CN115942866A - 莴苣盘梗霉抗性sg01 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表现出对莴苣盘梗霉的抗性的新型莴苣植物。本发明还涉及所述植物的种子和部分，例如叶和头。本发明进一步涉及制造和使用这类种子和植物的方法。本发明还涉及与对莴苣盘梗霉的所述抗性相关联的新型基因序列，并且涉及与所述新型基因序列相关联的分子标记。

Description

莴苣盘梗霉抗性SG01
技术领域
本发明涉及表现出对莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)的抗性的新型莴苣植物。本发明还涉及所述植物的种子和部分，例如叶和头。本发明进一步涉及制造和使用这类种子和植物的方法。本发明还涉及与对莴苣盘梗霉的所述抗性相关联的新型基因序列，并且涉及与所述新型基因序列相关联的分子标记。
背景技术
已知植物病原体对重要作物造成相当大的损害，导致显著的农业损失，对食物供应和依赖植物材料的其他工业都具有广泛的后果。这样，长期以来存在降低农业有害生物的发生率和/或其对作物生产的影响的需要。
这样的病原体的实例是真菌莴苣盘梗霉，其引起霜霉病。莴苣盘梗霉(B.lactucae)发生在世界范围内，并且对栽培莴苣(莴苣(Lactuca sativa))的产量和质量两者而言均是很大的问题。真菌可以在生长的任何阶段感染莴苣植物，在此之后，霜霉病的最初症状显露为叶表面上的褪绿的黄色斑点。在24小时至48小时内，白色绒毛状真菌生长显露在下叶表面，作为孢子形成的指示。在感染期间，病灶斑点变得越来越大并且更加褪绿，直到叶子完全变为棕色。
莴苣盘梗霉属于卵菌组，其是一类相对原始的真菌。该组的其他成员是例如腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)。莴苣盘梗霉含有不同的生理物种(“physios”)，是一种非常多变的病原体，并且是宿主特异性的。在莴苣盘梗霉繁殖之前的孢子形成过程中，通过无毒基因的突变，新生理物种相对频繁地出现。
在栽培莴苣(莴苣(L.sativa))所属的莴苣(Lactucae)属内，有许多已知的对莴苣盘梗霉的抗性。这些抗性通常是小种特异性的，并且基于称为Dm(霜霉病)抗性基因的质量基因。抗性机制被称为基因对基因机制，该基因对基因机制基于Dm抗性基因和病原体特异性无毒基因的产物之间的特异性相互作用(HR反应)，这导致莴苣植物的抗性。
由于莴苣盘梗霉的高可变性和新生理物种的频繁出现，因此由各种Dm抗性基因所介导的小种特异性抗性可以由盘梗霉病原体的新出现的生理物种迅速打破。
仍然需要针对真菌病原体莴苣盘梗霉的新型抗性，尤其地，针对该真菌病原体的广谱抗性。
发明内容
本发明通过提供包含指定为“SG01”的盘梗霉(Bremia)抗性性状的新型莴苣植物及其部分和种子解决对莴苣盘梗霉的额外的和经改善的抗性的需要。还提供了用于鉴定和产生包含盘梗霉抗性性状的莴苣植物(例如，莴苣植物)及其部分和种子的核酸标记。在特定实施例中，本发明披露了对盘梗霉的抗性的新型来源：CGN23091，一个野生毒莴苣(Lactuca serriola)登录号。通过将来自野生来源的赋予盘梗霉抗性的序列基因渗入栽培莴苣植物(例如，莴苣)，将定性盘梗霉抗性赋予栽培莴苣植物。位于2号染色体上的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列具有显性性质；因此，一个拷贝的序列提供盘梗霉抗性表型。
总而言之，本发明内所披露的盘梗霉抗性莴苣植物的特征向莴苣种植者提供了新型解决方案，以在存在盘梗霉压力的田地中部署莴苣品种时增强经济和商业效率。此外，如本领域技术人员所熟知的，新的盘梗霉抗性可以与单个植物中的其他盘梗霉抗性叠加，并且可以提供针对多个小种/分离株的经改善的抗性谱，防止新出现的小种/分离株，并且可以延迟现有盘梗霉抗性的崩溃。
在第一实施例中，本发明提供了一种对莴苣盘梗霉具有抗性的莴苣植物(例如，栽培莴苣植物，如莴苣植物)，所述植物包含来自毒莴苣的基因渗入序列，所述基因渗入序列赋予对莴苣盘梗霉的定性和显性抗性，其中所述基因渗入序列包含在毒莴苣登录号CGN23091中或莴苣品系18LEN002364中，并且其中所述基因渗入序列位于2号染色体上并包含以下SNP标记中的一者或多者：
a)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型。
在另一个实施例中，本发明提供了一种对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物(例如，栽培莴苣植物，如莴苣植物)，所述植物包含来自毒莴苣的基因渗入序列，所述基因渗入序列赋予对莴苣盘梗霉的定性和显性抗性，其中所述基因渗入序列包含在毒莴苣登录号CGN23091中或莴苣品系18LEN002364中，并且其中所述基因渗入序列位于2号染色体上并包含以下SNP标记中的一者或多者：
a)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
其中所述莴苣植物与不包含所述基因渗入序列的对照莴苣植物(例如，莴苣植物)相比，对莴苣盘梗霉的抗性增强。
在代表性实施例中：
a)标记SL1831的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ ID NO:3；
b)SNP标记SL1847的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10，以及探针SEQ ID NO:8；
c)SNP标记SL1887的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ ID NO:13；以及
d)SNP标记SL1883的所述C基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20，以及探针SEQ ID NO:18。
在实施例中，根据本发明的植物是栽培植物。
在实施例中，本发明的基因渗入序列包含以下的一者或多者：SEQ ID NO:1，其具有由112位的核苷酸G表示的抗性标记等位基因；SEQ ID NO:6，其具有由112位的核苷酸A表示的抗性标记等位基因；SEQ ID NO:11，其具有由99位的核苷酸G表示的抗性标记等位基因；和/或SEQ ID NO:16，其具有由41位的核苷酸C表示的抗性标记等位基因；或序列，所述序列与前述序列中的一者或多者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性并且包含抗性标记等位基因。
在实施例中，根据本发明的植物对于所述一个或多个SNP标记是杂合的(例如，对于基因渗入序列和SG01盘梗霉抗性是杂合的)。
在实施例中，根据本发明的植物(对于所述一个或多个SNP标记是纯合的(例如，对于基因渗入序列和SG01盘梗霉抗性是纯合的)。
在实施例中，根据本发明的植物包含SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者、三者或更多者或所有四者(各自呈杂合或纯合形式)。
在代表性实施例中，根据本发明的植物包含至少以下SNP标记(呈杂合或纯合形式的任一个标记或两个标记)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
例如，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
在实施例中，本发明的基因渗入序列赋予至少针对莴苣盘梗霉小种Bl 16-36EU的抗性。
在实施例中，根据本发明的植物通过使毒莴苣登录号CGN23091或莴苣18LEN002364与不包含赋予对莴苣盘梗霉的抗性(例如，不包含SG01盘梗霉抗性)的所述基因渗入序列的第二莴苣植物杂交来获得。
在实施例中，根据本发明的植物是近交、双单倍体或杂种植物。通常，本发明的植物是二倍体。
作为另一方面，本发明提供了莴苣品系18LEN002364的植物。
它是提供从根据本文所述的实施例中任一项所述的莴苣植物获得的植物部分、器官或组织的另一个实施例，包括但不限于头、叶、芯、茎、根、花或花部分、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产品，以上各项包含基因渗入序列。在实施例中，植物部分、器官或组织展现出根据本发明的盘梗霉抗性，特别是当生长成为产生莴苣叶和/或头的莴苣植物时。
进一步提供了产生根据本发明的植物的种子。
还进一步提供了由根据本发明的植物产生的种子。
在另一个实施例中，设想了根据本发明的实施例中任一项所述的莴苣植物、植物部分或种子用于产生并收获莴苣头和/或叶的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及根据本文所述的任何实施例所述的莴苣植物、植物部分(例如，头或叶)或种子的用途，以产生本发明的具有盘梗霉抗性的另一种莴苣植物、植物部分或种子。
在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明的任何实施例所述的莴苣植物、植物部分或种子的用途，其中莴苣植物、植物部分或种子是莴苣18LEN002364或其子代或祖先。
在又一个实施例中，本发明涉及根据本发明的任何实施例所述的莴苣植物、植物部分或种子的用途，其中莴苣植物、植物部分或种子是毒莴苣登录号CGN23091或其子代或祖先。
作为另一个实施例，本发明提供了一种用于产生对莴苣盘梗霉(例如，与对照植物相比)具有增强的抗性的莴苣植物的方法，所述方法包括：
a)使根据本发明的莴苣植物与缺乏赋予对莴苣盘梗霉的抗性的所述基因渗入序列的第二莴苣植物杂交，以产生子代植物；
b)选择包含赋予对莴苣盘梗霉的抗性的所述基因渗入序列的子代植物，所述选择步骤包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记中的一者或多者：
i)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的植物。
任选地，所述方法进一步包括：
c)使所选择的子代自交或使所选择的子代植物与另一莴苣植物杂交，以产生另外的子代。在实施例中，选择另外的子代，并且再自交/杂交2代至10代。
在实施例中，b)的所述选择步骤包括检测(例如，通过基因分型)SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者、三者或更多者或所有四者。任选地，所述选择步骤包括检测至少以下SNP标记(呈杂合或纯合形式的任一个标记或两个标记)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
在实施例中，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
在实施例中，第一莴苣植物和/或第二莴苣植物是莴苣植物。
另一个实施例提供了一种用于产生对莴苣盘梗霉(例如，与对照植物相比)具有增强的抗性的莴苣植物的方法，所述方法包括：
a)使毒莴苣登录号CGN23091的植物与缺乏来自毒莴苣登录号CGN23091的基因渗入序列的第二莴苣植物(例如，莴苣植物)杂交以产生子代植物，所述基因渗入序列赋予对莴苣盘梗霉的抗性；
b)选择包含来自毒莴苣登录号CGN23091的2号染色体上的基因渗入的子代植物，所述基因渗入赋予对莴苣盘梗霉的抗性，所述选择步骤包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记中的一者或多者：
i)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而产生对莴苣盘梗霉具有抗性的莴苣植物。
任选地，所述方法进一步包括：
c)使所选择的子代植物自交或使所选择的子代与另一莴苣植物(例如，莴苣植物)杂交，以产生另外的子代。在实施例中，选择另外的子代，并且再自交/杂交2代至10代。
在实施例中，b)的所述选择步骤包括检测(例如，通过基因分型)SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者、三者或更多者或所有四者。任选地，所述选择步骤包括检测至少以下SNP标记(呈杂合或纯合形式的任一个标记或两个标记)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
在实施例中，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于产生对莴苣盘梗霉(例如，与对照植物相比)具有增强的抗性的F1杂种莴苣植物的方法，所述方法包括使根据本发明的植物(所述植物是近交莴苣(例如，莴苣)植物)与不同的近交莴苣(例如，莴苣)植物杂交，以产生F1杂种莴苣子代。根据所述方法，第二近交莴苣植物可以包含或不包含根据本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。
在实施例中，本发明提供了一种用于鉴定对莴苣盘梗霉(例如，与对照植物相比)具有增强的抗性的莴苣植物(例如，莴苣植物)的方法，所述方法包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记中的一者或多者的步骤：
a)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而鉴定对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物。
在实施例中，前述方法进一步包括选择包含所述一个或多个SNP标记的莴苣植物，并且使所选择的莴苣植物与第二莴苣植物(例如，莴苣植物)杂交，所述第二莴苣植物可以是相同或不同的莴苣植物，以产生包含所述一个或多个分子标记并且对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的子代莴苣植物。在实施例中，所述检测步骤包括通过基因分型来检测SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者、三者或更多者或所有四者。任选地，所述检测步骤包括检测至少以下SNP标记(呈杂合或纯合形式的任一个标记或两个标记)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
在实施例中，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
作为又一个实施例，本发明提供了一种产生莴苣种子(例如，莴苣种子)的方法，所述方法包括从根据本发明的种子生长莴苣植物，允许植物产生另外的莴苣种子，并且任选地收集另外的莴苣种子。
在另一个实施例中，本发明涉及提供一种对盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物、植物部分(例如，叶和/或头)或种子的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使缺乏本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的第一莴苣植物(例如，莴苣植物)与根据本发明的任何实施例所述的第二莴苣植物(例如，莴苣植物)杂交，
b)获得子代莴苣植物，以及，
c)任选地选择所述子代植物，其特征在于所述子代植物展现出对盘梗霉抗性的增强的抗性。
根据前述实施例，任选地，第二莴苣植物是毒莴苣登录号CGN23091或莴苣18LEN002364的植物，或其子代或祖先。
在另一个实施例中，本发明涉及一种鉴定包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的莴苣植物(例如，莴苣植物)的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供盘梗霉抗性性状分离的莴苣(例如，莴苣)群体；
b)从分离群体筛选出展现出对盘梗霉的抗性的植物，其中所述抗性性状可以通过本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的存在来鉴定；以及
c)从分离群体中选择植物，其中所述植物包含盘梗霉抗性性状。
本发明的这些以及其他方面在以下的本发明的描述中更详细地描述。
具体实施方式
本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明预期了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，本文建议的不同实施例的众多变化以及增加物对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
本文引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文并入。
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除非上下文另外指示，明确地预期的是本文所述的本发明的不同特征可以按任何组合使用。而且，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，本文陈述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果本说明书陈述组合物包含组分A、B和C，明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。定义。
如果下文没有另外说明，在本申请范围内所使用的技术术语和表述一般被给予在植物育种和栽培相关领域中通常应用于其上的意义。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，提及“一种植物”包括一种或多种植物，并且提及“一种细胞”包括多种细胞、组织等的混合物。
如本文使用的，术语“约”，当指代一个值或指代质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法。
如本文使用的，“莴苣”植物是指莴苣属中的任何植物，包括但不限于莴苣、山莴苣(L.saligna)、野莴苣(L.virosa)和毒莴苣。在实施例中，莴苣植物是莴苣。在实施例中，莴苣植物是栽培的。
“栽培莴苣”植物在本发明的范围内应理解为是指不再是呈天然状态，而是已经通过人类的照料进行发育和驯化并且供农业使用和/或人类消费且不包括野生莴苣种质(诸如毒莴苣登录号CGN23091)的植物。例如，在实施例中，栽培莴苣植物的茎和/或叶不具有刺并且具有闭合的花。可替代地或另外地，栽培莴苣植物是杂种植物。可替代地或另外地，栽培莴苣植物是莴苣植物。在莴苣植物和野生莴苣之间的种间杂交的背景下，当所述子代植物已经与莴苣植物回交至少三次时，所述种间杂交的子代植物被认为是“栽培莴苣”植物。
“等位基因”在本发明的范围内应理解为是指基因或其他遗传元件的可替代或变体形式。这类可替代或变体形式可以是单核苷酸多态性、插入、倒置、易位或缺失的结果，或是基因调控(由例如化学或结构修饰引起的)、转录调控或翻译后修饰/调控的结果。在二倍体细胞或生物体中，一个给定基因或遗传元件的两个等位基因典型地占有同源染色体对上相应的基因座。
“莴苣盘梗霉”。一种在莴苣中，特别是在较凉爽的生长区域中导致霜霉病的卵菌。
如本文使用的，术语“抗性(resistance/resistant)”(及类似术语)是指当与易感植物比较时，在类似的环境条件和病原体压力下，植物能够限制指定病原体的生长和发展和/或由病原体所引起的损伤的能力。抗性可以是质量的或数量的。在实施例中，“抗性”植物对特异性病原体展现出减少的症状、基本上没有症状或甚至没有症状。在一些实施例中，“抗性”植物示出一些症状，但仍然能够以可接受的产量产生可销售产品，例如，与不存在病原体时的产量和/或生长相比，产量可能减少和/或植物可能发育不良。在实施例中，根据本发明的莴苣植物对至少根据SEXTET代码由IBEB(国际盘梗霉评估委员会(InternationalBremia Evaluation Board))表征和分类的莴苣盘梗霉小种Bl 16-36EU具有抗性。在实施例中，本发明的盘梗霉抗性莴苣植物在标准测试条件(例如，下面实例1中定义的测试条件，例如，当接种盘梗霉小种Bl 16-36EU中的任一者时)下展现出没有或只有很少的坏死以及没有或非常稀疏的孢子形成。在实施例中，本发明的盘梗霉抗性是显性的。在实施例中，盘梗霉抗性是定性的。在实施例中，本发明的盘梗霉抗性展现出单基因遗传。
术语“增强的盘梗霉抗性”(及类似术语)在本文中应理解为意指所述植物与不包含本发明的基因渗入序列的对照莴苣植物相比，对至少一种盘梗霉小种或分离株具有更强的抗性(例如，与不包含本发明的基因渗入序列的对照莴苣植物相比，盘梗霉抗性的统计学显著改善，在p<0.1、p<0.05或p<0.01处使用学生检验)和/或具有更广泛的盘梗霉抗性谱(例如，具有针对一种或多种额外的盘梗霉小种/分离株的抗性)。在实施例中，“增强的盘梗霉抗性”是指提供针对植物可能已经具有的一种或多种盘梗霉小种或分离株的额外抗性(即，抗性的叠加)，从而与缺乏所述基因渗入序列的植物相比，降低盘梗霉抗性被破坏的风险(即，作为抗性治理的一种形式)。
“对照莴苣植物”在本发明的范围内应理解为意指与本发明的莴苣植物相同物种的莴苣植物(例如，莴苣)，并且不具有与盘梗霉抗性连锁的本发明的基因渗入序列(例如，不具有本发明的基因渗入序列的亲本莴苣植物中的一种亲本莴苣植物)。在实施例中，对照莴苣植物具有与本发明的莴苣植物相同的遗传背景，并且任选地是属于不包含本发明的基因渗入序列的相同植物品种的植物。本文根据UPOV的定义理解植物品种。因此，对照莴苣植物可以是近等基因株系、近交株系或杂种，条件是它们具有与本发明的莴苣植物相同的遗传背景，除了该对照植物不具有与盘梗霉抗性连锁的本发明的基因渗入序列。使对照莴苣植物在与本发明的莴苣植物相同的条件下生长相同的时间长度。
术语“性状”是指特征或表型(例如，抗病性，诸如盘梗霉抗性)。性状可以是以显性或隐性方式或是以部分或不完全显性方式遗传的。在本发明的背景下，本发明的盘梗霉抗性是显性性状。因此，本发明的莴苣植物的性状可以是纯合的或杂合的。此外，性状可以是单基因的或多基因的，或者可以是由一种或多种基因与环境相互作用而产生的。在本发明的背景下，位于2号染色体上的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列展现出单基因遗传，并且足以赋予盘梗霉抗性性状。
术语“杂种”、“杂种植物”以及“杂种子代”是指由在基因上不同的亲本产生的个体(例如，在基因上是杂合的或主要是杂合的个体)。
术语“近交株系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交株系可以通过几个循环的兄弟/姐妹育种或自交或通过双单倍体产生来获得。
术语“双单倍体株系”是指由花药培养得出的稳定的近交株系。在特定培养基和环境中培养的一些花粉粒(单倍体)可以发育成含有n个染色体的小植物。然后使这些小植物“加倍”并且包含2n个染色体。这些小植物的子代称为“双单倍体”并且基本上不再分离(稳定的)。
术语“栽培品种”或“品种”是指与天然存在的品种不同的园艺产生品种。在本发明的一些实施例中，栽培品种或品种是具有商业价值的。
术语“遗传上固定的”是指已经稳定掺入通常不含遗传元件的植物基因组中的遗传元件。当遗传上固定时，遗传元件可以通过有性杂交以容易和可预测的方式传播给其他植物。
术语“植物”或“植物部分”在本文中是指可从根据本发明的植物获得的植物部分、器官或组织，包括但不限于叶、茎、根、花或花部分、果实、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、头、芯、细胞或组织培养物(包括愈伤组织培养物)，或植物的任何其他部分或产品。在实施例中，植物部分包含本发明的基因渗入序列。在实施例中，植物部分展现出根据本发明的盘梗霉抗性性状，特别是当生长成为产生莴苣叶和/或头的植物时。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物。
植物“种子”是生长成为根据实施例中任一项所述的植物的种子。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或经培养的细胞的形式，或作为高等组织化单元(例如像，植物组织、植物器官或全株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花芽或胚。
如本文使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。该术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。该术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
“加工食品”在本发明的范围内应理解为意指已经从其天然状态改变的食品。用于加工食品的方法包括但不限于切割、切片、切丁、碾磨、罐装、冷冻、冷藏、脱水、加热和无菌加工。
“鲜切市场”在本发明的范围内应理解为意指市场上经过最低限度加工的蔬菜。
如本文使用的，术语“标记等位基因”或“标记基因座的等位基因”(及类似术语)是指多态性基因座处的等位基因(如本文所定义)，其作为标记用于定位和/或指示对一个或多个表型性状的可变性有贡献的一个或多个遗传连锁的基因座(例如，盘梗霉抗性基因座)的存在。
如本文使用的，“标记基因座”是指染色体上包含存在于个体的基因组中并且与一个或多个感兴趣的基因座遗传上连锁的核苷酸或多核苷酸序列的区域，所述区域可能包含对性状有贡献的基因或任何其他遗传决定子或因子。“标记基因座”还指染色体上包含与基因组序列互补的多核苷酸序列(如用作探针的核酸的序列)的区域。标记基因座可用于追踪第二连锁基因座(例如编码或有助于表型性状表达的连锁基因座)的存在。例如，标记基因座可以用来监测在基因座(如QTL或单一基因)处的等位基因的分离，这些等位基因遗传地或物理地连锁至该标记基因座上。
如本文使用的，术语“育种”及其语法变体是指生成子代个体的任何过程。育种可以是有性的或无性的，或其任意组合。示例性非限制性育种类型包括杂交、自交、双单倍体衍生物生成及其组合。
如本文使用的，短语“建立的育种群体”是指由育种计划中的亲本产生和/或用作亲本的潜在育种配偶的集合；所述育种计划为例如商业育种计划。建立的育种群体的成员典型地在基因和/或表型方面得到充分表征。例如，可能已经评估感兴趣的几个表型性状，例如在不同的环境条件下、在多个位置和/或在不同的时间。可替代地或另外，可能已经鉴别一个或多个与表型性状的表达相关的遗传基因座，并且可能已经就该一个或多个遗传基因座方面以及就与该一个或多个遗传基因座相关的一个或多个基因标记方面对育种群体的一个或多个成员进行基因型分析。
如本文使用的，术语“二倍体”植物是指具有两组染色体的植物，典型地，一组来自它的两个亲本中的每一个亲本。然而，应理解在一些实施例中，二倍体植物可以从相同的单一生物体接收它的“母本”和“父本”组的染色体，如当植物自交以产生植物的继代时。
“纯合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应的基因座处的相同的等位基因。
“杂合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应的基因座处的不同的等位基因。
“显性”等位基因在本发明的范围内应理解为是指当以杂合或纯合状态存在时确定表型的等位基因。
“隐性”等位基因是指当仅以纯合状态存在时确定表型的等位基因。
“回交”在本发明的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本(“轮回”亲本)中的一个亲本重复往回杂交的方法。不同的轮回亲本可以被用在随后的回交中。
“基因座”在本发明的范围内应理解为是指染色体上包含对性状有贡献的基因或任何其他遗传元件或因子的区域。
“遗传连锁”在本发明的范围内应理解为是指由于基因在同一染色体上的位置邻近而引起的遗传特征关联性，通过基因座之间的重组百分比来测量(厘摩，cM)。
出于本发明的目的，术语“共分离”是指以下事实：针对性状的等位基因和针对一个或多个标记的一个或多个等位基因倾向于一起传递，这是因为它们在同一染色体上物理地紧靠在一起(即，它们之间的重组由于它们物理的邻近而减少)，导致它们的等位基因由于它们在同一染色体上的邻近而非随机关联。术语“与……相关联”可以以相同的含义使用。
如本文使用的，术语“数量/质量性状基因座处的基因构造”是指在统计学上与感兴趣的表型性状有关并且表示感兴趣的表型性状的潜在遗传基础的基因组区域。
如本文使用的，短语“基因标记”或“分子标记”是指个体的基因组中与一个或多个感兴趣的基因座相关联的特征(例如，存在于个体的基因组中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些实施例中，基因标记在感兴趣的群体中是多态性的，或基因座被多态性占据，这取决于上下文。基因标记包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(indel)(即，插入/缺失)、简单序列重复(SSR)、限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标记、多样性阵列技术(DArT)标记以及扩增片段长度多态性(AFLP)以及许多其他实例。基因标记可以例如用于对染色体上含有对一个或多个表型性状的可变性有贡献的等位基因的遗传基因座进行定位。短语“基因标记”还可以是指与基因组序列互补的多核苷酸序列，如用作探针的核酸的序列。在实施例中，“基因标记”可以物理地位于染色体上与它相关联的遗传基因座内部或外部(即，对应地是基因内的或基因外的)的位置。
如本文使用的，术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组基因标记的基因型”包括个体的单倍型中存在的一个或多个基因标记基因座的具体等位基因。如本领域中已知的是，基因型可以涉及单个基因座或多个基因座，无论这些基因座是相关还是不相关的，和/或是连锁还是非连锁的。在一些实施例中，个体的基因型涉及一个或多个相关的基因，因为所述一个或多个基因参与感兴趣的表型(例如，如本文定义的数量性状)的表达。因而，在一些实施例中，基因型包括个体内在一个或多个遗传基因座处存在的一个或多个等位基因。在一些实施例中，基因型以单倍型(也在本文定义)表示。
如本文使用的，术语“种质”是指群体或其他个体组(例如，物种)的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，一组植物，其充当各种等位基因的储存库。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料，例如，对于给定的环境或地理区域。这样，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。
“单倍型”是多个遗传基因座处个体的基因型，即等位基因的组合。典型地，定义单倍型的遗传基因座在物理和遗传上是连锁的，即沿着同一染色体区段的多个基因座。
如本文使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“使基因渗入(introgressing)”和“经基因渗入的(introgressed)”(及其语法变体)是指使一个或多个遗传基因座的所希望的等位基因或所希望的等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传送。例如，可以经由两个亲本之间的有性杂交将指定基因座处的所希望的等位基因传递给至少一个子代，其中亲本中的至少一个亲本在其基因组中具有所希望的等位基因(“供体”亲本)。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所希望的等位基因。包含所希望的等位基因的后代可以重复地与轮回亲本回交以产生具有所希望的遗传背景的品系，并且对于所希望的等位基因进行选择，其中结果是所希望的等位基因在所希望的遗传背景中变得固定。例如，与增强的盘梗霉抗性相关联的标记可以从供体亲本基因渗入到不包含基因渗入序列的轮回亲本中。得到的后代可以任选地与轮回亲本重复回交并选择，直到子代在轮回亲本背景中具有赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。
如本文使用的，术语“连锁”及其语法变体是指同一染色体上不同的基因座处的等位基因在它们的传递是单独的情况下倾向于比偶然所预期的更经常地一起分离，在一些实施例中是它们物理的邻近的结果。
如本文使用的，短语“核酸”是指可对应于核苷酸串的任何物理单体单元串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA、cDNA或RNA聚合物)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含对于生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等等。在一些实施例中，核酸可以是单链、双链、多链或其组合。除非另外指示，否则本发明披露的主题的特定核酸序列任选地包含和/或编码除了明确指示的任一序列以外的互补序列。
如本文使用的，术语“多数”是指多于一个。因此，“多数个体”是指至少两个个体。在一些实施例中，术语多数是指多于整体的一半。例如，在一些实施例中，“群体中的多数”是指多于那个群体的成员的一半。取决于上下文，术语“多个”的这些用法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
如本文使用的，术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后代。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自交(即，同一株植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。该一个或多个后代可以是任何世代，例如F1、F2或任何后续世代。
如本文使用的，短语“质量性状”是指受一个或几个展现大多数表型作用的基因控制的表型性状。因此，质量性状通常被简单地遗传。植物中的实例包括但不限于花色和几种已知的抗病性，例如像，本发明的盘梗霉抗性。
如本文使用的，短语“数量性状”是指能以数字描述(即，定量(quantitated/quantified))的表型性状。数量性状通常展现出群体的个体之间的连续变化；即，表型性状的数值差异很小，并且可以彼此分级。通常，数量表型性状的群体中的频率分布呈现钟形曲线(即，在两个极端之间呈现正态分布)。“数量性状”通常是遗传基因座与环境相互作用的结果，或多个遗传基因座彼此相互作用和/或与环境相互作用的结果。数量性状的实例包括植物高度和产量。
如本文使用的，术语“数量性状基因座”(QTL)和“标记性状关联”是指基因标记与影响感兴趣的性状表型的染色体区域和/或基因之间的关联。典型地，这是统计学确定的；例如，基于文献中公开的一种或多种方法。QTL可以是具有差异地影响表型性状(数量性状或质量性状)的至少两个等位基因的染色体区域和/或遗传基因座。
术语“受体植物”在本文中用于指示将接受从供体植物获得的DNA的植物，该供体植物包含感兴趣的性状(例如，盘梗霉抗性)的基因渗入序列。所述“受体植物”可能已包含或可能已不包含盘梗霉抗性的一个或多个天然序列或基因渗入序列，在这种情况下，该术语指示将在不同的基因座处接受另外的基因渗入序列的植物。
术语“天然遗传背景”在本文中用于指示感兴趣的基因序列的原始遗传背景。例如，这样的遗传背景可以是野生种质的基因组。例如，在毒莴苣植物的2号染色体上的具体位置处发现了本发明的基因序列。相反，经由例如育种，涉及将包含该基因序列的DNA从例如毒莴苣植物的2号染色体转移到另一种莴苣物种(例如，莴苣)的2号染色体上的相同位置的方法，将导致该基因序列不在其天然遗传背景中。当本发明的基因序列从毒莴苣背景转移到另一种莴苣物种(例如，莴苣)时，它们被称为“基因渗入序列”或“基因渗入基因序列”(或类似术语)。
“供体植物”在本发明的范围内应理解为意指提供增强的盘梗霉抗性的至少一个序列(即，待基因渗入到受体植物中)的植物。
“基于标记的选择”在本发明的范围内应理解为是指例如使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中核酸与所希望的性状相关联，以鉴定携带赋予所希望的(或不希望的)性状的等位基因的植物，使得在选择性育种计划中可以使用(或避免)那些植物。
单核苷酸多态性(SNP)是DNA中单个位点的变异，是基因组中最常见的变异类型。SNP是当基因组(或其他共有序列)中的单个核苷酸—A、T、C或G—在生物物种的成员或个体的成对染色体之间不同时发生的DNA序列变异。例如，来自不同个体的两个测序的DNA片段，AAGCCTA至AAGCTTA，含有单个核苷酸的差异。在这种情况下，存在两个等位基因：C和T。SNP阵列的基本原理与DNA微阵列相同。这些是DNA杂交、荧光显微镜法和DNA捕获的融合。SNP阵列的三个组分是：包含核酸序列(例如，扩增的序列或靶标)的阵列，一个或多个标记的等位基因特异性寡核苷酸探针，以及记录并解释杂交信号的检测系统。所希望的等位基因的存在或不存在可以例如通过使用双链DNA染料的实时PCR或荧光报告探针法来确定。
“PCR(聚合酶链反应)”在本发明的范围内应理解为是指产生基因组的DNA或一个或多个子集的相对较大量的具体区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。
“PCR引物”在本发明的范围内应理解为是指DNA的具体区域的PCR扩增中所使用的相对较短的单股DNA片段。
“表型”在本发明的范围内应理解为是指在基因上控制的性状的一个或多个可区分的特征。
如本文使用，短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组、蛋白质组和/或代谢组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。
“多态性”在本发明的范围内应理解为是指一个群体中存在两种或更多种不同形式的基因、基因标记或遗传性状或例如通过可替代的剪接、DNA甲基化等可获得的基因产物。
如本文使用的“探针”是指能够识别并且结合于具体靶分子或细胞结构并且因而允许靶分子或结构的检测的一组原子或分子。在实施例中，“探针”是指可以用于通过分子杂交来检测互补序列的存在并且对其定量的经过标记的DNA或RNA序列。
如本文使用的，短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本发明披露的主题的上下文中是指配子融合以产生子代(例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子)。“有性杂交”或“异体受精”在一些实施例中是一个个体被另一个体受精(例如，植物中的异花授粉)。
“选择性育种”在本发明的范围内应理解为是指使用具有或显示令人希望的性状的植物作为亲本的育种程序。
术语“自交”在一些实施例中是指通过自体受精或自花授粉产生种子；即花粉和胚珠来自同一株植物。
“测试”植物在本发明的范围内应理解为是指用于在基因上表征待测试的植物中的性状的茄(Solanum)属植物。典型地，使待测试的植物与“测试”植物杂交，并且对杂交子代中的性状的分离比率进行评分。
如本文使用的术语“杂交”是指常规的杂交条件，优选地是指以下杂交条件，即：使用5x SSPE、1％ SDS、1x登哈特溶液(Denhardts solution)作为溶液和/或杂交温度在35℃与70℃之间，优选地65℃。杂交后，优选地首先用2x SSC、1％ SDS并且随后用0.2x SSC在35℃到75℃之间的温度下、特别地在45℃到65℃之间、但尤其在59℃下进行洗涤(关于SSPE、SSC和登哈特溶液的定义，参见上述引文中的Sambrook等人)。如例如上文Sambrook等人所述的高严格杂交条件是特别优选的。如果如上所述地在65℃发生杂交和洗涤，则例如存在特别优选的严格杂交条件。例如杂交和洗涤在45℃下进行的非严格杂交条件是不太优选的并且在35℃下是更不太优选的。
根据本发明，术语“对应于位置X的所述位置”(X是在本申请的相应上下文中可找到的任何数字)不仅包括随后提及的SEQ ID NO中的相应位置，还包括编码本发明的基因序列的任何序列，其中，在与参考SEQ ID NO比对之后，相应位置可能具有不同的数字，但对应于参考SEQ ID NO所指示的数字。可以通过应用本领域技术人员已知的各种比对工具来实现基因序列的比对。
在核酸杂交实验(如DNA杂交和RNA杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”Elsevier[爱思唯尔集团],纽约。通常，对于在限定的离子强度和pH值下的具体序列，高严格杂交和洗涤条件被选择为比热熔点低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与其靶子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
热熔点是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH值下)。非常严格条件被选择为等于特定探针的熔融温度(Tm)。针对互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实例是具有1mg肝素的50％甲酰胺、在42℃下、将该杂交过夜进行。高严格洗涤条件的实例是0.15M NaCl，在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下，0.2x SSC洗涤，持续15分钟(关于SSC缓冲液的说明，参见Sambrook，下文)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对例如超过100个核苷酸的双链体进行中等严格洗涤的实例是在45℃下，1x SSC，持续15分钟。对例如超过100个核苷酸的双链体进行低严格洗涤的实例是在40℃下，4-6x SSC，持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，并且温度典型地是至少约30℃。通过加入去稳定剂如甲酰胺也可以实现严格条件。通常，在具体的杂交测定中，信噪比是针对非相关的探针所观测到的2倍(或更高)指示检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性而生成核酸拷贝时，发生这种情况。
植物、种子、产物。
在第一实施例中，本发明提供了一种对莴苣盘梗霉(例如，与对照植物相比)具有增强的抗性的莴苣植物(例如，莴苣植物)，所述植物包含来自毒莴苣的基因渗入序列，所述基因渗入序列赋予对莴苣盘梗霉的抗性，其中所述基因渗入序列包含在毒莴苣种质(例如，登录号CGN23091)或保藏的莴苣品系18LEN002364中，并且其中所述基因渗入序列位于2号染色体上。在实施例中，抗性是定性抗性。在实施例中，抗性是定性抗性。在实施例中，抗性展现出单基因遗传。
在实施例中，本发明的植物是栽培植物，任选地栽培莴苣植物。
在实施例中，所述基因渗入序列赋予至少针对莴苣盘梗霉小种Bl16-36EU的抗性。
在实施例中，基因渗入序列包含本文表3中所示的SNP标记中的一者或多者。在实施例中，基因渗入包含以下SNP标记中的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者或所有四者：
a)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型。
在另一个实施例中：
a)标记SL1831的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ ID NO:3；
b)SNP标记SL1847的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10，以及探针SEQ ID NO:8；
c)SNP标记SL1887的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ ID NO:13；以及
d)SNP标记SL1883的所述C基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20，以及探针SEQ ID NO:18。
在代表性实施例中，本发明的植物包含至少以下SNP标记(每个单独的标记以杂合或纯合形式存在)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；
·SL1883和SL1887；
·SL1831、SL1847和SL1883；
·SL1831、SL1847和SL1887；
·SL1847、SL1883和SL1887；或者
·SL1831、SL1847、SL1883和SL1887。
例如，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
在代表性实施例中，基因渗入序列包含以下的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者或所有四者：SEQ ID NO:1，其具有由112位的核苷酸G表示的抗性标记等位基因；SEQID NO:6，其具有由112位的核苷酸A表示的抗性标记等位基因；SEQ ID NO:11，其具有由99位的核苷酸G表示的抗性标记等位基因；和/或SEQ ID NO:16，其具有由41位的核苷酸C表示的抗性标记等位基因；或序列，所述序列与前述序列中的一者或多者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含抗性标记等位基因。
在另一个实施例中，本发明提供了根据本文所述的实施例中任一项所述的植物，其中所述植物包含至少一个拷贝(例如，是杂合的)的所述赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。
在另一个实施例中，本发明提供了根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物包含两个拷贝(例如，所述植物是纯合的)的所述赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。
在另一个实施例中，根据本发明的植物是近交、双单倍体或杂种植物。
在实施例中，本发明提供了保藏的莴苣品系18LEN002364的植物。
在另一个实施例中，本发明提供了产生根据本发明的植物的种子。
在另一个实施例中，本发明提供了由根据本发明的植物产生的种子。
在另一个实施例中，本发明的莴苣植物是根据本文所述的任何实施例所述的莴苣植物，其中莴苣品系18LEN002364或其子代或祖先是所述赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的来源。
在另一个实施例中，本发明的莴苣植物是根据前述实施例中任一项所述的莴苣植物，其中毒莴苣登录号CGN23091或其子代或祖先是所述赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的来源。
在另一个实施例中，本发明的莴苣植物是根据前述实施例中任一项所述的莴苣植物，其中所述植物通过使毒莴苣登录号CGN23091或莴苣18LEN002364或其子代或祖先与不含有所述赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的莴苣植物杂交来获得。
另一个实施例提供了可从根据前述实施例中任一项所述的莴苣植物获得的植物部分、器官或组织，包括但不限于叶、芯、头、茎、根、花或花部分、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产品。在实施例中，植物部分、器官或组织包含赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。在实施例中，植物部分、器官或组织展现出根据本发明的盘梗霉抗性，特别是当生长成为产生莴苣头和/或叶的植物时。
在另一个实施例中，设想了根据前述实施例中任一项所述的莴苣植物、植物部分或种子用于产生并任选地收获莴苣头和/或叶的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明的任何实施例所述的莴苣植物、植物部分或种子的用途，其中莴苣植物、植物部分或种子是莴苣18LEN002364或其子代或祖先。
在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明的实施例中任一项所述的莴苣植物、植物部分或种子用于播种田地、温室或塑料大棚的用途。
在另一个实施例中，根据本发明的植物是雄性不育的。
在另一个实施例中，根据本发明的植物生长成熟的莴苣头和/或叶。
在一个实施例中，本发明提供了由根据本发明的实施例中任一项所述的莴苣植物产生的莴苣叶和头。
本发明进一步涉及莴苣植物种子，特别是栽培莴苣植物种子(例如，莴苣种子)，其生长成为根据本发明的实施例中任一项所述的莴苣植物。
本发明进一步涉及根据实施例中任一项所述的莴苣植物将本发明的盘梗霉抗性性状引入(例如，基因渗入)到缺乏所述盘梗霉抗性性状的莴苣植物(例如，莴苣植物)中的用途。
基因序列、标记。
本发明进一步涉及指导或控制莴苣植物中盘梗霉抗性性状的表达的基因序列。在另一个实施例中，本发明的基因序列位于2号染色体上。在本发明的另一个实施例中，基因序列可从供体植物获得，该供体植物具有莴苣18LEN002364或其子代或祖先的遗传背景，并且包含所述基因序列。
在另一个实施例中，本发明的基因序列与一个或多个标记基因座遗传地或物理地连锁，所述一个或多个标记基因座与盘梗霉抗性性状共分离。
在另一个实施例中，本发明的所述基因序列由如表3中所述的一个或多个SNP标记来表征，例如包含以下的SNP标记SL1831、SL1847、SL1883和SL1887中的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者或所有四者：
a)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型。
在代表性实施例中：
a)标记SL1831的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ ID NO:3；
b)SNP标记SL1847的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10，以及探针SEQ ID NO:8；
c)SNP标记SL1887的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ ID NO:13；以及
d)SNP标记SL1883的所述C基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20，以及探针SEQ ID NO:18。
在另一个实施例中，本发明披露了用于检测(例如，通过基因分型)在莴苣植物(任选地，栽培L.sativa莴苣植物)中的本发明的盘梗霉抗性性状基因座的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自以下的至少一种PCR寡核苷酸引物对和探针：
i.由正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5表示的引物对，以及探针SEQID NO:3；
ii.由正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10表示的引物对，以及探针SEQ ID NO:8；
iii.由正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15表示的引物对，以及探针SEQ ID NO:13；和/或
iv.由正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20表示的引物对，以及探针SEQ ID NO:18。
本发明还披露了根据本发明的SNP标记用于在莴苣植物，特别是栽培莴苣植物(例如，莴苣)中进行盘梗霉抗性性状基因座的诊断性选择和/或基因分型的用途
本发明进一步披露了这些DNA标记中的一些或全部标记用于鉴定在莴苣植物(特别是栽培莴苣植物，更特别是根据本发明的L.sativa莴苣植物)中盘梗霉抗性性状基因座的存在和/或用于监测盘梗霉抗性性状基因座基因渗入莴苣植物(特别是栽培莴苣植物，特别是根据本发明的且如本文所述的L.sativa莴苣植物)的用途。
本发明进一步披露了可在涉及本文所披露的以下至少一种寡核苷酸引物的PCR反应中获得的多核苷酸(扩增产物)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:20，并且分别与探针SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:SEQ ID NO:18反应。本发明还提供了可在涉及选自以下的PCR寡核苷酸引物对的PCR反应中获得的多核苷酸(扩增产物)：SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15；或SEQID NO:17和SEQ ID NO:20，并且分别与探针SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:SEQ ID NO:18反应。
本文还考虑了与所述扩增产物的序列具有至少90％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％序列同一性的多核苷酸，和/或展现出与可在上述PCR反应中获得的所述扩增产物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
在实施例中，扩增产物对应于使用可从包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的莴苣18LEN002364或其子代或祖先获得的相同引物/引物对的扩增产物，或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
根据本发明和本文所述的扩增产物可用于产生或开发可用于鉴定本发明的盘梗霉抗性性状基因座的新引物和/或探针。
因此，在一个实施例中，本发明进一步涉及衍生的标记，特别是衍生的引物或探针，其由根据本发明的且如本文所述的扩增产物并且通过本领域已知的方法开发，这些衍生的标记与盘梗霉抗性性状基因座遗传连锁。
育种方法。
本发明还提供了一种用于产生对莴苣盘梗霉(例如，与对照相比)具有增强的抗性的莴苣植物的方法。在实施例中，所述方法包括：
a)使根据本发明的第一莴苣植物(例如，莴苣植物，特别是栽培莴苣植物)与缺乏本发明的赋予对莴苣盘梗霉的抗性的基因渗入序列的第二莴苣植物杂交，以产生子代植物；以及
b)选择包含赋予对莴苣盘梗霉的抗性的所述基因渗入序列的子代植物；
从而产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的植物。
在实施例中，所述选择步骤包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记中的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者或所有四者：
i)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型。
在实施例中，第一莴苣植物是栽培莴苣植物。在实施例中，第一莴苣植物是莴苣植物。在实施例中，第二莴苣植物是莴苣植物。
在根据本发明的方法的实施例中，所述方法包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记(每个单独的标记以杂合或纯合形式存在)处的抗性相关联的基因型(如本文所述)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；
·SL1883和SL1887；
·SL1831、SL1847和SL1883；
·SL1831、SL1847和SL1887；
·SL1847、SL1883和SL1887；或者
·SL1831、SL1847、SL1883和SL1887。
例如，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
在另一个实施例中，本发明涉及本文所述的实施例中任一项所述的方法，其中步骤a)的第一莴苣植物是包含本发明的基因渗入序列的毒莴苣登录号CGN23091或其子代或祖先，并且第二莴苣植物缺乏赋予对莴苣盘梗霉的抗性的本发明的基因渗入序列。
在另一个实施例中，本发明涉及本文所述的实施例中任一项所述的方法，其中步骤a)的第一莴苣植物是包含本发明的基因渗入序列的莴苣18LEN002364或其子代或祖先，并且第二莴苣植物缺乏赋予对莴苣盘梗霉的抗性的本发明的基因渗入序列。
在实施例中，根据本发明的实施例中任一项，所述方法进一步包括：
c)使所选择的子代植物自交或与另一莴苣植物杂交，以产生另外的子代。在实施例中，选择另外的子代，并且再自交/杂交2代至10代。
作为另一个实施例，本发明提供了一种用于产生对莴苣盘梗霉(例如，与对照植物相比)具有增强的抗性的F1杂种莴苣植物的方法，所述方法包括使本发明的近交(包括双单倍体)莴苣植物与不同的近交莴苣植物杂交，以产生F1杂种子代。根据该方法，第二莴苣植物可以包含或不包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。
在实施例中，第一莴苣植物是栽培莴苣植物。在实施例中，第一莴苣植物是莴苣植物。在实施例中，第二莴苣植物是莴苣植物。
选择方法。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于鉴定对莴苣盘梗霉具有抗性并且包含至少一个拷贝的本发明的基因渗入序列(即，植物是杂合或纯合的)莴苣植物的方法，所述方法包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记中的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者或所有四者的步骤：
a)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而鉴定对莴苣盘梗霉具有抗性的莴苣植物。
在实施例中，植物是栽培植物(例如，栽培莴苣)。
在实施例中，进一步包括选择包含所述一个或多个SNP标记的莴苣植物，并且使所选择的莴苣植物与第二莴苣植物杂交，以产生包含一个或多个分子标记并且对莴苣盘梗霉具有抗性(例如，包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列)的子代莴苣植物。在实施例中，第二莴苣植物与所选择的莴苣植物不同。在实施例中，第二莴苣植物是莴苣。在实施例中，第二莴苣植物不包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列。在实施例中，第二莴苣植物确实包含所述基因渗入序列。
在另一个实施例中，本发明涉及鉴定包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的莴苣植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供盘梗霉抗性性状分离的群体；
b)从分离群体筛选出展现出对盘梗霉的抗性的成员，其中所述性状可以通过本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的存在来鉴定；以及
c)选择分离群体中的一个成员，其中所述成员包含盘梗霉抗性性状。
在另一个实施例中，本发明涉及鉴定包含本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的莴苣植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供盘梗霉抗性性状分离的群体，
b)从分离群体筛选出展现出对盘梗霉的抗性的成员，其中所述性状可以通过本发明的赋予盘梗霉抗性的基因渗入序列的存在来鉴定，其中本发明的所述基因渗入序列可以通过检测(例如，通过基因分型)在标记SL1831、SL1847、SL1883和/或SL1883(如本文所述)处的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或所有四个盘梗霉抗性相关联的等位基因来鉴定；以及
c)选择分离群体中的一个成员，其中所述成员包含盘梗霉抗性性状。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于鉴定包含在2号染色体上的基因渗入序列的莴苣植物(例如，莴苣，特别是栽培莴苣)的方法，其中所述基因渗入序列赋予对盘梗霉的抗性，所述方法包括：
a)提供盘梗霉抗性分离的群体；
b)使用检测(例如，通过基因分型)以下的试剂盒来筛选所述群体：
i)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
c)鉴定包含(b)的基因型中的一者或多者的植物。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于鉴定2号染色体上的盘梗霉抗性的野生莴苣来源的方法，其包括：
a)提供一个野生莴苣种质或多个野生莴苣种质；
b)使用检测(例如，通过基因分型)以下的试剂盒来筛选所述莴苣种质或多个野生莴苣种质：
i)SEQ ID NO:1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO:6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO:11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO:16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；和
c)鉴定包含(b)的基因型中的一者或多者的野生莴苣种质。
在又一个实施例中，本发明涉及从根据前述实施例中任一项所述的莴苣植物的基因组(优选地从莴苣18LEN002364或其子代或祖先的基因组)通过用以下寡核苷酸引物对进行PCR扩增来扩增的DNA标记的用途：正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ ID NO:3；正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10，以及探针SEQ ID NO:8；正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ ID NO:13；或正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20，以及探针SEQ ID NO:18，其中所述DNA片段指示在莴苣植物中的盘梗霉抗性性状的存在，以鉴定包含并展现出盘梗霉抗性性状的莴苣植物。
在根据本发明的方法的实施例中，所述方法包括检测(例如，通过基因分型)以下SNP标记(每个单独的标记以杂合或纯合形式存在)处的抗性相关联的基因型(如本文所述)：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；
·SL1883和SL1887；
·SL1831、SL1847和SL1883；
·SL1831、SL1847和SL1887；
·SL1847、SL1883和SL1887；或者
·SL1831、SL1847、SL1883和SL1887。
例如，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
用途
本发明还涉及可从根据本发明的实施例中任一项所述的莴苣植物获得的盘梗霉抗性-繁殖材料用于生长莴苣植物以产生盘梗霉抗性莴苣植物、种子、头和/或叶的用途，其中所述盘梗霉抗性可在标准测定，特别是如下面实例1中所述的测定中评估。
在实施例中，本发明提供了一种产生莴苣种子的方法，所述方法包括从根据权利要求13所述的种子生长莴苣植物，并且允许植物产生另外的莴苣种子，并且任选地收集种子。
本发明还涉及可从根据本发明的实施例中任一项所述的莴苣植物获得的盘梗霉抗性-繁殖材料用于产生莴苣头和/或叶的用途。
本发明还考虑了与其他基因序列(例如，WO 2011/003783中披露的那些基因序列)相关联的本发明的盘梗霉抗性基因序列的用途，所述其他基因序列与盘梗霉抗性相关联。
基于本发明的描述，拥有如本文所述的莴苣18LEN002364或其子代或祖先(包含所述基因渗入基因序列)的技术人员使用本领域熟知的育种技术(例如，利用本文所披露的SNP标记基因座)能毫无困难地将本发明的所述基因渗入基因序列转移到其他各种类型的莴苣植物中。
种子保藏信息
申请人已于2020年6月12日由NCIMB(NCIMB有限公司，弗格森建筑，克莱伯斯通庄园，巴克斯本，阿伯丁AB21 9YA，苏格兰(NCIMB Limited,Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,Scotland))将莴苣品系18LEN002364的至少2500粒种子保藏在NCIMB登录号NCIMB 43625下。
申请人选择专家解决方案，并要求根据EPC第32(1)条或其他国家或条约的相应法律和规则(专家证人条款)仅向专家发布保藏的材料，直到专利授权的提及公布为止，或者如果申请被驳回、撤回或者视为撤回的，自申请日起20年。
莴苣品系18LEN002364的该保藏品将保存在NCIMB保藏库(其是公共保藏库)中，保存期是30年，或在最近一次请求后5年，或专利的有效期限，以较长者为准，并且如果任何保藏的种子在此期间变得无法存活，则将被替换。此外，申请人已经满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品活力的指示。在本申请未决期间，专员应要求可获得该保藏品。在公布关于该品种的专利后，通过提供由NCIMB保藏的该品种的至少2500粒种子的获得，所述品种将不可撤销且不受限制地向公众发布。申请人对从NCIMB获得保藏的材料没有施加限制；然而，诸位申请人无权免除法律在转移生物材料或其在商业上的运输方面所施加的任何限制。申请人不免除对根据本专利或任何植物品种保护权利(例如，美国植物品种保护法，7USC§2321及以下等等)授予的其权利的任何侵犯。
现在将参考以下实例描述本发明。本领域技术人员应理解的是，这些实例并非将权利要求书的范围限于本发明，反而旨在成为某些实施例的示例。本发明的其他实施例可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行实践，其范围是由本披露和所附权利要求书限定的。
实例
实例1.对于莴苣盘梗霉的疾病测试
莴苣盘梗霉疾病测试在具有高湿度的气候室中进行。昼长是16小时，并且在白天期间，温度是18℃，并且相对湿度(RH)是约85％。在夜间，温度是15℃，并且RH是约100％。在测试的接种之前，盘梗霉病原体的孢子在对特异性分离株敏感的品种上繁殖。使用各种盘梗霉分离株和小种执行盘梗霉抗性的疾病测试。
盘梗霉分离株根据C组Sextet代码由IBEB(国际盘梗霉评估委员会；参见表1)进行表征和分类。
表1.盘梗霉小种Bl：16-36EU对IBEB C组的差异的反应
小种 Sextet代码 小种 Sextet代码 小种 Sextet代码
Bl:16EU 19-00-00 Bl:24EU 50-02-00 Bl:32EU 27-00-04
Bl:17EU 45-17-00 Bl:25EU 50-01-00 Bl:33EU 62-07-06
Bl:18EU 50-00-00 Bl:26EU 51-03-00 Bl:34EU 54-15-01
Bl:20EU 51-00-00 Bl:27EU 47-38-00 Bl:35EU 62-15-06
Bl:21EU 27-01-00 Bl:29EU 62-07-00 Bl:36EU 55-15-01
Bl:22EU 46-32-00 Bl:30EU 46-06-02
Bl:23EU 19-02-00 Bl:31EU 39-12-02  
在接种测试材料之前，收获具有孢子的叶并且用水从叶冲洗掉孢子。将孢子悬浮液的浓度调节至每ml 100,000个孢子。将孢子悬浮液喷洒在1周龄的植物上(子叶上)。接种之后七天至10天可进行观察/选择。通常，易感植物的子叶被孢子完全覆盖。取决于所使用的盘梗霉分离株，抗性植物的子叶将不会示出坏死或示出低水平坏死，具有或不具有稀疏孢子形成。
实例2.含有来自野生毒莴苣的盘梗霉抗性的莴苣的育种历史
发明人确定，野生毒莴苣登录号CGN23091对莴苣盘梗霉具有广谱抗性，指定为“SG01”抗性。进行第一回交循环以将来自野生毒莴苣种质的SG01盘梗霉抗性引入易感莴苣。然后回交到莴苣Dm0栽培品种中，自交，以及再进行四轮回交，并且最后进行三次自交。将得到的品系指定为18LEN002364，并于2020年6月12日由NCIMB保藏在保藏号NCIMB 43625下。保藏的B6F4育种品系的完整育种历史如下表2中所示。该品系针对来自野生毒莴苣来源的盘梗霉抗性进行固定，即品系18LEN002364包含在纯合状态下的来自野生毒莴苣种质的赋予SG01盘梗霉抗性的基因渗入序列。
表2.具有来自赋予莴苣盘梗霉(霜霉病)抗性的毒莴苣的基因渗入的B6F4莴苣的育种历史
Figure BDA0004038302020000391
Figure BDA0004038302020000401
实例3.对从野生毒莴苣转移到莴苣的盘梗霉抗性进行表型
实例2中所述的莴苣B6F4品系包含来自野生毒莴苣登录号CGN23091的、包含SG01盘梗霉抗性基因座的基因渗入，并且已经证明了针对莴苣盘梗霉的所有经测试的小种和分离株的抗性。
在至少六年的时间里，SG01抗性已经针对约400种野外分离株(field isolate)进行了测试，并且已经提供了针对所有评估的分离株的保护。此外，SG01抗性还针对所有当前的官方欧洲盘梗霉分离株(Bl:16-36EU)进行保护。
由SG01赋予的对前述莴苣盘梗霉分离株和小种的抗性是快速、高水平抗性，在植物中没有可观察到的坏死。此外，抗性表征为显性的(在杂合子和纯合子两者中均观察到高抗性)、分离是单基因的，并且性质上是定性的。
实例4.SG01盘梗霉抗性是固定的,并且在其他遗传背景下进行保护
来自毒莴苣登录号CGN23091的SG01盘梗霉抗性已从如上表1中所示的BC6和后代进行固定。SG01抗性已成功转移到其他莴苣遗传背景中。使保藏的品系进一步回交到商业奶油莴苣品种中，然后进行最后两次自交。将高代回交品系用作来源，以将盘梗霉抗性引入多个莴苣片段(包括幼叶、多叶、长叶莴苣、卷心莴苣以及室内和室外奶油莴苣)。在育种过程的每个步骤，测试选择用于下一代的植物(通过基因分型和表型)，并且确认针对一组盘梗霉分离株的抗性的存在。针对所测试的分离株的子集以及在所有遗传背景和所评估的所有环境条件下，维持快速且高水平的定性盘梗霉抗性。这些结果证实了SG01抗性的可遗传的遗传基础。
实例5.对来自毒莴苣的SG01盘梗霉抗性基因座进行作图和基因分型
来自毒莴苣的SG01盘梗霉抗性基因渗入已经回交到莴苣Dm0栽培品种中，直至B6代(上表1)。B6品系已经显示出在野外条件下具有盘梗霉抗性(实例2)，不存在连锁累赘。
材料与方法
A：测定开发
步骤1：微阵列开发
开发了由散布在莴苣基因组上的2500个SNP组成的阵列。通过比较不同片段(包括巴达维亚莴苣(batavia)、奶油莴苣、直立莴苣、卷心莴苣和多叶)上的一组17种莴苣品种/种质的简化测序获得的序列来鉴定变体。
该阵列用于对回交(BC)品系和从盘梗霉程序衍生的轮回亲本进行指纹分析。
步骤2：指纹识别：基因渗入的鉴定
指纹识别筛选指示BC品系(CGN23091:B7F2)与轮回亲本具有96％至98％同一性。SG01盘梗霉抗性与在从CGN23091衍生的BC品系中发现的基因渗入区域相关联。
使用参考莴苣v5物理图谱(Reyes-Chin-Wo等人，2017年《自然·通讯》((2017)Nat.Commun.)8,14953)，在连锁群2上从4119137bp位到37019114bp位的基因渗入大小的第一次估计为33MB。该区域与携带Dm3的主要抗性基因簇共定位，但SG01是不同于Dm3的基因座并且具有不同的抗性谱。
步骤3：2号染色体SG01盘梗霉抗性特异性标记的开发
使用下一代测序(Mardis，(2008)Annual Review of Genomics and HumanGenetics)[2008年基因组学与人类遗传学年度回顾]9:387，对轮回Dm0亲本和一组商业品种以及在2号染色体上携带盘梗霉抗性基因渗入的野生毒莴苣种质进行全基因组DNA测序(WGS)或简化基因组测序(RGS)。
与参考莴苣v5序列和轮回易感Dm0亲本的比对鉴定了连锁群2(LG2)上4119137nt到10787672nt之间的147,465个变体。此外，94,376个变体反映了在感兴趣的基因渗入区域内在易感Dm0轮回亲本与抗性回交品系之间的不同等位基因状态。
步骤4：作图和精细作图
选择来自步骤3的、在SG01基因渗入中在抗性回交品系与易感DM0轮回亲本之间具有不同等位基因状态的变体，并且将其转换为TaqmanTM PCR测定以检测SNP。与用于盘梗霉抗性的表型互补，使用标记来测试来自轮回Dm0亲本的大CGN23091 B7F4群体(295个个体)。从37个假定的SNP候选物中，如通过
Figure BDA0004038302020000422
计算的，两个SNP，SL1847和SL1831，显示出与盘梗霉抗性的100％共分离(表3)。SNP标记SL1883和SL1887也与抗性密切连锁。通过使用由来自表3的2个或更多个标记组成的单倍型，例如，在距抗性基因座约1cM距离内(例如，SL1887、SL1883、SL1847和SL1831标记中的任意两者或任意三者，或这些标记中的所有四者)，可以进一步增加标记的特异性。
这些标记可以单独使用或以任意组合使用，以鉴定包含SG01盘梗霉抗性的莴苣植物，以跟踪抗性以基因渗入新品系等中。例如，标记SL1883和SL1887可以一起使用，任选地加入其他标记。作为另一个示例性说明，标记SL1847和SL1887可以组合使用，任选地加入其他标记。
表3.遗传图谱
Figure BDA0004038302020000421
Figure BDA0004038302020000431
SNP标记SL1831、SL1847、SL1883和SL1887的物理位置，以及用于检测这些SNP的PCR引物/探针如下所示：
LG2上的9490680bp处的SNP SL1831(基于参考莴苣v5序列)
靶序列(SEQ ID NO:1):
Figure BDA0004038302020000441
>抗性等位基因：G
>引物正向(下划线)
AGATACAGGGCAGGGAGGAATG(SEQ ID NO:2)
>探针(双下划线)
检测抗性等位基因：ACCCTTCCCGGAGGA(SEQ ID NO:3)
检测易感等位基因：CAACCCTTCCTGGAGG(SEQ ID NO:4)
>引物反向(下划线)
TGATGTGGATGGCTTCATGGAAT(SEQ ID NO:5)
LG2上的8893684bp处的SNP SL1847(基于参考莴苣v5序列)
靶序列(SEQ ID NO:6):
Figure BDA0004038302020000442
>抗性等位基因：A
>引物正向(下划线)
CGCAGTGAAAGCCTTGGAGAT(SEQ ID NO:7)
>探针(双下划线)
检测抗性等位基因：TGCCTTTGTGGAATCATTT(SEQ ID NO:8)
检测易感等位基因：CCTTTGTGGAACCATTTC(SEQ ID NO:9)
>引物反向(下划线)
CACTTGATGGTGTAGAGGTGGA(SEQ ID NO:10)
LG2上的9514233bp处的SL1887(基于参考莴苣v5序列)
靶序列(SEQ ID NO:11)
Figure BDA0004038302020000443
>抗性等位基因：G
>引物正向(下划线)
GCATGAGACAGCTCGAAGAGT(SEQ ID NO:12)
>探针(双下划线)
检测抗性等位基因：CCTTCGATGACGATGATG(SEQ ID NO:13)
检测易感等位基因：TCCTTCGATGATGATGATG(SEQ ID NO:14)
>引物反向(下划线)
TGAGGCAAGACCACAACC(SEQ ID NO:15)
LG2上的8857531bp处的SL1883(基于参考莴苣v5序列)
靶序列(SEQ ID NO:16)
Figure BDA0004038302020000451
>抗性等位基因：C
>引物正向(下划线)
ACGACCTGGCCCAACATTCC(SEQ ID NO:17)
>探针(双下划线)
检测抗性等位基因)：TGAACCACCCGACTG(SEQ ID NO:18)
检测易感等位基因：TGAACCACCAGACTGG(SEQ ID NO:19)
>引物反向(下划线)
GTACCCGACTAAATTGCCCAAA(SEQ ID NO:20)
上文的信息总结在下表4中：
表4.
Figure BDA0004038302020000452
Figure BDA0004038302020000461
1在杂合子和纯合子两者中均存在抗性
虽然已经参考某些实施例的具体细节描述本发明，但不希望此类细节被视为对要求保护的本发明范围的限制，除非它们被包括在所附权利要求书中或到它们被包括在所附权利要求书中的程度。
                         序列表
<110>  Syngenta Crop Protection AG
de Lange, Michel  Norbert Alexander
Lokossou, Anoma Akuvi
<120>  莴苣盘梗霉抗性SG01
<130>  82134-EP-REG-ORG-X-1
<160>  20
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  155
<212>  DNA
<213>  莴苣（Lactuca sativa）
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (2)..(2)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (51)..(51)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (90)..(90)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (101)..(101)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (112)..(112)
<223>  r是A或G
<400>  1
tntaaagatt agatacaggg cagggaggaa tgcctttgag ataaatgagg ngatcgacag      60
tgtcatgaga cgatacaaag agatcaaccn ggcagatcat ncaattcctc crggaagggt     120
tgattccatg aagccatcca catcaacacc atcag                                155
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  2
agatacaggg cagggaggaa tg                                               22
<210>  3
<211>  15
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  3
acccttcccg gagga                                                       15
<210>  4
<211>  16
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  4
caacccttcc tggagg                                                      16
<210>  5
<211>  23
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  5
tgatgtggat ggcttcatgg aat                                              23
<210>  6
<211>  157
<212>  DNA
<213>  莴苣（Lactuca sativa）
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (101)..(101)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (104)..(104)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (112)..(112)
<223>  r是A或G
<400>  6
ggtacacgct cgcagtgaaa gccttggaga taactcagga gatcgatcat gccatgaaac      60
aactctctca gatagaatgg actgatgatt cagttccttt nggnagaaat grttccacaa     120
aggcatccac ctctacacca tcaagtgatt acaatga                              157
<210>  7
<211>  21
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  7
cgcagtgaaa gccttggaga t                                                21
<210>  8
<211>  19
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  8
tgcctttgtg gaatcattt                                                   19
<210>  9
<211>  18
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  9
cctttgtgga accatttc                                                    18
<210>  10
<211>  22
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  10
cacttgatgg tgtagaggtg ga                                               22
<210>  11
<211>  138
<212>  DNA
<213>  莴苣（Lactuca sativa）
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (41)..(41)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (62)..(62)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (99)..(99)
<223>  r是A或G
<400>  11
gcacttgcaa gcatgagaca gctcgaagag ttaactataa natattgcaa ggccttgaaa      60
gngattgtga agaaggaaga agacaatgca tcatcatcnt catcgaagga ggttgtggtc     120
ttgcctcatc taaagtcc                                                   138
<210>  12
<211>  21
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  12
gcatgagaca gctcgaagag t                                                21
<210>  13
<211>  18
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  13
ccttcgatga cgatgatg                                                    18
<210>  14
<211>  19
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  14
tccttcgatg atgatgatg                                                   19
<210>  15
<211>  18
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  15
tgaggcaaga ccacaacc                                                    18
<210>  16
<211>  80
<212>  DNA
<213>  莴苣（Lactuca sativa）
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (6)..(6)
<223>  n是A、T、C或G
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (6)..(6)
<223>  m是A或C
<220>
<221>  尚未归类的特征
<222>  (41)..(41)
<223>  n是a、c、g或t
<400>  16
agacgnttta acgacctggc ccaacattcc atgaaccacc ngactggttt tgggcaattt      60
agtcgggtac ctgcctttgc                                                  80
<210>  17
<211>  20
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  17
acgacctggc ccaacattcc                                                  20
<210>  18
<211>  15
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  18
tgaaccaccc gactg                                                       15
<210>  19
<211>  16
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  19
tgaaccacca gactgg                                                      16
<210>  20
<211>  22
<212>  DNA
<213>  合成
<400>  20
gtacccgact aaattgccca aa                                               22

Claims (27)

1.一种对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物，所述植物包含来自毒莴苣的基因渗入序列，所述基因渗入序列赋予对莴苣盘梗霉的定性和显性抗性，其中所述基因渗入序列包含在毒莴苣登录号CGN23091中或莴苣品系18LEN002364中，莴苣18LEN002364的代表性种子已经由NCIMB保藏在登录号NCIMB 43625下，并且其中所述基因渗入序列位于2号染色体上并包含以下SNP标记中的一者或多者：
a)SEQ ID NO：1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO：6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO：11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO：16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
其中所述植物与缺乏所述基因渗入序列的莴苣植物相比，对莴苣盘梗霉的所述抗性增强。
2.根据权利要求1所述的植物，其中：
a)标记SL1831的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO：2和反向引物SEQ ID NO：5，以及探针SEQ ID NO：3；
b)SNP标记SL1847的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO：7和反向引物SEQ ID NO：10，以及探针SEQ ID NO：8；
c)SNP标记SL1887的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO：12和反向引物SEQ ID NO：15，以及探针SEQ ID NO：13；以及
d)SNP标记SL1883的所述C基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO：17和反向引物SEQ ID NO：20，以及探针SEQ ID NO：18。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的植物，其中所述植物是栽培植物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述基因渗入序列包含以下的一者或多者：SEQ ID NO：1，其具有由112位的核苷酸G表示的抗性标记等位基因；SEQ ID NO：6，其具有由112位的核苷酸A表示的抗性标记等位基因；SEQ ID NO：11，其具有由99位的核苷酸G表示的抗性标记等位基因；和/或SEQ ID NO：16，其具有由41位的核苷酸C表示的抗性标记等位基因；或序列，所述序列与前述序列中的一者或多者具有至少95％同一性并且包含所述抗性标记等位基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的植物，其中所述植物对于所述一个或多个SNP标记是杂合的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的植物，其中所述植物对于所述一个或多个SNP标记是纯合的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的植物，其中所述植物包含所述SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者。
8.根据权利要求7所述的植物，其中所述植物包含至少以下SNP标记：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的植物，其中所述基因渗入序列赋予至少针对莴苣盘梗霉小种Bl 16-36EU的抗性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的植物，其中所述植物通过使毒莴苣登录号CGN23091或莴苣品系18LEN002364与不包含赋予对莴苣盘梗霉的抗性的所述基因渗入序列的第二莴苣植物杂交来获得。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的植物，其中所述植物是近交、双单倍体或杂种植物。
12.一种莴苣品系18LEN002364的植物，莴苣品系18LEN002364的代表性种子已经由NCIMB保藏在登录号NCIMB 43625下。
13.一种种子，所述种子产生根据权利要求1至12中任一项所述的植物。
14.一种根据权利要求1至12中任一项所述的植物的植物部分。
15.一种用于产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物的方法，所述方法包括：
a)使根据权利要求1至12中任一项所述的莴苣植物与缺乏赋予对莴苣盘梗霉的抗性的所述基因渗入序列的第二莴苣植物杂交，以产生子代植物；
b)选择包含赋予对莴苣盘梗霉的抗性的所述基因渗入序列的子代植物，所述选择步骤包括检测以下SNP标记中的一者或多者：
i)SEQ ID NO：1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO：6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO：11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO：16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述莴苣植物是莴苣品系18LEN002364。
17.一种用于产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物的方法，所述方法包括：
a)使毒莴苣登录号CGN23091的植物与缺乏来自毒莴苣登录号CGN23091的、赋予对莴苣盘梗霉的抗性的基因渗入序列的第二莴苣植物杂交以产生子代植物；
b)选择包含来自毒莴苣登录号CGN23091的2号染色体上的基因渗入的子代植物，所述基因渗入赋予对莴苣盘梗霉的抗性，所述选择步骤包括检测以下SNP标记中的一者或多者：
i)SEQ ID NO：1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
ii)SEQ ID NO：6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
iii)SEQ ID NO：11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
iv)SEQ ID NO：16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
c)使所选择的子代自交或使所选择的子代与另一莴苣植物杂交，以产生另外的子代。
19.根据权利要求18所述的方法，其中选择另外的子代，并且再自交和/或杂交2代至10代。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中b)的所述选择步骤包括检测所述SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述选择步骤包括检测至少以下SNP标记：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
22.一种用于产生对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的F1杂种莴苣植物的方法，所述方法包括使作为根据权利要求1至12中任一项所述的植物的近交莴苣植物与不同的近交莴苣植物杂交，以产生F1杂种子代。
23.一种用于鉴定对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物的方法，所述方法包括检测以下SNP标记中的一者或多者的步骤：
a)SEQ ID NO：1中SNP标记SL1831的在杂合或纯合状态下的G基因型；
b)SEQ ID NO：6中SNP标记SL1847的在杂合或纯合状态下的A基因型；
c)SEQ ID NO：11中SNP标记SL1887的在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或
d)SEQ ID NO：16中SNP标记SL1883的在杂合或纯合状态下的C基因型；
从而鉴定对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的莴苣植物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法进一步包括选择包含所述一个或多个SNP标记的莴苣植物，并且使所选择的莴苣植物与第二莴苣植物杂交，以产生包含所述一个或多个分子标记并且对莴苣盘梗霉具有增强的抗性的子代莴苣植物。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述检测步骤包括检测所述SNP标记SL1831、SL1847、SL1887和/或SL1883中的两者或更多者。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述检测步骤包括检测至少以下SNP标记：
·SL1831和SL1847；
·SL1831和SL1883；
·SL1831和SL1887；
·SL1847和SL1883；
·SL1847和SL1887；或者
·SL1883和SL1887。
27.一种产生莴苣种子的方法，所述方法包括从根据权利要求13所述的种子生长莴苣植物，并且允许所述植物产生另外的莴苣种子。
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