біу І11е Ав бев одежк бів 135 20 205 б1У пуб Тжроївнц біу біу Меб ВРібе Авроїуз вро охеу Ве Уаї біз Ту 2515 22 га смо зіУ тк АТіш зу век Уві Мах ТБ біу Ака дія пу с бед ль 225 | 238 235 тА

ЗУ її Рг Ууаї ку Чаї ХТіе Аза Чаї бій ТвЕ бів ТБЕ Мак Ме сім 245. 25 5

Без Ії Его Аза дер обга Зіу бій бе АвроБек НБів С15 Ак бек Узі ї80 255 иа то Вга Аїа спіу біпоУугі Тв о Бде рРко Авробех Віа Так був ТнЕ Дів 275 280 285

Сіт ія Мас рей вбжр вре аАво Ахо ті: Б1іу Бай Рко Цей ле Ге Тез «З 255 БІ йіа дай Ттр.Ака біу Ре бек обію зі піп дк дЕроіви Ва сін біт 305 ЗУ 315 320 її ех вій Аза біу беж Тк гів Уаї сіб Вяп пес вк ТВ о Тухк Ав 25 335 335 бій вто Аїа Рне уві Тує Ті Рго їуя Аїд діа біз цем Аку сі ЗУ 34 45 350 аїа Тегротаї Маї 116 Авб Бех уз 1 Авй хо ДВроАко 136 бій РКе 355 360 365

Ту Атїа біз г ТЕ Аїа Був 370 375 «їй» Я «Три 94 «їй вВт «вій» тек усашт певфі аю «оз Я

Бек вуз їі уаї пен аку Ууаії сіу ТкрробБеє Авр о Ав слу Бек Бко а1у 1 З Іо 15 йху су БбБесбів Бух іє Тук Пеш ТЕ бій біб Звр.овів Аїа Ара її 28 25 зо

Беж Тпжх бек Маії 112 Аза Ні Був Меї бів Гей АзвБ АБ біУу БІВ ТМ 35 40 ї5

Ага Ткр Уаї І1ї6 Двр о Бег Уві Узі біу Був дім йвр осіу ее біу Уаї 50 за о а Аза 16 Ні Сіу дек Аза АТ л1Єе Ата Чех Аза Тук бек дко Ді ва та 75 За тук Бі лій ТвЕ Бе ТЕ сво ТЕ впе Уаї ТБЕ б1у Ак ТЕ Ма1ї1 01у

ЗВ а5 1їе Біу Аза тую без Вів Ак Пеж ку їїе Ак Шуз тів обста Вт ТВЕ 100 155 116

Зб

Авр бій Рео їіз Т1е Пейп Тк осі Бпе Зер Акта без Авл обу Сем о бей 115 129 т25 чіу ага бід Ууаї Тук бек Бек Нів Ме сів Пезо обу зіш вже бу Тр: 135 14

Мековіа Тит дя сіу Уві Уві Ні бей ТвХх Хаї Бек Азр вер реп БІ; 145 їБ5И І5а 155 сіу уві Бех дви Кі пев Ак Тр опе Зак тТук Маї Рха Аїа Азп о ІТе 1655 170 175 слу сіу Рко лей вк ів ТБЕ Був о бек сей Ав РеФ РКО с АБ Ак вБЕо

І1850 185 12

Уаї Аза Тук ЇРТе Бко осі) АВА тах був АБрорРко Ак від Азія те бе 1535 200 205 сху іє дБ оАвр беж бій ЗКУ Був ТЕр Меч піу сіу Мебсрне Аве опуз 21а 215 285

Квробеж ВНе Ма3з би Твк ве би О1у Ткр о Ата Був Яет Ууаї Ма) ТБт

Зо 230 238 ко піУу Ага Атїа пт бесосзімж ві ІЗМе ре Узі БІіу Маї д1іе с Атїа Мах БУ 215 25 255 тве бів тв Ме Мес біп печ діє вхо Ата дяв ого біУу Біп Бей Ав з5а 705 ато зеж НІВ йо Ако 5еї Уа1 Бо Ага іа БІ бів Уакоткр реа РКО дер 275 -вО зв ов Уві ТНЕ Бу ТВЕ Аїв обіп Аїа Меї йез Авробів дабоАгЯа ЗА пу 2 За Зо ценз олео рез Рпе їЛе ва Аїа лази Тер Аса БТ Ве беж обі їм 51 за ТО 315 з ххх Азова) Бре піс пьу їїе Без бів Ата сбіу Шех ТЕ тБіє УЗ сту ал 330 335

Авпобец Ат ТВЕ С Тук авг шіп Рго АтТа пе мМаї Тук Тіє Ро Був Віа за 45 З50

Віа сій бе Або сзіу пі Аїа то чаї Уві ї1їе о двроБев Буд Тїє Де зби 365

Вт Аве Ага Ті са Ре ТукоАїа сій АкФф тат віза був О1у дал Уві з'йє з75 380 цей біц Ро піп Піу ре тів бї5 ТТ рЕо 185 35 «105 8 «2117 ЗБ «к12» ват «13» тхісісот век «апа з

Ага Ууаї Щ1у Тер бек АвроАвроБіу бЗехт Ро дій Аку бі пе піп Тує 1 З 10 15

Іізе Тує цем Тах біо О1Я Азр о Ніє Аїя Агро їі бек Таг йеє Маї Те 2 25 30

Азїа Нів був Меб бій без одер Ап біу 015 Іїе Ас Тртроуа)ї ІГе Агро 4 45

Зак За) Уві бту був бій Авробіу Гео біу баї біз бво І11а Нія б1іу п о БО дек Аа АТа її Дїв бек Аза Тук о бев йо Ата Тукобіц бій ТвВк Бе 68 7 75 5О бат пев ТВк оббе чаї тп б1у Ака Твх Уві бі Ії Су Аіа бтух Цех діа Аха бе біу 11е йхд був їі Піп Ак ТВЕ Авробіп о Рхо Іїв І1е оо Ро5 115 цес Тк обіу Рйе Бер Аїа Тед деп був бен оїец с1у Ак бІЮ Чаї Туг фІ5 135 їх5

Бек шеж Ні Ме бій мезй оціу біу Ркш Був 1М8 Ме Аїа ТНК оАви піу 139 135 140

Уаї Маїс Нів рей тТБк Ма бек АвроАвр о іївм Сі Біу Уві Бек два Іі 145 150 155 Іво

Без дк Ткр обвеми бек Ту ма1і Еко Ат дп тів всу щіу рРЕжО Пей Его 155 їта 115

Щі ТвжЕє був бек Пе Аво вКО Рко Авзо ВЕЯ БО Фаї Аіа тУук ті вто 1850 185 іза

Зіц Ава ТБж Су АБО Рто Дка Аза А13 116 Шек сіу Се Авр Ар сек 195 290 25 бів бу ув Трр бе йпіу «ру Меє Вйе бар о Ппув Дво обех ре чаї 1 210 2у5 та

Тих Ре Зі біу Тр о Ахла був дек Уві Чаї Тає біУ вх Віз пуб сей 225 234 2535 24 -і1іУ БіУ їі бо Маї біч Уві Ії Аза Уві сіш тож бій ТНк Меб Мех 45 255 295 іх Пеш їіе Рхо Аіїа вв Бк Сіу бій ойвсо йвробех чів біз ба бву 250 245 аа

Уві Ре Ака діа с1у біх Уві Тк Бре Рко Аню обетї Аза Тс уз ТЕ 275 ря) я

ВІВ біп Аїа Мес Тез Аво» ве Ав Ага біс бі Бевз Ро ге вне тїє

Ба 300 ій дів дво тро Ака біу Ра ек обі 01 біб да АвроБец Бпе о обуч з05 10 іх 235 сту Тіє цебз біп віза біу бек Тк її Маї біб яв бец да тре Ту 395 330 35

Авпобіп рЕс Аіа Рре Маї Тут ї1їе Рхго Пув дід дія сій рей йка сій 349 345 35

Зіу Аїа Тер Уві Уві ліє Авробек ГЦув Ті Ав Бро дар дДтло ї1е БТ; 385 Зо 155

Вле тут АтТа віз Аа ТБ Аза пуз с1у Ази Маї ГПевозго вк обБіп о оту

З 575 зво -б1їй» 16 «яви ЗА «їй БЕК «В13ж тек ісцю аезкічнт, «4005 10 піу тів Аза АвробіЗ Маї біз Бек був Рне Аха Узі П1у тЕр. Бех Вр ї з 15 ї5 лАвЕощіУу ас Ржо біз вч бі Не бій Тує ї1я Тек Ті Ту Сів б1ія 2 55 за

АвроНів Аїа АкЯ ТТ бек Те обек хаї Ії АТа нів Муз Мет б)п Тем 35 чо (5

Кво Взаи бі б1з ЇТе Акс Тео Узі 1 Азо обек уд Уа зу Був ові зо 25 о

Аве сіу цез біу Уві бід дви Ії Нів біу бек Аїа Аза 15 Аза бег 7о В БО

А1із тут Чек Ака Аїа Тук іл щ-13 ТВ оРде Так обеи сл ле Мах ТВЕ а зо 55 пі дже ТВх Уаї біу Ті біу Ата Тук Сем Аза Ахд їез біу 118 Вкщ 105 105 110 сСув ттіе біб Ага тн о Аяро обу Бо ГТе Ії Пцец Тр об1уУ Ве Бер Ата 115 і20 125 цей вап опув цем Бей СРТу Аку З1з Уаї Тух бек Беб Ніз Меб піп цех 130 і35 150 фу біу Бго Бу ї1е Меб діа Твж Авпобіу Маї Маї нів Без оТву чаї 145 155 155 150

Зех Ар АБО цей О1іч бі узі беж Авло їв Тез Ако Тр їв» бек Тут

Ії65 їло 175 чаї Бко АТїа вва ї1е біУу біу Рро Пеш Бус її Твх був Зак без Авр 55 185 195 ке Рко Авр о Ако Рго уаї Аїв Тух Ї1ів о рхо бі; оАзпоТбж Сув Аво о бто т го 208

Аке вів Ліз Ге йехг сіуУ ТІ Авродзр о бек бів о піу Му Тробев 01У ен! 215 йо бЗіу Мек Рве БвроБу двробвж вне Уаї сіб ТВ Бе ЗІЗ б3у Тк одІя пе8 230 23 249 їУув'зак Маї Маі Тис о 0іу Ах діа пу пЕейосфу 53у Гіз Бо Уаї Ех 245. ка БУ чаї хїе Віа Уві оО1ії ТАК бій ту Меб Меб бій бей ІТе вто лів дя жа 285 є же бі ото без Бор о беє нів сі) Ахо ввЕ Уаї бро ВЕЯ АСВ обі бій шт РЕНІ я чаї Ткр пе рго Ачзр о бех Ууаї Те оцуя Тв Дія бів Аза Меє Бен о Авр 23 785 ЗО

Енпе Ав Аг біб бі пва РО пе Ра ії Бей діа Зяп Тк Ак Б1У 305 зв 315 Зо

ЕНе беж Ту сьу Чіп Агч Ав цей бре сії піу тТ3е с пез бів Атїа Ту 325 333 З3У пет Ту ті уві біб Дав без дта Тих Тух АБп бій рРко Ата вва Уаї 340 345 За

Тук їв Бко цув Атїа Аїа сій це Ак сту бі дія Теромаїю Зав Кв 353 36о зва

Авзровек пу 112 Ав о РкО др о Ака ї18 515 па Туж 81їа зо вка Твх 370 З5 380

Ат був 51У АяпоМаїф дез б Ро піп озту Мей ЇїКе зізч Мехє

Зе5 3850 355 «в1йх 1 . «її» 486 «125 ВТ «213» ТЕїсісцй зевкїчим «Омж ії бат Су вне Аха уві бі ТрробЗек АвроАБросіу Бех Все пз Ака б01у ї 5 10 ї5 вке сій тую гі Тує рей тик бі бій АБ чів Аза Аз її Бах ів 20 й 3 ак чай іде ліз Ні Був Мех біло зва Авройвй біу біз її АЖа То 3 50 У

Уві її1е двр оЗег узі Заї Зі бує 5іш дзробіу без Біу Уаї біз Ап

В) 5 БО ті нів о С1у Бек Вів АТа Ї1їв Аїза бЗек Аза Тук бег дк АлХа Тук о б1з то 3 о пів Тцх Бе тт їжа Тв Ве уві Тк о б0іу АкЯ о Тпх Уаї сім її бу за зи Зв віа тТук Бен дія Ага Це жу Її Акт був Гі бсіп Лкб ТБж Авю бій 180 105 118

РЕ ої11їе ї1їе цец Твкобіу Бе бек вів Бей Ав о цув Бей Бешп о БУуУ Аку 115 123 125 сто Уві Тук о бех бек Ніз Мей: Сбіп їєю біу Піу Рхо Муз ЇЇ Меб лід 135 135 140 тах дсп осіу уУаї Уві ців Беп Тпт Маї Бех Авр о дор цем піз бу Уві т45 150 155 МБО

Зах двпоїїів Бес Аку Ттроїеа бек Тух Уаї Бко біа Азп Тіе б53Ж СІ ї65 170 175

БЕ пем вто Іїе Тв о їук дет без двр о Рго Рго др ого Ро Уаї лід 150 183 ї90

Тук 1їе Бк бін Ада Тс Су Ар РКО АкФ Ата дій Ї)е Бех с1у хіє 135 29а 25

Азр Ав дек піп о біу був Тер о бецобіу 05ІіУу Мес вве Авробук АвробЗек гій 215 а впе ув дів Тож Ве бін біу Тхр Аза Буз беж Узі Уві Тїпк біу Аа 225: 230 235 а

Аїа був Бед б1у біУ ІМе Рко оУаі сіу ба1ї Її Аза Мі бі тТвК біл 245 ш5У 255

Твї Мек мес біп Пец тіе Рко іа Авр Бко біУу біп Пебз дер огек нія що 255 ка січ буд Бет Уві бро Агу Аіа біу бій Уві Ттр Бне Бро Азробеу Аа я 25О ка5 їТбк був ТВйх Аза сій Віз Меб пед ойер бе двп Ага бі слу беб о Вто 250 5 за цез Бе її рео Аів два оТтр о джа сту РКе бак о біу сіу біб Ав Ар з05 315 5 За цей ве зіз бу їїе Пей бій Аза бі бек Та їі Ууаї Б10Б АзвоГбев за 3 335 акч Я ТУж Ав біб го Аха Ре Ууаїі Тук ГТ ко Був дів Аїя зач за 45 50 їв АСУ ЗУ Сі аАїа о тТтвроУв) Мах Ті Ав бес обу Т1іє Авпобко дер

355 ЗБ 3655 лкат їі ЗІ Ре Тух іа сів Ага тих о Афіа Був шіу ДБО Маї Бе ви 70 375 ЗО ем Був 385. «1005 18 київ 395 «вій» РЕТ «813 ТріБісви аввбзои «аб» 12 та Уві Бук бег оСув Ре Акч Уа)ї Ру Ттр бех Авр АзростуУ ет го ї В 19 15

БІч дЕЯ біу Бе сів Туг їїе Туго пес; ТВ бла біч Ар Ні Аїа Аго 25 25 39 т1є Бек вів чек Уві 112 Абе Ні цу Меб сїі5 рен Ар о АБа БІ СІ) 35 40 15 її Акш о Ткр о Уві їБТе Ашройет Маї Уві 51уУ був бід дер осьу їні біУу 5 50

Чаї Зі АЗО їі Ні бі Бег Атїа Аїа т1їе АбТа бес Аїа Тук беж АкФ 5 75 75 ва

Аіїа Тук обі сій тТвЕ вве ТК о беб ТВх Ре уві Тисобіу аку Тк о Маї 85 зо | За

ЗБУ 1іе іуУ діа Ту Беж АТя Ака їеч бе тів Ага ссСув Їта 01 дка 100 То5 МІ

ТЕ АБробібй вто ІБ І1е пев Твж Су вне Жех Аза печу Ав обу Бей ії5 179 т25 гену б1у Ак сім Уві Тук бетг Жег нів Мек біп бе пі бі вро Бу їз лів хо

ІТе Ме Аїа Тіт Ави біу Ма) Уві Кіз їез Тр оуді ех Ар оАвробеу 155 їх 155 169

Зі: сЧЕу уаї бах Авпої1з рез Аг Тер оБей бЗес Тук о Уаї Вго Віа Ав

Те5 170 115

Пе пту біу Бко Мей Бко тіє Твсоцув бек о беш АвроБро бро АвроАго

85 185 т5а хо Уаї Аа Туї І15 Рхо Біш Ап ої Сув АБрворРко Ака Аіа Аа ге 155 ЯЗ 205

Зег су ті ЯАвр о двр.обек іп сіу Фує ТЕр о бе зіу 5іу Моб Рпе дар

МЕ 715 кео їув бар обвг Рае Уаї бій) Тахо РБе біб о1у ТЕровів пу бек Заг оУаїх 225 239 235 39

Те біу АхЯ дів ГБує рец бБіу бі» 1їе бро Уаїх 01у хаї ТТ Аїя Мах 245 250 258 сів Те озій тих Меб Мек о бій Ба ІТе о Вхо Вів дар хо с1уУу Бій бе)

Ей 2653 а

Ав» Бек Ні бШія Аза бек чаї Ро до іа зу СЕ Уаї ТЕр Ре Ро 275 гно 285

Аве обетх чаї тах Ппує ТВЕ Вів біп Аіз Меб пеш вв Епе Ав ака бів

З 235 зой 51у еп Рго Гей Бе Іі Пцеп Аза Аве Ткр дха біу рве бех біу біу

ЗБ. 510 ЗІ5 ло бЗіп Ак йвр оцей бе 51 біу її Бей бів діа Сіу вх Ткт Де заї 325 зз3а 355 біз Аво пШей вйка ТЕ Туг бзп бів Рко Аїа РБе Узрф о тТух ЇТє Вко ув

Зо 345 350

Ава Ата піч цеч Ата б1у бу діа Тир Уві Уві 116 Авр бе ру о Тів 355 350 185 лап РКО АвровкКч її ЗІ рРНа тТУЄ Аза сій бе тах Аза Бу біу вп з'й З15 189

Узі Сем січ Рекс біб о бтіу Бей Т1я бі Меє 385 139 «хої0к 13 «1їм 19753 «йфп» лк «ші Азоресахкив пусвзихксїічев Нибя «Ом ха ксазксскаєт досазсоскчет хсгузадавс астасаасес соасвоєстіяЕ пссазвдадед по зарчаєзоеза Сссаєвсасс дсСосаєбУє сосок свас чЧевсссасва себвсаєласе ї2о акссасіств соссозувіаз аспсачебадс бостосаєте саавескЕече серосгсаву 159 здисатссзач зазчазазчсес чассьоківаа пссватавзоу загсакусся ассдавусдє 240 чЧесазчасссої чдовоЧесвкя зссазчсссас сесодссвасос давассовалев ссвЕсососе за есе ЯЄ соссвасосо здассгесак адвектассь вої свдаєсвов чадсвеусге 380 пексттачсчо азчаваксто ядвасасстсахє сасавзавсса пайстазсва сазассвоса «го сассзаєсЕк сасасаєтоє сосбасезод сссоссваао стбаотссвс актадаєкоє 485 хтсасчссса стсссасаєсс ссвбадсстсо ссосаєсесс сдсатєдачаї ссавоасачуз За зсзадчоазав ссясосассзч агссогассе абазссавзаї стос сває ссазчаасац оо акчааскссе сІссвдасаї ссацсзісав зер сссяа зоцЧазЗазчоача сасававаєва БО пегчсесасе дсачкссавч аакстакоас созасєасвес часззрасаз сазесссаух тей ззадазсоас ддсствпавкс скпсакстса асазакоєвоа Екакававіс ссазасчевко та усавассакт чесЕссссзк збеспассєя сода сстуси сазсбесссва сосаєтвиску БЕК) засусесцво роедесодсвї сабодзссксо ссазачоавую аецсзссаде Ессаваєиву ЗО часастссас зусазуснсс тсвусвзевсе сасаєсасвзоа стбсацесссо седавадаяс за0 ачесававасє угаптавасосв сасасавсос стачаскоса среЕчепіхкає бассечЕсася їзда сссазаєсУуко сзазчесусєза зеБсесесВВЕ сосасвовЕК сасасоссома ЕЧрапаксах 05 зчстакссрає гасчсассся скчусСазуєкос сууазасьов ассакесаве чсассооває 1146 сЕдптавчотЕ сКапеЕвЕКає зсвнагтаєтоє пасдвассає спссавсото буевесствся 123 зсаєгавссся сусаєсусас забатасасе запгоассасао спслачавьяє састасасаз 1260 зксастлеававс Єхпобессвая стстоснаао дчавасаєсс Ксзавасбох всксафсує 1370 стасадсесад зсасагоауеє докоасвстчє агубазсвіх Ззгсузасаст басауавсає їз їссвессазЗав азасскесес ясвевадсве пустесбаваке сяакічосав сгчЧазависее ї44а савсссоздаєа асзацасаза саавстсаско чодессков бесакасса зсактаст ак 1500 чесакасата бкасудізас сосазбаасв ясктбсасссЄ Єкссбкеста усудоатссаа 1550 апассвозаа Чесьсотасс вазідаводу часвектавахт уааесеасаса асосязадса 1689 садестссоєу сстазадест акдзакскоо сасзвазеєУ счбодзаваа сассгаєеса 15 сазечтанса десуссвася агузавсоус зосадеєваз Єбсасусола срчссоодає 1749 асчадчесаає даєасаєтстя зассадасчай доссасссяу сбЕсбвказста сдосазовсе 1800 пчвазцасягу адавсвеажос бадейцсасає ГадазбрЯЧеє чавсазссся геЕдавчсасо ІнБО кочсудваса звсзасааса аскаєзеваа сЗгссазскс асадкочаду ссадтасстто МО

Хлаксосесся зтзсосазех абасзсааце совеБскоЯ бектссавсає азратадена зво пЕКсаствкс дсадасадса двавбавебо сасссосче сусскодесс зоб адаЧоє ся дкшсассідца давксссоза ссттссачаєя сзссвассоас авааповась зе РИ попосасоацо абсятсзабіа авсобсассавч поспасазеяє сСоасесавасе скеаєоуєко 160 «атсвасадое по всссася сеЕсостсцва псзуаксаса сасвадосес асаєстосесо з725 савсадасса ссаєсксава гЕтасочкоо агасактеаса савсспабса сапебсекаєе шви сівпососцаа аскссвісає звастетасес ддасксуавєа ссідвповча бугасадава -340 здсстасдліс асазссоссо агузадсває сасвачієує садаєзаєва сббаессогсце 24по саєсцдаєсзат дсасссссачу час одсас сазачяацвкї адааацусасє зставковех ик счасспзаєс зсасесзазча часа чдосогаасвУ тіІтоусасаєся осесовосов. 2525 саасскстекк засзгактсва ссшеаєакев сеспеясесу аагавесахо возвазкаяа 258 засассовсє вадезаусвос ачзуєЗаааь Бсегодстес седчатаєтоа свахдапасе 2640 кдсасстввза піказастсс сеєвцавчтс сяк ссса адсасастуєЄ асстчевсс атО0 тасєзЕсатзс чсакзаладчю сввеЕссСоасе сксгрессласа пастсававкЕ Фбаксохотоа ЕХ азкекзчтеаста акатсусаає сесасісва аксосквсос сессесстее соабсазвУса яВий їтсавссвдаз зсссачсеяеє сеЕгУссаєдта збсасоучсаае дсачусачеас стсавозаксо 2880 спас рчЧеасі чсчуозасцає Засассвсаа зчсагчевас Босаваєтча впебсасовоє 2545 скКассесда пІстлескса сосасачесс сцаксвазаєя зссвастуЄ шосоаскск зад6 жкЕЧЕЕєаєз зсадастаАєс дедодвацовс садово сасгсосостає даавсавсза зо зачавоствца дезадсадсз азозаосскоу ставсодесає сзоасевошЕсспоасустасив з15й сЕичЕкцавка ссбсптасаце абодасаску чЕдзабаств сеоКесседазч сттавсосає з185о чаксозачце ссабренсеЕт пдасвссекс свзадасєттев асссєаевод сайкесоасеєа З2г2й тактзсстава Меачессвсає пово азоа сасссвоасса сседачесцає застозазеа А аастсассва сазссесвачбв сесачссозча зеЕсоаканатх сескексаса часєессвоє ЗавБИ затавєвнаса сСсасстоусава дазссоор всвохсосає зсссосеосеся Єстаасєвес за сссесассса лачассацаєс зсксгасов аасчцсасває завуєсвадеЄ ассасяссья 3480

З"Зазпававса дпачесстся сеасіспаєс саастсссат ЧФавгзсасаЕ ссравссоасое хай чдазодраєЄсає сУсогЧасая повозасвас бадтосвсаве ссвузесаєу часссяваос хвБпао саскзчесчоа аавадктазачса сало Ексо кава сасе севаєдескс запгасаєсса зїево спасіватавз зссзасстзча ссбкдатеєс СКсосарасак прсазодзабас ануса ай ТЕО вагазвпссгя закчосвУЧау агаїткхстова Чсствачосавя девЗЕесвва епоха. 3180 зсодспесаєсє сексстовас тссусацаау чссавессос ввавссоксеста ксосвассад 3850 їасистсаїєе сводсскссо асогвачрась пасссвданлея асазагбаєсоу зогссотехї зайво заксекчЕкес сасісскцзлоай Завосассоа соаасЕсцос пассовсае стоку ха зЯ0 зазкагавсо сласоваєсає Бсскссксчес басісцвбасе зчасосесаса Спдзаакоос 020 тесектсаск асадуасасЯ свв соКа сбуадачасє завісадеаЗ сзаєвассва зво саєциєєстк дсасеЕвавао ацастссваве беуіодяцаа абссовсаєсаа асо га 34 сасадссдає сторхддвнаса сваусаасва Савсваєскояй сесвассвкяа сскеусовео та зчасасаасся ЄкЕгасаббс зуб ссооБЕ базавуватс ссвессьуку ЗсЕсосоува 250

ЕПЕЄтаасьо апасосссача сіксадаоваа авасассахтсс арассаЗссуУ дсвузасасе 4326 зЧчааіваста сцсчгуссса восочадаЗа сесссосідує ахвесссаче зссвозазоа 258 чессвасаку СазчаєзсЧа азвстаєсесса аіуссзстоас засебсбудс взазсеваксх 3345 кдавзазасавє Бачеіавксза БсЧнаасває басСЕскаеує собацазавс васваєсвос мо заксоузаца сезрскссуа авсабуєстаче сабоссаєса зоддуссачно босассаваєд 550

Чіачецісе: азсодасска васесссває асЕусседав засодасаво Чеокопвссаці 6520 пЕЕсЕтакус здсасавєзко себсосесяї севаазосатсв сссвузахає зозадававоє з1еко зазасасасач сзазізстувс ахтосстава задазастсс садебсасває Чазаєсчасає 3740 ксСасєвскдає деєсаєстас ассаєуєсає азвЕєцачає гзсдвадває довсадоцка тод чесасацчвсї одвчастзаак суаїсаства сглавсссав буєвсзавса севсзкоаакя ТБ чачцсоцвКї засзсесабв сссгтсокьЕст србасубоцеє свтазастаєч асагавЕдіє Мага кЯстзаваса десосоувстс ссбазебоєя асуссессову стодасудає вбадеосатєує АВ саксраєцех дазчайсзад сооусадсас асузостсте астоаеоодваа вавсасчєссе пак чаетатазата адвасаттоо ЧЕЕсасссче сосескасєає оессаасосЕ сорасодовУч ЗІ всхктасасе сову вссссскада дсасссасаа сесайазеує ссозасазає 5155

Ччссгаввсас азававасва етасгодева зчзадсзавас зчасзвазчачи бастасосяе вежАВі авецсссцас здоссвасстя азосасіваа сесадсатстав спасаоуєвою безсезсоке зечо ссцссцовга азачавваду саадесчссава вдеЗсабаєть ЕЧЯасЯссЯах Чесвососта 50 састачсатЕ ЄдЕазоусаса асосдіссоцоає создссаддає сессебоста досассоаоазу 540 стваЗсзсос сао аяпсех екс сасьо сеасссвоссс Есавссаєта зевсігсаво з4бО «Кткасасіс сабосубабє ссесстасво бЕбсісваєе абачссзЕстс сааіаасосяє 1520 птеЕКЕастав сКЕКаасазає счссазеска бессазтаса пдчасвазава зсвачеаксо ЗНО, їгавсассв сесзвосавас стабавсзад сЕгуктатав зассавенох чабаслаєадч ЗЕ засавзсідна свосБевсса сеБесЕЕовт асабозабає Бссасцчасст содаслвстоє 57 тасзвеєусає ссктавусєтвс абвзавесаса аяссососсот саєсазстоасс агоавкссцке зво авазісаєса здсказоасас сстасваасї сссссастьс сесаксдеося асвовасьса Бе

Чак єзатспск чЧасчсвссаї асасодевас бсдазассасє дзазасцьосв баосососсо ЗАВ чесЧчсессесі зсбапіосса ссаавсксЄ УкЕдссвоаао суссадасявз сосазаєстве Зо аксастцесо ЕКЗ соси ЕСстЯсецста завуєсаєєт сзспоЧавас апегчавсте БО затвсвекск окоссадусеї здосуаєсєта свуссадасв бдабссссрає завсосєбсга «йо пбдссаздас ядсозвассз ссечавзачає сте остсада забчаоссек сетассасса 8128 вікссоусса заксусасава абасобосто савосссодав соссзсевоа аассстя 85180 слачаптакза ссавоасудсс ваславуказ асагсовазвзаес асескатесте асоястсеосту щейО стсссстсав всасосвскст ссвасачсає чаавтсособа втасбосувас бсассоадеве У сттссспсосбЕ сЕдстассяа асзуєтеска абстагазав патесссзаде суажевоєто зво завтштвцає Ссвабасьго сссватасук псассатаєєт сасстатєдає аопетасасх баг гассськснц стабксвссю цЕСЕСссазб зватсводає осаєдесвсев пебевсатує 4 во їсвЕсакуєє чЕстасвавс сктоаклсотає ярсеставск ссадсазовов акопгаводеє еБ45 хжавхвассс соуассзавс сссщсвесек чегессассє зевстсодоє песесстевЯ се00 зЕсосцовас абсо Зозсскєдає зсасссасс Кесохсесст асаарочзЗзува веБО чачеккахев сви ссвЗс азстацасто сесзадвоусс сувауазсза счсасуєчає в72о засєадатаяуз асакосвуаза созоцсасаз адапвозссЯ зсасасстав стсабзаєви єтяй зчавзузЕсу ссабссксув ссазаачаєс застсзеєка ссаєдаєкта свбкестасах БО басеоаєвсов сеобеваовааї Стооссцівас тбастодоса асстахтачеє БЕсесзатав 6335 пуксзассацва агссвовата КЕКсаобссд асєсостсора зсасаздавсв геБЧасассе 9360 соїгсссаєхе асбгссавтя сасзсреаіє сасзбтЧусьс сцдссвесства сечавхевує аг зававсссста склався скставсоссат вості ваА КетахсКЕВКЕ абазсеетесх тан чакзгшстдс спсавсачео сатсасвесте асосактссза стусазчодса захасхатаа тії весвсавчств аатусєстодаєсс астусозааїх сааучасттс зстсассзада тусскадаеда таз зласзаєсува чесачесвеє зевеоевваха доассесаце ббаваєссака осастсвесв тб савсазакст собксотадуев авзасоксщшса сосесерсод здавав досоаєваєє 3520 чадазчсточ куассестех часлачсска ссзавовксас зсазачоваа дачачазачо 738 саєдоссасу кбастосовза дессоскске пасчачсато СобвоЗбсув суваєставсо та4о зткчасодса сссвачссас ствасассос Зазассовос ачаєстазся зазесастее зо стазацстса саасссссоя даасстстов Чосоаставо пвосававає авскевуютсх тео сдавстсасва секосссссю Седазасаєт ксксавтеве басееесско вавнаєдтове тега аскскихачі ссуасатузе бвасзсссч сосстзсаас агечізавча себессацавач ТВО чсслрачаса соус бсвассвадта яаассасоссо бодссбавсоа асстоувоса тт закщассеса дваасавосв СЕ сгасеча ївосЕцате боїсосаоуа басчвоавазве тя зазасазаце псаїтасесос чсксасоЗаУу авасеЕсбасес асссавасос сс осохас тео здацчатсаат пчакесаськ песесессвс авесаєлаавь дагвесабяа сусдчасваса 1920 чсдасссваа стаасодано сессскуаєе ваєсбостоє дарасссєвя ассвасуває ТЗ гастрссавиє зсазанеаєве ассвозевсо сазауеєасе звасевссвд засааасоаз важо цексвзосава соіссослесва чевасглсзає зазоссесса зсзсгосаса зпЕвсассяв ВІ0О

Зозаваочса даксескесої сбсяадасвт заяаєстодсс яссваєтада Чеозсодчана 8165 стсавксаск десссаєссо озцссоаача босасекесе ковссуєсвЯа аскубасєца 82хО їсавасесєї сапсачгаоавоа кчаредацає асасатаєсєк ссасгатасєс апа зев нтно кладссабпе кЕвессосав Скбакрасає Бессссесау сасктссзуз зосаквавоє 3 зазчзшесссста асцасасгває згастсбааст бсссассвад всдааксовса Загааксовау вао чеасосбчзаза астЕсаекха даасксосат цсабоєкасе дсвссовава седаствасие лева кхчссвасчаї ассбссацеюс ссазосьосУ авсодабадсов Босвосстова асассацавЕ вило кесоасчеЕса счесесасо язвесссясу дезадааасс єсзасвачач водах но зсечзЕсассс вЧаадєсаєсв асдавссгтокоу гсвасадоса Ссоовускчєс ссевазвазає вола чЧсабсасасє асадсвачесс сосадусавс ассобосата сс чаакоастцах атом зстсаастза асасвастса асасвозває спстсасчсас собагсадетв сазасувове 75 такксоЗас сазавсвасєк пвасСекацек соесзасад БЧасавечасє сзаєсссвгад зго асвазасуаа савасесьск пітдсассоя вавсзадаєче сЗксасодчеє чаксктасахв БОІЧН скЕдстласає сазадекУуве аосродсаска сесазадауа кгудадеваєссакусстаєує 40 ассогаєссотї секосеЕссса чаццавааас Бізе асавх ззазаачесу астссесаце Зоо асзпачачас хсесзсвсвЕсо певессеква висвЕдасаєу сазссссавс азвассовсса Зоо пчЕдстчЕсх тлахтасвоспе тзахдекзто авекозЕсах: бЕплебастея сасесасота о зскпдесова дагасеатчуах вавстдааво сувазодава свасдадаєц задсвсвсас зіво чзЕсзоЧеЕЧа Есчуссачеозу сзбатасаса сСастсацава хтассоааває ссававаєоє згас сдсасадаче зсбстоссда асасебціса дісзасссво Басадосзас азоагвсасахт з30о качдассаєає сасіуаєусєв Заадсводас зеосвоауав ассбескєса вепвескева За6о чевзасасяко зазавсусся всдахтчаотв зазаачааєх завЧсбсво чодвксадов 3425 птвассаєте ссагасусвео сбабусакає созавчааса дазастїсст дассттавоє за стабЕксачу вкайаестде асаєсстеоєю ЕЕ Чсадав сесасаєссв Свосеекка з зЕбсрассЕв стсаведаце СЕ всатся астсашевас астчсвоївоа авбасівихса З500 задаспавце звссасвсасе сстокіссова адаваєадстї Ксавадаєвс аголасосує зЗбеб ксчусдсавча аусассвсос сттссогасо ссаціосодза чесавааосса асісодслаз зо счасвадсес чесвцбачса асгдпвоває сусаасвасс вакоєтаєьа срсаваєссту 78 састчсолає чедадекска гобссеецев косеозітЕЄ срзсатодав стазахдааас 850 «зазвуєувас асаткасаса косазсабає зсвозастат свесевесає Бахсесзаза аз азасааєстає сагогбсяєе оче вокса ссавсссосає сссастессо чссозавзсоє з сведцесЯсеті Ббазасусссе сазаєстасо уссашаїсда вчабасадчаа грасачадає 10955 качсасасса сіссавосаса сеЕдвсавока чЧЕсскІвааса сдЧсуссдоа сіавакастє і9080 падратсласс собака с авбсвсссад авозссдосо гясовадвас аасадвасев 191455 патсаптоаста спакссссса Стас садса кКствтсгсса гасодкаєтає кавова 10295 сгостактза вксзсатуєтс сеавасстча свасваєтса заасасасвєс асскодзатсх 1955850 чсачідсадв ацтсабачее сззсабессс ачкцвазаса вссавЕЗква сЗсказадед 13520 згасати босскасвоа авасвасчеау поебсчадуса ссостасвнах ссогасуусну 10380 сзбассосту чоссзваста састаатасо зсвососсяадча сесвоадасає зпосасиосх 10450 чааїсксссса зЗсзуеацаса чассвгсас акодевзазіу зкгассасакхо савЧазссаца 15592

КЕваїссідсос саазашзааза Содсаєсссуєс зсавассосав ссвасогуЗс скоссадаво 0550 задестесяєс Стагсгаск сдесусваас Собаче Чоастодсах гарссзасова і95ап ліяаавтств зссєссчгає бусакодасі свсчасадса дессвдваст сооасстаце і1968о ктзсаїєсЄкаєса баз уасза зазссасуаї сугактічуєт зсЕсвустає восаєзсвад 10720 акцеачссва асаскдосяв Заксачувая збгаєсаась стосу своо йквадаєтає івцоа ччассаччссч сечазчавсає зсзкучавух зосбдеваєсу ссвосассва ссссачлоаса УбвеИ касавачезла састбвсосвсо бзсавісзїо асізпсясзча січстозаву сдзадсехакє 10520 ссевдесбодаєс сСтудсяасасо зсосасасву тсатаєвозасс адоссаєтає ссгозасваЗ мова еЕККоєдссо Єдазовзадсс єсскудассЯ чЧадасаєаса десссссасає сабо зчче тІ104о тасоссавая ксаєзодсуас увасастоко Чбссасосоа стяскссаза бувессксова 15105 чагасстста зсзкаєсчаз ссоздоссадо баса кошеу сазаасаєковя сЗсасосене 11155 сскаєжасва авкссеепез ссозаєадас адасссоасоу сесасастесс їдасчнатаса 11228 кцукЕчассстс дгоасадесає сзакуссвое Часдасадес задідавака дссочавоче 11285 акгчпгекЗасз задасасско соясолачася сктбазочає чоЗоуазчас закачскае 113555 часазуачсяз аасссудаду засссстаєє зхассасат сбусудааве асавдассаєу 1:

акдсапессу стевссцосца ссозччссая сссдасроос взодадечЯес Суєсесссах ізо десцядсаач стос ссс апасестась ассавцасад ссезоадеза чссаЧаееее 11520 аассдізЗавуц застасогст Чдеесасзесь досвассода задусстосо бззазасова 1185880 азазчасськг гсчазудвав сстосацасї здечеЕсаласва стЯссдадав сстебадчаса 11690 тасаваєсяоує спос с асаласосссос заддстосеч ашпсбассосоч зачацсссоо Тов чесусчаскт зсауссзазчає задссосачаб сусаєсстаче зстасоастоз задшаєскася 1і175а аззсачсзасу стосодавос сова ассдачаєса аЗзсеразцес ачавазааске ц1аза заачазссдса сосзпчацеасс сЄдасссвааа Єгавсвовос суазадсвав асессачуда 1їВяо чозваслдаа чесхасста сасзавабсо стссвсааза опсзсачавто Єсодаачава 11940 састкостао стспугсасас ссавассуст дстасаскосд содааєтцдса саясаєввоо 1202о секазчавсау соассавачиа ссслвассачи завчотесзо асгозодада ссоссе 12050 сІсІБссасз апачаєтаса чЧчачовачева Гсссачуавсу ссобпдпсаза ззачассава 12120 чабсслтавкса чсзаззааес сСссссасаяаваа бсадссвіся адссЧассав Завасодкає 198180 пасток зпдсасосоас звасаууваче ассзчасссаа асчасзЗаєза БЯсстксоєс 12240 зспеавасаз заазссстоа завотаказст цпазтасатса аапазсбсвоа засссавасц 12300 лЕвЕсСЕсаці Басусссацча гоуросазчас спосазессяя асстасвайс ссооссдесву 12360 ччсектвоса когссастача сазазктасос асасстасву Ссгпсасскоас ассеуєтває їза2г9 сЕпасвачтає ссгасссачо гепазсаває ссруставсе сакссаззсв бапсазссога 12489 ссзазсваса Сссвачасос созакастсс зсбсачаєту асссссстав зазвасасво 2545 сствакслачча засстактозва чессосодава ссчассазаєу зсяассвасаєс акссвасаса 1і2гвої зчзсасесзсв: уасавеваве хсесеєзЗаво тасаєзгаба засосасаса вадсодевах тав заслтоавсоді ачепавссса додссавссво бастевкавЯ васскассач соадеосгсвах НКИ тактсвадас зсвускстс: пісочасово сто 12753 «їз «вії 2330 «кхг18з СРЕТ «гі13х Аїсребитив швуавикоічЧев: Яців «05 5

Меї сіу Бех ТЕЖ БУ рез ро Ті уві біУу Ба деп Аза бех тп ТЕ 1 5 10 15 ка дегоОео бек ТВх Пец Ага сій ІТе Ав Зекро Аіа Віа вій Аза Ре ай «З 30 сбІп 5ет дак Беж Ро аж Аха ше бек Мпув Му Бу век дка акЯ Уді з ст; 5 цу Шеж ІІТе Дко АБО» Азр о бТу Дар о біу бек Уві Ето Ар о Бро Мас сбпту

За 55 5 нія бту бій беї І1іе Ат бій бу ей Аза б1у Т16 116 Авробем орто 55 т 75 о пуз біз біу Віз Бех Аіа Рго Авр Уві Авроїіє бсх Ніз бРу Зек біз / 85 зо З

ДероНік рух Віз Зех Тух бів Мех Ап оСіу ї12 цей АБа бій дехї Нів 100 105 110 дапоЗіу йка Нів Дід бех йем деко був Маї Тук Вів Бе Сує Ти ви

ВХ 1525 125

Швв бі біу Був ТВхотсю ІТів Нівсбех а)! Пен тах йіз Авап Ап СІ 130 135 140

Мес віа Аїа Аза Був Ріє Мес Аку бек Уві Ака ТВ ТкроАїа Два о Авр 45 і 155 155

Тит вве бЗіу Бех зіш Муз Аїа 118 біп бен їі А1з Меб Аїз ТБ Бхо іт ї75 ліз Авр Має Ахо Те дв Аіїа бів ЧІз ТТе дга Тіз Аза Авробіп Рва 1855 ї85 150

Маії біз чаї хо біу пІу ТЕ АвлоАвп о Авп о баполує вів Авзп о Уаї бік

КВ 225 «05 їви от1іе Маї бі. І1їв Аїа Зто дка Тахо біу Уаї ех Аїз Маї Тгрорто 219 -ї8 ТО піу тт З1іУу НЕБ Аід Бек обід дп вко сід Пей РКО дзв о Аза без Так 225 230 2183 тай вха пу злу тт чаї Бе бе ЗТу роб БКо АтТа Бек цек Мек Ав) дія 245 259 255 їеца Сіу АвроБбує Уа) бле бер о бія ївб ї1із Віа бів Азія діа біу мі 280 зе5 2

Его ТВ о Сені діа Ткр Бех бі Бех нія Уаї зім бі Бк Без бі пені був ес Авробеї Тіє Ркбобій біо Ме тТук Акч Гуз вів Суз Уаї тає 250 255 309

Тре діа двроспій Віа Уві Аіа бек Суя піп оМеє Тіе біу Тук Ро дів 303 о 315 320

Ме т1іє ТПув Аїа бек Тср бі біу біУ 01у був б)у Ті Ага буз чаї зЗг5 340 335

АвпоАвгі Азо Дар бій Маї Був А1а« Без БНЄ Був Зіп УЗ бів РУ сти 345 345 350

Уаї Вже П1у Чет Рхо Ї1е Ре їзЗе Мес Аку ем Аїа бек бій Бех Ага 355 зе0 385

НП зей біз уаї дій без спец Сув двробіш Тук йпіу Авт Маї Аза Ата

БО 315 489

Газ пі бек Ак Авор о був бет Маї б1ій Ака дка Нів о зіт?; був о їде їв з5 380 395 за0 п біш біу Рхо Укі тлк Узі Аїа Еко ВЗкуУ Бій ТВеоУуві Був бі дей 425 410 415 піч бів аїа Аза Аа Ага Гей ойіа Гуз А1а Маї біу ТУк Уві б1іу Аїд 320 425 430 діа Так Чаї біб Тую без Тук Бех Меб сій Твакосту Зіч Тух Тух РКе йо о 345 іеч біз без Авпобто Ак пес пів Уві біс нів Рко Уві Тву бід бе 150 55 1850

Ії вів біс Узі йяп о йем Бгто авіа Аза біо Уаї Аза Уві біу Меб пу а БУ 470 475 Во

Ііа вко пбей Тер оЗільоїїе Рко Бій тів АК АкФ о Бйе тую сію Мебє Авр 585 250 «35

Ави Бі бі Бі ТУук два тів ТкЕроАтЯа Був ТУ АтТа Аза без Аїа те що зОп5 50

Ето Рпе Ап рве Ар ат Уві авродет біб Тр орхо Був ОБУ НЕБОоСув вх З2О ий маї вів УВІ Вт їле твЕобаеак сім АБО РТ Авр»оАзо біу па був рЕЗ 530 535 549

ТвЕ бу пу Буз Уа) Буш біо І1їе Чех Ве був Зеє був Рей АзпоУаї

ЗУ 550 555 5 тТев оту ук Рпе БвЕ Маї пу бакооіу піу СРУу її Ні Бій вБпеодів

ЗЕ ато 55

Аввозех Ів Бе 01у нів ХМаї ре Аза Тук СКУ СТІН ТВх Акч бек дія

ЗВО зЯ5 330 авіа її тТвг век Меб бек Гео дів бей пуб БО Її піп. їз Аке Бу 555 оо ва5 біш її Бів Тв Авт Маї Авр о Тує Тих Уа АвробБе)з Мейо Ава Аіїіа БІ вхо 515 що азрогпе АхЗ бі: Аве Бик Ті Ніз ТЕ сіу ТкроВБей Аве» отв Акб4 тів

БЕЗ 53о 535 вай затв Меє АхЯя Уа1 бій діа бій Агу Ро Бгто Тхр о Тух ї1е бек о Уаї Уві 845 50 БУ

ЗКУ Біу Аїа без Тук Був ТЕ ї1їє ТБ ТК Авб о Аїа бій тк Мак Зак яко 885 575

ЄСтіп тує Уві Бех Тук Це Бі Був біу Бій іє Ро со був нія 16 515 вко 685

Зек їжа Увж НІВ бек ТВт Ті пет Бей Ап тів біб 510 бек обу ТУГ 53 вав тав так тіє бів 112 Уві Аку же о сіу біб бі Бек тую АкЧ Бей АБое обеш то т10 715 зей дашповіу Бак Бей) ї1іє біс Ата дво Чаї піп Таж Пер Суз АЛарозіу пі

Тао та ТУ йей Мед оМев бій Сед АзроЗіу Два Бек нів Уаї її Тук Аза чіз бід т40 745 750 зЗій АїФ 51іУу ху ТЕ Акад Гечм пев (зе АБ сЬУ Мув так Сув ем о беб 158 75 755 зів Ав АвроЦів Аво Рго беж Акоа оПбе)з па Ата біз тТвх Вко Суя Був пла 5 789 ії» без вта РБе цебз о ї1в Аа АшробіуУ Аза Ні Уаї АБр о Аїа АввоУзі зву таза | 795 яро

Рто Тух А1а сі; Уві бій Маї Мебє мпуз Меб Су Має бго Бей Бец бек во ВІЗ 815 кто Ава діа сіу Чаї Ті Ави Уві Пеш рем бек зів зу Біо а мех 379 825 ло

ЗІй АТа б1У дво Бей І1в Аза дру ва бвр оте) дзроАБю Ро Зах дів 315 во 5 чаї цу Аха Ага от хо Бе Бій 5ЗтТу век Бпе Рко біб Месосбек вм 855 860

Ехо Т1е Ата діа бек біу бів Узі Нія Бу Ахо Сук йів Аівз Бек Гей щте5 ло Ба ав

Зве ха А1їа Ат Меє Уві во Атїао бу Тух Ар Нія Аїа біа дви був вА5 30 855 ау чаї біт Авробви Уві Тер Сув ївБО АвротТвх Бк Аза пе вхо: веде

ЗО. во5 Зо

Без обіп Тр обл; сій Бей омеї Звкоаї пе оАїа ТЕЖ Акад їі рко Аку з15 320 з25 І тб оїо ГПув бвх біч цеч Біб сіу Ббуз Тут Аби біз ТУЮ Був реп Ава зо 35 зо чаї Авр Нв Маї був Ті цув Ар оре Бгто ТБк осі Месб оцем Аєорозма за45 з5О 55 ва тТнкЕОоБ1в собів Біо двпобей Аза був Уаї век біа цу8 Ба Меє Уві ТЕ заз З З75

Ітє бл Ака Бей у АвроБже Сез Меб ек ле дже пу ек ТуУух сх зво 385 за іт зу дво сі: пек Нів Аза Пів БВе ї3е Уві був Вех без Рів сій зва 100 Топ сій Тут о Цей одег Ууді ім 515 бен, Рве бер Азрозіу І1е бій бер 1010 1605 Того

Авроуаї іє біз Два без йо Без біп Тух Беу Бу Дар цем бі 1025 1930 1035

Птв Маї Уваі Авор о її Уві Бе: о Бек Віз біп о Зіу Уаї АкБа депо руз

1750 1015 таб

ЖЖ Буд о Пей; їїіє цей Аза Сей Меб біб був зеб оаї Тух Бко Аяп 1055 1260 1085 ко Аївав Аїв тує дво Авр осат ББИ Ме Аха Бпе Беє Бей Гей оАви 1075 1075 това

Ніж пу АкФ тує тук Був Певй о діа їм бух Ата бБеї бій Бе їж 1085 1090 098 бів бій Тв Був без бе біз Гей Аху Так бе Те АТа Ака Аве 1190 1155 тт їєцш бек Ав бец Ар о Меб Ве отТнЕ біз бі. уз Діа Азр о рпе бек 1115 1129 1125 ей біп дзроАка уз пей оАзв ї1е Ачп Пій беї Меї ру вро гий 1138 їїЗ5 ї140

Уаї тах Аїа Рхо Пей РЕ Маї Зіз Ар о Аїа Тед уві Зек пез Рпє 3145 Ух5О 1155

АвроСув о твж даробіп Тк ої бій бів Ату Уаї 16 бій Так Тух 1169 11565 ТО

Ті бек Акч Бей Тух сій Бко біп о бви Узі Був Авр о беє їїв бій 1175 1180 хІ85 еп оБ»ув Тут біп Аз бекобіу уві 1їз Атїа Бей Тр сім Ре тпх 150 1195 1259 взіш біу Ахп Ні с) бує Аку лей обі йіа меж о маї її Пеш пух 1295 ї255 КЕ215 пак бе біз Зетк Уаї Зевс ТКХ Аза її о 5Зу дія ла Бей Був о Авр 18529 1255 12539 вра бек о Нів Тут Аіа беї бек діа сіу дзпотпх Уді Вів 11є Дів 1255 1240 1248 їн бе АзроАТа АвроїбЕ біз Ппез дав оту Ткобіз о бвробЗех 01 1255 255 1259 двроАзи АвростіВ Аза біп Агро пув Мес Дар був Пец о дек Ре узі 1965 1979 1275

Гей ру бій Аб5роуа1 Уаї Меї діа Авр о Бе; Абу Дів о Аза Ав Мах 1289 1285 1290

Ппуз' тугі Уві бет Сув Т1є Уві піл Ак Авробіу Аба І1з1є Мек о бто 12535 ТхюЮ 1305

Ме да Ак ТВу вВє маз пшоа о бек бів біб був бек Су Тук 15 1350 1315 135 бін січ бо ІЗ іс» Ака Нів Уаі біз Бгто Рез Без Бек Ада Сец 1325 1330 1335 це» чій пед АзроБув без оБуя УВІ був сту Ту оАни біз Меб був 1345 1345 1350 тух Тако Вко бет жо Дзр о Вга біб Тер о Нів ї18е лук о ТБ пез Ака 1355 ЗВО 13655

Ап тнє біз Ави Бко ПЗ Меє без нів дко Уа1і Бе Бце Акортах 1370 1375 1386 цей Уві дхо бі0 Рго Зек дДіз. біу Авп Ако Рне ТВг бек др Ніз

Т285 13959 1395

І1е тв Ав о Маі бій Ма1і буу і8ОоАТа сі Зі ко Бе) бек риє таб 1455 1410

ТЕ бауро бек бек І1е рез Був Жах йео Ме Ії Вів був Сім одін 1515 1420 1425 зви: біз бейп Нів діа Іде Ага Тпк о біу Ніз Зежт Ні Меє Тук ем 1430 1435 1445

Сув 116 Бей йуво сій бій Гув Їжа їжа Авройец Уаї орко чаї бех 1545 14155 1455

Зі Авп о ТнНУ Уві Уві дер Чаї ЗУ бій ойхО 010 Аїа Тпг о Ата с сСув 1450 ху 470

Зеї їмо цеш Був бів Мес Віз беб був її НОВ б Бей узї б1У 1475 тава 1485 діа АхЯ Меє Нів нів цей бБет Уві Суз бій Ттхр обі ак рив без 15386 1495 1500 ру бен о маї Зах др біу хо віа беї сіу Яеу Тер о Ажка Уді чаї 1505 1510 1515 тиж тва дяп уд Так обіМ мів ТьЕ о Сув ТНк Уві Авро Із)Е Тух дк 590 1535 1530 спи Уа Зі Авро тик б5Ій бек о бій Бу Бе Уаії Туко Вів бве тек 1535 і540 1545

Аїа це о5еї бек Біу Ро цеб о Нів 5іу Ма! Аїа беш оАвпотТпкозех 1550 1555 1550

ТуУук діб буа цей Бек Уві 118 Азробеш Був Ак Су беє Аїд АхЯ 1555 1576 1515

Авповвпо Гув ої ТЕ ОотТух Сув тує Авр Епе о рко бав Тл орре б

Т555 1585 І595

Аіїа вів Уаї піп був Бех Тур. бек Авп оТ1е Бек Зеї біз Ав Ап і8зУ 1650 1605 сіб був о Тух маї Був'Аїа Ту Зі Ббес Узі не Аїа бін пу Авп 1619 і415 1625 піу бек ТтхробтУ Тв обо Ті ї1е Ркб Меб бі ба АТїа Аїа Ііу 625 1630: 1535 їв) Аше Аяроїіе біу Меє Уаї сАїа ТЕО Гі їебв дяр о Меє Беє ТЕ 1680 1545 1659

Ркго бій рРБае рто бетобіу АкФф сій 116 ІТ6 Ууаі т11іє дів Авп оАвр 655 1860 1655

Іба трж о Бче йто Атїа Сіу баб бле сіу Ро Ака бій Авродта ве 167 т875 1680 вве 510 Ага Уві Рв оАвп ого, віз Суб Зі Був Був о Бемовке Бе 1685 тео 1835

І1е Жук бен Віз Афа Ав беж піу Ма дке тіє бу Ії ліа дер ї7а0 1795 то пі; заї Пуз йег Суз Бре Ага Уаї Піу Тюхв Твк Авро Ар Зах бек 1715 1750 1725

Ессе зів: Ако БіУу Рле Ака тук о тів тую Мет Тве Авро біз дяро НІВ 1735 ї735 1749 двтойхя 11іе біу бек бек Уві Тіє біз Нів Гру« Меє бій Гео Дер 4м1та5 1756 1755 бех бІіУу шЬа ї1е Агш Тер Уві Її16 Дер бек Маї Маї бу Був лм 150 і755 Тло

АвробіуУу фец біу Ммаї біріАБи їїе Нів біу бек Аіїа Аза 1Же Аїа їт5 їв Їтча

Бек діа Тух бвпоАка Афа стук бів біб ТВ рве Таж обей Твх ве іт90 75 1809 чаї Тв о БіУу Ара ТвВЕ Заї БіУу Ще бу Ліз Тук ех іа АкФф о Бей їн 15160 Т8І5 бі іє Ага Сув Іі біб йо Їів Авробій Его 116 119 Пец Так 1559 18595 1830

Бі ве Бек Аїа Без АБп о їув о тей їз бі дк Зії Уві Тукобех 1835 1840 1845

Зак Нія Мес піп Беш обі Сфу Вго руб Ііе Мебс Аза Тнх АвпосМу та3о їя55 тка

Уві Уаї Нія їез Так отТаї ко Аве одвр о пец бі біу Узі бес Дей ї865 алла 1875 її рем о вйгу Тер бец Зек о Тук Уа) Вго Аіз Азпої1є біу бту Вко 1889 ів хво їз Бус о 1ф1е тдк був бек їцез одвробко ї1Ме дер Ах Вко уаї Аів 855 ізо Узоа тук Ії Бко бій дДялп ТВк Су АБО Бео вка Аза Аіа тре бЗес З1іу та160 1915 1529 зйй Ав Аз обек біп бїіу уч Ттжр о їєй б1Уу сту Меї Ріпа АББОГУуВ 1975 1939 1335 взролеї РБе Мат бі тн гне бій ау ТЕЖ дів пух тв о Уаф очах 1340 1945 ІЗ50 тТрЕ ЕМ Ака Аїа Був пай стру ЗіУ їв Бво Мві Ку УЗаї 112 Аїд 1935 1365 ІЗБ55

Уаії піз. ТВгобів Тк Меб оМек бій їги Уа) Рхо Аїа вай Рео бІ1у тай 1975 т98о 16 о бго Азробек Ніз бій дво бегр Маї Рхо Агу Віз сбіу біпомаї1 їз8х То 1995

ТЕр вва Рхо Ввробеє А1їа Ту був ТНЕУ АБА біб Аід Мет бец одер 2009 2505 2819

Вде двпо Ага сій бьу лез йо без овне їТе Тем олії Аваотхр зго 2О09О 2025 сіб Рне бек бі шіу Сбіп ой лАвр о Сеа Ре Бій слу Авпоцей бій заз 2035. 2940

Аза Зру бек ТВж Її 8аї сій Аво Пез дк ТВ туго Аве» біб ро 2243 2150 2083

Аїа Рпе маї тую її Бко уз сАїв діа бій Пей Акай б5хУ біу Аїа 20пво 20655 2078

ТжвомМаї уаї ще Аяровек пуб їІзе Дай бо Аве о Ату тії бТа був 2075 2085 2085

Тек Аіа біб Акя Так оАіа с рує ЗУ Аєпомаї Бей ЗБ Во іп Бі1Уу 2990 20595 2195

Бе їїе бій їїе бук Бе Аг Зек ів біб беп пуб 610 був Меє 2105 ві 2145 бі дк їва Авр оБко 10 Бреш лів Авр оцей був Аіїа Ас Без бій

ТО 225 230

З1у Аїа Аво бі бек їеа бет Авробіу зіз Бекоїжу БІЙ Пуз Бех 25ї1Ь 2140 2145

Іеобін А1їа Ахе Був о був бій срешобец бхс без тує ТНЕ іп. тів 250 2т55 іо

Аїа Узі Аку ВМе Аля стю оре снів Аз ТЕ дає стей Абу МесоАїа гав 2170 ТЕЗ

Аза був ші Уві Тіє АхЗ ув Уві Уві Авв'їхв сі: двробБек АхЗ

ФАО 185 рено

Зеє ве Бне Тук Був дк Меи Акт АкФ Аха цер обех о Зіз Адвроха) 2155 220 225 це йАіа був обі; Т1їе йко сіу сМаї Т1е біу П3ій мпув о бае Рко Нів г81й 2515 2225

Був Зек АТа Хіе біб Сей ІЛе Був Був Тер Тук реч діа бек ПІЧ 2225 КеЗО 23

Аїз Аїа Азїа АБе бІу Бех РНК о двроТка АБр оАвроАвро АвроАїа вне 2240 «ак о чаї АЖа тр о Ака сій Бза Ре бій Ачй Ту Бу бів тує Тї18 був га го 265 сії зво Ас дій біп Ася Уаї беж АкЕ5 Бей Геб шех Авроуві діа га 28715 -ЕяО ту дво Бек дес Авр Пем сій Аїа бей Рко БІЙ б1у дез Бек Мет еВ: 2295 аз бем бейп Ар обу МВС Авробко Бек Буг АтяЯ Аза біпо Ре Т1е 930

Зп 2335 ЗВ 1 уві Мек Гуз Ма1ї Бех був 315 зга «1 15 «21їз 12683 «125 ДНК «гії» лібресиков пуовитоїіцев Нио5 кап» 18 хсаФфсстаса зчеацесабЯ СесуавЗавас аскусаасте сустуссьов ссзазотаво 80 часчасчада сссвсабабс споссабвЧє сасдвссаас чсасссасва бассабецех 120 зЕссасіске Суссазаєза асссвосеяе сасесовеео савессссує сссосссевацч То чЧесасссзас азпадаавцєс сасчкоссва зесзасавсяа баксасодоез асСзсвачодх 40 адстауавсех фозчсассазч чЧесаяросву сооссаадоє даасстацов соасоссево Зап ассивЕссЯє сесеааєсто ацдасевзЗсає ачаєсвкасьс бекедваєсца падсакчовие З36о чЕКсСрачевк авзасастссс васастухас сасавазавсча сзассвзаува бзазессавста 45 сассаваксск сСсасвгаєкає Сетбаєсзоод секоскааав сЕБеадтексяс аревавкеск я сптвавцксва бабссвсвсс сбровасесксс ссоботессі дсассдатлає ссавосаФчо о агтвуцзава їсесуаскчп віСазчазосос аасавссакс чдестеЕздєсса савзставаєс віх сосодссваєс своусгада содастесоає Кугсвасавс сассведаєу бЕессттавц ва ччаплодавс асвазазтає зубаачказа адескбаясоє 5счпваавата сосаєстаас т2а стссазпобаче астеособасс честадаваа аїсбсаєсстсе гавацісїса зсаассосав тво адасавоста сгасусдаса дсозсвавовс спдбодвова асавососиЕ бубесасася паб акзайвааца сайасвсасту всесалутає чебзсазс азаваєстає чдазбоватєоє Зпо сгстсасдака СвабадсссЄ дуавааовас дасдессада тестдсвсвх Бдзсвавтоє зе загсасзаза гссаазазує содсазасся стосстстсс всвоєвавєся кЧеквастя істо сзкезабсссє азкссакасе саЗабсасзад сссвускадо аесзссцасо сосбовзазая 1083 зудсадсакса дспосачаєд боадасабесс зсзоасавака ссвеадсаса сесасатхає 11550 адсктсвУсЕс ссЕгдааача зеозчсаазав геастакаасоо абзсатачиє себазаско ї150О зстісоасесра стаксассас десуазаєус ссаазоссаса заєссозссає вессатауає 12 ссгасасссісс апшрасассс вросассвся сасссостує задссссцаа заєтдайсоя і13958 тгсадсясає ГосаассеЗзе аачасесвас сІсрсататаз сабезстаєа звасезиаито 1350 запгсиссчса кстасаасає пабісаклсч сочтасацеа сасбадсааєо сСтасазесу 1420 ачатикессс всвзсбаазесїав гоаоааавсстає поптсвасско збраваччсаа асасостсяна: 1555 ассктЧеЕксях васодстаса дессадцутає абпуссяссяа сассзсасоо аусасеЧеу 1556 цугассптаса авзасатстска Єбодазазає БЕ КкІпЧаває задтавучЕк базатркаяи іга гдосаассда авсссвгасєс сучаказсаа Забзавізає ссасстосує ЕкЕрЧатоса іо сасразасах саскасяхса сасабаєтаєс сопоасгоса деавовассо бсостсскосе 1745

ЕскесзасаЯ піосдаачас сасзадаєсст сесвассазає осзасзчцаста стсзаєдаах ї800 сасавтавсча зачусвсзос вокскокста зассетасуа акстхосася савтсаУєу івбо чаайдаасвос закссасває чусабтазссос совасаасоз вабсусвазса чссвзацевса 1350

ЧсачавУсає сесочасасад сссавксаса сатскацосе азасавцясу абксазіста 1880 твзстатсчус авсрссаздаа чЧасасзеуає Сезаасчсаде дсвсассваа аббусрсаєс 2040 ачсЕссоксза аусасстЯЗе ддавсзазов'агсгавесзассв сесазаєчес савсосасат пй сво єсац сасбапвсає сесбсцатаує дусазеі баба асавцєвссю спос роеє РО тазчсатчаса сдосаасссс вобсеЕсСосвч асассададча сзасічасяс сьсоцессту ви тазаскачЕ спаЧесоаводе воссцЗачаасо сстдвастос сазчаєдлаєст вастппсваза дя члааєкцсскх Спссозечес воссазсвкса гсаасуласу свссвадеся спасти лк, ксадзсссса сЕдсрсазас ацсваоуЯкК сссаєтствя сссззачеує вбсабасасе 2400 здссссасахє ссЕсЕсеЕває завесаєсаієс соіцавакока саЗсзчазгше аббзЕртває 2468 сбакзясаке: сЄсбсавсзваєт сбодазасес састадазск Безссеоаво содаваєссої 25 ачаавцвзіоса сазчазачес геакуссвсва соустаасуа авосварваса васеусєвца 258 спаскоацста ссебассаєЯа агсавчасає сстуадасас тадеЗасаза чауднесасав 2ваа зчзедсасеска кловсстЯає сосезскосаєс всвосезасс зсабузаася баса да касасазУа Кадсоставс сект заса асгаадоссц віасстовка сааЧосаака Бо авіласчесда зассвавуза ссосссвачс зассесеооя бзаавсксос дустосесоа 2вий

Кабстассає узуасеєсяса сстсацаєта дасскстевта дазакесває єкбосавоасо 258 тзссчсавсе зчассотата Єлосасоваь зддавосстса бсбастьстве сссасатуєє 2345 зазасссасас оссчсватої деествабавк овес вс оабЕсадеєсо зкстосеотю засо гссосксоха задссеозисве соссовазссо азобастекча гЗабзуавсає Здсавесасад зво садсастєсв садісоєсувЕ босадіскоо застаєдаса бозвазозбва воабкосвсов ЗО заскчазаєст абсавсстсвв ЄсесазеЕвсв ссстсасоуво базі соаї саваявоцево БЖ зассчЕЯсссо асстсусевд стасявзсзу аєсасодаоу азудассвує Баскаскусе тро собосгдеаза сачечавазов Ясбачвусаз дозасавоча дасісассва чоапочоапУх 3300 касарсласо седстаєтаї сдвасасосс гвсзоасавоад азассдосда абастакьско 3360 стусачесса асссаєудек ссвочсетас сесогссодас вскогссача асевставох 3495 сасссчосацу суксвасаке зсставахяудс сктактатссза Усссачсасс свдесасоца, 3480 чесдарадесе зазасазаєт сдсссодсвус ссазоаєсаса чссозузаяя чракассесяе 13540 ксчасацаєт ссазубавста вбватаксас сопасаватачЕї ссяЯскссва ксссасаєсе з60о сЕтскуссса астабебссої сСабссадада ссадаєдсвс сСсбасучаакс дасаакодау зб

Зачсосваєча сасссоддача азгазсадсаєд ссобсдебас боссасксаас секдаєдаву 3759 сазаєсссса акдассдазу чоєсраєвосса содсаоєеао дзквабсадє деЧавкссау ЗНО асдазззас свазчсостасє дасудвааач сеапвазУсчау акегосоаає Чкагаєсса. зя4о еЧЕсесазбе асассаєсуа бассзаастая акседаєськ дак свс пльзеажетсв оо чаачдатаасці тсгаавазса адосавасяЯє сеізсудабає СКсесазеса азогавоастй з360 сЕсакацево сФдесзсвузу ссабсксусеЕ гсдачксссо саззачаєса Честчсвача 2020

ЕУЖЕсаєтву аагсачіарс стсвЕскЕєЯяЯ СЕЕТЕдасся зубавєезате сзлассзасаа 4080 асатакеос пссоєсеісавс сястсесачс сктостчовач саєссаєяаа Кстасачаєе пЯНЕч) стсащеєво4 сагусааває чЧерсасчєває здаасаєсссв сЕЄСЕдссакж собаебецаєс 425 с«ктадассза заскассосо вбозїсасау засвжуесес сусссвссуа Задасєвоае 1250 сатчсазчсеває васезасаха ссссскостас сзазазацах Єсазактеує човсзаавесо 390 азхасазасоє Баагтасася зсічзЕсесв гдааєЗсава сзасдасаво адтсвоєсов, 4380 аксесасьсс жуасакаата саассовосокх асакссауєт ссср сСава аклакеосову 3440 птетзсаУвс: сосзравове каверсазчс ссосвоавссо звузававнаєсео сстасесаєас: 4-0 счабсаасто чеасассовове сазссзсуся Здбссаазог чааватесос сзсгзЧраває аа чЕсвуєучсВ пдсзадчацюво бара аєу зіасзаавсеє візстваєцє гвстдсааоє заго спкпоасваче сазлоїспава авасазстазче зіва сса загвасвоасє сова стата зн

Чаззасаата ассассаата субаЗаєстє Єкестуаатає дсгацесакс сазесавузао ато ксадасісса ссагвозсау сасестазсо сусссввасї ссагаваека ссбузацату 800 часассялсоєо вссатедассс себсдсваза бабасссесу доссасесзав овасесвко 4565 пгасагалач увавусвавї зсзсаусвац суссасассс сСхобваваава заєбексової 4550 сасавзтлеза сдабвстсзо аскчасчсво ассгасавсса свсесасазчасє гладвохага 4385 зачазесзас асазсацсса сацдассрача аїзаасусах свосбатда аздсеавсоєа 5О4О сагвсвхсово зсзагсодачеа ссогсставва сзазбасств стессстоста спрастсаєв 5105 засуєочатає засусссопес даєачацесе базсссвєта сбгатватеє ссосаасеат 5180 зтіпчазастадч ссасоаттаєх басостсаву вадзаадепоао Качйтасасвя стссетаксоь ве згдчазавас абчсссоста сачасаауаян гасвЕевакеЕ ссісясксоє ггакаасесу Зав засасксзас зчсадуасье пахтастсека Єсгсасдасте всСкавсросат бсасобевЕд 380 зссаксацса сего Ев басастссяє ссзвасєєдев сстссеяриВ сссваєтата 400 чЧЕЕвістссва 5удассасьстї бара свасазстос сзавсєзбса Євасасовао 5180 саазваздха засоагсстта асассведіс асоквзасста савсазасес долахєзазах зай сасесцЕчає зсазсвдавс засгзаасас ссхзЕдаксь скстсогтаса газабасься «5ВО акчасксосгч апчасуєьос встабаєсог авассасаса ааствсаває одсбесвасво, Зб засцассаєо вссочісвааз чсевсгадес Засасассосо усаваєє тех кет дг то зкссосседаря зсЗзсссавов счаслободе зсассасася садазаєсда. сзетасзаво. атей аедсяакоас сосстсоспкс зессастасе засдссаєта абасетвеує десілададе зво седцсавсзсе зчассаїаве асбасосеве боєсастЕсї сесстдаглава десякидсах ан зстзаачсаєс сааавсібавкс ахкавессувс ссаозссоз авеЕсссасва сзачасосяа заа0 гсссвсвасчаєс состоблескоа судваачаче бпадссассї чаазчдавско сіссадвазе ЕКИЙ заасоїтесь вЕсасеаето сЕусосваої Есвсваавца Бабостцсяа сот бдуаасЯє ваво тсестсзвата якого одсач цвкаеацвоса боасоадосвас пдацівнааса гсавочавсавє біо сватстсяава сскссіаеве бЕсрсяваса ссавісьсСсв зсачваєтав соссттатта 185 сустзаАєста стічдасавке ссоассьсека ставссзааеоз сісескаасс батасвавеї 4 зісеаассстя Бсгівасава босочаєста зібссквЕс зсасзевса бсдЕвсКсВо «Зо стастсасача стасвстбас сстЕстосса сестер кс сстсауеаза ссасавсопча 536 состіпісвст Чекабоекса Ссавуєтакс таксаєсськ усастаєсев тесвасовеса оа8о зІвусачасц свігодевса атвассостя атозаавект стае екасє досатетак я: вана скжпсасьссво бЕсосастоесе чсзусвасасе Єбусаєачхо осксбасаса зсеваоисвке У стжктоствса агодзчазгува стракаєста сстІасаво сСавазсавссса здасуєстеа БВБОб адзазуєсзазлоаї згчпссасавзе бдасассакта содсасавтісз Здасасазазоа зЗасаєетвата веБО сагссаяссо зсувсасаца адчохсссов реосгосвсявВ азабассває псасстасев та кшастєкасає встансаєссЯс вдазсосассь БоаопразвссЯ сезсазсква скоЗасавсої Бай засос: скасовасоє азсслазаєк садчзвахтасеє сассксзасх сессзсваса вай коадавовтєь дасаскстсоу пссактвать бдсастарас чдехоаксстаЗ соя акаоо о атшстазсося азтссствав пбестеоатоь асссцаКЕв засссздваєс шбаптратсї азб5О ашстсстаса астссвстак сесосасесс дасадкєсово аспесставо савсевцуєч 7а2О чазчасаває зсансоваса савоссвзаає збсзассасу ссавзчассав запас ксеосх тпво ассзачаєає Сгечачасає загсзабуєс зУБескеукЄ гссхасааса бсосацієка 7145 взатсакасса сспсікЯбза сазвассЕжес сІЄзоавадя їсстозсаєує сек ссуаци тар лапаавсод бабааєтева аудексоїко асестсховЕ дваєстовктй забссагаєє пав зааУусаччая зЧанадссяс урссастема суусавуюе ссстсстцад двакавесеє 732 садуспчачуа зсрабрсаус закподсасмос в9ззрсакств асастсесаа асгуацлатча 783 сксгасказаза ссаксвсста аздпоссабєаз Кс босачая ссоссксцУаК частазутає 744) сааззасвас всцсвсабсав ссбасцасев асссоскксо зазсастисе сасісавесве 7500 ксксскозаа асухуссакс ссукауссто есосуаєсоа зсдсскусяс сбасазсаєса 5) чоаавсасех ссачавччо» зоазасассв сере свсе ссводувазс сасовсттод тей шсквабаасх качкасавУє чассасацаа апавтськеа стассдвяу СЕБЕ КО тА кскеЗаЗкаи сауавасавв асвавцссоа саскЕсасаЯасЄ сагуудачаза соччсставе тА савассстрс кдоєсасаза дахсавуєкує сссасвеЕке сбссостсває саваазадає тво зЕбСасавозЕ чЧасваксоесо асстазачоа асоцузгацекс сссзаїтаак ссассаецчає тя актсЕтадисе аайсдаваскяє сСсксассуєа асксстодсаце падссепсав асегсачсдав Т52О посвосссзвас азваассвачсв сазчбпзассо сдсасзацеєва сеопаачааа ссеіжсаваса тави сстдзаєвсяї ссапсчачев дзазасачах сгесссосав вадасесаза всбоадссасу що запчазадса спдазачаєро азбсастост спасучесазч беЗзачаєос аствеявЕкся БІ срчеЕсттаасх осасечаєтся вассосісад сздчадачсда Єкдаечасаєав своатстода зів

Стязбассача вакбасаєсся чепвЕсссто їссоддавтев актаєаскої сестовзаєах виго ктстдоуваде зсазаєтаао Ясбсссвзасо Яазтяасаба стсвуєуксї сассавоата пУяй зассакалас забссалцсо васпзачаєь севексалва сскасвсдса сек асстест Зо зсасвацево зсквасуєутг савечасаєх споззостоз взсссаксаво датацсаосе за0йО ацесчазаса ссеоуасісс Часзксасся скбсакозда зЕксасвоуде дузаатсато за бо зодаацсацасєє дадкЧоссаку дскасссода адісестацча аїоссодбоєса асачосаєся ВО часстчсссії аазчсовбоса ссасаєтаєо саацдессссоас зщоасвасасу чбоасаєаєсо аа сЕєтЯассооа сасіданедос саассоавніа сзастозача Сводабасаос сатосасече воко аксзчудсаз асчачсссає сСбуцесевав азбзадеьвва спасе соке Ссаезпчуєоа о саасчассаа чекгселвазчаеса азазбадвза асо ссКо дтассуазає дачасєчувог тео часпаскчах стасакаску стовроссва засто квасе єдсасбосєс вазатасаєот яв ассавссаву сстаєдсосе чпасссосшоб сгсуєсечач зазазасьек Фссасугуда кави зазадасавсЕ ссбсячраєсо сддвоасоссос вессссссаса с«стобсявує бздтасасза ав споспатслпав стдассвоче дебовехесза такасксєкав спсскссаст ссоссвкева зо пеассокаває ссасттадес пчехтасоаах зсадоакнда Егсаавосса зачпахсасза зо клацдаксаго сагзсзссав сасдїчаєся Есастозсає абагасасвс педодаваєво 93190 топаавасссв завасусьяс асазцусвсЕ гЕгсодласа ствассацає засосаусдє зІ8О атчевасахи Єсбасаксавз ассабаєсаєс ссебабідвна сбвадасасу седаудеасо з3я4о0 тескссасес ассесвзадев ддсабастаза абсоссласо абтассаавоа зачвассада запо чесЕсастсд ассаядуаєсєтоа пссвесссса гакукаство бодсабатеєда зачаздсаваа з360 чеЕссЕсаас спіячкессгя Кебсаоазсв асестосаса везсЕСЕЕКЕ сСоседаасає 9420 чкаєспссесоа скссбувУєє сегоссвЕсте аассасетек ссавбсобасе саодаавесвсє Зі чЧесасцзаса хкодссазза повазобвосс псабсочесссс ссссдааача аавссапевсса з54О зачасгасасо засоба тсод госавдавд сабсасосее сезЕбсорса чсчоааваєо з5ао зайсксвахУс кчасавчсза беадоасссясс адоісасачеє сЧазвУєсає агсзассавх зе часі сабе асасссчесаєс говоачасата аосексаєск ссссаокесс сдссевестя з720 гвсддаасста акдзазсіда адсдавсвсв ссатасаєц цдасаєсасвєя Совесагссак 37850 сстспаскає сасвазаааа чавссвсісає себсчстсво сЕхтоссдеса Кокосавспіс 546 зЕскісласс Заассісає зересссеса взвоссвсЕсва асбсстаєссапдч зпассавачя аа. скасачаевсса сесазассач сакассястс сассоусаєся ссзсечасо вЕжвасасац за5О рт асасто заасасстезс ассавзезсЕс зазчсгавкаве чапссаазаєс беЕрчсвосує 10020 сапузасавсо авазстасат астзстаєда бЕгсссакка посадптавоє аботокаевсх їішово асасятаєса єссразсаче пісттасєсцо свісасаєов ссбавасокоа асаасавссе 12140 «азакєукада сасхткпавоус косацичсач азчозуваае стаасатькс сзчсдававе і050о звссвасовх заст завацо чЧасазазчесе число б зазазаясау ЗесчказачЧе 1їп96о аштссттатаа сбЕсопватуса сеаесстаЄї зЧопоседазся асасссзкає зутазосса їа320 аксєсооаса ботесастсе бувесксссс адсоссагзає звцастсаскух гаБсосваве Бо38О закастасат єСасадсєоу зЕсаєесадус ссаацудчває зсусаєстес сдвасссоаба 10449 аесазсссоая ссіцкдаана даалескессв сЕЕяБскасї спусрчусваа ож инанисівів 05010 сосбвєсоаса ссдсєцасов адбвазакся састессяєч сіуоаєооає Єдаєазівує по збсссідвас укоудасігад діасаєстає агсастзасо задассаєва Єсдтіаєвуве їоБ2о кесЕбсваскта садевсасаа забцседсса акаде зссЯ вочакєсаучея заставстає тоб сво счо Завававоца сопдаскачає чісподвсдаса сасаіадави боссастаке Кутах

Уссазбусосї асіссаудує стасзацувч асахосаврає євасаєсет Езстодассоа БавОЄ вскгчксадав бсозачеста ссбгасссов сстацдсасас оцсоцсасаса зУуутассдас. ТпяБо дацссоакса кЕКсдзосоч ЕІ сосдас соідаасваце СЕсссодуса сдапубсао 10929 авастсссася счеачес да соутсссавда абсаспосча сзаатаціоає соабесаксету то88о асешісссвза ассасєстіса асчічЧчесісї авватїаїсаа забазесссат стає есся т154а чевааазсвиси зедувсокоє босхтастаса заасбоствЗа асссоваєсадча сзуасссвох 11100 чЧеасарсасоо сптодвоазатає збзсЧахтеес сасосадоса гсадбоазцсає Ссасцчаєзце т1160 свадоадаває засо састесєсдаєс азадасачіб стобоуаечаєс зЄссСсовачов М125о сдачечязча сачсоачесвс боссачасса зазестесздач зцаксостує єоусоаєсата 11285 зсезіздада сасазассаї дагасадесс скспоссосіо асссаооєся дсссдатссс Т11МО сакавачсозо ссдстоссст пастадусває зсБрЧасссо бседассскос пассвацаєа 11405 чсодсацасоца Бассацчассх савосястав пуаєсассіс сдгссабаст бостзваскою. 11а6ва занчасісое сгоуачадсв задчатасесс сссдазаоцав абобсдсачас боутсвасяа 1І1520 ввгдсловазча ассттадчаєс акасвассяоу соБосстеа сасабатссс сваапоаєстлеа 11555 чачестасабса чевчазчсска зассусчаєс чЧасапсваза сааасосачя ссусаксова 11640 кастасуєта ацдаддастос зазузактавь ссбсоссоаас сссзадачеб чакедататс ТЕО авчксїсзачЕ сазадувасї саазсазсос від садяс Есдаєссада вксчасаває 1740 сгдазадсова сассссзадау аЗсзазідта сосстаєст абосачваєс сспесаєданя її87о адсагачаво сксузвадаа зозагсска ссостацквсв сссваассує зусваоке 318850 зедзуазстос зеуасястко сссстадваєо дссуссваач Зкштоавссад завазксава 1540 частЗчцсаая ассстсцчес вето ссяо аазачаскас здаддачась акроозадває хг чксксвочева зопсадзесач зузсусваєє удчсзалавщх ссесесасаа ассвасчаке ти 6О ладсодвеса зовазасодва сссудсссос зауадсадсту сзусадодвяд саспоастоф 15120 чакзасчасо акаствІває сзсстачача задаавсосся азавпстасва сувугратако 12 заайзеасісба задстсавез затасстсвза гІчЧсесссМії аїоткасаое скоса 1728 засттасвай сессгассаса задвессЕсс якос встат агавцулаєт сагсасктасяа еВ) чЧекЕласссу свкссускса сЄссдсвадта бсссассова чсбодзасвав асусвосьвх ТаЗБО псксаєакас асккуєвкає ссєдцевакся бастсзавсв саугасесся ссававєаата тик гссааасцє Базабвсскє зсссачаєза абссомебав засадовгову сЕсаксдау 12480 здоїсасцва Ззусестсваза бдарсаваба асассвасає ассозатаса чеабатасах ї254о чЧататсстчес ЕсссткЧавда басаєасвса зассааясаса асасуусєсає вастовсоує їзБо0 здстваєссся Фоссзассаї басссєсуєуч аасссчссау бодбссссває саєссватує тео зсзастсдас Стозодвссос сс 13855 «ТО 15 «2115 2320 «2175 рАт «2135. Аіоресику5 щусвахоїЗев Ноав5 «асо» 16

Меб зіу Зежк ТВ Бів Без Рхо Х1є Уаї 5Іу Рпе Ар о йіа беж ТИ ТВк 1 5 то 15 хо беє Бе; бек ТБх за дка бів Ї1із Азов бек Аіа бів й1іва за Рце за Р5 35 сСіп бек век Беж Рхо бе; вкФфобех Бек Ппуз Був був зЗетї Ака Ако Упї їй 45 пу кех Ті йку Авр.оАЕросіу Авробіу Бех Уаї Ро Дар Ро Аа 0ІУ

Зо ЗБ во нів сСвРу біт Беж їТїе Акад сій бфу без Аза сіу І1е 116 дер Без о бто 65 70 Кв що пув'вза сіу дів Бет Аіа жо Авроуаї Аввоч1зїн Зак Бі 01у бек сій я За З5

Азр.оНіз Пуз бів бек тук бЗіп Мебє АвпобімМ Ії ге) два) суб Зеє НЕ 150 155 116

Авпоб1у йгу нів Аївз бех цем Зек о Буз аї Тут бфм ВНе Сув Те бі 115 їй 135 ем бі бЗту Був ТВ Бео ї18 Ніз бе Уві Пен оуаї Ата Два Ав о діу 150 135 140

Мек Аза А1з Аза Муз Рье Меї Акщо бек Ма) Атха Тпкоїкр о дів Ав Аяр 145 159 155 150

Тих Ере йіу Векобіі був о Аіїв Ів бів цеч ч16 Віа Мес А) ТВк то 65 то 175 біз АброМмеб дуЯа тіє Аяп Аїа сій Ніє 118 дк Іїе Аїа АБО бій рапе 150 135 5

Уаї бів Уві вто біу біу Тої Авподвп Ап оАнп о ТУук Ала дво Маї їв 135 20 25

Гей бів Маї біз 1 Аза бій Ак тп с1у УБЕ бетг бід ал Ткр о Рхо 2 о 215 таб біу Тр 01у Бів АДїа бах біб дДелоркго сім Пе орто дар ДІВ Пец Жве й5 230 23 ЕК

Віа Був біу їі Уаї Рае Без біу Рхо Ргро Ліда Бех Бех Меї Ал діа 245 239 255 їз щ1іу вро був Маї сіу бек Аїа рез 118 Аа біп діа Аза сту Маї 255 ат

Бко Твгогеу діа ткроЧех Сіу бег Чів Уві біб її2 Вхо пев бій Бей 415 280 7

Сув Пез йвробех ІЗе Рхо бій Зій Мес ТУукоАка був Аза суз Уві Бк 295 95 320 їБЕ о Ата Авр о йічз бів аї АтТа бек Сув б1п о Меб 116 біу тую Рко Вій 305 то ЗЕ5 325

Мес тів ув Аїз Бех Тгр о Б1у бі сі соїу пув бі її бра му: Маї 325 430 345

Ав Ав» АБр о ав їхіш чаї Ццев вта без бе пув сяїпй Маї бій і ка зо кв 356

Чаї ВЕБ Оу бек о Бхо їїв ре ї116 МеБ дк бен Аїд беї бій Звк Аги 355 36а 55 нів Ге піш Зах біп о гео їв Сув Авросій Тук біу Авпоуаї Аза Віа 373 З15 зна прац ків дат Ах двросСуз пек увІ біб дк Ася нів Біб Бу тв тв 390 55 що. га бів піу Вко Уаї Бплоуаії Аіа Его Ага Ота ТА Мі Був о сб1й Пе.

205 410 вг15

Зіч Біпсдтїа Аза дет АсЯ Геч оАфа ув Аїяз Уаї зіу Тук уаї 51Уу Аа 420 425 439 вій ТвЕ Уві сій Тує Бей Тух ЯЗек Мевб сій Трт біу бій Лує Тук Ре 135 440 145 пев біз рей дзбп бо Ася Бев бій Уаї біб; нів Бто баї Теж ої бак а 455 і850 їіїє діа сій Уві Авт рей РБко Аза Аза бій Увь Аза Уаї зіУу Меб щу 455 47 Я 185

Ії Бко пео Теробій Тіе рЕо сій Її1е Акз Акт ББе тТух ЗіуУ Ме Аво 85 480 135

Аза піу п3іу пІУу Тук о Авр о тів ТЕС Ако бує Тих Аїа дів Бей АБа о Тве 505 Вій

ВБко Ре Ап о Рпе Ар біз Уаі АБробет СБ Ткр бо пуш біу Нів Су 515 5аО 525 чаї йтїа Маї Ага ІКе ствах Зех біс Авпо вто Аве Аве сіу ВВ Бук Вко 530 535 340

Тпк пьу сіу бут Узі Був бійш її Бех вве був бек був с'вржо Авпочаї зав 5 555 зей

Ткр ' с1їу Тук Рье Бех аз цпув беж Сіу с1у б1у Тїе Ні Сум Бе Аза

ВЕБ 57 55

Авробек ціа Бе сту Ніз Уаї Бе Аза Тук бі сьо ТЕ Ако бек Аза

БІ 5В5 ваза

Аїа Іїе тнкК беж Мек овВек Брец Ат пей Тув зії Біе Зіп 118 ху Сіу

ЗВ 09 во пім ЇТЗе Нів ТЕ Аяй МаЗ Авробук ть Мав одер цей бедш Авп втіа ре кі біб бо азр Ейе духа Січ Азп оТБготіє Нія Тк обіу Тер орец АвроТвк Ага тів

Б 30 35 54 діа Мет Ако Уві біз одіа сі Ах вх Рко Тв тує Ії бек Чаї Хаї 525 5 баз зіу п1іу Ага без Тук Буш ТЕ Ті ТАК о ТБх йялп о Аїа віз ТЕ Уві счвЕ 80 855 БТ під Тук уаї бек Тує йпец їі Був ШіУу сіп тів Рхо гко був Чіз її 675 ВО «85

Зек пев о уаї Нів бек ТБк Ті бек Бем бвп Її 513 бій ес буя Тух в 35 7аа

Твк І16 бім ї1є Маї Ага Зв біу сір щіу Вег Тук Ага Пе Аго Мек тах ЕВ 715 72 авп опуу Зах пеної185 бів Аїа ахпоУаї п)п о тТлюко бе) Сув Авросіу біу 795 730 738

Ппеч їец Меб біп цем Азр о сС1у Ав Бек о Нів Уаї ї11є Тук Втв бій сіц 740 745 150 іш діа 5іу с1у Тк ій бе ре) ї1е В8в обі» був Так Сув Пем о ївиа 755 759 755 біп вяп дБ ОНіЗ Ар о Рто бек Аку це) Гей Аза діа ТЕ ро був о Був тд ЗВ 78 рез Бенц оАкоа Ре пейп Тіїе Аїз Авр.обіу Атя Ні Мазі Ар Аіз Аврочаї 785 та 733 оо га тую лів ов Мазі сід Ул) Меж Був Мес Сув Мес Рко пей пею ек зо5 819 815

Ето діа вія біу уаї Ії6 Авпй Узі) Щез гей обех отр біу біб та Мех вихо г за сів АКасбі двроцеш ТЕе Ата Акад пес Авро Без Ар о АЛяро вто сдек Кіа и 45 уаї Мув'АхУ Аїа б1іц Ркє ре біз с3у бек РБе Бко бій Мек Бех їви а5О 955 360

Его їв ша Аїа Зех Біу біп Уа» Нія Був с Ака Сув віз Ата беж Бей вЕ5 а 85 80 дви АіЗ Аза Ахо Мес Чаї ей А1із сту тус дворові Аха Віа АвзваогуБ 85 Зо ав уві Уві зіп дз ви Уві Тер оСув без Азв оТВх Рез АТа їва о Бсо впе по з05 зї19

Без бін Тв обіч 010 Бей Мебо бек уаї бец о Аха ТБ Ата беб Бо лу 92 иа

Вк ойей пуз ехо йій Пец сій біу Був Тук Авп о біч Тує був Бемовво 939 з35 40

Оаї Авр Нів Уві цув ї1в Ппув Дар Оле Ето Тк обій Ме Би да Бій щАд зво 355 З5о так ІТ бій бі дапоїен діа Сув мві Бех біз був бій Меї Уві Тв

ЗБ 319 з

Ії щін ду пепоУуді дев орто Бей Маб АвБлоїец цез був бекоТую сії зва Зч5 99 сіу буу Ак біш бек нів Аїд Нія где Ті Уві Туя бек о Шев ВНе Ст: 1000 То.

Сім Туг о бейп обех уаї бій біз Цей Ре обек АвБробіт Ті біт бах і5щ1о 1815 020 дав уві їїе біб Аа Ти бжа Їснш 51й Тук Бек бує Авр Іеви біл 1928 10350 1035 ув уаї Маї Авр тіїже Маії Пей жхеї Ні ЗБа СТУ Уві. Аке Ап буз тео 1955 1550

Тих Був Пе І1іє Без АТа бей о Меє 5іб Був Мей Уві Ту ркє Аа 1555 та6о 1055 рРко ра вра тк вк Азов обій Пет ої11е дроо Рана бек о Звк Пей Ав

Ба 1075 ово нНіз їув дк с ТУух Жук Був Бей о Аїа МЛео Куб Аїа бат піп бейпобей зо85 1055 12055 піч ліп ТлвАЄ пух Без Беж біз беб Ак о тТвЕ дек Ті о Аза Аква Аа 1190 105 1115 їсщшо шах ТЕ цей АвроМес Ре тв бій біз пуб Аіа Аброрде Бек 1115 1155 11255 це бід Ав о Ака ув їм Аза Ті Ап осі ех Мебо бу Азробеч із 1хЗ35 хі40 ах Тих Ада Рко Ше) Ртб Уаї бли АвроАїа Ге Уаї бет пе вде 1485. 1І5О 1155

АвроСув Так бар бій ТЕ Без о Піп обіп Дт Ма1ї 116 бо ТпЕ тує 166 1155 1179

Ііє бек дк Сей ТУух бів БО біс во Уві ув Авро бек Іїе 515 175 1180 щ185

Вам Був тТукК бій Авробех Б1Уу Уві Ті ліз Гем Тко біз вве тн їІ50 1155 1209

ЗІЧ.5ІУ Авпоніз біп ув ба пеопобіу Аза Ме Уа) тІїе цеч був 1205 її 1215

Зв БеЗ б5Іі0 Зех Узі Зек тах Аї8 Іі бІу Атїа Аїа Без Був Авор 1270 Іа т230

Афа Зет Ніяк Тує Аїа Бек Бех йіа сб1у Авп о Тйх уві нів тів АВ 1235 1240 1245 їва бай дер Аза дво ТвБробій цей Ава о Твт о ТБЕ о Зіа АБробек шіу 1250 ї255 То

АвройАвои Аве осів віз Сів Азро ув Мек Аврогую їй БК Впе тах 1265 1 Та

Бей Був бів дяр Уві Уві Мек сАТа Азр бе) Акад Аїя Вів Авроуві 28 ТУ 1280 мує мМаї Узі Зах Суя ТІіе Маї іп АжЯ АвроОТу Аза ї1Те Меї РЕ 1235 їзпа 1305

Ме Бк лЛхщ ТЛВк о бйе бейоШей бек ста бій бу без сСув тТух Бій 1310 1315 1320 сів бі Ркш діє бво дкч Нія уаї ЗІ его ро пе) дек АТа Сей 1555 1339 1335 пев бій без Аво Гук цеп був Чаї Пуво бі Тук деп бій Меб Був 340 1345 1350

Ту Тако Ро Бех Ах Ар ака біп ТтроНів Те стук Сїпк реа Ако і355 1355 1355

Авт ТвЕ бів дай оРЕб Був Меб лен Нівойко Уаї РО о РБе дгЯ тнЕ

І375 ІЗ75 їзво їво маї Ах овІй РКО дек овіа біУ яп ка вне стак Зек Ар Біє

1585 1399 1335 тіїе тп дар озаї піц чаї біу нів Ала бій ЗК РКО цею обеж Рпе 1506 їха5 і1что

Тит Жек Бак обес їтїе безо Був. бек Беш Мет ІТ Азя Пув ЗБ 515 та15 14941 1425 пед зів бем Ніз Аїа гіе Ак ПЕ біу нів бек Нів Мех Тує ба 1430 1435 1440 пуз тії леч був 13 Біб Був о Беш Без ввроїйем Узі Бкго уві Бех 1445 1450 БТА55 5іУ Ач тТвБЕ Маї Чаї АвроЧаї Зі бій о Авробга Аза ТВ Аза Су ї5ба 1455 тата

Зах їв бец опув біч Меє Лій бе Був 116 Біво бій беви уві бзіу 1475 1485 т485

Аїа йку Мес Ні пів сен бек Ма) Сує біп Тер обій Уві Був о Бем 1439 1455 ї506

Був ва Уаї ек Авробіу РКо Ата Зек сбіу Зак Ткр о Ака ав 'уаї 1505 1510 1515

ТЕ ТпЕ АвпоУаї ТЬБжї сСіу Нтв так Сув ТНк Уа) дз о гіє То дко ква 1525 533 з-- як 2-х пеиу наурио жшкя с ка щі : У тп, ії -щ пи а вії За» сій Аяр тах пі бек бів пув обец Уаї Тує Ні дек ТЕ 1535 1545 ї545 діа пи Жак озек бі рес це бів о Біу уаї Аза го йвлотих бак 1558 1555 155 туш бів бко беоб бетх Мі Тіє Авробси зув вхо Суво бех дія АСУ і585 АщІО і578

Авп о Ави о пув о Твв ТВ їукоСув о Тук о бвр Ре Вхо цей о Твх де ЗІ

І555 1555 158

Аза діа уді біпоГбув бек Ттр о бек дей Ї1є бек беж. іш дп одва 1555 1600 їб9ї бій Сше тТук хаї був дта Тк о зізч йеш Маф о Бпе Аа 5165 Був Ап

Т6510 1615 1650 біу беж Тер ШІУу ТНх Ро Тіе Іїв Рус Мес був Ак о дів Аза 515

РУ 1535 о35 їн дві зро тів піу Меб Уві А1а ТЕр о ї1їе цеш Або Мес бех ТНЕ 1650 1645 1650 ко біз Бпе Кк дек сСіу Яко бій ї1те ї1а Маї гЗіє Аїа бзп о Звр 1555 1859 Ів

Іі Тк о РБе Ага Віа сіу бет Бне 01у Рко Аку бі сАвро Аза Ре іета 1ет 1659 вВпе біз Віз уаї ТБ Ал оГеж о Віа Схжз бів Був Був о 0ео то Тез 1585 1690 1555

Їїе Тух без Віа йіз дз бек о сСіу дїя дко 116 біу І1ї2е Аїа зо рт 1705 1710 іш Маї дує дет Суд Рпе Аку Уві 51іу Тр Тпх Авро Авробас беє 175 1770 1725

Вко бім Абу сбіу Бпе Ака Тук о Тте Тух Мес Твжх о Аворо бію двр Пів 1530 1735 і740

Зкройку фІе бі Зекобек чаї Те Аза Нів5 бу Меї бій Пем дв 145 хТЗб 1755

Зако обіу бій Ї1е Атд Тер Уві її Аво бег туаї Уаі біу ув сій тео 1755 1710

Аве бі Бей бі Маї бів Авпо ІТе Ніз біу Зеко діа діа Іїє Ддіз 1775 1780 іт

Зедк Аїв Тук бек дкд о йіа тТуко Сім біб Те вве тт децд ТвВжЖ ре іїкай 1755 іо

Уві тв о буУ дАка Те ак пі їЇзе біу Дія Тук рез Віз дкЯ теги зво 1810 ї815 сі їз Або Су Бі ЗОКп Аг Іле ав Бій во 136 Її цем о тТве ї555 ха255 ІВЗО піу Влпе Беж Дід їв Авпобув їй Мез гудка піп Уві Ту дає 18345 і1840 ївА5 бвЕ Ція Меє бій цез Сім Зіу Рго був тів Меб Азїя ТвроОАВоп опію

ІЗ5О 1555 1860.

ТЧТаї та: Ніз Без ТЕ охУаї Бко Дер ов Ге біз біу Уві Бек Ап 1565 ї870 та75

Ті Пед ха Тер бе: бвт Тук о Уві РКО Аїа Ап їі6 біуУ бу БЕ 1550 885 ї850

Теп Врто ї1е Так опув Бех Пец о Аврорго Ї16 Ар о АтхЯа Ро уві дій 1895 ї50о0 1305

Тує Те со бій Ави ТАК Су АБрорко Аг Аза Аза Її Бех БІ 1915 1815 82

Іе вро бер бек біп сіу був Тк» їеч Зіу біУ Мес Ре Авроцув 1325 вза іїа35

Хвр бек бе Узі бій ТБ Рле бі сіу ТжроАта був о Тк Маї уві іа 1945 1350

Тк слу сАка Аїа був Мец бі бі 1іе Рхо Узі бі Маї Ібе діа 1355 і965: 1885

Чаї піз тв бій тТйг Мес Меє біп йей баї Бка Аїй АвроБко 1у їз7й 1578 19550 діп бро АДяробек Нія біб Ак бек Маї Бко дго Аїа бі біп Маї 1985 1990 1595

Тер рве ро Авв бек Аза Тв був Тяє дів біб йіа МебЄ без Авр 2000 хо 2005 2210 пе Азпо дко сіФф Зі Бец Во без РБе ї16е йвч АЇї Аа тр оАкаЧ 2915 2029 2075 тЗїу Ве дек біу 01у сія Аха Азроївц Бае обід СТУ Ававоцеб с1в го 2035 2040 «Аза сСіу сеї Твкоїі« Узі сів Аа Га Ака їТлх Тух АБ бій рхо хО45 це 5055

Від Бе Маї Тук тів Бро Гуз діа діа сів бебс дру біу Біу д18 зоба й Б5 3070

Тїхр Уаї Маї їі двр бег уз їХе Авп робо взройгу Ї18 біз Сув 20175 2щт8й 25 тук Аїа ді бе Твсодів цуз бу дало уаї цец бій о бго Бій бїу

РАМеІе 2995. з10о пез 11 біз її був Ре Аг бек сіб бів Бе був б, Сув Мес 5105 І1їй 2115 піУу Акч їжо бер ре бБіх Бво їМе вврорев Був вла Ака бе) ос 2120 2125 е13х 51 Ві дяп ОБу бех Баш бЗех АБО о с15 бій бек Мем Бій Був дет 2135 2140 2145 тРе біб Атасако пу цув бій Без Бей Бко бе) Ту спЕ буп оїїе ран 2155 2159 діа Уві Ахка српе діа суб пей Ні Авр ТЕ Заг без АКа Меї Аза 2155 217 175 діа пуз бту Узі Їїе Ага Був Уаї Маї Див Трр бій Авр Бех Аке 21850 2185 210 ек впе Бне Тує Був Ак Шви де Ага Ася цес бех 10 Авро Уві 2195 кего0 га вч діа бує сіц Ізв Акє піу Уві 118 б1іУ БЮ бує БНе Бк дів ле3 2215 и

Мун оЗек вів біз біз без Ті був Ппув ТхротуЄ Сей Аїа Бек оспій в: 2230 2-38 діз Аіа Аза Аїз сту ех ТпІ Ав о ТкродвроАвВр о Авро Ар оАТїа вне вва кгї5 ФУ чаї дія Тер Ак бій одеу Рка біз Аве Ту був бі тує Те Був 2855 жебО й січ Бем Аке Аза Біб» ке Уаі Бек Ага Ой Пе бех АвроЗаї дід пе70 ке15 ее сіу дек бек бек Авроїем біз Ата зе Бо біп Ху йеб ВЗех Мес гав гео. вея5 бец цей о АвроСув Мех АвроРко пек уув Аку Ада бік Бпе ТКе зій 230 2355 з сіз Уаіїі мес Бу уаї Гек сСув 2315 зай

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рослина пшениці, яка містить нуклеїнову кислоту ацетил-КоА карбоксилази, що надає стійкості до інгібування гербіцидом квізалофоп-р-етилу в дозах вказаного гербіциду, в яких він звичайно інгібує ріст рослини пшениці, де вказана нуклеїнова кислота, яка надає стійкості до інгібування вказаним гербіцидом, включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок ацетил-КоА карбоксилази, причому вказаний білок включає амінокислотне заміщення АІа2004Уаї, коли як порівняння наводиться А/оресигиз туозигоїде5, ЗЕО 1Ю МО: 14 або 16.

2. Рослина пшениці за п. 1, де вказаний білок являє собою 5ЕО ІЮ МО: 8, 10 або 12, або їхні консервативно модифіковані варіанти, які включають заміщення АІа2004Маї.

З. Рослина пшениці за п. 1, де вказана рослина пшениці включає послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 4, 5 або 6.

4. Рослина пшениці за п. 1, де вказана рослина пшениці створена введенням у вказану рослину гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує АКК-білок з одним або декількома заміщеннями, які надають стійкості до інгібування вказаним гербіцидом.

5. Спосіб підвищення продуктивності рослини пшениці, що має стійкість до гербіциду квізалофоп-р-етилу, шляхом обробки бур'янової рослинності та рослини пшениці за п. 1 вказаним гербіцидом.

6. Спосіб за п. 5, де вказана рослина пшениці за п. 1 має стійкість до інгібування вказаним гербіцидом, яка введена в зародкову плазму вказаної рослини пшениці за допомогою інтрогресії.

7. Спосіб за п. 5, де вказана рослина пшениці містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок ацетил-КоА карбоксилази, який включає в себе амінокислотне заміщення Аіагоб4Маї.

8. Спосіб за п. 5, де вказана рослина пшениці включає в себе 5ЕО ІЮО МО: 4.

9. Спосіб за п. 5, де вказана рослина пшениці створена введенням у вказану рослину гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує АКК-білок з одним або більше заміщеннями, який надає стійкості до вказаного гербіциду. Зо 10. Спосіб отримання рослини пшениці, стійкої до гербіциду квізалофоп-р-етилу, який включає введення у вказану рослину послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує АКК-білок, що включає амінокислотне заміщення АїІа2004Ма!І, порівняно з диким типом і стандартною послідовністю А/оресигиє туозигоїдез5 (ЗЕО ІЮ МО: 14 або 16), де вказаний АКК-білок надає стійкості до інгібування вказаним гербіцидом в дозах вказаного гербіциду, при яких він звичайно інгібує ріст рослини пшениці.

11. Спосіб за п. 10, де вказане введення вказаної зародкової плазми в елітну лінію вказаної рослини пшениці являє собою введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти.

12. Спосіб ідентифікації рослини пшениці, яка є стійкою до гербіциду квізалофоп-р-етилу, який включає: (а) отримання зразка нуклеїнової кислоти з рослини пшениці, (Б) аналіз вказаного зразка нуклеїнової кислоти на присутність послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує АКК-білок, що включає амінокислотне заміщення АЇа2004МаІї, що надає стійкість до вказаного гербіциду, яка присутня у вказаному зразку ампліфікованої нуклеїнової кислоти.

13. Рослина з модифікованою АКК полінуклеотидною послідовністю, причому вказана послідовність кодує АКК-поліпептид, що містить валін в положенні 2004, при порівнянні зі стандартною послідовністю А/оресигих туовзигоїдез5 5ЕО ІЮО МО: 14 або 16.

14. Виділений полінуклеотид, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, яка включає: БО (а) послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 4, 5 або 6; (Б) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 8, 10 або 12; і (с) послідовність нуклеїнової кислоти, яка включає повнорозмірний комплемент будь-якої однієї послідовності за пп. (а)-(Б).

15. Виділений полінуклеотид за п. 14, де вказаний полінуклеотид оптимізований для експресії в рослині.

16. Конструкт нуклеїнової кислоти, який включає в себе виділений полінуклеотид за п. 15, де вказаний полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором, який стимулює експресію в клітині-хазяїні.

17. Конструкт за п. 16, де вказаний полінуклеотид функціонально зв'язаний в антисмисловій орієнтації з вказаним промотором.

18. Експресійна касета, що включає ДНК-конструкт за п. 16.

19. Клітина-хазяїн, що містить стабільно введений в її геном щонайменше один ДНК-конструкт за п. 16.

20. Клітина-хазяїн за п. 19, де вказана клітина-хазяїн являє собою рослинну клітину.

21. Трансгенна рослина, що містить стабільно введений в її геном ДНК-конструкт за п. 16.

22. Трансгенна рослина за п. 21, де вказана рослина вибрана з групи, яка включає: кукурудзу, сою, пшеницю, рис, люцерну, ячмінь, просо, соняшник, сорго, канолу і бавовник.

23. Трансгенна рослина за п. 22, де вказана рослина являє собою пшеницю.

24. Виділений поліпептид з АКК активністю, вибраний з групи, що включає: (а) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 8, 10 або 12; (б) поліпептид, кодований амінокислотною послідовністю, що містить послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 4, 5 або 6. ТА о: с М шо ОО В ВУ ОН й 00. я хх |), с по МО о. МО ої :- кн АМС КК Си с - ; г с ш- о. . й с с он Вс с 5 Ко и С. с щ в: ЕЕ и ПО ОБ ОО ОО

Фіг. і ЗЕООКе ве Си ЗК СК Хеое ех ПО Деко ооо же ОК с ВО щ: ще 1 с с о с о. . о с З с я ОО о о: п с с 5 ис 5 хг шо ее Б То

КЕ. о. се Ко що, 5 З с 000 ие з о за шо ЕЕ і. І о в де 5 о.

її. 5 1. 5 с ОН в В А А ох їх ПОВ а ,ОООНО нн и и в в о о А й: С с с с с с Фіг, 2 й ше З Ох На и попа и у ву т ан | У о вн

Й. пе пат нн о ши ШЕ й З У В п КИ «ДЕ ХУ 5 СЯ ек ВК, засн с БЕЗ в я Соня хай ОК Я З Би ок І ШЕ в Е А я а ї снеки с що шІшШш ші п ших ж Бонн нео и НН а

. ШИ. її о Ко и КВ

Ж. ин АК хо Б. р ШОК их а ша ях Бе ОКХ В що КО я ой ев АК ЕЕ ше ав КВ І ши ле. ен с б хи НОВ А

Еш. У піна. и

Фіг. З Геном А піпениця сорту Наївег (не мутавтний) бтеттобАТОВТСТСАТВАТОССЛОСССТОААССТОООТТТСАСТАСАТТТАТСТОАСТОЛАСАЛСАССАТОСТ ССТАТТАССАСТТСТОТТАТАССССАСААСАТЕСАОСТТСАТААТОСТОАААТТАССТОССТТАТТСАТТСТОТТ СТОСОбААССАССАТОСОСТАСВСТОТООАСААСАТАСАТОЗААСТОСТОСТАТТОССАЄТОССТАТТСТАвОоб ССТАТСАССАСАСАТТТАСОСТТАСАТТТСТОАСТОСАСОБАСТОТТ СОААТАОВАВСАТАТСТТОСТОСАСТТО БСАТАСИСТОСАТАСАССОТАСТСАССАСОССАТТАТОСТААСССОССТТСТСТОСТТТОЛАСАДОСТТСТТВО СС СеБААСТСТАСАЄВСТОССАСАТОСАСТТООСТОВССССААААТТАТВОСВАСАДАСОСТОТТОТССАТСТОАСА СТТТСАБАТЄАССТТОАДССТСТОТСТААТАТАТТОАССТООСТСАОСТАТОТТОСТОССДАСАТТОСТОСАССТ СТТССТАТТАСААААТСТТТВБАСССАССТОАСАВАССССТТОСАТАТАТОССТВАЄЛАТАСАТОТОАТССТССТЬ СЛЕССАТСАЄТООСАТТОАТОАТАВССААССОАААТОСТТО СВО ОСАТОТТССАСАЛАБАСАСТТТТОТОВА САСАТТТИЛАВСАТОСООСЛАСТСАСТАСТТАСТОВСАОАВОВАДАСТСОБАСОСАТТСССОТОООТО ТАТА СетатепАСАСАСАВАЄТАТОАТІСАБСТСАТОССТаСТОАТОСАСОССАЄСТТОАТТСССАТВАССВСТСТОТТ ССТОвТОоСТОвОСААСТСТОСТТТОСАВАТТСАОСТАСТААВАСАВСТОААССЛАТОСТОСАСТТСАЛССЯТОАА ООАТТАССТСТОТТСАТОСТТОСТААСТОСАСАСВСТТСТСТОВТОВОСАДАСАВАТСТТ ТТ ТОААВСААТССТІ САСОСТОбИТСААСААТТОТТОЛОААССТТАССАСАТАСААТСАСССТЕССТТТОТАТАТАТССССААОЄСТОСА САЄСТАССТОвАСОСОСТТОаСТСОТОАТТОАТАВСААСАТАААТССАСАТССААТТВАСТТСТАТОСТВАСА ОБАСТОСЛААСЗО Білок УСМЗООСУРЕВСЯОТ У ТЕЕОНАВІСТУУАНКМОЦОМОВІК УЮ У СКЕОСІУЄМІНОЗАЛІАЗАУЗНАТЕЕ ТЕТЕТРУТОВТУСІВ АХ АКЕСІСІДЯТО ОРІ ОРЗАЦІКИ СВЕМУЗЗНМОКССРКІМАТМОУУНІТУОВ ву ЗМІНУ ЗУУРАМІОСРІРІТКООРРОКРУАТРЕМТСОРВАЛІЗ СІВ ОСКАОСМЕОКОЗЕМЕТРЕСАКУЧМУ ТОНАКЕОБІРУЄМАУЄТОТММОМРАОРС ОЇ ОЗНЕНМРИАССТІЛАЕРОЗАТКТАСАМЕОЕ МИСІ РІЄНАМИН ар СОАОС ЕС ДАО ПУЕТ УМО АРЛАРКАДЕКОСАМЛИЛОЗКІМРОВІЕСУАЕВТАК

Фіг. 4А

Мутантна посліловність генома А (узагальнююча типова посліловність) САТОДАСТАЛААТССТОСТТО- СТОТТОВАТОВТСТОАТОАТООСАССССТОААССТОВОТТСАСТАСАТТТАТСТСАСТОАДАВЛАБАССАТОСТ СОБТАТТАВСАСТТСТОТТАТАБСОСАСААВАТОСЛОСТТОАТААТОБТОАААТТАВСТОВОТТАТТ АТО ТОСОЛ АСОАССАТОВОСТАВЕТОТОСАСААСАТАСАТОВААСТаСТастАТТассаатасстТАТТСТАСО С ССТАТОАВСАСАСАТТТАСОСТТАСАТТТОТОАСТОВАСОБАСТОТТОВААТАВОЛОСАТАТСТТОСТОвАСТТО ССАТАСОВТОСАТАСАССОТАСТСАССАВСОСАТТАТОСТААССОВаттстотостттвАдСАЛесТтсТТевос СОБАДСТОТАСАССТСССАСАТ САТ ОО ОВССССААДАТТАТООСОАСААДСОСТО ТТ ОТОСАТСТОАСА СТТТСАБАТОАССТТОААОСТОТСТСТААТАТАТТОАООТООСТСАОСТАТОТТССТОССАДСАТТОСТавАЄСТ СТТССТАТТАСАДАДТСТТТОБАСССАССТИАСАБАСОСОТТОСАТАТАТСССТОАОААТАСАТОТадтостТосТе САБССАТСАСТОВСАТТОАТОАТАОССЛАСОСАДАТОСТТОвЕВООСАТОТТОВАСАДАВАСАЄТІТТЄТОвА САСАТТТОАЛОСАТССОСОААЄТСАСТАСТТАСТООСАСАОСОЛАААСТСОБАСОСАТТОСООТООСТОТТАТА СЕТОТОвАСАСАСАСАСТАТНАТОСАОСТСАТСОСТОСТОАТОСЛОБССАВСТТСАТТСССАТОАОбСОВТСТОТ ССтеСтТаСсТевосСААСТСТОСТТТССАСАТТСАСТТАСТААПАСАОСТСААОСААТОСТОВАСТТСЛАЄССТОАА СОАТТАССТСТОТТСАТССТТОСТААСТовАСАСаСТІСТСТООТаСОСАДАВАСАТСТТТТТОААСАДТССТТ САБОСТОСОТСАДСЛАТТОТТСАОААССТТАСВАСАТАСЛАТСАСССТОССТТТОТАТАТАТОСССЛАВОСТОСА САбСТАССТССАЄСООСТТООСТОСТОАТТСАТАБСААСАТААЛАТОСАСАТСОААТТОАСТЕСТАТИСТСАСА СОАСТОСАДАЄВСТААТСТТСТТОААССТСААССОТТОАТТОАСАТАССАЄ Білок КЛАСУ ЗОСРЕНИ РОМ ТЕЕОНАВІЗТУЛАНКМОМОМИ ВВА О У УВКЕОВІ С МУЕМІНОЗААІДОАУ 5ЕАХЕЕТЕТТРУТСВТУСІВАМЛАВНЯКИОКТООРІТОЕЗАЄМКІ ОВУ НМОСБРКІМАТНСУУНІ ТМ ПОЕСУЄМИ РМ ЗУУРАМІССРІЧТКООРРОВЕУАУТРЕМТСОРНААІСЮВОСКАОБМЕОКОЗЕМЕТЕЕВ МДКЗУУТСВАКОСІРМЕЛАУЄТОТ ММИацпРАОРСО ОНЕУ РЕАВОКЛИЕРОЗУТКТАОАМІОЕМНЕСІ РЕ НСАКВМНОгУС ОО ВОЕЕСИ ПАБ ПУЕМІАТУМОРАРЛИІРКАДЕНІОСАМЛАЛОЗКІМРОКІЕРУАЕВТАКО МУ. ЕРООИВІР

Фіг. 48

Геном В піпениця сорту Наїспег (немутантний) ССТСТТОбАТССТСТОАТОАТОССАССССТОААССТО СОТ ТСАВТАСАТТТАТСТОДСТОАДОДАВАССАТОС ТССТАТТАВСАСТТСТСТТАТАССССАСААОАТССАССТТСАТААТаСТаАААТТАССТасаТТАТЕСАТТСТС тотавсблАССАВСАТОвОасТАВатТОТабАСААСАТАСАТОСААСТОСТаСТАТТОССАСТОССТАТТСТАбО ПССТАТЕАВСАСАСАТТТАСОСТТАСАТТТСТОАСТОВАСССАСТОТТОСААТАССАБСАТАТСТТВСТСВАСТІ ВОСАТАСОСТОСАТАСАВССТАСТОАССЛОСССАТТАТОСТААСТОВОТТСТСТОССТТОААСААОСТТСТТОВС СОССАДСТТТАСАССТСССАСАТОСАСТТОВОСТОСССССААААТТАТОСССАСАДАССЯТОТТСТССАТСТОАС АБТТТСАСАТОАССТТОААВИТатАТСТААТАТАТТОАОСТавстоАВСТАТаттсстессААСАТТасТОвАСС ТЕРТССТАТТАСААААТСТТТОСАССОСАССТОАСАВАСССОТТОСТАСАТСССТОАВААТАСАТОСВАТОСТОСТ ССТОССАТСАСТООСАТТСАТЯАТАСССААСОВАЛАТОСТІвОбОвОаСАТатТТ С вАСАААСАСАЄТТИаТОв АСАСАТТТСАЛСОАТОВОССААСТСАСТТСТТАСТООСАСАССТАЛАСТОВСАСОСАТТОССоСТОватТОтТТАТ ВОСТОТОВАСАСАСАВАСТАТВАТОСАОСТСАТОССТОСТОАТССАВОССАССТТВАТТОССАТОАВССОТСТеТ тестеетостобосААВтТСТОатТТТОСАСАТТСАОСТАСТААВАСАССОСАСОСААТаСТОСАСТІСААССОТаХ АССАТТАССТСТОТТСАТОСТТОСТААСТОСАСАСОСТТСТСТОСТОАСАААВАСАТСТТТТТОААССААДТССТ ТЕАбОСТОВОТСААСААТТСТТСАВААССТТАВСАСАТАСААТСАВОСТОССТТТОТАТАТАТОСССААВОСТОС АБАЄСТАССТОСАСОбОСТТОССТООТСАТТСАТАВСААСАТАААТССАВАТСОВСАТТОА СТ СТАТОСТОДО АОСАСТЕСАДАОКСААТОТІСТОВААССТоВАвОО Беюк КУСМЗООБ5РЕНОРОУМТЕЕВНАКВТОУАНКМОЦ МОВІ МЮЗУУЄКЕРОЦОУЄМІНОЗАЛІАЗАТОКАХЕ ЕТЕТТЕУТОВТУСІСАХСАНІСТВСОВТОСРІЬТОВЗ АК ПЕТ НМ ОРКІМАТМОУУНЕТУЗОВІЕВ УМІЛІ ЗУМРАМІССРЕРТКОРРОВРУАХІРЕМТСОРНАЛІЗСТООЗаСКАЦОСМЕОКОБЕМЕТЕЕСМАКОУ УТОВАКІ ВІРУЄ АУЄТатМмМОацРАПРОССО5НЕНЗУРВА ВОМ ЕРОЗАУКТАВАМЦОРМКЕВКРЦКНАМИ ВО СОЛОМЕЕСПОДОУПУЄМ АТМ ОРГА ИЛРКАДЕН З ВАМЛАЛЛОКІРОМЕСАКАТАКОМУЕР ОВ

Фіг. 4С

Мутантяна послідовність генома: В (узагальнівюча типова послідОоВніств) СОСАТАВСАСАТОДАСТАСАСТСТТОСТТОСОТОТТОБАТОСТСТВАТОАТОССАССССТОААСВТВаОТТ СА ОТАСАТІТАТСТОАСТЕААСААСАССАТОСТОСТАТТАССАСТТСТОТТАТАЗСССАСААСАТОСАЄСТТОАТАД ТОСТОАДАТТАССТООСТТАТССАТІСТОТОТОвОСААОСАООАТОСОСТАССТОТОСАСААСАТАСАТОЙ ДАСТЗСТОСТАТТОССАЄТОССТАТТСТАСОСССТАТОАСОАБАСАТТАСОСТТАСАТІТОТОАСТесАСОвАС ТатТОвААТАССАОСАТАТСТТОСТОЗАСТТООСАТАСОВТЕСАТАСАВСОТАСТОАССАССССАТТАТССТААС ТООСТТСТСТОССТТвААСАДИЄТТСТТвОССОвОААОТТТАСАВСТОССАСАТОСАВТТ ОСТ ООССССААААТ ТАТОБСОВАСДАДСОСТОТТОТССАТСТОАСАВТТТСАСАТОАССТТОЛАВСТОТАТСТААТАТАТТвАСТООСТ САБСТАТОТТССТОССААСАТТООТОСАССТСТТОСТАТТАСААААТСТТТОСАСССАССТОАСАСАСОССТТОСТ ТАСАТСССТОАБААТАСАТОССАТССТОЯТОСТВССАТСАСТООСАТТВАТСАТАВССААОбОАААТОСТТОвО ВБОСАТОТТОБАСЛААВАСАСТТТТОТООАСАСАТТТОЛАББАТОООСОААОТСАСТТЯТТАСТООСАвАЄСТ АААСТСЕСАСССАТТССваТОСеТСТТАТАЄСТОТОВАСАСАСАВАСТАТВАТОСАЛОСТСАТОССТОСТОАТСС ДОбССАССТТБАТТСССАТОАОСООТСТТТОСТООТОСТОабсЛАСТСТОВТТТОСАСАТТСАЄТТАСТААВАЄ АОСБСАБОСААТОСТОВАСТТСААСССТОАЛОСАТТАССТСТОТТСАТОСТТОСТААСТОбАСАСОСТТСТОТОб ТОБАСАДАБАСАТСТИ ТТ ОААВОААТССТТСАВОСТОССТСААСААТТОТТ ОА ДАССТТАСОВАСАТАСАДТС АОССТОССТТТОТАТАТАТССССЛАСОСТОСАВДОСТАССТОВАвОобСТТ ОТО ТАТТОАТАССААСАТА ААТССАСАТСОСАТТОАСТТСТАТОСТОАСАССАСТОСАДАСОССЛАТИТТСТОСААССТСААСОСТТвАТТСА ЗАТЕ Білок СІДОЕМЕЗСЕВ УМ ОЮСОРЕНОКОУМСТЕЕОНАВІЗТУЛАНКМО ОМСЕВУИЛОБУМОКЕОСІЯУЄМІНОЗАА МАЗАУЗНАХЕЕТЕТІТЕУТОКТУ Ві ЗАЧ АК ВСЮВТОпРИСТО РАНКИ СЕУ ЗЗНМОКоВеКІМАТМО УМ ТМ СУМІ АМУР АМІОСРІРІТКОРРОКРУАТРЕМТСОРАААЛІВСІ ОО5 СКМ СО МЕОКОЕМЕТ РЕСМАКОУУТЕВАКІ ВІР МАМО МОМРАЮРСДІО5НЕНЗУРВАСОЛАЕРОБІТКТАЧАМСОКМЧНЕЄ ЧЕКАМИ ОДВОЦ ЕЕ ПАОУПУКМ ВТ УМАРАКУЧРКАДЕВОСАМЛАЛОЗКІМРОВЕЕУАЕНТАКОМ УЕРОЄЦЕМ

Фіг. 40)

Геном О пшениця сорту Наїсвег (немутантний) АТСТІЯСТТОСОТатТОвАТООТСТОАТОАТИОСАВСССТОДАСОТООСТТТСВАТАТАТТТАТСТОАСТОААВА АБАССАТОСТОСТАТТАССОСТТСТОТТАТАВСОСАСАЛСАТОСАССТТОАТААТОСТОАДАТТАССТОСВТТА ТТОАТТСТОТТОТАССОААССАССАТООССТАБСТОТОВАБААСАТАСАТОСААСТОСТОСТАТТОССАСТОС СТАТТСТАСОВССТАТОАСБАВАСАТТТАСОСТТАСАТТТОТОАСТОСААБОСАСТОТТОВААТАОСАССАТАТС ТТОСТОВАСТТЕССАТАСССТОСАТТСАСССТАСТОАССАСОССАТТАТОСТААСТОССТТТТСТОССТТОААСАА ССТІСТТОССОВОСААСТСТАСАССТОССАСАТОСАВТТОСТаССССААААТТАТОСССАСАДАСССТа ТО ТЕСАТСТОАСАСТТТСАСАТСАССТТСААБОТОТАТСТААТАТАТТСАССТООСТСАССТАТОТТОСТОССААСА. ТТОСТОВАССТСТТОСТАТТАСААААТСТТТ ОБ АСССАССТСАСАБАССССТТОСТТАСАТОССТОАСВААТАСАТО: ТОАТССТССТОСАСОСАТСАВТОВСАТТЗАТОАТАСССААВОСАЛАТОВТТОВБОСОСАТОТТССАСАЛАСАЄ АСТТТТаТОСАСАСАТТТОААССАТОООСОААСТСАСТАСТТАСТОВСАСАСССАВАСТОВСАСОСАТТОССО ТевСТОТАТАССТОТОВАВАСАСАСАСТАТОАТОСАССТСАТСССТОСТОАТОСАВОТСАВСТТСАТТСССАТО дособтстоТтостостесТавослАСТСТОСТТТССАВАТТСАОСТАСТААСАСАВСОСАСОСААТОСТОвВАЄ ТТСААСССТОААОБАТТАССТСТСТТСАТССТТОСТААСТОСАСАСОСТТСТСТОСТОВОСАЛАСАВАТСТТТ ОААСОААТОСТТСАВССТООСТСААСААТТСТТСАСЛАССТТЛОВАСАТАСААТСАСССТОССТТТСТАТАТАТС СССААСОСТОСАСАССТАССТОСАВСООСТТООСТОТОАТТСАТАССААСАТАААТССАСАТСССАТТАСТ ТСТАТОСТВАВАОВАСТОСАААВОССЛАТОТТСТ-СААССТСАЛОСО. Білок ОСЕКУЄИЗООС5РЕНСКОМІУСТЕЕОНАЯ ЗАЗУАНКМ ОО МО ЕІ МЛНОБУУВКЕО СІ СУЄМІНСЗААЛІАВАУЗИ АУБЕТЕТЕТЕУТОВТУВІСАУ АВІ.СІВСОВТ ВОРІТ ОРАНКИ СВЕУУ У НМОїОРКІМАТМОУМНЕТУЗОЮ СЕБУЗМНАУЛУУРАМІССРІРІТКОЮРРОВРУ ВИ РЕМТСТРААЛІЗСТЮТО СКУЛ ОСМЕРКОБЕМУЄТЕЕСМ А. КУЛІ ОВАКІОСІРУЄЛАУЄТОТММОМРАБВРСДЦОЗНЕВЗУРВАССУЧМЕРОЗАТКТАОАМІОКМВЕСІРіЯНА МИ ВСЕСВІТ ЕСТОДОТІУЕМІ ТУ МОРАРИРКААЕ ВОВАМАЛЛОЗКІМРОВІЕРАСВТАКСММІМЕ

Фіг. Б

Послідовність мутантного геному Ю (узагальнююча типова послідовність) ТВААСТААВАТСТТОСТТОСОТОТТОбАТОСТСТОАТОАТОВСАБСОСТОААССТОВОСТТТСААТАТАТТТАТСТ САСТОААБААСАССАТОСТССТАТТАССОСТІСТОТТАТАВСОСАСААСАТОСАВСТТОАТААТОСТОАААТТА обТебаттАТТСАТТСТОТСТАССОААВСАССАТОСОСТАССТОТОСАСААСАТАСАТОСААСТОСТОСТАТ тТОССАСТОССТАТТСТАСООССТАТОАОСАСАСАТТТАСОСТТАСАТТТСТОАСТОВААВОАСТСТТОСААТАВ САБСАТАТСТТОСТОВАСТТООСАТАСОСТОСАТТСАСССТАСТОАССАВСССАТТАТОСТААСТОССТІТТСТОС СПОЛАСААОСТ ІСТ ООССООбААСТОТАСАОСТОССАСАТОСАСТТООБТОССССААААТТАТЕОССАСАА АСОСТОТТСТССАТСТОАСАСТТТСАСАТОАССТІОАДОСТОТАТСТААТАТАТТОАОСТООСТСАВСТАТОТТС СТЕССААСАТТОСТОСАССТСТТССТАТТАСААААТСТТСВАСССАССТОЛСАВАССССТТССТАСАТСССТВА БААТАСАТОТОАТОСТОСТОСАСССАТСАСТООСАТТСАТОАТАСССАДСОСАААТОСсТІвСаовОСАТОТТС ВАСАААСАСАСТТТТОТОбАБАСАТУТОААВОАТООбСОААОТСАСТАОТТАСТООСАСАССВАААСТСОВА обоАттОсоаТоССтОТТАТАССТОТОСАСАСАСАСАСТАТОАТОСАВСТСАТОССТОСТОАТССАВСТСАССТ ТОАТТСОСАТОАССОСТСТОТТОСТОСТОСТОвОСААЄТСТОСТТТОСАВАТТСАСТТАСТААСАСАВСССАООС АДТОСТабАСТТСААСССТОААОСАТТАССТСТОТТСАТОСТТССТААСТОСАСАОССТІСТСТОСТОсосААдО АСАТСТТТТТОААООААТОСТТСАСОСТОВОТСААСААТТСТТЗАСААССТТАСОАСАТАСААТСАВССТОССТТ ТОТАТАТАТССССААООСТОСАСДОСТАССТВаАаОвОСТТОвОТСОТСАТТОАТАССААСАТАДАТССАСАТЕ ОСАТТОАСТТСТАТаСТОАСАОСАСТОСАААДОСОСААТСТТСТТВААССТСААСССТТОАТТСсАСАТОС Білок ЕМКБСЕВМОУУЗРОВ5РЕКОВО МИ ТЕЕОНАВІЗАЗМІАНКМОГ ОМВО МУК СМЕМІНОЗАДІААУ5 ВАЖЕЕТЕТІТЕУТОКТИвІСАУСАНЬСІВО ОТОЙ РИСТОЕОАНЧКЦ СВЕУУЗЗНМ ЦІ ОСРКІМАТМОМУНІТ МОВІ. ЕЗУЗМИ УЛ УРАМІОСРІРТКЦОРРОВРУАМУІРЕМТСОРВАДЕОІВО5ОСКАЛОЗМЕОКОБЕМЕТРЕСУУАКУУ МТОВАКІОСІРУЗМАУЄТОТМ МО ПРАВЕ О5НЕВ5УРНАСОУ У ЕРОЗУТКТАОАМИЗЕМАЕОІРІЕТАММВ, БЕЗССОВОВГЕЕСТОАСЗ МЕМ АТ УМИРАЄУВРЕААВІАСВАМУЛОЗКІМРОВІЕРУАЕВТАКаМЕРОСНЕМ

Фіг. 4

100 і, ще ся ШИ о сакстнттнпінн ш 80 - - 70

50. : !

5 о. а зо ї 1 ою. 16 ! Зразки

Фіг. У 200 Ва мірзхо - 160 4 ж 140 - 120 4 т 160 4 Т 5 ВО. з -5 504 си Дх НИ і | | ІІ ги 204 В | . я Зразки

Фіг. 6 іГеном А пшениці сорту ях зе ко . зю т й зи А и в КВ и Й ТИ А ! Наїснег еВ и о ЗЕ ин сот ДН ВЕ В: ВН В : КБ Музантнийтєвом А утво ОВО жор АА ВИ ВО ВИ АТ ТО Геном В пшениці хорту І В ни о Ов с Ви с Я М не и НН Я Наюцвег ПКТ ТюОАНАЮТТУТИ ГИНИКЕ МКАМ ЛИ МИТ Яд ДМСУ, ит Ж Мутантний геном ВО сотінесо вет кто вс А во фонова т Геном В пшениці сорту. сотню півник я кепки ки Деми у . р З З а З а м в о о о во а о м а п КН схо п в в п кВ ВО В Набсвех Мутантний. гевнамоЇ) ші те тег ля КУКИ То ЛЕО ВИ од НВ КІ ТУДУ ГИ В зво 7

Фіг. 7 пк це роз т- -60 100 з З : З ки їш- 80 Ву не о, В тя З за г б так лено з є - 70 з и с єть у ж «Є м дов «ож ж тва о тк ро й я, ї т й ак тк же аа ШИ З зді я 50 г -е іоокюц, оз лю ак -е» са ж пежкехев Ши я тоакозж ре ї я во зни - 5 ши Те а я - й теж ї хо 59 4 .:.:.и1Ішениця сорту Наїсбег певне :

КЕ. тжааккивтя В 04 -М утантний геном А Ше щи і ре "Мутантний геном В щ гі 6 Що о З --ееМутантний геном ІЗ Е о 20 40 бо во 100 т т т Зразки

Фіг. 5 пік ДЯ бле ов. ДІЇ Здай йо Оля Кенсецйсуєна (узакальніоюча) послідовність ЗПОЕЖНЕ НВ КЕЙ ВЕ ЗНАВ АКТ ВЕК ТЛ ЗА І КВ В ОТЖЕ ВК вив Аня

1. Транеляція генома А пниениці сорту Неневег МІН а АН МО В ОО

2..Крансяхцій генома В пшієниці соріу Навег ку. хз кту тт тих тти т ух єю нути юю вахти пла са кт ха тт ютювут юю

3. Трансияйця генома З) пшениці соруу Навег сх стос ит кал ит хе т я ню вик ик июня

А. ранедяцій мутантяюто гена м. вин и нн а а п м в п о па аа

5. Трансляція мутантного гена З Ки в ки пи тт т т ТИ

5. Трвневяція мутантисто гева З нен мною нива пом нааман о ооаа аа ни

7. Крапстяція віро АМОНІЙ ви,

Я. Кранеляція рі|! 9600901 ем о дуууі іі. Ж лучнллтчетянтх Ви седана нин Вих, Консенсуєна Сузагальнюююча) Й НЯ АН ОН ен й пн в й послідовністк УВУ ВОНА КК ВИК КВ ТУ ОТ МИТИ Геном А пшениці сорту Цаїснсг сзузшютивуюух ючи йі ат ваня ручних ЖЖ хін кт ку ха каже нююктяя я Геном В певен сорту Натсйсе сечитекх іт пута ха сюда уж тлазачла ноті сухості у а уяч рія тя уні и гра піт іні юх Геном Ю пшениці соріу МНаїспесг фікація ху іє тіней ітчя узяті кт ііі ад ужити є ші ж тра яю я да рж я вт ря юю ту ка Мутантний геном А кеш икяа ік тт айкркєюєевєахию Ва хіт кіл но Жінки ся хх юю ри ав кі я Мутантний геном ІЗ лаки юул и ухва юки ати ча и пк Малахії ткали тії ажаєювіуві іі хатка Мутантний геном 0 вигадливі скиту уєтасттт і лаєтті ча ЖІ. чази ціла кіт ятки тт няхйна течіях ВіІПОУбООВе ето АМЯОВ429 п НИ мн п я с З З а и: З МЕ НИ о и віп ооводео Цегпе МОХУ ЗО Не и Я м ЕК СН А А, А о о

Фіг. 9