MX2010014147A - Desarrollo de especies de cesped resistentes a herbicidas. - Google Patents

Abstract

La invención es concerniente con una planta resistente a herbicidas de plantas inhibidores de ACCasa, seleccionada y cultivada del grupo Panicodae o tejido, semilla o progenie de la misma y métodos de selección de la misma. La invención también es concerniente con métodos para controlar malezas en la vecindad de una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa.

Description

DESARROLLO DE ESPECIES DE CESPED RESISTENTES A HERBICIDAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención revelada en la presente es concerniente en general con ásteres con resistencia a herbicidas de céspedes selectivos y métodos para desarrollar los mismos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El paspalum de costa (Paspalum vaginatum) es un césped de temporada caliente que es en general apto a medios ambientes de dunas . Los atributos favorables del paspalum de costa incluyen su tolerancia a la sal, encharcamiento de agua y sequía. Estas características hacen al paspalum un candidato de césped premium para jurisdicciones en donde cualquiera o todo de estos problemas ambientales podrían ser una cuestión. Por ejemplo, los arquitectos de campos de golf recomiendan paspalum de costa para nuevos campos en áreas de costa tropicales o subtropicales, en donde la sal o calidad del agua pueden afectar el crecimiento del césped y mantenimiento. Además, muchos campos de golf existentes han reemplazado al pasto bermuda (Cyno on dactylon) con paspalum. En comparación con el pasto bermuda, el paspalum requiere menos nitrógeno y es más tolerante a irrigación con agua salobre o agua de calidad deficiente, lo que reduce los costos de manejo y mejora la flexibilidad de irrigación.

Una limitación principal para limitar el pasto bermuda con paspalum es el reestablecimiento del pasto bermuda. El pasto bermuda es altamente competitivo y difícil de erradicar una vez establecido. El pasto bermuda y otros céspedes cubiertos de malas hierbas reducen extensamente el valor específico y calidad del césped de paspalum. Así, se desea controlar o limitar el pasto bermuda o áreas de césped pobladas con paspalum, el desarrollo de césped de paspalum con resistencia a herbicidas de hierbas selectivos es deseable. Los procedimientos del pasado en desarrollo de césped resistente a herbicidas incluye el uso de procedimientos de diseño genéticos. Sin embargo, las plantas producidas mediante procedimiento de diseño genético pueden ser difíciles de comercializar debido a las regulaciones gubernamentales y restricciones con respecto al uso de plantas modificadas genéticamente. Así, las modalidades de la invención incluyen el desarrollo de cultivos de hierba césped con resistencia no transgénica a herbicidas, también como cultivos con resistencia transgénica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Modalidades de la invención son concernientes con una planta resistente a herbicidas inhibidores de ACCasa seleccionadas y cultivadas del grupo Panicodae o tejido, semilla o progenie de la misma. En algunas modalidades, la ACCase la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es regenerada de una célula sin diferenciar resistente a herbicida que ha sufrido un método de selección, en donde el método de selección incluye: proveer un callo de células sin diferenciar de una planta del grupo de Panicodae, poner en contacto el callo con por lo menos un herbicida en una cantidad suficiente para retardar el crecimiento o exterminar el callo, seleccionar por lo menos una célula resistente en base . a un efecto diferencial del herbicida, y regenerar una planta entera viable de la variedad de la por lo menos una célula resistente. En algunas modalidades, la planta es una planta no transgénica.

En algunas modalidades de la invención, la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es un miembro de la tribu Paniceae. En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es una seleccionada del grupo de: Axonopus (pasto alfombra) , Digiteria (digitaria) , Echinochloa, Panicum, Paspalum (pasto, bahía) , Pennisetum, Setaria y Stenotaphrum (pasto de San Agustín). En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es una seleccionada del grupo de: paspalum de costa (P. vaginatum) , acrostide o grana, césped de fescue alto, pasto zoysia, pasto bermuda (Cynodon spp) , pasto azul de Kentucky, pasto azul de Texas, pasto de centeno perenne, pasto búfalo (Buchloe dactyloides) , pasto centípedo (Eremochloa ophiuroides) y pasto de San Agustín (Stenotaphrum secundatum) , pasto alfombra (Axonopus spp.) y pasto bahía (Paspalum notatum) .

En algunas modalidades de la invención, la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es resistente a un inhibidor de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) . En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida de inhibidor de ACCasa es resistente a un herbicida de ciclohexandiona, un herbicida de propionato de ariloxifenoxi , un herbicida de fenilpirazolina o mezclas de los mismos, En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es resistente a por lo menos un herbicida seleccionado del grupo que consiste de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chJoraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butyl , fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

En algunas modalidades de la invención, la resistencia a herbicida de la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa es conferida mediante una mutación de por lo menos una posición de aminoácido del gen de ACCasa seleccionado del grupo de: 1756, 1781, 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096. En algunas modalidades, la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de isoleucina a leucina en posición de aminoácido 1781.

Modalidades de la invención también son concernientes con una progenie de una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa como se describe en los párrafos anteriores. En algunas modalidades, la progenie es un resultado de reproducción sexual del padre resistente a herbicida inhibidor de ACCasa. En algunas modalidades, la progenie es resultado de la reproducción asexual del padre de la planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa.

Modalidades de la invención también son concernientes con una semilla de una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa como se describe en cualquiera de los párrafos anteriores, o una progenie de la misma.

Modalidades de la invención son concernientes con un césped que comprende una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa como se describe en cualquiera de los párrafos anteriores o una progenie o semilla de la misma. Modalidades de la invención también son concernientes con un lote de cria de césped que comprende una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa como se describe en cualquiera de los párrafos anteriores, o una progenie o semilla del mismo. En modalidades de la invención, un césped comercial, campo de golf o campo que comprende una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa como se describe en cualquiera de los párrafos anteriores o una progenie o semilla de la misma es provista .

Modalidades de la invención también son concernientes con un método para identificar ' una planta resistente a herbicida del grupo de Panicodae, que incluye: proveer un callo de células sin diferenciar de una planta del- grupo de Panicodae, poner en contacto el callo con por lo menos un herbicida en una cantidad suficiente para retardar el crecimiento o exterminar el callo, seleccionar por lo menos una célula resistente en base a un efecto diferencial del herbicida, y regenerar una planta entera viable de la variedad de la por lo menos una célula resistente, en donde la planta regenerada es resistente al por lo menos un herbicida. En algunas modalidades, el método incluye además expandir la por lo menos una célula resistente a una pluralidad de células sin diferenciar. En algunas modalidades, el callo de la célula sin diferenciar es provisto de una planta no transgénica.

En algunas modalidades de la invención, la planta 'provista en el método es una seleccionada de la tribu de Paniceae. En algunas modalidades, la planta es una seleccionada del grupo de: Axonopus (pasto alfombra), igiteria (digitaria) , Echinochloa, Panicum, Paspalum (pasto bahía) , Pennisetum, Setaria y Stenotaphrum (pasto de San Agustín) . En algunas modalidades, la planta es una seleccionada del grupo de: paspalum de costa (P. vaginatum) , agrostide o grana (Agrostis spp) , pasto festuca alto, pasto Zoysia, pasto bermuda (Cynodon spp) , pasto azul de Kentucky, pasto azul de Texas, pasto de centeno perenne, pasto búfalo (Buchloe dactyluides) , pasto de centípedo (Eremochloa ophiuroides) y pasto de San Agustín (Stenotaphrum secundatum) , pasto alfombra (Axonopus spp.) y pasto bahía (Paspalum notatum) .

En algunas modalidades de la invención, el por lo menos un herbicida usado en el método es un inhibidor de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) . En algunas modalidades, el por lo menos un herbicida es seleccionado del grupo de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, séthoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizf.op, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fiuazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

En algunas modalidades de la invención, la resistencia a herbicida de la planta es conferida por una mutación de por lo menos una posición de aminoácido del gen de ACCasa seleccionado del grupo de: 1756, 1781, 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096. En algunas modalidades, la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de isoleucina a leucina en la posición de aminoácido 1781·.

Modalidades de la invención también son concernientes con un cultivo de tejido de células regenerables de una planta resistente a herbicida identificada por los métodos como se describe en los párrafos anteriores .

En modalidades de la invención, se provee un método para controlar malezas en la vecindad de una planta resistente a herbicida, en donde la planta resistente a herbicida es identificada por los métodos descritos en los párrafos anteriores, el método incluye: poner en contacto por lo menos un herbicida a las malezas y a la planta resistente a herbicida, en donde por lo menos un herbicida es puesto en contacto con las malezas y con la planta a una velocidad suficiente para inhibir el crecimiento de una planta no seleccionada de la misma especie o suficiente para inhibir el crecimiento de las malezas. En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida es resistente a un inhibidor de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) . En algunas modalidades, el método incluye poner en contacto el herbicida directamente con la planta resistente a herbicida. En algunas modalidades, el método incluye poner en contacto el herbicida con un medio de cultivo en el cual la planta resistente a herbicida está localizada.

En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida es resistente a un herbicida de ciclohexandiona, un herbicida de propionato de ariloxifenoxi , un herbicida de fenilpirazolina o mezclas de los mismos . En algunas modalidades, la planta resistente a herbicida es una planta no transgénica .

En algunas modalidades de la invención, la resistencia a herbicida en la planta es conferida por una mutación de por lo menos una posición de aminoácido del gen de ACCasa seleccionada del grupo de: 1756, 1781, ^ 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096. En algunas modalidades, la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de isoleucina a leucina en la posición de aminoácido 1781 del gen de ACCasa.

En algunas modalidades, el por lo menos un herbicida usado en el método es seleccionado del grupo de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaguizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

Modalidades de la invención son concernientes con un marcador de ADN específico de paspalum de costa depositado como No. de Depósito de ATCC. , o un fragmento del mismo, que es apto de identificar cultivos de césped resistentes a herbicidas. En algunas modalidades, el marcador de ADN específico de paspalum de costa comprende SEQ ID NO: -5 o un fragmento de la misma.

Modalidades de la invención también son concernientes con un método para identificar una planta resistente a herbicida, que incluye: obtener una muestra genética de la planta y analizar la muestra en cuanto, a la presencia o ausencia de una mutación en posición 1781 del gen de ACCasa, en donde la presencia de una mutación en posición 1781 es indicadora de resistencia a herbicida en la planta. También contemplados son los usos del marcador en posición 1781 del gen de ACCasa en un método para identificar una planta resistente a herbicida .

Modalidades de la invención son concernientes con un método de cruza ' auxiliada por marcador, que incluye las etapas de: identificar un elemento de interés para cria y selección, en donde el elemento está en enlace con un gen de ACCasa, proveer una primera planta que porta una variante de secuencia de ACCasa apta de conferir después de la resistencia a la planta a un herbicida inhibidor de ACCasa, en donde la planta comprende además el elemento de interés, cruzar la primera planta con una segunda planta, identificar la progenie de la etapa de cruce por tener la variante de secuencia de ACCasa y seleccionar la progenie probable de tener el elemento de interés en base a la etapa de identificación. En algunas modalidades, el elemento es seleccionado de: un rasgo o un gen. En algunas modalidades, el rasgo es por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de: tolerancia a herbicida, resistencia a enfermedad, resistencia a insectos de peste, ácido graso alterado, prote na o metabolismo de carbohidratos, velocidades de crecimiento incrementada, tolerancia a esfuerzo mejorada, madurez preferida, propiedades organolépticas mejoradas, características morfológicas alteradas, esterilidad, otros rasgos agronómicos, rasgos para usos industriales o rasgos para atractivo al consumidor mejorado.

En algunas modalidades de la invención, la variante de secuencia de ACCasa incluida en el método incluye una variación en por lo menos una de posición: 1756 , 1783 , 1999 , 2027 , 2041 , 2078 , 2099 y 2096 . En algunas modalidades, el herbicida al cual la planta es resistente es por lo menos uno seleccionado del grupo de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, pfofoxydim, sethoxydim. clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, . clofop cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

En algunas modalidades, la etapa de identificación incluida en el método incluye un proceso seleccionado de: detección molecular de la variante de secuencia, observación de resistencia a un inhibidor de ACCasa, y selección mediante aplicación de un inhibidor de ACCasa.

Modalidades de la invención son concernientes con una planta transgénica, transformada con un segmento de ADN que comprende por lo menos 250 bases derivadas de la secuencia- del depósito de ATCC No. , y plantas de progenie de la misma. En algunas modalidades, la planta de progenie es seleccionada de: una progenie de retrocruce, un híbrido, una progenie clonal, y una progenie sib-apareada . En algunas modalidades, el segmento de ADN comprende por lo menos 250 bases derivadas de SEQ ID NO: 5.

Modalidades de la invención también son concernientes con una célula transformada que contiene un segmento de ADN que comprende por lo menos 250 bases derivadas de la secuencia del Depósito de ATCC No. . En algunas modalidades, el segmento de ADN comprende por lo menos 250 bases derivadas de SEQ ID NO : 5.

En modalidades de la invención, se provee un método para identificar una mutación en la posición 1781 del gen de ACCasa en una célula, el método incluye obtener una muestra genética de una célula, amplificar selectivamente un fragmento de ADN al usar el cebador de SV384F y cebador.de SV348R.en una etapa de amplificación, y secuenciación del fragmento de ADN para determinar la presencia o ausencia de una mutación en posición 1781 del gen de ACCasa, en donde la presencia de una mutación en el fragmento de ADN es indicador de la presencia de la mutación en posición 1781 en la célula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Aquellos de habilidad en el arte entenderán que las figuras descritas . a continuación son por propósitos ilustrativos solamente. No se pretende que las figuras limiten el alcance de las enseñanzas de presente de ninguna manera.

La Figura 1 es un diagrama de la ruta de biosíntesis de ácido graso en plantas .

La Figura 2 es una ilustración de una modalidad de un protocolo de selección de herbicida para seleccionar plantas resistentes a herbicida no transgénicas como se revela en la presente.

La Figura 3 es una gráfica que ilustra una curva de dosis de sethoxydim-respuesta, para paspalum de costa {Paspalum vaginatum) .

La Figura 4 es una fotografía de un callo resistente a sethoxydim de paspalum de costa que crece en un medio de inducción de callo inducción que contiene sethoxydim.

La Figura 5 es una serie de cromatografías que ilustran la mutación de aminoácido en posición 1781 del gen de ACCasa en una planta de paspalum de costa resistente a herbicida seleccionado como se revela en la presente.

La Figura 6 es una fotografía que ilustra la respuesta de plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, a sethoxydim Segment™ a 7 días después tratamiento (DAT) .

La Figura 7 es gráfica que ilustra la lesión a plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, por sethoxydim Segment™ a 7 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 8 es una fotografía que ilustra la respuesta de plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la- presente, a sethoxydim Segment™ a 14 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 9 es gráfica que ilustra la lesión a plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, mediante sethoxydim de Segment™ a 14 días después de tratamiento (DAT) .

La Figura 30 es una fotografía que ilustra la respuesta de plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, a sethoxydim Segment™ a 21 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 11 es gráfica que ilustra la lesión a plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, mediante sethoxydim Segment™ a 21 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 12 es una gráfica que ilustra el peso seco promedio de plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas, como se revela en la presente, después de tratamiento con sethoxydim Segment™ a 42 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 13 es una gráfica que ilustra la lesión a plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, mediante sethoxydim Poast™ a 21 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 14 es una gráfica que ilustra la lesión a plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, mediante el herbicida de fluazifop-p-butilo Fusilade II™ a 21 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 15 es una gráfica que ilustra la lesión a plantas testigo y plantas resistentes a herbicida, seleccionadas como se revela en la presente, mediante el herbicida fenoxaprop-p-butilo Extra™ II de Acclaim a 21 días después del tratamiento (DAT) .

La Figura 16 es una ilustración de una modalidad de producción de callo obtenida del meristemo intercalar de una planta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La resistencia a herbicidas de césped selectivos puede proveer un medio altamente efectivo para controlar céspedes cubiertos de malas hierbas en varias especies de hierba para céspedes. Los procedimientos de ingeniería genética han sido propuestos para el desarrollo de plantas resistentes a herbicidas, sin embargo, estos pueden ser difíciles de comercializar debido a regulaciones gubernamentales y restricciones con respecto al uso de plantas modificadas genéticamente. En contraste, la liberación ambiental de plantas con resistencia a herbicida derivadas por medios no transgénicos no está sometido actualmente a regulación gubernamental estricta. Así, modalidades de la invención son concernientes con métodos para filtrar y seleccionar plantas de hierbas para céspedes resistentes a herbicidas, en los que se incluyen métodos que son efectivos sin transgénesis.

Definiciones A no ser que se indique de otra manera, los términos se comprenderán de acuerdo con el uso convencional por aquellos de habilidad ordinaria en el arte relevante.

Como, se usa en la presente, el término "explante" se refiere a un tejido de planta que incluye tejido meristemático . También se puede referir a tejidos de planta que incluyen, sin limitación, uno o más embriones, cotiledones, hipocotilos, bases de hojas, mesocotilos, plúmulas, protoplastos y ejes embriónicos.

Como se usa en la presente, el término "callo" se refiere a una masa celular de planta sin diferenciar que puede ser cultivada o mantenida en un medio de cultivo para producir células genéticamente idénticas .

Como se usa en la presente, el término "resistente a herbicida" o "tolerante a herbicida", incluyendo cualquiera de sus variaciones, se refiere a la habilidad de una planta para recuperarse de, sobrevivir y/o prosperar después de contacto con un herbicida en una cantidad que es suficiente para provocar retardo de crecimiento o muerte de una planta no resistente de la misma especie. Comúnmente, cantidades de herbicida suficientes para provocar el crecimiento o muerte de una planta no resistente fluctúan de aproximadamente 2 µ? a aproximadamente 100 µ? de concentración de herbicida. En algunas modalidades, una cantidad suficiente de herbicida fluctúa de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? de concentración de herbicida, de aproximadamente 8 µ? a aproximadamente 30 µ? de concentración de herbicida, o de aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 25 µ? de concentración de herbicida. Alternativamente, cantidades de herbicida suficientes para provocar el crecimiento o muerte de una planta no resistente fluctúan de aproximadamente 25 gramos de ingrediente activo por hectárea (g de ingrediente activo ha"1) a aproximadamente 6500 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida. En algunas modalidades, una cantidad suficiente de herbicida fluctúa de aproximadamente 50 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 5000 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida, aproximadamente 75 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 2500 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida, aproximadamente 100 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 1500 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida, o aproximadamente 250 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 1000 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida.

Como se usa en la presente, el término "selección auxiliada por marcador" se refiere al proceso de seleccionar un rasgo deseado o rasgos deseados en una planta o plantas al detectar uno o más marcadores en enlace con el rasgo deseado. Tales marcadores pueden ser marcadores fenotípicos, tales como por ejemplo, resistencia a un herbicida o antibiótico. Asimismo, tales marcadores pueden ser marcadores moleculares tales como por ejemplo, uno o más polimorfismos (como se describe posteriormente en la presente) , ADN o AR enzimas u otras secuencias que son fácilmente detectables .

Un polinucleótido "exógeno" a una planta individual es un polinucleótido que es introducido a la planta por medios diferentes a un cruce sexual. Ejemplos mediante los cuales esto se puede llevar a cabo son descritos a continuación e incluyen transformación, métodos biolísticos, electroporación y los semejantes. Tal planta que contiene el ácido nucleico exógeno es denominada en la presente como planta transgénica de generación R0 (para plantas generadas de células transformadas in vitro) . R0 también se puede referir a cualquier otra planta regenerada ya sea transgénica o no.

Como se usa en la presente, el término M transgénico" describe una planta que no se presentan en la naturaleza que contiene un genoma modificado por el hombre, en donde la planta incluye en su genoma una molécula de ácido nucleico exógena, que puede ser derivada de la misma especie o una especie diferente, incluyendo una especie no de planta. La molécula de ácido nucleico exógena puede ser un elemento regulador genético tal como un promotor, me orador u otfo elemento regulador, o pueden contener una secuencia de codificación, que puede ser enlazada a un elemento regulador genético natural o heterólogo. Las plantas transgénicas que surgen de cruce sexual o mediante auto-reproducción son descendentes de tal planta.

Como se usa en la presente, "polimorfismo" significa la presencia de una o más variaciones de una secuencia de ácido nucleico en uno o más sitios en una población de uno o más individuos. La variación puede comprender, pero no está limitada a uno o más cambios de base, la inserción de uno o más nucleótidos o la cancelación de uno o más nucleótidos. Un polimorfismo incluye un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) , una repetición de secuencia simple (SSR) , inserciones-cancelaciones (inserciones y cancelaciones), un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, un haplotipo y un SNP de etiqueta. Además, un polimorfismo puede incluir un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región sin traducir 5' de un gen, una región sin traducir 3' de un gen, microARN, siARN, un sitio de rasgo cuantitativo (QTL) , un marcador satélite, un transgen, mARN, ds mARN, un perfil transcripcional o un patrón de metilación. Un polimorfismo puede surgir de procesos aleatorios en replicación de ácido nucleico, por medio de mutagénesis, como resultado de elementos genómicos móviles, de la variación del número de copia y durante el proceso de meiosis, tal como un cruce desigual, duplicación de genoma y rupturas y fusiones de cromosoma. La variación puede ser encontrada comúnmente o puede existir a baja frecuencia dentro una población, la primera tiene mayor utilidad en el cruce de plantas general y la última puede estar asociada con variaciones fenotípicas raras pero importantes.

Como se usa en la presente, un "marcador" se refiere a una secuencia de ácido nucleico polimórfica o elemento de ácido nucleico. En un aspecto más amplio, un "marcador" puede ser una característica detectable que puede ser usada para discriminar entre diferencias heredables entre organismos. Ejemplos de tales características pueden incluir marcadores genéticos, composición de proteína, niveles de proteína, composición de aceite, niveles de aceite, composición de carbohidrato, niveles de carbohidrato, composición de ácido graso, niveles de ácido graso, composición de aminoácido, niveles de aminoácidos, biopolímeros , farmacéuticos, composición de almidón, niveles de almidón, almidón fermentable, campo de fermentación, eficiencia de fermentación, campo de energía, compuestos secundarios, metabolitos, características morfológicas y características agronómicas.

Como se usa en la presente, un "análisis de marcador" se refiere a un método para detectar un polimorfismo en un sitio particular utilizando un método particular, por ejemplo medición de por lo menos un fenotipo (tal como color de semilla, color de flor u otro rasgo detectable visualmente) , polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) , extensión de una sola base, electroforesis , alineación de secuencia, hibridización de oligonucleótido específico alélico (ASO) , ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) , tecnologías a base de microarréglos y tecnologías de secuenciación de ácido nucleico, etc.

Como se usa en la presente, "genotipo" se refiere al componente genético del fenotipo, y este puede ser caracterizado indirectamente utilizando marcadores o caracterizado directamente mediante secuenciación de ácido nucleico. Marcadores apropiados incluyen un carácter fenotípico, un perfil metabólico, un marcador genético o algún otro tipo de marcador. Un genotipo puede constituir ' un alelo para por lo menos un sitio de marcador genético o un haplotipo para por lo menos una ventana de haplotipo. En algunas modalidades, un genotipo puede representar un solo sitio y en otros puede representar un conjunto de sitios de genoma amplio. En algunas modalidades, el genotipo puede reflejar la secuencia de una porción de un cromosoma, un cromosoma entero, una porción del genoma y el genoma entero .

Como se usa en la presente, "sitio de rasgo cuantitativo (QTL) " se refiere a un sitio que controla a algún grado rasgos représentables numéricamente que son distribuidos usualmente de manera continua.

Como se usa en la presente, un "fragmento de secuencia de ácido nucleico" se refiere a una porción de una secuencia de nucleotidos de un polinucleotido o una porción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Fragmentos de una secuencia de nucleotidos pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína de plena longitud natural o correspondiente. Los fragmentos de una secuencia de nucleotidos puede fluctuar de por lo menos aproximadamente 20 nucleotidos, aproximadamente 50 nucleotidos, aproximadamente 100 nucleotidos, aproximadamente 250 nucleotidos y hasta la secuencia de nucleotidos de plena longitud de genes o secuencias que codifican proteínas como se revela en la presente.

Plantas apropiadas para selección Modalidades de la invención son concernientes con plantas . resistentes a herbicidas del grupo Panicodae regenerados de una célula resistente a herbicida que ha sufrido un proceso de selección de herbicida también como métodos para identificar las mismas. La planta puede ser por ejemplo, una seleccionada del grupo de: una tribu de Isachneae, una tribu de Neurachneae, una tribu de Arundinellaeae, y una tribu de Paniceae. En algunas modalidades, la planta puede ser cualquier miembro de un género seleccionado de la lista provista en la Tabla A o Tabla B. Una lista no exhaustiva ejemplar de plantas apropiadas para uso en la invención incluyen miembros de la tribu de paniceae, tales como: Axonopus, mala hierba, pasto bahía, pasto de San Agustín y mijos, en los que se incluyen cola de zorra (Setaria italical) , perla (Pennisetu glaucum) , y Proso (Pcmicum miliaceum; denominado comúnmente como mijo "común", mijo de maíz común, mijo puerco o mijo blanco) .

En algunas modalidades, la planta es una especie de hierbas para céspedes que tienen valor comercial en aplicaciones tales como, por ejemplo, campos de golf, campos atléticos, paisajes comerciales, céspedes comerciales o domésticos y pastizales. Especies de hierbas para céspedes ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, paspalum de costa {Paspalum vaginatum) , pasto bahía {Paspalum notatum) , pasto bermuda (Cynodon spp.) , pasto grama azul (Buchloe dactyloides) , Axonopus {Axonopus spp.), pasto centípede (Eremochloa ophiuroides) , pasto kikuya, zacate banderita, pasto de San Agustín (Stenoiaphrum secondatum) , pasto Zoysia, pasto azul anual, lolio anual, pasto azul de Canadá, fescua o festuca de che ings , agróstide o grama colonial, agróstide o grama trepador, pasto de trigo encrestado, pasto de trigo de fairway, pasto fescue o festuca duro, pasto azul de Kentucky, pasto azul de Texas, dáctilo aglomerado, pasto de centeno perenne, pasto fescua o festuca rojo, copa rojiza, pasto azul burdo, pasto para ovejas, pasto gromo suave, pasto fescua o festuca alto, pasto Timothy, agrostis de terciopelo, pasto alcalino con malezas, pasto de trigo del oeste y los semejantes.

Tabla A. Miembros de género (organizados por tribu) del Grupo Panicodae Tribu: Isachneae Tribu: Neurachneae Tribu: Arundinelleae Coelachne Neurachne Arundinella Cyrtococcum Paraneurachne Chandrasekharania Heteranthoecia Thyridolepis Danthoniopsis Hubbardia Dilophotriche Isachne Gamotia Limnopoa Gilgiochloa Sphaerocaryum Isalus Jansenella Leudetia Loudetiopsis Trichopteryx Tristachyá Zonotriche Tabla B: Miembros de género de la tribu de Panlceae del Grupo de Pan codae Tribu: Paníceae Achlaena Echinochloa Perulifera Acostia Echinolaena Plagiantha Acritochaete Entolasia Plagiosetum Acrecerás Erichloa Poecilostachys Alexfloydia Fasciculochloa Pseudechinolaena Alloteropsis Gerritea Pseudochaetochloa Amphicarpum Holcolemma Pseudoraphis Ancistrachne Homolepis Reimarochloa Anthaenantiopsis Homopholis Reynaudia Anthenantia Hydrothauma Pvhynchelytrum Anthephora Hygrochloa Sacciolepis Arthragrostis Hylebates Scutachne Arthropogon Hymenachne Setaria Axonopus Ichananthus Setariopsis Baptorhachis Ixophorus Snowdenia Bekeropsis Lasiacis Spheneria Boivinella Lecomtella Spinifex Brachiaria Laeptocoryphium Steinchisma Calyptochloa Leptoloma Stenotaphrum Camusiella Leucophrys Stereochlaena Cenchrus Louisiella Streptolophus Centrochloa Megaloprotachne Streptostachys Chaetrium Melinis Tainiorhachis Chaetopoa Mesosetum Tarigidia Chamaeraphis Microcalamus Tatianyx Chasechloa Mildbraediochloa Thrasya Chloachne Oldentelytrum Thrasyopsis Chlorocalymma Ophiochloa Thuarea Cleistochloa Oplismenopsis Thyridachne Cliffordiochloa Oplismenus Trachys Commelinidium Oryzidium Tricholaena Cymbosetaria Otachyrium Triscenia Cyphochlaena , Ottochloa Urantheocium Dallwatsonia Panicum Urochloa Dichanthelium Paratheria Whitecloa Digitada Paractenium Xerochloa Digitariopsis Paspalidium Yakirra Dimorphochloa Paspalum Yvesia Dissochondms Pennisetum Zygochloa Eccoptocarpha En modalidades de la invención, la planta a ser sometida al (los) métodos de ' la invención puede ser una encontrada en la naturaleza, una planta no transgénica cultivada o una planta que ha sido modificada mediante medios genéticos, tales como por ejemplo, una planta transgénica.

Fuente de Callo Selecciones de explante pueden ser cosechadas de cualquier porción de la planta que produce un callo o una masa de células sin diferenciar que pueden ser cultivadas in vitro. Por ejemplo, una selección de explante puede ser obtenida del tejido de meristemo intercalado de una planta, influorescencias inmaduras o tejido meristemático de hoja. En algunas modalidades, la selección de explante puede ser obtenida de una semilla de una planta o un fragmento o sección de la misma.

Antes de la adquisición de explante, el tejido o semilla fuente puede ser sometido a una etapa de esterilización para evitar contaminación microbiana in vitro. La esterilización puede incluir enjuague en una solución de blanqueo, tal como por ejemplo, una solución de aproximadamente 10% (volumen/volumen) a.100% (volumen/volumen), enjuague en una solución de alcohol (por ejemplo, etanol) , tal como por ejemplo una solución de aproximadamente 50% (volumen/volumen) a 95% (volumen/volumen), y/o enjuague en agua desionizada estéril. La etapa de esterilización puede tomar lugar a cualquier temperatura que no es mortal al material de planta, preferiblemente de alrededor de 20°C a aproximadamente 42 °C.

Los explantes secos (explantes que han sido extirpados de la semilla bajo condiciones de baja humedad) o explantes húmedos secos (explantes que han sido extirpados de la semilla enseguida de la hidratación/imbibición y son subsecuentemente deshidratados y almacenados) de varias edades pueden ser usados.' En algunas modalidades, los explantes son relativamente "jóvenes" en que han sido removidos de semillas para menos de un día, por ejemplo de aproximadamente 1 a 24 horas, tal como aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20 ó 23 horas antes del uso. En algunas modalidades, los explantes pueden ser almacenados por períodos más largos, incluyendo días, semanas, meses o aún años, dependiendo de las condiciones de almacenamiento usadas para mantener la viabilidad del explante. Aquellos de habilidad en el arte pueden entender que los tiempos de almacenamiento pueden ser optimizados de tal manera que se puede obtener una formación de callo eficiente.

En algunas modalidades, una semilla seca o un explante puede primero ser cebado, por ejemplo mediante imbibición de un líquido tal como agua o un líquido de esterilización, re-secado y usado posteriormente para producción de tejido de callo.

El explante puede ser recuperado de una semilla hidratada, de semilla almacenable seca, de una rehidratación parcial de explante hidratado seco, en donde "hidratación" y "rehidratación" es definido como un cambio mensurable del porcentaje de humedad de semilla interno o de una semilla que es "cebada"; esto es, una semilla que ha iniciado la germinación pero ha sido colocada apropiadamente en estasia pendiente de condiciones favorables para consumar el proceso de germinación. Aquellos de habilidad en el arte serán aptos de usar varios métodos de hidratación y optimizar la duración del tiempo de incubación antes de la inducción del tejido de callo. El nuevo explante resultante es almacenable y puede germinar y/o ser usado para inducir la formación del callo cuando se proveen condiciones apropiadas. Así, el nuevo explante de meristemo almacenable seco puede ser denominado como una semilla artificial.

La selección de explante es cultivada en un medio de cultivo de planta apropiado para la promoción de formación de callo. Por ejemplo, el medio de cultivo de planta puede ser medio M5/B5 (Murashige y Skoog. 1962. Physiol Plant 15:473-497; Gamborg et al. 1968. Exp Cell Res 50:151-358, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) complementado con auxinas y nutrientes, incluyendo aminoácidos, carbohidratos y sales. Una variedad de medios de cultivo de tejido son conocidos que, cuando son complementados apropiadamente, soportan el crecimiento y desarrollo del tejido de planta, incluyendo formación de tejido de callos a partir de selecciones de explante. Estos medio de cultivo de tejido pueden ya sea ser comprados como una preparación comercial o preparado sobre pedido y modificados por aquellos de habilidad en el arte. Ejemplos de tales medios incluyen, pero no están limitados a aquellos descritos por Murashige y Skoog (1962. Physiol Plant 15:473-497); Chu et al. (1975. Scientia Sínica 18:659-668); Linsmaier y Skoog (1965. Physiol Plant 18:100-127); Uchimiya y Murashige (1962. Plant Physiol 15:73); Gamborg et al. (1968. Exp Cell Res 50:' 151-158); Duncan et al. (1985. Plant 165:322-332); Lloyd y McCown (1981. Proc-lnt Plant Propagator's Soc 30:421-427); Nitsch y Nitsch (1969. Science 163:85-87); y Schenk y Hildebrandt (1972. Can J Bot 50:199- 204) ; cada una de las anteriores es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Asimismo, aquellos de habilidad en el arte pueden hacer derivaciones de estos medios, complementados de conformidad. Aquellos de habilidad en el arte están concientes de que los medios y complementos de medios tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para uso en la transformación y regeneración son frecuentemente optimizados para la cosecha objetivo particular o variedad de interés. Los medios de cultivo de tejido pueden ser complementados con carbohidratos, tales como pero no limitados a glucosa, sacarosa, maltosa, mañosa, fructosa, lactosa, galactosa y/o dextrosa, o proporciones de carbohidratos. Los reactivos están disponibles comercialmente y pueden ser comprados de una diversidad de proveedores (véase, por ejemplo Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.; y PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, Kans . ) . Además auxinas apropiadas pueden incluir pero no están limitadas a, dicamba, ácido 2 , 4-diclorofenoxi acético ("2,4-D") y los semejantes. Las formulaciones de inducción de callo pueden depender de la selección de explante y pueden ser seleccionadas y optimizadas de acuerdo con protocolos que son bien conocidos para aquellos de habilidad en el arte.

Evaluación de Formación de Callo La habilidad de cada genotipo para producir callos es evaluada antes de que ocurra el primer subcultivo. Las líneas celulares más prolíficas pueden ser determinadas al observar el número de explantes por genotipo, que producen callos. Una escala numérica relativa puede ser aplicada a cada callo después de aproximadamente 30 días. Por. ejemplo, una escala numérica puede consistir de una clasificación de l a 5, dependiendo de la cantidad de los callos producidos por el explante. Una clasificación ejemplar de 5 puede indicar que el explante produce una grande cantidad de tejido de callos, mientras que una clasificación de 1 es asignada a los explantes que tienen cantidades muy bajas de producción de callo visible. Después de la clasificación, cada callo es removido y subcultivado . Los callos producidos por cada explante pueden ser identificados como una línea de célula individual. El subcultivo de cada callo se puede llevar a cabo cada dos o tres semanas, por ejemplo.

Evaluación de Respuesta de Dosis a Herbicida La concentración de herbicida apropiada usada en la selección en cuanto a callos resistentes es determinada al colocar tejido de callo de cada genotipo ser probado en una serie de placas de medio de inducción con concentraciones variables de herbicida. El intervalo de concentraciones de herbicida probadas en el análisis de dosis-respuesta es preferiblemente 0 a 15 veces la dosificación mortal predicha, más preferiblemente 2 a 10 veces la dosificación mortal predicha y comúnmente alrededor de 3 a 5 veces la dosificación mortal predicha. La concentración de herbicida a ser usada en la selección en cuanto callos resistentes puede ser de 30-50% mayor que la dosificación mínima a la cual no hay crecimiento del callo testigo, tal como se determina por el análisis de dosis-respuesta.

Selección de Células Resistentes a Herbicida Para seleccionar células resistentes a herbicida, el tejido de callo maduro puede ser colocado sobre el medio de inducción de callo que contiene la concentración de herbicida apropiada, tal como es determinada por análisis de dosis-respuesta. Los callos pueden ser subcultivados a cajas nuevas como sea necesario durante el proceso de selección. Después que los callos resistentes son identificados, pueden ser subcultivados sobre el medio de inducción para crecimiento adicional, suficiente para soportar la regeneración.

Regeneración de Células Resistentes a Herbicida a Plantas Enteras Los callos son removidos del medio de cultivo de planta y depositado sobre un medio de regeneración apropiado. Una variedad de medios de cultivo de tejido son conocidos que, cuando son complementados apropiadamente, soportan el crecimiento, desarrollo y regeneración de tejido de planta.

Estos medios de cultivo de tejido pueden ya sea ser comprados como una preparación comercial o preparado sobre pedido y modificados por aquellos de habilidad en el arte. Ejemplos de tales medios incluyen, pero no están limitados a aquellos enlistados anteriormente en la presente. Como un ejemplo no limitante, Paspalum vaginatum puede ser regenerado al colocar callos de cada linea resistente sobre un medio que consiste de medio basal MS/B5 complementado con 1.24 mg L"1 de CuS04 y 1.125 mg/L"1 de BAP ( 6-bencilaminopurina) . El medio de regeneración puede depender de la fuente del tejido de planta y la selección del medio de regeneración y protocolo apropiados para la regeneración son conocidos para aquellos de habilidad en el arte.

La regeneración puede ocurrir ya sea sobre medios sólidos o líquidos en receptáculos tales como por ejemplo, cajas de Petri, matraces, tanques o cualquier otra cámara apropiada que es usada para el cultivo. El receptáculo puede opcionalmente ser sellado (por ejemplo, con cinta de filtro) para facilitar el intercambio de gas para las plantas de regeneración. Las condiciones de la cámara de cultivo pueden estar a entre aproximadamente 20°C o menos, a 40°C o más. En algunas modalidades, temperaturas apropiadas para el cultivo puede fluctuar de aproximadamente 22 °C a 37°C, aproximadamente 25°C a 35°C, o aproximadamente 28°C a 32°C. La exposición de oscuridad: luz puede fluctuar de aproximadamente 1 hora de oscuridad: 23 horas luz a aproximadamente 12 horas de oscuridad o más: 12 horas luz o menos. En algunas modalidades, la exposición a la oscuridad: luz puede fluctuar de aproximadamente 2 horas de oscuridad: 22 horas de luz, a aproximadamente 10 horas de oscuridad: 14 horas de luz, de aproximadamente 4 horas de oscuridad: 20 horas de luz, a aproximadamente 8 horas de oscuridad: 16 horas de luz. La exposición a la oscuridad: luz puede ser seguid por cualquiera entre aproximadamente 1 hora a 10 horas de oscuridad, aproximadamente 2 horas a 8 horas de oscuridad, o aproximadamente 4 horas a 6 horas de oscuridad. En algunas modalidades, el período de oscuridad puede ser seguido por ciclos adicionales de exposición a la oscuridad: luz seguida por exposición a la oscuridad en cualquier combinación apropiada para regeneración. La intensidad de luz apropiada es seleccionada de acuerdo con protocolos bien conocidos en el arte para facilitar el crecimiento. Por ejemplo, para facilitar el crecimiento y regeneración de Paspalum vaginatum, la intensidad de luz aproximadamente equivalente a aquella provista por las bombillas blancas frías de General Electric (GE) a una intensidad de 66-95 µ? m"2 s"1 puede ser provista a las plantas de crecimiento.

Progenie de Plantas Regeneradas Las plantas regeneradas pueden ser reproducidas asexual o sexualmente. Por ejemplo, las plantas regeneradas pueden ser auto-polinizadas. En algunas modalidades, el polen puede ser obtenido de plantas regeneradas y cruzadas a plantas de cultivo de semilla de otra planta que tiene un segundo rasgo deseado. En algunas modalidades, el polen puede ser obtenido de una planta que tiene un segundo rasgo deseado y usado para polinizar plantas regeneradas. La progenie de las plantas regeneradas puede ser por ejemplo, una semilla o un corte de propagación, en el cual la resistencia a herbicida de la planta regenerada es heredada del padre. Además, las plantas regeneradas pueden ser auto-cruzadas o cruzadas por gemelo para desarrollar una línea de plantas homocigas para el alelo resistente. En algunos casos tales plantas homócigas pueden tener un nivel más alto de resistencia a las plantas heterócigas seleccionadas originalmente.

La propagación vegetativa puede ser llevada a cabo al utilizar césped, tapones, retoños y estolones. Cuando son aplicados a variedades de hierba para céspedes, la propagación vegetativa de tales céspedes produce progenie que son comúnmente clónales (genéticamente idéntico) . Las variedades vegetativas clónales producen una hierba para césped que es muy uniforme en apariencia.

Ciertas variedades son propagadas solamente por medios vegetativos; variedades ejemplares que tienen este elemento incluyen ornamentales, frutos pequeños y árboles.

Caracterización Molecular de Resistencia a Herbicida Las mutaciones que conducen a resistencia a herbicida en plantas pueden ser caracterizadas mediante extracción y subsecuente amplificación de PCR de ADN del tejido de planta. El ADN de planta puede ser extraída mediante cualquier número de métodos de extracción de ADN, tal como el método de CTAB (Lassner, et al., 1989. Plant Mol. Biol . Rep. 7:1 16-128, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) , un método de SDS-potasio-acetato (Dellaporta et al. 1983. Plant Molecular Biology Repórter 1:19-21, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) , amplificación directa de tejido de hojas (Berthomieu y Meyer 1991. Plant Molecular Biology 17:555-557, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) , un método de ebullición (Ikeda el al. 2001. Plant Molecular Biology Repórter 19(1): 27-32, que es incorporado por referencia en la presente en su totalidad) , un método de tratamiento alcalino (Xin et al. 2003. BioTechniques 34:820-826, que es incorporada por referencia en la presente en su totalidad) , tarjetas de FTA®, o cualesquier otros protocolos de extracción de ADN efectivos para plantas. Los cebadores usados para iniciar la amplificación de PCR de las regiones de ADN que confieren resistencia a herbicida pueden ser diseñados para coincidir con secuencias de flanqueo conservadas del número más alto de especies relacionadas posibles .

Identificación de Mutaciones Asociadas con Resistencia a Herbicidas Inhibidores de ACCasa Las plantas identificadas por ser resistentes a herbicidas inhibidores de ACCasa mediante los métodos revelados en la presente pueden ser evaluadas en cuanto a mutaciones genéticas dentro del gen de ACCasa. Por ejemplo, en algunas modalidades, las mutaciones genéticas pueden conducir a mutaciones en la prote na de ACCasa en los residuos de Gln 1756, lie 1781, Trp 1999, Trp 2027, lie 2041, Asp 2078, Cys 2088 y/o Gly 2096. En algunas modalidades, las sustituciones en aquellos residuos pueden incluir, pero no están limitadas a leucina, alanina, valina, cisteína, ácido aspártico, glicina, arginina y ácido glutámico. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido dentro de la proteina de ACCasa puede ser, por ejemplo, Gln 1756 a Glu, lie 1781 a Leu, lie 1781 a Ala, He 1781 a Val, Trp 1999 a Cys, Trp 2027 a Cys, lie 2041 a Asp, He 2041 a Val, Asp 2078 a Gly, Asp 2078 a Val, Cys 2088 a Arg, y/o Gly 2096 a Ala y los semejantes. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido pueden ser una combinación de dos o más mutaciones en. posiciones tales como aquellas descritas anteriormente, que involucran cambios tales como aquellos descritos anteriormente. Asimismo, en algunas modalidades, otras sustituciones conservadoras se pueden hacer en estás posiciones y/u en otras posiciones conocidas para aquellos de habilidad en el arte como posiciones de contacto o interacción entre uná ACCasa y un inhibidor de ACCasa.

Mutaciones en el gen de ACCasa que conducen a sustituciones de aminoácido en la proteína de ACC incluyen aquellas enlistadas en la Tabla C.

Tabla C. Resumen de Sustituciones de Aminoácidos Asociadas con Resistencia a Herbicida de Inhibidor de ACCasa Además, la resistencia a herbicida de ACCasa puede ser conferida mediante cualesquier sustituciones conservadoras en cualquiera de las posiciones de aminoácidos referidas. Una tabla de sustituciones conservadoras es provista en la Tabla D.

Tabla D. Sustituciones de aminoácido conservadoras Evaluación de Resistencia de Planta Entera a Herbicida La resistencia a herbicida de planta entera puede ser evaluada al comparar los efectos de la exposición a herbicida sobre líneas celulares resistentes a herbicida con testigos susceptibles a herbicida. La exposición a herbicida se puede llevar a cabo al tratar plantas resistentes a herbicida y plantas testigo susceptibles a herbicida con clasificaciones variables de herbicida, que fluctúan de 0 a 20 veces la dosis mortal conocida para la especie de interés.

Resistencia a Herbicida Modalidades de la invención son concernientes con métodos y composiciones como se revela en la presente para desarrollar resistencia a herbicida en plantas para aplicaciones comerciales. En modalidades de la invención, las plantas son seleccionadas e identificadas por ser resistentes a herbicidas inhibidores de ACCasa.

Se sabe que la acetil co-enzima A carboxilasa (ACCasa) existe en dos formas: eucarióntica y procarióntica . La forma procarióntica está compuestas de cuatro subunidades, mientras que la forma eucarióntica es un solo polipéptido con dominios funcionales distintos (Harwood, el al. 1988. Plant Molecular Biology 39: 101 - 138, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) . La acetil-coenzima A es carboxilada mediante ACCasa para formar malonil-coenzima A en la primera etapa comprometida de biosíntesis de lípido. La ACCasa es dividida en compartimientos en dos formas en la mayoría de las plantas (Sasaki, et al. 1995. Plant Physiology 108:445-449, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Se sabe que el cloroplasto es el sitio primario de síntesis de lípido; sin embargo, ACCasa puede estar presente en el citosol también. La mayoría de las plantas tienen la forma procarióntica en el cloroplasto y la forma eucarióntica en el citosol. La proteína procarióntica tetramérica es codificada mediante cuatro genes distintos, uno está ubicado en el genoma de cloroplasto. La forma eucarióntica es codificada por un gen nuclear de aproximadamente 12,000 pares de bases de tamaño (Podkowinski , et al. 1996. PNAS 93: 1870-1874, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Los céspedes son únicos en que las formas eucariónticas de ACCasa son encontradas tanto en el citosol como en el cloroplasto (Sasaki, et al. 1995. supra) . Las formas eucariónticas plastídicas y citosólicas de la ACCasa en los céspedes son muy similares, como lo son los genes que codifican para ellas (Gornicki, et al. 1994. PNAS 91 : 6860-6864 , que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Sin embargo, a pesar del hecho de que hay homología entre las formas eucarionticas plastxdicas y cistólicas de la ACCasa, la forma cistólica no es afectada por los herbicidas que inhiben ACCasa (Delye. 2005. Plant Physiology 137:794-806, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) .

Los herbicidas que actúan como inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) interrumpen la biosíntesis de lípidos en plantas, lo que puede conducir a áreas crecientes activamente de destrucción de membrana tales como tejido meristemático . Los inhibidores de ACCasa son ejemplificados por la familia química del ariloxifenoxipropionato (APP) , también conocidos como FOPS, y la familia de ciclohexandiona (CHD) , también conocidas como DIM.

Así, modalidades de la invención son concernientes con plantas seleccionadas en cuanto a resistencia a herbicidas inhibidores de ACCasa y métodos de identificar las mismas. En algunas modalidades, la planta es resistente a un herbicida de ciclohexandiona, un herbicida de ariloxifenoxi proprionato, un herbicida de fenilpirazolina o mezclas de los mismos. En algunas modalidades, la planta es resistente a por lo menos, un herbicida seleccionado de la lista provista en la Tabla E.

Tabla E. Inhibidores de Acetil Coenzima ? Carboxilasa Las cicolohexandionas herbicidas incluyen pero no están limitadas a, sethoxydim (2- [1- (etoxiimino) -butil] -5- [2-(etiltio)propil] -3-hidroxi-2-ciclohexen-l-ona, disponible comercialmente de BASF (Parsippany, NJ.) bajo la designación POAST™) , clethodim ( (E,E)-(±)-2-[l-[ [ ( 3 -cloro-2 -propeni1 ) oxi ] -imino]propil] -5- [2- (etiltio)propil] -3-hidroxi-.2-ciclohexen-l-ona; disponible como SELECT™ de Chevron Chemical (Valent) (Fresno, Calif.)), cloproxydim ( (E, E) -2- [ [ (3-cloro-2-propenil) oxi] imino]butil] -5- [2- (etiltio) ropil] -3-hidroxi-2-ciclohexen-l-ona; disponible como SELECTONE™ de Chevron Chemical (Valent) (Fresno, Calif.)), y tralkoxydim (2-[l-( etoxiimino ) propi1 ] -3 -hidroxi-5-mesitilcielohex-2 -enona , disponible como GRASP™ de Dow Chemical EUA (Midland, Mich.)) . Ciclohexandionas herbicidas adicionales incluyen, pero no están limitadas a, clefoxydim, cycloxydim y tepraloxydim.

Ariloxifenoxi propionatos y/o ácidos ariloxifenoxipropanoicos herbicidas exhiben actividad herbicida general y selectiva contra plantas. En estos compuestos, el grupo ariloxi puede ser fenoxi, piridiniloxi o quinoxalinilo . Ariloxifenoxi propionatos herbicidas incluyen, pero no están limitados a haloxyfop (ácido (2- [4- [ [3-cloro-5- ( trifluo-rometil) -2-piridinil] oxi] fenoxi] -propanoico) , que está disponible como VERDICT™ de Dow Chemical U.S. A. (Midland, Mich.)), diclofop (ácido ( (±) -2- [4- (2 , -diclorofenoxi ) -fenoxi] propanoico) , disponible como HOELON™ de Hoechsl-Roussel Agri-Vet Company (Somerville, N.J.)), fenoxaprop (ácido (±)-2- [4-[ (6-cloro-2-benzoxazolil) oxi] fenoxi]propanoico; disponible como WHIP™ de Hoechst-Roussel Agri-Vet Company (Somerville, N.J.)); fluazifop (ácido (±) -2- [4- [ [5- ( trifluorometil) -2-piridinil] oxi] fenoxi)propanoico; disponible como FUSILADE™ de IC1 Americas ( ilmington, Del.)), fluazifop-P (ácido (R)-2-[4- [ [5- (trifluorometil) -2-piridinil ] oxi] fenoxi]propanoico; disponible como FUSILADE 2000™ de ICI Americas (Wilmington, Del.)), quizalofop (ácido (±) -2- [4 [ ( 6-cloro-2-quinoxalinil ) -oxi] fenoxi Jpropanoico; disponible como ASSURE™ de E. I. DuPont de Nemours (Wilmington, Del.)), y clodinafop.

Análogos de Ciclohexandionas Herbicidas o Propio-natos de Ariloxifenoxi Herbicidas o Fenilpirazolinas Herbicidas Incluidos entre los inhibidores de ACCasa se encuentran herbicidas que están estructuralmente relacionados con las ciclohexandionas herbicidas , propionatos de ariloxifenoxi herbicidas o fenilpirazolinas herbicidas, como se revela en la presente, tales como por ejemplo, análogos, metabolitos, 'intermediarios, precursores, sales y los semejantes.

Transformación con un gen de interés En los métodos revelados en la presente, fragmentos particulares de ADN han sido aislados y clonados en vectores por propósitos de transformar tejido o células de plantas. Por ejemplo, un fragmento de 384 pares de bases ha sido aislado del gen de ACCasa de la Línea A (Ejemplos) , en los cuales se ha identificado una mutación de isoleucina a leucina en posición 1781 de la proteína de ACCasa ("lie 1781 Leu" o "I1781L") . Tales fragmentos identificados pueden ser usados para transformación de tejidos y células de plantas como se revela en la presente.

Varios métodos han sido desarrollados para transferir genes a un tejido de planta, en los que se incluyen pero no limitados a, microproyeccion de alta velocidad, microinyección, electroporación, absorción de ADN directa y transformación moderada bacterianamente. Bacterias conocidas por moderar la transformación de célula de planta incluyen un número de especies de los Rhizobiaceae, en los que se incluyen pero no limitados a, Agrobacterium sp., Sinorhizobium sp. , Mesorhizobium sp., y Bradyrhizobium sp. (por ejemplo, Broothaerts et al., 2005. Nature 433:629-633 y publicación de solicitud de patente estadounidense 2007/0271627, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Objetivos para tal transformación pueden ser tejidos de callo sin diferenciar, tejido diferenciado, una población de células derivadas de una línea celular específica y los semejantes. El co-cultivo y etapas subsecuentes pueden ser efectuados en condiciones oscuras o en la luz, por ejemplo incubadores de Percival iluminados, por ejemplo por 2 a 5 días (por ejemplo, un fótoperíodo de 16 ñoras de luz/8 horas de oscuridad, con intensidad de luz de =5 µ?, tal como aproximadamente 5-200 µ? u otras condiciones de iluminación que permiten el desarrollo de plástido normal) a una temperatura de aproximadamente 23°C o menos dé 25°C, y puede ser efectuada hasta aproximadamente 35°C o 40°C o más.

El vector que contiene el fragmento de ADN aislado puede contener un número de componentes genéticos para facilitar la transformación de la célula o tejido de planta y regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico estructural.

En algunas modalidades, el vector puede contener un gen marcador seleccionable, filtrable o puntuable. Estos componentes genéticos también son denominados en la presente - como componentes genéticos funcionales, ya que producen un producto que sirve para función de identificación de una planta transformada, o un producto de utilidad agronómica. El ADN que sirve como dispositivo de filtración o selección puede funcionar en un tejido de planta regenerable para producir un compuesto que conferiría al tejido de planta resistencia a un compuesto de otra manera tóxico. Un número de genes marcadores filtrables o seleccionables son conocidos en el arte y pueden ser usados en la presente invención. Genes de interés para uso como marcador incluirían pero no están limitados a GUS, proteína fluorescente verde (GFP) , luciferasa (LUX) y los semejantes. Marcadores ejemplares adicionales son conocidos e incluyen ß-glucuronidasa (GUS) que codifica una enzima para varios sustratos cromogénicos (Jefferson et al. 1987. Biochem Soc Trans 15:7-19; Jefferson et al. 1987.. EMBO J 6:3901-3907, ' cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) ; un gen de sitio R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de plantas (Dellaporta et al. 1988. En: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts . 18th Stadler Genetics Symposium 11: 283-282, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) ; un gen de ,ß- lactamasa (Sutcliffe et al. 1978. Proc Nati Acad Sci USA 75:3737-3741 , que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad); un gen que codifica una enzima para varios sustratos cromogénicos son conocidos (por ejemplo, PADAC , una cefalosporina cromogénica) ; un gen de luciferasa (Ow et al. 1986. Science 234:856-859, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) ; un gen de xylE (Zukowsky et al. 1983. Proc Nati Acad Sci USA 80: 1101-1105, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) que codifica un , catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikatu et al. 1990. Bio/Technol 8:241-242, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad); un gen de tirosinasa (Katz el al. 1983. J" Gen Microbiol 129:2703-2714, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) que codifica una enzima apta de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez condensa a melanina; proteína fluorescente verde (Elliot et al. 1999. Plant Cell Rep 18:707-714, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) y una a-galactosidasa . Como es bien conocido en el arte, otros métodos para transformación de plantas pueden ser utilizados, por ejemplo como se describe por Miki et al. (1993. En: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y Thompson (eds.), CRC Press, Inc.: Boca Ratón, pp. 67-88, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) , incluyendo el uso de bombardeo de microproyectiles (por ejemplo, patente estadounidense No. 5,914,451; McCabe et al. 1991. Bio/Technology 11:596-598; patente estadounidense No. 5,015,580; patente estadounidense No. 5,550,318; y patente estadounidense No. 5,538,880; cada una de las anteriores es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) .

Las plantas transgénicas pueden ser regeneradas de una célula de planta transformada mediante métodos y composiciones conocidos en el arte. Por ejemplo, una planta transgénica formada utilizando métodos de transformación de Agrobacterium contiene comúnmente una sola secuencia de ADN recombinante simple insertada a un cromosoma y es denominado como un evento transgénico. Tales plantas transgénicas pueden ser denominadas en la presente como heterócigas para la secuencia exógena insertada. Una planta transgénica homóciga con respecto a un transgen puede ser obtenida al aparear sexualmente (auto-reproducción) una planta transgénica segregante independiente que contiene una sola secuencia de gen exógena para sí misma, por ejemplo una planta de R0, para producir semilla de Ri. Un cuarto de la semilla de Ri producido será homócigo con respecto al transgen. La germinación de la semilla de Ri resulta en plantas que pueden ser probadas en cuanto a cigosidad, comúnmente utilizando un análisis de SNP o un análisis de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotos y homocigotos (esto es, un análisis de zigosidad) . Alternativamente, la progenie de R2 puede ser desarrollada y probada de varias plantas Ri, en donde una progenie de R2 homogénea, con todos los individuos resistentes es indicadora de un padre Ri homócigo.

Para confirmar la presencia del ADN exógeno o "transgen (es ) " en las plantas transgénicas , se pueden efectuar una variedad de análisis. Tales análisis incluyen, por ejemplo análisis de "biología molecular", tales como Southern y northern blotting y análisis de PCR, INVADER™; análisis "bioquímicos", tales como detectar la presencia de un producto de proteína, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISA y Western blot) o mediante función enzimática; análisis de partes de plantas, tales como análisis de hojas o raíces y también al analizar el fenotipo de la planta regenerada entera.

Una vez que una mutación ha sido seleccionada y confirmada en una planta, o una vez un transgen ha sido introducido a una planta, aquella mutación o transgen puede ser introducido a cualquier planta que es sexualmente compatible con a primera planta al cruzar, sin la necesidad de seleccionar directamente mutantes en, o transformar la segunda planta. Por consiguiente, como se usa en la presente, el término "progenie" puede definir la descendencia o progenie de cualquier generación descendiente de una planta padre preparada de acuerdo con la presente invención, en donde la progenie comprende un genotipo o fenotipo deseado, ya sea transgénico o no transgénico. Una "planta transgénica" , dependiendo del uso convencional y/o definiciones reguladoras, pueden así ser de cualquier generación. El "cruce" de una planta para proveer una línea de planta que tiene una o más mutaciones, fenotipos seleccionados y/o transgenes o alelos agregados en relación con una línea de planta de partida puede dar como resultado que una secuencia particular sea introducida a una línea de planta al cruzar una línea de planta de partida o base con una línea de planta donadora que comprende un alelo mutante, un transgen o los semejantes. Para obtener esto, se pueden por ejemplo efectuar las siguientes etapas: (a) semillas de planta de la primera planta padre (línea de partida) y segunda planta padre (línea de planta donadora que comprende un transgen o alelo deseado) ; (b) cultivar las semillas de las primeras y segundas plantas padres en plantas que llevan flores.; (c) polinizar una flor de la primera planta padre con polen de la segunda planta padre; y (d) cosechar semillas producidas en la planta padre que lleva la flor fertilizada.

Métodos para controlar céspedes cubiertos de malas hierbas indeseables y cultivar selectivamente plantas resistentes a herbicidas La exclusión de céspedes con hierbas malas indeseables se pueden llevar a cabo al tratar el área en la cual se desea el crecimiento de especies de plantas resistentes con herbicidas a los cuales se ha establecido resistencia. Así, las modalidades de la invención también son concernientes con métodos para controlar hierbas malas o malezas en la vecindad de una planta resistente a herbicida identificada por los métodos revelados en la presente, que incluyen: poner en contacto por lo menos un herbicida con las malezas y con - la planta resistente a herbicida, en donde el por lo menos un herbicida es puesto en contacto con las malezas y con la planta a una velocidad suficiente para inhibir el crecimiento o provocar la muerte de una planta no seleccionada de la misma especie y/o de una especie de maleza que se desea suprimir. La planta no seleccionada comúnmente no es · resistente al herbicida.

En algunas modalidades, él herbicida se .puede poner en contacto directamente con la planta resistente a herbicida y con las malezas. Por ejemplo, el herbicida puede ser aplicado directamente sobre la planta resistente a herbicida y las malezas. Alternativamente, el herbicida puede ser atomizado directamente sobre la planta resistente a herbicida y las malezas . Otros medios mediante los cuales el herbicida puede ser aplicado a la planta resistente a herbicida y malezas incluyen pero no están limitados a, empolvar o atomizar un área o lote de tierra que contiene la planta resistente a herbicida y las malezas.

En algunas modalidades, el herbicida sé puede poner en contacto o ser agregado a un medio de cultivo en el cual la planta resistente a herbicida y las malezas están ubicados. El medio de cultivo puede ser, pero no está limitado a suelo, turba, suciedad, lodo o arena. En otras modalidades, el herbicida puede estar incluido en agua con la cual las plantas son irrigadas .

Comúnmente, las cantidades de herbicida suficientes para provocar el crecimiento o > muerte de la planta no resistente o no seleccionada fluctúa de aproximadamente 2 µ o menos a aproximadamente 100 µ? o más de concentración de herbicida. En algunas modalidades, una cantidad suficiente de herbicida fluctúa de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? de concentración de herbicida, de aproximadamente 8 µ? a aproximadamente 30 µ? de concentración de herbicida, o de aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 25 µ? de concentración de herbicida. Alternativamente, las cantidades de herbicida suficientes para provocar el crecimiento o muerte de una planta no resistente fluctúan de aproximadamente 25 gramos de ingrediente activo por hectárea (g de ingrediente activo ha"1) a aproximadamente 6500 g de ingrediente activo ha-1 de aplicación de herbicida. En algunas modalidades, una cantidad suficiente de herbicida fluctúa de aproximadamente 50 g de ingrediente activo ha-1 a aproximadamente 5000 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida, aproximadamente 75 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 2500 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida, aproximadamente 100 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 1500 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida, o aproximadamente 250 g de ingrediente activo ha"1 a aproximadamente 1000 g de ingrediente activo ha"1 de aplicación de herbicida.

Métodos de selección auxiliados por marcador La selección auxiliada por marcador (MAS) , también conocido como cruce molecular o cruza auxiliada por marcador (MAB) , se refiere al proceso de seleccionar un rasgo deseado o rasgos deseados en una planta o plantas al detectar uno o más marcadores en la planta, en donde el marcador está en enlace con el rasgo deseado. En algunas modalidades, el marcador usado para MAS es un marcador molecular. En otras modalidades, es un marcador fenotípico, como se discute anteriormente.

En programas de cría o cruza molecular, se pueden usar alelos marcadores genéticos para identificar plantas que contienen un fenotipo deseado en uno o más sitios de marcación, varios sitios o un haplotipo, y que por consiguiente se esperaría que transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado, a su progenie. Los marcadores útiles en la cría de plantas debido a que, una vez establecidos, no son sometidos a interacciones medio ambientales o epistáticas. Además, ciertos tipos de marcadores son apropiados para la detección de altó rendimiento, permitiendo una identificación rápida de manera efectiva en el costo.

Debido a diferencias alélicas en marcadores moleculares, los sitios de rasgos cuantitativos (QTL) pueden ser identificados mediante evaluación estadística de los genotipos y fenotipos de poblaciones segregantes. Procesos para mapear QTL son bien conocidos en el arte y son descritos en, por ejemplo, WO 90/04651; patente estadounidense No. 5,492,547, patente estadounidense No. 5,981,832, patente estadounidense No. 6,455,758; Flint-Garcia et al. 2003 Ann. Rev. Plant Biol . 54:357-374, cada una de las cuales es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Utilizar marcadores para inferir fenotipo en estos casos da como resultado en la economización de un programa de cría mediante sustitución de fenotipado costoso, que consume mucho tiempo con el genotipado. Los procedimientos de marcador permiten que la selección ocurra antes de que la planta llegue a la madurez, ahorrando así tiempo y conduciendo al uso eficiente de los lotes . La selección puede también ocurrir al nivel de semilla, de tal manera que las semillas preferidas son plantadas (publicación de patente estadounidense No. 2005/000213435 y publicación de patente estadounidense No. 2007/000680611, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Además, los programas de cría pueden estar diseñados para impulsar explícitamente la frecuencia de fenotipos específicos, favorables mediante apuntamiento de genotipos particulares (patente estadounidense No; 6,399,855, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . La fidelidad de estas asociaciones puede ser monitoreada continuamente para asegurar la habilidad predictiva mantenida y así decisiones de cruza informadas (solicitud de patente estadounidense 2005/0015827, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) .

Así, las modalidades de la invención son concernientes con métodos de cruza auxiliados por marcador, que incluyen identificar un elemento de interés para la cruza y selección, en donde el elemento está en enlace con un gen de ACCasa, proveer una primera planta que porta una variante de secuencia de ACCasa apta de conferir la resistencia a la planta a un herbicida innibidor de ACCas , en donde la planta comprende además el elemento de interés, cultivar la primera planta con una segunda planta, identificar la progenie de la etapa de cruce por tener la variante de secuencia de ACCasa, y seleccionar progenie probable de tener elemento de interés en , base a la etapa de identificación. El elemento de interés puede ser cualquiera de uno o más seleccionados del grupo de: tolerancia a herbicida, resistencia a enfermedad, resistencia a insectos de peste, ácido graso alterado, metabolismo de proteína o carbohidrato, velocidades de crecimiento incrementado, tolerancia a esfuerzos mejorada, madurez ' preferida, propiedades organolépticas mejoradas, características morfológicas alteradas, esterilidad, otros rasgos agronómicos, rasgos para usos industriales, o rasgos para atractivo al consumidor mejorado.

En algunas modalidades; se pueden utilizar análisis a base de ácido nucleico en cuanto a la presencia o ausencia del polimorfismo genético para la selección de semillas o plantas en una población de cruce. El análisis puede ser usado para seleccionar genes, QTL, alelos o regiones genómicas (haplotipos) que comprenden o están enlazados a un marcador genético. Por ejemplo, el marcador puede ser la variante de secuencia de ACCasa que incluye una variación correspondiente a por lo menos una posición de aminoácido en la proteína de ACCasa seleccionada del grupo de: Gln 1756, lie 1781, Trp 1999, Trp 2027, lie 2041, Asp 2078, Cys 2088 y Gly 2096. En algunas modalidades, la variación puede ser por lo menos una seleccionada del grupo de: Gln 1756Glu, Ilel78lLeu, Ilel78lAla, lie 178lVal, Trpl999Cys, Trp2027Cys, Ile204lAsp, Ie204lVal, Asp2078Gly, Asp2078Val, Cys2088Arg y Gly2096Ala. Los métodos de análisis de ácido nucleico son conocidos en el arte e incluyen, pero no están limitados a, métodos de detección a base de PCR (por ejemplo, análisis de TaqMan) , métodos de microarreglo, y métodos de secuenciación de ácido nucleico . En algunas modalidades, la detección de sitios polimórficos en una muestra de ADN, ARN o cADN puede ser facilitada por medio del uso de métodos de amplificación de ácido nucleico. Tales métodos incrementan específicamente la concentración de polinucleótidos que abarcan el sitio polimórfico o incluyen aquel sitio y secuencias ubicadas ya sea distantes o próximos al mismo. Tales moléculas amplificadas pueden ser detectadas fácilmente mediante electroforesis de gel, métodos de detección de fluorescencia u otros medios. Así, análisis de amplificación, los oligonucleótidos usados en tales análisis y los productos de ácido nucleico correspondientes producidos por tales análisis pueden también ser usados en un programa de cruce o cría auxiliada por marcador para seleccionar la progenie que tiene el rasgo o rasgos deseados mediante cría selectiva.

Asimismo, el MAS basado en resistencia a herbicidas inhibidores de ACCasa se puede hacer en una base puramente fenotípica. Inicialmente, las plantas son criadas y seleccionadas o diseñadas, de tal manera que un rasgo de interés está en asociación (enlace) no aleatorio con un alelo que confiere resistencia a inhibidor de ACCasa. Luego, aquella planta puede ser cruzada con una planta que tiene otro(s) rasgo(s) deseable(s). Las plantas que muestran resistencia a inhibidores de ACCasa supuestamente también portarán el rasgo que está enlazado al marcador de resistencia. La suposición será más fuerte a medida que el enlace es más cercano/más alto. Asi, un alelo de resistencia a inhibidor de ACCasa puede servir ya sea como un marcador fenot pico para MAS, para producir plantas que, por ejemplo, sobreviven a una dosis de otra manera mortal de un inhibidor de ACCasa, o como marcador molecular debido a la facilidad de detección de la variante de secuencia asociada con el alelo de resistencia. Por ejemplo, la resistencia a herbicida que está asociada con una variante de secuencia de ACCasa puede ser analizada. El rasgo de resistencia a herbicida puede incluir resistencia a cualquiera de uno o más herbicidas seleccionados del grupo de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, métamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden. La selección mediante aplicación de un herbicida inhibidor de ACCasa y observación de resistencia al herbicida puede ser evaluada como se describe en la presente.

Los protocolos de MAS son bien conocidos en el arte, y emplean varios marcadores como herramientas. Por ejemplo, MAS es descrita en la patente estadounidense No. 5,437,697, publicación de patente estadounidense No. 2005/000204780, publicación de patente estadounidense No. 2005/000216545, publicación de patente estadounidense No. 2005/000218305, publicación de patente estadounidense no. 2006000504538, patente estadounidense No. 6,100,030 y en Mackill (2008. Phil Trans R Soc B 363:557-572), cada una de las anteriores que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Así, la persona de habilidad en el arte puede usar el fenotipo de resistencia o secuencia de la invención como herramienta en un protocolo de MAS para seleccionar rasgos que están enlazados a un alelo de resistencia de inhibidor de ACCasa.

Habiendo descrito la invención en detalle, será evidente que modificaciones, variaciones y modalidades equivalentes son posibles sin desviarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, se debe apreciar que todos los ejemplos en la presente revelación son provistos como ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes son provistos para ilustrar adicionalmente modalidades de la invención reveladas en la presente. Se debe apreciar por aquellos de habilidad en el arte que las técnicas reveladas en los ejemplos que siguen representan procedimientos que se ha encontrado que funcionan bien en la práctica de modalidades de la invención, y así se puede considerar que constituyen ejemplos de modos para su práctica. Sin embargo, aquellos de habilidad en el arte deben apreciar, a la luz de la presente revelación, que se pueden efectuar muchos cambios en las modalidades específicas que son reveladas- y todavía obtener un resultado semejante o similar sin desviarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 PRODUCCIÓN DE CALLO OBTENIDA DE MERISTEMO INTERCALADO DE UNA PLANTA Una selección de explante ejemplar es ilustrada en la Figura 18. El tejido de explante puede ser obtenido de un brote que contiene las tres hojas superiores. El brote es cortado debajo del nodo de hoja más bajo y la copa o parte superior de cada hoja puede ser recortada para conservar espacios durante el procedimiento de esterilización. Las secciones son colocadas en una solución de blanqueo (20% volumen/volumen) , por aproximadamente 10 minutos, seguido por 10 minutos en etanol al 70% antes de ser enjuagada con agua estéril. Las dos hojas externas (más viejas) son removidas, dejando la hoja más nueva sobre el tallo restante. La nueva hoja es esterilizada en blanqueador al 20% por 1 minuto, etanol al 70% por 1 minuto, y subsecuentemente enjuagada en agua estéril. La base de . la hoja ¦ próxima al nodo, es el meristemo intercalado. Los 5 milímetros inferiores de esta sección son removidos y depositados sobre medio de inducción de callo que contiene sales básales de MS (Murashige y Skoog. 1962. Physiol Plant 15:473-497, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) complementadas con vitaminas B5 (Gamborg et al. 1968. Exp Cell Res 50: 151-158, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad), ácido 2 , -ciclorofenoxiacético ("2,4-D"), sacarosa y ajustada a un pH de 8.5. Los explantes depositados son colocados en la oscuridad a una temperatura de 27°C.

Tabla 1. Medio de inducción de callo EJEMPLO 2 PRODUCCIÓN DE CALLO OBTENIDO DE INFLUORESCENCIAS INMADURAS DE PASPALUM Influorescencias inmaduras fueron cosechadas de plantas cultivadas en invernadero antes del brote y usadas como fuente de tejido de explante para generación de callos. Las dos espiguillas fueron separadas y esterilizadas en la superficie con blanqueador al 10% (volumen/volumen) con varias gotas de Tween 80 por 10 minutos y enjuagadas con agua estéril antes de la deposición sobre el medio de MS con vitaminas B5 (Murashige y Skoog. 1962. supra; Gamborg et al. 1968. supra) y 2 mg/litro de 2,4-D. El tejido de explante de 10 genotipos fue obtenido, incluyendo ocho líneas experimentales de la Universidad de Georgia, Programa de Cruce de Paspalum de Costa, un ecotipo recolectado (Mauna Kea (Pl 647892)), y la variedad sembrada comercial "Seaspray". Cuatro explantes fueron colocados sobre cada placa, y las placas fueron selladas con NescofilnP1 (Karlan Research Products Co; Cottonwood, AZ) . Los explantes fueron colocados en la oscuridad a 27 °C. Un total de 21 líneas celulares fueron generadas de estos 10 genotipos (Tabla 2). Se le dio a cada callo generado una designación de línea celular en base al genotipo y la fecha en que el tejido de explante fue colocado sobre el medio de inducción.

Tabla 2. Resumen de generación y selección de callo in vitro para mutaciones que confieren resistencia a sethoxydim en paspalum de costa EJEMPLO 3 CURVA DE DOSIS-RESPUESTA DE PASPALUM A HERBICIDA La respuesta a la dosis de tejido de paspalum en cultivo a la proporción de sethoxydim fue determinada utilizando tejido de callos generado de la variedad "Seaspray" como cultivo modelo. El efecto de la concentración de sethoxydim sobre el crecimiento de callo fue determinado al colocar tejido de callos de "Seaspray" sobre medio MS/B5 (Murashige y Skoog. 1962. supra; Gamborg et al., 1968. supra) que contiene 2 mg/L de 2-4,D y uno de ocho concentraciones de sethoxydim. Las proporciones de herbicida fueron replicadas 6 veces e incluían concentraciones de 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 25, 50, y 100 µ? de sethoxydim. El sethoxydim fue diluido en metanol y agregado después que el medio sometido a autoclave fue enfriado a aproximadamente 55°C (con el fin de impedir la pérdida de actividad de la degradación térmica) . El medio fue protegido de la foto-degradación al envolver los recipientes en hoja de aluminio antes del almacenamiento.

Para medir el crecimiento de callo, 0.5 gramos de tejido de callo fueron pesados, separados en nueve piezas iguales y colocadas en un patrón de 3 x 3 sobre el medio sólido de cada placa. Seis placas replicadas para cada una de las ocho concentraciones de sethoxydim fueron distribuidas en un soporte en una sala de cultivo en un diseño completamente aleatorizado . A 21 días después de la deposición, el tejido de cada placa fue pesado y registrado. Para el subcultivo, 0.5 gramo de cada placa fueron obtenidos para el siguiente período de cultivo. Este proceso fue proseguido por nueve semanas, proporcionando tres mediciones de crecimiento para cada placa. El peso de cada placa en cada punto de medición (3 semanas, 6 semanas y 9 semanas) fue dividido por el peso inicial para obtener el incremento comparativo en masa. El crecimiento de callo por cada proporción de herbicida promediado sobre los tres subcultivos consecutivos fue usado para discernir una concentración apropiada para selección de mutantes . El crecimiento de callo en respuesta a la concentración de sethoxydim fue ajustado a una función de decaimiento exponencial negativa utilizando regresión no lineal (SAS Institute, Inc. 2008. SAS OnlineDoc® 9.2. Cary, NC) . La proporción de herbicida más baja para inhibir totalmente el crecimiento dé callo fue de sethoxydim 7.5 µ?. Para seguridad de eficacia, se escogió una concentración de sethoxydim 10 µ? para selección de células resistentes (Figura 3).

EJEMPLO 4 SELECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM La selección de células resistentes a sethoxydim (SR) fue efectuada al colocar aproximadamente tejido de callo de seis meses de edad sobre un medio de inducción de callo (Ejemplo 1) que contiene sethoxydim 10 µ?. Se usaron placas grandes (de 245 x 245 mm de tamaño) para seleccionar eficientemente números mayores de células. El tejido de callo de aproximadamente 4 mm de diámetro fue colocado en una rejilla de 15 x 15, dando un total de 225 callos por placa. Los callos fueron subcultivados tres veces a intervalos de tres semanas (Ejemplo 3) para un período de selección total de nueve semanas. Los callos resistentes fueron subcultivados en cajas de Petri de 100 x 15 mm que contienen medio de inducción de callo (Ejemplo 1) complementado con sethoxydim 10 µ? por un. mes con él fin de obtener callos suficientes. Esto proporcionó un tiempo de selección total de 12 semanas o más .

Un total de 20,250 callos fueron seleccionados. El proceso de selección dio como resultado 65 lineas resistentes a sethoxydim (SR) , que representan una proporción de mutación de un evento de resistencia por 312 callos. Las seis líneas celulares que produjeron callos SR fueron: Mauna Kea,, GA 05-025-164, UGA03.539.13, UGA05.025.181 , UGA03.525.22 y UGA03.09E-3. La frecuencia de callos de SR fue baja en todos los genotipos y fluctuó de 0 a 0.0051. Aunque la probabilidad' de recuperar una línea de SR fue baja para todos los genotipos, el número de líneas de SR recuperadas variaron y fluctuó a tan alta como nueve por placa de 225 callos. El análisis estadístico en cuanto a diferencias en la probabilidad de obtener un evento de callos resistentes no indicó ninguna diferencia significativa (p=0.35) entre genotipos. Se le dio a los callos resistentes designaciones de SR, fueron removidos del medio de selección y subcultivados para incrementar el tejido antes de la regeneración.

EJEMPLO 5 REGENERACIÓN DE LÍNEAS RESISTENTES A SETHOXYDIM Se intentó la regeneración en todos los callos resistentes. El medio de regeneración usado fue el medio de MS/B5 (Murashige y Skoog. 1962. supra; Gam org et al 1968. supra) complementado con 1.24 mg/L de CuS04, y 1.125 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP) (Altpeter, et al. 2005. International Turfgrass Society Research Journal 10:485-489, que es incorporada en la presente por referencia) . Los callos de cada línea resistente a sethoxydim (SR) fueron colocados en una rejilla de 4 X 4. sobre cinco placas, cada callo tiene un diámetro aproximado de 4 mm de tamaño. Las placas fueron luego depositadas en una cámara de cultivo a 25°C con un fotoperíodo de 1 hora de oscuridad: 23-h de luz, en donde la intensidad de luz fue provista a 66-95 µp???ße de fotones nf2 s"1 mediante tubos fluorescentes blancos fríos . Todas las placas fueron evaluadas en cuanto a regeneración al final de un período de 30 días. Si aparecían .brotes, las líneas celulares fueron subcultivadas para un mes adicional sobre el medio de regeneración.

Después del desarrollo del brote, las raíces fueron inducidas al colocar el tejido sobre el medio de MSO (como se enlista en la Tabla 3 a continuación) sin reguladores del crecimiento. Cuando el crecimiento de raíz fue apropiado (aproximadamente 30 días) , las plantas fueron removidas del medio y colocadas directamente en macetas que contienen una mezcla 1:1 de Fafard® 3B (Agawam, MS) mezcla y arena. Las plantas en maceta fueron luego transferidas a un invernadero con fotoperíodos de 10 horas de luz, 14 horas de oscuridad a una temperatura de 24 °C a 32 °C .

Tabla 3. Medio de MSO para inducción de raíz Dos de las 65 líneas celulares de SR se perdieron antes de la regeneración, así, de las 63 líneas de SR restantes, tres líneas fueron regeneradas: Línea A, Línea B y Línea C. Las Líneas A y B se originaron de la misma línea celular derivada de Mauna Kea iniciada el 12 de enero de 2008 , mientras que la Línea C se originó de la línea experimental UGA 03 - 098E-3 iniciada el 4 de marzo de 2008 . El tejido de callos de las tres líneas que se generó fue denso y amarillo en comparación con la mayoría de las líneas, que fueron blancos y blandos .

EJEMPLO 6 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LÍNEAS RESISTENTES A SETHOXYDIM Una vez que las líneas de paspalum de SR fueron seleccionadas, se caracterizó la mutación que provoca la resistencia. El ADN fue extraído del callo o tejido de hoja de plantas regeneradas utilizando el método de CTAB (Lassner et al 1989. Plant Mol Biol Report 7: 116-128, que es incorporado en la presente por referencia) . Secuencias de aminoácido de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) (Delye, et al. 2005. Weed Research 45:323-330, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) fueron usadas para determinar regiones homologas entre especies. La secuencia de nucleótidos de Setaria viridis ACCasa (GenBank AF294805) (Delye, el al. 2002, Plant 214:421-427, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) fue usada para diseñar cebadores que amplifican la región homologa en paspalum de costa, y las bases individuales fueron cambiadas para coincidir con el número más alto de especie de césped posible como se determina por la función BLAST de GenBank. Los cebadores resultantes amplifican un fragmento de 384 pares de bases del gen de ACCasa que abarca la transversión de A a T que provoca la sustitución de lie a Leu en posición 1781. Los cebadores fueron designados SV384F (5' CGGGGTTCAGTACATTTAT 3', SEQ ID NO: 1) y SV348R (5' GATCTTAGGACCACCCAACTG 3 ' , SEQ ID NO : 2) . La temperatura de recocido fue de 53 °C con un tiempo de extensión de 30 segundos y 35 ciclos . Los cebadores desarrollados para secuenciación de la posición 2078 del gen de ACCasa fueron designados SVAC2F (5' AATTCCTGTTGGTGTCATAGCTGTGGAG 3', SEQ ID NO : 3) y SVAClR (5' TTCAGATTTATCAACTCTGGGTCAAGCC 3 ' , SEQ ID NO : 4 ) , y las condiciones de PCR utilizada para amplificar este segmento fueron las mismas como las condiciones usadas para amplificar 1781. Los cebadores de SVAC amplifican un fragmento de 520 pares de bases que abarca la región de codificación de la posición 2078 en el gen de ACCasa.

EJEMPLO 7 IDENTIFICACIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM Y REGENERACIÓN DE PASPALUM RESISTENTE A SETHOXYDI DE LÍNEAS CELULARES La Tabla 2 resume el proceso de selección a la fecha.

A la fecha, 65 líneas celulares resistentes a sethoxydim han sido producidas. La frecuencia de formación de callos resistentes fue de 1 por 312 callos que sufren el proceso de selección pleno. La frecuencia de callos resistentes a sethoxydim regenerables (SR) fue de 1 por 32.5 callos resistentes . La frecuencia de líneas de SR que se regeneraron fue de 1 por 10,125 callos puestos a través del proceso de selección.

El volumen promedio de una sola célula de callo fue medida para ser de 1.3582 xlO"5 L. Esto provee una aproximación de 258,000 células por pieza de callo de 4 milímetros de diámetro. Así, los 20,250 callos puestos por medio de selección contenían aproximadamente 5.2 billones de células . Suponiendo que solamente una sola célula mutante fue responsable por cada línea de célula de SR, la frecuencia de células resistentes en este experimento fue de una por 8xl07 células. La frecuencia de obtener la mutación A a T en posición 1781 fue una en el 1.74xl09.

A la fecha, cuatro callos de SR, Línea A, Línea B, Línea C y Línea D han producido plántulas verdes , y dos callos de SR (Línea A y Línea B) han sido establecidos como plantas viables. Las Líneas A, B y D se originaron de la misma línea celular, Mauna Kea 12JA 08, mientras que la Línea C se originó de la línea experimental UGA 03-098E-3 iniciada . el 4 de marzo de 2008. La Línea A ha sido la más prolífica en términos de plantas regeneradas, produciendo más de 500 plantas individuales. La Línea B ha producido aproximadamente 20 plantas, i Amplicones de ACCasa fueron obtenidos de 63 de las 65 líneas de SR, y solamente tres líneas, incluyendo la Línea A (Figura 5), exhibieron una transversión de A a T en posición 1781. Existe la posibilidad de que mutaciones en posiciones diferentes a 1781 ó 2078 también ocurrieran en estas líneas celulares de SR. Las líneas resistentes son heterócigas para la mutación, de tal manera que los cromatogramas de secuencias ilustran un doble máximo en el punto de mutación, un máximo representa el alelo tipo silvestre y el otro el alelo mutado. De las dos líneas que produjeron plantas viables, solamente la Línea A posee la mutación de lie a Leu esperada. La secuencia genética del amplicón obtenido para la Línea A es dada a continuación como SEQ ID NO: 5 , con el codón destacado y subrayado que indica la mutación de lie a Leu. La Línea B tiene la secuencia tipo silvestre en posición 1781 . Puesto que la resistencia a sethoxydim puede también ser conferida mediante una mutación de Asp a Gly en- posición 2078 ; el ADN de la Línea B fue analizado en cuanto a la presencia de esta mutación, pero ninguna línea lo poseía. La naturaleza de la resistencia á sethoxydim sigue estando sin determinar para la Línea B.

Más que 500 plantas de Línea A han sido trasplantadas al suelo . Las plantas regeneradas de la Línea A fueron incrementadas vegetativamente para sufrir pruebas de herbicida con el fin de confirmar la expresión de resistencia a sethoxydim a nivel de planta entera.

SEQ ID NO: 5 3CGATTGGGCCGAAGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGA TACCCCrrTTTCAGTACATTTATCTGACTGAAGAAGA TATGCrCG'rAlTAGCIUl X: TG'RI ATAGCACA'RAAGCTACAGCLXKJACAGCGGTGAAATTAGGTGGATTAT GACT CTGTTGTGGGCAAGGAGGA GGGCRRGGTGTTGAGAATTTACA GGAAGTGCTGCT ATTGCCAGTGCTTATTCTAGGGCATACGAGGAGACATTTACACTTACGTTCGTGACT GGGCGGAC GTAGGAATAGGACK TT/\TCTTGCACGACTTGGTATACGGTGCATACA GCGTCTRGACCAGCCCATTATTTTAACAGGGTTTTCTGCCCTGAACAAGCTTCT GG GCGTGAAGTTTACAGCTCCCACATGCAGTTGGGTGGTCCTAAGATCATGGCGACGA ATGGTGTTGTCCACCTCACTGTTTCAGATGATCTTGAAGGTGTATCCAGTATATTGA GGTGGCTCAGCTATGTTCCTGCCAACATTGGTGGACCTCTTCCTATTACAAAACCTT TGGACCCACCGGACAGACCTGTTGCGTACATCCCTGAGAACACATGCGATCCACGT GCAGCCATCCGTGGTGTAGATGACAGCCAAGGGCAATGGTTGGGTGGTATGTTTGA CAAAGACAGCTTTGTGGAGACATTTGAAGGATGGGCGAAAACAGRRG'RCACTGGCA GGGCATAGCTTGGAGGAATTCCTGTGGGTGTCATAGCTGTGGAGACACAGAACATG ATGCAGCTCATCCCTGCTGA CCAGGCCAGCTTGAITCTCATGAGCGATCTGTTCCT CGGGCTGAACAAGTGTGGTTCCCAGATTCTGCAACGAAGACTGCTCAAGCATTGTT GGACTRCAACCGTGAAGGATTGCCTCTGTOAT NGCTAACTGGAGAGGTTTCTC TGGTGGACAAAGAGATCTCTTTGAAGGAARRCTTCAGGCTGGGTCAACAATTGTTG AGAACCTTAGGACGTACAATCAACGTGCGTRRGTCTACATTCCTATGGCTGGAGAGC TGCGTGGAGGAGCTTGGGTTGTGGTTGATAGCAAAATAA Un vector que contiene SEQ ID NO: 5 fue depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201· 10-2209 Estados Unidos de América, el junio de 2009 y el Número de Acceso asignado EJEMPLO 8 EVALUACIÓN DE RESISTENCIA DE PLANTA ENTERA A SETHOXYDIM (HERBICIDA SEGMENT™) Plantas resistentes a sethoxydim regeneradas de una línea celular resistente a sethoxydim, Línea A, fueron probadas en cuanto a resistencia a nivel de planta entera en un experimento de dosis-respuesta llevado a cabo en un invernadero. En este experimento, la Línea A fue comparada con dos testigos susceptibles a herbicida; la línea padre original, Mauna Kea (PT) ; y una línea de Mauna Kea regenerada de cultivo de tejido (TTC) . Las plantas fueron trasplantadas a Cone-tainers™ que miden 4X14 cm y se ensanchan a 1 cm (Stuewe and Sons Inc., Corvallis, Oregon) que contiene una mezcla de 1:1 de mezcla Fafard® 3B y arena y colocado sobre bancos sobre luces de sodio en un invernadero con un fotoperíodo de 16 horas mantenidas a 27/32°C día/noche por dos semanas antes de las aplicaciones de tratamiento. Cada uno de los tres genotipos, Línea A, PT y TC fueron tratados con 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 y 3200 g de ingrediente activo ha-1 proporciones de sethoxydim utilizando el herbicida de Segment™ (BASF Corp. , Florham Park, NJ) . Todas las proporciones de herbicida fueron aplicadas a un volumen de atomización de 1871 ha"1 en una cámara de atomización experimental, y después de secado, regresaron al banco de invernadero y mantenidas bajo las condiciones descritas anteriormente. Valores estimativos visuales de lesión de cosecha fueron registrados a 7, 14, 21 y 28 días después de tratamiento (DAT) utilizando una escala de 0 a 100, en donde 0 es igual a ninguna lesión y 100 es igual a muerte completa. A los 42 días después de tratamiento, la porción por encima del suelo de todas las plantas fue cosechada, secada por 48 horas a una temperatura de 50°C, y pesada para determinar el peso seco de planta. Los tratamientos fueron arreglados en un diseño de bloque completo aleatorizado . Solamente dos réplicas de TCC fueron posibles debido a materiales de planta limitados; de otra manera se usaron cuatro réplicas para los otros dos genotipos (PT y Línea A) . Los datos fueron primero analizados utilizando un análisis bidireccional de varianza y analizados subsecuentemente dentro de la proporción de herbicida. Diferencias entre medias de genotipo a cada proporción de herbicida fueron determinadas utilizando Diferencia Significativa Mínima de Fisher (LSD) .

La Figura 9 ilustra el efecto de proporción de sethoxydim sobre clasificaciones de lesión de cada uno de los tres genotipos probados a 14 DAT. La Figura 11 ilustra el efecto de la proporción de sethoxydim sobre clasificaciones de lesión de cada uno de los tres genotipos probados a 21 DAT. El análisis bidireccional de varianza indicó genotipo significativo, proporción de herbicida y efectos de genotipo por herbicida para clasificaciones de lesión a 7, 14, 21, y 28 días después del tratamiento (datos no mostrados) . La Línea A mostró una resistencia a herbicida excelente, aún a la proporción más alta de 3200 g de ingrediente activo ha-1 (Figura 8, Tabla 4). En contraste, tanto PT como TC tuvieron puntuaciones de lesiones de 30 o mayor a proporciones de 200 g de ingrediente activo ha"1, y puntuaciones de lesión de 80% o mayor a proporciones iguales o mayores de 800 g de ingrediente activo ha"1. Cuando las puntuaciones de lesión promedio fueron comparadas para cada uno de los tres genotipos a cada proporción de herbicida, la Línea A tuvo significativamente menos lesión que PT o TC a todas las proporciones por encima de 100 g de ingrediente activo ha"1 a todas las fechas de clasificación. La puntuación de lesión máxima observada en la Línea A fue de 7.5% a 3200 g de ingrediente activo ha"1 o una dosificación 15 veces mayor que la proporción marcada más baja para césped centípede, Eremochloa ophiuroides (Munro) , una especie de hierba para césped naturalmente tolerante a sethoxydim.

El peso seco promedio de los tres genotipos tomados 42 DAT son presentados en la Figura 12. Los pesos secos de las dos líneas susceptibles, PT y TCC disminuyeron en respuesta a la proporción de sethoxydim incrementada en tanto que el peso seco de CLA permaneció relativamente sin cambio aún a proporciones mayores de 1600 g de ingrediente activo ha"1.

Valores estimativos de LD50 para los tres genotipos fueron de 189, 276 y >3200 g de ingrediente activo ha"1 para PT, TC y Línea A, respectivamente. Estos datos proveen evidencia de que el nivel de resistencia a herbicida presente en la Línea A es más que apropiado para proveer control efectivo de céspedes con hierbas malas susceptibles con preocupaciones acerca de la lesión por herbicida.

Tabla 4. Respuesta de tres genotipos de paspalum de costa proporción de sethoxydim. 1. Gramos de ingrediente activo ha 2. DAT = días después de tratamiento 3. Medias en la misma hilera (proporción de herbicida) y dentro de un grupo variable medido (esto es 7 DAT) seguidos por la misma letra no son considerados ser significativamente diferente a 0.05 de acuerdo con un LSD protegido.

EJEMPLO 9 EVALUACIÓN DE RESISTENCIA DE PLANTA ENTERA A SETHOXYDIM (HERBICIDA POAST™) Un segundo experimento de invernadero fue iniciado para . plantas de SR regeneradas de una segunda línea celular resistente a sethoxydim, Línea B, para resistencia a sethoxydim a nivel de planta entera. En el experimento previo (Ejemplo 8) , lesiones menores se presentaron en la Línea A a concentraciones más altas del herbicida sethoxydim Segment™. Estos síntomas de lesión fueron más indicadores de lesión por surfactante en lugar de lesión por sethoxydim. Así, el herbicida de Poast™, una formulación de sethoxydim que no contiene surfactante, fue escogido para caracterizar el nivel de resistencia a la Línea B y comparar el nivel de resistencia a sethoxydim de la Línea B a la Línea A. En este experimento, ambas Línea A y Línea B fueron comparadas con dos testigos susceptibles a herbicida: la línea parental original, Mauna Kea (PT) ; y una línea de Mauna Kea regenerada de cultivo de tejido (TTC) . Las plantas fueron trasplantadas a Cone-tainers™ que miden 4 x 14 cm y que se ensanchan a 1 cm (Stuewe and Sons Inc., Corvallis, Oregon) que contienen una mezcla 1:1 de mezcla 3B de Fafard® y arena colocada sobre bancos bajo luces de sodio en un invernadero con un fotoperíodo de 16 horas mantenidas a 27/32°C día/noche por aproximadamente dos semanas antes de la aplicación de tratamientos de herbicida.

Cada uno de los cuatro genotipos (Línea A, Línea B, PT y TCC) fueron tratados con 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 y 6400 g de ingrediente activo ha-1 proporciones de sethoxydim utilizando el herbicida de Poast™ (BASF Corp., Florham Park, NJ) . Todas las proporciones de herbicidas fueron aplicadas a un volumen de atomización de 1871 ha"1 en una cámara de atomización experimental, y después de secado, las plantas fueron devueltas al banco de invernadero y mantenidas bajo las condiciones descritas anteriormente. Valores estimativos visuales de lesión de cosecha fueron registradas a 16, 21 y 28 días después de tratamiento (DAT) utilizando una escala de 0 a 100, en donde 0 es igual a ninguna lesión y 100 es igual muerte completa. El experimento fue un factorial cuatro por nueve con cuatro genotipos y nueve proporciones de herbicidas. Los tratamientos fueron dispuestos en un diseño de bloque completo aleatorizado . Cuatro réplicas fueron usadas para todos - los cuatro genotipos. Los datos fueron analizados primero utilizando un análisis de varianza bidireccional (SAS, 2008) y analizados subsecuentemente dentro de la proporción de herbicida. Diferencias entre medias de genotipo a cada proporción de herbicida fueron determinadas utilizando Diferencia de Mínimos Significativos de Fisher (LSD) .

La Figura 13 ilustra el efecto de la proporción de sethoxydim sobre clasificaciones de lesión de cada uno de los cuatro genotipos probados a 21 DAT. El análisis de varianza bidireccional indicó genotipo significativo, proporción de herbicida y efectos de proporción de genotipo por herbicida para clasificaciones de lesión a 16, 21 y 28 DAT (datos no mostrados) . Ambas lineas Linea A y Linea B mostraron resistencia a herbicida excelente, aún a la proporción más alta de 6400 g de ingrediente activo ha"1 (Figura 13) . En contraste, tanto PT como TCC tuvieron puntuaciones de lesión de 27 o mayor a proporciones de 400 g de ingrediente activo ha"1, y puntuaciones de lesión de 80% o mayor a proporciones de 1600 g de ingrediente activo ha"1 o más. Cuando las puntuaciones de lesión promedio fueron comparadas para cada uno de los cuatro genotipos a cada proporción de herbicida, la Línea A y Línea B tuvieron significativamente menos lesión que PT o TCC a todas las proporciones por encima de 200 g de ingrediente activo ha"1 a todas las fechas de clasificación. La puntuación de lesión máxima observada en la Línea A y Línea B fue menor de 20% para todas las proporciones hasta 6400 g de ingrediente activo ha"1.

Valores estimativos de LD50 para los cuatro genotipos fueron 720, 782, >6400, >6400 g de ingrediente activo ha"1 para PT, TC, Línea A y Línea B, respectivamente. Estos datos proveen evidencia fuerte de que el nivel de resistencia a herbicida presente tanto en la Línea A como en la Línea B es más que apropiado para proveer un control efectivo de céspedes con hierbas malas susceptibles sin preocupaciones con respecto a la lesión de herbicida.

EJEMPLO 10 RESISTENCIA CRUZADA DE PASPALUM RESISTENTE A SETHOXYDIM CON OTROS HERBICIDAS INHIBIDORES DE ACCASA Sethoxydim es un miembro de la clase de conocida como herbicidas inhibidores de ACCasa. Esta familia de herbicidas es frecuentemente dividida en dos grupos, las ciclohexandionas (CHD) , caracterizados por un anillo de ciclohexano, y denominadas comúnmente como las "Dims", y los herbicidas de ariloxifenoxipropionato (APP) , denominados comúnmente como los "Fops" . Dependiendo de similaridades estructurales y/o de cadena lateral, la resistencia a sethoxydim puede ser indicadora de resistencia a una amplia clase de herbicidas en la familia inhibidora de ACCasa. Por ejemplo, resistencia cruzada a ambos de los herbicidas de CHD y APP ha sido reportada en varias especies con hierbas malas de plantas que proseen la mutación ILE a LEU 1781 más comúnmente asociada con resistencia a sethoxydim (Delye, 2005. Weed Science 53:728-746, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Así, la resistencia a líneas resistentes a sethoxydim A y B a otros herbicidas inhibidores de ACCasa fue determinada en una serie de experimentos de invernadero.

En los experimentos, tanto la Línea A como la Línea B fueron comparadas con dos testigos susceptibles a herbicida; la línea parental original, Mauna Kea (PT) ; y una línea de auna Kea regenerada de cultivo de tejido (TTC) . Las plantas fueron trasplantadas a Coné-tainers™ que miden 4 x 14 cm y se ensanchan a 1 cm (Stuewe and Sons Inc., Corvallis, Oregon) que 'contiene una mezcla 1:1 de mezcla Fafard® 3B y arena y colocada sobre bancos debajo de luces de sodio en un invernadero con un fotoperíodo de 16 horas mantenido a 27/32°C día/noche por aproximadamente dos semanas antes de la aplicación de tratamientos de herbicida.

Cada uno de los cuatro genotipos, Línea A, Línea B, PT, TCC, fueron comparados en tres experimentos de dosis-respuesta de herbicida separados. Los herbicidas probados incluían fluazifop-p-butilo (Fusilade IT™) y fenoxaprop-p-etilo (Acclaim Extra™) . En cada uno de los experimentos, cuatro réplicas de cada uno de los cuatro genotipos fue tratado con nueve proporciones del herbicida apropiado . Las proporciones de fluazifop de 0, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 y 3200 g de ingrediente activo ha"1 .· proporciones de fluazifop-p-butilo utilizando el herbicida de Fusilade II™ (Syngenta Crop Protection, Inc., Greensboro, NC) . Las proporciones de fenoxaprop fueron de 0, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 y 3200 g de ingrediente activo ha"1 proporciones de fenoxaprop-p-etilo utilizando el herbicida de Acclaim Extra™ (Bayer Environmental Science, Montvale, NJ) . Todas las proporciones de herbicida fueron aplicadas a un volumen de atomización de 187 L ha"1 en una cámara de atomización experimental, y después del secado, las plantas fueron devueltas al banco de invernadero y mantenidas bajo las condiciones descritas anteriormente. Valores estimativos visuales de lesiones de cosecha fueron registrados a 21 y 28 días después del tratamiento (DAT) utilizando una escala de 0 a 100, en donde 0 es igual a ninguna lesión y 100 es igual a muerte completa. El experimento fue un . factorial de cuatro por nueve con cuatro genotipos y nueve proporciones de herbicida. Los tratamientos fueron dispuestos en un diseño de bloque completo aleatorizado . Se usaron cuatro réplicas para todos los cuatro genotipos. Los datos fueron analizados primero utilizando un análisis de varianza bidireccional (SAS, 2008) y analizados subsecuentemente dentro de la proporción de herbicida. Las diferencias entre medias de genotipo a cada proporción de herbicida fueron determinadas utilizando Diferencia Mínima Significativa de Fisher (LSD) .

La Figura 14 ilustra el efecto de a proporción de fluazifop sobre clasificaciones de lesión de cada uno de los cuatro genotipos probado a 21 DAT. El análisis de varianza bidireccional indicó fenotipo significativo, proporción de herbicida y genotipo por efecto de proporción de herbicida para clasificaciones de lesión a 21 y 28 DÁT (datos no mostrados) . Tanto la Línea A como la Línea B mostraron significativamente menos lesión que PT y TCC a todas las proporciones por encima de 50 g de ingrediente activo ha"1. Valores estimativos de LD50 para los cuatro genotipos fueron de 36, 37, 800 y 516 g de ingrediente activo ha"1 para PT, TC, Línea A y Línea B, respectivamente. Estos datos proveen evidencia fuerte de la presencia de una resistencia cruzada a fluazifop tanto en la Línea A como en la Línea B. El nivel de resistencia cruzada presente es apropiado para proveer control efectivo de céspedes con hierbas malas susceptibles sin preocupaciones serias respecto a la lesión por herbicida.

La Figura 15 ilustra el efecto de la proporción de fenoxaprop sobre clasificaciones de lesión de cada uno de los cuatro genotipos probados a 21 DAT. El análisis de varianza bidireccional indicó genotipo significativo, proporción de herbicida y efectos de genotipo por proporción de herbicida para clasificaciones de lesión a 21 y 28 DAT (datos no mostrados) . Tanto la Línea A como la Línea B mostraron significativamente menos lesión que PT y TCC a todas las proporciones por encima de 50 g de ingrediente activo ha-1. En -este experimento, tanto la Línea A como la Línea B expresaron niveles muy altos de resistencia cruzada a fenoxaprop. La Línea A fue lesionada menos de 20% a todas las proporciones de fenoxaprop hasta 1600 g de ingrediente activo ha"1 y la Línea B fue lesionada menos del 20% aún a la proporción más alta de 3200 g de ingrediente activo ha"1. Los valores estimativos de LDso para los cuatro genotipos fueron de 56, 22, >3200 y >3200 g de ingrediente activo ha"1 para PT, TC, Línea A y Línea B, respectivamente. Estos- datos proveen fuerte evidencia de la presencia de resistencia cruzada a fenoxaprop tanto en la Línea A como en la Línea B. El nivel de resistencia cruzada presente es más que apropiado para proveer control efectivo de céspedes con hierbas malas susceptibles sin preocupaciones serias con a la lesión de herbicida.

EJEMPLO 11 SELECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO AGRÓSTIDE O GRAMA Para inducir la formación de callo, semillas de pastp agróstide o grama son esterilizados en la superficie en blanqueador al 10% por cuatro horas en tanto que son agitados vigorosamente. Luego, las semillas esterilizadas son colocadas sobre el medio de inducción de callo como se describe en la Tabla 5 (Luo, el al. 2003 . Plant Cell Reports 22 ( 9 ) : 645 - 652 , que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) .

Tabla 5. Medio de inducción de callo para pasto agrostide Componente Concentración (por litro de medio) Medio MS/B5 (Murashige and Skoog. 1962, supra; Gamborg et al. 1968, supra) Dicamba 6.6 mg Caseína hidrilizada 500 mg Sacarosa 30 g Gelrite® 2 g Una vez que se obtiene el tejido de callo del pasto agrostide o grama, los callos son seleccionados mediante el proceso de selección de sethoxydim como se describe previamente (Ejemplo 4) . Brevemente, se efectúa la selección de células resistentes a sethoxydim (SR) al colocar el tejido de callo sobre el medio de inducción de callo (Tabla 5) que contiene sethoxydim 10 µ?. Se usan placas grandes (de 245 x 245 mm de tamaño) para seleccionar eficientemente números mayores de células. El tejido de callo de aproximadamente 4 mm de diámetro son colocados en una rejilla de 15 x 15, dando un total de 225 callos por placa. Los callos son subcultivados tres veces a intervalos de tres semanas (Ejemplo 3) para un período de selección total de nueve semanas. Los callos resistentes son subcultivados en cajas de Petri de 100 x 15 mm que contienen medio de inducción de callo (Tabla 5) complementado con sethoxydim 10 µ? por un mes · con el fin de obtener callos suficientes. Esto proporcionó un tiempo de selección total de 12, semanas o más.

EJEMPLO 12 REGENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM EN / PASTO AGROSTIDE O GRAMA Una vez que se obtienen callos resistentes a sethoxydim, se intenta la regeneración en todos los callos resistentes. El medio de regeneración usado es como se describe en la Tabla 6 (Luo, et al. 2003. supra) .

Tabla 6. Medio de regeneración para pasto agrostide Cualesquier protocolos de regeneración conocidos para aquellos de habilidad en el arte se pueden llevar a cabo para la regeneración de callos de pasto agrostide resistente a sethoxydim. Un protocolo de regeneración ejemplar es descrito en Luo, et al (2003. supra). Otro protocolo de regeneración ejemplar es descrito en el Ejemplo 5.

EJEMPLO 13 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LÍNEAS RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO AGROSTIDE Una vez que se identifican líneas de pasto agrostide o grama resistente a sethoxydim (SR) se puede caracterizar la mutación que provoca la resistencia. Un protocolo ejemplar para identificar una mutación en la posición 1781 del gen de ACCasa es descrito en la presente (Ejemplo 6). Además, las líneas de pasto agrostide pueden ser analizadas en cuanto a mutaciones en cualquier otras posiciones en el gen de ACCasa a diseñar cebadores para amplificar regiones específicas que incluyen las posiciones 2027, 2041, 2078 (Ejemplo 6) y 2096 (Delye, 2005. supra) . El diseño de cebadores y regiones de amplificación para análisis de secuencia son bien conocidos para aquellos de habilidad en the arte.

EJEMPLO 14 EVALUACIÓN DE RESISTENCIA DE PLANTA ENTERA A SETHOXYDIM Y HERBICIDAS INHIBIDORES DE ACCASA EN PASTO AGROSTIDE Una vez que se regeneran plantas de pasto agrostide o grama resistente a sethoxydim, la resistencia de planta entera a sethoxydim se puede llevar a cabo como se describe en la presente (Ejemplos 8 y 9) . Además, la resistencia cruzada a otros herbicidas inhibidores de ACCasa se puede llevar a cabo como se describe en la. resente (Ejemplo 10), EJEMPLO 15 INDUCCIÓN DE TEJIDO DE CALLO DE CÉSPED FESTUCA ALTO Para inducir formación de tejido de callo, semillas de pasto festuca alto son esterilizadas en ácido sulfúrico al 50% por 30 minutos, enjuagados con agua desionizada y etanol al 95% y agitadas en blanqueador al 100% con tween al 0.1% por 30 minutos. Las semillas son luego enjuagadas en agua estéril 10 veces por cuatro minutos cada vez. Una vez esterilizadas, las semillas son colocadas sobre el medio de MS/B5D2 (Murashige y Skoog. 1962. supra; Gamborg et al. 1968, supra) para la germinación. Una semana más tarde, todas las semillas germinadas son lesionadas al cortar las semillas para promover el crecimiento de callo. Las semillas rebanadas son colocadas en un medio de inducción de callo como se describe en la Tabla 7 para inducir la formación de tejido de callo. Los callos son transferidos cada dos semanas para propagación para uso en experimentos adicionales.

Tabla 7. Medio de inducción de callo para pasto festuca alto EJEMPLO 16 SELECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO FESTUCA ALTO Una vez que el tejido de callo de pasto festuca alto es obtenido, los callos pueden ser seleccionados mediante el proceso de selección de sethoxydim como se describe previamente (Ejemplo 4) . Brevemente, la selección de células resistentes a sethoxydim (SR) es efectuada al colocar el tejido de callo sobre el medio de inducción de callo (Tabla 7) que contiene sethoxydim 10 µ?. Se usan placas grandes (245 x 245 mm de tamaño) para seleccionar eficientemente números mayores de células. El tejido de callo de aproximadamente 4 mm de diámetro es colocado en una rejilla de 15 x 15, dando un total de entre aproximadamente 200 a 250 callos por placa. Los callos son subcultivados tres veces a intervalos de dos semanas (Ejemplo 3) . Los callos resistentes son subcultivados en cajas de Petri de 100 x 15 mm que contiene medio de inducción de callo (Tabla 7) complementado con sethoxydim 10 µ? y propagados por al menos un mes con el fin de obtener suficiente callo.

EJEMPLO 17 REGENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTE A SETHOXYDIM EN PASTO FESTUCA ALTO Una vez que se obtienen callos resistentes a sethoxydim, se intenta la regeneración sobre todos los callos resistentes. Un medio de regeneración ejemplar como se describe en la Tabla 6 (Luo, et al. 2003. supra) puede ser usado. Otro protocolo de regeneración ejemplar es descrito en el Ejemplo 5. Sin embargo, cualquier protocolo de regeneración conocidos para aquellos de habilidad en el arte se puede llevar a cabo para la regeneración de callos de festuca alto resistentes a sethoxydim.

EJEMPLO 18 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LÍNEAS RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO FESTUCA ALTO Una vez que se identifican lineas de festuca alto resistentes a sethoxydim (SR) , la mutación que provoca la resistencia puede ser caracterizada. Un protocolo ejemplar para identificar una mutación en la posición 1781 del gen de ACCasa es descrito en la presente (Ejemplo 6). Además, las líneas de festuca alto pueden ser analizadas en cuanto a mutaciones en cualquier otras posiciones en el gen de ACCasa al diseñar cebadores para amplificar 1 regiones específicas que incluyen las posiciones 2027, 2041, 2078 (Ejemplo 6) y 2096 (Delye. 2005. supra) . El diseño de cebadores y regiones de amplificación para análisis de secuencia son bien conocidos para aquellos de habilidad en el arte.

EJEMPLO 19 EVALUACIÓN DE RESISTENCIA DE PLANTA ENTERA A SETHOXYDIM Y HERBICIDAS INHIBIDORES DE ACCASA EN PASTO FESTUCA ALTO Una vez que las plantas de festuca alto resistente a sethoxydim son regeneradas, la resistencia de planta entera a sethoxydim se puede llevar a cabo como se describe en la presente (Ejemplos 8 y 9) . Además, la resistencia cruzada a otros herbicidas inhibidores de ACCasa se puede llevar á cabo como se describe en la presente (Ejemplo 10) .

EJEMPLO 20 SELECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO ZOYSIA Para inducir la formación de tejido de callo, semillas de pasto zoysia son esterilizados en ácido sulfúrico al 50% por 30 minutos, enjuagados con agua desionizada y etanol al 95% y agitados en blanqueador al 100% con tween al 0.1% por 30 minutos. Las semillas son luego enjuagadas en agua estéril 10 veces por cuatro minutos cada vez. Una vez esterilizadas, las semillas son colocadas sobre el medio de'MS/B5D2 (Murashige y Skoog. 1962. supra; Gamborg et al., 1968. supra) para germinación. Una semana más tarde, todas las semillas germinadas son lesionadas al cortar las semillas para promover el crecimiento de callo. Las semillas rebanadas son colocadas en un medio de inducción de callo como se describe en la Tabla 7 para inducir la formación de tejido de callo. Los callos son transferidos cada dos semanas para propagación para uso en experimentos adicionales .

EJEMPLO 21 SELECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO ZOYSIA Una vez que se obtiene el tejido de callo de pasto zoysia, los callos pueden ser seleccionados mediante proceso de selección de sethoxydim como se describe previamente (Ejemplo 4) . Brevemente, " la selección de células resistentes a sethoxydim (SR) es efectuada al colocar tejido de callo sobre el medio de inducción de callo (Tabla 7) que contiene sethoxydim 10 uM. Se usan placas grandes (245 x 245 mm de tamaño) para seleccionar eficientemente números mayores de células. El tejido de callo de aproximadamente 4 mm de diámetro es colocado en una rejilla de 15 x 15, dando un total de entre aproximadamente 200 a 250 callos por placa. Los callos son subcultivados tres veces a intervalos de dos semanas (Ejemplo 3). Los callos resistentes son subcultivados en cajas de Petri de 100 x 15 mm que contienen medio de inducción de callo (Tabla 7) complementado con sethoxydim 10 µ? y propagados por al menos un mes con el fin de obtener suficientes callos.

EJEMPLO 22 REGENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO ZOYSIA Una vez que se obtienen callos resistentes a sethoxydim, se intenta la regeneración sobre todos los callos resistentes. Se puede usar un medio de regeneración ejemplar como se describe en la Tabla 6 (Luo, et al. 2003. supra) . Otro protocolo de regeneración ejemplar es descrito en el Ejemplo 5. Sin embargo, cualquier protocolo de regeneración conocido para aquellos de habilidad en el arte se puede llevar a cabo para la regeneración de callos de pasto zoysia resistentes a sethoxydim.

EJEMPLO 23 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LÍNEAS RESISTENTES A SETHOXYDIM EN PASTO FESTUCA ALTO Una vez que se identifican las líneas de festuca alto resistentes a sethoxydim (SR) , la mutación que provoca la resistencia puede ser caracterizada. Un protocolo ejemplar para identificar una mutación en posición 1781 del gen de ACCasa es descrito en la presente (Ejemplo 6) . Además, las líneas de festuca alto pueden ser analizadas en cuanto a mutaciones en cualesquier otras posiciones en el gen de ACCasa al diseñar cebadores para amplificar regiones específicas que incluyen las posiciones 2027, 2041, 2078 (Ejemplo 6) y 2096 (Delye. 2005. supra) . El diseño de cebadores y regiones de amplificación para análisis de secuencias son bien conocidos para aquellos de habilidad en el arte.

EJEMPLO 24 EVALUACIÓN DE RESISTENCIA DE PLANTA ENTERA A SETHOXYDIM Y HERBICIDAS INHIBIDORES DE ACCASA EN PASTO ZOYSIA Una vez que las plantas de pasto zoysia resistentes a sethoxydim son regeneradas, la resistencia de planta entera a sethoxydim se puede llevar a cabo como se describe en la presente (Ejemplos 8 y 9) . Además, la resistencia cruzada a otros herbicidas inhibidores de ACCasa se puede llevar a cabo como se describe en la presente (Ejemplo 10) .

EJEMPLO 25 CONTROL DE ESPECIES DE MALEZAS ENTRE PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDA MEDIANTE APLICACIÓN DE UN HERBICIDA Un lote que contiene tanto césped bermuda como paspalum de costa resistente a sethoxydim es tratado con 150 g de ingrediente activo ha"1 de sethoxydim una vez a la semana en un período de tres meses. Después del período de tratamiento de tres meses, se observa que el pasto bermuda muere lentamente en tanto que el paspalum resistente a sethoxydim continúa prosperando, dejando el lote poblado con más de 80% de paspalum resistente a sethoxydim.

EJEMPLO 26 CONTROL DE ESPECIES DE MALEZAS ENTRE PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDA MEDIANTE APLICACIÓN DE UNA COMBINACIÓN DE HERBICIDAS Un lote que contiene tanto pasto bermuda como paspalum de costa resistente a sethoxydim es tratado tanto con 150 g de ingrediente activo ha"1 de sethoxydim como 150 g de ingrediente activo ha-1 de fenoxaprop una vez a la semana en un período de tres meses . Después del período de tratamiento de tres meses, se observa que el pasto bermuda muere lentamente en tanto que el . paspalum resistente a sethoxydim continúa prosperando, dejando el lote poblado con más de 80% de paspalum resistente a sethoxydim.

EJEMPLO 27 SELECCIÓN AUXILIADA POR MARCADOR; IDENTIFICACIÓN DE RASGOS APROPIADOS PARA SELECCIÓN UTILIZANDO LA RESISTENCIA A HERBICIDA COMO MARCADOR Una variedad de festuca alto que tiene varios rasgos deseables para propósitos de cría es cultivada como se describe en la presente (véanse Ejemplos 15-19) para identificar líneas de callos resistentes a sethoxydim de la variedad. Estas líneas son regeneradas a plantas maduras de generación Ro. Las plantas Ro que tienen la mutación 11781L de ACCasa, que confiere resistencia a sethoxydim, son cruzadas con una variedad de festuca alto diferente que carece de los varios rasgos. Por medio de cruces subsecuentes, ciertos de los rasgos deseables son mostrados que se segregan no aleatoriamente con resistencia a sethoxydim. Por medio de cruces adicionales, el enlace entre resistencia a sethoxydim y cada uno de los rasgos enlazados puede ser cuantificado . Para cada rasgo encontrado a ser enlazado a resistencia a sethoxydim, tal resistencia es un marcador útil para protocolos de cría/selección auxiliados por marcador .

EJEMPLO 28 SELECCIÓN AUXILIADA POR MARCADOR: SELECCIÓN DE UN RASGO ENLAZADO DESEABLE BASADO EN EL FENOTIPO DE MARCADOR Plantas de festuca alto resistentes a sethoxydim del Ejemplo 27, de la generación o progenie R0 de tal generación, son usadas para Cría y selección auxiliada por marcador. Una variedad comercial de festuca alto que carece de uno de los rasgos enlazados identificado en el Ejemplo 27 es cruzado con las plantas de festuca alto resistentes a sethoxydim del Ejemplo 27 para formar una generación híbrida. Las semillas de la generación híbrida son germinadas y las plantas son tratadas con sethoxydim a un nivel suficiente para matar o retardar severamente el crecimiento de plantas no resistentes. Plantas resistentes a sethoxydim, saludables, son seleccionadas para cruces adicionales . Una gran proporción de tales plantas seleccionadas portan el rasgo enlazado. Generaciones adicionales de cruces entre plantas resistentes a sethoxydim con plantas de la variedad comercial, seguidas por tratamiento con sethoxydim y selección, dan como resultado una línea de planta que tiene sustancialmente los antecedentes genéticos dé la variedad comercial, pero que porta el rasgo deseable que fue confirmado por ser enlazado a resistencia a sethoxydim.

EJEMPLO 29 SELECCIÓN AUXILIADA POOR MARCADOR: SELECCIÓN DE UN RASGO ENLAZADO DESEABLE BASADO EN UN MARCADOR MOLECULAR Plantas de festuca alto resistentes a sethoxydim del Ejemplo 27, de la generación o progenie R0 de tal generación, son usadas para la cría y selección auxiliadas por marcador. Una variedad comercial de festuca alto que carece uno de los rasgos enlazados identificados en el Ejemplo 27 es cruzado con las plantas de festuca alto resistentes a sethoxydim del Ejemplo 27 para formar una generación híbrida. Semillas de la generación híbrida son germinadas y muestras de las plantas germinadas son seleccionadas mediante métodos moleculares tales como PCR en cuanto a la presencia del SNP asociado con la mutación 11781L. Por ejemplo, los cebadores SV384F y SV384R (Ejemplo 6, SEQ ID NOs : 1 y 2) pueden ser usados en un análisis de amplificación para detectar el marcador. La presencia del marcador molecular en una planta híbrida confirma la probabilidad de que la planta híbrida también porta los rasgos deseables enlazados a resistencia a sethoxydim, como se discute en el Ejemplo 27. Las plantas que portan el marcador molecular son seleccionadas para cruces adicionales . Una gran proporción de tales plantas seleccionadas portan el rasgo enlazado. Generaciones adicionales de cruces entre plantas que tienen el marcador, con plantas de la variedad comercial, seguidas ya sea por selección molecular adicional o mediante tratamiento de sethoxydim y selección, dan como resultado en una línea de planta que tiene sustancialmente los antecedentes genéticos de la variedad comercial, pero que portan el rasgo deseable que fue confirmado por estar enlazado a resistencia a sethoxydim.

Los varios métodos y técnicas descritos anteriormente proveen un número de maneras paira llevar a cabo la invención. Además, el experimentado en el arte reconocerá la posibilidad de aplicación de varios elementos de diferentes modalidades. Similarmente, los varios elementos, aspectos y etapas discutidos anteriormente, también como otros equivalentes conocidos para cada uno de tales elementos, aspectos o etapas, pueden ser combinados y/o modificados por aquel de habilidad ordinaria en el arte para efectuar métodos de acuerdo con los principios descritos en la presente. De entre los varios elementos, aspectos y etapas algunos serán incluidos específicamente y otros excluidos específicamente en diversas modalidades .

Aunque la invención ha sido revelada en el contexto de ciertas modalidades y ejemplos, se comprenderá por aquellos experimentados en el arte que las modalidades de la invención se extienden más allá de las modalidades reveladas específicamente a otras modalidades alternativas y/o usos y modificaciones y equivalentes de los mismos.

Muchas variaciones y elementos alternativos han sido revelados en modalidades de la presente invención. Todavía variaciones y elementos alternativos adicionales serán evidentes para aquel de habilidad en el arte.

En algunas modalidades, los términos "un" y "uno" y "el" y referencias similares usadas en el contexto para describir una modalidad particular de la invención (especialmente en el contexto de ciertas de las siguientes reivindicaciones) pueden ser interpretados para cubrir tanto el singular como el plural. La cita de intervalos de valores en la presente pretende solamente servir como método corto para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo. A no ser que se indique de otra manera en la presente, cada valor individual es incorporado a la especificación como si fuera citado individualmente en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden ser efectuados en cualquier orden apropiado, a no ser que se indique de otra manera en la presente o de otra manera se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") provisto con respecto a ciertas modalidades en la presente pretende solamente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en cuanto al alcance de la invención de otra manera reivindicada. Ningún lenguaje en la especificación debe ser interpretado para indicar cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

Las agrupaciones de elementos o modalidades alternativas de la invención revelados en la presente no serán interpretados como limitaciones. Cada miembro del grupo puede ser denominado a y reivindicado individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos encontrados en la presente. Uno o más miembros de un grupo pueden ser incluidos en, o borrados de, un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se presenta cualquiera de tal inclusión o cancelación, la especificación se considera en la presente que contiene el grupo tal como es modificado satisfaciendo así la descripción escrita de todos los grupos de Markush usados en las reivindicaciones adjuntas.

Modalidades preferidas de esta invención son descritas en la presente, que incluyen el mejor modo conocido para ios inventores para llevar a cabo la invención. Variaciones en aquellas modalidades preferidas serán evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte después de la lectura de la descripción anterior. Se contempla que los técnicos experimentados pueden emplear tales variaciones como sea apropiado, y la invención se puede llevar a la práctica de otra manera que como se describe específicamente ' en la presente. Así, muchas modalidades de esta invención incluyen todas las modificaciones y equivalentes de la materia citada en las reivindicaciones adjuntas en la presente tal como sea permitido por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos es abarcada por la invención, a no ser que se indique de otra manera en la presente o sea de otra manera claramente contradicho por el contexto .

Además, se han hecho numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas en toda esta especificación. Cada una de las referencias citadas anteriormente y publicaciones impresas . son incorporadas individualmente en la presente por referencia en su totalidad.

En el cierre, sé comprenderá que las modalidades de la invención reveladas en la presente son ilustrativas de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden ser empleadas pueden estar dentro del alcance de la invención. Así, a manera de ejemplo, pero no de limitación, configuraciones alternativas de la presente invención pueden ser utilizadas de acuerdo con las enseñanzas en la presente. Así, las modalidades de la presente invención no están limitadas a aquellas como se muestra y describe precisamente.

Claims (55)

REIVINDICACIONES

1. Una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa seleccionada y cultivada caracterizada porque es del grupo de Panicodae o te ido, semilla o progenie del mismo.

2. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es regenerada de una célula sin diferenciar resistente a herbicida que ha sufrido un método de selección, en donde el método comprende : proveer un callo de células sin diferenciar de una planta del grupo de Panicodae; poner en contacto el callo con por lo menos uh herbicida en una cantidad suficiente para retardar el crecimiento o matar el callo; seleccionar por lo menos una célula resistente en base al efecto diferencial del herbicida; y regenerar una planta entera viable de la variedad de la por lo menos una célula resistente.

3. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es un miembro de la tribu de Paniceae.

4. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la planta es una seleccionada del grupo de: Axonopus (Axonopus), Digiteria (digitaria) , Echinochloa, Pánicum, Paspalum (pasto bahía) , Pennisetum, Setaria y Stenotaphrum (pasto de San Agustín) .

5. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la . reivindicación 3, caracterizada porque la planta es una seleccionada del grupo que consiste de: paspalum de costa (P. vaginatum) , pasto agrostide o grama, pasto festuca alto, pasto zoysia, pasto bermuda (Cynodon spp) , pasto azul de Kentucky, pasto azul de Texas, lolio perenne, buchloe (Buchloe dactyloides) , césped centípedo (Eremochloa ophiuroides) y pasto de San Agustín {Stenotaphrum secundatum), Axonopus (Axonopus spp.) y pasto bahía (Paspalum notatum) .

6. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es resistente a un inhibidor de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) .

7. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es resistente a un herbicida de ciclohexandiona, un herbicida de ariloxifenoxi proprionato, un herbicida fenilpirazolina o mezclas de los mismos.

8. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de por lo menos una posición de aminoácido del gen de ACCasa seleccionado del grupo de: 1756, 1781, 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096.

9. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porgue la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de isoleucina a leucina en posición de aminoácido 1781.

10. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue la planta es resistente a por lo menos un herbicida seleccionado del grupo gue consiste de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaguizafop, guizalofop, trifop y pinoxaden.

11. La planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue la planta es una planta no transgénica.

12. Una progenie de una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1-11.

13. La progenie de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porgue la progenie es un resultado de reproducción sexual de un padre de planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa.

14. La progenie de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la progenie es un resultado de reproducción asexual del padre de planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa.

15. Una semilla de una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de caracterizada porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Una semilla, caracterizada porque es de la progenie de conformidad con la reivindicación 12.

17. Una semilla caracterizada porque es de la progenie de la reivindicación 13.

18. Una semilla caracterizada porque es de la progenie de conformidad con la reivindicación 14.

19. Un césped caracterizado porque comprende una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una progenie o semilla de la misma.

20. Un lote de cría de hierba para césped caracterizado porque comprende una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una progenie o semilla de la misma.

21. Un césped comercial, campo de golf o campo caracterizado porque comprende una planta resistente a herbicida inhibidor de ACCasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una progenie o semilla de a misma.

22. Un método para identificar una planta resistente a herbicida del grupo de Panicodae, caracterizado porque comprende : proveer un .' callo de células sin diferenciar de una planta del grupo Panicodae; poner en contacto el callo con por lo menos un herbicida en una cantidad suficiente para retardar el crecimiento o matar el callo; seleccionar por lo menos una célula resistente en base a un efecto diferencial del herbicida; y regenerar una planta entera viable de la variedad de la por lo menos una célula resistente, en donde la planta regenerada es resistente al por lo menos un herbicida.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende además expandir la por lo menos una célula resistente a una pluralidad de células sin diferenciar.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado "porque la planta es una seleccionada de la tribu de Paniceae.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la planta es una seleccionada del grupo de: Axonopus (Axonopus) , Digiteria (digitaria) ,. Echinochloa, Panicum, Paspalum (pasto bahía) , Pennisetum, Setaria y Stenotaphrum (pasto de San Agustín) .

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la planta es una selecci'onada del g^po de: paspalum de costa (P. vaginatum) , pasto agrostide o grama (Agrostis. spp) , festuca alto, pasto Zoysia, pasto bermuda (Cynodon spp), pasto, azul de Kentucky, pasto azul de Texas, lolio perenne, Buchloe (Buchloe dactyloides) , pasto centípedo (Eremochloa ophiuroides) y pasto de San Agustín (Stenotaphrum secundatum) , Axonopus {Axonopus spp) y pasto bahía (Paspalum notatum) .

27. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el por lo menos un herbicida es un inhibidor de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) .

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de por lo menos una posición de aminoácido del gen de ACCasa seleccionado del grupo que consiste de: 1756, 1781, 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096.

29. El método de .conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de isoleucina a leucina en posición de aminoácido 1781.

30. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el por lo menos un herbicida es seleccionado del grupo que consiste de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

31. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el callo de células sin diferenciar es provisto de una planta no transgénica.

32. Un cultivo de tejido de células regenerables de una planta resistente a herbicida caracterizado porque es identificado mediante el método de conformidad con la reivindicación 22.

33. Un método para controlar malezas en la vecindad de una planta resistente a herbicida identificada mediante el método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende: poner en contacto por lo menos un herbicida con las malezas y a la planta resistente a herbicida, en donde el por lo menos un herbicida es puesto en contacto con las malezas y con la planta a una proporción suficiente para inhibir el crecimiento de una planta no seleccionada de la misma especie o suficiente para inhibir el crecimiento de las malezas .

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la planta resistente a herbicida es resistente a un inhibidor de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) .

35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la planta resistente a herbicida es resistente a un herbicida de ciclohexandiona, un herbicida de ariloxifenoxi proprionato, un herbicida de fenilpirazolina o mezclas de los mismos.

36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la resistencia a herbicida en la planta es conferida mediante una mutación de por lo menos una posición de aminoácido del gen de ACCasa seleccionado del grupo de: 1756, 1781, 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la resistencia a herbicida es conferida por una mutación de isoleucina a leucina en posición de aminoácido 1781 del gen de ACCasa.

38. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el por lo menos un herbicida es seleccionado del grupo que consiste de : alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

39. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la planta resistente a herbicida es una planta no transgénica.

40. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende poner en contacto el herbicida directamente con la planta resistente a herbicida.

41. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende poner en contacto el herbicida con un medio de crecimiento en el cual la planta resistente a herbicida está ubicada.

42. Un marcador de ADN específico de paspalum de costa caracterizado porque está depositado como No. de Depósito de la ATCC, o un fragmento del mismo, que es apto de identificar cultivos de césped resistentes a herbicida.

43. Un método de identificar una planta resistente a herbicida, caracterizado porque comprende: obtener una muestra genética de la planta; y analizar la muestra en cuanto a la presencia o ausencia de una mutación en posición 1781 del gen de ACCasa, en donde la presencia de una mutación en posición 1781 es indicadora de resistencia a herbicida en la planta.

44. El uso del marcador en posición 1781 del gen de ACCasa, caracterizado porque se usa en un método para identificar una planta resistente a herbicida.

45. Un método de cría auxiliada por marcador, caracterizado porque comprende las etapas de: identificar un elemento de interés para cría y selección, en donde el elemento 'está en enlace con un gen de ACCasa; proveer una primera planta que porta una variante de secuencia de ACCasa apta de conferir a la planta resistencia a un herbicida inhibidor de ACCasa, en donde la planta comprende además el elemento de interés; cruzar la primera planta con una segunda planta; identificar progenie de la etapa de cruce por tener la variante de secuencia de ACCasa; y seleccionar progenie probable de tener el elemento de interés en base a la etapa de identificación.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el elemento es seleccionado de: un rasgo o un gen.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el rasgo es por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de: tolerancia a herbicida, resistencia a enfermedad, resistencia a insecto de peste, ácido graso alterado, metabolismo de proteína o carbohidrato, velocidades de crecimiento incrementadas, tolerancia de esfuerzo mejorada, madurez preferida, propiedades organolépticas mejoradas, características morfológicas alteradas, esterilidad otros rasgos agronómicos, rasgos para usos industriales o rasgos para atractivo al consumidor mejorado.

48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la variante de secuencia de ACCasa comprende una variación en por lo menos una posición de: 1756, 1781, 1999, 2027, 2041, 2078, 2099 y 2096.

49. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porgue el herbicida es seleccionado de: alloxydim, butroxydim, cloproxydim, profoxydim, sethoxydim, clefoxydim, clethodim, cycloxydim, tepraloxydim, tralkoxydim, chloraizfop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenthiaprop, fluazafop-butilo, fluazifop, haloxyfop, isoxapyrifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, trifop y pinoxaden.

50. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la etapa de identificación comprende un proceso seleccionado de: detección molecular de la variante de secuencia, observación de resistencia a un inhibidor de ACCasa, y selección mediante aplicación de un inhibidor de ACCasa .

51. Una planta transgénica, caracterizada porque es transformada con un segmento de ADN que comprende por lo menos 250 bases derivadas de SEQ ID NO: 5.

52. Una planta de progenie caracterizada porque es de la planta de conformidad con la reivindicación 51.

53. La planta de progenie de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la progenie es seleccionada de: una progenie de retrocruce, un híbrido, una progenie clonal y una progenie gemelo-apareada.

54. una célula transformada caracterizada porque contiene un segmento de ADN que comprende por lo menos 250 bases derivadas de SEQ ID NO: 5.

55. Un método de identificar una mutación en posición 1781 del gen de ACCasa en una célula, caracterizado porque comprende : obtener una muestra genética de una célula; amplificar selectivamente un fragmento de ADN al usar el cebador de SV384F y cebador de SV348R en una etapa de amplificación; y secuenciar el fragmento de ADN para determinar la presencia o ausencia de una mutación en posición 1781 del gen de ACCasa, en donde la presencia de una mutación en el fragmento de ADN es indicadora de la presencia de la mutación en posición 1781 en la célula.