CN102115744B - 与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0204 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，或者其为谷子基因组中含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段。本发明还涉及该分子标记的引物、该分子标记在谷子抗除草剂基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子抗除草剂基因定位方法、以及一种谷子育种方法。本发明发现了与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0204，将谷子基因组DNA序列与谷子抗除草剂基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立。

Description

与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0204

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及该分子标记的引物、该分子标记在谷子抗除草剂基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子抗除草剂基因定位方法、以及一种谷子育种方法。

背景技术

谷子(Setaria italica L.Beauv.)是起源于我国的重要粮食作物，主要在我国的北方种植，在国家粮食生产和粮食安全中占有较为重要的地位。谷子是二倍体自花授粉作物，其基因组较小，约470Mb，这些特性使其很适合作为基因组研究的对象。

利用除草剂除草己成为当今农田有效地控制杂草、提高农作物产量与质量的一项重要措施。然而，由于谷田杂草种类多，数量大，目前生产上又缺乏抗除草剂的品种，谷田不能施用广谱除草剂除草，这成为障碍谷子生产的一大难题。

目前，遗传连锁图谱的构建已成为基因定位、图位克隆以及基因组结构与功能研究的重要基础。而分子标记又是构建遗传连锁图谱的基础。因此，迫切需要发现与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记。

发明内容

本发明人依据全基因组序列，经过大量的实验和不懈的努力，提供了一种与谷子(Setaria italica L.Beauv.)抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0204，并由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0204，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中加边框部分为引物设计区段：

648bp

TGCCGCGGTAGAGGTGAGCGACGGTGAATGTGCTCGATTGCTAAACCAGATATGCCAGTGAAACACAGGTGTCTCACGAAATGCGTGTGAATTATTTTTTCTTGGTTTCACTCACTTGTAATTAAGGCTCCGTTTGGTAGAGCTTCGGCTTCTTATAAAACGGCTTCAGCTTCAGCTTCTTCGGTGGAGTGGCTTTTTTAGTGAAGCTGAAGCCGTTTTGCAAAACGTTTGGTAAAACGGCTTCTCAATGGCAATATATGTAATTTTATGATCACTTAATGCTTGGAGAGAAAGGAGAAGCCGGTGAAGCCACTTTTTTCAGCTTCTCCTCTCTAGTGTAAGCCGTTTTGCGGCTTCTCCCCGGCTTTGGTGGTGAAGCCGTTTTGAAATTGACCCTTTGGTAGGGCTTCACCAAAAGTCGGTGGAGAAGCACTTTGAGAAGTCCTACCAAACAGGGCCTAATTTGCTTCTTATTTGACGCTATTTTTCCCTTGTCATTTTGAAATGGTTCGAACTCGGAACTTCCGGACGATTTGGATTGGGCCTGATTACGAGGAATCCTATATGGTCGGCTGGATCGGTTTGGCGAGTGGGCTTTGCTGGATCCT

(SEQ ID NO：1)

在本发明中，术语“与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记”是指这样的分子标记，在遗传连锁图谱中，该分子标记与谷子抗除草剂基因的遗传连锁距离小于2cM或者小于3cM；或者在谷子的大于400个样本中，抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的样本中含有该分子标记。抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的确定参见后文中的描述。

在本发明中，具体地，所述除草剂为拿捕净。拿捕净是一种选择性强的内吸传导型茎叶处理剂，能被禾本科杂草的茎叶迅速吸收，并传导到顶端和节间分生组织，使其细胞分裂遭到破坏。拿捕净在禾本科与双子叶植物间选择性很高，对阔叶作物安全，广泛应用于除去稗草、野燕麦、狗尾草、马唐、牛筋草、看麦娘、野黍、臂形草、黑麦草、稷属、旱雀麦、狗牙根、芦苇、冰草、假高粱、白茅等禾本科杂草。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示：

SIsv0204F：TTGGCCTCGGTGAAGCTCAT(SEQ ID NO：2)

SIsv0204R：TGCAGTAATCCAGCCCACAT(SEQ ID NO：3)。

本发明的分子标记也可以为含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段；该DNA片段的长度为适当长度，但并不特别限定，例如，小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段)为谷子基因组中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，优选地，为谷子基因组中SEQID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测谷子基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有SEQ ID NO：1所示的序列。SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于SEQ ID NO：1的一个位置上，以致该控制序列指导SEQ ID NO：1编码的多肽的产生。

本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的分子标记。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。本发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用抗拿捕净型的谷子的基因组DNA作为模板，以上述引物进行PCR扩增，得到的扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化的步骤。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。

本发明的还一方面涉及所述分子标记的检测方法，包括下述步骤：

(1)根据本发明的分子标记的核苷酸序列设计引物；

(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；

(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。

例如，可以以被检测谷子的基因组DNA为模板，以上述引物(SEQID NO：2和SEQ ID NO：3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子抗除草剂基因定位或检测中的用途。

本发明的还一方面涉及一种谷子抗除草剂基因定位的方法，包括使用本发明的分子标记的步骤。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子辅助育种中的用途。

本发明的还一方面涉及一种谷子辅助育种方法，包括检测本发明的分子标记的步骤。

本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选谷子是否抗除草剂(例如，可以参考，DNA分子标记在小麦抗病育种中的用途，陇东学院学报(自然科学版)，2006年4月第16卷第1期，P65-69)。检测出具有本发明的分子标记的为抗拿捕净型或部分抗拿捕净型，不具有该分子标记的为不抗拿捕净型。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记引物。所述检测还可以通过测序方法进行。该谷子辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。

在本发明中，具体地，所述谷子可以为张谷1号、谷子A2不育系、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的F2代。其中，张谷1号、或张杂谷3号自交产生的部分F2代(芽苗叶片正常)为抗拿捕净型；张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的部分F2代(芽苗叶片褪色)为部分抗拿捕净型；谷子A2不育系、张杂谷3号自交产生的部分F2代(芽苗叶片枯死)，为不抗拿捕净型。

上述抗拿捕净型、部分抗拿捕净型、不抗拿捕净型是通过下述方法确定的：

配置4L 15g/L的Agar powder(琼脂粉)培养基水溶液，灭菌锅灭菌溶化。待其温度冷却至50℃左右加入6ml的拿捕净(购自阿拉丁试剂(中国)有限公司，货号：1113709)，倒平皿，培养基厚度约0.8cm左右。培养基冷却后，撒F2代种子于培养基中，置于光培室中培养3天，统计芽苗叶片情况是正常，褪色，还是枯死。其中，芽苗叶片正常的为抗拿捕净型，褪色的为部分抗拿捕净型，枯死的为不抗拿捕净型。

发明的有益效果

本发明提供了与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记，并将谷子基因组DNA与谷子抗除草剂基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与抗除草剂基因的遗传紧密连锁距离为1.5cM。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于谷子辅助育种。

附图说明

图1：分子标记引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)对F2代480个单株扩增的部分结果。其中：

泳道1-12为F2代中12株抗拿捕净型和部分抗拿捕净型的单株的PCR扩增产物；泳道14-25为F2代中12株不抗拿捕净型的单株的PCR扩增产物。泳道13为marker，其为200bp DNA Ladder；其分子量包括：4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1800bp、1600bp、1400bp、1200bp、1000bp、800bp、600bp、400bp、以及200bp。结果显示：抗拿捕净型和部分抗拿捕净型的植株中条带大小为648bp，不抗拿捕净型的植株中条带大小小于648bp。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

1.张谷1号种子，其于2010年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P201012，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，430072。

2.谷子A2不育系种子，其于2010年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P201013，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，430072。

3.张杂谷3号种子，其于2010年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P201010，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，430072。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：谷子F2代分离群体的构建

父本为张谷1号：抗拿捕净型(株型高，株高为150cm左右)，旗叶长而窄，刚毛红色，颖壳红色，可育，叶色偏绿。

母本为A2不育系：不抗拿捕净型(株型矮，株高为100cm左右)，旗叶短而宽，刚毛绿色，颖壳绿色，部分不育，叶色偏黄。

父本和母本杂交得到F1(张杂谷3号，部分抗拿捕净型，株高为130cm左右)。

F1代自交产生F2代群体，共得到480个单株。对480个F2代个体按照前述确定抗拿捕净类型的方法进行抗拿捕净性状分析，发现抗拿捕净型和部分抗拿捕净型共360株(其中抗拿捕净型120株，部分抗拿捕净型240株)，不抗拿捕净型120株。

实施例2：父母本以及F1代、F2代个体基因组DNA的提取

用CTAB法分别提取实施例1中的父母本、F1代、以及480个F2代个体的基因组DNA，具体方法如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3ml1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15ml的离心管中，然后往研钵中加入1ml 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30分钟，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：

CTAB                        15g

1M Tris.Cl(pH为8.0)         75ml

0.5M EDTA                   30ml

NaCl                        61.4g

加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10分钟，将上层水相移到新的15ml离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5分钟。于-20℃放置30分钟沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10分钟，弃掉上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μl TE溶解DNA。

(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。

(6)将得到的父母本以及F1代、F2代个体的基因组DNA存于-20℃备用。

实施例3：分子标记的制备

以实施例2中提取的父本、F1代、或F2代中的抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的基因组DNA为模板，以分子标记引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

无菌水                   20.2μl

10*Buffer(含Mg²⁺)        2.5μl

dNTPs(25mM)              0.15μl

Taq酶(5U/μl)            0.15μl

正向引物                 0.5μl

反向引物                 0.5μl

模板                     1.0μl

总体积                   25μl

PCR反应程序如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

将扩增产物纯化，得到分子标记。纯化后进行测序，结果如SEQ IDNO：1所示。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子标记。

实施例4：分子标记引物的初步筛选

对父本进行de novo测序(60X contig N50：22K，scaffold N50：320K；Total size：400Mb)，母本重测序(10X)。

根据父母本测序数据，利用SOAP软件(例如SOAP2.20，可以从http://soap.genomics.org.cn/下载，也可以使用其它的序列比对软件)比较父母本之间的序列差异，然后基于差异的序列，在父本5’端和3’端外侧约50bp位置，随机选取20bp左右的长度，用primerpremier软件随机设计引物，一共设计了1105对引物，下面的表1中示出了其中的部分引物的序列(SEQ ID NO：2-41)。

表1：1105对随机引物中的部分引物

分别以实施例2中提取的父母本及F1代的基因组DNA为模板，以设计的1105对引物进行PCR扩增，PCR反应体系其它条件和程序与实施例3中类似。

将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，以检测引物的有效性和多态性。在此有效性是指是否有扩增产物；多态性是指父母本间扩增产物的片段大小有差异。

按照如下的筛选标准进行引物的筛选：父母本及F1均有扩增产物，并且父母本扩增产物均只有一条明晰的带型且大小有差异，F1表现为有父母本带型的杂合带型，即有父本和母本带型的两条带。

筛选结果：从随机设计的1105对引物中筛选出616对引物。

实施例5：谷子F2代遗传连锁图谱的构建

用实施例4中得到的616对分子标记引物F2群体的480个个体分别进行PCR检测，所用模板为实施例2中制得的F2群体的480个个体的基因组DNA，PCR体系的其它成分以及PCR程序与实施例4相同。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中分子标记引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)对480个个体扩增的部分结果如图1所示。

将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将F2群体单株扩增条带为父本型的记为a，扩增条带为母本型的记为b，扩增条带同时含有父本型和母本型的记为h，都没有的记为-，最终得到F2群体480个个体的616对引物扩增的基因型数据。比如，用第一对引物得到的480个个体的数据是a，b，h，-，b，......共480个数据，用第二对引物得到的数据为b，a，h，a，-，......共480个数据，共616对引物分别统计，所得即为该F2群体的基因型数据。

用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps withMAPMAKER/EXP 3.0，S Lincoln，M Daly，E Lander-Cambridge，MA：Whitehead Institute，1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。遗传连锁图上标明了616对引物的位置及与抗除草剂基因的遗传距离。

根据480个个体的抗除草剂表型，与父本型性状相似的记为a(抗拿捕净)，与母本型性状相似的记为b(不抗拿捕净)，性状居于父本和母本之间的记为h(部分抗拿捕净)。得到480个个体的表型数据，480个个体的表型数据与之前得到的480个个体的基因型数据进行比较，相似高则代表该标记与抗除草剂(抗拿捕净或部分抗拿捕净)性状紧密连锁。

根据上述结果将抗除草剂(拿捕净)基因定位在遗传连锁图谱上。

实施例6：与谷子抗除草剂紧密连锁的分子标记的验证

1.在实施例5制得的遗传连锁图谱的基础上，根据与谷子抗除草剂基因的遗传连锁距离，在与谷子抗除草剂基因的遗传紧密连锁距离为1.5cM的位置确定了分子标记引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)，并找到对应的父本序列位置，上下游引物之间的序列即为分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.另外，在实施例5中的对F2代的480个个体的PCR扩增产物的电泳中，对于分子标记引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)的扩增结果是：360个抗拿捕净型和部分抗拿捕净型的扩增产物均有648bp大小的条带，而120个不抗拿捕净型的PCR扩增产物均没有648bp的条带(部分扩增结果如图1所示)。并且经测序证明该648bp的片段的序列与SEQ ID NO：1相同。

可见，本发明的分子标记(SEQ ID NO：1)为与谷子抗除草剂(拿捕净)基因紧密连锁的分子标记。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (11)

1.一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中，所述除草剂为拿捕净。

2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的分子标记。

3.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的重组载体。

4.权利要求1所述的分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示。

5.权利要求1所述的分子标记的制备方法，包括下述步骤：

使用抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的谷子的基因组DNA作为模板，以权利要求4所述的引物进行PCR扩增；

其中，所述抗拿捕净型的谷子为保藏号为CCTCC NO：P201012的张谷1号，或保藏号为CCTCC NO：P201010的张杂谷3号自交产生的F2代中的抗拿捕净型；所述部分抗拿捕净型的谷子为张杂谷3号或张杂谷3号自交产生的F2代中的部分抗拿捕净型。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其还包括将PCR扩增的产物进行纯化的步骤。

7.权利要求1所述的分子标记的检测方法，包括下述步骤：

(1)根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列设计引物；

(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；

(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记；

其中，所述引物为权利要求4所述的引物。

8.权利要求1所述的分子标记在谷子抗除草剂基因定位或检测中的用途；其中，所述除草剂为拿捕净。

9.一种谷子抗除草剂基因定位的方法，包括使用权利要求1所述的分子标记的步骤；其中，所述除草剂为拿捕净。

10.权利要求1所述的分子标记在谷子辅助育种中的用途，其中，检测出具有权利要求1所述的分子标记的为抗拿捕净型或部分抗拿捕净型，不具有该分子标记的为不抗拿捕净型。

11.一种谷子辅助育种方法，包括检测权利要求1所述的分子标记的步骤，其中，检测出具有权利要求1所述的分子标记的为抗拿捕净型或部分抗拿捕净型，不具有该分子标记的为不抗拿捕净型。