BRPI0912913A2 - processos de determinação, métodos de identificação, métodos de seleção assistida por marcador, método de detecção de um sítio de resistência, planta de milho e progênie - Google Patents

Abstract

PROCESSOS DE DETERMINAÇÃO, MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, MÉTODOS DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR, MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM SÍTIO DE RESISTÊNCIA, PLANTA DE MILHO E PROGÊNIE. O carvão do topo é uma das doenças mais devastadoras do milho causando severas perdas de produção em todo o mundo. A presente invenção descreve o mapeamento fino de um QTL importante que confere resistência ao carvão do topo. São descritos marcadores úteis para cultivo e métodos de conferir resistência ao carvão do topo. É descrita uma sequência de ácido nucleico do sítio genético que confere resistência ao carvão do topo. São descritos genes que codificam proteínas que conferem resistência ao carvão do topo.

Description

"PROCESSOS DE DETERMINAÇÃO, MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÂO, à MÉTODOS DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR, MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM SÍTIO DE RESISTÉNCIA, PLANTA DE MILHO E PROGÉNIE" 5 O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/090.704, depositado em 21 de agosto de 2008, cujo teor é incorporado ao presente como referência.

Campo da Invenção O presente relatório descritivo refere-se a composições e 10 métodos úteis no aumento da resistência ao carvão do topo (head smut) em milho.

Antecedentes da InvençÃo Carvão do topo é uma doença sistêmica do solo em milho (Frederiksen, 1977), causada pelo fungo específico de hospedeiro 15 Sphace/otheca rei/iana (Kuhn) Clint. Os telioesporos de soros enterrados no solo são a principal fonte de infecção e podem sobreviver por três anos no SOIO sem perda da capacidade de infecção (\Nu et al, 1981). O fungo infecta mudas por meio das raízes ou coleóptilos durante e após a emergência das sementes (Krüger, 1962). Em uma infecção de uma variável susceptível, as plantas 20 prosseguem com o crescimento vegetal normal, mas algumas podem atrofiar (Matyac e Kommedahl, 1985a). Ao amadurecer, os soros substituem espigas ou borlas das plantas infectadas, o que resulta em quase nenhum rendimento de milho para a planta. A proporção de plantas infectadas em um campo infectado poderá somar 80% (Frederiksen, 1977). jin (2000) relatou que a 25 incidência dessa doença variou de 7,0% a 35,0%, às vezes atingindo até 62,0%, resultante do cultivo de cultivares susceptíveis. No norte da China, carvào do topo causa perda de rendimento de até 0,3 milhão de toneladas por ano (Bai et al, 1994). Relatou-se que o milho no sul da Europa, América do

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T Norte e Ásia também sofre seriamente com essa doença (Xu et al, 1999). « Considerando os elementos econômicos e ecológicos, o cultivo de variedades resistentes é uma forma eficaz de controlar epidemias de carvão do topo. O < cultivo de diversos genes resistentes/QTLs contra carvão do topo em 5 variedades de milho de elite seria uma forma promissora de aumentar a resistência contra essa doença. Até o momento, muitas pesquisas estudaram modelos genéticos que conferem resistência ao carvão do topo. Mei et al (1982) relataram que a resistência contra carvão do topo foi controlada por genes nucleares 10 parcialmente dominantes sem diferença encontrada em cruzamentos recíprocos. Ma et al (1983) reiataram que a resistência de milho ao carvão do topo era uma característica quantitativa, afetada por genes de resistência parcial e suas interações não alélicas. Stromberg et al (1984) descobriram que a população de F1 exibiu uma incidência de doença intermediária entre pais 15 resistentes e susceptíveis. Ali e Baggett (1990) relataram que ações genéticas aditivas e dominantes foram preponderantes sob diferentes tratamentos. Bernardo et al (1992) estudaram o efeito genético de gene(s) de resistência utilizando análise média de geração, o que sugere que o efeito aditivo é decisivo, enquanto os efeitos dominantes e epistáticos são fracos. Shi et al 20 (2005) relataram que, além do efeito aditivo, a sobredominância também r desempenha um papel fundamental na resistência contra carvão do topo. E óbvio que a resistência contra carvão do topo em milho pode estar envolvida em uma série de elementos genéticos e agir de forma complexa.

DescriçÃo Resumida da InvençÃo 25 São fornecidos composições e métodos de identificação e seleção de plantas de milho com maior resistência ao carvão do topo. Em uma primeira realização, a presente invenção refere-se a um poIinucleotídeo isolado que compreende um polinucleotÍdeo selecionado a u 0 partir do grupo que consiste de: (a) pelo menos uma sequência de nucleotideos que codifica 0 um poIipeptídeo que confere ou aumenta a resistência ao carvão do topo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 27, 32, 35, 38, 41, 44, 5 105,108,111,113e116; (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar um poIipeptídeo que confere ou aumenta a resistência ao carvão do topo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 25, 26, 30, 31, 34,36,37, 39,40,42,43,45, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115e 117;e 10 (C) um complemento da sequência de nucleotídeos da parte (a) ou (b), em que o complemento e a sequência de nucleotideos consistem do mesmo número de nucleotídeos e são 1OO°/o complementares.

Em uma segunda realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende o polinucleotideo isolado reivindicado.

15 Em uma terceira realização, a presente invenção refere-se a uma construção de DNA recombinante que compreende o polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora. Em uma quarta realização, a presente invenção refere-se a uma 20 célula de milho que compreende a construção de DNA recombinante ou o polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção. Em uma quinta realização, a presente invenção refere-se a um processo de produção de uma planta de milho que compreende a transformação de uma célula vegeta! com a construção de DNA recombinante 25 de acordo com a presente invenção e regeneração de uma planta da célula vegetal transformada. Em uma sexta realização, a presente invenção refere-se a uma planta de milho que compreende a construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção. Em uma sétima realização, a presente invenção refere-se a uma " semente de milho que compreende a construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção.

5 Em uma oitava realização, a presente invenção refere-se a um processo de conferir ou aumentar a resistência ao carvão do topo, que compreende a transformação de uma planta com a construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção, de forma a conferir ou aumentar a resistência ao carvão do topo.

10 Em uma nona realização, a presente invenção refere-se a um processo de determinação da presença ou ausência do polinucleotÍdeo de acordo com a presente invenção em uma planta de milho, que compreende pelo menos um dentre: (a) isolamento de moléculas de ácido nucleico da mencionada 15 planta de milho e amplificação de sequências homólogas ao polinucleotÍdeo de acordo com a presente invenção; ou (b) isolamento de moléculas de ácido nucleico das mencionadas plantas de milho e realização de hibridização Southern; ou (c) isolamento de proteínas da mencionada planta de milho e 20 realização de Western Blot utilizando anticorpos para a proteína; ou (d) isolamento de proteínas da mencionada planta de milho e realização de teste ELISA utilizando anticorpos para a proteína; ou (e) demonstração da presença de sequências de mRNA derivadas do transcrito de mRNA e exclusivos para o sÍtio de resistência ao 25 carvão do topo; de forma a determinar a presença do polinucleotídeo de acordo com a presente invenção na mencionada planta de milho. Em uma décima realização, a presente invenção refere-se a um

«

processo de determinação da presença ou ausência do sÍtio de resistência ao *

carvão do topo em uma planta de milho, que compreende pelo menos um dentre: (a) isolamento de moléculas de ácido nucleico da mencionada

5 planta de milho e amplificação de sequências exclusivas para o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção; ou

(b) isolamento de proteínas da mencionada planta de milho e realização de Western Blot utilizando anticorpos para a proteína; ou

(c) isolamento de proteínas da mencionada planta de milho e

10 realização de teste ELISA utilizando anticorpos para a proteína; ou (d) demonstração da presença de sequências de mRNA derivadas do transcrito de mRNA e exclusivos para o sítio de resistência ao carvão do topo; de forma a determinar a presença do sÍtio de resistência ao

15 carvão do topo na mencionada planta de milho, Em uma décima-primeira realização, a presente invenção refere-

se a um processo de alteração do nível de expressão de uma protelna capaz de conferir resistência ao carvão do topo a uma célula de milho que compreende:

20 (a) transformação de uma célula de milho com a construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção; e

(b) cultivo da célula de miiiio transformada sob condições que sejam apropriadas para expressão da construção de DNA recombinante em que a expressão da construção de DNA recombinante resulta na produção de

25 níveis alterados de um proteina capaz de conferir resistência ao carvão do topo à célula de milho transformada em comparação com níveis de expressão em uma pianta de milho do tipo selvagem que possui resistência ao carvão do topo.

«

Em uma décima-segunda realização, a presente invenção refere- 4 se a um processo de alteração do nivel de expressão de uma protelna capaz de conferir resistência ao carvão do topo a uma célula de milho que compreende:

5 (a) transformação de uma célula de milho com a construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção; e

(b) cultivo da célula de milho transformada sob condições que sejam apropriadas para expressão da construção de DNA recombinante em que a expressão da construção de DNA recombinante resulta na produção de

10 níveis alterados de um proteína capaz de conferir resistência ao carvão do topo à célula de milho transformada em comparação com níveis de expressão em uma planta de milho do tipo selvagem que possui resistência ao carvão do topo.

Em uma décima-terceira realização, a presente invenção refere-

15 se a um processo de alteração do nível de expressão de uma proteína capaz de conferir resistência ao carvão do topo a uma pIanta de milho que compreende:

(a) transformação de uma célula de planta de milho com a construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção; e

20 (b) regeneração de uma planta de milho transformada a partir da célula de planta de milho transformada; e

(C) cultivo da planta de milho transformada sob condições que sejam apropriadas para expressão da construção de DNA recombinante em que a expressão da construção de DNA recombinante resulta na produção de

25 níveis alterados de um proteína capaz de conferir resistência ao carvão do topo na planta de milho transformada em comparação com níveis de expressão em uma planta de milho do tipo selvagem que possui resistência ao carvão do topo.

© e Em uma décima-quarta realização, a presente invenção refere-se g a um processo de alteração do níve! de expressão de uma proteina capaz de # conferir resistência ao carvão do topo a uma planta de milho que compreende: (a) transformação de uma célula de planta de milho com a 5 construção de DNA recombinante de acordo com a presente invenção; e (b) regeneração da planta de milho transformada a partir da célula de planta de milho transformada; e (c) cultivo da célula de milho transformada sob condições que são apropriadas para expressão da construção de DNA recombinante em que 10 a expressão da construção de DNA recombinante resulta na produção de niveis alterados de um proteina capaz de conferir resistência ao carvão do topo na célula de milho transformada em comparação com níveis de expressão em uma ptanta de milho do tipo selvagem que possui resistência ao carvão do topo.

15 Em uma décima-quinta realização, a presente invenção refere-se a um método de identificação de uma planta de milho que exibe resistência ao caNão do topo, em que o método compreende a detecção em uma planta de milho de um sÍtio marcador genético, em que: (a) uma sonda marcadora genética que compreende, no todo 20 ou em parte, o sÍtio marcador genético ou seu complemento hibridiza-se sob condições severas em bacm.pk071.j12, bacm.pkO07.18 e bacm2.pk166.h1; e (b) o mencionado sÍtio marcador genético compreende pelo menos um alelo que é associado à resistência ao carvão do topo. Em uma décima-sexta realização, a presente invenção refere-se 25 a um método de identificação de uma planta de milho que exibe resistência ao carvão do topo, em que o método compreende a detecção no germoplasma da planta de milho de pelo menos um alelo de um sitio marcador, em que: (a) o sÍtio marcador encontra-se a 7 CM de SSR148152,

*

Ò CAPS25082, STS171, SNP661 e STS1944; e (b) pelo menos um alelo é associado à resistência ao carvão do topo. Em uma décima-sétima realização, a presente invenção refere- 5 se a um método de identificação de uma planta de milho que exibe resistência ao carvão do topo, em que o método compreende a detecção no germoplasma da planta de milho de pelo menos um alelo de um sítio marcador, em que: (a) o sÍtio marcador está posicionado em um intervalo 10 cromossômico que compreende e é flanqueado por umc1736 e umc2184 ou em um intervalo cromossômico que compreende e é flanqueado por SSR148152/SNP661; e (b) pelo menos um alelo é associado à resistência ao carvão do topo.

15 Em uma décima-oitava realização, a presente invenção refere-se a um método de seleção assistida por marcador que compreende: (a) obtenção de uma primeira planta de milho que contém pelo menos um alelo de um sítio marcador, em que o sÍtio marcador está localizado dentro de 7 cM de SSR148152, CAPS25082, STS171, SNP661 e STS1944 em 20 um mapa genético de IBM público e o alelo está associado ao aumento da resistência ao caNão do topo; (b) cruzamento da mencionada primeira planta de milho com uma segunda planta de milho; (c) avaliação da progênie para pelo menos o mencionado 25 alelo; e (d) seleção de plantas de milho de progênie que contém pelo menos o mencionado alelo. Em uma décima-nona realização, a presente invenção refere-se a um método de seleção assistida por marcador que compreende: d

(a) obtenção de uma primeira planta de milho que contém pelo

" menos um alelo de um sÍtio marcador, em que o sÍtio marcador está localizado em um inteNa|o cromossômico que compreende e é flanqueado por umc1736

5 e umc2184 e o alelo é associado a resístência aumentada ao carvão do topo; (b) cruzamento da mencionada primeira planta de milho com uma segunda planta de milho; (c) avaliação da progênie para pelo menos o mencionado alelo; e

10 (d) seleção de plantas de milho da progênie que contém pelo menos o mencionado alelo.

Em uma décima-nona realização, a presente invenção refere-se a um método de detecção de um sitio de resistência ao carvão do topo que compreende a detecção da presença de pelo menos um alelo marcador

15 selecionado a partir do grupo que consiste de: MZA6393, 1M2-9, E6765-3, 2M4-1, 2M10-5, 2M11-3, 3M1-25 e STS148-1. Também fica claro que, em qualquer um dos métodos mencionados acima, qualquer um dos alelos marcadores descritos associados à resistência ao carvão do topo pode ser ligado a qualquer segundo alelo

20 marcador.

Esse segundo alelo marcador também seria associado à resistência ao caNão do topo e seria útil nas formas descritas acima.

Breve Descrição DAS Figuras E Listagens DE SequÊncias A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir, das figuras e da Listagem de

25 Sequências anexa que fazern parte do presente pedido.

A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nuc/eic Ac/ds Research

W " 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical Journal 219 (n° 2): 345-373 (1984), 0 que são integralmente incorporados ao presente como referência. Os sÍmbolos " e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. § 1.822.

5 Figura 1: desenvolvimento de um marcador SNP (SNP140313) para AZM4_ 140313 (sequência de Zea mays montada a partir de TIGR) e sua , aplicação na elaboração de genótipos de populações de BC. No sítio l AZM4 _ 140313, foi detectado um sÍtio SNP (sublinhado) em que os nucleotídeos "C" (alelo 1) e "T" (alelo 2) correspondem às linhagens parentais 10 "ji1037" e "Huangzao4", respectivamente. Na primeira rodada de amplificação por PCR, um par de primers normais (L: 5'-CAGAGGCATTGAACAGGAAG-3' e R: 5'-CTGCTATTCCACGAAGTGCT-3') foi projetado para amplificar linhagens parentais e indivíduos BC1. Na segunda rodada de amplificação por PCR, um novo par de primers, incluindo o primer esquerdo (snpL: 5'- 15 CTCTTCCACCGAGAATAGCG-3') com um nucleotídeo "C" não coincidente (em negrito) e o primer direito (snpR: 5'-CTGCTATTCCACGAAGTGCT-3'), foi projetado para amplificar os produtos de PCR de primeira rodada diluidos. lsso ' produziu um sítio Hhal "GCGC" para o alelo 1, mas não alelo 2 nos produtos de PCR resultantes. Os produtos de PCR foram digeridos com Hhal e submetidos 20 em seguida a eletroforese sobre gel de poliacrilamida a 6°/j. Foram observadas faixas poliméricas em duas linhagens parentais, "Ji1037" (Iinha 21, faixa de 373 bp digerida) e "Huangzao4" (linha 22, faixa de 391 bp intacta) e entre indivíduos BC1 (linhas 1 a 20). Linhas 1 a 20: os indivíduos BCi selecionados aleatoriamente que exibem homozigoto (1/1, uma faixa que possui o mesmo 25 tamanho de "Huangzao4") ou heterozigoto (1/2, duas faixas correspondentes a "jl1037" e "Huangzao4", respectivamente). Linha 21: os produtos de PCR digeridos por Hhal amplificados a partir de "Ji1037", foi observada uma faixa de 373 bp digerida. Linha 32: os produtos de PCR digeridos por Hhal amplificados a partir de "Huangzao4", observou-se uma faixa de 391 bp não digerida. Linha 0 23: os produtos de PCR não digeridos amplificados a partir de ^ji1037". Linha ' 24: os produtos de PCR não digeridos amplificados a partir de "Huangzao4". Figura 2: Mapeamento genético dos marcadores recém- 5 desenvolvidos sobre a região do cesto 2.09. Dos nove marcadores recém- desenvolvidos, seis foram mapeados sobre o cesto 2.09 com cinco marcadores (SSR148152, CAPS25082, STS171, SNP661 e STS1944) na região de resistência qHSR1 e um marcador (STSrga840810) fora dela. O principal QTL de resistência, qHSR1, foi delimitado em um intervalo de cerca de 2 Mb, 10 flanqueado pelos marcadores recém desenvolvidos SSR148152 e STS661. Figura 3: alinhamento do gene inibidor de xilanase de Mo17 e B73. A sequência MO17 é encontrada em qHSR1, o sÍtio que confere resistência ao carvão do topo em milho. B73 é uma variedade sensíve! ao carvão do topo de milho.

15 Figura 4: desenho comparativo de MO17, B73 e estrutura genômica de Huangzhao na região qHSR. Ambos, B73 e Huangzhao, contêm exclusões na região em comparação com Mo17. Os marcadores mencionados na presente invenção são exibidos no topo. São observados seis genes de interesse, um gene de hidrolase que é exclusivo para MO17; Gene 1, uma proteina de 20 repetição de anquirina, é encontrado em todas as três linhagens; Gene 2, uma quinase associada à parede celular, é encontrado em MO17 e B73; Gene 3 e Gene 4 são quinases similares a LRR-Xa21 relacionadas que são exclusivas para MO17; e Gene 5 é uma terceira quinase similar a LRR-Xa21D completa ou parcialmente encontrada em todas as três linhagens. Mo17 possui 172 kb de 25 comprimento nessa região e Huangzhao possui 56 kb de comprimento. As descrições de sequências e a Listagem de Sequências anexas ao presente atendem às normas que regem descrições de sequências de aminoácidos e/ou nucleotídeos em pedidos de patente conforme estabelecido

" em 37 C. F. R. §1.821-1.825. A Listagem de Sequências contém o código de y uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três " letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC- IUBMB descritos em Nuc/eic Acids Res. 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical 5 J. 219 (2): 345-373 (1984), que são incorporados ao presente como referência. Os sÍmbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. §1.822. SEQ ID N° 1 é o primer de amplificação CAPS25082-L.

SEQ ID N° 2 é o primer de amplificação CAPS25082-R.

10 SEQ ID N° 3 é o primer de amplificação SNP140313-L. SEQ ID N° 4 é o primer de amplificação SNP140313-R. SEQ ID N° 5 é o primer de amplificação SNP140313-snpL. SEQ ID N° 6 é o primer de amplificação SNP140313-snpR. SEQ ID N° 7 é o primer de amplificação SNP661-L.

15 SEQ ID N° 8 é o primer de amplificação SNP661-R. SEQ ID N° 9 é o primer de amplificação SNP661-snpL. SEQ ID N° 10 é o primer de amplificação SNP661-snpR. SEQ ID N° 11 é o primer de amplificação STS1944-L. SEQ ID N° 12 é o primer de amplificação STS1944-R.

20 SEQ ID N° 13 é o primer de amplificação STS171-L. SEQ ID N° 14 é o primerde amplificação STS171-R. SEQ ID N° 15 é o primer de amplificação SSR148152-L. SEQ ID N° 16 é o primer de amplificação SSR148152-R. SEQ ID N° 17 é o primer de amplificação STSrga3195-L.

25 SEQ ID N° 18 é o primer de amplificação STSrga3195-R. SEQ ID N° 19 é o primer de amplificação STSrga840810-L. SEQ ID N° 20 é o primer de amplificação STSrga840810-R.

SEQ ID N° 21 é o primer de amplificação STSsyn1-L.

P ' W

P SEQ ID N° 22 é o primer de amplificação STSsyn1-R. SEQ ID N° 23 é marcador MZA6393 (de bacm.pk071.j12.f) que "" define uma extremidade do contíguo de BAC que cobre o sÍtio qHSR1. As versões B73 e Huangzhao dessa região marcadora são encontradas em SEQ 5 ID N° 47 e 48, respectivamente. SEQ ID N° 24 é marcador ST148 da versão MO17 de ZMMBBc0478L09f que define uma extremidade do contíguo de BAC que cobre o sÍtio qHSR1. A versão Huangzhao dessa região marcadora pode ser encontrada em SEQ ID N° 49.

10 SEQ ID N° 25 é o contíguo de BAC composto de clones sobrepostos bacm.pk071.j12, bacm.pkO07.18 e bacm2.pk166.h1 que cobre o sÍtio qHSR1. SEQ ID N° 26 é a sequência de ácido nucleico de Mo17 que representa a região de codificação de genes de um gene inibidor de xilanase 15 contido no interior do sÍtio qHRS1. SEQ ID N° 27 é o produto de tradução de SEQ ID N° 26. SEQ ID N° 28 é a sequência de ácido nucleico de B73 que representa a região de codificação de genes de um gene inibidor de xilanase contido no interior da região do genoma B73 que é sintênico para o sÍtio qHRS1.

20 SEQ ID N° 29 é o produto de tradução de SEQ ID N° 28. SEQ ID N° 30 é a região de DNA genômico de Mo17 que codifica o inibidor de xilanase de SEQ ID N° 26/27 e 3 kb acima no fluxo da região de codificação. SEQ ID N° 31 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que 25 representa a região de codificação de genes para um gene quinase de proteína associado à parede celular contido no interior do sÍtio qHRS1. SEQ ID N° 32 é o produto de tradução de SEQ ID N° 31. SEQ ID N° 33 é a região de DNA genômico de Mo17 que codifica

+ a quinase de proteína associada à parede celular de SEQ ID N° 31/32 e 2,4 kb

ÈP acima no fluxo da região de codificação.

" SEQ ID N° 34 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que representa a região de codificação de genes para um gene de proteína de 5 dimerização da famllia HAT (PCO662117) contido no interior do sítio qHRS1. SEQ ÍD N° 35 é o produto de tradução de SEQ ID N° 34. SEQ ID N° 36 é a região de DNA genômico de MO17 que codifica o gene de proteina de dimerização da família HAT de SEQ ID N° 34/35 e 2,4 kb acima no fluxo da região de codificação.

10 SEQ ID N° 37 é a sequência de ácido nucleico de Mo17 que representa a região de codificação de genes para um gene de proteína de dimerização da familia HAT (PCO662162/PCO548849/PCO523172 contido no interiordo sÍtio qHRS1. SEQ ID N° 38 é o produto de tradução de SEQ ID N° 37.

15 SEQ ID N° 39 é a região de DNA genômico de Mo17 que codifica o gene de proteína de dimerização da família HAT de SEQ ID N° 37/38 e 2,4 kb acima no fluxo da região de codificação. SEQ ID N° 40 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que representa a região de codificação de genes para um gene de proteína não 20 caracterizado (PCO648231) contido no interior do sÍtio qHRS1. SEQ ID N° 41 é o produto de tradução de SEQ ID N° 40- SEQ ID N° 42 é a região de DNA genômico de Mo17 que codifica o gene de proteina não caracterizado de SEQ ID N° 40/41 e 2,4 kb acima no fluxo da região de codificação.

25 SEQ ID N° 43 é a sequência de ácido nucleico de Mo17 que representa a região de codificação de genes para um gene de proteína não caracterizado (61 _ 24) contido no interior do sÍtio qHRS1. SEQ ID N° 44 é o produto de tradução de SEQ ID N° 43.

" SEQ ID N° 45 é a região de DNA genômico de MO17 que codifica » o gene de proteína não caracterizado de SEQ ID N° 43/44 e 2,4 kb acima no " fiuxo da região de codificação. SEQ ID N° 46 é a sequência de ácido nucleico que codifica uma 0 5 única sequência EST de MO17 contida no interior do sÍtio qHRS1. SEQ ID N° 47 é o marcador MZA6393 que cobre o sÍtio qHSR1 de Huangzhao. SEQ ID N° 48 é o marcador MZA6393 que cobre o sitio qHSR1 de B73.

10 SEQ ID N° 49 é o marcador ST148 de Huangzhao. SEQ ID N° 47 é o marcador MZA6393 de Huangzhao4.

SEQ ID N° 48 é o marcador MZA6393 de B73. SEQ ID N° 49 é o marcador STS-148 de Huangzhao4.

SEQ ID N° 50 é o primer de amplificação MZA6393L.

15 SEQ ID N° 51 é o primer de amplificação MZA6393R.

SEQ ID N° 52 é o primer de amplificação 1M2-9L.

SEQ ID N° 53 é o primer de amplificação 1M2-9R.

SEQ ID N° 54 é o marcador 1M2-9 de Mo17.

SEQ ID N° 55 é o marcador 1M2-9 de Huangzhao4.

20 SEQ ID N° 56 é o primer de amplificação E6765-3L.

SEQ ID N° 57 é o primer de amplificação E6765-3R.

SEQ ID N° 58 é o marcador E6765-3 de Mo17.

SEQ ID N° 59 é o primer de amplificação 2M4-1L.

SEQ ID N° 60 é o primer de arnplificação 2M4-1R.

25 SEQ ID N° 61 é o marcador 2M4-1 de Mo17. SEQ ID N° 62 é o primer de amplificação 2M10-5L.

SEQ ID N° 63 é o primer de amplificação 2M10-5R.

SEQ ID N" 64 é o marcador 2M10-5 de Mo17.

W 6 SEQ ID N° 65 é o primer de amplificação 2M11-3L. SEQ ID N° 66 é o primer de amplificação 2M11-3R. SEQ ID N° 67 é o marcador2M11-3 de MO17. SEQ ID N° 68 é q primer de amplificação 3M1-25L.

5 SEQ ID N° 69 é o primer de amplificação 3M1-25R. SEQ ID N° 70 é o marcador 3M1-25 de MO17. SEQ ID N° 71 é o marcador 3M1-25 de Huangzhao4. SEQ ID N° 72 é o primer de amplificação STS148-1L. SEQ ID N° 73 é o primer de amplificação STS148-1R.

10 SEQ ID N° 74 é o primer de amplificação MZA15839-4-L. SEQ ID N° 75 é o primer de amplificação MZA15839-4-R. SEQ ID N° 76 é o primer de amplificação MZA18530-16-L. SEQ ID N° 77 é o primer de amplificação MZA18530-16-R. SEQ ID N° 78 é o primer de amplificação MZA5473-801-L.

15 SEQ ID N° 79 é o primer de amplificação MZA5473-801-R. SEQ ID N° 80 é o primer de amplificação MZA16870-15-L. SEQ ID N" 81 é o primer de amplificação MZA16870-15-R. SEQ ID N° 82 é o primer de amplificação MZA4087-19-L. SEQ ID N° 83 é o primer de amplificação MZA4087-19-R.

20 SEQ ID N° 84 é o primer de amplificação MZA158-30-L. SEQ ID N° 85 é o primer de amplificação MZA158-30-R. SEQ ID N° 86 é o primer de amplificação MZA15493-15-L. SEQ ID N° 87 é o primer de amplificação MZA15493-15-R. SEQ ID N° 88 é o primer de amplificação MZA9967-11-L.

25 SEQ ID N° 89 é o prirner de amplificação MZA9967-11-R. SEQ ID N° 90 é o primer de amplificação MZA1556-23-L. SEQ ID N° 91 é o primer de amplificação MZA1556-23-R. SEQ ID N° 92 é o primer de amplificação MZA1556-801-L.

~

P SEQ ID N° 93 é o primer de amplificação MZA1556-801-R. r SEQ ID N° 94 é o primer de amplificação MZA17365-1O-L. SEQ ID N° 95 é o primer de amplificação MZA17365-1O-R. SEQ ID N° 96 é o primer de amplificação MZA17365-801-L.

5 SEQ ID N° 97 é o primer de amplificação MZA17365-801-R. SEQ ID N° 98 é o primer de amplificação MZA14192-8-L. SEQ ID N° 99 é o primer de amplificação MZA14192-8-R. SEQ ID N° 100 é o primer de amplificação MZA15554-13-L. SEQ ID N° 101 é o primer de amplificação MZA15554-13-R.

10 SEQ ID N° 102 é o primer de amplificação MZA4454-14-L. SEQ ID N° 103 é o primer de amplificação MZA4454-14-R. SEQ ID N° 104 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que representa a região de codificação de genes para proteína de repetição de anquirina (Gene 1, Figura 4).

15 SEQ ID N° 105 é o produto de tradução de SEQ ID N° 104. SEQ ID N° 106 é a região de DNA genômico de Mo17 que codifica proteina de repetição de anquirina. SEQ ID N° 107 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que representa a região de codificação de genes para hidrolase.

20 SEQ ID N° 108 é o produto de tradução de SEQ ID N" 107. SEQ ID N° 109 é a região de DNA genômico de Mo17 que cod ifica hidrolase. SEQ ID N° 110 é a sequência de ácido nucleico de Mo17 que representa a região de codificação de genes para quinase similar a LRR-Xa21 25 (Gene 3, Figura 4). SEQ ID N° 111 éo produtodetraduçãodeSEQ ID N° 110. SEQ ID N° 112 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que representa a região de codificação de genes para quinase similar a LRR-Xa21

" (Gene 4, Figura 4). . SEQ ID N° 113 éo produtodetraduçãode SEQ ID N° 112.

P SEQ ID N° 114 é a região de DNA genômico de MO17 que codifica quinase similar a LRR-Xa21 (Gene 4, Figura 4).

5 SEQ ID N° 115 é a sequência de ácido nucleico de MO17 que representa a região de codificação de genes para quinase similar a LRR- ' Xa21D (Gene 5, Figura 4). SEQ ID N° 116 é o produto detradução de SEQ ID N° 115. SEQ ID N° 117 é a região de DNA genômico de MO17 que 10 codifica quinase similar a LRR-Xa21D (Gene 5, Figura 4). DescriçÃo Detalhada DA InvençÃo A presente invençáo fornece composições alélicas em milho e métodos de identificação e seleção de plantas de milho com maior resistência ao carvão do topo. Também dentro do escopo da presente invenção, 15 encontram-se métodos e composições alélicas utilizaclas para identificar e contrasselecionar plantas de milho que possuem resistência reduzida ao carvão do topo. As definições a seguir são fornecidas como auxílio na compreensão da presente invenção. O mapeamento do sÍtio de resistência ao carvão do topo é 20 descrito no documento ldentification and Fine-Mapping of a Major qtl Conferring Resistance Against Head Smut in Maize de Yongsheng Chen, Qing Chao, Guoqing Tan, Jing Zhao, Meijing Zhang, Qing Ji e Mingliang Xu. O documento é anexado na forma de apêndice ao relatório descritivo. O termo "alelo" designa uma ou mais sequências de nucleotídeos 25 diferentes que ocorrem em um sÍtio específico. "Alelo favorável" é o alelo em um sÍtio específico que confere ou contribui com um fenótipo agronomicamente desejável, tal como aumento da resistência ao carvão do topo ou, alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas com

W redução da resistência ao carvão do topo que pode ser removido de um

W programa de cultivo ou plantio ("contrasseleção"). Um alelo favorável de um * marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável ou, alternativamente, segrega com o fenótipo vegetal desfavorável, de forma a 5 fornecer o benefício de identificação de plantas. Uma forma alélica favorável de um segmento de cromossomo é um segmento cromossômico que inclui uma sequência de nucleotídeos que contribui com desempenho agronômico superior em um ou mais sÍtios genéticos localizados fisicamente sobre o segmento cromossômico. "Frequência de alelo" designa a frequência 10 (proporção ou percentual) na qual um alelo está presente em um sitio dentro de um indivíduo, dentro de uma linhagem ou dentro de uma população de linhagens. Para o alelo "A", por exemplo, indivíduos diploides do genótipo "AA", "Aa" ou "aa" possuem frequências de alelo de 1,0, 0,5 ou 0,0, respectivamente. Pode-se estimar a frequência de alelo dentro de uma linhagem por meio de 15 cálculo da média das frequências de alelos de uma amostra de indivíduos daquela linhagem. De forma similar, pode-se calcular a frequência de alelos dentro de uma população de Iinhagens por meio de cálculo da média das frequências de alelos de linhagens que compõem a população. Para uma população com uma quantidade finita de indivíduos ou linhagens, uma 20 frequência de alelos pode ser expressa na forma de contagem de individuos ou linhagens (ou qualquer outro agrupamento especificado) que contêm o alelo. Um alelo é associado "positivamente" a uma caracteristica quando for ligado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que a caracteristica ou forma de característica desejada ocorrerá em uma planta que 25 compreende o alelo. Um alelo é associado "negativamente" a uma característica quando for ligado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que a característica ou forma de característica desejada não ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.

W b e Um indivíduo é "homozigótico" em um sitio se o indivíduo contiver apenas um tipo de alelo naquele sÍtio (um organismo diploide, por exemplo, " contém uma cópia do mesmo alelo em um sÍtio para cada um dos dois cromossomos homólogos). Um organismo é "heterozigótico" em um sítio caso 5 mais de um tipo de alelo esteja presente naquele sÍtio (tal como um indivíduo diploide com uma cópia cada de dois alelos diferentes). O termo "homogeneidade" indica que membros de um grupo possuem o mesmo genótipo em um ou mais sítios específicos. Por outro lado, o termo "heterogeneidade" é utilizado para indicar que indivíduos no grupo diferem de 10 genótipo em um ou mais sÍtios específicos. Da forma utilizada no presente, as expressões "intervalo de cromossomo" ou "segmento de cromossomo" designam um espaço linear contíguo de DNA genômico que reside na planta sobre um único cromossomo. Os elementos genéticos ou genes localizados sobre um único intervalo de 15 cromossomo são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo de cromossomo não é particularmente limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos Iocalizados dentro de um único inteNa|o de cromossomo são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética, por exemplo, menor ou igual a 20 cM ou, alternativamente, menor ou igual a 10 CM. lsso 20 significa que dois elementos genéticos em um único intervalo de cromossomo sofrem recombinação em uma frequência menor ou igual a 2Ô°/o ou 1O°/o.

O termo "cruzado" ou "cruzamento" indica a fusão de gametas por meio de polinização para produzir progênie (tais como células, sementes ou plantas). O termo engloba cruzamentos sexuados (polinização de uma planta 25 por outra) e autocruzamento (autopolinização, tal como quando o pólen e o óvulo são da mesma planta). "Teste de cruzamento superior" é um teste de progênie derivado do cruzamento de cada pai com a mesma linhagem de teste, normalmente homozigótica. O pai sendo testado pode ser uma variedade b polin izada aberta, cruzamento ou linhagem congênita. « "Mapa genético" é uma descrição de relacionamentos de ligação " genética entre sÍtios sobre um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) em uma dada espécie, geralmente ilustrado em forma de diagrama tabular.

5 "Mapeamento genético" é o processo de definição das relações de ligação de sÍtios por meio do uso de marcadores genéticos, populações que segregam os marcadores e princípios genéticos padrão de frequência de recombinação. "SÍtio de mapa genético" é um sÍtio em um mapa genético relativo a marcadores genéticos vizinhos sobre o mesmo grupo de ligação, em que pode 10 ser encontrado um marcador especificado em uma dada espécie. Caso dois marcadores diferentes possuam o mesmo sÍtio de mapa genético, os dois marcadores encontram-se em tal proximidade entre si que a recombinação entre eles ocorre com tão baixa frequência que não pode ser detectada. A ordem e as distâncias genéticas entre marcadores genéticos 15 podem diferir de um mapa genético para outro. Isso ocorre porque cada mapa genético é um produto da população de mapeamento, tipos de marcadores utilizados e potencial polimórfico de cada marcador entre populações diferentes. 10 CM do mapa genético derivado internamente (também denominado no presente "PHB", Pioneer Hi-8red) é aproximadamente equivalente a 25-30 cM 20 no mapa público de quadro de vizinhos 2005 IBM2 (mapa de alta resolução disponível em GDB de milho). As informações podem ser correlacionadas de um mapa para outro, entretanto, utilizando uma estrutura geral de marcadores comuns. Os técnicos comuns no assunto podem utilizar a estrutura de marcadores comuns para identificar as posições de marcadores genéticos e 25 QTLs em cada mapa genético individual. Uma comparação das posições de marcadores entre o mapa genético derivado internamente e o mapa genético de vizinhos IBM2 pode ser observada na Tabela 3. "Frequência de recombinação genética" é a frequência de um

W cruzamento sobre eventos (recombinação) entre dois sítios genéticos. A

P frequência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de ° marcadores e/ou características após a meiose. Uma frequência de recombinação genética pode ser expressa em centimorgans (CM), em que 1 CM 5 é a distância entre dois marcadores genéticos que exibem frequência de recombinação de 1°/0 (ou seja, um evento de cruzamento ocorre entre esses dois marcadores uma vez a cada cem divisões celulares). O termo "genótipo" é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais sítios genéticos, em comparação com a 10 característica observável (o fenótipo). Genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais sÍtios conhecidos que o indivíduo herdou dos seus pais. O termo genótipo pode ser utilizado para indicar a constituição genética de um indivíduo em um único sítio, em diversos sÍtios ou, de forma mais geral, o termo genótipo pode ser utilizado para indicar a composição genética de um indivíduo para 15 todos os genes no seu genoma. "Germoplasma" designa o material genético de um indivíduo (tal como uma planta), um grupo de indivíduos (tal como uma linhagem, variedade ou família de plantas) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultivo. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, 20 ou pode ser separado do organismo ou célula. Geralmente, o germoplasma fornece material genético com uma composição molecular específica que fornece uma base física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um cultivo de organismo ou célula. Da forma utilizada no presente, germoplasma inclui células, sementes ou tecidos dos quais podem ser 25 cultivadas novas plantas ou partes de plantas, tais como folhas, hastes, pólen ou células que podem ser cultivadas em uma planta inteira. "Haplótipo" é o genótipo de um indivíduo em uma série de sÍtios genéticos, ou seja, uma combinação de alelos. Tipicamente, os sítios genéticos

' descritos por um haplótipo são ligados física e geneticamente, ou seja, sobre o 0 mesmo segmento de cromossomo.

P "Hibridização" ou "hibridização de ácido nucleico" designa o emparelhamento de fitas de RNA e DNA complementares, bem como o 5 emparelhamento de fitas únicas de DNA complementar. "Estringência" designa as condições relativas à temperatura, resistência iônica e à presença de certos solventes orgânicos, tais como formamida, sob as quais são conduzidas hibridizações de ácido nucleico. Sob condições de alta estringência (alta temperatura e baixo teor de sal), dois ácidos nucleicos se emparelharão ou 10 "hibridizarão", apenas se houver uma alta frequência de sequências de base complementares entre eles. O termo "introgressão" designa a transmissão de um alelo desejado de um sÍtio genético de um antecedente genético para outro. A introgressão de um alelo desejado em um sÍtio especificado pode ser 15 transmitida, por exemplo, para pelo menos uma progênie por meio de cruzamento sexual entre dois pais da mesma espécie, em que pelo menos um dos pais contém o alelo desejado no seu genoma. Alternativamente, por exemplo, pode ocorrer transmissão de um alelo por meio de recombinação entre dois genomas doadores, tal como em um protoplasta fundido, em que pelo 20 menos um dos protoplastas doadores contém o alelo desejado no seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, um alelo selecionado de um marcador, QTL, transgene ou similar. Em qualquer dos casos, progênie que compreende o alelo desejado pode ser retrocruzada repetidamente em uma linhagem que possui um antecedente genético desejado, e selecionada em busca do alelo 25 desejado para resultar na fixação do alelo em um antecedente genético selecionado. Uma "linhagem" é um grupo de individuos com pais idênticos que são geralmente congênitos até certo grau e são geralmente homozigóticos e homogêneos na maior parte dos sÍtios (isogênicos ou quase isogênicos).

"Sublinhagem" designa um subconjunto congênito de descendentes que são " geneticamente distintos de outros subconjuntos congênitos similares que descendem do mesmo progenitor.

5 "Linhagem ancestral" é uma Iinhagem parental utilizada como fontes de genes, por exemplo, para o desenvolvimento de linhagens de elite. "População ancestral" é um grupo de ancestrais que contribuíram com a maior parte da variação genética que foi utilizada para desenvolver linhagens de elite, "Descendentes" são a progênie de ancestrais e podem ser separados dos seus 10 ancestrais por muitas gerações de cultivo. Linhagens de elite, por exemplo, são os descendentes dos seus ancestrais. "Estrutura de pedigree" define o relacionamento entre um descendente e cada ancestral que gerou aquele descendente. Uma estrutura de pedigree pode cobrir uma ou mais gerações, descrevendo relacionamentos entre o descendente e seus pais, avós, bisavós etc.

15 "Linhagem de elite" é uma linhagem agronomicamente superior que resultou de muitos ciclos de cultivo e seleção em busca de desempenho agronômico superior. Diversas linhagens de elite são disponíveis e conhecidas dos técnicos no assunto de cultivo de milho. "População de elite" é um conjunto de indivlduos ou linhagens de elite que podem ser utilizados para representar o 20 estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de safra, tal como milho. De forma similar, um "germoplasma de elite" ou linhagem de elite de germoplasma é um germoplasma agronomicamente superior, tipicamente derivado de uma planta com desempenho agronômico superior, tal como uma linhagem de elite 25 existente ou recém desenvolvida de milho, e/ou capaz de gerá-la, "Mapa genético IBM público" designa quafquer um dos mapas a seguir: quadro de IBM, IBM2, vizinhos de IBM2, IBM2 FPC0507, vizinhos de IBM2 2004, vizinhos de IBM2 2005 ou vizinhos de IBM2 2005. Todos os mapas

% genéticos de IBM são baseados em uma população B73 x Mo17 na qual a e progênie do cruzamento inicial foi acasalada aleatoriamente por diversas * gerações antes da construção de linhagens congênitas recombinantes para mapeamento. Versões mais novas refletem a adição de sítios mapeados por 5 BAC e genéticos bem como refinamento do mapa aprimorado devido à incorporação de informações obtidas de outros mapas genéticos. Por outro lado, uma "linhagem de milho exótica" ou um "germoplasma de milho exótico" é uma linhagem ou germoplasma derivado de milho não pertencente a uma linhagem de milho de elite disponível ou linhagem 10 de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de milho ou linhagens de germoplasma, um germoplasma exótico não apresenta relação próxima de descendente com o germoplasma de elite com o qual é cruzado.

Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de nenhuma . linhagem de elite de milho conhecida, mas sim é selecionado para introduzir 15 elementos genéticos inovadores (tipicamente alelos inovadores) em um programa de cultivo. Da forma utilizada no presente, o termo "ligação" é utilizado para descrever o grau com que o sÍtio marcador é "associado a" outro sítio marcador ou algum outro sÍtio (tal como um sÍtio de resistência ao carvão do topo). A 20 relação de ligação entre um marcador molecular e um fenótipo é fornecida como uma "probabilidade" ou "probabilidade ajustada". O valor de probabilidade (também conhecido como valor p) é a probabilidade estatística de que a combinação específica de um fenótipo e a presença ou ausência de um alelo marcador específico é aleatória. Desta forma, quanto mais baixa a avaliação de 25 probabilidades, maior a propensão à cossegregação de um fenótipo e um marcador específico. Em alguns aspectos, a avaliação de probabilidades é considerada "significativa" ou "não significativa". Em algumas realizações, uma avaliação de probabilidades de 0,05 (p = 0,05 ou probabilidade de 5°/0) de

W determinação aleatória é considerada uma indicação significativa de

Q cossegregação. Uma probabilidade aceitável pode ser, entretanto, qualquer

W probabilidade de menos de 5Õ°/o (p = 0,5). Uma probabilidade significativa pode ser, por exemplo, menos de 0,25, menos de 0,20, menos de 0,15, menos de 0,1, 5 menos de 0,05, menos de 0,01 ou menos de 0,001. No mapeamento de intervalos, a Iigação entre dois sítios marcadores pode ser calculada utilizando razões de probabilidades (ou seja, a razão entre ligação e ausência de ligação). Esta razão é mais convenientemente expressa na forma de logaritmo das razões e é denominada logaritmo do valor 10 de probabilidade (LOD) ou avaliação LOD (Risch, Science 255: 803-804 (1992)). Valor LOD de 3 entre dois marcadores indica que a ligação é mil vezes mais provável que a ausência de ligação. Valores LOD mais baixos, tais como 2,0 ou 2,5, podem ser utilizados para detectar um nlvel de Iigação maior. "SÍtios ligados" estão localizados em boa proximidade, de tal 15 forma que a recombinação meiótica entre pares de cromossomos homólogos não ocorra com alta frequência (frequência menor ou igual a 1O°/o) entre os dois sítios, tais como sitios ligados cossegregados por pelo menos cerca de 9Õ°/o do tempo, tal como 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97°/o, 98%, 99%, 99,5%, 99,75% ou mais do tempo. Os sÍtios marcadores são especialmente úteis 20 quando demonstram uma probabilidade significativa de cossegregação (ligação) com uma característica desejada (tal como aumento da resistência ao carvão do topo). Em alguns aspectos, por exemplo, esses marcadores podem ser denominados "marcadores QTL ligados". A Iigação pode ser expressa como uma faixa ou limite desejado.

25 Em algumas realizações, por exemplo, qualquer marcador é ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador quando os marcadores forem separados em menos de 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 unidades de mapa (ou CM). Ligação adicional pode ser descrita por separações de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,

" 3, 2, 1 unidades de mapa (ou CM). Em alguns aspectos, é vantajoso definir uma 0 faixa de ligação limitada,tal como 10 a 20 CM, 10 a 30 cM ou 10 a 40 cM.

" Quanto mais perto um marcador for ligado a um segundo sÍtio, melhor torna-se o indicador para o segundo sÍtio. Desta forma, "sitios ligados 5 de perto" tais como um sÍtio marcador e um segundo sÍtio exibem uma frequência de recombinação entre sÍtios de 10°/o ou menos, cerca de 9°/0 ou menos, cerca de 8°/0 ou menos, cerca de 7°/0 ou menos, cerca de 6°/0 ou menos, cerca de 5°/0 ou menos, cerca de 4°/0 ou menos, cerca de 3°/0 ou menos ou cerca de 2% ou menos. Em outras realizações, os sÍtios relevantes exibem 10 uma frequência de recombinação de cerca de 1°/0 ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, cerca de 0,5% ou menos ou cerca de 0,25% ou menos. Também se afirma que dois sítios no mesmo cromossomo e em uma distânca tal que a recombinação entre os dois sitios ocorra em uma frequência de menos de 1O°/o (tal como cerca de 9°/,, 8°/,, 7°/0, 6°/0, 5°/0, 4°/,, 3°/,, 2°/,, 1°/,, 0,75%, 0,5%, 15 0,25% ou menos) estão "próximos" entre si. Como 1 cM é a distância entre dois marcadores genéticos que exibem frequência de recombinação de 1°/0, qualquer marcador está ligado de forma próxima (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que se encontre em boa proximidade, tal como a 10 CM de distância ou menos. Dois marcadores com ligação próxima sobre o mesmo cromossomo 20 podem ser posicionados a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25, 0,1, 0,075, 0,05, 0,025 ou 0,01 CM ou menos entre si. Com referência à relação entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético que contribui com o aumento da resistência ao carvão do topo e um marcador próximo, ligação de fase de "acoplamento" 25 indica o estado em que o alelo "favorável" no sÍtio de resistência de hastes é fisicamente associado sobre a mesma fita de cromossomo do alelo "favorável" do SÍtio marcador ligado correspondente. Na fase de acoplamento, os dois alelos favoráveis são herdados juntos pela progênie que herda aquela fita de r" 28 W· cromossomo. Em ligação de fase de "repulsa", o alelo "favorável" no sitio de « interesse é ligado fisicamente a um alelo "desfavorável" no sÍtio marcador " próximo e os dois alelos "favoráveis" não são herdados juntos (ou seja, os dois sÍtios encontram-se "fora de fase" entre si).

5 A expressão "desequilíbrio de ligação" designa uma segregação não aleatória de sÍtios ou caracteristicas genéticas (ou ambos). Em qualquer um dos casos, desequillbrio de ligação indica que os sÍtios relevantes encontram-se em proximidade física suficiente ao longo de um comprimento de um cromossomo, de tal forma que sejam segregados juntos com frequência 10 maior que a aleatória (ou seja, não aleatória) (no caso de características cossegregantes, os sÍtios subjacentes às características encontram-se em proximidade suficiente entre si. Os marcadores que exibem desequilíbrio de ligação são considerados ligados. SÍtios ligados cossegregam-se mais de 50% do tempo, tal como de cerca de 51% a cerca de 1OO°/o do tempo. Em outras 15 palavras, dois marcadores que se cossegregam possuem uma frequência de recombinação de menos de 50°/o (e, por definição, são separados em menos de 50 CM sobre o mesmo grupo de ligação). Da forma utilizada no presente, a ligação pode ser realizada entre dois marcadores ou, alternativamente, entre um marcador e um fenótipo. Um sÍtio marcador pode ser "associado" (ligado) a 20 uma característica, tal como resistência ao carvão do topo. O grau de ligação de um marcador molecular a uma caracteristica fenotípica é medido, por exemplo, na forma de probabilidade estatística de cossegregação daquele marcador molecular com o fenótipo. O desequilíbrio de ligação é mais comumente determinado 25 utilizando a medida j2, que é calculada utilizando a fórmula descrita por Hill, W, G. e Robertson, A., Theor. Appl. Genet. 38: 226-231(1968). Quando r' = 1, existe LD completo entre os dois sitios marcadores, o que significa que os marcadores não foram separados por meio de recombinação e possuem a

© mesma frequência de alelos. Valores de j2 acima de 1/3 indicam LD b suficientemente forte, útil para mapeamento (Adrlie et al, Nature Reviews " Genetics 3: 299-309 (2002)). Desta forma, os alelos encontram-se em desequilíbrio de ligação quando os valores j2 entre sÍtios marcadores 5 emparelhados for maior ou igual a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0. Da forma utilizada no presente, "equiiíbrio de Iigação" descreve uma situação na qual dois marcadores segregam-se independentemente, ou seja, classificam-se aleatoriamente entre os progên ies. Marcadores que exibern equilíbrio de ligação são considerados não ligados (quer dependam eles ou 10 não do mesmo cromossomo). "SÍtio" é uma região cromossômica na qual está localizado um gene ou marcador. "SÍtio de gene", por exemplo, é um sítio de cromossomo especificado no genoma de uma espécie no qual pode ser encontrado um gene especlfico.

15 "Milho" e "milho branco" são utilizados de forma intercambiável no presente. As expressões "marcador", "marcador molecular", "ácido nucleico marcador" e "sítio marcador" designam uma sequência de nucleotídeos ou seu produto codificado (tal como uma proteina) utilizado como ponto de referência 20 ao identificar um sÍtio ligado. Um marcador pode ser derivado da sequência de nucleotldeos genômica ou de sequências de nucleotídeos expressas (tal como de um RNA ou cDNA dividido) ou de um polipeptídeo codificado. A expressão também designa sequências de ácidos nucleicos complementares ou Iaterais às sequências de marcadores, tais como ácidos nucleicos utilizados como 25 sondas ou pares de primers capazes de amplificar a sequência de marcadores. "Sonda marcadora" é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula que pode ser utilizada para identificar a presença de um sÍtio marcador, tal como uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma

" sequência de sÍtio marcador, por meio da hibridização de ácidos nucleicos.

B Sondas marcadoras que compreendem trinta ou mais nucleotídeos contíguos - do sÍtio marcador (a sequência de SÍtio marcador, "no todo ou em parte") podem ser utilizadas para hibridização de ácidos nucleicos. Alternativamente, 5 em alguns aspectos, uma sonda marcadora designa uma sonda de qualquer tipo que seja capaz de diferenciar (ou seja, genotipificar) o alelo específico que se encontra presente em um sÍtio marcador. Ácidos nucleicos são "complementares" quando se "hibridizarem" ou emparelharem especificamente em solução, tal como de acordo com normas de emparelhamento de bases 10 Watson-Crick. Os marcadores com a designação PHM representam um conjunto de primers que amplificam um pedaço especlfico de DNA, denominado no presente "amplicon". As sequências de nucleotideos dos amplicons de diversas linhagens de milho são comparadas e são identificados polimorfismos ou variações. Os 15 polimorfismos incluem polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs), repetições de sequências simples (SSRS), inserções/exclusões (indels) etc. "Alelo marcador", alternativamente "alelo de um sÍtio marcador", pode designar uma ou uma série de sequências de nucleotídeos polimórficos encontrada em um sÍtio marcador em uma população que é polimórfica para o 20 sÍtio marcador. Alternativamente, alelos marcadores designados com um número representam a combinação específica de alelos, também denominada "haplótipo", em sítios poIimórficos informativos daquele sÍtio marcador específico. Em alguns aspectos, são fornecidos sítios marcadores correlacionados com a resistência ao carvão do topo em milho.

25 "SÍtio marcador" é um sÍtio que pode ser utilizado para rastrear a presença de um segundo sÍtio ligado, ta! como um sítio ligado que codifica ou contribui com a expressão de uma caracteristica fenotlpica. Um sÍtio marcador pode ser utilizado, por exemplo, para monitorar a segregação de alelos em um

'" sÍtio, tal como QTL, que são genética ou fisicamente ligados ao sÍtio marcador. .a

"Marcadores genéticos" são ácidos nucleicos que são

- polimórficos em uma população e os alelos marcadores podem ser detectados e diferenciados por um ou mais métodos analíticos, tais como RFLP, AFLP,

5 isozima, SNP, SSR e similares.

A expressão também se refere a sequência de ácidos nucleicos complementares às sequências genômicas, tais como ácidos nucleicos utilizados como sondas.

Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por meio de métodos bem

10 estabelecidos na técnica.

Estes incluem, por exemplo, sequenciamento de DNA, métodos de amplificação específicos de sequências com base em PCR,

detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP),

detecção de marcadores de isozimas, detecção de polimorfismos de nucleotídeos por meio de hibridização específica de alelos (ASH), detecção de

15 sequências variáveis amplificadas do genoma da planta, detecção de reprodução de sequências autossustentadas, detecção de repetições de sequências simples (SSRS), detecção de polimorfismos de nucleotideos isolados

(SNPS) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs). Também são conhecidos métodos bem estabelecidos de

20 detecção de marcas de sequências expressas (ESTS) e marcadores SSR derivados de sequências EST e DNA polimórfico amplificado aleatoriamente

(RAPD). "Resistência ao carvão do topo" designa a capacidade de uma planta de milho de suportar infecções pelo fungo específico de hospedeiro

25 Sphace/otheca rei/iana (Kühn) Clint. lsso inclui, mas sem limitações, redução da produção de soros, aumento do vigor das plantas, aumento da função das borlas e aumento do rendimento de milho em comparação com pIantas de milho que não possuem o sítio de resistência descrito no presente.

á Os ácidos nucleicos e polipeptídeos conforme as realizações

P encontram uso em métodos para conferir ou aumentar a resistência a fungos " de uma planta. A fonte da resistência pode ser um sÍtio de resistência genética de ocorrência natural que sofre introgressão por meio de cultivo em uma 5 população de milho sensível que não contém o sítio de resistência ou, alternativamente, os genes que conferem a resistência podem ser expressos de forma ectópica na forma de transgenes que conferem resistência quando expressos na população sensível. Consequentemente, as composições e métodos descritos no presente são úteis na proteção de plantas contra 10 patógenos fúngicos. "Resistência a patógenos", "resistência a fungos" e "resistência a doenças" destinam-se a indicar que a planta evita os sintomas da doença que são resultado de interações entre patógenos e plantas. lsso significa que se evita que os patógenos causem doenças das plantas e os sintomas de doenças associados ou, alternativamente, os sintomas de doenças 15 causados pelo patógeno são minimizados ou reduzidos, tais como a redução da tensão e perda de rendimento associada. Os técnicos no assunto apreciarão que as composições e métodos descritos no presente podem ser utilizados com outras composições e métodos disponiveis na técnica para proteção das plantas contra ataque de patógenos.

20 Desta forma, os métodos de acordo com as presentes realizações podem ser utilizados para proteger plantas contra doenças, particularmente as doenças que são causadas por patógenos fúngicos de plantas. Da forma utilizada no presente, "resistência a fungos" designa aumento da resistência ou tolerância a um patógeno fúngico em comparação com o de uma planta do tipo 25 selvagem. Os efeitos podem variar de um leve aumento da tolerância aos efeitos do patógeno fúngico (tais como inibição parcial) até a resistência total, de tal forma que a planta não seja afetada pela presença do patógeno fúngico.

Aumento do nível de resistência contra um patógeno fúngico específico ou

'U contra um espectro mais amplo de patógenos fúngicos constitui "aumento" ou aprimoramento da resistência a fungos.

As realizações da presente invenção

" também aumentarão ou aprimorarão a resistência a patógenos fúngicos, de forma a aumentar a resistência da planta a um ou mais patógenos fúngicos.

O

5 termo "aprimorar" designa melhorar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, fazer crescer e similares.

No presente, as plantas de acordo com a presente invenção são descritas como sendo resistentes a infecções por Sphacelotheca rei/iana (Kühn) Clint ou que possuem "resistência aprimorada" a infecções por Sphace/otheca rei/iana (Kühn) Clint como resultado do sÍtio de resistência ao

10 carvão do topo de acordo com a presente invenção.

Consequentemente, elas tipicamente exibem aumento da resistência à doença em comparação com plantas equivalentes que são susceptiveis a infecções por Sphace/otheca rei/iana (Kühn) CIint, pois não contêm o sítio de resistência ao carvão do topo.

Em aspectos específicos, métodos de conferir ou aprimorar a

15 resistência a fungos em uma planta compreendem a introdução em uma planta de pelo menos um conjunto de expressão, em que o conjunto de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo antifúngico de acordo com as realizações ligado operativamente a um promotor que dirige a expressão na planta.

A planta expressa o polipeptideo, de forma a

20 conferir resistência a fungos à planta ou aumentar o nivel de resistência inerente da planta.

Em realizações específicas, o gene confere resistência ao patógeno fúngico, Sphacelotheca rei/iana (Kühn) Clint.

A expressão de um polipeptídeo antifúngico de acordo com as realizações pode ser dirigida a tecidos vegetais específicos nos quais a

25 resistência a patógenos é particularmente importante, tais como as folhas, raízes, hastes ou tecidos vasculares.

Essa expressão preferida por tecidos pode ser realizada por meio de promotores preferidos por raízes, preferidos por folhas,

preferidos por tecido vascular, preferidos por hastes ou preferidos por sementes.

¥ "Sequência de nucleotídeo", "polinucleotídeo", "sequência de ácido q nucleico" e "fragmento de ácido nucleico" são utilizados de forma intercambiável

" e designam um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla e contém opcionalmente bases de nucleotideos sintéticas, não naturais ou

5 alteradas. "Nucleotídeo" é uma unidade monomérica a partir da qual são construídos polímeros de DNA ou RNA e consiste de uma base de purina ou pirimidina, pentose e um grupo de ácido fosfórico.

Nucleotídeos (normalmente encontrados na sua forma de 5'-monofosfato) são indicados pela sua designação de letra única conforme segue: "A" para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA

10 ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato ou desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A, C ou

T, "I" para inosina e "N" para qualquer nucleotídeo.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados de

15 forma intercambiável no presente para designar um polímero de resíduos de aminoácidos.

Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são uma substância artificial análoga a um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural.

Os poIipeptídeos de acordo com as

20 realizações podem ser produzidos a partir de um ácido nucleico descrito no presente ou utilizando métodos de biologia molecular padrão.

Uma proteina truncada de acordo com as realizações pode ser produzida, por exemplo, por meio da expressão de um ácido nucleico recombinante de acordo com as realizações em uma célula hospedeira apropriada ou, alternativamente, por

25 meio de uma combinação de procedimentos ex vivo, tais como digestão e purificação de protease.

Da forma utilizada no presente, as expressões "que codifica" ou

"codificado", quando utilizadas no contexto de um ácido nucleico especlfico,

.

W indicam que o ácido nucleico compreende as informações necessárias para

R tradução direta da sequência de nucleotídeos para uma proteína especificada.

" As informações por meio das quais uma proteína é codificada são especificadas pelo uso de códons. Um ácido nucleico que codifica uma 5 proteína pode compreender sequências não traduzidas (tais como introns) em regiões traduzidas do ácido nucleico ou podem não possuir essas sequências não traduzidas intervenientes (tais como em cDNA). As realizações da presente invenção englobam composições de proteína ou polinucleotídeo isoladas ou substancialmente purificadas. Uma 10 proteína ou polinucleotídeo "isolado" ou "purificado" ou sua parte biologicamente ativa é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o polinucleotÍdeo ou proteina encontrado no seu ambiente de ocorrência natural ou interagem com ele. Desta forma, um pdinucleotideo ou protelna isofado ou purificado é substancialmente livre de 15 outro material celular ou meio de cultivo quando produzido por meio de métodos recombinantes (tais como amplificação de PCR) ou substancialmente livres de precursores químicos ou outras substâncias quando quimicamente sintetizados. ldealmente, um polinucleotÍdeo "isolado" é Iivre de sequências (tais como sequências codificadoras de proteínas) que ladeiam naturalmente o 20 pdinucleotídeo (ou seja, sequências Iocalizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotideo) no DNA genômico do organismo do qual é derivado o polinucleotÍdeo. Em várias realizações, por exemplo, o polinucleotídeo isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, cerca de 4 kb, cerca de 3 kb, cerca de 2 kb, cerca de 1 kb, cerca de 0,5 kb ou cerca de 0,1 kb de sequência de 25 nucleotídeos que ladeiam naturalmente o polinucleotídeo em DNA genômico da célula da qual é derivado o pohnucleotideo. Uma proteina que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteina que contêm menos de cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 1O°/o, cerca de 5°/0 ou

- " cerca de 1°/0 (em peso seco) de proteina contaminante. Quando a proteína de 0 acordo com as realizações ou sua parte biologicamente ativa for produzida de forma recombinante, meio de cultivo representa idealmente menos de cerca de 30%, cerca de 20°/o, cerca de 10%, cerca de 5°/0 ou cerca de 1°/0 (em peso 5 seco) de precursores químicos ou substâncias não de proteínas de interesse. Fragmentos e variantes das sequências de nucleotídeos descritas e proteínas codificadas por elas também são englobados pelas realizações. "Fragmento" destina-se a indicar uma parte da sequência de nucleotídeos ou uma parte da sequência de aminoácidos e, desta forma, a proteína codificada 10 por ela. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem codificar fragmentos de proteínas que retenham a atividade biológica da protelna nativa e, portanto, possuem a capacidade de conferir resistência a fungos sobre uma planta. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotideos que são úteis como sondas de hibridização não codificam, necessariamente, 15 fragmentos de proteinas q ue retêm atividade biológica. Desta forma, fragmentos de uma sequência de nucleotideos podem variar de pelo menos cerca de quinze nucleotídeos, cerca de cinquenta nucleotídeos, cerca de cem nucleotídeos e até a sequência de nucleotídeos de comprimento total que codifica os polipeptídeos de acordo com as realizações.

20 Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma parte biologicamente ativa de um polipeptídeo de acordo com as realizações codificará pelo menos cerca de quinze, cerca de 25, cerca de trinta, cerca de quarenta ou cerca de cinquenta aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo de comprimento 25 total das realizações, Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização ou primers de PCR geralmente não necessitam codificar uma parte biologicamente ativa de uma proteina. Da forma utilizada no presente, "sequência de comprimento total",

©

P m

W com referência a um poHnucleotídeo especificado, indica possuir a sequência e de ácido nucleico completa de uma sequência nativa. "Sequência nativa" " destina-se a indicar uma sequência endógena, ou seja, uma sequência não elaborada encontrada no genoma de um organismo.

5 Desta forma, um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de acordo com as realizações pode codificar uma parte biologicamente ativa de um polipeptídeo ou pode ser um fragmento que pode ser utilizado como sonda de hibridização ou primer de PCR utilizando os métodos descritos abaixo. Uma parte biologicamente ativa de um polipeptídeo antipatogênico pode ser 10 preparada por meio de isolamento de uma parte de uma das sequências de nucleotídeos de acordo com as realizações, que expressam a parte codificada da proteína e determinam a capacidade da parte codificada da proteína de conferir ou aumentar a resistência a fungos em uma planta. Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos de 15 acordo com as realizações compreendem pelo rnenos cerca de quinze, cerca de vinte, cerca de cinquenta, cerca de 75, cerca de cem ou cerca de 150 nucleotídeos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos de comprimento total descrita no presente. "Variantes" destina-se a indicar sequências substancialmente 20 similares. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma exclusão e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sÍtios internos no polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sÍtios no poHnucleotídeo nativo. Da forma utilizada no presente, um polinucleotÍdeo ou polipeptideo "nativo" compreende uma sequência de 25 nucleotideos ou sequência de aminoácidos de ocorrência natural, respectivamente. Os técnicos no assunto reconhecerão que serão elaboradas variantes dos ácidos nucleicos de acordo com as realizações, de forma a manter a estrutura de Ieitura aberta. Para nucleotídeos, variantes e - a

W conservadoras incluem as sequências que, devido à degeneração do código ~ genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos de " acordo com as realizações. Variantes alélicas de ocorrência natural como essas podem ser identificadas com o uso de métodos de biologia molecular 5 bem conhecidos, tais como métodos de hibridização e reação em cadeia de polimerase (PCR) conforme descrito abaixo. Pohnucleotídeos variantes também incluem polinucleotideos sinteticamente derivados, tais como os gerados, por exemplo, utilizando mutagênese dirigida o sítio, mas que ainda codificam uma proteína de acordo com as realizações. Geralmente, variantes 10 de um polinucleotideo específico das realizações possuirão identidade de sequências de pelo menos cerca de 4Õ°/o, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 6O°/q, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91°6, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94°/o, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 15 98%, cerca de 99% ou mais com aquele polinucleotídeo especifico conforme determinado por meio de programas de alinhamento de sequências e parâmetros descritos em outros pontos do presente. Variantes de um polinucleotÍdeo específico das realizações (ou seja, o polinucleotídeo de referência) podem também ser avaliados por meio de 20 comparação do percentual de identidade de sequências entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o poIipeptídeo codificado pelo polinucleotÍdeo de referência. Desta forma, são descritos, por exemplo, poiinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo com um dado percentual de identidade de sequências para o polipeptídeo de SEQ ID N° 3. O 25 percentual de identidade de sequências entre quaisquer dois polipeptideos pode ser calculado utilizando programas de alinhamento de sequências e parâmetros descritos em outro ponto do presente. Quando qualquer dado par de polinucleotÍdeos de acordo com as realizações for avaliado por meio de

" comparação do percentual de identidade de sequências compartilhado pelos m dois polipeptídeos que codificam, o percentual de identidade de sequências

' entre os dois polipeptideos codificados é de pelo menos cerca de 4Õ°/o, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de

5 7O°/j, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de

96%, cerca de 97°/o, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais.

Proteína "variante" destina-se a indicar uma proteína derivada da proteina nativa por meio de exclusão ou adição de um ou mais aminoácidos em

10 um ou mais sÍtios internos na proteina nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sÍtios na proteína nativa.

Proteínas variantes englobadas pelas realizações são biologicamente ativas, ou seja, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, a capacidade de conferir ou aumentar a resistência a patógenos fúngicos vegetais

15 conforme descrito no presente.

Essas variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana.

Variantes biologicamente ativas de uma proteína nativa de acordo com as realizações possuirão identidade de sequências de pelo menos cerca de 4Ó°/o, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 7Õ°/o, cerca de 75°/o,

20 cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais com a sequência de aminoácidos da proteína nativa conforme deteminado por meio de programas de alinhamento de sequências e parâmetros descritos em outros pontos do presente.

Uma variante

25 biologicamente ativa de uma protelna de acordo com as realizações pode diferir daquela proteína em até cerca de um a quinze resíduos de aminoácidos, até cerca de um a dez, tal como cerca de seis a dez, até cerca de cinco, até cerca de quatro, três, dois ou mesmo um resíduo de aminoácido.

W As proteínas de acordo com as realizações podem ser alteradas

W de várias formas, incluindo substituições, exclusões, truncagens e inserções de " aminoácidos. Os métodos dessas manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Variantes e fragmentos de sequências de aminoácidos das proteínas 5 antipatogênicas podem ser preparados, por exemplo, por meio de mutações no DNA. Os métodos de mutagênese e alterações de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 82: 488-492; Kunkel et al (1987), Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente Norte-Americana n° 4.873.192; Walker e Gaastra, Eds. (1983), 10 Techniques in Mo/ecu/ar Bio/ogy (MacMillan Publishing Company, New York) e referências ali mencionadas. Orientação quanto a substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al (1978), At/as of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington DC), incorporado ao 15 presente como referência. Substituições conservadoras, tais como a troca de um aminoácido por outro que possui propriedades similares, podem ser ideais.

Desta forma, os genes e polinucleotÍdeos de acordo com as realizações incluem sequências de ocorrência natural e formas mutantes. De forma similar, as proteínas das realizações englobam proteínas de ocorrência 20 natural e também suas variações e formas modificadas. Essas variantes continuarão a possuir a capacidade desejada de conferir ou aumentar a resistência a patógenos fúngicos de plantas. Obviamente, as mutações que serão realizadas no DNA que codifica a variante não devem colocar a sequência fora do quadro de leitura e, idealmente, não criarão regiões 25 complementares que poderão produzir estrutura de mRNA secundária. Vide a Patente EP n° 0075444. Não se espera que as exclusões, inserções e substituições das sequências de proteína englobadas no presente produzam alterações radicais nas características da proteína. Quando for difícil prever o efeito exato da

P substituição, exclusão ou inserção antes que isso aconteça, entretanto, os " técnicos no assunto apreciarão que o efeito será avaliado por meio da seleção de plantas transgênicas que tenham sido transformadas com a proteína 5 variante para determinar o efeito sobre a capacidade da planta de resistir a ataques patogênicos de fungos. PolinucleotÍdeos e protelnas variantes também englobam sequências e proteínas derivadas de procedimentos mutagênicos ou recombinogênicos, incluindo, sem limitações, procedimentos tais como 10 comutação de DNA. Os técnicos no assunto poderão idealizar modificações que alterariam a faixa de patógenos aos quais reage a proteína. Com esse procedimento, uma ou mais sequências de codificação de proteínas diferentes podem ser manipuladas para criar uma nova proteina que possua as propriedades desejadas. Desta forma, bibliotecas de polinucleotídeos 15 recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotÍdeos com sequências relacionadas que compreendem regiões de sequências que possuem identidade de sequências substancial e podem ser recombinadas de forma homóloga in vitro ou in vivo. Utilizando esta abordagem, por exemplo, motivos de sequências que codificam um domínio de interesse podem ser 20 comutados entre o gene de proteína das realizações e outros genes de proteinas conhecidos para obter uma nova codificação de gene para uma proteina com uma propriedade de interesse aprimorada, ta! como maior capacidade de conferir ou ampliar a resistência a patógenos fúngicos de plantas. Estratégias dessa comutação de DNA são conhecidas na técnica.

25 Vide, por exemplo, Stemmer (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747- 10751; Stemmer (1994), Nature 370: 389-391; Crameri et al (1997), Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al (1997), j. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 4504-4509; Crameri et al (1998),

+

' Nature 391:288-291; e Patentes Norte-Americanas n° 5.605.793 e 5.837.458. * Os polinucleotÍdeos de acordo com as realizações podem ser

" utilizados para isolar sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas.

Desta forma, métodos tais como PCR,

5 hibridização e similares podern ser utilizados para identificar essas sequências com base na homologia de sequências com as sequências descritas no presente.

As sequências isoladas com base na sua identidade de sequências com as sequências completas descritas no presente, suas variantes ou fragmentos são englobadas pelas realizações.

Essas sequências incluem

10 sequências que são ortólogas das sequências descritas. "Ortólogos" destina-se a indicar genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado da evolução das espécies.

Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeos e/ou suas sequências de proteína codificadas

15 compartilharem identidade de sequências de pelo menos cerca de 60°/o, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 8Ó°/o, cerca de 85°/o, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97°/o, cerca de 98%, cerca de 99°6 ou mais.

As funções de ortólogos frequentemente são altamente conservadas entre as espécies Desta

20 forma, polinucleotídeos isolados que codificam uma proteína que confere ou aumenta a resistência contra patógenos vegetais fúngicos e que se hibridizam sob condições severas nas sequências descritas no presente, suas variantes ou fragmentos, são englobados pelas realizações.

Em uma abordagem de PCR, primers de oligonucleotídeos

25 podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes de CDNA ou DNA genômico extraido de qualquer organismo de interesse.

Métodos de projeto de primers de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e descritos em Sambrook et al

" (1989), Mo/ecu/ar C/oning.' A Laboratoiy Manual (segunda edição, Cold Spring e

Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova lorque). Vide também lnnis et al,

" eds. (1990), PCR Protoco/s.' A Guide to Methods and App/ications (Academic Press, Nova lorque); lnnis e Gelfand, eds. (1 995), PCR Strategies (Academic

5 Press, Nova Iorque); e lnnis e Gelfand, eds. (1999), PCR Methods Manual (Academic Press, Nova lorque). Os métodos conhecidos de PCR incluem e não se limitam a métodos que utilizam primers emparelhados, primers abrigados, primers especificos isolados, primers degenerados, primers especificos de genes, primers específicos de vetores, primers parcialmente não

10 coincidentes e similares.

Em métodos de hibridização, um polinucleotídeo conhecido, no todo ou em parte, é utilizado como sonda que se hibridiza seletivamente em outros polinucleotideos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômicos clonados ou fragmentos de CDNA (ou seja,

15 bibliotecas genômicas ou de DNA) de um organismo selecionado.

As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA,

fragmentos de RNA ou outros oligonucleotÍdeos e podem ser marcados com um grupo detectável tal como 32p ou qualquer outro marcador selecionável.

Desta forma, por exemplo, podem ser elaboradas sondas de hibridização por meio de

20 marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base nos poIinucleotídeos de acordo com as realizações.

Métodos de preparação de sondas de hibridização e construção de cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e descritos em Sambrook et al (1989), acima.

Um polinucleotídeo completo descrito no presente ou uma ou

25 mais de suas porções, por exemplo, pode ser utilizado como sonda capaz de hibridizar-se especificamente em poIinucleotídeos correspondentes e RNAS mensageiros.

Para atingir hibridização específica sob uma série de condições, essas sondas incluem sequências que são exclusivas e idealmente contêm

" pelo menos cerca de dez nucleotideos de comprimento, pelo menos cerca de $ quinze nucleotideos de comprimento ou pelo menos cerca de vinte " nucleotídeos de comprimento. Essas sondas podem ser utilizadas para amplificar polinucleotÍdeos correspondentes a partir de um organismo 5 selecionado por meio de PCR. Este método pode ser utilizado para isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como teste de diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Os métodos de hibridização incluem seleção de hibridização de bibliotecas de DNA em placas (sejam elas placas ou colônias; vide, por 10 exemplo, Sambrook et al (1989), acima).

A hibridização dessas sequências pode ser conduzida sob condições severas. Por "condições severas" ou "condições de hibridização severas", compreende-se condições sob as quais uma sonda se hibridizará na sua sequência alvo até um grau detectavelmente maior que em outras 15 sequências (tais como pelo menos duas vezes o fundo). Condições severas são dependentes de sequências e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ao controlar a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, podem ser identificadas sequências alvo que são 1OO°/o complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as 20 condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falta de coincidência nas sequências, de tal forma que sejam detectados alguns graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda contém menos de cerca de mil nucleotideos de comprimento, idealmente menos de quinhentos nucleotideos de comprimento.

25 Tipicamente, condições severas serão aquelas em que a concentração de sais é de menos de cerca de 1,5 M de ions de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de ions (ou outros sais) sob pH 7,0 a 8,3 e a ternperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (tais

P como dez a cinquenta nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas

B longas (tais como mais de cinquenta nucleotídeos). Podem também ser ° atingidas condições severas com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida. Exemplos de condições de baixa estringência incluem 5 hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCl, 1°/0 SDS (dodecii sulfato de sódio) a 37 °C e lavagem em lX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrato trissódico) a 50-55 °C. Exemplos de condições de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% formamida, 1,0 M NaCl, 1°/0 SDS a 37 °C e lavagem em 0,5X a lX SSC a 55 até 60 °C. Exemplos 10 de condições de alta estringência incluem hibridização em 5Ô°/o formamida, 1 M NaCl, 1°/0 SDS a 37 °C e lavagem final em O,1X SSC a 60 até 65 °C por pelo menos trinta minutos. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1°/0 SDS, A duração da hibridização é geralmente de menos de cerca de 24 horas, normalmente cerca de quatro a 15 cerca de doze horas. A duração do tempo de Iavagem será de pelo menos um periodo de tempo suficiente para atingir o equilíbrio. A especificidade é tipicamente função de lavagens pós- hibridização, em que os fatores críticos são a resistência iônica e a temperatura da soIução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, o ponto de fusão 20 térmica (Tm) pode ser aproximado por meio da equação de Meinkoth e Wahl (1984), Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) " 0,41 (°/jGC) - 0,61 (°/0 form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes; °/oGC é o percentual de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, °/0 form é o percentual de formamida na soIuçâo de hibridização e L é o 25 comprimento do hibrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob pH e resistência iônica definidos) em que 5Q°/o de uma sequência alvo complementar hibridizam-se em uma sonda perfeitamente coincidente. Tm é reduzido em cerca de 1 °C para cada 1°/0 de falta de coincidência; desta forma, Tm,

P condições de hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridização 0 em sequências com a identidade desejada. Caso sejam procuradas sequências " com Z 9Ó°/o, a Tm pode ser reduzida em 10 °C. Geralmente, são selecionadas condições severas cerca de 5 °C mais baixas que a Tm para a sequência 5 específica e seu complemento sob pH e resistência iônica definidos. Condições severamente severas podem utilizar, entretanto, hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C menos que a Tn condições moderadamente severas podem utilizar hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C menos que a Tm; condições de baixa estringência podem utilizar hibridização e/ou lavagem a 11, 10 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menos que a Tm. Utilizando a equação, composições de lavagem e hibridização e Tm desejada, os técnicos comuns no assunto compreenderão que são inerentemente descritas variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem. Caso o grau desejado de resultados de falta de emparelhamento em Tm de menos de 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C 15 (solução de formamida), é ideal aumentar a concentração de SSC de forma que possa ser utilizada temperatura mais alta. Um extenso guia da hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratoiy Techniques in Biochemistiy and Mo/ecu/ar Bio/ogy — Hybridization with Nuc/eic Acid Probes, Parte I, Capltulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al, eds. (1995), Current 20 Protoco/s in Mo/ecu/ar Bio/ogy, capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley- lnterscience, Nova lorque). Vide Sambrook et al (1989), acima. Podem ser utilizados diversos procedimentos para verificar a presença ou ausência de uma sequência especifica de DNA, RNA ou proteína.

Estes incluem, por exemplo, análise Southern Blot, Northern Blot, Western Blot 25 e EIJSA. Métodos como esses são bem conhecidos dos técnicos no assunto e existem muitas referências que fornecem protocolos detalhados. Essas referências incluem Sambrook et al (1989), acima, e Crowther, J. R. (2001), The EL/SA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos.

As expressões a seguir são utilizadas para descrever os

P relacionamentos de sequências entre dois ou mais polinucleotídeos ou " poIipeptídeos: (a) "sequência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de sequências" e (d) "percentual de identidade de sequências".

5 (a) Da forma utilizada no presente, "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como base de comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou toda uma sequência especificada; como segmento de sequência genética ou cDNA de comprimento total, por exemplo, ou a sequência genética ou de DNA completa.

10 (b) Da forma utilizada no presente, "janela de comparação" faz referência a um segmento contínuo e especificado de uma sequência de polinucleotídeo, em que a sequência de polinucleotÍdeo na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou exclusões) para 15 alinhamento ideal dos dois polinucleotÍdeos. Geralmente, a janela de comparação possui pelo menos cerca de vinte nucleotídeos contíguos de comprimento e, opcionalmente, pode ser de cerca de trinta, cerca de quarenta, cerca de cinquenta, cerca de cem ou mais longa. Os técnicos no assunto compreendem que, para evitar alta similaridade com uma sequência de referência devido à 20 inclusão de lacunas na sequência de polinucleotideo, uma penalidade de inteNa|o é tipicamente introduzida e subtraída do número de coincidências. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Desta forma, a determinação do percentual de identidade de sequências entre quaisquer duas sequências pode ser realizada utilizando 25 um algoritmo matemático. Exemplos não limitadores desses algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988), CAB/OS 4: 11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482 (1970); o algoritmo de alinhamento global de Needleman & Wunsch (1970), J.

m

W « ' Mol. Biol. 48: 443-453; o método de alinhamento de busca local de Pearson e b Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 872264, modificado como em Karlin e Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5873-5877.

5 lmplementações computadorizadas desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências, para determinar a identidade de sequências. Essas implementações incluem, sem limitações: CLUSTAL no programa PC/Gene (d isponível por meio da lntelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0), GAP, 10 BESTFIT, BLAST, FASTA e T FASTA no pacote de software genético GCG Wisconsin, Versão 10 (disponível por meio da Accelrys lnc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, Estados Unidos). Alinhamentos utilizando esses programas podem ser realizados utilizando os parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al (1988), Gene 73: 237-244 (1988): 15 Higgins et al, (1989), CAB/OS 5: 151-153; Corpet et al (1988), Nuc/eic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al (1992), CAB/OS 8: 155-65; e Pearson et al (1994), Meth. Mol. Biol. 24: 307-331. O programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller (1988), acima. Uma tabela de resíduos em peso PAM120, uma penalidade de comprimento do intervalo de 12 e penalidade do intervalo de 4 20 podem ser utilizadas com o programa ALIGN ao comparar sequências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul et al (1990), J. Mol. Biol. 215: 403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990), acima. Pesquisas de nucleotideos de BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, avaliação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de 25 nucleotídeos homólogas a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteina de acordo com as realizações. Pesquisas de proteínas de BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, avaliação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína

M ou polipeptídeo de acordo com as realizações. Para obter alinhamentos em e inteNa|os para fins de comparação, pode-se utilizar BLAST em intervalos (em " BLAST 2.0) conforme descrito em Altschul et al (1997), Nuc/e/c Acids Res. 25:

3389. Alternativamente, pode-se utilizar PSI-BLAST (em BLAST 2.0) para 5 realizar uma pesquisa que sofreu iteração que detecta relações distantes entre moléculas. Vide Altschul et al (1997), acima. Ao utilizar-se BLAST, BLAST em intervalos e PSI-BLAST, podem ser utilizados os parâmetros padrão dos programas correspondentes (tais como BLASTN para sequências de nucleotídeos e BLASTX para proteínas). Vide wwwmcbi.nlm,nih.gov. Pode-se 10 também realizar alinhamento manual por meio de inspeção- A menos que indicado em contrário, os valores de similaridade e identidade de sequências 'fornecidos no presente designam o valor obtido utilizando GAP Versão 10, empregando os parâmetros a seguir: O percentual de identidade e de similaridade para uma sequência de nucleotideos utilizando 15 Peso de lntervalo de 50 e Peso de Comprimento de 3 e a matriz de avaliação nwsgapdna.cmp; percentual de identidade e percentual de similaridade para uma sequência de aminoácidos utilizando Peso de Lacuna de 8 e Peso de Comprimento de 2 e a matriz de avaliação BLOSUM62; ou qualquer de seus programas equivalentes. Por "programa equivalente", designa-se qualquer 20 programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gere um alinhamento que possui coincidências de resíduos de aminoácidos e nucleotídeos idênticas em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970), j. Mol.

25 Biol. 48: 443-453, para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de coincidências e minimiza o número de intervalos. GAP considera todos os alinhamentos e posições de intervalo possiveis e cria o alinhamento com o maior número de bases coincidentes e menos intervalos.

' Ele permite o fornecimento de uma penalidade de criação de intervalos e uma b penalidade de extensão de intervalos em unidades de bases coincidentes. GAP " necessita ter um lucro do número de coincidências de criação de intervalos para cada intervalo que insere. Caso seja selecionada uma penalidade de 5 extensão de intervalo maior que zero, GAP necessita ter adicionalmente um lucro para cada intervalo inserido do comprimento do inteNa|o vezes a penalidade de extensão de intervalo. Valores de penalidade de criação de intervalos padrão e valores de penalidade de extensão de intervalos na Versão 10 do Pacote de Software Genético GCG Wisconsin para sequências de , 10 proteína são 8 e 2, respectivamente. Para sequências de nucleotídeos, a penalidade de criação de intervalo é de 50, enquanto a penalidade de extensão de intervalo padrão é de 3. As penalidades de criação de intervalo e de extensão de intervalo podem ser expressas na forma de número inteiro selecionado a partir do grupo de números inteiros que consiste de 0 a 200.

15 Desta forma, por exemplo, as penalidades de criação de intervalo e de extensão de intervalo podem ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou mais. GAP apresenta um membro da família de melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros dessa família e nenhum outro membro possui 20 melhor qualidade. GAP exibe quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, ldentidade e Similaridade. A Qualidade é a medida maximizada a fim de alinhar as sequências. A razão é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. O percentual de identidade é o percentual dos simbolos realmente coincidentes. O percentual de similaridade 25 é o percentual dos sÍmbolos que são similares. Os sÍmbolos que se encontram através dos intervalos são ignorados. Uma similaridade é avaliada quando o valor matriz de avaliação para um par de sÍmbolos for maior ou igual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz de avaliação utilizada na Versão 10 do Pacote

E ' de Software Genético GCG Wisconsin é BLOSUM62 (vide Henikoff e Henikoff

P (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 10915).

(C) Da forma utilizada no presente, "identidade de sequências"

P ou "identidade" no contexto de dois polinucleotídeos ou sequências de 5 polipeptídeos refere-se aos resíduos nas duas sequências que são idênticas quando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Quando o percentual de identidade de sequências for utilizado como referência a proteínas, reconhece-se que as posições de residuos que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácidos 10 conseNadoras, em que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros residuos de aminoácidos com propriedades químicas similares (tais como carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula, Quando as sequências diferirem de substituições conservadoras, o percentual de identidade de sequências pode ser ajustado para cima para 15 corrigir a natureza conservadora da substituição. Afirma-se que as sequências que diferem dessas substituições conseNadoras possuem "similaridade de sequências" ou "similaridade". Meios de realização desse ajuste são bem conhecidos dos técnicos no assunto, Tipicamente, isso envolve a avaliação de uma substituição conservadora como coincidência parcial e não total, de forma a 20 aumentar o percentual de identidade de sequências. Desta forma, por exemplo, quando um aminoácido idêntico receber uma avaliação 1 e uma substituição não conservadora receber uma avaliação zero, uma substituição conservadora recebe uma avaliação de zero a 1. A avaliação de substituições conservadoras é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE 25 Qntelligenetics, Mountain View, Califórnia). (d) Conforme utilizado no presente, "percentual de identidade de sequências" indica o valor determinado por meio da comparação de duas sequências idealmente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em a que a parte da sequência de pohnucleotídeos na janela de comparação pode 0 compreender adições ou exclusões (ou seja, intervalos) em comparação com a " sequência de referência (que não compreende adições nem exclusões) para alinhamento ideal das duas sequências. O percentual é calculado por meio de 5 determinação da quantidade de posições em que o resíduo de aminoácidos ou base de ácido nucleico idêntico ocorre nas duas sequências para gerar o número de posições coincidentes, dividindo o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por cem para gerar o percentual de identidade de sequências.

10 O uso do termo "poIinucleotÍdeo" não se destina a limitar as realizações a polinucleotídeos que compreendem DNA. Os técnicos comuns no assunto reconhecerão que polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos.

Esses desoxirribonucleotideos e ribonucleotídeos incluem moléculas de 15 ocorrência natural e análogos sintéticos. Os polinucleotídeos das realizações também englobam todas as formas de sequências, incluindo, sem limitações, formas de fita única, formas de fita dupla e similares. Os poIinucleotÍdeos isolados de acordo com as realizações podem ser incorporados a construções de DNA recombinantes capazes de 20 introdução e reprodução em uma célula hospedeira. "Vetor" pode ser uma construção que inclui um sistema de reprodução e sequências que são capazes de transcrição e tradução de uma sequência de codificação de polipeptídeos em uma dada célula hospedeira. Diversos vetores apropriados para a transfecção estável de células vegetais ou para o estabelecimento de 25 plantas transgênicas foram transcritos, por exemplo, em Pouwels et al, Cloning Vectors.' A Laboratoty Manual, 1985, supl. 1987; Weissbach e Weissbach, Methods for P/ant Mo/ecu/ar Bio/ogy, Academic Press, 1989; e Flevin et al, P/ant Mo/ecu/ar Bio/ogy Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990.

Q ^

W ' Tipicamente, vetores de expressão de plantas incluem, por exemplo, um ou 0 mais genes vegetais clonados sob o controle de transcrição de sequências " reguladoras 5' e 3' e um marcador selecionável dominante. Esses vetores de expressão vegetal podem também conter uma região reguladora promotora (tal 5 como uma região reguladora que controla a expressão específica de tecidos ou células, regulada pelo ambiente ou por desenvolvimento, indutível ou constitutiva, um sÍtio de início de transcrição, um sitio de ligação de ribossomos, um sinal de processamento de RNA, um sÍtio de término de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

10 As expressões "construção recombinante", "conjunto de expressão", "construção de expressão", "construção quimérica", "construção", "construção de DNA recombinante" e "fragmento de DNA recombinante" são utilizadas de forma intercambiável no presente e são fragmentos de ácido nucleico. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial 15 de fragmentos de ácidos nucleicos, que incluem, sem limitações, sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Uma construção de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação 20 derivadas da mesma fonte e dispostas de uma forma diferente da encontrada na natureza. Essa construção pode ser utilizada por si própria ou pode ser empregada em conjunto com um vetor. Caso seja utilizado um vetor, a seleção do vetor depende do método que será empregado para transformar células hospedeiras como é bem conhecido dos técnicos no assunto. Pode ser 25 utilizado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. Os técnicos no assunto conhecem bem os elementos genéticos que devem estar presentes sobre o vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras que compreendem qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico m - 0 0 isolados de acordo com as realizações. A seleção para obter Iinhagens que b exibem o nível e padrão desejado de expressão dos polinucleotÍdeos ou do " sÍtio Rcgl pode ser realizada por meio de amplificação, análise Southern de DNA, análise Northern da expressão de mRNA, análise de imunomanchas da 5 expressão de proteína, análise fenotípica e similares. A expressão "construção de DNA recombinante" designa uma construção de DNA montada a partir de fragmentos de ácidos nucleicos obtidos de diferentes fontes. Os tipos e origens dos fragmentos de ácido nucleico podem ser muito diversos.

10 Em algumas realizações, são adicionalmente fornecidos conjuntos de expressão que compreendem um promotor ligado operativamente a uma sequência de nucleotideos heteróloga de acordo com as realizações. Os l conjuntos de expressão das realizações encontram uso na geração de plantas transformadas, células vegetais e micro-organismos e na prática dos métodos 15 de indução da resistência a patógenos fúngicos de plantas descritos no presente. O conjunto de expressão incluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas operativamente a um polinucleotideo de acordo com as realizações.

"Ligado operativamente" destina-se a indicar uma Iigação funcional entre dois ou mais elementos. "Sequências reguladoras" designam sequências de 20 nucleotídeos localizadas acima no fluxo (sequências não codificadoras 5'), no interior ou abaixo no fluxo (sequências não codificadoras 3') de uma sequência de codificação e que podem influenciar a transcrição, processamento de RNA, estabilidade ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir, mas sem limitações, promotores, sequências líderes 25 de tradução, introns e sequências de reconhecimento de poIiadenilação. Uma ligação operativa entre um poIinucleotídeo de interesse e uma sequência reguladora (tal como um promotor) é, por exemplo, uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotideo de interesse. Elementos Iigados

Q operativamente podem ser contíguos ou não contíguos. Quando utilizado para

V designar a ligação de duas regiões de codificação de proteínas, Iigado operativamente indica que as regiões de codificação encontram-se no mesmo quadro de leitura. O conjunto pode conter adicionalmente pelo menos um gene 5 adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, O(S) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecido(s) sobre diversos conjuntos de expressão. Esse conjunto de expressão é equipado com uma série de sÍtios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do poIinucleotideo que codifica um polipeptídeo antipatogênico que fica sob a regulagem de transcrição das 10 regiões reguladoras. O conjunto de expressão pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis. O conjunto de expressão incluirá, na direção 5'-3' de transcrição, uma região de início de transcrição (ou seja, um promotor), uma região de início de tradução, um polinucleotÍdeo de acordo com as realizações, uma 15 região de término de tradução e, opcionalmente, uma região de término de transcrição funcional no organismo hospedeiro. As regiões reguladoras (ou seja, promotores, regiões de regulagem da transcrição e regiões de término de tradução) e/ou o polinucleotÍdeo de acordo com as realizações podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões 20 reguladoras e/ou o polinucleotídeo de acordo com as realizações podem ser heterólogos para a célula hospedeira ou entre si. Da forma utilizada no presente, "heterólogo", com relação a uma sequência, indica uma sequência que se origina de uma espécie exógena ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada da sua forma nativa em sua composição e/ou 25 sÍtio genômico por meio de intervenção humana deliberada. Um promotor ligado operativamente a um polinucleotídeo heterólogo, por exemplo, é de uma espécie diferente da espécie da qual foi derivado o poHnucleotídeo ou, se da mesma espécie ou análoga, um ou ambos são substancialmente modificados

W da sua forma original e/ou sÍtio genômico ou o promotor não é o promotor 0 nativo para o polinucieotideo ligado operativamente.

- A região de término opcionalmente incluída pode ser nativa com a região de inicio de transcrição, pode ser nativa com o polinucleotídeo de 5 interesse ligado operativamente, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, exógena ou heteróloga) para o promotor, o polinucleotÍdeo de interesse, o hospedeiro ou qualquer de suas combinações. Regiões de término convenientes são disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de término de octopino 10 sintase e nopalino sintase. Vide também Guerineau et al (1991), Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991), Ce// 64: 671-674; Sanfacon et al (1991), Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al (1990), P/ant Ce// 2: 1261-1272; Munroe et al (1990), Gene 91: 151-158; Ballas et al (1989), Nuc/eic Acids Res. 17: 7891-7903; e joshi et al (1987), Nuc/e/c Acids Res. 15: 9627-9639. Em 15 realizações específicas, utiliza-se o terminal do gene inibidor de protease de batata || (Pinll). Vide, por exemplo, Keil et al (1986), Nucl. Acids Res. 14: 5641- 5650; e An et al (1989), Plant Ce// 1: 115-122, integralmente incorporados ao presente como referência. Diversos promotores podem ser utilizados na prática das 20 realizações, incluindo o promotor nativo da sequência de polinucleotideos de interesse. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Uma ampla variedade de promotores vegetais é discutida na análise recente de Potenza et al (2004), ln Vitro Cell Dev. Biol. - P/ant 40: 1-22, integralmente incorporado ao presente como referência. Os ácidos nucleicos 25 podem ser combinados, por exemplo, com promotores constitutivos, preferidos de tecido, indutíveis por patógenos ou outros para expressão em plantas. Esses promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos em WO 99/43838 e

" na Patente Norte-Americana n° 6.072.050; o promotor 35S de CaMV central

P (Odell et al (1985), Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al (1990), " P/ant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al (1989), P/ant' Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al, (1992), P/ant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last 5 et al (1991), Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al (1984), EMBO J. 3: 2723-2730); promotor de ALS (Patente Norte-Americana n° 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785,

5.399.680, 5.268.463, 5.608.142 e 6.177.611.

10 Pode às vezes ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor indutível, particularmente de um promotor indutível por patógeno. Esses promotores incluem os de proteínas relativas a patogênese (protelnas PR), que são induzidas após infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, protelnas SAR, beta-1,3-glucanase, chitinase etc. Vide, por exemplo, 15 Redolfi et al (1983), Neth. j. P/ant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al (1992), P/ant Ce// 4: 645-656; e Van Loon (1985), Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Vide também WO 99/43819, incorporada ao presente como referência. São de interesse promotores que resultam na expressão de uma proteína localmente no local de infecção por patógenos ou perto dele. Vide, por 20 exemplo, Marineau et al (1987), P/ant Mol. Biol. 9: 335-342; Matton et al (1989) Mo/ecu/ar Plant-iWicrobe lnteractions 2: 325-331; Somsisch et al (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 2427-2430: Somsisch et al (1988), Mol. Gen, Genet. 2: 93-98; e Yang (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 14972-

14977. Vide também Chen et al (1996), P/ant j. 10: 955-966; Zhang et al 25 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 2507-2511; Warner et al (1993), P/ant j. 3: 191-201; Siebertz et al (1989), P/ant Ce// 1: 961-968; Patente Norte- Americana n° 5.750.386 (indutivel por nematoides); e as referências ali mencionadas. É de interesse específico o promotor indutível para o gene PRms

" de milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moni/iforme (vide,

W por exemplo, Cordero et al (1992), Physiol. Mol. Plant Path. 41: 189-200).

K Além disso, como os patógenos entram nas plantas através de feridas ou danos por insetos, pode-se utilizar um promotor indutível por feridas 5 nas construções de acordo com as realizações. Esses promotores indutíveis por feridas incluem o gene inibidor de proteinase de batata (pin ll) (Ryan (1990), Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; e Duan et al (1996), Nature Biotechno/ogy 14: 494-498); wunl e wun2, Patente Norte-Americana n°

5.428.148; winl e win2 (Stanford et al (1989), Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); 10 sistemina (McGurl et al (1992), Science 225: 1570-1573); WlPl (Rohmeier et al (1993), P/ant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp et al (1993) FEBS Letters 323: 73-76); MPl gene (Corderok et al (1994), P/ant J. 6 (2): 141-150) e similares, incorporados ao presente como referência. Podem ser utilizados promotores com regulagem quimica para 15 modular a expressão de um gene em uma planta por meio da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor indutível por substâncias, em que a aplicação da substância induz a expressão genética ou um promotor reprimível por substâncias, em que a aplicação da substância reprime a expressão genética. Promotores indutíveis 20 por substâncias são conhecidos na técnica e incluem, sem limitações, o promotor ln2-2 de milho, que é ativado por agentes de segurança herbicidas de benzenossulfonamida, o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofÍlicos hidrofóbicos que são utilizados como herbicidas pré-emergência e o promotor PR-la de fumo, que é ativado por ácido salicüico. Outros 25 promotores regulados por substâncias de interesse incluem promotores que reagem a esteroides (vide, por exemplo, o promotor indutível por glucocorticoide em Schena et al (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 10421-10425 e McNellis et al (1998), P/ant J. 14 (2): 247-257) e promotores indutíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz

Q

V et al (1991), Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 e Patentes Norte-Americanas n° " 5.814.618 e 5.789.156), incorporadas ao presente como referência. Promotores preferidos de tecidos podem ser utilizados para dirigir 5 a expressão aprimorada dos polipeptideos de acordo com as realizações em um tecido vegetal específico. Um promotor preferido de tecido pode ser utilizado, por exemplo, para expressar um polipeptídeo em um tecido vegetal em que a resistência a doenças é particularmente importante, tal como as raízes, a haste ou as folhas. Os promotores preferidos por tecidos incluem 10 Yamamoto et al (1997), P/ant J. 12 (2): 255-265; Kawamata et al (1997), P/ant Ce// Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al (1997), Mol. Gen. Genet. 254 (3): 337-343; Russell et al (1997), Transgenic Res. 6 (2): 157-168; Rinehart et al (1996), P/ant Physlol. 112 (3): 1331-1341; Van Camp et al (1996), P/ant Physiol. 112 (2): 525-535; Canevascini et al (1996), P/ant Physiol. 112 (2): 513- 15 524; Yamamoto et al (1994), P/ant Ce/l Physiol. 35 (5): 773-778; Lam (1994), Results Probl. Ce// Dih'er. 20: 181-196; Orozco et al (1993), P/ant Mol. Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (20): 9586-9590; e Guevara-Garcia et al (1993), P/ant J. 4 (3): 495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

20 Promotores preferidos de tecido vascular são conhecidos na técnica e incluem os promotores que dirigem seletivamente a expressão de proteína, por exemplo, em tecido de xilema e floema. Os promotores preferidos por tecido vascular incluem e não se limitam ao promotor de gene prunasina hidrolase de Prunus serotina (vide, por exemplo, Patente lnternacional n° WO 25 03/006651) e também os encontrados no Pedido de Patente Norte-Americano com Número de Série 10/109.488. Promotores preferidos de hastes podem ser utilizados para dirigir a expressão de um poIipeptídeo de acordo com as realizações. Exemplos de

W ^ « promotores preferidos de haste incluem o promotor de gene MS8-15 de milho (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.986.174 e o Pedido " lnternacional n° WO 98/00533) e os encontrados em Graham et al (1997), P/ant Mol B/ol 33 (4): 729-735.

5 Promotores preferidos por folha são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Yamamoto et al (1997), P/ant J. 12 (2): 255-265; Kwon et al (1994), P/ant Physiol. 105: 357-67; Yamamoto et al (1994), Plant Ce// Physiol.

35 (5): 773-778; Gotor et al (1993), P/ant J. 3: 509-18; Orozco et al (1993), Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129-1138; e Matsuoka et al (1993), Proc. Natl. Acad.

10 Sci. U. S. A., 90 (20): 9586-9590. Os promotores preferidos de raizes são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos disponíveis na literatura ou isolados do zero a partir de diversas substâncias compativeis. Vide, por exemplo, Hire et al (1992), P/ant Mol. Biol. 20 (2): 207-218 (gene glutamina sintetase específico de 15 raiz de soja); Keller e Baumgartner (1991), P/ant Ce// 3 (10): 1051-1061 (elemento de controle especifico de raízes no gene GRP 1.8 de feijão francês); Sanger et al (1990), Plant Mol. Biol. 14 (3): 433-443 (promotor especifico de raízes do gene manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); e Miao e't al (1991), Plant Cell 3 (1): 11-22 (clone de CDNA de comprimento total 20 que codifica glutamino sintetase (GS) citosólica, que é expressa em raízes e nódulos de raizes de soja). Vide também Bogusz et al (1990), P/ant Cell 2 (7): 633-641, em que são descritos dois promotores específicos de raízes isolados de genes de hemoglobina do não legume fixador de nitrogênio Parasponia andersonii e do não legume não fixador de nitrogênio relacionado Trema 25 tomentosa. Os promotores desses genes foram ligados a um gene relator de B- glucuronidase e introduzidos no não legume Nicotiana tabacum e no legume Lotus cornicu/atus e, nos dois casos, preservou-se a atividade promotora específica de raízes. Leach e Aoyagi (1991) descrevem a sua análise dos

% 0

UB

W promotores dos genes indutores de raízes rolC e rolD com alta expressão de Agrobacterium rhizogenes (vide Plant Science (Limerick) 79 (1): 69-76). Eles ' concluíram que os determinantes de DNA preferidos de tecido e amplificadores são dissociados nesses promotores. Teeri et al (1989) utilizaram fusão genética 5 para lacZ para demonstrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium que codifica octopino sintase é especialmente ativo na epiderme da extremidade de raízes e que o gene TR2' é específico de raizes na planta intacta e estimulado por meio de ferida em um tecido de folhas, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (vide 10 EMBO J. 8 (2): 343-350). O gene TRI', fundido a npt// (neomicina fosfotransferase ll), exibiu características similares. Promotores preferidos de raízes adicionais incluem o promotor genético VfENOD-GRP3 (Kuster et al, (1995), P/ant Mol. Biol. 29 (4): 759-772); e o promotor rol8 (Capana et al (1994), P/ant Mol. Biol. 25 (4): 681-691. Vide também as Patentes Norte- 15 Americanas n° 5.837.876, 5.750.386, 5.633.363, 5.459.252, 5.401.836,

5.110.732e5.023.179. Os promotores "preferidos de sementes" incluem promotores "específicos de sementes" (os promotores ativos durante o desenvolvimento de sementes tais como promotores de proteínas de armazenagem de sementes) 20 bem como promotores de "germinação de sementes" (os promotores ativos durante a germinação de sementes). Vide Thompson et al (1989), 81oEssays 10: 108, incorporado ao presente como referência. Esses promotores preferidos em sementes incluem, sem limitações, Ciml (mensagem induzida por citoquinina), cZ19B1 (zeina de 19 kDa de milho); milps (l-fosfato de 25 mioinositol sintase) (vide WO 00/11177 e Patente Norte-Americana n°

6.225.529, incorporada ao presente como referência). Gamazeina é um promotor específico de endosperma preferido. Glob-l é um promotor específico de embriões preferido. Para dicotiledôneas, promotores específicos de a sementes incluem e, sem limitações, f3-faseolina de feijão, napina, f3- . conglicinina, lectina de soja, cruciferina e similares.

Para monocotiledôneas,

" promotores específicos de sementes incluem, sem limitações, zeina de 15 kDa de milho, zeina de 22 kDa, zeina de 27 kda, g-zeina, ceroso, contraído 1,

5 contraído 2, globulina 1 etc.

Vide também WO 00/12733, em que são descritos promotores preferidos de sementes de genes endl e end2; incorporada ao presente como referência.

São conhecidas modificações de sequências adicionais para aumentar a expressão genética em hospedeiros celulares.

Estas incluem a

10 eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítios de divisão de exon-intron, repetições similares a transposson e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão genética.

O teor de G-C da sequência pode ser ajustado em níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por meio de

15 referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira.

Quando possÍvel, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias de grampo de cabelo previstas.

Conjuntos de expressão podem conter adicionalmente sequências Iíderes 5'. Essas sequências lideres podem agir para aprimorar a

20 tradução.

Os Ilderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, tais como líder de EMCV (região não codificadora 5' de encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al (1989), Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U. S.

A. 86: 6126-6130): líderes de potivírus, tais como lider de TEV (vírus da corrosão do fumo) (Gallie et al (1995), Gene 165 (2): 233-238), líder de MDMV (VÍrus de

25 Mosaico Anão de Milho) e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al (1991), Nature 353: 90-94); líder não traduzido do mRNA de proteina de revestimento de vÍrus mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al (1987), Nature 325: 622-625); lider de vÍrus

' mosaico de fumo (TMV) (Gallie et al (1989) em Mo/ecu/ar Bio/ogy of RNA, Ed.

W Cech (Liss, Nova lorque), págs. 237-256); e líder de vÍrus de manchas " cloróticas de milho (MCMV) (Lommel et al (1991), Viro/ogy 81: 382-385). Vide também Della-Cioppa et al (1987), P/ant Physiol. 84: 965-968. Outros métodos 5 conhecidos por aprimorarem a tradução podem também ser utilizados, tais como introns e similares. Na preparação do conjunto de expressão, os diversos fragmentos de DNA podem ser manipulados, de forma a fornecer as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura 10 adeq uado. Com este propósito, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer sÍtios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Com este propósito, podem ser envolvidos mutagênese in vitro, reparo de primers, restrição, 15 combinação e ressubstituições, tais como transições e transversões. O conjunto de expressão pode também compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam a resistência 20 a antibióticos, tais como os que codificam neomicina fosfotransferase || (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos tais como j3-galactosidase e proteinas fluorescentes 25 tais como proteina fluorescente verde (GFP) (Su et al (2004), Biotechnol. Bioeng. 85: 610-9 e Fetter et al (2004), P/ant Ce// 16: 215-28), proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte et al (2004), J. Ce/l Science 117: 943-54 e Kato et al (2002), Plant Physiol 129: 913-42) e proteína fluorescente amarela

"" (PhiYFP® da Evrogen, vide Bolte et al (2004), J. Ce// Sc/ence 117: 943-54). b Para marcadores selecionáveis adicionais, vide, de forma geral, Yarranton · (1992), Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 6314-6318; Yao et al (1992), Ce// 71: 63-72; Reznikoff 5 (1992), Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al (1980) em The Operon, págs. 177-220; Hu et al (1987), Ce// 48: 555-566; Brown et al (1987), Ce/l 49: 603-612; Figge et al (1988), Ce// 52: 713-722; Deuschle et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 86: 5400-5404; Fuerst et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 2549-2553; Deuschle et al (1990), Science 248: 480-483; Gossen (1993) Tese de 10 Ph.D, Universidade de Heidelberg; Reines et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 1917-1921; Labow et al (1990), Mol. Ce//. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 3952-3956; Baim et al (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 5072-5076; Wyborski et al (1991), Nuc/eic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989), Topics Mol. Struct. Biol. 10: 143- 15 162; Degenkolb et al (1991), Ant'imicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al (1988), Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993), Tese de Ph.D, Universidade de Heidelberg; Gossen et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A. 89: 5547-5551; Oliva et al (1992), Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913- 919; e Hlavka et al (1985), Handbook of Experimental Pharmaco/ogy, Vol. 78 20 (Springer-Verlag, Berlim); gj|| et al (1988), Nature 334: 721-724. Essas descrições são incorporadas ao presente como referência. A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitadora. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado nas realizações.

25 Em certas realizações, as sequências de ácidos nucleicos de acordo com as realizações podem ser reunidas com qualquer combinação de sequências de poHnucleotídeos de interesse, a fim de criar plantas com um fenótipo desejado, Essa reunião pode ser realizada por meio de uma

W combinação de genes na construção de DNA ou de cruzamento de Rcgl com b uma outra linhagem que compreende a combinação. Os polinucleotÍdeos de ' acordo com as realizações podem ser reunidos, por exemplo, com quaisquer outros polinucleotídeos de acordo com as realizações ou com outros genes. As 5 combinações geradas podem também incluir diversas cópias de qualquer um dos polinucleotÍdeos de interesse. Os polinucleotideos de acordo com as realizações podem também ser reunidos com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma série de combinações de características desejadas que incluem, sem limitações, características 10 desejáveis para ração animal tais como genes com alto teor de óleo (por exemplo, Patente Norte-Americana n° 6.232.529); aminoácidos equilibrados (tais como hordotioninas (Patentes Norte-Americanas n° 5.990.389, 5.885.801,

5.885.802 e 5.703.409); cevada com alto teor de lisina (VVilliamson et al (1987), Eur. J. Biochem. 165: 99-106; e WO 98/20122); e proteínas com alto teor de 15 metionina (Pedersen et al (1986), J. Biol. Chem. 261: 6279: Kirihara et al (1988), Gene 71: 359: e Musumura et al (1989), P/ant Mol. Biol. 12: 123)); aumento da digeribilidade (tal como proteínas de armazenagem modificadas (Pedido Norte-Americano com número de série 10/053.410, depositado em sete de novembro de 2001); e tiorredoxinas (Pedido Norte-Americano com 20 número de série 10/005.429, depositado em três de dezembro de 2001)), cujos relatórios descritivos são integralmente incorporados ao presente como referência. Os polinucleotídeos de acordo com as realizações podem também ser reunidos a características desejáveis para resistência a insetos, doenças ou herbicidas (tais como proteinas tóxicas Bac/llus thuringiensis (Patentes Norte- 25 Americanas n° 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881; Geiser et al (1986), Gene 48: 109); lectinas (van Damme et al (1994), P/ant Mol. Biol.

24: 825); genes de desintoxicação de fumonisina (Patente Norte-Americana n°

5.792.931); genes de resistência a doenças e virulência (Jones et al (1994),

H .

P ' Science 266:789; Martin et al (1993), Science 262: 1432; Mindrinos et al

P (1994), Ce// 78: 1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que geram · resistência a herbicidas tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidores de glutamino sintase tais como fosfinotricina ou basta (tais como gene bar): e 5 resistência a glifosato (genes EPSPS, genes GAT tais como os descritos no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° US 2004/0082770, além de WO 02/36782 e WO 03/092360)); e características desejáveis para processamento ou produtos de processo tais como alto teor de óleo (por exemplo, Patente Norte-Americana n° 6.232.529); óleos modificados (tais como 10 genes dessaturase de ácido graxo (Patente Norte-Americana n° 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (tais como pirofosforilases ADPG (AGPase), sintases de amido (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (tais como Patente Norte-Americana n° 5.602.321; betacetotiolase, póli-hidroxibutirato 15 sintase e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al (1988), J. Bacteriol. 170: 5837-5847) possibilitam a expressão de pólli-hidroxialcanoatos (PHAS)), cujas revelações são incorporadas ao presente como referência. Poder-se-á também combinar os polinucleotídeos de acordo com a presente invenção com pdinucleotídeos que fornecem caracteristicas agronômicas tais como 20 esterilidade do macho (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n°

5.583.210), resistência das hastes, tempo de floração ou características de tecnologia da transformação tais como regulagem do ciclo celular ou direcionamento genético (tal como WO 99/61619, WO 00/17364, WO 99/25821), cujos relatórios descritivos são integralmente incorporados ao 25 presente como referência. Estas combinações acumuladas podem ser criadas por meio de qualquer método, incluindo, mas sem limitações, o cultivo cruzado de plantas utilizando qualquer metodologia TopCross® ou convencional, ou transformação

W ^· m 4 genética. Caso as características sejam combinadas por meio de t transformação genética das pIantas, as sequências de polinucleotÍdeos de " interesse podem ser combinadas a qualquer tempo e em qualquer ordem. Uma planta transgênica que compreende uma ou mais características desejadas, 5 por exemplo, pode ser utilizada como alvo de introdução de características adicionais por meio de transformação subsequente. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por meio de qualquer combinação de conjuntos de transformação. Caso sejam introduzidas duas sequências, por 10 exemplo. as duas sequências podem estar contidas em conjuntos de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo conjunto de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um conjunto de transformação que suprimirá a expressão do 15 poIinucleotÍdeo de interesse. lsso pode ser combinado com qualquer combinação de outros conjuntos de supressão ou conjuntos de sobre- expressão para gerar a combinação desejada de características na planta. Os métodos de acordo com as realizações podem envolver, sem limitações, a introdução de um polipeptldeo ou polinucleotideo em uma planta.

20 "lntrodução" destina-se a indicar a apresentação à planta do polinucleotÍdeo. Em algumas realizações, o po|inuc|eotídeo será apresentado de tal forma que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta, incluindo a sua potencial inserção no genoma de uma planta. Os métodos de acordo com as realizações não dependem de um método específico de introdução de uma 25 sequência em uma planta, apenas o polinucleotídeo obtém acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos de introdução de polinucleotídeos em pIantas são conhecidos na técnica e incluem, sem limitações, métodos de transformação estável, métodos de transformação

W + n u transitória e métodos mediados por vÍrus. 0 "Transformação" designa a transferência de um fragmento de " ácido nucleico para o genoma de um organisrno hospedeiro, o que resulta em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros que contêm os 5 fragmentos de ácidos nucleicos transformados são denominados organismos "transgênicos". "Célula hospedeira" designa a célula na qual tem lugar a transformação da construção de DNA recombinante e pode incluir uma célula de levedura, uma célula bacteriana e uma célula vegetal. Exemplos de métodos de transformação de plantas incluem transformação mediada por 10 Agrobacterium (De Blaere et al, 1987, Meth. Enzymol. 143: 277) e tecnologia de transformação de "disparador de genes" ou acelerada por partículas (Klein et al, 1987, Nature (London) 327: 70-73: Patente Norte-Americana n°

4.945.050), entre outros. "Transformação estável" destina-se a indicar que a construção de 15 nucleotideos introduzida em uma planta integra-se ao genoma da planta e é capaz de ser herdada pela sua progênie. "Transformação transitória" ou "expressão transitória" destina-se a indicar que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não integra o genoma da planta ou um poÍipeptídeo é introduzido em uma planta.

20 Protocolos de transformação, bem como protocolos de introdução de polipeptídeos ou sequências de poIinucleotÍdeos em plantas podem variar, dependendo do tipo de pIanta ou célula vegetal, ou seja, monocotiledônea ou dicotiledônea, destinado à transformação. Métodos apropriados de introdução de polipeptideos e polinucleotÍdeos em células vegetais incluem microinjeção 25 (Crossway et al (1986), Biotechniques 4: 320-334), eletroporação (Riggs et al (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 5602-5606, transformação mediada por Agrobacter/um (Patentes Norte-Americanas n° 5.563.055 e 5.981.840), transferência genética direta (Paszkowski et al (1984), EMBO J. 3: 2717-2722) e

" aceleração de partlculas balísticas (vide, por exemplo, Sanford et al, Patentes

W Norte-Americanas n° 4.945.050, 5.879.918, 5.886.244 e 5.932.782; Tomes et al ' (1995) em Plant Ce//, T/ssue and Organ Cu/ture.' Fundamental Methods, Ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlim); McCabe et al (1988), 5 Biotechno/ogy 6: 923-926); e transformação com Lecl (WO 00/28058), Vide também Weissinger et al (1988), Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al (1987), Particulate Science and Techno/ogy 5: 27-37 (cebola); Christou et al (1988), Plant Phys/ol. 87: 671-674 (soja); McCabe et al (1988), Bio/Techno/ogy 6: 923-926 (soja); Finer e McMullen (1991), ln Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 10 (soja); Singh et al (1998), Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta et al (1990), Biotechno/ogy 8: 736-740 (arroz); Klein et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 4305-4309 (milho); Klein et al (1988), Biotechno/ogy 6: 559-563 (milho); Patentes Norte-Americanas n° 5.240.855, 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al (1988), Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al (1990) 15 Biotechno/ogy 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al (1984), Nature (London) 311: 763-764; e Patente Norte-Americana n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al (1985) em The Experimental Manipu/ation of Ovu/e Tissues, ed. Chapman et al (Longman, Nova lorque), págs. 197-209 (pólen): Kaeppler et al 20 (1990), P/ant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler et al (1992), Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por bigode de gato); D'Halluin et al (1992), Plant Ce// 4: 1495-1505 (eletroporação); Li et al (1993), Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995), Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); osjoda et al (1996), Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho via 25 Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são incorporados ao presente como referência. São conhecidos na técnica métodos de inserção dirigida de um polinucleotÍdeo em um sÍtio específico no genoma vegetal. Em uma realização, a inserção do polinucleotídeo em um sítio genômico desejado é atingida utilizando r

* um sistema de recombinação especifico de sÍtio.

Vide, por exemplo, WO

' 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 e WO 99/25853, todos OS quais são incorporados ao presente como referência.

Resumidamente, o

5 pohnucleotídeo de acordo com as realizações pode estar contido em um conjunto de transferência flanqueado por dois sÍtios de recombinação não idênticos.

O conjunto de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de forma estável no seu genoma um sÍtio alvo que é flanqueado por dois sÍtios de recombinação não idênticos que correspondem aos sÍtios do

10 conjunto de transferência.

É fornecida uma recombinase apropriada e o conjunto de transferência é integrado ao sÍtio alvo.

O polinucleotídeo de interesse é integrado, portanto, a uma posição cromossômica específica do genoma vegetal.

As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com formas convencionais.

Vide, por exemplo, McCormick et

15 al (1986), P/ant Ce// Reports 5: 81-84. Estas plantas podem ser cultivadas em seguida e polinizadas com a mesma linhagem transformada ou linhagens diferentes e a progênie resultante que possui expressão constitutiva da característica fenotípica desejada é identificada.

Podem ser cultivadas duas ou mais gerações para garantir que a expressão da característica fenotípica

20 desejada seja mantida e herdada de forma estável e, em seguida, as sementes são colhidas para garantir que foi atingida a expressão da característica fenotípica desejada.

Desta forma, as realizações fornecem sementes transformadas (também denominadas "sementes transgênicas") que possuem uma construção de nucleotídeos de acordo com as realizações, tais como um

25 conjunto de expressão das realizações, incorporada de forma estável ao seu genoma.

Conforme utilizado no presente, o termo "planta" pode ser uma planta integral, qualquer uma de suas partes, ou um cultivo de células ou a

O 0 b tecidos derivado de uma planta. Desta forma, o termo "planta" pode designar

D qualquer um dentre: plantas inteiras, componentes ou órgãos de plantas ." (incluindo, mas sem limitações, embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, sementes, espigas, sabugos, cascas, hastes, raizes, 5 extremidades de raízes, anteras e similares), tecidos vegetais, células vegetais, protoplastas vegetais, cultivos de tecido de células vegetais das quais a planta de milho pode ser regenerada, caules de pIantas, grupos de plantas e sementes de plantas. Célula vegetal é uma célula de uma planta, seja ela tomada diretamente de uma semente ou planta ou derivada por meio do cultivo 10 de uma célula tomada de uma planta. Grão destina-se a indicar a semente madura produzida por cultivadores comerciais para fins diferentes do cultivo ou reprodução da espécie. Progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas também são incluidas no escopo das realizações, desde que essas partes compreendam os poHnucleotídeos introduzidos.

15 As realizações de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para conferir ou aumentar a resistência a patógenos fúngicos ou proteger contra ataque de patógenos fúngicos em plantas, especialmente milho (Zea mays). Elas protegerão diferentes partes da planta contra ataque por patógenos, incluindo, mas sem limitações, hastes, espigas, folhas, raízes e borla.

20 Outras espécies vegetais podem também ser de interesse na prática das realizações da presente invenção, incluindo, mas sem limitações. As características "fenótipo", "característica fenotípica" ou "característica" designam uma ou mais características de um organismo. O fenótipo pode ser observável a olho nu ou por qualquer outro meio de avaliação 25 conhecido na técnica, tal como microscopia, análise bioquímica ou teste eletromecânico. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado por um único gene ou sítio genético, ou seja, uma "única característica genética", Em outros casos, um fenótipo é o resultado de diversos genes.

a "Mapa físico" do genoma é um mapa que exibe a ordem linear de

Ó marcas identificáveis (incluindo genes, marcadores etc.) sobre DNA de ' cromossomo. Ao contrário de mapas genéticos, entretanto, as distâncias entre marcas são absolutas (medidas, por exemplo, em pares de bases ou 5 fragmentos genéticos contíguos sobrepostos e isolados) e não com base em recombinação genética. Em milho, diversos BACs ou cromossomos artificiais bacterianos, cada qual contendo um grande inserto de DNA genômico de milho, foram montados em contiguos (fragmentos genéticos contiguos sobrepostos ou "DNA 10 contíguo"). BAC pode ser montado em um contíguo com base no alinhamento de sequências, caso o BAC seja sequenciado, ou por meio do alinhamento da sua impressão digital de BAC com as impressões digitais de outros BACS em um contiguo. Os conjuntos são disponiveis ao público utilizando o genoma Navegador de Genoma de Milho, que é disponível ao público na lnternet.

15 Uma "planta" pode ser uma planta integral, qualquer uma de suas partes ou um cultivo de células ou tecidos derivado de uma planta. Desta forma, o termo "planta" pode designar qualquer um dentre: plantas inteiras, componentes ou órgãos de plantas (tais como folhas, hastes, raízes etc.), tecidos de plantas, sementes, células de plantas e/ou sua progênie. Célula 20 vegetal é uma célula de uma pIanta, tomada de uma pianta ou derivada por meio do cultivo de uma célula tomada de uma planta. Desta forma, a expressão "planta de milho" inclui pIantas de milho inteiras, células de plantas de milho, protoplasta de planta de milho, célula de planta de milho ou cultivo de tecido de milho do qual as plantas podem ser regeneradas, calos de plantas de milho e 25 células de plantas de milho que são intactas em plantas de milho ou partes de plantas de milho, tais como sementes de milho, espigas de milho, flores de milho, cotilédones de milho, folhas de milho, hastes de milho, botões de milho, raízes de milho, extremidades de raízes de milho e similares.

W A expressão "sÍtio de característica quantitativa" ou "QTL" designa

P uma região de DNA que é associada à expressão diferencial de uma ' característica fenotípica em pelo menos um antecedente genético, tal como em pelo menos uma população de cultivo. QTLs apresentam relação próxima com 5 O(S) gene(s) subjacente(s) à caracterlstica em questão. Antes de descrever a presente invenção em detalhes, dever-se-á compreender que a presente invenção não se Iimita a realizações específicas.

Dever-se-á também compreender que a terminologia utilizada no presente destina-se a descrever realizações específicas e não se detinha a ser 10 limitadora. Da forma utilizada no presente e nas reivindicações anexas, os termos no singular e as formas no singular "um", "uma" e "o/a", por exemplo, incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Desta forma, por exemplo, referência a "pIanta", "a planta" ou "uma planta" também inclui uma série de plantas. Dependendo do contexto, o uso do 15 termo "planta" pode também incluir progênie geneticamente similar ou idêntica daquela planta. O uso da expressão "um ácido nucleico" inclui opcionalmente diversas cópias daquela molécula de ácido nucleico. São fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com aumento da resistência ao carvão do topo por meio da genotipificação de sitios 20 marcadores associados. A resistência ao carvão do topo em milho é uma caracteristica agronomicamente irnportante, pois as infecções por carvão do topo reduzem o rendimento. Reconheceu-se por algum tempo que sÍtios cromossômicos (ou intervalos) especificos podem ser mapeados no genoma de um organismo e 25 correlacionam-se a fenótipos quantitativos específicos, tais como resistência ao carvão do topo. Esses sÍtios são denominados sÍtios de características quantitativas ou QTL. O cultivador de plantas pode convenientemente utilizar marcadores moleculares para identificar individuos desejados por meio da

' identificação de alelos marcadores que exibem probabilidade estatisticamente

D significativa de cossegregação com um fenótipo desejado, manifestado na ' forma de desequilíbrio de ligação. Ao identificar um marcador molecular ou conjuntos de marcadores moleculares que se cossegregam com uma 5 característica quantitativa, o cultivador identifica um QTL. Ao identificar e selecionar um alelo marcador (ou alelos desejados de diversos marcadores) que se associa ao fenótipo desejado, o cultivador de plantas é capaz de selecionar rapidamente um fenótipo desejado selecionando o alelo marcador molecular adequado (um processo denominado seleção assistida por 10 marcador, ou MAS). Diversos métodos bem conhecidos na técnica são disponíveis para detectar rnarcadores moleculares ou conjuntos de marcadores moleculares que se cossegregam com uma característica quantitativa tal como resistência ao carvão do topo. A ideia básica subjacente a todos esses 15 métodos é a detecção de marcadores, para os quais genótipos alternativos (ou alelos) possuem fenótipos médios significativamente diferentes. Desta forma, realiza-se uma comparação entre sÍtios marcadores da magnitude de diferença entre genótipos alternativos (ou alelos) ou o nivel de significado daquela diferença. Deduz-se que os genes de características encontram-se em sÍtio 20 mais próximo do(s) marcador(es) que possui(ern) a maior diferença genotipica associada. Dois desses métodos utilizados para detectar QTLS são: 1) análise de associação estruturada com base na população e 2) análise de associação com base em pedigree. Em uma análise de associação estruturada 25 com base na população, são obtidas linhagens de populações previamente existentes com diversas bases, tais como linhagens de cultivo de elite. Análises de associação com base na população dependem da queda de desequilíbrio de ligação (LD) e da ideia de que, em uma população desestruturada, apenas

U ~

P ' correlações entre QTL e marcadores com Iigação próxima ao QTL 0 permanecerão após tantas gerações de acasalamento aleatório. Na realidade, ' a maior parte das populações previamente existentes possui subestrutura populacional. Desta forma, o uso de uma abordagem de associação 5 estruturada ajuda a controlar a estrutura populacional ao alocar indivíduos a populações utilizando dados obtidos de marcadores distribuidos aleatoriamente ao longo do genoma, de forma a minimizar o desequilíbrio devido à estrutura populacional nas populações individuais (também denominadas subpopulações). Os valores fenotípicos são comparados com os genótipos 10 (alelos) em cada sÍtio marcador para cada linhagem na subpopulação. Uma associação entre marcador e característica significativa indica a boa proximidade entre o sítio marcador e um ou mais sítios genéticos que estão envolvidos na expressão daquela característica. Em análises de associação com base em pedigree, LD é gerado por meio da criação de uma população a 15 partir de um pequeno número de bases. Em uma abordagem de mapeamento de intervalos, por exemplo (Lander e Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989), cada uma das muitas posições ao longo do mapa genético (digamos em intervalos de 1 CM) é testada para determinar a probabilidade de localização de um QTL naquela posição. Os dados de genótipos e fenótipos são utilizados 20 para calcular uma avaliação de LOD para cada posição de teste (registro de razão de probabilidades). Quando a avaliação de LOD exceder um valor limite crítico (igual no presente a 2,5), existem evidências significativas de posicionamento de um QTL naquela posição sobre o mapa genético (que cairá entre dois sítios marcadores específicos).

25 Os marcadores associados à característica de resistência ao carvão do topo são identificados no presente, bem como os alelos marcadores associados ao aumento ou à redução da resistência ao carvão do topo. Os métodos envolvem a detecção da presença de pelo menos um alelo marcador

.

b ¥ associado o aumento ou à redução da resistência ao carvão do topo no a germoplasma de uma planta de milho.

' Uma medida comum de ligação é a frequência em que essas caracterlsticas se cossegregam. Esta pode ser expressa na forma de 5 percentual de cossegregação (frequência de recombinação) ou em centiMorgans (cM). cM é uma unidade de medida da frequência de recombinação genética. 1 CM é igual a 1°/0 de chance de que uma característica em um sítio genético será separada de uma característica em um outro sÍtio devido ao cruzamento em uma única geração (o que significa que as 10 características segregam juntas 99% do tempo). Como a distância cromossômica é aproximadamente proporcional à frequência de cruzamento ao longo de eventos entre características, existe uma distância física aproximada correlacionada à frequência de recombinação. Em milho, por exemplo, 1 cM correlaciona-se, em média, a cerca de 2.140.000 pares de bases (2,14 Mbp).

15 SÍtios marcadores são, por si próprios, características e podem ser determinados de acordo com análise de ligações padrão por meio de rastreamento dos sÍtios marcadores durante a segregação. 1 CM é, portanto, igual a i°/o de chance de que um sítio marcador será separado de outro sÍtio, devido ao cruzamento em uma única geração.

20 Outros marcadores ligados aos marcadores de QTL podem ser utilizados para prever o estado da resistência ao carvão do topo em uma planta de milho. lsso inclui qualquer marcador em até 50 CM do sÍtio genético. Quanto mais próximo um marcador estiver de um marcador de QTL, mais eficaz e vantajoso é aquele marcador como indicador da característica desejada. SÍtios 25 em ligação próxima exibem uma frequência de cruzamento entre sÍtios de cerca de 1O°/o ou menos, preferencialmente cerca de 9°/0 ou menos, de preferência ainda maior cerca de 8°/0 ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7°/0 ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6°/0 ou menos, de b preferência ainda maior cerca de 5°/0 ou menos, de preferência ainda maior # cerca de 4°/0 ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3°/0 ou menos e, ' de preferência ainda maior, cerca de 2°/0 ou menos. Em realizações de alta preferência, os sÍtios relevantes (tais como um sítio marcador e um sÍtio alvo tal 5 como QTL) exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1°/0 ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos.

Desta forma, os sÍtios são espaçados em cerca de 10 CM, 9 CM, 8 CM, 7 cM, 6 CM,5CM,4CM,3CM,2CM,1CM,0,75CM,0,5CM,0,25CM,O,1CM,O,075CM, 10 0,05 CM, 0,025 cM, 0,01 cM ou menos. Em outras palavras, afirma-se que dois sÍtios posicionados no mesmo cromossomo e em uma distânca tal que a recombinação entre os dois sÍtios ocorra em uma frequência de menos de 10% (tal como cerca de 9%, 8%, 7°/,, 6°/,, 5°/,, 4°/,, 3°/,, 2%, 1°/d, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,075%, 0,05%, 0,025%, 0,01% ou menos) estão "próximos" 15 entre si. Embora alelos marcadores especificos possam exibir cossegregação com o fenótipo de resistência ao carvão do topo, é importante observar que o sÍtio marcador não é necessariamente parte do sÍtio QTL responsável pela expressão do fenótipo de resistência ao carvão do topo. Não 20 é necessário, por exernplo, que a sequência de polinucleotÍdeos marcadores seja parte de um gene que forneça resistência aprimorada ao carvão do topo (que seja, por exemplo, parte do quadro de leitura aberta do gene). A associação entre um alelo marcador específico com o fenótipo de resistência ao carvão do topo maior ou menor deve-se à fase de ligação de "acoplamento" 25 original entre o alelo marcador e o alelo QTL na linhagem de milho ancestral da qual se originou o alelo QTL. Eventualmente, com recombinação repetida, o cruzamento de eventos entre o marcador e o sítio QTL pode alterar essa orientação. Por esta razão, o alelo marcador favorável pode alterar-se,

" dependendo da fase de ligação que existe no pai resistente utilizado para criar 0 populações em segregação. lsso não muda o fato de que o marcador genético ' pode ser utilizado para monitorar a segregação do fenótipo. Ele apenas altera qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população em 5 segregação. Diversos métodos bem conhecidos na técnica são disponíveis para identificar intervalos cromossômicos. As fronteiras desses intervalos cromossômicos são delineadas para englobar marcadores que serão ligados a um ou mais QTL. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é delineado de 10 tal forma que qualquer marcador que repouse dentro daquele intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem as fronteiras do intervalo) possa ser utilizado como marcador da resistência ao carvão do topo. Cada intervalo compreende pelo menos um QTL e, além disso, pode realmente compreender mais de um QTL. A boa proximidade de diversos QTL no mesmo 15 intervalo pode ofuscar a correlação de um marcador específico com um QTL específico, pois um marcador pode demonstrar ligação a mais de um QTL. Por outro lado, por exemplo, caso dois marcadores em boa proximidade exibam cossegregação com a característica fenotipica desejada, às vezes é incerto se cada um desses marcadores identifica o mesmo QTL ou dois QTL diferentes.

20 lndependentemente, o conhecimento de quantos QTL encontram-se em um inteNa|o específico não é necessário para elaborar ou praticar a presente invenção. Tambérn são fornecidos métodos de seleção assistida por marcadores (MAS), nos quais fenótipos são selecionados com base em 25 genótipos marcadores. Para reafizar MAS, um ácido nucleico correspondente ao alelo de ácido nucleico marcador é detectado em uma amostra biológica de uma planta a ser selecionada. Esta detecção pode assumir a forma de hibridização de uma sonda de ácido nucleico em um alelo marcador ou seu amplificador, utilizando, por exemplo, hibridização específica de alelos, análise 0 g

Southern, análise Northern, hibridização in situ, hibridização de primers seguida

' por amplificação de PCR de uma região do marcador, sequenciamento de DNA de um produto de amplificação de PCR ou similares.

Os procedimentos

5 utilizados para detectar alelos marcadores são conhecidos dos técnicos comuns no assunto.

Após verificar-se a presença (ou ausência) de um alelo marcador específico na amostra biológica, a planta é selecionada e cruzada em uma segunda pIanta, preferencialmente uma planta de milho de uma linhagem de elite.

As plantas de progênie produzidas por meio do cruzamento podem ser

10 avaliadas para determinar aquele alelo marcador específico e apenas as plantas de progênie que possuem o alelo marcador desejado serão selecionadas.

Os cultivadores de plantas de milho desejam combinações de sítios genéticos desejados, tais como os alelos marcadores associados ao

15 aumento da resistência ao carvão do topo, com genes de alto rendimento e outras características desejadas para desenvolver variedades de milho aprimoradas.

A seleção de grandes quantidades de amostras por meio de métodos não moleculares (tais como avaliação de características em plantas de milho) pode ser cara, demorada e não confiável.

O uso dos marcadores

20 polimórficos descritos no presente, quando ligados geneticamente a sÍtios de resistência ao carvão do topo, fornece um método eficaz de seleção de variedades com resistência ao carvão do topo em programas de cultivo.

Uma vantagem da seleção assistida por marcadores sobre avaliações de campo para determinação da resistência ao carvão do topo, por exemplo, é que MAS

25 pode ser realizado em qualquer época do ano, independentemente da estação de cultivo.

Além disso, os efeitos ambientais são, em grande parte, irrelevantes para a seleção assistida por marcadores.

Um outro uso de MAS no cultivo de plantas é assistir na

+ 0

«

" recuperação do genótipo parental recorrente por meio de cultivo cruzado. k

O cultivo cruzado é o processo de cruzamento de uma progênie de volta

" para um dos seus pais ou linhagens parentais.

O cruzamento é normalmente realizado com fins de introgressão de um ou alguns sÍtios de

5 um pai doador (tal como um pai que compreende sítios marcadores da resistência ao carvão do topo desejáveis) em um antecedente genético que, de outra forma, é desejável do pai recorrente (tal como uma Iinhagem de milho que, de outra forma, apresenta alto rendimento). Quanto mais ciclos de cruzamento forem realizados, maior a contribuição genética do

10 pai recorrente com a variedade que sofreú introgressão resultante. lsso frequentemente é necessário porque, de outra forma, as plantas podem ser indesejáveis, por exemplo, devido a baixo rendimento, baixa fecundidade ou similares.

Por outro lado, linhagens que são o resultado de programas de cultivo intensivo podem apresentar excelente rendimento, fecundidade

15 ou similares, sendo meramente deficientes em uma característica desejada tal como resistência ao carvão do topo.

Uma aplicação de MAS é o uso dos marcadores para aumentar a eficiência de um esforço de introgressão ou cruzamento desejado na introdução de aumento da resistência a QTL de carvão do topo em um fundo

20 desejado (tipicamente com alto rendimento). No cruzamento assistido por marcador de marcadores específicos (e QTL associado) de uma fonte doadora,

por exemplo, em um fundo genético exótico ou de elite, seleciona-se entre uma progênie cruzada a característica do doador e utiliza-se em seguida cruzamento repetido na linha exótica ou de elite para reconstituir o máximo de

25 genoma de fundo exótico ou de elite possÍvel.

Os marcadores de QTL de preferência superior (ou alelos marcadores) de MAS são aqueles que possuem a associação mais forte com a caracterlstica de resistência ao carvão do topo.

.b Exemplos ~ Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para ' limitar as reivindicações anexas. Compreende-se que os exemplos e realizações descritos no presente destinam-se apenas a fins ilustrativos e que 5 os técnicos no assunto reconhecerão diversos reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem abandonar o espirito da presente invenção ou o escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1 Materiais Vegetais 10 Duas linhagens congênitas, "ji1037" (pai doador) e "Huangzhao4" (pai recorrente), cuja resistência difere amplamente do fungo específico de hospedeiro Sphacelotheca rei/iana CIint, foram utilizadas como linhagens parentais para desenvolver todas as populações de mapeamento neste estudo.

Todos os materiais vegetais testados no presente estudo foram inoculados 15 artificialmente com S. rei/iana Clint. "Ji1037" exibe total resistência ao carvão do topo e nenhum indivlduo susceptível foi observado no campo, enquanto "Huangzhao4", linhagem congênita chinesa, é altamente susceptível ao carvão do topo com cerca de 75°/o de indivíduos susceptíveis no campo. Em 2004, uma população BC1 que consistia de 314 individuos junto com dois pais foi 20 cultivada na fazenda experimental da Academia de Ciências Agrícolas de jilin, Gongzhulin. Cada indivíduo BC, foi avaliado para determinar sua resistência contra carvão do topo. Indivíduos BC1 resistentes sofreram cruzamento com "Huangzhao4" para gerar famílias BC1,2 (população de BC2). Em 2005, cerca de vinte plantas de cada família de BC1,2 foram cultivadas em um único ponto 25 para avaliar suas resistências ao caNão do topo. lndivíduos recombinantes da população de BC2 foram identificados e cruzados com "Huangzhao4" para gerar famílias de BC2-3 ou autopolinizados para produzir famílias de BC2F2. Em 2006, cerca de oitenta indivíduos de cada uma das 59 famílias BC2,3 e nove m e " famílias BC2F2 foram cultivados na fazenda experimental da Academia de % Ciências Agrícolas de Jilin para pesquisar as suas resistências ao carvão do " topo. Descrição Detalhada da InvençÃo 5 Inoculação artificial e AVALIAçÃO resistente no campo Os soros contendo telioesporos de S. re/iana foram recolhidos do campo na estação de cultivo anterior e armazenados em um saco de pano em um ambiente seco e bem ventilado. Antes do plantio, os esporos foram removidos dos soros, filtrados e misturados em seguida com solo em uma 10 razão de 1:1000. A mistura de solo e telioesporos foi utilizada para cobrir sementes de milho durante o cultivo de sementes para conduzir inoculação artificial. Plantas em estágio de amadurecimento foram avaliadas para determinar a presença ou ausência de soro na espiga ou borla como indicador da susceptibilidade/resistência.

15 Extração de DNA Tecidos de folhas de plantas com um mês de idade foram colhidas e moídas em um pó em nitrogênio líquido. Foi extraido DNA genômico, seguindo-se o método descrito por Murray e Thompson (1980).

Genotipificação em marcadores de SSR e construção de mapas 20 de ligação Os marcadores de SSR foram empregados em primeiro lugar para verificar o seu polimorfismo entre dois pais "ji1037" e "Huangzhao4".

Apenas os marcadores de SSR que exibiram faixas polimórficas de forma não amblgua e foram distribuídos de forma homogênea ao longo de dez 25 cromossomos foram utilizados para populações de segregação de genótipos. Reações de PCR foram realizadas conforme segue: desnaturação a 94 °C por dois minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94 °C por trinta segundos, combinação a 58 °C por trinta segundos, extensão a 72 °C por trinta

K segundos e uma etapa de extensão final a 72 °C por dez minutos. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese sobre gel de poliacrilamida a 6°/0, " seguida por manchas de prata para visualização. Ao todo, 94 indivíduos BCi foram selecionados aleatoriamente a 5 partir da geração BC, e testados para determinar os seus genótipos nos 113 marcadores SSR polimórficos. Uma faixa de PCR foi marcada como "2" caso seja a mesma do pai doador e avaliada como "1" caso seja idêntica à do pai recorrente. A razão entre homozigotos (1/1) e heterozigotos (1/2) na população cruzada de BC1 foi analisada para determinar a sua consistência de 1:1 em 10 cada marcador SSR por meio de teste X2. As distâncias genéticas entre marcadores de SSR foram estimadas por meio de MAPMAKER/Exp versão

3.Ob (Lincoln et al, 1992). A propósito, alguns marcadores sobre o cromossomo 2 foram genotipificados em diferentes escalas de populações e as suas posições genéticas foram ajustadas com os dados de integração no software 15 JoinMap, Análise de dados e mapeamento genético/QTL Supostos QTLs que conferem resistência ao carvão do topo foram identificados de acordo com o projeto lll de Análise com Base em Características (Lebowitz et al, 1987). Resumidamente, espera-se que 20 indivíduos BC1 com o QTL de resistência sejam mais resistentes ao carvão do topo que aqueles com o QTL de resistência. Consequentemente, um alelo marcador adjacente ao QTL de resistência em acoplamento exibiria frequência mais alta no grupo resistente que no grupo susceptível. Utilizou-se um teste X2 de grade quádrupla (SAS versão 8.2) para testar frequências de alelos em 25 todos os marcadores entre os grupos resistentes e susceptíveis para varrer suposto QTL ao longo de todo o genoma. Em seguida, foram empregados diversos métodos para confirmar a regiâo QTL principal e a sua eficácia na resistência ao carvão do topo. Em primeiro lugar, os marcadores de SSR na

" suposta região principal de QTL foram utilizados para genotipificar todos os . indivíduos BC1 para confirmar a presença do QTL principal. Em segundo lugar, " os percentuais de infecção de indivíduos BC1 foram estimados com base nas suas progênies de BC1,2 para confirmar o suposto QTL principal por meio de 5 análise de variação de fator único. Em terceiro lugar, suposto QTL foi identificado ao longo dos dez cromossomos por meio do método de mapeamento de inteNa|os composto (programa Windows QTL Cartographer Versão 2.0). Por fim, o QTL principal foi adicionalmente confirmado estimando- se o seu efeito genético na redução da incidência de doenças.

10 Exemplo 3 Desenvolvimento dos marcadores ESPECÍFICOS de REGIÃO As sequências disponíveis na região de QTL com maior resistência, incluindo as sequências EST, IDP, RGA, BAC e com extremidade BAC ancoradas, foram utilizadas para desenvolver marcadores de alta 15 densidade. Essas sequências foram comparadas com bancos de dados NCBI e MAGI por meio de tBLASTn para obter possÍveis sequências mais longas. O primer foi projetado utilizando o software PRIMER 5.0 de acordo com os parâmetros a seguir: vinte nucleotídeos de comprimento, teor de GC de 4Õ°/o a 6Ó°/o, nenhuma estrutura secundária e nenhum traço consecutivo de um 20 nucleotideo isolado. Foram utilizados pares de primers para amplificar os segmentos correspondentes dos dois pais. Os parâmetros de ciclização foram definidos da mesma forma que os descritos acima, exceto pela temperatura de combinação, que foi ajustada de acordo com diferentes pares de primers. Apenas os 25 amplificadores idênticos ou maiores que os previstos foram cortados do gel e purificados com o Kit de Extração de Gel (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Os produtos de PCR foram clonados em seguida no vetor pGEM-T (Promega, Madison, Estados Unidos). Normalmente, três a cinco clones positivos para

.

cada amplificador foram selecionados para sequenciamento, para evitar qualquer contaminação ou falta de coincidência. A sequência amplificadora " foi comparada em primeiro lugar com a original da qual foi derivada para garantir que foi obtida a correta e, em seguida, conduziu-se comparação 5 para pesquisar a divergência de sequências entre dois pais utilizando software DNAMAN. Os lnDels foram propensos ao desenvoívimento de marcadores de sÍtio marcados por sequência (STS), enquanto polimorfismo nuclear isolado (SNP) pode ser utilizado para desenvolver marcador de SNP ou marcador de CAPS (sequência polimórfica amplificada dividida). É 10 desenvolvido um marcador CAPS caso o SNP refira-se a um dado sítio de restrição. No desenvolvimento do marcador SNP, foi utilizado um programa SNPpicker de software seqVlSTA para observar se foi possÍvel criar um sÍtio de restrição específico por meio da introdução de um par de bases sem coincidências no primer para alterar um "meio sÍtio" para um "sÍtio 15 completo" para um sÍtio de restrição específico, seguindo o método descrito por Niu e Hu (2004). Os pares de primers foram utilizados para amplificar os dois pais para desenvolver marcadores de alta densidade. Para marcadores de STS, faixas de PCR polimórficas deverão aparecer após a eletroforese 20 sobre gel de agarose ou poliacrilamida. Para esses marcadores de CAPS e SNP, puderam ser observadas faixas polimórficas sobre gel de agarose ou poliacrilamida após a digestão com certas endonucleases de restrição.

Exemplo 4 Mapeamento Fino 25 lndivíduos recombinantes da população de BC2 foram retirados de seleção com os marcadores de SSR na região QLT principal. Devido à penetração parcial para resistência ao carvão do topo, seria de alto risco julgar se um BC2 recombinante conduz ou não o gene da resistência com base no desempenho de um único indivíduo. Desta forma, adotamos um método mais robusto de julgar a presença ou ausência do gene de resistência para um único BC2 recombinante com base nos dois genótipos e fenótipos da sua progênie. Caso não haja gene de resistência na região doadora para um certo BC2 recombinante, a sua progênie com regiões doadoras não exibiria diferença de resistência ao carvão do topo com relação àqueles sem regiões doadoras. Por outro Iado, caso a região doadora abrigue o gene de resistência, a progênie com as regiões doadoras exibiria resistência significativamente mais alta que aquelas sem as regiões doadoras. Ao comparar os tamanhos de insertos das regiões doadoras "resistentes" e "não resistentes", poderlamos fixar um intervalo no qual reside o gene de resistência. Com uma aplicação dos marcadores de alta densidade recém desenvolvidos, poderíamos por fim definir as regiões doadoras que abrigam o gene de resistência e, portanto, estreitar a região de resistência em um intervalo muito curto. Em todas as comparações, foram estimadas diferenças significativas em software SAS utilizando o teste X2, Exemplo 5 ConstruçÃo do mapa de LIGAçÃO de SSR Ao todo, foram verificados setecentos marcadore.s de SSR para determinar os seus polimorfismos entre "Ji1037" e "Huangzhao4".

Dentre os 347 marcadores de SSR poIimórficos, 113 marcadores distribuidos regularmente ao longo de dez cromossomos foram selecionados para genotipificar a população de mapeamento BC1. Destes 113 marcadores, 33 (29,2%) exibiram segregação de distorção sob P < 0,05ousobp<O,O1. Geralmente, marcadores que exibiram distorção genética não apresentaram impacto negativo sobre a detecção de QTL. Foi construído,

portanto, um mapa de ligação utilizando todos os 113 marcadores de SSR. O mapa possuía cerca de 1753,4 cM de comprimento com um marcador em média a cada 14,6 CM.

Exemplo 6 Mapeamento DE SUPOSTOS QTLS Segundo o projeto lll de análise de TB (Lebowitz et al, 1987), cada um dos 113 marcadores de SSR foi testado para determinar a sua frequência a '4 (heterozigoto) e 1/1 (homozigoto) nos grupos resistente e susceptível. As orientações significativas em frequências entre os grupos resistente e susceptivel foram observadas para os marcadores localizados nas quatro regiões cromossômicas (cestos 1,02/3, 2,08/9, 6,07 e 10,03/4), o que sugere a presença de quatro supostos QTLs (Tabela 1). Os marcadores no cesto 2,09, por exemplo, não exibiram distorção das razões 1:1 entre heterozigoto e homozigoto em toda a população BCi. Os percentuais de heterozigotos nesses marcadores diferem significativamente, entretanto, entre os grupos resistentes e susceptíveis com os valores P < 0,0001 (Tabela 1).

O resultado indicou fortemente a presença de um QTL importante (denominado qHSR1) nessa região. Os marcadores no cesto 10,03/4 e no cesto 1,02/3 apresentaram valores P < 0,01 (Tabela 1), o que indica a presença de supostos QTLS com menos efeitos nessas duas regiões. Os marcadores no cesto 6,07 também exibiram inclinação com os valores P < 0,05 (Tabela 1), o que sugere a presença de um possível QTL menor, Além disso, observou-se que apenas um marcador no cesto 4,01 ou cesto 5,03 exibe inclinação de frequência entre os grupos resistente e susceptível (Tabela 1) e, portanto, foi difícil julgar se um QTL estava ou não presente nesses dois cestos.

Tabela 1

Varrimento DE Suposto QTL AO Longo DE T,O,D,O,O.GENO,M,A,P,O,R,MElO DE UM

Teste X2 DE Grade QuÁdrupla NOS 113 Marcadores SSR percentual de heterozigoto (°/0) suposto cestos marcadores no grupo R no grupo S X2 Valores p QTL

1,02 bnlg1614 48,65 71,43 4,93 0.0265

1,02 bnlg1083 50,00 72,73 5,00 0.0253 Sim

1,03 umc1403 44,74 76,36 9,69 0.0019

2,08 bnlg1141 65,63 36,36 6,95 0.0084

2,08/09 umc1230 68,57 40,38 6,66 0.0099

2,09 bnlg1520 72,22 36,36 11,19 0.0008

2,09 umc1525 81,08 33,93 19,87 <0.0001

2,09 umc1736 86,11 30,00 26,49 <0,0001 sim

2,09 bnlg1893 91,67 26,00 36,28 <0.0001

2,09 umc1207 91,67 26,53 35,46 <0.0001

2,09 phi427434 91,43 29,63 32,64 <0.0001 2,09 umc2184 94,74 30,19 37,65 ·0.0001

2,09 i umc2077 94,59 28,85 37,96 <0.0001

2,09 l umc2214 92,11 34,55 30,58 <0.0001

4,91 , l umc1164 60,00 37,21 4,02 0.045 ?

5,03 I umc1447 56,76 34,00 4,48 0.0344 ?

6,07 I umc1063 34,21 57,14 4,78 0.0289 Sim 6,07 | phi299852 33,33 56,36 4,638 0.0314

10,03 I umc1938 76,47 34,69 14,038 0.0002 Sim 10,04 I phi062 72,97 41,07 9,128 0.0025

Os marcadores de SSR em cada cesto são ordenados de acordo com as suas posições no mapa de ligação genética do presente estudo.

Grupo R: grupo resistente; grupo S: grupo susceptivel; valor P: probabilidade da hipótese HO que é independente entre genótipo e característica.

Os percentuais de heterozigotos (1/2) no cesto 2,09 e no cesto 10,03/4 foram significativamente mais altos no grupo resistente que no grupo susceptível, o que sugere que os alelos de resistência foram derivados a partir do pai doador "ji1037". Por outro lado, heterozigotos (1/2) no cesto 1,02/3 e cesto 6,07 apresentaram percentuais 5 mais baixos no grupo resistente em comparação com o gmpo susceptível, o que indica que os alelos de resistência foram derivados do pai susceptível "Huangzhao 4".

Comparações dos quatro supostos QTLS no presente estudo com os detectados por outros grupos resultaram em dois QTLs comuns. O QTL no cesto 1,02/3 neste estudo também foi relatado por Shi et al (2005) e Lu e Brewbaker (1999). O principal QTL no cesto 2,09 no nosso estudo também foi detectado no estudo de Shi, no qual a população de mapeamento foi derivada do cruzamento de "Huangzhao4" x "MO17" (Shi et al, 2005)- De forma interessante, a mesma linhagem susceptível "Huangzhao4" e uma linhagem resistente com relação próxima "ji1037" ("ji1037" foi desenvolvido a partir do cruzamento de "Mo17"/"Suwan") foram utilizadas para preparar a população de mapeamento no presente estudo. lsso pode explicar por que o mesmo QTL importante com efeito genético similar foi detectado no cesto 2,09 em ambos os estudos. O principal QTL no cesto 2,09 é, portanto, a melhor opção de clonagem do gene de resistência e seleção assistida por marcador para aumentar a resistência de milho ao carvão do topo.

Exemplo 7 Confirmação do QTL principal Para confirmar a presença do QTL principal (qHSR1) no cesto 2,09 e seu efeito genético sobre a resistência ao carvão do topo, é necessário utilizar marcadores para genotipificar todos os indivíduos BCi. Os oito marcadores SSR no cesto 2,09, incluindo bnlg1520, umdc1736, bnlg1893, umc1207, phi427434, umc2184, umc2077 e umc2214, foram utilizados para genotipificar as 118 pIantas BC1 resistentes e 158 susceptiveis. Dos 118

O

D ©.

6 ind ividuos resistentes, 107 (90,7%) eram heterozigotos/recombinantes e apenas onze (9,3%) eram homozigotos nos oito marcadores. Dos 158 indivíduos susceptíveis, entretanto, apenas sessenta (38%) eram heterozigotos/recombinantes e até 98 (62%) eram homozigotos. Estes 5 resultados demonstraram que a região doadora no cesto 2,09 poderá aumentar significativamente a resistência de milho ao carvão do topo, o que sustenta fortemente a presença do QTL principal no cesto 2,09. Dever-se-á observar que o carvão do topo era muito sério em 2004 devido à seca durante a etapa de formação de mudas. O "Huangzhao4" susceptível continha 86% de 10 indivíduos susceptíveis, em comparação com cerca de 75% em ano normal. Além disso, foram produzidas ao todo 95 famílias BC1,2 a partir dos indivíduos BC1 resistentes. Essas famílias BC1,2 variaram de 5,9% a cerca de 88,3% das incidências de doenças. Análise de fator isolado de variação foi realizada por meio da análise da incidência de doenças e genótipo em cada um dois oito 15 marcadores SSR sobre a região do cesto 2,09. Os resultados demonstraram que esses oito marcadores SSR Iigaram-se fortemente a qHSR1 (Tabela 2).

Tabela 2 AnÁlise DE Fator Isolado DE Variação DAS FAMÍLfAS BC1:2 ) Marcadores ) SSR bO bl LR F(1,n-2) pf(F) umc2214 3,8321 -4,5175 18,6152 20,0983 **0,0000 umc2077 3,8506 -4,5464 18,7612 20,2716 "0,0000 umc2184 3,8534 -4,5509 18,7920 20,3082 *"0,0000 I phi427434 I 3,8583 I -4,5828 19,0426 20,6065 **0,0000 umc1207 3,8574 -4,5890 19,0812 20,6525 **0,0000 bnlg1893 ! 3,8566 I -4,5941 19,1175 20,6959 **0,0000 umc1736 3,8411 -4,7083 20,0836 21,8536 **0,0000 bnlg1520 ! 3,7321 I -4,4259 18,1954 19,6013 **0,0000

à y = bO + blx + e; LR = -21og (LO/LI); ** significativo em nivel de 0,01% Além disso, o software \NinQtlCart 2.0 (Statistical Genetics, Universidade do Estado da Carolina do Norte, Estados Unidos) foi utilizado para varrer os supostos QTLs ao longo de todo o genoma com o Mapeamento de lntervalos Compostos (CIM). Um QTL principal com valor LOD 11,8 foi detectado no cesto 2,09, flanqueado por marcadores SSR umc1736 e umc2184. O QTL poderá explicar cerca de 30% da variação fenotipica. Exemplo 8 Desenvolvimento de novos marcadores sobre a REGIÃO do cesto 2,09 No nosso estudo, ao todo, trinta pares de primers foram projetados com base nas sequências disponíveis no cesto 2,09 para amplificar Iinhagens parentais. Três dos trinta pares de primers foram desenvolvidos diretamente em marcadores STS/SSR polimórficos. Dois marcadores STS, STS1944 e STSrga3195, foram desenvolvidos a partir de IDP1944 e RGA3195 (Zmtuc03-

0811.3195), respectivamente. O marcador SSR SSR148152 foi desenvolvido a partir do clone de BAC AC148152 (Tabela 3). Dos 27 pares de primers restantes, vinte geraram amplificadores não amblguos, que foram clonados e sequenciados em seguida. Alinhamentos de sequências entre duas linhagens parentais revelaram graus variáveis de variações de nucleotídeos com relação a diferentes amplificadores. Nenhum poIimorfismo foi encontrado entre duas linhagens parentais para os amplificadores correspondentes a dois ESTs ancorados. Foram observados três SNPS para os amplificadores correspondentes a três sequências de milho (comprimento total de 2056 bp) recuperadas do Website TIGR. Os amplificadores correspondentes a sequências 8AC-terminais revelaram divergências mais altas com um total de 18 SNPS no comprimento cumulativo de sequência de 1251 bp. Alinhamento de sequências para os quatro amplificadores com base em RGA resultou em cinco lnDels e 26 SNPS em uma sequência de 3711 bp acumulada. Alinhamento de sequências para cinco amplificadores com

' base em IPD revelou um lnDel e 15 SNPS em 2814 bp. A sequência de sintenia em arroz também foi utilizada para desenvolver marcadores e revelou apenas um lnDel em 2088 bp. Tomados em conjunto, foram obtidos sete lnDels e 62 SNPs, resultando em cerca de um lnDel por 1800 bp e um SNP por 200 bp na região 5 qHSR1. Com base nos polimorfismos acima, foram finalmente desenvolvidos seis marcadores adicionais, incluindo dois marcadores SNP (SNP140313 e SNP661, desenvolvidos a partir de AZM4_ 140313 e IDP661, respectivamente), um marcador CAPS (CAPS25082, desenvolvido a partir de IDP25082) e três marcadores STS (STS171, STSrga840810 e STSsynl, desenvolvido a partir de 10 IDP171, RGA BG840810, e um gene de arroz sintênico LOC _Os07g07050, respectivamente) (Tabela 3 e Figura 1). Tabela 3 Nomes, SequÊncias Originais E SequÊncias DE Primer PARA Nove Marcadores RecÉm Desenvolvidos Marcadores Sequências orig inais Tipos Enzimas Pares de primers (5' ~ 3') (SEQ ID N°) I CAPS25082 I IDP25082 I CAPS I Taql ! L:AAGTCCTTCACGGTCTACCA [1] R:CGGTTAGGACGATGTCAGAA [2] L:CAGAGGCATTGAACAGGAAG [3] AZM4_ 140313 I I i R:CTGCTATTCCACGAAGTGCT [4] I SNP140313 I I SNP I Hhal from TIGR snpL:CTCTTCCACCGAGAATAGCG [5] snpR:CTGCTATTCCACGAAGTGCT [6] L:CTTCTGTTCTGTGCCAGGTA m R:CAAGAACGTAGCAACTCAGC j8] SNP661 IDP661 SNP I Taql P I snpL:ATTGTCCCTGAGATGATTCG [9] I snpR:CAAGAACGTAGCAACTCAGC [10] STS1944 IDP1944 STS L:CATTGGCAACAGGACAAGTG [11] R: GACATCAGCCTCAACATTGG (12] L:CCAGAGACTTGCGTGAAGAT [1 3] IDP171 STS I

R R: AACAGACTGGTTGTACGTGC [14]

Marcadores l Sequências originais I Tipos I Enzimas Pares de primers (5' ~ 3') (SEQ ID N") L:GTAGGAAGACTGCCGGAGAC [15] SSR148152 I BAC clone AC148152 I SSR I R:GACGCTAGAATGACTGAACC [16] ) ZMTUC03-0811.3195 I I I L:CTAGAGGTTCAGGCATATGGCG [17] STSrga3195 I I STS i (RGA) I i I R:AGCTCCACAGGAA.TTCGTTGAG [18) STSrga840810 I BG840810(RGA) ! STS I I L:GCGTCAGGCAGTTCAACTTC [19] R:TGTTCTTGCACTCGCACTTG (20] LOC_ Os07g07050 I I I L:GGCACATGGACGTACAAGAT [21] STSsynl I I STS I from rice I I I R:GCACAGAGGAAGCTAGGAGA [22] L: primer esquerdo; R: primer direito. Para marcadores SNP, foi utilizado em primeiro lugar um par de primers L e R para amplificar DNA genômico e, em seguida, um par de primers snpL (primer sem coincidência) e snpR foi utilizado para amplificar produtos de PCR diluidos da primeira etapa para alterar um "meio sÍtio" para "sÍtio total" para um sÍtio de restrição especifico. Faixas polimórficas puderam ser observadas após a digestão de produtos de PCR de segunda rodada com uma certa enzima e submetidas a eletroforese sobre gel de poliacrilamida. Dos nove marcadores recém desenvolvidos, SNP140313 e STSrga3195 foram mapeados sobre chr. 1 e STSsynl foi mapeado sobre chr.

5. Os seis marcadores restantes foram mapeados de forma autêntica sobre o cesto 2,09 com cinco marcadores (SSR148152, CAPS25082, STS171, SNP661 e STS1944) dentro e um marcador (STSrga840810) fora da região qHSR1 de resistência. Os marcadores recém desenvolvidos facilitariam muito MAS e o mapeamento fino do gene de resistência (Figura 2). Exemplo 9 Avaljação Fenotípica dos Recombinantes de BC2 e Mapeamento Fino do QTL de ResistÊncia Principal Com base em genótipos de recombinantes BC2 parentais,

° ufilizamos marcadores STS171 e/ou STS1944 para genotipificar toda a progênie dos recombinantes BC2. O percentual de heterozigoto foi testado para determinar a sua diferença entre os grupos resistentes e susceptíveis por meio de teste X2. O valor de probabilidade s 0,05 (definimos no presente o limite em 5 p = 0,05) indica a correlação significativa entre fenótipo (resistência) e genótipo (heterozigoto) e o recombinante BC2 parental foi deduzido em seguida para conduzir a região doadora resistente (Tabela 4). BC2-64, por exemplo, foi inferido para abrigar qHSR1 devido ao baixo valor P (" 0,05) no sÍtio STS1944.

Para BC2-50, os sítios STS1944 e STS171 exibiram os valores P 10 muito baixos, o que indica que o BC2-50 parental necessita abrigar qHSR1. Por outro lado, não foi observada nenhuma diferença significativa (conforme exibido pelo alto valor P) em percentuais de heterozigotos entre os grupos resistentes e susceptíveis para BC2-25, o que indica a ausência de qHSR1 na região doadora. Tomados em conjunto onze recombinantes BC2 (BC2-64, BC2- 15 50, BC2-65, BC2-27, BC2-19, BC2-46, BC2-66, BC2-60, BC2-43, BC2-37 e BC2-69) foram inferidos como conduzindo qHSR1 e considerados os recombinantes BC2 resistentes; enquanto isso, cinco recombinantes BC2 (BC2- 67, BC2-68, BC2-49, BC2-25 e BC2-45) foram inferidos como não abrigando qHSR1 e considerados os recombinantes BC2 susceptíveis (Tabela 4).

20 Tabela 4A BC2 Recombjnantes Parentais, Seus Genótipos na Região QHSR1, Teste X2 em ProgÊnies e Fenótipos BC2 Deduzidos Genótipos em marcadores SSR para os recombinantes BC2 parentais I Recombinante I s BC2 SSR14815 phi427434 umc218 I bnlg1893 / SNP661 STS1944 I parentais 2 4 sts171 I bc2-50 1/2 1/2 1/2 y, 1/2 1/2 a - I Genótipos em marcadores SSR para os recombinantes BC2 parentais b

W I Recombinante I I s BC2 I SSR14815 I I phi427434 I I umc218 I bnlg1893 I/ I SNP661 I STS1944 I I parentais I2 I i i I I4 I STS171 I BC2-65 I 1/1 I 1/2 I 1/2 l '4 I 1/2 I 1/2 BC2-27 1/1 1/2 1/2 '4 1/2 1/2 I BC2-64 I 1/1 I 1/2 I 1/2 !% I 1/2 | 1/2 BC2-67 1/1 1/1 1/1 % 1/2 1./2 I BC2-68 I 1/1 ; 1/1 I 1/1 : '4 I 1,/2 I 1/2 BC2-49 1/1 1/1 1/1 '4 1/2 1/2 I BC2-25 I 1/1 l 1/1 i 1/1 I 1/1 i 1/2 I 1/2 BC2-45 1/1 1/1 1/1 1/1 1/2 1/2 ! BC2-19 I 1/2 I 1/2 I 1/2 I '4 ! 1/2 I 1/1 I BC2-46 ! 1/2 I 1/2 I 1/2 I '& I 1/2 I 1/1 BC2-66 1/1 1/2 1/2 1/2 1/2 1/1 BC2-60 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/1 BC2-43 1/2 1/2 1/2 1/2 1/1 1/1 ) BC2-37 I 1/2 i 1/2 I 1/2 ) 1/1 I 1/1 I/ I BC2-69 I 1/2 I 1/2 I 1/2 l 1/1 I 1/1 ! 1/1 Tabela 4B BC2 Recombinantes Parentais, Seus Genótipos NA Região QHSR1, Teste X2 EM ProgÊnies E Fenótipos BC2 Deduzidos i Recombinantes ) Teste X' em progênies I Fenótipos BC2 I I BC2 parentais ! Marcadores I Valores P I deduzidos ! STS171 0,003 I BC2-50 : I Resistentes i STS1944 0,0002

Recombinantes Teste X' em progênies Fenótipos BC2

BC2 parentais Marcadores Valores P deduzidos

STS171 0,042 BC2-65 Resistentes STS1944 0,051

BC2-27 STS171 0,006 Resistentes

BC2-64 STS1944 0,022 Resistentes

BC2-67 STS1944 0,273 Susceptiveis

BC2-68 STS1944 0,384 Susceptiveis

BC2-49 STS1944 0,805 Susceptíveis

BC2-25 STS1944 0,478 Susceptiveis

BC2-45 STS1944 0,730 Susceptíveis

BC2-19 STS171 0,033 Resistentes

STS171 <0,0001 BC2-46 Resistentes STS1944 0,0107

BC2-66 STS1944 0,026 Resistentes

BC2-60 STS1944 0,020 Resistentes

BC2-43 STS171 0,033 Resistentes

BC2-37 STS171 0,018 Resistentes

BC2-69 STS171 0,004 Resistentes

Com base nos fenótipos deduzidos, a região de QTL com resistência principal pôde ser reduzida por meio de comparação das regiões doadoras entre todos os recombinantes BC2 (Tabela 4). BC2-50 continha um genótipo heterogêneo na região qHSR1 e exibiu alta resistência ao carvão do topo com o valor P " 0,01. No lado esquerdo, três recombinantes BC2 (BC2-64,

BC2-65 e BC2-27) com os seus pontos de cruzamento acima no fluxo de bnlg1893 exibiram resistência ao carvão do topo; enquanto isso, os outros cinco BC2 recombinantes com seus pontos de cruzamento abaixo no fluxo de

«

"' STS171 (BC2-67, BC2-68 e BC2-49) ou SNP 661 (BC2-25 e BC2-45) exibiram susceptibilidade ao carvão do topo.

No lado d ireito, todos os sete recombinantes BC2 exibiram resistência ao carvão do topo e apresentaram pontos de cruzamento abaixo no fluxo de STS1944 (BC2-19, BC2-46, BC2-66

5 e BC2-60) ou SNP661 (BC2-43) ou STS171 (BC2-37 e BC2-69). De forma interessante, um recombinante BC2 resistente, BC2-66, apresentou a região doadora mais curta entre SSR148152 e umc2184 e considerou-se que essa região doadora cobre qHSR1. Pôde-se concluir a partir da análise acima que o principal QTL de resistência (qHSR1) estava localizado em um intervalo de

10 SSR148152/SNP661, que se estimou ser de cerca de 2 Mb com base no mapa flsico disponivel na Universidade do Arizona.

Exemplo 10 Estimativa DO Efeito GenÉtíco DO QTL Principal Teoricamente, 93,75°/o dos antecedentes genéticos na progênie

15 de BC2-3 foram revertidos no pai recorrente "Huangzhao4". Devido ao baixo ruído de fundo em progênie de BC2.3, o efeito genético de qHSR1 pôde ser definitivamente estimado por meio de comparação de incidências de doença entre dois grupos com e sem qHSR1 na mesma família BC2.3. Ao todo, 1524 indivlduos de 24 familias BC2,3 foram verificados para determinar a presença

20 ou ausência de qHSR1 com marcadores STS171 e STS1944. As incidências de doenças foram estimadas para dois grupos com e sem qHSR1 em c"ada família BC2,3. Consequentemente, o grupo sem qHSR1 exibiu mais susceptibilidade que o grupo com qHSR1 em cada família de BC2,3 com diferença média de 28,6% ± 10,8%, Em outras palavras, um único qHSR1 de

25 resistência pôde reduzir a incidência de doenças em 28,6% ± 10,8% (Figura 2). Além da progênie de BC2.3, a progênie de BC2F2 também foi empregada para estimar o efeito genético de qHSR1 no presente estudo.

A população de BC2 foi genotipificada em primeiro lugar em dois marcadores

" bnlg1893 e umc2184, resultando em 73 plantas BC2 com qHSR1 e outras 31 plantas BC2 sem qHSR1. Todas essas plantas BC2 foram autopolinizadas para produzir famllias de BC2F2 correspondentes. Conforme esperado, a progênie de BC2F2 derivada de plantas BC2 com qHSR1 exibiu mais resistência que as 5 derivadas das plantas BC2 sem qHSR1. Dos 529 indivíduos BC2F2 derivados de 31 plantas BC2 sem qHSR1, 204 (38,7%) foram considerados susceptiveis.

Destes, 262 (19,3%) dentre 1358 indivíduos BC2F2 derivados de 73 plantas BC2 com qHSR1 eram susceptíveis. Na progênie BC2F2 derivada de plantas BC2 com qHSR1, ocorreu segregação no sítio qHSR1, resultando em um 10 quarto de indivíduos BC2F2 sem qHSR1. Espera-se que esses indivíduos BC2F2 sem qHSR1 possuam a mesma incidência de doença estimada de 31 famílias BC2F2 sem qHSR1 (38,7%). Para os outros três quartos de individuos BC2F2 com qHSR1 (um quatro de homozigotos e metade de heterozigotos), necessitamos estimar a sua incidência de doença. Com base nas explicações 15 acima, pudemos elaborar a equação 3/4X% + 1/4*38,7% = 19,3%; aqui, "X" representa o percentual de infecção para esses indivíduos BC2F2 com qHSR1.

"X" é calculado como 12,8%. Em resumo, o sítio qHSR1 pôde reduzir a incidência de doenças em 25,9% na progênie BC2F2, de 38,7% (indivíduos sem qHSR1) para 12,8% (indivíduos com qHSR1).

20 Exemplo 11 CaracterizaçÃo DA SequÊncia Genômica DE QHSR1 A fim de isolar o gene responsável pelo fenótipo conferido pelo sÍtio qHSR1, BACS que contêm a região entre os marcadores MZA6393 (de bacm.pk071.j12.f, SEQ id n° 23) e o marcador ST148, a versão MO17 de 25 ZMBBc0478L09f (SEQ ID N° 24) foi isolada de uma biblioteca de BAC preparada a partir da linhagem Mo17 resistente. Esta biblioteca foi preparada utilizando métodos padrão de preparação de DNA genômico (Zhang et al (1995), Plant Journal 7: 175-184) seguida por digestão parcial com Hindlll e

,. Iigação de fragmentos selecionados por tamanho em uma forma modificada do vetor disponivel comercialmente pCCIBAC® (Epicentre, Madison, Estados Unidos). Após transformação em células de E. co/i EPl300® seguindo as instruções do fornecedor (Epicentre, Madison, Estados Unidos), 125.184 clones 5 recombinantes foram colocados em 326 placas de microtítulos com 384 cavidades. Esses clones foram colocados em seguida sobre filtros de nylon (Hybond N+, Amersham Biosciences, Piscataway, Estados Unidos). Três clones sobrepostos (bacm.pk071,j12, bacm.pkO07.18 e bacm2.pk166.h1) foram identificados e caracterizados.

10 A biblioteca foi sondada com sondas de oligonucleotÍdeos sobrepostos (sondas de passagem; Ross et al (1999), Screening Large-lnsert Libraries by Hybridization, págs. 5.6.1-5.6.52 em A. Boyl, ed., Current Protoco/s in Human Genetics, Wiley, Nova lorque) projetadas com base nas sequências encontradas nas sequências de BAC. Foram realizadas análises de pesquisa 15 BLAST para retirar sequências repetidas e identificar sequências exclusivas conforme o projeto da sonda. A posição e o interespaçamento das sondas ao longo do contíguo foram verificados por meio de PCR. Para cada sonda, foram projetados dois oligos 24-mer autocomplementares ao longo de 8 bp. A sua combinação resultou em passagem de 40 bp, das quais foram preenchidas 20 duas sobreposições de 16 bp. As sequências exatas são diferentes das que costumavam ser como sondas de passagem em vez de apenas primers de PCR. Foram preparadas sondas de hibridização conforme descrito (Ross et al (1999), acima) e os filtros preparados por meio da colocação em grade da biblioteca de BAC foram hibridizados e Iavados conforme descrito por Ross et 25 al (1999), acima). Utiiizou-se análise de formador de imagens de fósforo para detecção de sinais de hibridização. Em seguida, as membranas foram extraidas das sondas colocando-as em uma solução recém fervida de O,1X SSC e 0,1% SDS, permitindo-se que elas se resfriem à temperatura ambiente h na solução por uma noite. BACs que forneceram sinal positivo foram isolados das placas.

Mapeamento de restrição e experimentos de PCR com primers correspondentes aos marcadores utilizados anteriormente e as sequências 5 obtidas a partir das extremidades de cada BAC foram utilizadas para determinar a ordem dos BACS que cobrem a região de interesse. Três BACs que cobriam toda a região (bacm.pk071.j12, bacm.pkO07.18 e bacm2.pk166.h1) foram selecionados para sequenciamento. Esses BACs foram sequenciados utilizando métodos de sequenciamento de disparo padrão 10 e as sequências, montadas utilizando o pacote de software Phred/Phrap/Consed (Ewing et al (1998), Genome Research, 8: 175-185). A sequência montada dos clones de BAC é exibida em SEQ ID N° 25.

Após a montagem, as sequências que se acreditarem estar na região mais próxima do sÍtio dos dados de mapeamento foram anotadas, o que 15 significa que foram deduzidas possiveis regiões de codificação genética e regiões que representam elementos repetitivos. Regiões de codificação de genes (gênicas) foram procuradas utilizando o pacote de software fGenesH (Softberry, Mount Kisco, Nova lorque, Estados Unidos). fGenesH previu uma parte de uma proteína de tal forma que, ao sofrer BLAST (BLASTx/nr), exibisse 20 homologia parcial no nível de aminoácido em uma parte de proteína de arroz que foi indicada como codificadora de uma proteína que confere resistência à doença em arroz. A parte da sequência de milho que exibiu homologia nessa proteína caiu no final de um estiramento contíguo de sequência de consenso de BAC e aparentemente é truncada. A fim de obter a representação completa 25 do gene no BAC de milho, a sequência de aminoácidos de arroz foi utilizada em análise tBLASTn contra todas as outras sequências de consenso do mesmo clone BAC de milho. lsso resultou na identificação de uma sequência de consenso que representa a extremidade 3' do gene de milho. A parte central do gene não foi representada, entretanto, nas sequências obtidas. Os primers de PCR foram projetados sobre as regiões 5' e 3' do suposto gene e utilizados em um experimento de PCR com DNA do BAC de milho original na forma de modelo. A sequência do produto de PCR resultante continha sequência que 5 liga os fragmentos 5' e 3' isolados anteriormente. Diversos quadros de Ieitura aberta foram detectados em SEQ ID N° 25 incluindo um gene inibidor de xilanase (SEQ ID N° 26/27), uma quinase de proteína associada à parede celular (SEQ ID N° 31/32), dois genes de dimerização de proteínas da família HAT (SEQ ID N° 34/35 e SEQ ID N° 37/38) e duas proteínas não caracterizadas (SEQ ID N° 40/41 e SEQ ID N° 43/44). O gene inibidor da xilanase exibe uma diferença polimórfica em comparação com o ortólogo encontrado em B73. O gene Mo17 é 97,8% idêntico, por meio de alinhamento Clustal V, ao gene B73 e contém duas exclusões de dois e dez aminoácidos (vide Figura 3). A região de DNA genômico que inclui 2,4 kb acima no fluxo dos ORFS de SEQ ID N° 43/44 é exibida em SEQ ID N°45. A sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento de EST adicional da região qHSR é exibida em SEQ ID N° 46.

Qualquer um, qualquer combinação ou todos esses genes podem conferir ou contribuir com a resistência ao carvão do topo no sÍtio qHSR1.

Espera-se que polimorfismos associados a Mo17, que é resistente ao carvão do topo, sejam diagnósticos de sequências que definem qHSR1.

Exemplo 12 Cruzamento DO SÍTIO QHSR1 EM LINHAGENS SUSCEPTÍVEIS Uma introgressão de sÍtio qHSR1 de linhagens congênitas é elaborada para confirmar que o sÍtio qHSR1 poderia ser cruzado sucessivamente em congênitos e que hibridos produzidos com as linhagens congênitas com o sÍtio qHSR1 teriam aumentado ou conferido resistência ao carvão do topo.

.

P MO17 é uma linha congênita com forte resistência ao carvão do topo, mas as suas fracas caracteristicas agronômicas tornam-na um mau pai doador na ausência do uso dos métodos de cultivo assistidos por marcador descritos no presente. Para demonstrar o valor fenotípico do sÍtio qHSR1, o 5 sÍtio sofre introgressão em dez linhagens congênitas de elite, com 25 congênitos adicionais agregados no segundo ao longo do estágio BC3 conforme segue. A população de Fl derivada do cruzamento entre MO17 e as linhagens congênitas de elite são cruzadas uma vez nos pais recorrentes (os congênitos de elite), resultando em uma população BCl. As mudas são 10 plantadas, genotipificadas com marcadores ao longo do genoma, selecionadas (com o sitio qHSR1 e fundo mínimo de MO17) e novamente cruzadas em linhagens congênitas recorrentes para desenvolver uma população de BC2.

Famílias de BC2 são genotipificadas e novamente selecionadas para determinar a presença da região qHSR1 de MO17. PIantas positivas são 15 cruzadas em congênitos parentais recorrentes uma vez mais para desenvolver populações de BC3. Sementes dessas populações de BC3 são plantadas e as plantas são genotipificadas. Plantas BC3 com ou sem a região de interesse são isoladas para elaborar famílias de BC3S1. Essas famílias foram utilizadas para comparação fenotlpica (BC3S1 com ou sem a região de interesse).

20 A fim de observar o desempenho do gene qHSR1 em uma situação heterozigótica tal como seria encontrado em um hibrido comercial, são realizados cruzamentos de teste apropriados. Especificamente, pIantas BC3S1 individuais homozigóticos para o gene qHSR1 bem como plantas homozigóticas para o alelo susceptível são utilizadas para elaborar 25 cruzamentos de teste com congênitos selecionados. No caso das linhagens BC3S1 e dos híbridos, as diferenças fenotípicas esperadas indicam aumento significativo da resistência ao carvão do topo em linhagens e híbridos que contêm a região que conduz qHSR1. Os dados demonstram claramente que o uso de métodos de cruzamento para mover o gene das realizações para outras linhagens geneticamente competentes para uso do gene resulta em aumento da resistência ao carvão do topo.

5 Como resultado do mapeamento fino do sÍtio do gene qHSR1, pode-se utilizar quaisquer dois marcadores de flanco que sejam geneticamente ligados ao gene qHSR1 para selecionar uma pequena região cromossômica com cruzamentos ao norte e ao sul do gene qHSR1. Este possui o benefício de reduzir o arrasto de ligação, o que pode ser um fator de confusão ao tentar realizar introgressão de um gene específico de germoplasma não adaptado, tal como MO17, em germoplasma de elite. É vantajoso ter marcadores laterais com ligação próxima para seleção de um gene e altamente vantajoso ter marcadores no próprio gene. Este é um aprimoramento sobre o uso de um marcador isolado ou marcadores laterais distantes, pois, com um único marcador ou com marcadores de ligação distantes, a Iigação associada a qHSR1 pode ser rompida e, por meio de seleção desses marcadores, é mais provável selecionar inadvertidamente plantas sem o gene qHSR1. Como a seleção assistida por marcador é frequentemente utilizada no lugar de seleção fenotípica após a confirmação da associação entre marcador e característica, o resultado infeliz desse erro seria a seleção de plantas que não são resistentes ao carvão do topo e o descarte de plantas que sejam resistentes ao carvão do topo. Neste particular, marcadores no gene qHSR1 são particularmente úteis, pois eles, por definição, permanecerão ligados com resistência ao carvão do topo conforme aprimorado ou conferido pelo gene. Além disso, marcadores com o sÍtio qHSR1 são tão úteis quanto os demais por uma razão similar. Devido à sua muito boa proximidade do gene qHRS1, eles são muito propensos a permanecerem ligados ao gene qHSR1. Após sofrerem introgressão com o gene qHSR1, esses congênitos de elite podem ser utilizados para a produção de sementes híbridas e como fonte doadora para introgressão adicional do gene qHSR1 em outras linhagens congênitas.

Desta forma, os dados demonstram que progênie congênita convertida utilizando MO17 como fonte de doadores retém o intervalo cromossômico MO17 truncado. Os congênitos que compreendem o intervalo cromossômico M17 truncado são muito úteis como as próprias fontes doadoras e não há necessidade de retornar para MO17 como fonte doadora. Utilizando cultivo assistido por marcadores conforme descrito no presente, o intervalo cromossômico de MO17 truncado pode ter seu tamanho adicionalmente reduzido conforme o necessário sem preocupação com a perda da ligação entre os marcadores e o gene qHSRl.

Exemplo 13 Uso D,E,QHSR.1_C,OMO,T,R,ANSGEN.E,P,ARA.C,RlAR,P,LA,NTA,S,DE,M,I,L,HO,R,ESI,S,T,ENT,E,S O gene qHSR1 pode ser expresso também na forma de transgene, permitindo a modulação da sua expressão em diferentes circunstâncias. Os exemplos a seguir demonstram como o gene qHSR1 poderá ser expresso em diferentes formas para combater doenças diferentes ou proteger partes diferentes da pIanta, ou simplesmente para mover o gene qHSR1 para diferentes linhagens de milho na forma de transgene, como alternativa para o método descrito no Exemplo 12.

Exemplo 13A Neste exemplo, o possÍvel gene qHSR1 (inibidor de xilanase e outros genes indicados no intervalo de QTL, conforme definido no Exemplo 11) é expresso utilizando o seu próprio promotor.

A fim de transformar os genes de qHSR1 completos, incluindo as regiões promotora e de codificação de proteínas, fragmentos de DNA que contêm a região de codificação completa e a região a cerca de 2 kb acima no fluxo são amplificados por meio de PCR utilizando o clone de BAC como DNA modelo. Para permitir a clonagem utilizando a Tecnologia Gateway® (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), sÍtios att8 são incorporados aos primers de PCR e o produto amplificado é clonado em vetor pDONR221 por meio de reação de recombinação Gateway® BP, O fragmento resultante, flanqueado por sÍtios attL, é movido por meio da reação de recombinação Gateway® LR em um vetor binário. O DNA de construção é utilizado em seguida para transformação de milho conforme descrito no Exemplo 14.

Exemplo 13B A fim de expressar os genes qHSR1 (inibidor de xilanase e outros genes indicados no intervalo de QTL, conforme definido no Exemplo 11) ao longo de toda a pIanta em baixo nível, a região de codificação dos genes e seus terminais são colocados atrás dos promotores de um gene actina de arroz (Patentes Norte-Americanas n° 5.641.876 e 5.684.239) ou o gene F3.7 (Patente Norte-Americana n° 5.850.018). Para permitir a clonagem utilizando tecnologia Gateway® (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), sÍtios att8 são incorporados em primers de PCR que são utilizados para amplificar os genes qHSR1 a partir de 35 bp acima no fluxo do seu códon de início. Um sÍtio Notl é adicionado ao primer att81. O produto qHSR1 amplificado é cIonado em vetor pDONR221 por meio de reação de recombinação Gateway® BP (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Após a clonagem, o gene qHSR1 resultante é flanqueado por sÍtios attL e possui um SÍtio Notl exclusivo a 35 bp acima no fluxo do códon de início. Em seguida, fragmentos promotores são amplificados por PCR utilizando primers que contêm sitios Notl. Cada promotor é fundido ao sitio Notl de qHSR1. Na etapa final, a construção de gene quimérico é movida por meio de reação de recombinação Gateway® LR (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) para o vetor binário PHP20622. Este é utilizado para transformação de milho conforme descrito no Exemplo 14.

Exemplo 13C A fim de expressar os genes qHSR1 (inibidor de xilanase e outros genes indicados no intervalo de QTL, conforme definido no Exemplo 11) ao longo de toda a planta em alto nível, a região de codificação dos genes e seus 5 terminais são colocados atrás da região não traduzida 5' promotora e um intron de um gene ubiquitina de milho (Christensen et al (1989), P/ant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al (1992), P/ant Mol. Biol. 18: 675-689). Para permitir a clonagem utilizando a tecnologia Gateway® (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), sÍtiOS att8 são incorporados em primers de PCR que são utilizados para amplificar os genes qHSR1 a partir de 142 bp acima no ftuxo do códon de início. O produto amplificado é clonado em pDONR221 (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) utilizando uma reação de recombinação Gateway® BP (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Após a clonagem, o gene qHSR1 resultante é flanqueado por sítios attL. Na etapa final, o clone qHSR1 é movido por meio de reação de recombinação Gateway® LR (|nvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) para um vetor que continha o promotor ubiquitina de milho, região não traduzida 5', e o primeiro intron do gene ubiquitina conforme descrito por Christensen et al (acima), seguido por sÍtios Gateway® ATTRI e R2 para inserção do gene qHSR1, atrás do conjunto de expressão de ubiquitina. O vetor também continha um gene marcador apropriado para transformação de milho, de forma que o plasmídeo resultante, que conduz o gene quimérico (promotor ubiquitina de milho - região não traduzida de ubiquitina 5' - intron 1 de ubiquitina - qHSR1), seja apropriado para transformação de milho conforme descrito no Exemplo 14.

Exemplo 13D A fim de expressar os genes qHSR1 (inibidor de xilanase e outros genes indicados no intervalo de QTL, conforme definido no Exemplo 11) em um nível de expressão preferido por raízes, a região de codificação dos genes e seus terminais são colocados atrás de um promotor preferido de raízes tal como, mas sem limitações, promotor NAS2 de milho, promotor Ciclo de milho (US 2006/0156439, publicado em treze de julho de 2006), o promotor ROOTMET2 de milho (WO 05063998, publicado em quatorze de julho de 2005), o promotor 5 CRIBIO (VVO 06055487, publicado em 26 de maio de 2006), o CRWAQ81 (VVO 05035770, publicado em 21 de abril de 2005) e o promotor ZRP2.47 de milho (acesso NCBI n° U38790, Gl n° 1063664). O fragmento descrito no Exemplo 13b que contém a região de codificação qHSR1 flanqueada por sítios attL e que contém um sÍtio Notl exclusivo com 35 bp acima no fluxo do códon de início de qHSR1 é utilizado para permitir clonagem utilizando a tecnologia Gateway® (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Fragmento promotor é amplificado por PCR utilizando primers que contêm sitios Notl. Cada promotor é fundido ao sítio Notl de qHSR1.

Na etapa final, a construção de gene quimérico é movida por meio de reação de recombinação Gateway® LR (lnvitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) para o vetor binário PHP20622. Este é utilizado para transformação de milho conforme descrito no Exemplo 14.

Exemplo 14 Transformação Mediada POR Agrobacter/um DE Milho E RegeneraçÃo DE Plantas TransgÊnicas As construções de DNA recombinante preparadas nos Exemplos 6a a 6d foram utilizadas para preparar plantas de milho transgênico conforme segue.

Milho é transformado com construções de polinucleotideos selecionados descritos nos Exemplos 13a e 13C utilizando o método de Zhao (Patente Norte-Americana n° 5.981.840 e Patente PCT publicada n° WO 98/32326). Resumidamente, embriões imaturos foram isolados de milho e os embriões foram colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium, b na qual as bactérias foram capazes de transferir a construção de poHnucleotídeos para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação. Os embriões foram cocultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2; etapa de cocultivo). Os embriões imaturos 5 foram cultivados sobre meio sólido após a etapa de infecção. Após esse período de cocultivo, é realizada uma etapa de "repouso" opcional. Nesta etapa de repouso, os embriões foram incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transforniadores de plantas (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos foram cultivados sobre meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida, embriões inoculados foram cultivados sobre meio que contém um agente seletivo e calo transformado em crescimento é recuperado (etapa 4: a etapa de seleção). O calo é regenerado em seguida em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração) e calos cultivados sobre meio seletivo foram cultivados sobre meio sólido para regenerar as plantas.

Exemplo 15 AvaliaçÃo de Plantas TransgÊnicas Plantas transgênicas são realizadas conforme descrito no Exemplo 14 utilizando as construções descritas nos Exemplos 13a a 13d, respectivamente. Elas são avaliadas com protocolos descritos no Exemplo 9 para determinar aumento da resistência ao carvão do topo- Exemplo 16 AnÁlise da Distribuição do Gene QHSRI ao Longo de Germoplasma e Identifjcação de Variantes de SequÊncias QHSR1 Após a identificação, sequenciamento e mapeamento fino de qHSR1, outras linhagens são selecionadas em busca do gene qHSR1. Para determinar a presença do gene qHSR1 em outro germoplasma de milho, combinações de primers específicos de genes são utilizadas para amplificar DNA genômico a partir de um quadro diverso de linhas congênitas de milho por meio de reação em cadeia de polimerase.

São identificadas linhagens

5 congênitas com qHSR1 (alelo MO17). Desta forma, além do uso de MO17 como fonte doadora, outras fontes que contêm o gene qHSR1 podem também ser utilizadas como fontes doadoras.

Variantes do gene qHSR1 também são identificadas e analisadas para determinar polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPS). Nem todas as variantes alélicas do gene qHSR1 indicavam um fenótipo resistente.

Linhagens congênitas com haplótipos ou alelos distintos são avaliadas para determinar a sua resistência ao carvão do topo e são identificadas supostas variantes alélicas resistentes.

A sua eficácia na resistência ao carvão do topo é validada em populações segregantes (tais como população F2). Os SNPS podem ser utilizados como marcadores para identificar com precisão e rastrear a sequência de qHSR1 em um programa de cultivo de plantas e para diferenciar entre variantes alélicas resistentes e susceptíveis.

Além disso, esses SNPS indicam que existem variantes de sequências que exibem um fenótipo resistente e podem ser utilizadas nos métodos e produtos descritos no presente.

Exemplo 17 AnÁlise Adicional da Distribuição do Gene QHSR1 ao Longo de Germoplasma e Identificação de Variantes de SequÊncias de QHSR1 A região qHSR1 foi adicionalmente definida como um intervalo de

172 kb na linhagem parental resistente Ji1037 e um intervalo de 56 kb na linhagem parental susceptível Huangzhao4. A discrepância de tamanho também se deve a uma exclusão (116 kb) em Huangzhao4 em comparação com ji1037. Os principais recombinantes que foram utilizados para mapeamento fino foram repetidamente pesquisados para determinar suas resistências ao carvão do topo em Gongzhuling na província de Jilin e na estufa de inverno na llha de Hainan e exibem resistência consistente ao carvão do topo.

5 Clones de BAC MO17 positivos foram selecionados com base na caracterização da região qHSR1. Além disso, marcadores na região qHSR1 foram utilizados para selecionar uma biblioteca de BAC de Huangzhao4. Os clones de BAC positivos sobrepostos mínimos foram submetidos a sequenciamento para obter uma visão ampla na região de qHSR1. A vista comparativa entre as linhagens congênitas de Mo17, B73 e Huangzhao4 é exibida na Figura 4. Ao todo, foram identificados seis supostos genes adicionais, uma proteína de repetição de anquirina (SEQ ID N° 104 a 106, a sequência de codificação, tradução de protelna e DNA genômico, respectivamente) é encontrada em todas as três linhagens congênitas, um gene que codifica uma proteína quinase associada à parede (SEQ ID N° 31-33) é ausente em Huangzhao4, um gene que codifica hidrolase (SEQ ID N" 107- 109) é ausente em B73 e Huangzhao4, duas das três proteínas quinase similares a Xa21 (SEQ ID N° 110-115) estão ausentes em Huangzhao 4 e a terceira proteína quinase similar a Xa21 (SEQ ID N° 115-117) está presente em pelo menos Mo17 e Huangzhao4.

Exemplo 18 Caracterização DE POSSÍVEIS GENES DE RESJSTÊNCIA NA REGIÃO QHSRI São realizadas três abordagens para validar os possÍveis genes de resistência: 1) um teste de complementaridade, pois ambos, Mo17 e B73, exibem alguma resistência ao carvão do topo, os três genes compartilhados (proteína de repetição de Anquirina, proteína quinase associada à parede e Xa21D quinase) são propensos a serem possiveis genes que contribuem com o fenótipo, todos esses três genes são subclonados a partir dos clones de BAC

K positivos em um vetor de expressão, seguidos por transformação em linhagens congênitas susceptíveis; 2) método de RNA1, vetores de RNA1 são construídos para todos os seis supostos genes na região de 172 kb e transformados em seguida em MO17 para vencer os supostos genes um a um, o que permite a 5 identificação dos genes envolvidos em resistência ao carvão do topo; 3) sobre- expressão de possÍveis genes em linhagens susceptíveis, construções de sobre-expressão com cada um dos seis possÍveis genes individuais ligados a promotores fortes são construídas e introduzidas em linhagens susceptiveis para determinar se qualquer um dos possiveis genes individuais na região 10 qHSR1 é suficiente para conferir resistência ao carvão do topo. Exemplo 19 Desenvolvimfnto de MARCADORES NA REGIÃO QHSR1 ÚTEIS PARA SELEçÃO assistida por MARCADORES As sequências de BAC, especialmente as sequências de 15 codificação, foram adicionaimente utilizadas para desenvolver marcadores com alta densidade. No total, oito marcadores foram desenvolvidos na região de 172 kb (Ji1037 qHSR1 que é equivalente a MO17) (Tabela 5). Esses marcadores foram utilizados para integrar o qHSR1 de resistência a outras Iinhagens congênitas susceptíveis por meio de seleção assistida por marcadores.

20 Tabela 5 Marcadores no Intervalo de 172 kb que COBREM A REGIÃO QHSR1 i Produtos de PCR Tipo de Posi Nome do Sequência Primer (j11037/Huangzhao4 marcad ção marcador (SEQ ID N°) )(seqidn°) or 5: MZA6 GTATTTCTACCAGCGT codomi 412bp/325bp 0 MZA6393 393L GGCCT-3' nante [23/47]

[50] MZA6 5'-

Produtos de PCR Tipo de Posi I Nome do I Primer I Sequência (j11037/Huangzhao4 marcad ção I marcador I I (SEQ ID N°) )(SEQIDN°) or I 393R I GACAAGCTGCAGATC GAAGA-3' [51] 5'- I 1M2- I 9L I TCGTGACGGACCTGT codomi 7::7 l 1M2"9 | 1M2_ ) AGTG::3' [52] 618bp/759bp nante [54/55] 9R I TCGCGGTTCAGAAGA ACAAC-3' [53] 5'- I E6765 I 26,4 I

I

I -3L I CATGTGCCGACCGAC | CATTC-3' f56] domina 426bp I E6765-3 I nte kb I I E6765 I 5'" [58 I -3R I GGAGTGCGATGTCTA CAGCT-3' [57] 5'- I 2M4- I ,, r 4 I CACGTTGTGACTCAAG domina 99kb j 2M4-1 ATCG-3' [59 573bp nte 5'" [61] 2M4-

ATCAAGGACCATCAG 1R CACAG-3' [60] 5'- 2M1O-

CCTCCTCTCCATCTGG 141, I 5L TCCA-3' [62] domina 589bp I 2M10-5 nte 5kb I 5'- [64] 2M1O-

CGTGTGCTTGGAAGA 5R ATCTC-3' [63] 5l 148k I 2M11- TGGACAGACCTTAGCT domina 563bp I 2M11-3 3L nte b I TGCT-3' f65] [67] 2M11- 5'-

Produtos de PCR Tipo de Posi Nome do Sequência Primer (j11037/Huangzhao4 marcad ção marcador (SEQ ID N°) )(SEQ1DN°) or 3R GTTCGTAAGTGCGTCA ATGG-3' [66] 5'- 3M1-

GCTAGATAGCTGCTTC 25L codomi 163k TTCC-3' (68] 328bp/468bp 3M1-25 nante b 5'- {70/71] 3M1-

GTACCTACGATTCGG 25R CAGAA-3' [69] 5l STS14

CTTCCATCGGTACTCC 8-1L codomi 172, ATTC-3' [72] 177bp/132bp STS148-1 nante lkb 5'- [24/49] STS14

TTCTCCAGGTGTGAGA 8-1R AATC-3 [73] O efeito genético da região de qHSR1 em resistência ao carvão do topo foi testado utilizando onze populações BC4. A linhagem congênita de MO17 sofreu cruzamento em Ji853, 444, 4287, 98107, 99094, Chang 7-2, V022, V4, 982, 8903 e 8902. A região de qHSR1 sofreu cruzamento em seguida por quatro gerações, utilizando marcadores tais como MZA6393, 2M10-5, STS148-1, STS661 e E148-4, para selecionar as plantas com a região qHSR1. Essas populações de BC4 foram fenotipificadas na estufa de inverno na ilha de Hainan. Essas populações de BC4 continham plantas com e sem o qHSR1 (Tabelas 6A e B). As plantas sem a região qHSR1 foram consideradas controles para contar a resistência de linha base dos diferentes antecedentes genéticos. As plantas individuais nas populações BC4 foram avaliadas para determinar a resistência ao carvão do topo e foi calculado o percentual de plantas resistentes para os grupos com e sem a região qHSR1. A região

O qHSR1 conferiu um aumento de cerca de 25% do Índice de resistência. A própria linhagem congênita "4287" contém a região qHSR1 e exibe resistência ao carvão do topo e, por esta razão, a integração da região qHSR1 em antecedentes genéticos de "4287" possui efeito mínimo sobre a resistência ao 5 carvão do topo.

Tabela 6A Efejtos GenÉticos DA RegiÃo QHSR1 EM ResistÊncia AO CARVÃO DO TOPO ! Antecedentes I Tamanho da I Marcadores após a região R j genéticos ) população Sem qHSR1 I Ccjm I qHSR1 Ji853 I 353 I 28 MZA6393, 2M10-5, STS148-1 444 ! 118 ) 29 MZA6393, 2M10-5. STS148-1 4287 I 226 I 64 MZA6393. STS661 98107 I 81 I 27 MZA6393. 2M10-5, STS661 99094 ! 17 ) 46 MZA6393, 2M10-5, STS661 Chang7-2 I 176 I 86 MZA6393, 2M10-5, STS148-1 V022 148 91 MZA6393, 2M10-5. STS148-1 V4 I 69 I 134 MZA6393. 2M10-5, STS148-1 982 I 99 I 83 MZA6393. 2M10-5. STS661 8903 ! 201 I 143 MZA6393, 2M10-5. E148-4 8902 I 67 ! 118 MZA6393. 2M10-5. E148-4 Tabela 6B Antecedent Percentual das plantas resistentes em es populações cruzadas genéticos Sem qHSR1 Com qHSR1 Diferença Valor P Ji853 20,54% 52,60% 32,06% 5,27E-09 444 35,37% 59,53% 24,16% 0,0012 4287 84,67% 84,31% -0,36% 18,22% 42,22% 24,00% 0,0004 98107 0 33,93% 33,93% 0,01253 99094 b

W Antecedent Percentual das plantas resistentes em es populações cruzadas genéticos Sem qHSR1 Com qHSR1 Diferença Valor P Chang7-2 12,48°6 38,63% 26,15% 7,52E-08 V022 44,41% 71,82°6 27,41°/, 1,71E-06 V4 21,29% 49,97% 28,68% 5,24E-05 982 16,83% 29,91°/, 13,08% 3,30E-05 8903 23,96% 40,34% 16,38% 2,79E-09 8902 18,41% 38,26% 19,85% 9,19E-06 Exemplo 20 Desenvolvimento DE MARCADORES ADIcIoNAis NA REGIÃO QHSR1 ÚTEIS PARA SELEÇÃO ASSISTIDA P,O.R,M,A,R,C,A,D,O,R,E,S, Linhagens de introgressão para qHSRl estão sendo criadas 5 para cultivo de material e avaliação da eficácia de qHSR1 no oeste da América do Norte, México e China. Trinta e cinco linhagens Pioneer congênitas (CN3K7 é a linhagem doadora; GRBIM, HNA9B, HN4CV, HNVS3, HNN4B, HNH9H, HNGFT, GRORA, HFTWK e GRVNS são linhagens sem hastes rígidas para a China; GROP2, HEF3D, HFOSV, HFHHN, HN05F, 10 HN088, HNOEI, HN8TO, HNNWJ e HNW4C são linhagens sem hastes rígidas para o oeste da América do Norte; EDGJ4, EDWIN, EDVNA, EDVS9 e EDV9Z são linhagens com hastes rígidas para a China; e 2HC5H, 2H071, 4F1FM, 4F1VJ, 4FJNE, 7T9HV, IARMJ, IAYOM, IAGFC e 1A1V3 são linhagens com hastes rígidas para o México) foram cruzadas com MO17 para 15 gerar o Fl. Marcadores de SNP, tais como MZA15839-4, MZA18530-16, MZA5473-801, MZA16870-15, MZA4087-19, MZA158-30, MZA15493-15, MZA9967-11, MZA1556-23, MZAI 556-801, MZA17365-10, MZA17365-801, MZA14192-8, MZA15554-13 e MZA4454-14 estão sendo utilizados para selecionar a região qHSR1 durante cruzamentos subsequentes. 39 a 65 20 marcadores de SNP sobre regiões cromossômicas não ligadas foram

«

P utilizados na geração BCl para seleção contra o fundo.

As linhagens estão sendo cmzadas em uma geração BCl, BC2, BC3 ou BC4 e, em seguida, isoladas. As pIantas homozigóticas para a região qHSR1 são identificadas na geração isolada e cmzadas em seguida em um congênito de 5 cruzamento de teste, tal como EF6\NC ou EF890 para introgressões NSS. As linhagens BC de cruzamento de teste têm avaliada em seguida a eficácia no sítio apropriado para a linhagem congênita, tal como oeste da América do Norte, México ou China. Em cada sÍtio, utiliza-se uma quantidade suficiente de réplicas e tamanho de população para avaliar a eficácia de qHSR1. O híbrido equivalente sem o QTL de 10 caNão do topo também foi cultivado para comparação. Caso não se espere alta pressão de doença, o experimento será inoculado artificialmente com o patógeno de caNão do topo para garantir alta pressão de doença.

Os marcadores que são úteis pam cultivo assistido por marcadores para desenvolver linhagens de intmgressão são exibidos na Tabela 7. Oito desses 15 marcadores (MZA6393, 1M2-9, E6765-3, 2M4-1, 2M10-5, 2M11-3, 3M1-25 e STS148- 1) estão Iocalizados dentro da região qHSR. Os marcadores da Tabela 7 que se encontram fora da região qHSR foram desenvolvidos para que fossem específicos para MO17 e, portanto, são ligados à região qHSR. Esses marcadores, ainda que exemplos, não se destinam a ser uma relação completa de todos os marcadores úteis. Podem ser 20 desenvolvidos muitos marcadores que são específicos para a região qHSR. Além disso, qualquer marcador que seja ligado ou associado a um desses marcadores especificos poderá ser útil na seleção assistida por marcadores.

Tabela 7A Marcadores NA Região QHSR Tipo de I I Posição I Posição I MO17 I Marcadores | marcador ) Cromossomo : genética I fisica (bp)* i SNP I MZA15839-4 I SNP I 2 I 220,22 i I T I MZA18530-16 I SNP I 2 220,34 I G

«

* Tipo de I I Posição I Posição I MO17 I

Marcadores I marcador I Cromossomo I genética I física (bp)* | SNP i MZA5473-801 | SNP I 2 | 225,11 I i G

I MZA16870-15 I SNP I 2 I 226,92 i i G

I MZA4087-19 I SNP I 2 I 228,58 I I C

MZA158-30 ! SNP I 2 I 228,58 I I T i MZA15493-15 | SNP I 2 I 230,55 ) I G

I MZA9967-11 i SNP I. 2 I 231,1 l I T

MZA6393 codominante 2 x 0 x

1M2-9 : codominante I 2 I x I 7,27 I x

E6765-3 I dominante ) 2 ) x ) 26,4 l x

2M4-1 dominante 2 x 99 x

2M10-5 I dominante I 2 I x i 141,5 I x

2M11-3 dominante 2 x 148 x

3M1-25 codominante 2 x 163 x

STS148-1 codominante 2 x 172,1 x

I MZA1556-23 I SNP I 2 i 235,32 I I A

I MZA1556-801 I SNP I 2 l 235,32 I I C

! MZA17365-10 l SNP 2 I 235,68 I I G

MZA17365-801 SNP 2 235,68 D

MZA14192-8 SNP 2 235,8 G

MZA15554-13 SNP 2 244,27 G

MZA4454-14 SNP 2 245,91 C

Tabela 7B

Marcadores NA RegiÃo qhsR

Tamanho

Primer Frontal Primer Reverso (J11037/Huangzhao4)

Marcadores (SEQ ID N°) (SEQ ID N°) (SEQ ID N°)

MZA15839- gatgcaatggaagaattcgtg tgaactcagctttggataccaa

4 [74] [75]

MZA18530- gtttcctcatggcactactct agtaaagccacacatcttattc

16 [76] [77]

£ m

Tamanho

Primer Frontal l Primer Reverso I (J11037/Huangzhao4) I

I Marcadores I (SEQ ID N°) I (SEQ ID N°) I (SEQ ID N°)

I MZA5473- ) cccatgatggctacattctg I cagaggcttgcgttaacaac I

801 I [78] i [79] I MZA16870- I atttcagcgtttgcggtgtc I ataatgaagttgacctaagtcc I

15 I [80] I [81] I MZA4087- l agctaaacagcggatgactg i caaacatgcaaagaatgaggtt I

19 I [82] ) [83]

I ccaccaccggccccagta I aaagtgatacataaggcacaca I l MZA158-30 I [84] Í [85]

I MZA15493- i gataattgggaatgggcagat agaaatatcctcatcctcaatg !

15 I [86] [87]

i MZA9967- i tttccggttttggtggacga cgtccgactcattatacatca

11 I [88] [89]

I gtatttctaccagcgtggcct gacaagctgcagatcgaaga I 412/325

I MZA6393 I [50] [51] I (23/47]

) tcgtgacggacctgtagtgc tcgcggttcagaagaacaac I 618/759

1M2-9 I [52] [53] i [54/55]

catgtgccgaccgaccattc ggagtgcgatgtctacagct 426

E6765-3 [56] [57] [58]

cacgttgtgactcaagatcg atcaaggaccatcagcacag 573

2M4-1 [59] [60] [61]

cctcctctccatctggtcca cgtgtgcttggaagaatctc 589

2M10-5 [62] [63] [64]

tggacagaccttagcttgct gttcgtaagtgcgtcaatgg 563

2M11-3 [65] [66] [67]

gctagatagctgcttcttcc gtacctacgattcggcagaa 328/468

3M1-25 [68] [69] [70/71]

cttccatcggtactccattc ttctccaggtgtgagaaatc 176/132

I STS148-1 [72] [73] [24/49]

I MZA1556- tgtgctccctggtccgcc tcaagtgcccctagctcct

23 [90] [91]

F

Tamanho

Primer Frontal I Primer Reverso I (j11037/Huangzhao4) :

I Marcadores I (SEQ ID N°) ! (SEQ ID N°) ) (SEQ ID N°)

I MZA1556- l tgtgctccctggtccgcc | tcaagtgcccctagctcct

801 I [92] I [93] i MZA17365- I cctatggctggttgctctt I gccaacaagtcaacatcctaa

10 l [94] l [95]

; MZA17365- cctatggctggttgctctt I gccaacaagtcaacatcctaa

801 [96] I [97]

I MZA14192- tcctggaacgccatggtact I cagggacatcaagcgcca

8 [98] I [99]

) MZA15554- acttccgaggcgtcgcagtt I atgaacactcactcactcctc

13 [100] I [101]

I MZA4454- atgagggtttggaggcgtat ttacctcaactaagggcatcc

14 [102] {103]

lii

! |

|I

Claims (12)

Reivindicações

1. PROCESSO DE DETERMINAÇÃO, da presença ou ausência de um polinucleotideo em plantas de milho, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um dentre: (a) isolamento de moléculas de ácido nucleico da mencionada planta de milho e amplificação de sequências homólogas ao polinucleotídeo; ou (b) isolamento de moléculas de ácido nucleico das mencionadas plantas de milho e realização de hibridização Southern: ou (C) isolamento de proteinas da mencionada planta de milho e realização de Western Blot utilizando anticorpos para a proteína; ou (d) isolamento de proteinas da mencionada planta de milho e realização de teste ELISA utilizando anticorpos para a proteína; ou (e) demonstração da presença de sequências de mRNA derivadas do transcrito de mRNA e exclusivas para o sÍtio de resistência ao carvão do topo (head smut); e adicionalmente em que o poIinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste de: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que confere ou aumenta a resistência ao carvão do topo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 27, 32, 35, 38, 41, 44, 105,108,111,113e116; (ii) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de conferir ou aumentar a resistência ao carvão do topo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 25, 26, 30, 31, 34. 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 104, 106,107, 109, 110, 112, 114,115e117;e (iii) um complemento da sequência de nucleotideos da parte (i) ou (ii), em que o complemento e a sequência de nucleotideos consistem do mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares; de forma a determinar a presença do polinucleotÍdeo na mencionada planta de milho.

2. PROCESSO DE DETERMINAÇÃO, da presença ou ausência do sÍtio de resistência ao carvão do topo em plantas de milho, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um dentre: 5 (a) isolamento de moléculas de ácido nucleico da mencionada planta de milho e amplificação de sequências exclusivas para um polinucleotÍdeo que confere resistência ao carvão do topo; ou (b) isolamento de proteínas da mencionada planta de milho e realização de Western Blot utilizando anticorpos para a proteína; ou (c) isolamento de proteínas da mencionada planta de milho e realização de teste ELISA utilizando anticorpos para a proteína; ou (d) demonstração da presença de sequências de mRNA derivadas do transcrito de mRNA e exclusivos para o sÍtio de resistência ao carvão do topo; e, adicionalmente, em que o polinucleotÍdeo é selecionado a partir do grupo que consiste de: (i) pelo menos uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo que confere ou aumenta a resistência ao carvão do topo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N" 27, 32, 35, 38, 41, 44, 105,108,111,113e116; (ii) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de conferir ou aumentar a resistência ao carvão do topo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 25, 26, 30, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 104,106, 107,109, 110, 112,114,115e117;e (iii) um complemento da sequência de nucleotídeos da parte (i) ou (ii), em que o complemento e a sequência de nucleotideos consistem do mesma número de nucleotídeos e são 1OO°/o complementares; de forma a determinar a presença do sÍtio de resistência ao carvão do topo na mencionada planta de milho.

e

3. MÉTODO DE 1DENTIFICAÇÃO, de uma planta de milho que exibe resistência ao carvão do topo, caracterizado pelo fato de que o método compreende a detecção em uma planta de milho de um sitio marcador genético, em que: 5 (a) uma sonda marcadora genética que compreende, no todo ou em parte, o sÍtio marcador genético, ou seu complemento, hibridiza-se sob condições severas em bacm.pk071 .j12, bacm.pkO07.18 e bacm2.pk1 66.h1; e (b) o mencionado sÍtio marcador genético compreende pelo menos um alelo que é associado à resistência ao carvão do topo.

10 4, MÉTODO DE IDENTlFICAçÃO, de uma planta de milho que exibe resistência ao carvão do topo, caracterizado pelo fato de que o método compreende a detecção no germoplasma da planta de milho de pelo menos um alelo de um sÍtio marcador, em que: (a) o sÍtio marcador encontra-se a 7 CM de SSR148152, 15 CAPS25082, STS171, SNP661 e STS1944; e (b) pelo menos um alelo é associado à resistência ao carvão do topo.

5. MÉTODO DE |DENT|F|CAÇÃO, de uma planta de milho que exibe resistência ao carvão do topo, caracterizado pelo fato de que o 20 método compreende a detecção no germoplasma da planta de milho de pelo menos um alelo de um sÍtio marcador, em que: (a) o sÍtio marcador está posicionado em um intervalo cromossômico que compreende e é flanqueado por umc1736 e umc2184; e (b) pelo menos um alelo é associado à resistência ao carvão 25 do topo.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sítio marcador está posicionado em um intervalo cromossômico que compreende e é flanqueado por SSR148152/SNP661.

m

7. MÉTODO DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obtenção de uma primeira planta de milho que contém pelo menos um alelo de um sÍtio marcador, em que o sÍtio marcador está localizado 5 dentro de 7 cM de SSR148152, CAPS25082, STS171, SNP661 e STS1944 em um mapa genético de IBM público e o alelo está associado ao aumento da resistência ao carvão do topo; (b) cruzamento da mencionada primeira planta de milho com uma segunda planta de milho; 10 (C) avaliação da progênie para pelo menos o mencionado alelo; e (d) seleção de plantas de milho de progênie que contém pelo menos o mencionado alelo.

8. MÉTODO DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR, 15 caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obtenção de uma primeira planta de milho que contém pelo menos um alelo de um sitio marcador, em que o sÍtio marcador está localizado em um intervalo cromossômico que compreende e é flanqueado por umc1736 e umc2184 e o alelo é associado a resistência aumentada ao carvão do topo; 20 (b) cruzamento da mencionada primeira planta de milho com uma segunda planta de milho; (C) avaliação da progênie para pelo rnenos o mencionado alelo; e (d) seleção de plantas de milho de progênie que contém pelo 25 menos o mencionado alelo.

9. MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM SÍTIO DE RESISTÉNCIA, ao carvão do topo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção da presença de pelo menos um alelo marcador selecionado a partir do grupo que consiste de: MZA6393, 1M2-9, E6765-3, 2M4-1, 2M10-5, 2M11-3, 3M1-25 e STS148-1.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um alelo marcador associado à resistência ao carvão do topo possui Iigação com um segundo alelo marcador.

11. PLANTA DE MILHO, caracterizada pelo fato de que é produzida por meio de um dos métodos, conforme definidos em uma das reivindicações 3 a 9.

12. PROGÊNIE, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir da planta de milho conforme definida na reivindicação 11.